MX2008004225A - Metodo para la produccion de una poblacion de celulas t - Google Patents

Abstract

Se describe un método para la producción de una población de células T que es capaz de expresar CD45RA y que también expresa por lo menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste de CD62L, CCR7, CD27 Y CD28. El método comprende el paso que consiste en cultivar una población de células que contiene células T en presencia de una fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la fibronectina y el fragmento.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE UNA POBLACIÓN DE CÉLULAS T CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un método para preparar una población de células T, la cual es útil en el campo médico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un cuerpo vivo es protegido de sustancias extrañas principalmente por una respuesta inmune y un sistema inmune ha sido establecido por varias células y los factores solubles producidos en consecuencia. Entre éstos, los leucocitos, especialmente los linfocitos, juegan un papel clave. Los linfocitos están clasificados en dos tipos principales, linfocito B (el cual puede ser referido posteriormente en este documento como célula B) y linfocito T (el cual puede ser referido posteriormente en este documento como célula T) , los cuales reconocen ambos específicamente un antígeno y actúan sobre el antígeno para proteger al cuerpo vivo. En la periferia, las células T están constituidas principalmente de células T CD4 que tienen el marcador CD (Agrupación de Diferenciación) 4 y células T CD8 que tienen el marcador CD8. Una mayoría de las células T CD4 es referida como una célula T ayudante (referida posteriormente en este documento como TH) , implica la asistencia en la producción de anticuerpos e inducciones de varias respuestas inmunes y se diferencia en Thl o Th2 que es diferente en la clase de una citocina producida por la estimulación de antígeno. Una mayoría de las células T CD8 se diferencian en células T citotóxicas (Tc: linfocito T citotóxico, también referido como célula T eliminadora, la cual puede ser referida posteriormente en este documento como CTL) , exhibiendo una actividad citotóxica por la estimulación de antígenos. Por ejemplo, en la condición patológica del cáncer, la inmunoterapia ha provocado un interés en años recientes, como una cuarta terapia después de la cirugía, quimioterapia y radioterapia. Puesto que la inmunoterapia utiliza la inmunocompetencia poseída inherentemente por un humano, se dice que una carga física sobre un paciente causada por la inmunoterapia es ligera en comparación con aquella causada por otras terapias. Como la inmunoterapia, se ha conocido una terapia que incluye el paso que consiste en transferir células activadas por linfocinas obtenidas por la expansión de CTLs o linfocitos de sangre periférica inducidos ex vivo o similares de acuerdo con varios métodos, células NKT, células ?dT o similares; una terapia de transferencia de células dendríticas o una terapia de vacunas peptídicas por medio de la cual se espera una inducción de CTLs específicos para antígenos in vivo; terapia de células Thl; terapia de genes inmunes que incluye además el paso que consiste en transducir un gen para el cual se pueden esperar varios efectos para las células mencionadas anteriormente ex vivo y transferir una célula transducida al cuerpo; y similares. La fibronectina es una glicoproteína gigantesca I que tiene un peso molecular de 250 mil, la cual existe en la sangre de un animal, sobre la superficie de una célula cultivada o en una matriz extracelular de un tejido y se ha sabido que tiene varias funciones. Una estructura de dominio de la misma se divide en siete porciones (Figura 1 y las que siguen) , en donde tres clases de secuencias similares están contenidas en una secuencia de aminoácidos de la misma, las repeticiones de cada una de estas secuencias constituyen la secuencia completa. Tres clases de las secuencias similares son referidas como tipo I, tipo II y tipo III. Entre éstos, el tipo III está constituido por 71 a 96 residuos de aminoácidos, en donde una identidad de estos residuos de aminoácidos es de 17 a 40%. En la fibronectina, existen catorce secuencias de tipo III, entre las cuales la 8a, 9a o 10a secuencia (cada una que es referida posteriormente en este documento como III-8, III-9 o III-10) está contenida en un dominio de enlace celular y la 12a, 13a o 14a secuencia (cada una que es referida posteriormente en este documento como 111-12, 111-13 o III-14) está contenida en un dominio de enlace a heparina. Además, una región de enlace a VLA (antígeno de activación muy tardía) -5 está contenida en 111-10 y su secuencia de núcleo es RGDS . Además, una región referida como IIICS existe en el lado C-terminal del dominio de enlace a heparina. Una región referida como CS-1 que consta de 25 aminoácidos y que tiene una actividad de enlace a VLA-4 existe en IIICS (por ejemplo, Publicaciones que no son Patentes 1 a 3) . Entre las inmunoterapias, en una terapia que incluye el paso que consiste en transferir células activadas con linfocinas obtenidas por la expansión de CTLs o linfocitos de sangre periférica inducidos ex vivo o similares de acuerdo con las acciones de IL-2 y un anticuerpo anti-CD3, con respecto a las desventajas tales como que tanto una actividad citotóxica se mantiene cuando los CTLs específicos para antígenos inducidos ex vivo se expanden, que tanto los linfocitos se pueden expandir de manera efectiva y similares, los presentes inventores ya han estudiado los efectos de utilizar fibronectina o un fragmento de la misma (por ejemplo, Publicaciones de Patentes 1 a 3) . En años recientes, se ha reportado que como linfocitos T utilizados en la inmunoterapia, en un caso donde se administran células T nativas o células T de memoria central en un estado más indiferenciado, un efecto terapéutico mucho más alto se puede esperar en la administración a un cuerpo vivo, preferiblemente que un caso donde se administran células T efectoras ya diferenciadas terminalmente (por ejemplo, Publicaciones que no son Patentes 4 y 5) . Además, también en una terapia de transferencia de células < dendríticas, una terapia de vacunas peptídicas o similares para la cual se espera la inducción de CTLs específicos para antígenos in vivo, se considera que son pocas las, células T nativas, los orígenes a partir de los cuales sé pueden inducir los CTLs, por ejemplo, en el cuerpo de un paciente con un cáncer progresivo; por lo tanto, no se puede esperar frecuentemente un efecto suficiente. Publicación que no es Patente 1: FIBRONECTIN, ACADEMIC PRESS INC., 1-8, realizada por Deane F. Momer, publicada en 1988 Publicación que no es Patente 2: Kimizuka F. y otros ocho, J. Biochem. , 1991, 110(2), 284-291 Publicación que no es Patente 3: Hanenberg H. y otros cinco, Human Gene Therapy, 1997, 8(18), 2193-2206 Publicación que no es patente 4: Gattinoni L. y otros nueve, J". Clin . Invest . , 2005, 115(6), 1616-1626 Publicación que no es Patente 5: Benigni F y otros diez, J.

I munol , 2005, 175(2), 739-748 Publicación de Patente 1: WO 03/016511 Publicación de Patente 2: WO 03/080817 Publicación de Patente 3: WO 2005/019450 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN PROBLEMAS A SER RESUELTOS POR LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para preparar una población de células T, la cual es efectiva en la administración a un cuerpo vivo .

MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS Una primera invención de la presente invención se refiere a un método para preparar una población de células T, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28; caracterizado porque el método incluye el paso que consiste en cultivar una población de células que contiene células T, en presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma. En la primera invención de la presente invención, los días de cultivo totales que incluyen el paso de cultivo se ejemplifican por de 4 a 14 días. También, se ejemplifica que el cultivo en presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma se lleva a cabo por lo menos al inicio del cultivo y además, es preferible que el cultivo se lleve a cabo por lo menos durante un día o más. Además, en la primera invención de la presente invención, se ejemplifica que el paso de cultivo en presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma se lleva a cabo en presencia de un ligando de CD3. También, el ligando de CD3 es ejemplificado por un anticuerpo anti-CD3. En la primera invención de la presente invención, el fragmento de fibronectina es ejemplificado por un polipéptido (m) que contiene por lo menos una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID Nos: 1 a 8 del Listado de Secuencias o un polipéptido (n) que contiene por lo menos una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución, supresión, inserción o adición de uno o el número plural de aminoácidos en cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores, en donde el polipéptido (n) tiene una función equivalente a aquella del polipéptido anterior (m) . También, el fragmento de fibronectina es ejemplificado por un polipéptido que comprende todas las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID Nos: 1 a 3 y 5 a 8 del Listado de Secuencias. Además, en la primera invención de la presente invención, también se ejemplifica el método de preparación que incluye además el paso que consiste en separar células que expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD45RA, CD62L, CCR7 , CD27 y CD28. Además, en la primera invención de la presente invención, también se ejemplifica el método de preparación que incluye además el paso que consiste en transducir un gen extraño dentro de la población de células. En el método de preparación, en la transducción del gen extraño, se puede utilizar un vector de retrovirus, un vector de adenovirus, un vector de virus adeno-asociado, un vector de lentivirus o un vector de virus de simio. Una segunda invención de la presente invención se refiere a una población de células T obtenida por medio del método de la primera invención de la presente invención, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de I CD62L, CCR7, CD27 y CD28. j Una tercera invención de la presente invención se refiere a un medicamento que contiene como ingrediente efectivo la población de células T obtenida por medio del método de la primera invención de la presente invención, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos . uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28. Una cuarta invención de la presente invención se refiere a un método para tratar o prevenir una enfermedad, que incluye el paso que consiste en administrar a un sujeto una cantidad efectiva de la población de células T obtenida por medio del método de la primera invención de la presente invención, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28. Una quinta invención de la presente invención se refiere al uso de la población de células T obtenida por medio del método de la primera invención de la presente invención, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28 en la manufactura de un medicamento. Una sexta invención de la presente invención se refiere a un método para preparar una población de células T, caracterizado porque el método incluye el paso que consiste en estimular la población de células T obtenida por medio del método de la primera invención de la presente invención, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28, con por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar un antígeno, una célula que ha presentado un antígeno, un antígeno, un ligando de CD3 , un ligando de CD28, una citocina, una quimiocina y una célula capaz de producir una citocina. Una séptima invención de la presente invención se refiere a una población de células T obtenida por medio del método de la sexta invención de la presente invención. Una octava invención de la presente invención se refiere a un medicamento que contiene como ingrediente efectivo la población de células T obtenida por medio del método de la sexta invención de la presente invención. Una novena invención de la presente invención se refiere a un método para tratar o prevenir una enfermedad, que incluye el paso que consiste en administrar a un sujeto una cantidad efectiva de la población de células T obtenida por medio del método de la sexta invención de la presente invención. Una décima invención de la presente invención se refiere al uso de la población de células T obtenida por medio del método de la sexta invención de la presente invención en la manufactura de un medicamento. Una undécima invención de la presente invención se refiere a un medicamento que contiene: (a) una preparación que contiene como ingrediente efectivo la población de células T obtenida por medio del método de la primera invención de la presente invención, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28 y (b) una preparación que contiene como ingrediente efectivo por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar un antígeno, una célula que ha presentado un antígeno, un antígeno, un ligando de CD3 , un ligando de CD28, una citocina, una quimiocina y una célula capaz de producir una citocina, en donde las preparaciones están contenidas en el medicamento como dos preparaciones separadas que se administran de manera simultánea o por separado. Una duodécima invención de la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad, caracterizado porque el método incluye los siguientes pasos (a) y (b) que consisten en: • (a) administrar a un paciente la población de células T obtenida por medio del método de la primera invención de la presente invención, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28; y (b) administrar a un paciente por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar un antígeno, una célula que ha presentado un antígeno, un antígeno, un ligando de CD3, un ligando de CD28, una citocina, una quimiocina y una célula capaz de producir una citocina.

EFECTOS DE LA INVENCIÓN De acuerdo con el método de preparación de la presente invención, se proporciona una población de células T que expresa CD45RA y que expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que, consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28. Una población de células obtenida por medio del método de preparación tiene una relación alta de células T las cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28, y es sumamente útil en un tratamiento de una enfermedad con terapia celular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [Figura 1] una vista esquemática que muestra una estructura de dominio de fibronectina. [Figura 2] una gráfica que muestra una acción supresiva de formación de tumores de ratón por medio de la administración de células T.

MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La presente invención ha sido completada por los descubrimientos que, al incluir el paso de cultivo en presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma (la cual puede ser referida posteriormente en este documento como el ingrediente efectivo en la presente invención) , se obtiene una población de células que contiene una relación alta de células T las cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28. Casualmente, la población de células T la cual expresa CD45RA y la cual expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que, consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28 como se utiliza en este documento significa una población de células T que contiene en una relación alta células T las cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28. También, una relación alta en este documento significa que, cuando el cultivo se lleva a cabo en las mismas condiciones excepto por la presencia o ausencia del ingrediente efectivo en la presente invención, una relación de las células T las cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28 en una población de células T obtenida por medio de un cultivo en presencia del ingrediente efectivo en la presente invención es alta en comparación con aquella en el caso de la ausencia del ingrediente efectivo en la presente invención. Es preferible que la población de células T contenga las células T mencionadas anteriormente en una relación más alta preferiblemente por 5% o más y más preferiblemente por 10% o más, en comparación con aquella en el caso de la ausencia del ingrediente efectivo en la presente invención. La relación de las células T las cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , ¡CD27 y CD28, en la población de células resultante, varía dependiendo de varias clases de factores ambientales, por ejemplo, diferencias individuales y condiciones físicas de una persona quien proporciona células utilizadas en la preparación de células T tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, por sus siglas en inglés) . Por lo tanto, es imposible definir incondicionalmente la "relación alta" mencionada anteriormente por un valor ,numérico. También, la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención, significa una población que contiene células T y células diferentes de células T, por ejemplo, otros linfocitos tales como células NK y se puede contener un componente de hematocito diferente de los linfocitos . La presente invención será explicada concretamente más adelante . (1) Fibronectina y un Fragmento de la misma Utilizados en la Presente Invención. La fibronectina y un fragmento de la misma descritos en este documento pueden ser cualquiera de aquellos obtenidos de la naturaleza o aquellos sintetizados artificialmente. La fibronectina y un fragmento de la misma se pueden preparar en una forma sustancialmente pura a partir de una sustancia de, origen natural, en base a la descripción, por ejemplo, de Ruoslahti E. y colaboradores [J. Biol . Chem. , 256(14), 7277-7281 (1981)]. En este punto, el término "fibronectina sustancialmente pura o un fragmento de fibronectina" descrito en este documento significa que esa fibronectina y un fragmento de fibronectina no contienen esencialmente otras proteínas que existen junto con la fibronectina en la naturaleza. Cada uno de la fibronectina y un fragmento de la misma mencionados anteriormente se puede utilizar solo o en una mezcla de clases plurales en la presente invención. Casualmente, se sabe que existe un gran número de variantes de empalme de fibronectina. Como la fibronectina utilizada en la presente invención, se puede utilizar cualquier variante siempre y cuando se exhiban los efectos deseados de la presente invención. Por ejemplo, en el caso de la fibronectina derivada de plasma, se sabe que una región referida como ED-B presente corriente arriba de un dominio de enlace celular y una región referida como ED-A presente entre el dominio de enlace celular y el dominio de enlace a heparina son suprimidas. Esta fibronectina derivada de plasma también se puede utilizar en la presente invención. La información útil sobre los fragmentos de fibronectina que se pueden utilizar en la presente invención y la preparación de los fragmentos se puede obtener de Kimiduka F. y colaboradores [J". Biochem. , 110, 284-291 (1991)], Kornbrihtt A. R. y colaboradores [EMBO J. , 4(7), 1755-1759 (1985)], Sekiguchi K. y colaboradores [Biochemistry, 25(17), 4936-4941 (1986)] y similares.

Además, la secuencia de ácido nucleico que codifica la fibronectina o la secuencia de aminoácidos de fibronectina se da a conocer en el Acceso de GenBank No. NM_002026 y NP_002017. En la presente ¡ invención, el fragmento de fibronectina es ejemplificado por, por ejemplo, un polipéptido (m) que contiene por lo menos una secuencia de aminoácidos que contiene cualquiera de las regiones de III-8 (secuencia de aminoácidos , mostrada en la SEQ ID NO: 1 del Listado de Secuencias) , III-9 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NOs 2 del Listado de Secuencias) , 111-10 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 del Listado de Secuencias) , III-ll (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 del Listado de Secuencias) , III- 12 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 del Listado de Secuencias) , 111-13 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 del Listado de Secuencias) , 111-14 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 del Listado de Secuencias) y CS-1 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 del Listado de Secuencias) (véase la Figura 1) y un polipéptido (n) que contiene por lo menos una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución, supresión, inserción o adición de uno o un número plural de aminoácidos en cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, en donde él polipéptido (n) tiene una función equivalente a aquélla del polipéptido mencionado anteriormente (m) . La longitud del fragmento es, por ejemplo, en términos del número de aminoácidos, preferiblemente de 20 a 1000 y más preferiblemente de 100 a 800. En este punto, el número plural en este documento es un concepto que incluye el número indefinido pero pequeño y es preferiblemente de 2 a 12, más preferiblemente de 2 a 10 y adicionalmente más preferiblemente de 2 a 8 , el cual se refiere posteriormente en este documento a lo mismo. Además, como el • fragmento, se puede utilizar preferiblemente un fragmento que tiene una actividad de adherencia celular y/o una actividad de enlace a heparina. La actividad de adherencia celular puede ser evaluada al someter a ensayo el enlace del fragmento (su dominio de enlace celular) utilizado en la presente invención a una célula utilizando un método conocido. Por ejemplo, el método mencionado anteriormente incluye un método de Williams D. A. y colaboradores [Nature, 352, 438-441 (1991)] . El método es un método para determinar el enlace de una célula a un fragmento inmovilizado en una placa de cultivo. Además, la actividad de enlace a heparina se puede evaluar al someter a ensayo el enlace del fragmento (su dominio de enlace a heparina) utilizado en la presente invención a heparina utilizando un método conocido. Por ejemplo, el enlace del fragmento a heparina se puede evaluar de la misma manera al utilizar heparina, por ejemplo, una heparina etiquetada en lugar de la célula en el método mencionado anteriormente de Williams D. A. y colaboradores . I Además, el fragmento de fibronectina es ejemplificado por un polipéptido seleccionado del grupo que consta de C-274 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID ?O: 9 del Listado de Secuencias) , H-271 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID ?O: 10 del Listado de Secuencias) , H-296 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID ?O: 11 del Listado de Secuencias) , CH-271 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID ?O: 12 del Listado de Secuencias) , CH-296 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13 del Listado de Secuencias) , C-CS1 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 14 del Listado de Secuencias) y CH-296Na (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 15 del Listado de Secuencias) . Cada uno de los fragmentos mencionados anteriormente CH-271, CH-296, CH-296Na, C-274 y C-CS1 es un polipéptido que tiene un dominio de enlace celular con una actividad de enlace a VLA-5. También, C-CS1, H-296, CH-296 y CH-296Na son polipéptidos que tienen CS-1 con una actividad de enlace a VLA-4. Además, H-271, H-296, CH-271, CH-296 y CH-296Na son polipéptidos que tienen un dominio de enlace a heparina. En este punto, el CH-296Na es un polipéptido que contiene una región del dominio de enlace celular a CS-1 de fibronectina derivada de plasma. En la presente invención, también se puede utilizar un fragmento en el cual cada uno de los dominios i anteriores es modificado. El dominio de enlace a heparina de la fibronectina está constituido por tres secuencias de tipo III (111-12, 111-13 y 111-14) . Un fragmento que contiene un dominio de enlace a heparina que tiene una supresión de una o dos de las secuencias de tipo III anteriores también se puede utilizar en la presente invención. Por ejemplo, los fragmentos pueden ser ejemplificados por CHV-89 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16 del Listado de Secuencias) , CHV-90 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 17 del Listado de Secuencias) y CHV-92 (secuencia de aminoácidos mostrada en la; SEQ ID NO: 18 del Listado de Secuencias) , los cuales son fragmentos en los cuales un sitio de enlace celular de la fibronectina (dominio de enlace a VLA-5: Prol239 a Serl515) y una de las dos secuencias de tipo III se enlazan o CHV-179 (secuencia de aminoácidos mostrada en la¡ SEQ ID NO: 19 del Listado de Secuencias) y CHV-181 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 20 del Listad de Secuencias) , los cuales son fragmentos en los cuales el sitio de enlace celular de la fibronectina y dos de las secuencias de tipo III se enlazan. CHV-89, CHV-90 y CHV-92 contienen 111-13, 111-14 y 111-12, respectivamente, y CHV-179 contiene 111-13 y 111-14 y CHV-181 contiene 111-12 y 111-13, respectivamente. Además, un fragmento que tiene una adición de un aminoácido adicional a cada uno de los fragmentos mencionados anteriormente se puede utilizar en la presente invención. Por ejemplo, el fragmento se puede preparar por la adición de un aminoácido deseado a cada uno de los fragmentos mencionados anteriormente. Por ejemplo, H-275-Cys (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21 del Listado de Secuencias) es un fragmento que tiene un dominio de enlace a heparina de la fibronectina y un residuo de cisteína en una G terminal.

El fragmento utilizado en la presente invención puede ser uno de aquellos que contienen un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución, supresión, inserción o adición de uno o el número plural de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que constituye el fragmento que contiene por lo menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la fibronectina de origen natural ejemplificada anteriormente, en donde el polipéptido tiene 1 una función equivalente a aquella del fragmento, siempre y cuando se obtengan los efectos deseados de la presente invención. Es preferible que la sustitución o similares de los aminoácidos se lleve a cabo a un grado que pueda cambiar las características fisicoquímicas y similares de un polipéptido dentro del intervalo en que se puede mantener la función inherente del polipéptido. Por ejemplo, es preferible que la sustitución o similares de los aminoácidos sea conservadora dentro del intervalo en que no sean cambiadas sustancialmeñte las características poseídas inherentemente por el polipéptido (por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga eléctrica, pK y similares) . Por ejemplo, es preferible que la sustitución de los aminoácidos sea sustituciones dentro de cada uno de los grupos de: 1. glicina, alanina; 2. valina, isoleucina, leucina; 3. ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; 4. serina, treonina; 5. lisina, arginina; 6. fenilalanina, tirosina y que la supresión, adición o inserción de aminoácidos sean la supresión, adición o inserción en los aminoácidos que tienen características similares a las características de las cercanías del sitio objetivo en el polipéptido ' dentro del intervalo en que no son cambiadas sustancialmente las características de las cercanías del sitio objetivo. I En este punto, cuando el fragmento utilizado en la presente invención se !ha obtenido por medio de una i técnica de ingeniería genética, en un caso donde, por ejemplo, el polipéptido se prepara utilizando Escherichia coli o similares como hospedante, la metionina en una N-terminal es suprimida algunas veces por el efecto de la metionina peptidasa o similares, derivada de Escherichia coli, y el polipéptido mencionado anteriormente también se puede utilizar en la presente invención. En otras palabras, un polipéptido que tiene uña supresión de metionina en una N-terminal de los polipéptidos mostrados en las SEQ ID NOs: I 15 y 21 del Listado de Secuencias también se puede utilizar preferiblemente en la presente invención. La sustitución o similares de los aminoácidos puede ser una de aquellas de origen natural que son causadas por una diferencia entre especies o individuos o puede ser una de aquellas inducidas artificialmente. La inducción artificial se puede llevar a cabo por medio de un método conocido y no está limitada particularmente. La inducción artificial se puede llevar a cabo al preparar, por ejemplo, un ácido nucleico dado que tiene una sustitución, supresión, adición o inserción de uno o un número plural de nucleótidos en el ácido nucleico que codifica la región mencionada anteriormente y el fragmento dado derivado de fibronectina de origen natural, de acuerdo con un método conocido, y utilizando el ácido nucleico, con lo cual se puede preparar un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución o similares en la secuencia de aminoácidos del polipéptido que constituye los fragmentos y similares, que tienen una función equivalente a aquella de la región mencionada anteriormente y el fragmento dado derivado de fibronectina de origen natural . Además, la frase "que tiene una función equivalente" se refiere en este documento a que una porción de las células T que expresan CD45RA y que expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28 en una población de células T obtenida al utilizar un polipéptido es más alta que aquella en una población de células T obtenida en ausencia del polipéptido, el cual es un- control comparativo. La acción mencionada anteriormente se puede confirmar apropiadamente de acuerdo con el método y similares descritos en los Ejemplos 1, 2 y 6 expuestos posteriormente. Además, como el fragmento que comprende un polipéptido que tiene la sustitución o similares de los aminoácidos, se prefiere un fragmento que tiene una actividad de adherencia celular y/o una actividad de enlace a heparina y también se prefiere un fragmento que tiene un dominio de CS-1. La actividad de adherencia celular y la actividad de enlace a heparina se pueden evaluar de acuerdo con los métodos mencionados anteriormente para determinar esas actividades . Como el fragmento que comprende un polipéptido que tiene la sustitución o similares de los aminoácidos, por ejemplo, también se puede utilizar en la presente invención un fragmento que tiene uno o más aminoácidos insertados como un conector , entre dos dominios diferentes. Casualmente, como la fibronectina, similarmente al fragmento mencionado anteriormente, se puede utilizar en la presente invención un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución, supresión, inserción o adición de uno o el número plural de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos del polipéptido de la fibronectina, en donde la relación de las células T que expresan CD45RA y que expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28 en una población de células T obtenida al utilizar el polipéptido es más alta que aquella en una población de células T obtenida en ausencia del polipéptido, el cual es un control comparativo. Además, como la fibronectina o el fragmento de la misma utilizados en la presente invención, siempre y cuando se obtengan los efectos deseados de la presente invención, se puede utilizar un polipéptido que tenga una homología de 50% o más, preferiblemente un polipéptido que tenga una homología de 70% o más, más preferiblemente un polipéptido que tenga una homología de, 90% o más y adicionalmente más preferiblemente un péptido que tenga una homología de 95% o más, con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que constituye la fibronectina o el fragmento de la misma, en donde el polipéptido que constituye la fibronectina o el fragmento de la misma tiene una función equivalente a aquella de la fibronectina de origen natural o el fragmento que contiene por lo menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la misma ejemplificado anteriormente. Casualmente, por ejemplo, DNASIS Pro Ver.2.6 (manufacturado por TAKARA BIO INC. se puede utilizar para el cálculo de la homología. Casualmente, el; fragmento de fibronectina utilizado mucho más preferiblemente en la presente invención incluye un polipéptido que contiene en la secuencia de aminoácidos la totalidad de III-8 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 del Listado de Secuencias) , III-9 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 del Listado de Secuencias) , 111-10 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 del Listado de Secuencias) , III-12 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 del Listado de Secuencias) , 111-13 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 del Listado de Secuencias) , III-14 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 del Listado de Secuencias) y CS-1 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 del Listado de Secuencias) , en otras palabras, un polipéptido que contenga un dominio de enlace a heparina, un dominio de enlace celular y CS-1 y más preferiblemente, el fragmento de fibronectina incluye el CH-296 mencionado anteriormente o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución, supresión, inserción o adición de uno o el número plural de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos del polipéptido que constituye el fragmento, que tiene una función equivalente a aquella del CH-296. Otro polipéptido de fibronectina utilizado preferiblemente en la presente invención incluye H-296, CH-271, H-271 y C-CS1, como se muestra en el Ejemplo 18 o 'polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución, supresión, inserción o adición de uno o el número plural de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos del polipéptido que constituye el fragmento, que tiene una función equivalente a aquella de esos polipéptidos. El fragmento de fibronectina descrito en este documento también se puede preparar como un fragmento de fibronectina recombinante a partir de un recombinante genético en base a, por ejemplo, la descripción de la especificación de Patente Norteamericana No. 5,198,423. Por ejemplo, cada uno de los fragmentos mencionados anteriormente de H-271 (SEQ ID NO: 10), H-296 (SEQ ID NO: 11), CH-271 (SEQ ID NO: 12) y CH-296 (SEQ ID NO: 13) y un método para obtener estos fragmentos se describen detalladamente en la especificación de esta patente. Además, el CH-296Na (SEQ ID NO: 15) y el método de preparación del mismo se describen en el documento WO 2005/019450. Además, el fragmento C-274 (SEQ ID NO: 9) mencionado anteriormente se puede obtener de acuerdo con el método descrito en la especificación de Patente Norteamericana No. 5,102,988. Además, el fragmento C-CSl (SEQ ID NO: 14) se puede obtener de acuerdo con el método descrito en la especificación de la Gaceta de Patente Japonesa No. 3104178. Cada uno de los fragmentos mencionados anteriormente de CHV-89 (SEQ ID NO: 16) , CHV-90 (SEQ ID NO: 17) o CHV-179 (SEQ ID NO: 19) se pueden obtener de acuerdo con el método descrito en la especificación de la Gaceta de Patente Japonesa No. 2729712. Además, el fragmento CHV-181 (SEQ ID NO: 20) se puede obtener de acuerdo con el método descrito en el documento WO 97/18318. El fragmento CHV-92 (SEQ ID NO: 18) se puede obtener por medio de una técnica de ingeniería genética utilizando un plásmido construido de manera convencional en base al plásmido descrito en las bibliografías por referencia a la especificación de la Gaceta de Patente Japonesa No. 2729712 y el documento WO 97/18318.' Estos fragmentos o fragmentos los cuales se pueden derivar de estos fragmentos de una manera convencional se pueden preparar al utilizar microorganismos depositados en the International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial I Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1- i chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón (Código postal 305- 8566) bajo los siguientes números de acceso o también se pueden preparar al modificar un plásmido llevado en cada organismo de acuerdo con uní método conocido. FERM BP-2264 (Escherichia coli que lleva un plásmido que codifica H-271, Fecha de Depósito: 30 de Enero de 1989) ; FERM BP-2800 (Escherichia coli que lleva un plásmido que codifica CH-296, Fecha de Depósito: 12 de Mayo de 1989) ; FERM BP-2799 (Escherichia coli que lleva un plásmido que codifica CH-271, Fecha de depósito: 12 de Mayo de 1989) ; FERM BP-7420 (Escherichia coli que lleva un plásmido que codifica H-296, Fecha de depósito: 12 de Mayo de 1989); FERM BP-1915 (Escherichia coli que lleva un plásmido que codifica C-274, Fecha de depósito: 17 de Junio de 1988); FERM BP-5723 (Escherichia coli que lleva un plásmido que codifica C-CSl, Fecha de depósito: 5 de Marzo de 1990) ; FERM BP-10073 (plásmido que codifica CH-296Na, Fecha de depósito: 23 de Julio de 2004) ; FERM P-12182 (Escherichia coli que lleva un plásmido que codifica CHV-89, Fecha de depósito: 8 de Abril de 1991) ; y FERM P-12183 (Escherichia coli que lleva un plásmido que codifica CHV-179, Fecha de depósito: 8 de Abril 8, 1991) . Puesto que la fibronectina es una glicoproteína gigantesca, no es necesariamente fácil en forma industrial y en la manufactura del medicamento para preparar y utilizar una proteína de origen natural. Además, puesto que la fibronectina es una proteína multifuncional, se pueden considerar algunas desventajas causadas por una región diferente de la región que exhibe el efecto por el método de la presente invención dependiendo de las condiciones de su uso. Por estas razones, es preferible que se utilice preferiblemente un fragmento de fibronectina y más preferiblemente un fragmento de fibronectina recombinante obtenido como se describiera anteriormente, en la presente invención, desde el punto de vista de disponibilidad, facilidad de manejo y seguridad. Además, es preferible utilizar el fragmento de fibronectina mencionado anteriormente, desde el punto de vista de la realización de un doblez de expansión alto. Además, el peso molecular del fragmento de fibronectina utilizado en la presente invención no está limitado particularmente y es preferiblemente de 1 a 200, kD, más preferiblemente de 5 a 190 kD y aún más preferiblemente de 10 a 180 kD. El peso molecular se puede determinar, por ejemplo, por medio de la electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida. En este punto, en la secuencia de aminoácidos del polipéptido que constituye el fragmento de fibronectina de la presente invención, la parte de la secuencia de aminoácidos diferente de aquella de la secuencia de aminoácidos del polipéptido que constituye un fragmento de fibronectina de origen natural es arbitraria y no está limitada particularmente, siempre y cuando la exhibición de los efectos deseados de ¡la presente invención no sea inhibida. ¡ (2) Método para Preparar la, Población de Células T El método para preparar una población de células T de la presente invención será explicado concretamente posteriormente en este documento. La presente invención es un método para preparar una población de células que contiene en una alta relación células T las cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28 y preferiblemente células T la cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L y CCR7. El ' método de la presente invención se caracteriza porque el método incluye el paso que consiste en cultivar una población de células que contienen células T, en presencia de la fibronectina mencionada anteriormente, un fragmento1 de la misma o una mezcla de la misma. ¡ CD45RA, CD62L, ?CR7 , CD27 y CD28 son todos marcadores de antígenos de superficie celular de linfocitos y se sabe que son expresados en células no diferenciadas tales como las células T nativas. En otras palabras, las células T las cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28, contenidas en una alta relación en una población de células obtenida por medio del método de preparación de la presente invención se pueden clasificar en células no diferenciadas antes de la diferenciación en células T de memoria, es decir, células tipo T naturales, en vista de un fenotipo de marcador de antígenos de superficie celular. Como se describe en las Publicaciones que no son patentes 4 y 5 mencionadas anteriormente, se describe que las células T nativas tienen una alta proporción de supervivencia, alto efecto de proliferación celular, alto efecto de acumulación para un tumor, alta productividad de células efectoras específicas para tumores, en un cuerpo vivo, cuando las células T nativas se administran al cuerpo vivo y que las células T nativas son útiles en el campo de la terapia celular. Además, como se muestra en el Ejemplo 3 expuesto posteriormente, la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención se convierte en células T activadas que producen una gran cantidad de IL-2, al estimular la población de células T por un anticuerpo anti-CD3 o un anticuerpo anti-CD28. También, como se muestra en el Ejemplo 4 expuesto posteriormente, puesto qué la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención muestra una quimiotaxis en respuesta a CCL21 que es una quimiocina y la población de células T también tiene la capacidad de emigrar al nodo linfático. Además, como se muestra en los Ejemplos 5 a 8 expuestos posteriormente, la estimulación de antígenos se aplica a la población de células T, con lo cual se inducen los CTLs que tienen actividades citotóxicas específicas para antígenos. Además, como se muestra en el Ejemplo 9 expuesto posteriormente, puesto que la población de células T muestra una alta viabilidad en presencia de una cantidad pequeña de IL-2 o la ausencia de la misma, en comparación con una población de células T preparada en ausencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma, se espera que la población de células T también muestre una alta viabilidad en un cuerpo vivo. De hecho, el Ejemplo 11 expuesto posteriormente muestra que en un caso donde la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presenté invención se administra a un ratón NOD/scid, en comparación con un caso que de la población de células T, preparada en ausencia de fibronectina, un fragmento \ de la misma o una mezcla de la misma, las células T tienen una alta proporción de injerto al bazo y también tienen un alto porcentaje de viabilidad. Además, el Ejemplo 11 también muestra que, puesto que la población de células T administrada también causa una reacción de GVHD, se inducen células que tienen altas actividades citotóxicas. En vista de lo anterior, la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención no solo tiene el fenotipo del marcador de antígenos de superficie celular, sino también una función adecuada para el uso en el campo de la terapia celular, poseída por las células T nativas. Sin embargo, sorprendentemente, como se muestra en el punto (4) del Ejemplo 7, punto (2) del Ejemplo 8, punto (4) del Ejemplo 15 y punto (2) del Ejemplo 16, los CTLs inducidos de una población de células T obtenida al sujetar adicionalmente la población de células T preparada de acuerdo con el método mencionado anteriormente al paso de separación de una población de células que expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 y CD28 mencionados posteriormente tienen altas actividades citotóxicas y también tienen altas capacidades para reconocer un antígeno específico, en comparación con aquellos de células T nativas obtenidas de PBMCs y células T que muestran el fenotipo similar obtenido en ausencia del ingrediente efectivo en la presente invención. En otras palabras, la población de células T obtenida por medio de los procedimientos de separación mencionados anteriormente tiene una acti idad citotóxica significativamente alta con la diferenciación en CTLs, en comparación con aquellas de células T nativas normales. En este respecto, la población de células T mencionada anteriormente es una población de células que contiene células tipo T naturales novedosas que tienen características más efectivas, las cuales son diferentes de las células T nativas. Los efectos terapéuticos altos de la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionado anteriormente se puede esperar similarmente que sean exhibidos en las células tipo T naturales tanto CD8+ como CD4+. Además, como se describe en la Publicación de Patente 2 mencionada anteriormente, la expansión de células T se lleva a cabo en presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma, con lo cual se puede realizar una velocidad de proliferación muy alta. Por lo tanto, la población de células T obtenida por medio del método de la presente invención es sumamente adecuada para el uso en el campo de la terapia celular. I La población de células que contiene células T utilizadas en el método de preparación de la presente invención es ejemplificada1 por PBMCs, células T nativas, células T de memoria, células madre hemopoyéticas, células mononucleares de sangre del cordón umbilical y similares. Además, siempre y cuando las células sean hematocitos, las células se pueden utilizar en la presente invención. Se puede utilizar cualquiera de estas células las cuales se recolectan de un cuerpo vivo o se pueden utilizar directamente las células las cuales se obtienen por vía de un cultivo ex vivo, por ejemplo, de la población de células T obtenida por medio del método de la presente invención o se pueden utilizar aquellas las cuales han sido sujetadas a un almacenamiento congelado. Además, por ejemplo, también se puede utilizar una población de células obtenida por vía de varios procedimientos de separación de las células utilizadas en la preparación de la población de células T mencionada anteriormente obtenida de un cuerpo vivo, por ejemplo, cualquier población de células obtenida al separar células tales como PBMCs en células CD8+ o células CD4+. Ocasionalmente, en el método para preparar una población de células T de la presente invención, se puede utilizar un material que contiene i las células mencionadas anteriormente, por ejemplo, sangre tal como sangre periférica o sangre de cordón umbilical; una obtenida al retirar componentes tales como eritrocitos y plasma de la sangre; un fluido de médula1 ósea y similares. Es preferible que el método para preparar una población de células T de la presente invención se lleve a cabo en días de cultivo totales de preferiblemente cuatro a 14 días. En otras palabras, cuando los días de cultivo totales son de 4 a 14 días, es alta una relación de las células T las cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28 en la población de células T resultante, lo cual las hace sumamente adecuadas para el uso en el campo de la terapia celular. Ocasionalmente, cuando los días de cultivo totales son menos de 4 días, no se puede obtener el número satisfactorio de células para el uso en la inmunoterapia general. En la presente invención, los días de cultivo totales' son más preferiblemente de 5 a 14 días y aún más preferiblemente de 7 a 14 días . En el método para preparar una población de células T de la presente invención, es preferible que el cultivo se lleve a cabo , en presencia del ingrediente efectivo en la presente invención, de manera particularmente preferible , por lo menos en una etapa I temprana del período de cultivo completo. Es preferible que el cultivo en presencia del ingrediente efectivo en la presente invención se lleve ¡a cabo más preferiblemente por I lo menos al inicio del cultivo. El cultivo en presencia del ingrediente activo en la presente invención se puede llevar a cabo durante el período completo del período de cultivo o durante cualquier parte del período. En otras palabras, la presente invención comprende aquellas modalidades las i cuales incluyen el paso mencionado anteriormente en una parte de los pasos para ' preparar las células T. Es preferible que el cultivo en presencia del ingrediente efectivo en la presente invención se lleve a cabo durante un día o más, más preferiblemente durante 3 días o más y aún más preferiblemente durante 4 días o más, desde el inicio del cultivo. En la presente invención, la concentración de fibronectina, o un fragmento de la misma o una mezcla de la misma durante el cultivo no está limitada particularmente y es, por ejemplo, preferiblemente de 0.001 a 500 µg/mL y de manera particularmente preferible de 0.01 a 500 µg/mL. En la presente invención, es preferible que el cultivo en presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma se lleve a cabo en presencia de un ligando de CD3, desde el punto de vista de la estimulación de manera efectiva de un complejo de TCR-CD3 con células T para hacer proliferar las células. En la presente invención, un ligando de CD3 no está limitado particularmente, siempre y cuando una sustancia tenga una actividad de enlace a CD3 y se ejemplifique por, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, de manera particularmente preferible por un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y, por ejemplo, OKT3. La concentración de un ligando de CD3 en el medio no está limitada particularmente. Por ejemplo, en un caso donde se utiliza el anticuerpo monoclonal anti-CD3, la concentración es, por ejemplo, preferiblemente de 0.001 a 100 µg/mL y de manera particularmente preferible de 0.01 a 100 µg/mL. Además, en la presente invención, se puede agregar otro factor de co-estimulación tal como un ligando de CD28 para introducir la co-estimulación como la ocasión lo demande. Por ejemplo, se i ejemplifica un anticuerpo anti-CD28, CD80, B7-1, B7-2 y similares. El medio utilizado en el método para preparar una población de células T de la presente invención no está limitado particularmente y se puede utilizar un medio conocido que se prepara al mezclar componentes necesarios para expandir células T. Por ejemplo, un medio comercialmente disponible se puede seleccionar apropiadamente para utilizarse. Estos medios pueden contener citocinas, proteínas apropiadas y otros componentes además de los , constituyentes inherentes . Las citocinas son ejemplificadas por, por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IFN-? y similares , preferiblemente se utiliza un medio que contiene IL-2. La concentración de IL-2 en el medio no está limitada particularmente y es, por ejemplo, preferiblemente de 0.01 a 1 x 105 U/mL y más preferiblemente de 0.1 a 1 x 104 U/mL. También, las proteínas apropiadas son ejemplificadas, por ejemplo, por un anticuerpo anti-IL-4. También, además de lo anterior, se puede agregar un factor de : estimulación de linfocitos tal como lectina. La concentración del componente en el medio no está limitada particularmente, siempre y cuando se puedan obtener los efectos deseados. Además, en el cultivo, también se puede agregar suero y plasma al medio. Las cantidades de suero y plasma agregadas al medio no estás limitadas particularmente y son ejemplificadas por de 0% en volumen a 20% en volumen y las cantidades de suero y plasma utilizadas se pueden cambiar dependiendo de la etapa de, cultivo. Por ejemplo, se puede utilizar suero y plasma al disminuir gradualmente la I concentración de los mismos-. Ocasionalmente, el origen del suero o plasma puede ser ya sea autólogo (lo que significa que el origen es el mismo que aquel de la célula cultivada) o no autólogo (lo que significa que el origen es diferente de aquel de la célula cultivada) . Preferiblemente, se puede utilizar suero o plasma autólogo, desde el punto de vista de la seguridad. [ La preparación de¡ una población de células T de la presente invención se lleva a cabo usualmente en un medio que contiene componentes dados en presencia del ingrediente efectivo mencionado anteriormente en la presente invención. El número de células al inicio del cultivo utilizado en la presente invención no está limitado particularmente y se ejemplifica, por ejemplo, por preferiblemente de 1 célulá/mL a 1 x 108 células/mL, más preferiblemente de 1 célula/mL a 5 x 107 células/mL, aún más preferiblemente de 1 élula/mL a 2 x 107 células/mL. Además, las condiciones de cultivo no están limitadas particularmente y se pueden ¡ emplear las condiciones usuales I que se utilizan para el cultivo de células. Por ejemplo, i las células se pueden cultivar bajo las condiciones de 37°C en presencia de C02 al 5% y, similares. Además, el medio se puede diluir al agregar un medio fresco a la solución de cultivo de células, el medio se puede intercambiar o el equipo de cultivo de células se puede intercambiar, en intervalos apropiados . El equipo de cultivo de células utilizado en el método para preparar una -población de células T de la presente invención no estái limitado particularmente y se puede utilizar, por ejemplo, una caja de Petri, matraz, bolsa, baño de cultivo grande, biorreactor y similares. En este punto, como una bolsa, se puede utilizar una bolsa I permeable al gas de C02 para el cultivo de células. Además, en un caso donde las células T se producen en masa industrialmente, se puede utilizar un tanque de cultivo I grande. Además, el cultivo se puede llevar a cabo en ya sea un sistema abierto o un sistema cerrado. Preferiblemente, el cultivo se lleva a cabo en un sistema cerrado, desde el punto de vista de la seguridad de las células T resultantes. Ocasionalmente, el ingrediente efectivo en la presente invención, un ligando de CD3 , otro factor de co-estimulación y proteínas apropiadas, citocinas y otros componentes, contenidos en el medio mencionado anteriormente, se pueden disolver para estar co-presentes o los componentes anteriores se pueden inmovilizar en una fase sólida apropiada, por ejemplo, un equipo de cultivo de I células (que incluye cualquiera de aquellos de un sistema abierto y un sistema cerrado) , tal como una caja de Petri, un matraz o una bolsa o en un portador de cultivo de células tal como perlas, una membrana o un portaobjetos de vidrio y se pueden utilizar. Los materiales para esas fases sólidas no están limitados particularmente, siempre y cuando los materiales se puedan utilizar para el cultivo de células. Cuando los componentes se inmovilizan en, por ejemplo, el equipo mencionado anteriormente, es preferible inmovilizar una cantidad dada de cada componente en base a la cantidad del medio que se coloca en el equipo de manera que, con la colocación del medio en el equipo, el medio esté contenido en una proporción similar a aquella de una concentración deseada en el caso donde los componentes se disuelven en el medio y se utilizan. La cantidad de los componentes inmovilizados no está limitada particularmente, siempre y cuando se puedan obtener los efectos deseados. El portador mencionado anteriormente se utiliza al sumergir el portador en un medio de cultivo en el equipo de cultivo de i células durante el cultivo de células . Cuando los componentes mencionados anteriormente son inmovilizados en el portador mencionado anteriormente, es preferible inmovilizar una cantidad dada de cada componente en base a la cantidad del medio colocado en el equipo de manera que el medio esté contenido en una proporción similar a aquella de una concentración deseada con la colocación del portador en el medio, en el caso donde los componentes se disuelven en el medio y se utilizan. - La cantidad de los componentes inmovilizados no está limitada particularmente, siempre y cuando se puedan obtener los efectos deseados. Un método para inmovilizar el ingrediente efectivo en la presente invención, un ligando de CD3 y otro factor de co-estimulación1 en la fase sólida no está i limitado particularmente. , Por ejemplo, las sustancias I mencionadas anteriormente se pueden inmovilizar al ponerlas en contacto con la faise sólida en una solución amortiguadora apropiada. Además, con respecto a la inmovilización del fragmento de fibronectina en la fase sólida, la inmovilización también se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos en los documentos WO 97/18318 y WO 00/09168. ! Una vez que los diversos componentes mencionados anteriormente o el ingrediente efectivo en la presente invención se inmovilizan en la fase sólida, la población de células T se puede separar fácilmente del ingrediente efectivo o similares únicamente al separar la población de células T de la fase sólida después de que la población de células T se obtiene por medio del método de la presente invención, de manera que la contaminación de la población de células T con el ingrediente efectivo o similares se puede prevenir. También, el método de preparación de la presente invención puede incluir adicionalmente el paso que consiste en separar una población de células T que expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 y CD28, de la población de células T obtenida por medio de un cultivo en presencia del ingrediente efectivo en la presente invención. En otras palabras, la población de células T obtenida por medio del cultivo en presencia del¡ ingrediente efectivo en la presente invención como se describiera anteriormente contiene en una relación alta células T las cuales expresan I CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28. Por lo tanto, los procedimientos para separar células que expresan I por lo menos un marcador de antígenos de superficie seleccionado del grupo que consta de CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 y CD28 se llevan a cabo adicionalmente y con lo cual las células tipo T naturales o una población de células T que contiene aún más células tipo T naturales se pueden obtener de manera más efectiva. En este caso, las células T a ser separadas no están limitadas particularmente y son ejemplificadas, por ejemplo, por células que expresan CD45RA y son ejemplificadas preferiblemente por células que expresan CD45RA y que expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28 y más preferiblemente células que expresan CD45RA y CD62L y células que expresan CD45RA y CCR7. Los procedimientos de separación no están limitados particularmente y la separación se puede llevar a cabo de acuerdo con un método conocido, por ejemplo, por medio del uso de un clasificador de células, perlas magnéticas, columna o similares. Por ejemplo, cuando se separan las células que expresan CD45RA y CCR7 , la separación se puede llevar a cabo como se describe en el punto (3) del Ejemplo 3 expuesto posteriormente. Además, las células T preparadas por medio del método de la presente invención son clonadas, con lo cual las células T se pueden mantener como células T estables. También, la población de células T se cultiva adicionalmente de acuerdo :con el método de la presente invención o un método conocido, utilizando la población de células T obtenida por medio del método de la presente invención, con lo cual se puede obtener recientemente una población de células T. Además, la estimulación de antígenos o similares se aplica de acuerdo con un método conocido, por ejemplo, de la misma manera que los Ejemplos 5 a 8 expuestos posteriormente, utilizando la población de células T obtenida por medio del método de la presente invención, con lo cual se pueden preparar CTLs específicos para antígenos . La población de células T obtenida por medio del método de la presente invención contiene en una alta relación células T las cuales expresan CD45RA y las cuales expresan por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28, que son células T no diferenciadas como se mencionara anteriormente y la población de células T también contiene células T que tienen actividades citotóxicas dependiendo de la clase de células utilizadas en el cultivo. La actividad citotóxica de la población de células T también se puede evaluar por medio de una prueba conocida in vi tro . Puesto que la población de células T obtenida por medio de la presente invención contiene en una relación alta células tipo T naturales no diferenciadas, como se mencionara anteriormente, la población -de células T obtenida por medio del método de preparación , de la presente invención no muestra necesariamente una alta actividad citotóxica en el sistema de evaluación anterior. Las enfermedades para las cuales se administra la población de células T preparada por medio del método de la presente invención no están limitadas particularmente y son ejemplificadas, por ejemplo, por cáncer, leucemia, tumor maligno, hepatitis y enfermedades infecciosas causadas por un virus tal como influenza o VIH, una bacteria o un hongo, por ejemplo tuberculosis, MRSA, VRE y micosis establecida profundamente . Además, cuando un gen extraño se transduce adicionalmente en la misma como se describe posteriormente, los efectos también se pueden esperar para varias enfermedades genéticas. La población de células T preparada por medio del método de la presente invención también se puede utilizar para la infusión de linfocitos de donador y similares con el propósito de prevención de una enfermedad i infecciosa después del transplante de médula ósea o irradiación de rayos X ¡ y la remisión de leucemia recurrente . Además, la presente invención proporciona una población de células T obtenida por medio del método para la preparación de una población de células T de la presente invención mencionado anteriormente, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que [ consta de CD62L, CCR67, CD27 y CD28. Además, la presente invención proporciona un medicamento (agente terapéutico) que contiene la población de células T como un ingrediente efectivo. El agente terapéutico mencionado anteriormente que contiene la población de células T se utiliza de manera adecuada en la inmunoterapia. En la inmunoterapia, las células T adecuadas para tratar a un paciente se administran al paciente, por ejemplo, por medio de un método de administración tal como intravenoso, intra-arterial, subcutáneo o intraperitoneal por medio de la inyección o goteo. El agente terapéutico es muy útil para el uso en las enfermedades mencionadas anteriormente y la infusión de linfocitos de donador. El agente terapéutico se puede, preparar como gotas o como una inyección, por ejemplo, al combinar la población de células T preparada por medio del método de la presente invención como un ingrediente efectivo con, por ejemplo, un portador orgánico o inorgánico conocido que es adecuado para la administración parenteral, un excipiente, un agente de estabilización y similares, de acuerdo con un método conocido en el campo farmacéutico. Casualmente, la cantidad de la población de células T de la presente invención contenida en el agente terapéutico, la dosis del agente terapéutico y las condiciones para el agente terapéutico se pueden determinar apropiadamente de acuerdo con la i inmunoterapia conocida. Por ejemplo, la cantidad de la población de las células T de la presente invención contenida en el medicamento no está limitada particularmente y, por ejemplo, es ejemplificada por preferiblemente de 1 x 10 a 1 x 10 células/mL, más preferiblemente de 1 x 10 a 1 x 10 células/mL y aún más preferiblemente de 1 x 10 a 1 x 109 células/mL. También, la dosis del medicamento de la presente invención no está limitada particularmente y es ejemplificada, por ejemplo, por preferiblemente de 1 x 106 a 1 x 1012 células/día, más preferiblemente de 1 x 107 a 5 x 1011 células/día y aún más preferiblemente de 1 x 108 a 2 x ÍO11 células/día, por adulto al día. Además, una inmunoterapia por el agente terapéutico se puede utilizar en combinación con una farmacoterapia o radioterapia conocida por medio de la administración de un fármaco o una terapia por medio de cirugía. El método para preparar una población de células T de la presente invención puede incluir además el paso que consiste en transducir un gen extraño en las células T. En otras palabras, una modalidad de la presente invención proporciona un método para preparar una población de células T que incluye además el paso que consiste en transducir un gen extraño en células T. En este punto, el término "gen extraño" significa un gen el cual es transducido artificialmente en células T dentro de las cuales se debe transducir un gen y también comprende un gen derivado de la misma especie como aquel del cual se derivan las células T en las cuales se debe transducir un gen. Al llevar a cabo el método para preparar las células T de la presente invención, se mejora la capacidad para la proliferación de células T cultivadas. Al combinar el método para preparar las células T de la presente invención con el paso que consiste en transducir un gen, se espera un incremento en la eficiencia de transducción de genes . Un medio para transducir un gen extraño no está limitado particularmente y un método apropiado se puede seleccionar de métodos conocidos para transducir un gen a utilizarse. El paso que consiste en transducir un gen se puede llevar a cabo en cualquier punto dado durante la preparación de una población de células T. Por ejemplo, es preferible llevar a cabo el paso simultáneamente con o durante el curso de la preparación mencionada anteriormente de la población de células T o después del paso, desde el I punto de vista de eficacia de trabajo. Como el método ! mencionado anteriormente para transducir un gen, cualquiera de los métodos que utilizan un vector viral y los métodos sin el uso del vector se pueden emplear en la presente invención. Los detalles de esos métodos ya han sido publicados en numerosas bibliografías. j El vector viral mencionado anteriormente no está limitado particularmente y se utiliza un vector viral I conocido que se utiliza ordinariamente en el método para i transducir un gen, por ejemplo, un vector retroviral, i vector lentiviral, vector adenoviral, vector viral adeno-asociado, vector viral de simio, vector viral de vaccinia, vector viral de sendai o similares. De manera particularmente preferible, como el vector viral se utiliza I un vector retroviral, vector adenoviral, vector viral i adeno-asociado, vector lentiviral o vector viral de simio.

Como el vector viral mencionado anteriormente son preferibles aquellos que carecen de capacidad de replicación de manera que el vector viral no puede autorreplicarse en una célula infectada. Además, con la transducción del gen, también se puede utilizar una i sustancia la cual mejora la eficiencia de transducción de genes, tal como RetroNectinMR (marca registrada, I manufacturada por TAKARA BIO INC) . El vector retroviral y el vector lentiviral se utilizan con el propósito de terapia génica o similares debido a que no se puede incorporar establemente un gen extraño insertado en los mis 1mos en el ADN cromosómico en la -célula en la cual se deben ¡transducir los vectores . Puesto I que los vectores tienen una eficiencia de infección alta para las células durante la división y proliferación, la transducción de genes se lleva a cabo preferiblemente en el paso de preparación en la presente invención. Como el método - para transducir un gen sin I utilizar un vector viral, por ejemplo, se puede utilizar un método que utiliza un portador tal como un liposoma o ligando-polilisina, método de fosfato de calcio, método de electroporación, método de -pistola génica o similares sin limitar la presente invención a los mismos. En este caso, se transduce un gen extraño incorporado en un ADN plásmido, ADN lineal o ARN. El gen extraño a ser transducido en las células T en la presente invención no está limitado particularmente y se puede seleccionar cualquier gen el cual es deseable que sea transducido en las célµlas mencionadas anteriormente. Como el gen descrito anteriormente, además de un gen que codifica una proteína (por ejemplo, enzimas, citocinas, receptores o similares) , por ejemplo, se puede utilizar un gen que codifica un ácido nucleico antisentido, ARNsi (ARN interférente pequeño) o una ribozima. Además, se puede transducir simultáneamente un gen marcador apropiado el cual permite la selección de células en las cuales se transduce un gen. El gen extraño mencionado anteriormente se puede insertar, por ejemplo, en un vector, un plásmido o similares, para ser expresado bajo control de un promotor apropiado y se puede utilizar. Además, a fin de lograr una transcripción eficiente de un gen, en un vector pueden existir otros elementos reguladores los cuales cooperan con un promotor o un sitio de inicio de trascripción, por ejemplo, una secuencia ;mejoradora o una secuencia terminadora. Además, con el propósito de insertar un gen extraño en un cromosoma de células T en las cuales se debe introducir el gen por medio de la recombinación homologa por ejemplo, un gen extraño se puede ordenar entre las secuencias flanqueadoras que comprenden secuencias de nucleótidos cada una que tiene homología con las secuencias de nucleótidos localizadas en ambos lados del sitio de inserción objetivo deseado del gen en el cromosoma. El gen extraño a ser transducido puede ser uno que es de origen natural o se puede generar artificialmente o puede ser uno -en el cual las moléculas ! de ADN que tienen diferentes I orígenes entre sí se enlazan por un medio conocido tal como la ligadura. Además, el gen extraño puede ser uno que tenga una secuencia en la cual se introduce una mutación en una secuencia de origen natural dependiendo de su propósito, De acuerdo con el método de la presente invención, por ejemplo, un gen que codifica una enzima asociada con la resistencia! a un fármaco utilizado para el tratamiento de un paciente con cáncer o similares se puede transducir en células T, proporcionando a las células T con lo cual resistencia a un fármaco. Si se utilizan las células T descritas anteriormente, la inmunoterapia y la I terapia de fármaco se pueden utilizar en combinación y, por lo tanto, se pueden obtener efectos terapéuticos más altos. El gen de resistencia a un fármaco es ejemplificado, por ejemplo, por un gen de resistencia a múltiples fármacos. Por otra parte, a la inversa de la modalidad mencionada anteriormente, ' un gen para proporcionar sensibilidad a un fármaco particular se puede transducir en células T, proporcionando a las células T con lo cual i sensibilidad al fármaco. En este caso, las células T después de ser transplantadas a un cuerpo vivo se pueden retirar al administrar el fármaco. El gen para proporcionar sensibilidad a un fármaco és ejemplificado, por ejemplo, i por un gen de timidina cinasa. I Otros genes a ser transducidos son ejemplificados por un gen que codifica un TCR que reconoce un antígeno de I superficie de células objetivo y un gen que codifica un receptor quimérico que tiene un sitio de reconocimiento de antígenos de un anticuerpo para el antígeno de superficie de células objetivo y que contiene una región intracelular de TCR (CD3 o similares) . La presente invención también proporciona un -método para tratar o prevenir una enfermedad, que incluye el paso que consiste en ' administrar a un sujeto una cantidad efectiva de la población de células T obtenida por medio del método mencionado anteriormente. El término "sujeto" como se utiliza enceste documento no está limitado particularmente y se refiere preferiblemente a un paciente con la enfermedad descrita anteriormente, al cual se administra la población de , células T preparada por medio del método de la presente invención.

Además, el término "cantidad efectiva" como se utiliza en este documento es una cantidad de la población de células T mencionada anteriormente que exhibe un efecto terapéutico o profiláctico, en un caso donde la población de células T se administra al sujeto mencionado anteriormente, en comparación con un sujeto al cual no se administra la población de células T. La cantidad efectiva específica se establece apropiadamente dependiendo de su forma de administración, método de administración, propósito de uso y edad, peso, síntoma o similares de un sujeto y no es constante. La población de células T se puede administrar preferiblemente en la misma cantidad efectiva que el medicamento mencionado anteriormente. El método de administración tampoco está limitado. Por ejemplo, la población de células T se puede administrar por medio del goteo, inyección o similares, de la misma manera que en el caso del medicamento mencionado anteriormente. Además, la presente invención también proporciona el uso de la población de células T mencionada anteriormente en la manufactura de un medicamento. El método para manufacturar el medicamento se lleva a cabo de la misma manera que aquel para el medicamento mencionado anteriormente. También, las enfermedades a las cuales se administra el medicamento no están limitadas particularmente y son las mismas que aquellas del medicamento mencionado anteriormente. Además, la presente invención puede preparar una población de células T activadas al estimular la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionado anteriormente, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28, con por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que - consta de una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un i antígeno, antígeno, ligando de CD3 , ligando de CD28, citocina, quimiocina y célula capaz de producir una citocina. Además, la presente invención proporciona la población de células T obtenida por medio del método de preparación mencionado anteriormente. La población de células T activadas objtenida como se describiera anteriormente se puede utilizar como un ingrediente efectivo de un medicamento, como con la población de células T obtenida por medio del método de preparación mencionado anteriormente. En este punto, el término "estimulación con un factor de estimulación" no está limitado particularmente, siempre y cuando la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionada anteriormente sea activada por un factor de estimulación y se ejemplifica, por ejemplo, por llevar a cabo un cultivo en la coexistencia de la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención y un factor de estimulación. La célula capaz de presentar un antígeno como se utiliza en este documento no está limitada particularmente, siempre y cuando una célula se utilice generalmente como una célula que presenta un antígeno y se ejemplifica, por ejemplo, por una célula dendrítica, célula ?dT, monocito, célula B, célula T, macrófago, fibroblasto, célula de Langerhans, una población de células que contiene por lo menos una célula de las células mencionadas anteriormente y que es ejemplificada de manera particularmente preferible por una célula dendrítica, célula ?dT, célula T, célula B, monocito, macrófago, una población de células que contiene por lo menos una célula de las células mencionadas anteriormente. Además el origen de la célula capaz de presentar un antígeno puede ser ya sea autólogo o no autólogo para un paciente al cual se administra la célula y se utiliza preferiblemente: una célula autóloga. En este punto, la célula capaz de presentar un antígeno como se utiliza en este documento significa una célula que es capaz de presentar un antígeno, pero que no presenta el antígeno. Como la célula que ha presentado un antígeno como se utiliza en este documento, se puede utilizar ya sea una célula en la cual un antígeno apropiado ha sido agregado artificialmente a la célula mencionada anteriormente capaz de presentar el antígeno o una célula que ya presenta un antígeno con la recolección de un cuerpo vivo. La célula que ha presentado un antígeno también se puede preparar de la misma manera que aquella descrita en el punto (5) del Ejemplo 5 expuesto posteriormente y se puede utilizar. En 1 este punto, la frase "célula capaz de presentar el antígeno" no está comprendida en el significado de la frase "célula que ha presentado un antígeno" . El antígeno como se utiliza en este documento no está limitado particularmente, siempre y cuando el péptido esté presente en una célula1 que presenta un antígeno y sea reconocido por células T de manera que las células T son activadas eficientemente. ¡Por ejemplo, el antígeno es ejemplificado por un péptido, glicopéptido, extracto de células tumorales, producto tratado con ultrasonido de i célula tumoral y producto tratado de manera hidrotérmica de célula tumoral, virus, bacteria, proteína y similares. Además, los ejemplos específicos de un ligando de CD3 y un ligando de CD28 son ejemplificados por un ligando de CD3 y un ligando de CD28 descritos anteriormente. En este punto, la población de células T la cual expresa CD45RA y la cual expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28, obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionado anteriormente es co-estimulada con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, como en el Ejemplo 3 expuesto posteriormente, con lo cual se puede preparar una población de linfocitos activados capaz de producir una citocina. La citocina como se utiliza en este documento no está limitada particularmente, siempre y cuando una citocina pueda actuar sobre! células T y pueda activar las células T. Por ejemplo, la1 citocina es ejemplificada por IL-2, IFN-?, TGF-ß, IL-15, IL-7, IFN-a, IL-12, CD40L, IL-27 y similares y es ejemplificada de manera particularmente preferible por IL-2, IFN-? e IL-12, desde el punto de vista de mejoramiento de una inmunidad celular. La quimiocina como se utiliza en este documento no está limitada particularmente, siempre y cuando una quimiocina actúe sobre células T y muestre actividad de emigración. Por ejemplo, la quimiocina es ejemplificada por RANTES, CCL21, MIP1 a, MIP1 ß, CCL19, CXCL12 , IP-10 y MIG. La célula capaz de producir una citocina como se utiliza en este documento no está limitada particularmente, siempre y cuando la célula sea capaz de producir la citocina mencionada anteriormente. Por ejemplo, la célula Thl se utiliza preferiblemente, desde el punto de vista de mejoramiento de una inmunidad celular.

Además, la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionada anteriormente contiene en una relación alta células tipo T nativas que no están diferenciadas y no son estimuladas por un antígeno. Por lo tanto, como el factor de estimulación utilizado en este documento, es particularmente preferible utilizar una célula capaz de presentar el antígeno, una célula que haya presentado un antígeno y/o un antígeno. Por ejemplo, como se muestra en el punto (5) del Ejemplo 5, punto (8) del Ejemplo 6, punto (2) del Ejemplo 7, punto (1) del Ejemplo 8, punto (7) del Ejemplo 14 y punto (2) del Ejemplo 15 expuestos posteriormente, la estimulación de antígenos se proporciona a la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionado anteriormente, con lo cµal se pueden inducir CTLs específicos para antígenos útiles que tienen actividades citotóxicas muy altas y también que tienen capacidades altas para reconocer un antígeno. Además, el cultivo se puede llevar a cabo en presencia de la fibronectina mencionada anteriormente, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma y un componente conocido que se utiliza en el cultivo de células T, además de los factores de estimulación mencionados anteriormente. La población de células T preparada como se describiera anteriormente es una población de células T muy útil que tiene efectos terapéuticos altos. La presente invención también proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad, que incluye el paso que consiste en administrar a un sujeto una cantidad efectiva de la población de células T activadas obtenida por medio del método mencionado anteriormente. Además, la presente invención también proporciona el uso de la población de células T activadas mencionada anteriormente en la manufactura de un medicamento. Un método para manufacturar el medicamento se lleva a cabo de la misma manera que aquella' para el medicamento mencionado anteriormente. También, las enfermedades a las cuales se administra el medicamento no están limitadas particularmente y son las mismas que aquellas del medicamento mencionado anteriormente. Además, la presente invención proporciona un medicamento que contiene: (a) una preparación que contiene como ingrediente efectivo la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionado anteriormente, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28; y (b) una preparación que contiene como ingrediente efectivo por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3, ligando de CD28, citocina, quimiociona y célula capaz de producir una citocina, en donde las preparaciones están contenidas en el medicamento como dos preparaciones separadas que se administran simultáneamente o por separado. Como se mencionara anteriormente, la población de células T obtenida por medio del método de la presente invención contiene en una relación alta células tipo T naturales. Por lo tanto, los factores de estimulación mencionados anteriormente se administran simultáneamente con o por separado de la población de células T a un paciente, con lo cual se pueden exhibir al máximo los efectos de la población de células T administrada y se pueden exhibir efectos terapéuticos más altos sobre las enfermedades. En este punto, como el factor de estimulación, es preferible uno que pueda proporcionar la estimulación de antígenos, en otras palabras, uno que se pueda utilizar como vacuna, por ejemplo, por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3 , ligando de CD28, citocina, quimiocina y célula capaz de producir una citocina y una célula capaz de presentar un antígeno, una célula que ha presentado un antígeno o un antígeno se utilizan más preferiblemente en la presente invención. Se puede preparar y formar en una preparación (a) una preparación que contiene como ingrediente efectivo la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionado anteriormente, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28 en el medicamento, de la misma manera que en el caso del medicamento que contiene la población de células T como un ingrediente efectivo como se mencionara anteriormente. Además, el contenido en el medicamento, la dosis y la forma de administración de la población de células T que expresa CD45RA y que expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28 no están limitados particularmente y pueden ser, por ejemplo, los mismos que aquellos para el medicamento que contiene la población de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionado anteriormente . Además, como (b) una preparación que contiene como ingrediente efectivo por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3, ligando de CD28, citocina, quimiocina y célula capaz de producir una citocina, en el medicamento, por ejemplo, se puede utilizar una formada en una preparación al combinar el factor de estimulación con un portador apropiado. También, como ejemplos específicos -de por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar! un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3 , ligando de CD28, citocina, quimiocina y célula capaz de producir una citocina, por ejemplo, 'se pueden utilizar los factores de estimulación ejemplificados anteriormente. Por ejemplo, cuando una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno o célula capaz de producir una citocina se utiliza como el factor de estimulación, una¡ preparación se puede formar al 1 combinar el factor de estimulación con un portador farmacéutico apropiado para el goteo o inyección sin i limitación particular. Además, cuando se utiliza un péptido I de antígeno, el péptido de ' antígeno se puede combinar con i un adyuvante apropiado sin limitación particular. También, cuando se utiliza una citocina o quimiocina, una preparación también se puede formar al incorporar la citocina o quimiocina en un1 liposoma por medio de un método i conocido. Además, como el contenido del factor de estimulación en la preparación se puede seleccionar apropiadamente dependiendo de la clase de factor de estimulación utilizado y no está limitado particularmente. Por ejemplo, cuando una célula capaz de presentar un antígeno, una célula que ha presentado un antígeno o una célula capaz de producir una citocina se utiliza como el factor de estimulación, el contenido es ejemplificado, por ejemplo, por preferiblemente de 1 x 103 a 1 x 109 células/mL, más preferiblemente de 1 x 103 a 1 x 108 células/mL y aún más preferiblemente de 1 x 104 a 1 x 107 células/mL. Además, la forma de administración del factor de estimulación se puede seleccionar apropiadamente dependiendo de la clase del factor de estimulación utilizado y no está limitada particularmente. Por ejemplo, el factor de estimulación se administra por medio de una administración intravenosa, administración intra-arterial, administración subcutánea, administración intraperitoneal, administración oral o similares. La dosis no está limitada particularmente, siempre y cuando la dosis sea efectiva para tratar o mejorar una enfermedad del paciente. Por ejemplo, cuando se administra una célula capaz de presentar un antígeno, la dosis es ejemplificada, por ejemplo, por preferiblemente de 1 x 103 a 1 x 1011 células/día, más preferiblemente de 1 x 103 a 1 x 1010 células/día y aún más preferiblemente de 1 x 104 a 1 x 109 células/día. También, cuando se administra un péptido de antígeno, la dosis es ejemplificada, por ejemplo,! por preferiblemente de 0.001 a i 100 mg/día, más preferiblemente de 0.003 a 30 mg/día y de manera particularmente preferible de 0.01 a 10 mg/día. Casualmente, como un ejemplo preferible de administración de la preparación (b) , por ejemplo, es preferible que una célula capaz de presentar un antígeno se combine con un antígeno para formarse en la preparación (d) i y se administre. Por ejemplo, es preferible que una célula dendrítica se combine con' un péptido de antígeno y se administre. En este caso, :el contenido y la dosis de la célula capaz de presentar un antígeno y el antígeno en la preparación se pueden implementar como se mencionara anteriormente . Además, las administraciones de la preparación I (a) y la preparación (b) en el medicamento se administran simultáneamente o por separado a un paciente. En este punto, el término "simultáneamente" significa que las preparaciones se administran a un paciente como preparaciones separadas simultáneamente en términos de tiempo o que la preparación (a) y la preparación (b) se mezclan antes de la administración a un paciente y se administran. Por ejemplo, en un caso donde la preparación (a) y la preparación (b) | se administran como gotas la I presente invención comprende una modalidad tal que las preparaciones anteriores : se mezclan antes de la administración y se administran a un paciente. Además, el término "por separado" significa que la preparación (a) y la preparación (b) se administran por separado en términos de tiempo. Los intervalos de administraciones de la preparación (a) y la preparación (b) no están limitados particularmente, siempre y, cuando una estimulación de un factor de estimulación contenido en la preparación (b) se proporciona a una población de células T contenida en la preparación (a) en el cuerpo del paciente. Preferiblemente, es preferible que la preparación (b) se administre después de que se administra la preparación (a) . También, el número de veces de administración tampoco está limitado particularmente y cada preparación se puede administrar una vez o en porciones divididas de varias veces. Además, la presente invención también proporciona un método para tratar una enfermedad, que incluye los pasos que consisten en (a) administrar a un paciente la población I de células T obtenida por medio del método de preparación de la presente invención mencionado anteriormente, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28 y (b) administrar a un paciente por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3 , ligando de CD28, citocina, quimiocina y célula capaz de producir una citocina. El método de tratamiento puede exhibir efectos terapéuticos muy altos, como se mencionara anteriormente. En este punto, como el factor de estimulación, es preferible uno que pueda proporcionar la estimulación de antígenos, en otras palabras, uno que se pueda utilizar como una vacuna, por ejemplo, por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3, ligando de CD28, citocina, quimiocina y célula capaz de producir una citocina y una célula capaz de presentar, una célula que ha presentado un antígeno o un antígeno se utilizan más preferiblemente en la presente invención. ¡ En el método de tratamiento, el paso que consiste en (a) administrar a un paciente la población de células T obtenida por medio del método de la presente invención no está limitado particularmente y se lleva a cabo, por ejemplo, al emplear la dosis y la forma de administración similares a aquellas en el método de administración del medicamento mencionado anteriormente. Además, el paso que consiste en (b) administrar a un paciente por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que consta de una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3 , ligando de CD28, citocina, quimiocina y célula capaz de producir -una citocina tampoco está . limitado particularmente y se puede llevar a cabo, por ejemplo, al emplear la dosis y la forma de administración similares a aquellas para el medicamento mencionado anteriormente. Además, los intervalos de administraciones del paso de (a) y el paso de (b) mencionados anteriormente se pueden implementar de la misma manera que en el caso del medicamento que contiene la preparación de (a) y la preparación de (b) mencionadas anteriormente, en otras palabras, no están limitados particularmente siempre y cuando una estimulación del factor de estimulación administrado por el paso de; (b) se agregue a una población de células T administrada por el paso de (a) en el cuerpo del paciente y se pueda llevar a cabo simultáneamente o por separado. Preferiblemente, ; es deseable que el paso de administración de (b) se lleve a cabo después del paso de administración de (a) . También, el número de veces de administración tampoco está ¡ limitado particularmente y cada preparación se puede administrar una vez o en porciones divididas de varias veces .

EJEMPLOS La presente invención será descrita más específicamente a continuación en este documento por medio de los Ejemplos, sin pretender limitar el alcance de la presente invención a los mismos. Ejemplo 1: Análisis de células T CD45RA+ CD62L* (1) Aislamiento y Almacenamiento de PBMCs El componente sanguíneo se recolectó de un donador individual normal humano, obtenido con consentimiento informado. El componente sanguíneo recolectado se diluyó dos veces con solución salina amortiguada con fosfato (referida en lo sucesivo como "PBS"), se colocó sobre una placa FicollMR (manufacturada por Amersham Bioscience) y se centrifugó a 600 x g durante 20 minutos. Las células mononucleares de sangre periférica (referidas en lo sucesivo como "PBMCs") en la capa intermedia se recolectaron con una pipeta y se lavaron. Las PBMCs recolectadas se suspendieron en una solución de almacenamiento de FBS al 90% (manufacturado por Cambrex Corporation) /DMSO al 10% (manufacturado por SIGMA) o una solución de almacenamiento de un volumen equivalente de CP- 1 (manufacturado por KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO. , LTD.) que contenía albúmina de suero humano al 8% (manufacturada por Baxter Limited, referida en lo sucesivo como "HSA") y medio RPMI 1640 (manufacturado por SIGMA) y 7i se almacenó en nitrógeno líquido. Durante la expansión de células T, estas PBMCs almacenadas se fundieron rápidamente en un baño de agua a 37°C y se lavaron con medio RPMI 1640 que contenía 10 µg/mL de DNaseMR (manufacturada por Calbiochem) . Después, el número de células vivas se calculó por medio del método de tinción con azul de tripano. Las células se sometieron a cada experimento. i (2) Inmovilización de Anticuerpo Anti-CD3 Humano y el Fragmento CH-296 ¡ Un anticuerpo anti-CD3 humano y un fragmento CH- 296 se inmovilizaron en un [ equipo de cultivo utilizado en el siguiente experimento. Concretamente, 1.9 mL cada uno de PBS que contenía un ' anticuerpo anti-CD3 humano (manufacturado por JANSSEN PHARMACEUTICAL K.K.) (concentración final: 5 µg/mL) se agregaron a una placa de cultivo de células de 12 pocilios (manufacturada por Becton Dickinson) . Con la adición, ] el fragmento CH-296 se agregó a un grupo con la adición de CH-296 para tener una concentración final de 25 µg/mL. Después de que ; estos equipos de cultivo se incubaron a temperatura ambiente durante 5 horas, los equipos de cultivo se almacenaron a 4°C hasta el uso. Inmediatamente antes del so, el PBS que contenía el anticuerpo y el CH-296 se retiró por medio de la aspiración de estos equipos de cultivo' y después cada pocilio se lavó dos veces con PBS y luego una vez con el medio RPMI 1640 y los equipos de cultivo se sujetaron a cada experimento. (3) Expansión de ¡la Población de Células T Las PBMCs las cuales se prepararon en el punto (1) del Ejemplo 1 se suspendieron en AIM-V (manufacturado por Invitrogen) que contenía suero AB humano al 1% (manufacturado por Cambrex) (referido en lo sucesivo simplemente como "AIM-V al 1%"), para tener una densidad de 1 x 106 células/mL, para preparar una suspensión de células. Después, el AIM-V al 1% se agregó a una placa inmovilizada con el anticuerpo anti-CD3 humano o una placa inmovilizada con el anticuerpo anti-CD3 humano y el CH-296, preparado en el punto (2) del Ejemplo 1, en un volumen de 2 -mL/cada pocilio, y la suspensión de células anterior se agregó al mismo en un volumen de 1 mL/cada pocilio. La IL-2 (PROLEUKIN, manufacturada por Chiron) se agregó al mismo I para tener una concentración final de 1000 U/mL y estas placas se sujetaron al cultivo a 37°C en C02 al 5% (día cero del cultivo) . En o después del cuarto día desde el inicio del cultivo, se llevó a cabo un subcultivo con un matraz de cultivo de células de 12.5 cm2 totalmente nuevo (manufacturado por Becton Dickenson) al cual no se inmovilizó nada utilizando AIM-V al 1% y la IL-2 se agregó al mismo para tener una concentración final de 500 U/mL (volumen del medio de cultivo: 6 mL) . Concretamente, el subcultivo se llevó a cabo a una densidad de 0.05 x 106 células/mL en el cuarto día desde el inicio del cultivo, a una densidad de 0.1 x 106 células/mL en el séptimo día y a una densidad de 0.15 x 106 células/mL en el décimo día. En el séptimo día, el décimo día y el decimocuarto día desde el inicio del cultivo, se contó el número de células vivas por medio del método de tinción con azul de tripano y un doblez de expansión se calculó al comparar el número de células contadas con el número de células al inicio del cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 1 Doblez de Expansión (veces) Día de 10° Día de 14° Día de Cultivo Cultivo Cultivo Control (Sin Inmovilización de ; x 14 x 257 x 2491 CH-296) CH-296 x 38 x 315 X 4387 Como se muestra en la Tabla 1, en el grupo en el cual se utilizó el equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de células T, las veces de expansión de la población de células T fueron altas en cualquier etapa del cultivo en comparación con aquellas del grupo de control. (4) Análisis de Células T CD45RA+ CD62L+ en Cada i Día de Cultivo i Las células preparadas en cada día de cultivo en el punto (3) del Ejemplo 1 se lavaron con PBS y luego con I PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (manufacturada por SIGMA, referida en lo sucesivo como "BSA") (referida en lo sucesivo como "BSA al 1%/PBS"). Las células se suspendieron en BSA al 1%/PBS y a las mismas se agregó como control negativo la IgGl de ratón etiquetada con FITC/lgGl de ratón etiquetada con RDl/IgGl de ratón etiquetada con PC5 (manufacturada por Beckmann Coulter) . Similarmente, se agregó el anticuerpo anti-CD62L humano de ratón etiquetado con FITC (manufacturado por SIGMA) /anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl (manufacturado por Beckmann Coulter) . Después de I que se agregó cada uno de los anticuerpos, las células se i incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron con BSA al 1%/PBS y luego se resuspendieron en PBS. Las células se sujetaron a la citometría de flujo (Cytomics FCSOOMR, manufacturada por I Beckmann Coulter) y se calculó un porcentaje de células T CD45RA+ CD62L+. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 ; Porcentaje de Células T CD45RA+ CD62L+ (%) 7o Día de 10° Día de 14° Día de Cultivo Cultivo Cultivo Control (Sin Inmovilización !29.1 39.8 37.8 de CH-296) CH-296 '48.9 73.8 51.3 Como se muestra eh la Tabla 2, en el grupo en el cual se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con el fragmento CH-296, se obtuvieron los resultados de la población de células T CD45RA+ CD62L+ más alta en las células T durante el cultivo, en comparación con aquellos del grupo de control en cualquiera del séptimo día, el décimo día y el decimocuarto día del cultivo. Se aclaró a partir de estos resultados que las células T se pueden expandir mientras que se incrementa el porcentaje de la población de células T CD45RA+ CD62L+ de la población de células T durante la expansión de los días 7 a 14 por la co-existencia del fragmento CH-296 en una etapa temprana de expansión. Ejemplo 2: Análisis de Células T CD45RA+ CCR7+ (1) Expansión de la Población de Células T Las PBMCs las cuales se prepararon en el punto (1) del Ejemplo 1 se suspendieron en AIM-V que contenía suero AB humano al 3% (referido en lo sucesivo simplemente como "AIM-V al 3%) para tener una densidad de 1 x 106 células/mL, para preparar una suspensión de células. Después, el AIM-V al 3% se i agregó a una placa inmovilizada con el anticuerpo anti-CD3 humano o una placa inmovilizada con el anticuerpo anti-CD3 humano y el CH-296, preparado en el punto (2) del Ejemplo l, en un volumen de 2 mL/pocillo y la suspensión de células anterior se agregó al mismo en un i volumen de 1 mL/cada pocilio. La IL-2 se agregó al mismo I para tener una concentración final de 1000 U/mL y estas placas se sujetaron al cultivo a 37°C en C02 al 5% (día cero de cultivo) . En el cuarto día después del inicio del cultivo, cada grupo se diluyó con suero AB humano al 1% AIM-V para tener una densidad de 0.075 x 106 células/mL (volumen de líquido: 6 mL) , la dilución se transfirió a un matraz de cultivo de células de 12.5 cm2 al cual no se inmovilizó nada y la IL-2 se agregó al mismo para tener una concentración final de 500 U/mL. La concentración del suero se determinó, asumiendo que, las PBMCs obtenidas de 30 mL de recolección de sangre se cultivaron en 10 L de un medio de I cultivo. El cultivo continuó y en el séptimo día, cada grupo se transfirió a un matraz de cultivo de células de 25 cm totalmente nuevo (manufacturado por Becton Dickenson) , al cual no se inmovilizó ¡ nada, utilizando un medio de cultivo (volumen de líquido: 12.6 mL) , preparado por medio de la dilución con suero AB humano al 0.05% AIM-V para I tener una densidad de 0.25 x 106 células/mL. A cada grupo se agregó IL-2 para tener una concentración final de 500 U/mL. En el undécimo día, \ cada grupo se transfirió a un matraz de cultivo de células de 25 cm2 totalmente nuevo al cual no se inmovilizó nada,, utilizando un medio de cultivo preparado por medio de la clilución con el suero AB humano AIM-V de la misma concentración en el suero que del séptimo i día para tener una densidad de 1.04 x 106 células/mL (volumen del líquido: 12.6 mL) . A cada grupo se agregó IL-2 I para tener una concentración final de 500 U/mL. En el I decimocuarto día del inicio del cultivo, el número de I células vivas se contó por ¡medio -del método de tinción con azul de tripano y un doblez de expansión se calculó al comparar el número de las células contadas con el número de las células al inicio del cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 3. ' Tabla 3 Concentración en Días de Doblez de el Suero (%) Cultivo Expansión (veces) Control (Sin Inmovilización 3 ? 1 ? 0.05 14 Días x 276 de CH-296) CH-296 3 ? 1 ? 0.05 14 Días x 688 Como se muestra en la Tabla 3, en el grupo en el cual se utilizó el equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de células T, las veces de expansión de las células T fueron altas en comparación con aquellas del grupo de control. En este momento, se ha aclarado que, el fragmento CH-296 se utiliza adecuadamente durante la expansión de células T y en este ejemplo, se ha aclarado que el fragmento CH-296 también se utiliza adecuadamente durante una expansión de 14 días de células T. (2) Análisis de' Células T CD45RA+ CCR7+ en Subconjuntos de Células T CD8+ y Células T CD8" después del Cultivo Las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 2 se lavaron con PBS y luego con BSA al 1%/PBS. Las células se suspendieron en ¡PBS que contenía BSA al 1% y a las mismas se agregó como control negativo IgGl de ratón etiquetada con FITC/lgGl dé ratón etiquetado con RDl/IgGl de ratón etiquetada con PC5, + IgGl de ratón etiquetada con ECD (manufacturada por Beckman Coulter) . Similarmente, el anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CCR7 humano de ratón etiquetado con FITC (manufacturado por R & D Systems) /anticuerpo anti-CD8 humano de ratón etiquetado con ECD (manufacturado por Beckmann Coulter) . Después de que se agregó cada uno de los anticuerpos, las células se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Durante el curso de la incubación, la mezcla de incubación se agitó suavemente cada diez minutos . Después de la incubación, las células se lavaron con BSA al 1%/PBS y se resuspendieron en PBS. Las células se sujetaron a la citometría de flujo y se clasificaron en una región de células T CD8+ y una región de células T CD8" por la actitud de tinción de CD8. Para cada población de células, se calculó el porcentaje de células T CD45RA+ CCR7+. Los resultados se muestran en las Tablas 4 y 5.

Tabla 4 Células T CD8+ Células T CD45RA+ CCR7+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) 11.9 CH-296 37.4 Tabla 5 Células T CD8" (Células T CD4+) Células T CD45RA" CCR7+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) 9.7 CH-296 35.0 Como se muestra en la Tabla 4, en el grupo en el cual se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con el fragmento CH-296, se obtuvieron los resultados de la población de células T CD45RA+ CCR7+ más alta en células T durante el cultivo, en comparación con aquellos del grupo de control. Este fenómeno fue el mismo aún en un caso donde se analizaron las células T CD8" (Tabla 5) , es decir una población de células de la cual la mayoría eran células T CD4+. Se aclaró a partir de estos resultados que la población de células T se puede expandir mientras que se incrementa el porcentaje de la población de células T CD45RA+ CCR7+ de las células T por la co-existencia del fragmento CH-296 en una etapa temprana de una expansión de 14 días. ¡ Ejemplo 3: Análisis de Capacidad de Producción de Citocina de Células T CD45RA+ CCR7+ y Células T CD45RA' I CCR7" en una Población de 'Células T Expandida Utilizando CH-296 (1) Expansión de la Población de Células T Las PBMCs la cuales se prepararon en el punto (1) del Ejemplo 1 se suspendieron en GT-T503 (manufacturado por TAKARA BIO, INC.) que contenía suero AB humano al 0.5% y HSA la 0.2% (referido en lo sucesivo simplemente como "GT-T503 al 0.5%") para tener una densidad de 0.25 x 106 células/mL, para preparar- una suspensión de células.

Después, el GT-T503 al 0.5% se agregó a una placa 1 inmovilizada con el anticuerpo anti-CD3 humano o una placa inmovilizada con el anticuerpo anti-CD3 humano y el CH-296, preparado en el punto (2) del Ejemplo 1, en un volumen de 0.5 mL/pocillo y la suspensión de células anterior se agregó al mismo en un volumen de 1 mL/pocillo. La IL-2 se agregó al mismo para tener una concentración final de 1000 U/mL y estas placas se sujetaron al cultivo a 37°C en C02 al 5% (día cero de cultivo) . En el cuarto día después del inicio del cultivo, el medio de cultivo de cada grupo se diluyó aproximadamente 8 veces con el GT-T503 al 0.5% y 6 mL de la dilución se transfirieron a un matraz de cultivo de células de 12.5 cm2 totalmente nuevo al cual no se inmovilizó nada y la IL-2 se agregó al mismo para tener una concentración final de 500 'U/mL. El cultivo se continuó y en el séptimo día el medio de cultivo de células de cada grupo se diluyó aproximadamente 4.2 veces con el GT-T503 al 0.5% y 12.6 mL de la dilución se transfirieron a un matraz de cultivo de células de 25 cm2 totalmente nuevo al cual no se inmovilizó nada. A cada grupo se agregó la IL-2 para tener una concentración final de 500 U/mL. En el décimo día, el medio de cultivo de células de cada grupo se diluyó aproximadamente 2 veces con GT-T503 al 0.5% que contenía I HSA al 0.2% y 12.6 mL de la dilución se transfirieron cada uno a un matraz de cultivo 'de células de 25 cm2 totalmente nuevo al cual no se inmovilizó nada. A cada grupo se agregó la IL-2 para tener una concentración final de 500 U/mL. En el decimocuarto día desde el inicio del cultivo, el número I de células vivas se contó por medio del método de tinción con azul de tripano y un doblez de expansión se calculó al comparar el número de células contadas con el número de células al inicio del cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 Doblez de Expansión (veces) Control (Sin Inmovilización de CH-296) x 172 CH-296 x 581 Como se muestra en la Tabla 6, en el grupo en el cual se utilizó el equipo de cultivo inmovilizado con CH- 296 en una etapa temprana de la expansión de la población de células T (referido en lo sucesivo como "el grupo CH-296"), el doblez de expansión de la población de células T fue alto en comparación con aquel del grupo de control. (2) Análisis de Células T CD45RA+ CCR7+ Las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 3 se tiñeron con cada anticuerpo y se analizaron de la misma manera que en el punto (4) del Ejemplo 1, con la condición de que las combinaciones de los anticuerpos fueron de la siguiente manera. Concretamente, la tinción se llevó a cabo con IgGl de ratón etiquetada con FITC/lgGl de ratón etiquetada con RDl/IgGl de ratón etiquetada con PC5 y anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CCR7 humano de ratón etiquetado con FITC. Las células teñidas se analizaron con un citómetro de flujo y se calculó un porcentaje de células T CD45A+ CCR7+. i Los resultados se muestran en la Tabla 7. ! Tabla 7 Células T CD45RA+ CCR7+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) , 21.2 CH-296 63.7 ! Como se muestra en la Tabla 7, en el grupo CH- 296, se obtuvieron los resultados de la población de i células T CD45RA+ CCR7+ más ¡alta en la población de células - T durante el cultivo, en comparación con aquellos del grupo de control . ¡ I (3) Aislamiento ^e Células T CD45RA+ CCR7+ y Células T CD45RA" CCR7" Después de la Expansión de la Población de Células T Las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 3 se tiñeron de la misma manera que en el punto (2) del Ejemplo 2 y después las células se lavaron con BSA al 1%/PBS y se suspendieron en el medio GT-T503. Las células se sujetaron a la clasificación con MofloMR (manufacturado i por DAKO DENMARK A/S) en células T CD45RA+ CCR7+ y células T ! CD45RA" CCR7" de células T CD8+ y similarmente en células T CD45RA+ CCR7+ y células T CD45RA" CCR7" de células T de CD8", i es decir una mayoría de las cuales fueron células T CD4+.

Además, las células teñidas' antes de la misma clasificación se sujetaron a la citometría de flujo y se clasificaron en una región de células T CD8¡+ y una región de células T CD8" de acuerdo con la actitud de tinción de CD8. Se calculó el i porcentaje de células T CD45RA+ CCR7+ para cada población de células . Los resultados se muestran en las Tablas 8 y 9. i Tabla 8 Células T CD8+ j Células T CD45RA+ CCR7+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) ¡ 15.9 CH-296 | 52.6 Tabla 9 Células T CD8" (Células T CD4+) Células T CD45RA+ CCR7+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) ¡ 5.4 CH-296 ! 34.0 Co o se muestra en la Tabla 8, con respecto a las células T CD8+, en el grupo CH-296, se obtuvieron los resultados de un porcentaje más alto de la población de células T CD45RA+ CCR7+ en una población de células T i después del cultivo, en comparación con aquellos del grupo de control. Este fenómeno fue el mismo aún en un caso donde se analizaron células T CD8" (Tabla 9) , es decir una población de células de la¡ cual la mayoría son células T CD4+. ¡ (4) Inmovilización de Anticuerpo Anti-CD3 Humano y Anticuerpo Anti-CD28 Humano Un anticuerpo anti-CD3 humano y un anticuerpo anti-CD28 humano se inmovilizaron en un equipo de cultivo utilizado en el siguiente experimento. Concretamente, 80 µL I de cada amortiguador de ac¡etato (pH 5.3) que contenía un anticuerpo anti-CD3 humano ¡ (2 µg/mL) se agregaron a una I placa de cultivo de células de 96 pocilios (manufacturada 1 por Becton Dickinson) . A la¡ misma se agregaron además 80 µL i cada uno de amortiguador de acetato que contenía anticuerpo anti-CD28 humano (manufacturado por DAKO DENMARK A/S) (20 µg/mL) . El anticuerpo anti-CD3 humano se agregó para tener una concentración final de 1 µg/mL y el anticuerpo anti- CD28 humano se agregó para tener una concentración final de µg/mL. Después de que' estos equipos de cultivo se incubaron a temperatura ambiente durante 5 horas, los 1 1 equipos de cultivo se almacenaron a 4°C hasta el uso. Inmediatamente antes del uso, el amortiguador de acetato que contenía el anticuerpo se retiró por medio de la aspiración de esos equipos de cultivo y después cada pocilio se lavó dos veces con PBS y una vez con el medio GT-T503 y los equipos de¡ cultivo se sujetaron a cada experimento. (5) Estimulación de Células Se ha sabido que las células T nativas y las células T de memoria central producen IL-2 en una gran cantidad con la estimulación con un antígeno en el cuerpo.

Además, se ha sabido que las células T de memoria efectora producen IFN-? o IL-4 en una gran cantidad con la estimulación con un antígeno. A fin de confirmar que cada i una de las fracciones de células obtenidas en el punto (3) I del Ejemplo 3 mantiene estas funciones, se determinó la capacidad de producción de ] citocina cuando se estimularon con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Se recolectó cada una de la población de células obtenida en el punto (3) del Ejemplo 3, las células entonces se suspendieron en el medio GT-T503 al 0.5% y el número de células se contó. Las células se agregaron a cada pocilio de la placa inmovilizado con el anticuerpo anti-CD3 humano y el anticuerpo anti-CD28 humano^ preparado en el punto (4) del Ejemplo 3 para tener una densidad de 2 x 105 células/0.2 mL y las células se cultivaron; a 37°C en C02 al 5%. Después de 24 horas, el sobrenadante del cultivo se recolectó y se utilizó para el experimento para la determinación de citocina de acuerdo con el método ELISA. (6) Determinación de Producción de Citocina de Acuerdo con el Método ELISA Como se muestra en el punto (3) del Ejemplo 3, en el grupo CH-296, se obtuvieron los resultados de un porcentaje más alto de las células T CD45RA+ CCR7+, en comparación con aquellos del grupo del control. A fin de confirmar que esta población de células T CD45RA+ CCR7+ mantiene su propiedad comq células tipo T naturales, se evaluó la capacidad de producción de citocina de las células T CD45RA+ CCR7+ y las células T CD45RA" CCR7" i aisladas después de la expansión de la población de células T. La producción de IL-2 o IFN-? se determinó con un Equipo i de Desarrollo ELISA (manufacturado por R & D Systems) y la producción de IL-4 se determinó con Interleucina-4 Humana READY-SET GO!MR (manufacturada por eBioscience) . Los 1 resultados de cada producción de citocina en el grupo de control y el grupo CH-206 ¡se muestran en las Tablas 10 y I 11, respectivamente.

Tabla 10 Control (Sin Inmovilización de CH-296) IL-2 (pg/mL) IFN-? (pg/ml_) IL-4 (pg/mL) Células T Células T CD45RA+ CCR7+ 286.7 568.0 30.5 CD8+ Células T CD45RA" CCR7" 104.9 1229.0 430.8 Células T Células T CD45RA+ CCR7+ 1539.4 107.9 113.9 CD8" Células T CD45RA" CCR7" 877.0 1200.0 1004.0 Tabla 11 Inmovilización de CH-296 IL-2 (pg/mL) IFN-? (pg/mL) IL-4 (pg/mL) Células T Células T CD45RA+ CCR7+ 174.4 251.3 < 0 CD8+ Células T CD45RA" CCR7" 44.9 526.3 58.1 Células T Células T CD45RA+ CCR7+ ; 1958.2 144.3 20.3 CD8" Células T CD45RA" CCR7" 611.0 587.5 727.3 Como se muestra en las Tablas 10 y 11, en el grupo de control y el grupo CH-296, se confirmó la producción de IL-2. En ambos grupos, las células T CD8" tuvieron una cantidad más grande de la producción de citocina que aquella de las células T CD8+ y las células T CD45RA+ CCR7+ tuvieron una cantidad más grande de la producción que aquella de las células T CD45RA" CCR7". Se mostró a partir de lo anterior que la población de células T CD45RA+ CCR7+ obtenida por; la expansión de la población de células T tuvo propiedades : como células tipo T naturales . Por otra parte, el IFN-? y la IL-4 se produjeron dominantemente en las células T CD45RA" CCR7" en tanto el grupo de control como el grupo CH-296, sugiriendo que la población de células T CD45RA" CCR7" es una población en la cual se mantiene la función de memoria efectora. Ejemplo 4: Análisis de Quimiotaxis de una Población de Células T Expandida utilizando CH-296 (1) Inmovilización de Anticuerpo Anti-CD3 Humano y Fragmento CH-296 La inmovilización se llevó a cabo de la misma manera que en el punto (2) del Ejemplo 1, excepto que el PBS que contenía un anticuerpo anti-CD3 humano (concentración final: 5 µg/mL) se agregó en un volumen de 0.45 mL cada uno. (2) Expansión de una Población de Células T Se llevaron a cab¡o los mismos procedimientos que aquellos del punto (1) del Ejemplo 3 excepto que en el cuarto día desde el inicio del cultivo, el medio de cultivo se diluyó aproximadamente 14 veces y se agregaron 10 mL de la dilución a un matraz dé cultivo de células de 25 cm2 totalmente nuevo (manufactµrado por Corning) , que en el octavo día en el inicio delj cultivo, el medio de cultivo se diluyó aproximadamente 2 veces y se agregaron 10 mL de la dilución a un matraz de 'cultivo de células de 25 cm2 totalmente nuevo (manufacturado por Corning) y que en el undécimo día desde el inicio del cultivo, 10 mL del medio GT-T503 que contenía HSA al 0.2% se agregaron a cada uno del matraz. Los resultados' de las veces de expansión se 1 muestran en la Tabla 12. I I Tabla 12 ' Doblez de Expansión (veces) Control (Sin Inmovilización de CH-296) x 414 CH-296 : x 646 Como se muestra en la Tabla 12, en el grupo en el cual se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH- i 296 en una etapa temprana d 1e la expansión de la población de células T (referido en ,1o suceeivo como "el grupo CH-296"), el doblez de expansión de la población de células T fue alto en comparación con aquel del grupo de control. (3) Análisis de Células T CD45RA+ CCR7+ i Para las células ,preparadas en el punto (2) del 1 Ejemplo 4, se calculó un porcentaje de células T CD45RA+ I CCR7+ de la misma manera qué en el punto (2) del Ejemplo 3. - Los resultados se muestran en la Tabla 13. ! I Células T CD45RA+ CCR7+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) ' 31.5 CH-296 56.8 Como se muestra en la Tabla 13, en el grupo CH- ? 296, se obtuvieron los resultados de una población de células T CD45RA+ CCR7+ más alta en la población de células T durante el cultivo, en comparación con aquel del grupo de control . (4) Análisis de Quimiotaxis En el grupo CH-296, se han obtenido los resultados de un porcentaje más alto de una población de células T CD45RA+ CCR7+, en comparación con aquel del grupo de control. Las células CCR7-positivas tales como las células T nativas y células T de memoria central muestran quimiotaxis en respuesta a -la quimiocina CCL21. Este es un evento importante para que esas células emigren de los vasos sanguíneos a los nodulos linfáticos y se confirmó si las células obtenidas después de la expansión tenían quimiotaxis en respuesta a ,CCL21. Las células obtenidas en i el punto (2) del Ejemplo 4 se centrifugaron, el -sobrenadante se retiró ¡y las células entonces se suspendieron en el medio RPMI 1640 que contenía BSA al 0.5% (mostrado en lo sucesivo como un medio de reacción) para tener una densidad de 5 x 106 células/mL. A una capa más baja de una placa TranswellMR (Transwell Polycarbonate, 24-pocilios, tamaños de poros 5 µm, manufacturada por Corning) se agregaron 600 µL de un ¡medio de reacción que contenía CCL21 (manufacturado por R & D Systems) a una concentración final de 1 µg/mL y se agregaron 100 µL de la suspensión de células preparada a la capa superior. Se determinó el I número de células que emigraron a la capa inferior después del cultivo a 37°C durante ] 2 horas y el número de células i que permanecían en la capa ' superior. El porcentaje de las células que indujeron la quimiotaxis se calculó a partir de la siguiente fórmula (1) : [Su 1] Porcentaje (%) de Células que Indujeron la Quimiotaxis = (Número de Células que Emigraron a la Capa Inferior + (Número de Células que Permanecían en la Capa superior + Número de Células que Emigraron a la Capa Inferior) ) x 100 Los resultados se muestran en la Tabla 14. Tabla 14 Porcentaje de Células que Indujeron - la Quimiotaxis (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) 43.2 CH-296 58.8 Como se muestra en la Tabla 14 , las células que mostraron quimiotaxis en respuesta a CCL21 se confirmaron I tanto en el grupo de control como en el grupo CH-296 y el porcentaje fue más alto para el grupo CH-296. En otras palabras, se aclaró que las : células que tenían la capacidad de emigración a los nodulos ; linfáticos se obtuvieron en una gran cantidad al utilizar :CH-296 con la expansión de la población de células T.

Ejemplo 5: Inducción de CTLs Anti-MART-1 de una Población de Células Expandida Utilizando CH-296 (1) Inmovilización de- Anticuerpo Anti-CD3 Humano y Fragmento CH-296 , Se llevaron a cabo los mismos procedimientos que en el punto (1) del Ejemplo!4. (2) Expansión de -una Población de Células T Se llevaron a cabo los mismos procedimientos que en el punto (2) del Ejemplo 4. Los resultados de las veces de expane ¡ion se muestran en la Tabla 15 .

Tabla 15 Doblez de Expansión (veces) Control (Sin Inmovi lización de CH-296) x 189 CH-296 x 387 Como se muestra en la Tabla 15, en el grupo en el cual se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH- 296 en una etapa temprana de la expansión (referido en lo sucesivo como "el grupo CH-296"), el doblez de expansión fue alto en comparación con ¡aquel del grupo de control. (3) Análisis de Células T CD45RA+ CCR7+ y CD45RA+ CD62L+ Las células preparadas en el punto (2) del Ejemplo 5 se tiñeron con cada anticuerpo y se analizaron de la misma manera que en el punto (4) del Ejemplo 1, con la condición de que las combinaciones de los anticuerpos fueran de la siguiente manera. Concretamente, la tinción se llevó a cabo con IgGl de ratón etiquetada con FITC/lgGl de ratón etiquetada con RDl (ambas manufacturadas por DAKO DENMARK A/S) , anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CCR7 humano de ratón etiquetado con FITC y anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CD62L humano de ratón etiquetado con FITC (en lo sucesivo el anticuerpo anti-CD62L humano que es un producto manufacturado por I eBioscience) . Estas células teñidas se analizaron con un citómetro de flujo y se calcularon los porcentajes de células T CD45RA+ CCR7+ y células T CD45RA+ CD62L+. Los resultados se muestran en la Tabla 16.

Tabla 16 Control (Sin Inmovilización con CH-296) CH-296 Células T CD45RA+ CD62L+ (%) ¡ 60.2 76.9 Células T CD45RA+ CCR7+ (%) 47.1 75.0 Como se muestra en1 la Tabla 16, en el grupo CH-296, se mostraron valores altos en ambos marcadores de superficie celular en comparación con aquellos del grupo de control. (4) Almacenamiento de Células Cultivadas Las células en el decimocuarto día del cultivo preparadas en el punto (2) del Ejemplo 5 se suspendieron en una solución de almacenamiento compuesta de volúmenes equivalentes de FBS al 90% DMSO al 10% o CP-1 que contenía HSA al 8% y medio RPMI 1640 y la suspensión se almacenó en nitrógeno líquido. Durante ¡la inducción de los CTLs, estas células cultivadas almacenadas se fundieron rápidamente en un baño de agua a 37°C y se: lavaron con medio RPMI 1640 que contenía 10 µg/mL de DNaseMR. Después, el número de células vivas se calculó por medio ¡ del método de tinción con azul i de tripano. Las células se sujetaron a cada experimento. (5) Inducción dé CTLs Específicos para un i Antígeno Asociado Antitumor ¡ (MART-1) 1 Utilizando las células preparadas en el punto (4) del Ejemplo 5, se llevó !a cabo la inducción de CTLs I específicos para un antígeno asociado antitumor (antígeno de melanoma reconocido por células T: MART-1) . La inducción de CTLs específicos para ¡un antígeno asociado antitumor (MART-1) se llevó a cabo¡ al modificar parcialmente un método de Plebanski M. y colaboradores [Eur. J. Immunol . , 25(6), 1783-1787 (1995)]. ' Concretamente, utilizando las PBMCs preparadas en el punto (1) del Ejemplo 1 como células que presentan un antígeno,- las PBMCs se incubaron en un I medio a RPMI 1640 que contenía sueros AB humano al 5% (referidos en lo sucesivo 'simplemente como "5HRPMI") que i contenían 40 µg/mL de péptido de epítopo derivado del antígeno de melanoma MART-1 (péptido de enlace HLA-A2.1 derivado del antígeno de melanoma MART-1 descrito en la SEQ ID NO: 22 del Listado de ;Secuencias) como un péptido de antígeno y 3 µg/mL de microglobulina ß2 (manufacturada por Scrips) , una mezcla de NEAA¡0.1 mM, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM (todos manufacturados por Cambrex) y 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina (manufacturado por MEIJI SEIKA KAISHA, LTD.) en una - incubadora de C02 al 5% a 37°C durante 2 horas. Después de la consumación de incubación, la mezcla se irradió con rayos X (1.42 C/kg) y la densidad se ajustó con el 5HRPMI a 3 ¡para 4 x 106 células/mL. Por otra parte, las células cultivadas preparadas en el punto (4) del Ejemplo 5 se suspendieron en 5HRPMI para tener una densidad de 2 x 106 células/mL y la suspensión se agregó a una ' placa de cultivo de células de 24 pocilios (manufacturada por Becton Dickenson) en un volumen de 0.5 mL/cada pocilio. A cada pocilio se agregaron a las células que presentan un antígeno preparadas por medio del método anterior ¡ en un volumen de 0.5 mL/cada pocilio e IL-7 (manufacturada por R & D Systems) y KLH (manufacturado por Calbiochem) se agregaron para tener una concentración final de 25 ng/mL y 5 µg/mL, respectivamente. La placa se cultivó en una incubadora de C02 al 5% a 37°C. En el primer día desde el inicio del cultivo, se agregó 1 mL de 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 a cada pocilio. En el cuarto día desde el inicio del cultivo, la mitad del volumen del sobrenadante de cultivo se retiró y se agregó 1 mL de 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 a cada pocilio. Además, en el séptimo día, ¡ las células que presentaban un antígeno se prepararon de la misma manera como antes y la mezcla entonces se irradió ; con rayos X (1.42 C/kg) y las células se prepararon para- tener una densidad de 4 x 106 células/mL y las células - se agregaron a una placa de cultivo de células de 24 pocilios totalmente nueva en un volumen de 0.5 mL/cada pocilio. Las células respondedoras sujetadas a un cultivo de una semana (una parte de las células continuó siendo cultivada para el ensayo de actividad citotóxica) se suspendieron en 5HRPMI, para tener una densidad de 1.8 a 2.0 x 106 células/mL y la suspensión se agregó a una placa similar en un volumen de 0.5 mL/cada pocilio. Además, la IL-7 se agregó a la misma para tener una concentración final de 25 ng/mL para estimular de ¡nuevo las células. En el octavo día desde el inicio del cultivo, se agregó 1 mL de 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 a cada pocilio. En el undécimo día desde el inicio de cultivo, las células en cada pocilio se suspendieron y se dividieron en dos pocilios a la mitad de volumen cada uno y se agregó 1 mL de 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 a cada pocilio y las células continuaron siendo cultivadas hasta el decimoquinto día. (6) Determinación de Doblez de Expansión En cuanto a las células obtenidas en el punto (5) del Ejemplo 5, en el séptimo día y el decimocuarto día desde el inicio del cultivo¡, se contó el número de células I vivas por medio del método de tinción con azul de tripano y I un doblez de expansión se calculó al comparar el número de células contadas con el número de células al inicio del cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17 ¡ Días de Cultivo Control (Sin¡ Inmovilización con CH-296 CH-296) Séptimo Día x 1.5 x 1.9 Decimocuarto Día ' x 6.0 x 8.4 Como se muestra en la Tabla 17, en la población de CTL inducida a partir del grupo CH-296, las veces de expansión de la población de CTL fueron altas en comparación con aquellas del grupo de control. En otras palabras, se aclaró que la población de CTL se podría obtener en una cantidad más grande al llevar a cabo la inducción de CTLs a partir de célula cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la población de células T. (7) Ensayo de Actividad Citotóxica La actividad citotóxica de los CTLs en el decimoquinto día desde el inicio del cultivo preparados en el punto (5) del Ejemplo 5 se evaluó por medio de un método para someter a ensayo la actividad citotóxica utilizando calceína-AM [Lichtenfels R: y colaboradores, J". Immunol . Methods 172(2), 227-239 (1994)]. Concretamente, las células T2 de una línea de células ¡restringida con respecto a HLA-A2.1 (ATCC CRL-1992) , las cuales se co-cultivaron durante toda la noche junto con ¡ un péptido de epítopo o se cultivaron en ausencia dé un péptido de epítopo, se I suspendieron en el medio RPMI 1640 que contenía FBS al 5% i para tener una densidad de í x 106 células/mL, y entonces se agregó calceína-AM (manufacturada por DOJINDO LABORATORIES) a las mismas para tener una concentración final de 25 µM y las células se cultivaron a 37°C durante 1 hora. Las células se lavaron con un medio que no contenía calceína-AM y después se obtuvieron las células objetivo etiquetadas con calceína. Las células objetivo etiquetadas con calceína se mezclaron con una cantidad 30 veces de células K562 (Human Science Research Resources Bank JCRB0019) , para proporcionar células para someter a ensayo la actividad citotóxica. En este punto, las células K56¡2 se utilizaron para excluir la actividad citotóxica no específica por células NK mezcladas en las células respondedoras. Los CTLs preparados en el punto (5) del Ejemplo 5 se diluyeron en serie con el 5HRPMI como células efectoras, para tener una densidad de 3 x 105 a 3 x 106 células/mL. Después, la dilución se suministró previamente a cada pocilio de una placa de cultivo de células de 96 pocilios en un volumen de 100 µL/cada pocilio y a estas placas se agregaron las células para someter a ensayo la actividad citotóxica en un volumen de 100 µL/cada pocilio preparada de manera que las células objetivo etiquetadas con calceína tuvieran una densidad de 1 x 105/mL. Con la determinación, la relación de las células efectoras (E) con respecto a las células objetivo etiquetadas con calceína (T) se expresa como una relación de E/T y las determinaciones se hicieron en relaciones de E/T de 30, 10 y 3. La placa que contenía la suspensión de células anterior se centrifugó a 400 x g durante 1 minuto y después las células se incubaron en una incubadora de C02 al 5% a 37°C durante 4 horas. Después, 100 µL del sobrenadante de cultivo se recolectaron de cada pocilio y la cantidad de calceína liberada en el sobrenadante de cultivo se determinó con un lector de placas de fluorescencia (espectrofluorómetro) (manufacturado por BERTHOLD TECHNOLOGIES) (excitado a 485 nm/medido a 538 o 535 nm) . La "Actividad Citotóxica Específica (%)" se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula (2) : [Su 2] ; Actividad Citotóxica Específica (%) = { (Valor Medido en Cada Pocilio — Cantidad Liberada Mínima) / (Cantidad* Liberada Máxima — Cantidad Liberada Mínima) } x 100 En la fórmula anterior, la cantidad liberada mínima es la cantidad de calceína liberada en el pocilio i que contenía solo células para someter a ensayo la actividad citotóxica, que muestra la cantidad de calceína liberada naturalmente de las células objetivo etiquetadas con calceína. Además, la¡ cantidad liberada máxima se refiere a la cantidad de, calceína liberada cuando las células se desestabilizaron- completamente por la adición de 0.1% del surfactante Tritón X-100MR (manufacturado por Nakalai Tesque Inc.) a la células para someter a ensayo la actividad citotóxica. Los resultados del ensayo de la actividad citotóxica se muestran en la Tabla 18.

Tabla 18 Células Objetivo EU Actividad Citotóxica (%) Control (Sin Inmovilización CH-296 de CH-296) T2 30 <0 <0 10 <0 <0 3 <0 <0 T2 + Péptido MART-1 30 62.0 87.2 10 29.1 60.1 3 9.2 26.3 Como se muestra én la tabla 18, en la población i de CTL inducida a partir del grupo CH-296, las actividades I citotóxicas específicas de la población de CTL fueron altas en comparación con aquellas- del grupo de control . En otras I palabras, se aclaró que las células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo' de cultivo inmovilizado con CH- 296 en una etapa temprana de la expansión de la población de células T se podría inducir a una población de CTL que i tenga una actividad citotóxica específica aún más alta. Ejemplo 6: MLR Alogénica e Inducción de CTLs i Anti-MART-1 de Población dé Células Expandidas Utilizando I una Bolsa de Cultivo Permeable al Gas Después de la Estimulación en una Etapa Temprana de CH-296 (1) Inmovilización de Anticuerpo Anti-CD3 y Fragmento CH-296 ¡ i Un anticuerpo anti-CD3 humano y un fragmento CH- i 296 se inmovilizaron en un i equipo de cultivo utilizado en el siguiente experimento. Concretamente, 9 mL cada uno de 1 I PBS que contenía un i anticuerpo anti-CD3 humano (concentración final: 5 µg/mL) se agregaron a un matraz de cultivo de célula de 75 ¡ cm2 (manufacturado por Becton Dickinson). Con la adición,* el CH-296 se agregó a un grupo con la adición de CH-296 para tener una concentración final de 25 µg/mL. > ' ! Después de que ¡estos equipos de cultivo se incubaron a temperatura ambiente durante 5 horas, los equipos de cultivo se almacenaron a 4°C hasta el uso. Inmediatamente antes del uso, el PBS que contenía el anticuerpo y el CH-296 se retiraron por medio de la aspiración de estos equipos de cultivo y después cada matraz se lavó dos veces con PBS y luego una vez con el medio RPMI y los equipos de cultivo se sujetaron a cada experimento . (2) Expansión de Población de Células T Las PBMCs las cuales se prepararon en el punto (1) del Ejemplo 1 se suspendieron en GT-T503 al 0.5% para tener una densidad de 0.5 x 106 células/mL, para preparar una suspensión de células. Después, el GT-T503 al 0.5% se agregó previamente a un matraz inmovilizado con el anticuerpo anti-CD3 humano o un matraz inmovilizado con el anticuerpo anti-CD3 humano y el CH-296, preparado en el punto (1) del Ejemplo 6, en un volumen de 21 mL/matraz y la suspensión de células anterior se agregó al mismo en un volumen de 9 mL/cada matraz. Se agregó IL-2 a los mismos para tener una concentración final de 1000 U/mL y estos matraces se sujetaron al cultivo a 37°C en C02 al 5% (día cero de cultivo) . En el cuarto día después del inicio del cultivo, 14 mL del medio de cultivo de cada grupo y 186 mL de GT-T503 al 0.5% se transfirieron a una bolsa de cultivo permeable al gas (200 cm2 manufacturada por TAKARA BIO, INC., código comercial :KB210) a la cual no se inmovilizó nada y la IL-2 se agregó adicionalmente a la misma para tener una concentración final de 500 U/mL. El cultivo continuó y en el octavo día, 100 mL del medio de cultivo de células de cada grupo se retiraron de la bolsa de cultivo, dejando 100 mL del medio de cultivo de células en la bolsa y el medio de cultivo restante se diluyó 2 veces con el GT-T503 al 0.5%, para constituir un volumen de 200 mL de la dilución de células en la bolsa. A cada grupo se agregó además IL-2 para tener cada uno una concentración final de 500 U/mL. En el undécimo día desde el inicio del cultivo, 200 mL del medio GT-T503 que contenía HSA al 0.2% se agregaron a los mismos para diluirse 2 veces con el medio de cultivo de células de cada grupo. A cada grupo se agregó además IL-2 para tener cada uno una concentración final de 500 U/mL. En el decimocuarto día desde el inicio del cultivo, el número de células vivas se contó por medio del método de tinción con azul de tripano y se calculó un doblez de expansión al comparar el número de células contadas con el número al inicio del cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19 Doblez de Expansión (veces) Control (Sin Inmovilización de CH-296) ¡ x 225 CH-296 i x 333 Como se muestra en la Tabla 19, aún en un caso donde las células se cultivaron en una bolsa de cultivo permeable al gas, en el grupo en el cual se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa i temprana de la expansión de la población de células T (referido en lo sucesivo como "el grupo CH-296"), el doblez de expansión de la población de células T fue alto en comparación con aquel del grupo de control . (3) Análisis de Células T CD45RA+ CCR7+, células T CD45RA+ CD62L+, células T CD45RA+ CD27+, células T CD45RA+ CD28+, células T CD27+ CD28+,y células T CD45RA+ CCR7+ CD62L+ en una Población de Células T Cultivada en una Bolsa de Cultivo Permeable al Gas . Las células preparadas en el punto (2) del Ejemplo 6 se tiñeron con cada anticuerpo y se analizaron de la misma manera que en el punto (4) del Ejemplo 1, con la condición de que las combinaciones de los anticuerpos fueran de la siguiente manera. Concretamente, la tinción se llevó a cabo con IgGl de ratón etiquetada con FITC/lgGl de ratón etiquetada con RDl/IgGl de ratón etiquetada con PC5, anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CCR7 humano de ratón etiquetado con FITC, anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CD62L humano de ratón etiquetado con PC5 (manufacturado por Beckmann-Coulter) , anticuerpo anti- CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CD28 humano de ratón etiquetado con FITC (manufacturado por eBioscience) , anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CD27 humano de ratón etiquetado con PC5 (manufacturado por Beckmann-Coulter) y anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CCR7 humano de ratón etiquetado con I FITC/anticuerpo anti-CD62L ¡humano de ratón etiquetado con PC5. Estas células teñidas ¡ se analizaron con un citómetro I de flujo y se calcularon ¡ los porcentajes de células T I CD45RA+ CCR7+, células T CD45RA+ CD62L+, células T CD45RA+ CD2D\ células T CD45RA+ CD28+, células T CD27+ CD28+ y células T CD45RA+ CCR7+ CD62L+. Los resultados se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20 Control (Sin Inmovilización de CH-296 CH-296) Células T CD45RA+ CCR7+ 24.4% 49.0% Células T CD45RA+ CD62L+ 40.2% 60.2% Células T CD45RA+ CD28+ 36.9% 63.0% Células T CD45RA+ CD27+ 46.3% 63.1 % Células T CD28+ CD27+ 58.9% 72.1% Células T CD45RA+ CCR7+ CD62L 23.0% 47.3% Como se muestra en la Tabla 20, en el grupo CH-296, un valor alto se muestra en cualquiera de los marcadores de superficie celular, en comparación con aquellos del grupo de control. Se ha sabido que CD27 y CD28 tienen altos porcentajes de expresión en células no diferenciadas tales como células T nativas. Por lo tanto, se aclaró que aún cuando se analizó con estos marcadores, el porcentaje de la población de células tipo T naturales se incrementó en la población de células T al permitir que CH-296 actuara en una etapa temprana del cultivo. (4) MLR Alogénica Una MLR alogénica se llevó a cabo utilizando las células preparadas en el punto (2) del Ejemplo 6.

Concretamente, las PBMCs, preparadas de la misma manera que en el punto (1) del Ejemplo 1 derivadas de un donador alogénico (donador no propio: un donador diferente del I donador utilizado en el punto (2) del Ejemplo 6) , se irradiaron con rayos X (¡0.88 C/kg) y las células se suspendieron con 5HRPMI para tener una densidad de 2 x 106 células/mL (células estimuladoras) . Por otra parte, las células cultivadas preparadas en el punto (2) del Ejemplo 6 se suspendieron en 5HRPMI para tener una densidad de 2 x i 106 células/mL (células respondedoras) . Las células estimuladoras y las células respondedoras preparadas se agregaron a una placa de cultivo de células de 24 pocilios en un volumen de 0.5 mL/cada pocilio. La IL-2 se agregó a cada pocilio para tener una concentración final de 500 U/mL y después las células en la placa se cultivaron en una incubadora de C02 al 5% a 37°C. En el tercer día desde el I inicio del cultivo, 1 mL de 5HRPMI que contenía 1000 U/mL ! de IL-2 se agregó a cada pocilio. En el quinto día desde el I inicio del cultivo, la mitad del volumen del sobrenadante i de cultivo se retiró y 1 mL de 5HRPMI que contenía 1000 i U/mL de IL-2 se agregó a cada pocilio. Además, en el séptimo día, las células en cada pocilio se suspendieron, la suspensión se dividió en dos pocilios de la mitad de I volumen cada uno, 1 mL de 5HRPMI que contenía 1000 U/mL de IL-2 se agregó a cada pocilio y el cultivo continuó hasta el décimo día. (5) Determinación del Doblez de Expansión En cuanto a las células obtenidas en el punto (4) del Ejemplo 6, en el séptimo día y en el décimo día desde el inicio del cultivo, el número de células vivas se contó por medio del método de tinción con azul de tripano y se calculó un doblez de expansión al comparar el número de i células contadas con el número de células al inicio del cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 21.

Tabla 21 Días del Donador de Células Células Respondedoras Cultivo Estimuladoras Control (Sin Inmovilización con CH-296 CH-296) Séptimo Día A x 1.7 x 2.7 B x 1.6 x 2.7 Décimo Día x 1.8 x 3.0 B x 2.1 x 2.7 Como se muestra en la Tabla 21, en un caso donde una MLR alogénica se llevó ', a cabo utilizando el grupo CH-296, el doblez de expansión ¡ después de la reacción fue alto en comparación con aquel del grupo de control. En otras palabras, se aclaró que cuando una MLR alogénica se llevó a cabo utilizando células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la población de células T, las células que reconocían a aloantígenos proliferaron en una cantidad aún más grande. (6) Ensayo de Actividad Citotóxica La actividad citotóxica de las células en el décimo día desde el inicio de la inducción, preparadas en el punto (4) del Ejemplo 6 se sometió a ensayo de la misma manera que en el punto (7) del Ejemplo 5. En este punto, como las células objetivo con la determinación, las PBMCs propias o PBMCs no propias las cuales se sujetaron a la blastogénesis (destrucción) ¡ con fitohemaglutinina (referida en lo sucesivo simplemente ¡como "PHA" ) durante 10 días se utilizaron como células objetivo etiquetadas con calceína. Durante el ensayo para la actividad citotóxica, se mezcló una cantidad de 30 veces de1 células K562 y células objetivo etiquetadas con calceína. Los resultados para el ensayo de I actividad citotóxica se muestran en la Tabla 22.

Tabla 22 ¡ Donador de Células Objetivo E/T Actividad Citotóxica (%) Células Control (Sin Inmovilización CH-296 Estimuladoras de CH-296) A Células no Propias 30 50.6 63.8 Destruidas con PHA ; 10 29.3 44.1 3 7 16.9 ¡ 30 < 0 < 0 Células Propias 10 < 0 < 0 Destruidas con PHA 3 < 0 < 0 B Células no Propias 30 2 266..66 6 600..11 Destruidas con PHA 10 9.1 38.0 < 0 13.0 Células Propias 30 < 0 < 0 Destruidas con PHA 10 < 0 < 0 3 < 0 < 0 Como se muestra en la Tabla 22, en un caso donde I la MLR alogénica se llevó a cabo utilizando el grupo CH-296, la actividad citotóxica específica para aloantígenos después de la reacción fue alta, en comparación con aquella del grupo de control. En otras palabras, en las células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la población de células T, se aclaró que se I podría obtener una población de células que tenía una actividad citotóxica específica para aloantígenos aún más potente por medio de la MLR alogénica. (7) Almacenamiento de Células Cultivadas Las células en el decimocuarto día del cultivo preparadas en el punto (2) del Ejemplo 6 se sujetaron a un almacenamiento congelado y se fundieron de la misma manera que en el punto (4) del Ejemplo 5. Las células se sujetaron a cada experimento. ¡ (8) Inducción de ¡ CTLs Específicos para Antígeno Asociado Antitumor (MART-1) ; Utilizando las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 1 y el punto (7) del Ejemplo 6, la inducción de CTLs específicos para un antígeno asociado antitumor (MART-1) se llevó a cabo de la misma manera que en punto (5) del Ejemplo 5 y el cultivo continuó durante trece días, con la condición de que las modificaciones se hicieran de la siguiente manera: Las características incluyen las células cultivadas preparadas en el punto (7) del Ejemplo 6 se suspendieron en 5HRPMI para tener una densidad de 1 x 106 células/mL; en el segundo día desde el inicio del cultivo, 1 mL de 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 se agregó a cada pocilio, en el sexto día desde el inicio del cultivo, las células respondedoras se suspendieron en 5HRPMI para tener una densidad de 0.3, a 1.3 x 106 células/mL y las células que presentaban un antígeno se suspendieron en las mismas para tener una densidad de 1.6 x 106 células/mL; y en el séptimo día desde el inicio del cultivo, 1 mL de 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 se agregó a cada pocilio y en el décimo día desde el inicio del cultivo, las células en cada pocilio se suspendieron y se dividieron en dos pocilios de la mitad de volumen cada uno y 1 mL de 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 se agregó a cada pocilio. (9) Ensayo de Actividad Citotóxica La actividad citotóxica de los CTLs en el decimotercer día desde el inicio de la inducción, preparados en el punto (8,) del Ejemplo 6 se sometió a ensayo de la misma manera que en el punto (7) del Ejemplo 5, excepto que se estableció de nuevo una relación de E/T de 90. Los resultados del ensayo de actividad citotóxica se muestran en la Tabla 23. ¡ Tabla 23 Células E/T Actividad Citotóxica (%) Objetivo PBMQs Control (Sin Inmovilización CH-296 de CH-296) T2 90 30.96 N.T. N.T. 30 9.13 23.04 15.78 10 2.42 ; 9.63 10.56 3 1.94 3.06 3.62 T2 + Péptido 90 59.49 N.T. N.T.

MART-1 30 41.37 25.46 87.53 10 25.29 8.85 77.21 3 7.75 11.26 56.18 N. T. : no sometido a prueba Como se muestra en la Tabla 23, en la población de CTL inducida a partir del grupo CH-296, la actividad citotóxica específica de la población de CTL fue alta, en comparación con aquella del' grupo de control y el grupo de PBMC. En otras palabras,; se aclaró que las células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la población de células T se podrían inducir a una población de CTL que tenga una actividad citotóxica específica aún más alta.

Ejemplo 7: Inducción de CTLs Anti-MART-1 a partir de Células T CD45RA* CCR7+ CD8+ y Células CD45RA' CCR7' CD8+ Derivadas de Células Expandidas (1) Aislamiento de Células T CD45RA+ CCR7+ CD8+ y Células T CD45RA" CCR7" CD8+ Las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 1 y aquellas preparadas en el punto (7) del Ejemplo I 6 se tiñeron de la misma manera que en el punto (2) del I Ejemplo 2. Después, las células se lavaron con BSA al 1%/PBS y se suspendieron e'n un medio IMDM (manufacturado I por Invitrogen) . Las células se sujetaron a un clasificador de células de alto desempeño Moflo y una fracción CD45RA+ CCR7+ CD8+ y una fracción CD45RA" CCR7" CD8+ se aislaron respectivamente, obteniendo con lo cual una fracción que tenía de 92 a 99% de pureza. (2) Inducción de CTLs Específicos para un Antígeno Asociado Antitumor ¡ (MART-1) Utilizando las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 7, la inducción de CTLs específicos para un antígeno asociado antitumor (MART-1) se llevó a cabo de la misma manera que en el punto (8) del Ejemplo 6 y el cultivo continuó durante trece días, con la condición de que las modificaciones se hicieran de la siguiente manera: Las características incluyen al inicio del cultivo, las células del inicio del cultivo y las células que presentaban un antígeno se agregaron en un volumen de 0.25 mL cada una a I una placa de cultivo de ¡48 pocilios (manufacturada por Becton Dickenson) ; y en el segundo día desde el inicio del cultivo, 0.5 mL de 5HRPMI y' que contenía 60 U/mL de IL-2 se i colocó en cada pocilio y en. el cuarto día desde el inicio del cultivo, la mitad del volumen del sobrenadante de cultivo se retiró y 0.5 mL¡de 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 se agregó a cada pocilio. (3) Determinación del Doblez de Expansión En cuanto a las células obtenidas en el punto (2) I del Ejemplo 7, en el decimptercer día desde el inicio del cultivo, el número de células vivas se contó por medio del método de tinción con azul de tripano y un doblez de expansión se calculó al comparar el número de células contadas con el número de células al inicio del cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 24.

Tabla 24 Células del Inicio del Cultivo Doblez de Expansión Control (Sin Inmovilización de CH-296 CH-296) Células T CD45RA+ CCR7+ CD8+ x1.2 x7.8 Células T CD45RA" CCR7" CD8+ x?.8 x1.2 Como se muestra en la Tabla 24, en la población de CTL inducida utilizando las células T CD45RA+ CCR7+ CD8+ aisladas de células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa ¡ temprana de la expansión -de la población de células T (referido en lo sucesivo como "el grupo CH-296"), el doblez de expansión de la población de CTL fue alto, en comparación con aquel del grupo de control. En otras palabras, se aclaró que la¡ población de CTL se obtuvo en una cantidad más grande al! llevar a cabo la inducción de CTLs a partir de las células T CD45RA+ CCR7+ contenidas en 1 un alto porcentaje en células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivó inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la población de células t- ¡ (4) Ensayo de Actividad Citotóxica La actividad citotóxica de los CTLs en el i decimotercer día desde el inicio de la inducción, preparados en el punto (2) del Ejemplo 7 se sometió a ensayo de la misma manera que en el punto (7) del Ejemplo 5. Los resultados para el ensayo de actividad citotóxica se muestran en la Tabla 25.

Tabla 25 Células del Células E/T - Actividad Citotóxica (%) Inicio del Objetivo PBMCs Control (Sin CH-296 Cultivo Inmovilización de CH-296) Células T T2 10 8.35 N. T. 18.62 CD45RA+ 3 < 0 1.77 9.8 CCR7+ CD8+ T2 + Péptido 10 i 83.59 N. T. 89.49 MART-1 3 i 66.61 20.92 67.07 I Células T T2 30 ' - 17.16 N. T. N. T. I CD45RA" 10 ; 3.19 N. T. N. T. I CCR7" CD8+ 3 | 0.78 10.15 8.96 T2 + Péptido 30 ; 8.66 N. T. N. T. MART-1 10 < 0 N. T. N. T. 3 < 0 9.06 3.21 N . T . : NO sometido a prueba . Como se muestra én la Tabla 25, en la población de CTL inducida utilizando las células T CD45RA+ CCR7+ CD8+ aisladas del grupo CH-296, la actividad citotóxica específica de la población de CTL fue alta, en comparación con aquellas del grupo de control y el grupo de PBMC. Además, la actividad citot !óxica específica fue alta en comparación con aquella de la población de CTL inducida utilizando las células T ¡ CD45RA" CCR7" CD8+. En otras palabras, se aclaró que las- células T CD45RA+ CCR7+ CD8+ las cuales están contenidas e¡n un alto porcentaje en las células cultivadas en la cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CHt296 en una etapa temprana de la I expansión de la población dé células T se podrían inducir a I una población de CTL de la cual la actividad citotóxica específica era aún más alta.¡ Ejemplo 8: Determinación de Capacidad para Reconocer Antígenos de CTLs ¡ (1) Inducción dé CTLs Específicos para un Antígeno Asociado Antitumor ¡ (MART-1) i Utilizando las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 1 y aquellas en1 el punto (7) del Ejemplo 6, la inducción de CTLs específicos para un antígeno asociado antitumor (MART-1) se llevó a cabo en la misma manera que en el punto (8) del Ejemplo 6 y el cultivo continuó durante catorce días . I (2) Determinación de Capacidad para Reconocer un Antígeno La capacidad para reconocer un antígeno de los CTLs en el decimocuarto día del inicio de la inducción, preparados en el punto (1) , del Ejemplo 8 se determinó al modificar parcialmente u? método de Valmori, D. y colaboradores [Valmori D. y colaboradores, J. Immunol . , 160, 1750-1758 (1998)]. En otras palabras, las células T2 se suspendieron en el medio RPMI 1640 que contenía FBS al 5% para tener una densidad de 1 x 106 células/mL, luego se agregó calceína-AM a las mismas para tener una concentración final de 25 µM y las células se cultivaron a 37°C durante 1 hora. Las células incubadas , se lavaron con un medio que no contenía calceína-AM y la ¡densidad se ajustó a 2 x 105 células/mL. Las células objetivo etiquetadas con calceína se suministraron en cada pocilio de una placa de cultivo de células de 96 pocilios en un, volumen de 50 µL/cada pocilio. A cada pocilio en el cual se colocaron estas células se agregó 5HRPMI que contenía un péptido de antígeno de 0 a 20 µM (péptido de epítopo derivado¡del antígeno de melanoma MART-1) en un volumen de 50 µL/cada pocilio. La placa mencionada anteriormente se incubó en una incubadora de C02 al 5% a 37°C durante 1 hora. A cada pocilio después de la incubación se agregó una suspensión de células que contenía una cantidad de 30 veces de células K562 (ajustadas a una densidad de 6 x 106 células/mL) en un volumen de ¡50 µL/cada pocilio. Los CTLs preparados en el punto (1) del Ejemplo 8 se ajustaron con 5HRPMI para tener una densidad de 6 x 106 células/mL como células efectoras y después a cada pocilio de la placa se agregaron las células en un volumen de 50 µL/cada pocilio. La placa a ! la cual se colocó la suspensión i de células mencionada anteriormente se centrifugó a 400 x g durante 1 minuto y las células entonces se incubaron en una incubadora de C02 al 5% a 37?°C durante 4 horas. Después, 100 µL del sobrenadante de cultivo se recolectaron de cada pocilio y la cantidad de calceína liberada en el sobrenadante de cultivo se determinó con el lector de placas de fluorescencia (espectrofluorómetro) (485 nm/535 nm) . La "actividad citotóxica específica (%)" se calculó de acuerdo con la fórmula (2) mencionada anteriormente. Los resultados del ensayo de la estabilidad de reconocimiento de antígenos se muestran en la Tabla 26. La capacidad para reconocer un antígeno se expresó como un valor relativo de la actividad citotóxica en cada concentración de péptido agregada cuando la actividad citotóxica a una concentración de péptido agregada a las células objetivo de 10 µM se asumió que era 100. ; Tabla 26 Concentración Final de Valor Relativo de Actividad Citotóxica a 10 µM de Péptido Agregado a las i Péptido Agregado Células Objetivo (µM) PBMCs Control (Sin Inmovilización CH-296 de CH-296) 10.0 100 ¡ 100 100 1.0 124.36: 74.39 91.44 0.1 72.54 ¡ 0.01 72.77 0.001 29.63 : 36.83 74.3 0.0001 18.39 9.8 41.72 0 16.24 ¡ 5.69 5.16 Como se muestra en la Tabla 26, en la población I de CTL inducida a partir del grupo CH-296, se eliminaron aún las células objetivo con péptido de antígeno agregado de una concentración aún -más baja, en comparación con aquellas del grupo de control y el grupo de PBMC, de manera ! que fue alta una capacidad para reconocer un antígeno i específica de la población] de CTL. En otras palabras, se aclaró que las células cultivadas en las cuales se utilizó i un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa i temprana de la expansión de la población de células T se i podrían inducir a una población de CTL que tenga una capacidad para reconocer ún antígeno específica aún más i alta. ; Ejemplo 9: Prueba' de Viabilidad de una Población 1 I de Células de Expansión de una Población de Células T 1 Utilizando CH-296 ¡ (1) Expansión de una Población de Células T Loe procedimientos se llevaron a cabo de la misma manera que en el punto (1) del Ejemplo 3 excepto que se utilizó un amortiguador 'de acetato (pH 5.3) en la inmovilización de un anticuerpo anti-CD3 humano y un fragmento CH-296 y que en el cuarto día desde el inicio del i cultivo, el medio de cultivo se diluyó aproximadamente 14 i veces y 6.3 mi de la dilución se colocaron en un matraz de cultivo de 25 cm2 totalmente nuevo y en el octavo día desde el inicio del cultivo, el medio de cultivo se diluyó aproximadamente 2 veces y 6.3 mi de la dilución se transfirieron a un matraz de cultivo de 25 cm2 totalmente nuevo. Los resultados se muestran en la Tabla 27.

Tabla 27 Doblez de Expansión (veces) Control (Sin Inmovilización de CH-296) x 277 CH-296 x 344 Como se muestra e? la Tabla 27, en el grupo en el cual se utilizó un equipo ¡de cultivo inmovilizado con el fragmento CH-296 (referido ' en lo sucesivo como "el grupo CH-296") en una etapa temprana de la expansión de la población de células T, un doblez de expansión alto se obtuvo en comparación con aquel del control . (2) Análisis de Células T CD45RA+ CCR7+ y Células T CD45RA+ CD62L+ Las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 9 se tiñeron con cada anticuerpo y se analizaron de la misma manera que en el punto (4) del Ejemplo 1, con la condición de que las combinaciones de los anticuerpos fueran de la siguiente manera. Concretamente, la, tinción se llevó a cabo con igGl de ratón etiquetada con FITC/lgGl de ratón etiquetada con RDl/IgGl de ratón etiquetada con PC5 y anticuerpo anti- CCR7 humano de ratón etiquetado con FITC/anticuerpo anti- CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti- i CD62L humano de ratón etiquetado con PC5. Estas células i teñidas se analizaron con un citómetro de flujo y se calcularon los porcentajes' de células T CD45RA+ CCR7+ y células T CD45RA+ CD62L+. Los resultados se muestran en las Tablas 28 y 29. ¡ Tabla 28 Células T CD45RA+ CCR7+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) 27.2 CH-296 60.5 Tabla 29 Células T CD45RA+ CD62L+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) 71.3 CH-296 84.0 A partir de los resultados de las Tablas 28 y 29, en el grupo CH-296, se obtuvieron los resultados de la población de células T CD45RA+ CCR7+ más alta y la población de células T CD45RA+ CD62L+ más alta, en comparación con aquellos del grupo de control. (3) Cultivo Utilizando Células Alimentadoras de Células del Punto (1) ¡ Las células después de la expansión obtenidas en el punto (1) del Ejemplo 9 se ajustaron con 5HRPMI para tener una densidad de 2 x 106 células/mL y la suspensión de ! células se colocó en una placa de cultivo de células de 24 pocilios en un volumen de 0.5 mL/cada pocilio. Además, las I PBMCs propias preparadas en el punto (1) del Ejemplo 1 se 1 suspendieron en 5HRPMI, la , suspensión entonces se irradió con rayos X (0.90 C/kg) y, se resuspendió en 5HRPMI para i tener una densidad de 2 x 106 células/mL (para proporcionar i células alimentadoras) . Estas células alimentadoras se i agregaron a la placa de cultivo de células de 24 pocilios I mencionada anteriormente en un volumen de 0.5 mL/cada pocilio y la placa se cultivó en una incubadora de C02 al 5% a 37°C durante 7 días. Durante este período, el cultivo se llevó a cabo sin agregar en absoluto citocinas tal como IL-2. ¡ (4) Análisis de Células Anexina V+ 7AAD+ I Las células obtenidas en el punto (3) del Ejemplo i 9 se recolectaron y se tiñéron de acuerdo con el protocolo ¡ del Equipo de Anexina V/7AAD (manufacturado por Beckman Coulter) a fin de determinar las células que se sometieron a la apoptosis. Las células' se sujetaron a la citometría de flujo y se determinó un porcentaje de células Anexina V+ 7AAD+, es decir las células que se sometieron a la apoptosis para cada población de células . Los resultados se muestran en la Tabla 30.

Tabla 30 Células Anexina V+ 7AAD+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) ¡ 57.6 J CH-296 44.9 - Se mostró a partir de los resultados de la Tabla 30, en el grupo en el cual ¡se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la población dé células T, que la población de células Anexina V+ 7AAD+ fue más baja de manera que el porcentaje de células apoptóticas fue más bajo, en comparación con aquellos del grupo de control. En otras i palabras, se aclaró que las células que tenían viabilidad alta pueden proliferar dominantemente, aún bajo el ambiente de, por ejemplo, una baja concentración de IL-2 por medio del uso de un fragmento CH-296 en la expansión de la población de células T. Ejemplo 10: Estudios Sobre los Efectos de Transferencias de Células T Utilizando un modelo de Tumor Singénico en Ratón A fin de confirmar los efectos sobre los tumores ¡ de células T sujetadas a la' expansión utilizando CH-296, se condujo una prueba utilizando un modelo de tumor singénico de ratón. i ¡ I (1) Preparación del CH-296 de Ratón El CH-296 de ratón como se muestra en la SEQ ID I ¡ NO: 23 del Listado de Secuencias se obtuvo al diseñar un I fragmento de fibronectina de ratón basado en una secuencia de CH-296 humano y al construir un plásmido de acuerdo con i un método convencional, obteniendo con lo cual el CH-296 de ratón de una manera de ingeniería genética utilizando el plásmido. En otras palabras, la cepa HBlOl de Escherichia i coli que albergaba el plásmido se cultivó y se sujetó a la i inducción para la expresión. Después, las células se 1 desestabilizaron para preparar proteínas crudas y las proteínas entonces se sujetaron a la purificación con una i columna de intercambio ' catiónico, una columna de ! intercambio aniónico o una columna de filtración en gel i para proporcionar una proteína propuesta. La proteína obtenida se sujetó a la filtración bacteriana y después se ! almacenó a -80°C hasta el usio (2) Preparación ¡de Linfocitos Esplénicos de Ratones Portadores de Cáncer I I El carcinoma IMC i (referido en lo sucesivo como "IMC") se implantó en la cavidad abdominal de ratonas CDFi (manufacturado por Nippon SLC, Inc.) para generar ascitos y los ascitos se implantaron a diferentes ratones cada 7 días y se subcultivarón. Los ascitos en el séptimo día desde el i subcultivo se recolectaron,) se lavaron con PBS y luego se I , 7 suspendieron en PBS para tener una densidad de 5 x 10 células/mL. Esta suspensióni de células se implantó por vía subcutánea al lado derecho i del abdomen de ratones CDFx en i un volumen de 0.1 mL, para formar un tumor sólido. Después de 21 días, el bazo se extirpó y se homogeneizó en el medio RPMI 1640 utilizando un portaobjetos de vidrio. Una porción i de los siete ratones se¡ recolectó junta en un tubo utilizando el medio RPMI 16,40 para conformar un volumen de 45 mL y la mezcla se dejó reposar sobre hielo durante 5 i minutos. Después, la mezcla se transfirió a un tubo I totalmente nuevo a través dé un Filtro de Células de 40 µm (manufacturado por Becton Dickenson) . Después de la centrifugación, el sobrenadante se retiró y el residuo se sujetó a la hemolisis incluyendo los pasos de procedimiento que consisten en suspender el residuo en 2 mL de amortiguador ACK (NH4C1 0.15 M, KHC03 0.01 M, Na2EDTA 0.01 i mM pH 7.4), agregar adicidnalmente 2 mL del amortiguador ACK al mismo para suspender la mezcla y después agregar el medio RPMI 1640 para conformar un volumen de una suspensión I de células de 50 mL. Después de la centrifugación, el i sobrenadante se retiró, el¡ residuo se suspendió en 10 mL del medio RPMI 1640 y la suspensión se transfirió a un tubo I totalmente nuevo a través del Filtro de Células. El medio RPMI 1640 se agregó para! conformar un volumen de una suepensión de células de 40 mL. Después, la suspensión de células se centrifugó, el sobrenadante se retiró y después i el residuo se suspendió en ,una mezcla preparada al mezclar volúmenes equivalentes del¡ medio RPMI 1640 y CP-1 que ! I contenía HSA al 8% y la suspensión se almaceno en nitrógeno i líquido hasta el uso. , (3) Inmovilización de Anticuerpo Anti-CD3 de Ratón y Fragmento CH-296 de ¡Ratón i Un anticuerpo antji-CD3 de ratón y un fragmento 1 CH-296 de ratón se inmovilizaron en un equipo de cultivo utilizado en el siguiente experimento. Concretamente, 400 µL de cada amortiguador de acetato (pH 5.3) que contenía un anticuerpo anti-CD3 de ratón (manufacturado por R & D Systems) (concentración final: 14 µg/mL) se agregaron a la placa de cultivo de células de 24 pocilios y el equipo de i cultivo se incubó durante toda la noche a 4°C. Después, el CH-296 preparado en el punto (1) del Ejemplo 10 se agregó para tener una concentración final de 25 µg/mL y el equipo de cultivo se incubó a temperatura ambiente durante 5 horas adicionales. Inmediatamente, antes del uso, un amortiguador -de acetato que contenía el anticuerpo y el CH-296 de ratón se retiraron por medio de la aspiración de estos equipos de cultivo y después cada pocilio se lavó dos veces con PBS y luego una vez con el medio RPMI 1640 y el equipo de cultivo se sujetó a cada experimento. (4) Purificación i de Linfocitos Esplénicos con Fibras de Nailon - Los linfocitos esplénicos preparados en el punto I (2) del Ejemplo 10 se purificaron utilizando fibras de nailon a fin de incrementar la pureza de los linfocitos.

Una jeringa de 10 mL (manufacturada por TERUMO CORPORATION) se rellenó con 0.6 g de fibras de nailon (manufacturadas i por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.), se equilibró con 1 PBS y luego se esterilizó a 121°C durante 20 minutos. Esta i columna se equilibró con el medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10% (manufacturado por DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., 1 LTD.) y se incubó a 37°C en una incubadora de C02 al 5% durante 1 hora. Los linfocitos esplénicos preparados en el punto (2) del Ejemplo 10 se suspendieron en 2 a 3 mL del i medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10% en una densidad de manera que no excediera 2 x 108 células, la suspensión se aplicó a la columna y después la columna se incubó a 37 °C 1 en una incubadora de C02 ¡al 5% durante 1 hora. Quince i mililitros del medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10% calentado previamente a 37°C se agregaron a la columna y las células eluidas se recolectaron. i (5) Expansión de1 una Población de Células T de Ratón Los linfocitos preparados en el punto (4) del Ejemplo 10 se suspendieron en el medio RPMI 1640 que I contenía FBS al 10%, una mezcla de NEAA 0.1 mM, piruvato de sodio 1 mM y 2-mercaptoetanol 50 µM (manufacturado por Nakalai Tesque, Inc.) (referido en lo sucesivo como "medio mRPMI"), para tener una densidad de 1.5 x 106 células/mL. Después, el medio mRPMI sé agregó previamente a la placa inmovilizada con el anticuerpo anti-CD3 de ratón y el CH-296 de ratón preparado en el punto (3) del Ejemplo 10 en un I volumen de 0.7 mL/pocillo, la suspensión . de células I anterior se agregó al mismo en un volumen de 0.5 mL/cada pocilio y estas placas se 'cultivaron a 37°C en C0 al 5% (día cero de cultivo) . En !el segundo día del cultivo, la suspensión de células se diluyó utilizando el medio mRPMI para tener una densidad de 1 x 105 células/mL y una cantidad completa se transfirió a un matraz de cultivo de células de 75 cm2 totalmente nuevo al cual no se inmovilizó nada. En ese momento, la ILr2 de ratón (manufacturada por R & D Systems) se agregó para tener una concentración final de 100 U/mL o la IL-7 de ratón (manufacturada por E. & D Systems) se agregó para tener una concentración final de 10 ng/mL. En el quinto día del cultivo, el subcultivo se llevó a cabo de la misma manera que aquella en el segundo día del cultivo excepto que la suspensión de células se diluyó para tener una densidad de 1.5 x 106 células/mL. En el séptimo día del cultivo, las células se recolectaron y se sujetaron a una prueba con el siguiente modelo de tumor singénico. (6) Evaluación de Acción de Rechazo de Tumor de la Transferencia de una Población de Células T en un Modelo de Tumor Singénico de CDFi-IMC El IMC se implantó por vía subcutánea al lado derecho del abdomen de ratonas CDFi de seis semanas de edad bajo anestesia de la misma manera que en el punto (2) del Ejemplo 10. Las células preparadas en el punto (5) del Ejemplo 10 se suspendieron ' en PBS para tener una densidad de 3 x 108 células/mL y la ¡suspensión se administró de las i venas de las colas de los ratones en una cantidad de 0.1 mL (día cero de administración) . La IL-2 de ratón (3 x 104 U/0.2 mL) se administró a la cavidad abdominal durante cuatro días consecutivos desde el día cero de administración. Como un control, se estableció un grupo sin I la administración de las células expandidas . El tamaño del tumor se expresó como área de tumor (cm2) al determinar regularmente la longitud y la anchura del tumor hasta 21 días después del implante de IMC. Los resultados se muestran en la Figura 2. La Figura 2 es una gráfica que muestra el número de días desde el implante de IMC y el tamaño del tumor, en donde- los triángulos sólidos indican i el grupo de control y los círculos sólidos indican el grupo administrado con células T. - Como se muestra en la Figura 2, se descubrió que el grupo administrado con las células que se cultivaron en presencia de CH-296 (el grupo administrado con células T) suprime significativamente la formación de I un tumor. Ejemplo 11: Evaluación de una Población de Células T Humana Expandida Utilizando CH-296 por la Inducción de GVHD en ratones NOD/Scid. (1) Expansión de una Población de Células A fin de preparar las células en una gran cantidad, se cambió un equipo de cultivo. Concretamente, 21 mL de PBS que contenía un anticuerpo anti-CD3 humano (concentración final: 5 µg/mL) se agregaron a un matraz de cultivo de 175 cm2 (manufacturado por Becton Dickenson) . En ese momento, el CH-296 se agregó al grupo con la adición de CH-296, para tener una concentración final de 25 µg/mL y el equipo de cultivo se incubó a temperatura ambiente durante I 5 horas. Inmediatamente antes del uso, el PBS que contenía el anticuerpo y el CH-296¡ se retiraron por medio de la aspiración de estos equipos de cultivo y después cada matraz se lavó dos veces con PBS y una vez con el medio RPMI . Las PBMCs frescas se prepararon al recolectar 54 mL de sangre de donadores individuales normales humanos . Las PBMCs se suspendieron en el medio GT-T503 que contenía plasma propio al 0.5% y - HSA al 0.2% (referido en lo sucesivo como "GT-T503 con plasma propio al 0.5%"), para tener una densidad de 0.5 x 10G células/mL, la suspensión se agregó en un volumen de 21 mL cada uno a un matraz inmovilizado con un anticuerpo anti-CD3 o un matraz inmovilizado con un anticuerpo anti-CD3 y CH-296, el cual se preparó previamente y la IL-2 se agregó al mismo para tener una concentración final de 1000 U/mL. Estos matraces comenzaron a ser cultivados a 37°C en C02 al 5% (día cero de cultivo) . Al siguiente día, el GT-T503 con plasma propio al 0.5% se agregó al matraz¡ en un volumen de 49 mL cada uno ! y la IL-2 se agrego al medio de cultivo para tener una concentración final de 10¡00 U/mL en base al medio de 1 cultivo. En el cuarto día desde el inicio del cultivo, 42 mL del medio de cultivo de cada grupo y 158 mL del GT-T503 con plasma propio al 0.5% se transfirieron a una bolsa de cultivo permeable al gas (600 cm2, manufacturada por TAKARA BIO, INC, código de producto comercial: KB610) a la cual no se inmovilizó nada. Además^ la IL-2 de agregó a la misma i para tener una concentración final de 500 U/mL y el cultivo continuó. En el sexto día 'del inicio del cultivo, el GT- T503 con plasma propio al 0;.5% en un volumen de 400 mL y la IL-2 se agregaron a la misma para obtener una concentración final de IL-2 de 500 U/mL¡ (600 mL de medio de cultivo) .

Después de dos días se retiró la mitad del volumen del i medio de cultivo de los 6001 mL de medio de cultivo y el GT- T503 con plasma propio al 0.5% del mismo volumen y la IL-2 (concentración final: 500 U/mL) se agregaron a la misma (octavo día de cultivo) . En el undécimo día después del i inicio del cultivo, el medio GT-T503 que contenía HSA al 0.2% en un volumen de 600 mL y la IL-2 se agregaron para tener una concentración final de IL-2 de 500 U/mL y el cultivo continuó hasta el decimocuarto día. Las células después del cultivo se suspendieron en un líquido de I almacenamiento compuesto de volúmenes equivalentes de CP-1 i i que contenía HSA al 8% y un medio RPMI 1640 y la suspensión i se almacenó en nitrógeno líquido hasta el uso. (2) Agrupamiento J El día antes de la administración de las células, los pesos corporales de diejz ratonas NOD/scid de 8 semanas ! de edad (producidas de CLEÁ Japan, Inc.) se midieron y se i agruparon en 4 grupos. Los ¡ miembros de los grupos en este Ejemplo fueron de la siguiente manera. Grupo A: Solvente + Alimentador + IL-2 Humana + Anticuerpo Anti-Asialo GM1 1 Grupo B: PBLs + Alimentador + IL-2 Humana + Anticuerpo i Anti-Asialo GM1 ¡ i Grupo C: Células después de la Expansión (Sin Inmovilización de CH-296) '+ Alimentador + IL-2 Humana + i Anti-Asialo GM1 ' Grupo D: Células después de la Expansión (con Inmovilización de CH-296) ?+ Alimentador + IL-2 Humana + i Anti-Asialo GM1 i El Grupo A y el Grupo B satisficieron n = 2 y el Grupo C y el Grupo D satisficieron n = 3. (3) Administración de Anticuerpo Anti-Asialo GM1 Se ha sabido que el tratamiento con el anticuerpo anti-asíalo GM1 sirve para retirar las células NK en ratones NOD/scid, aumentando por lo cual el injerto de células humanas. En el día antes de la administración de las células explantadas, 20 µL de un anticuerpo anti-asíalo GM1 (manufacturado por Wako Puré Chemicals Industries, Ltd.) se diluyeron con solución salina fisiológica que contenía HSA al 0.4% (referida en lo sucesivo simplemente como "solución salina fisiológica a la cual se agregó HSA al 0.4%") y una porción de 0.4 mL se administró a la cavidad abdominal. (4) Preparación ! de Células Administradas y Administración Las células expandidas las cuales se almacenaron congeladas en el punto (1) del Ejemplo 11 y las PBMCs almacenadas congeladas del ¡mismo donador preparadas de la misma manera que en el puntó (1) del Ejemplo 1 se fundieron rápidamente en un baño de a¡gua a 37 °C. La concentración de linfocitos de sangre periférica (referidos en lo sucesivo como "PBLs") se calcularon al asumir que un porcentaje de las células CD3 -positivas de las PBMCs era 70%. Utilizando una solución salina fisiológica a la cual se agregó HSA al 4% como solvente, una parte de PBLs se suspendió en el solvente como células alimentadoras en una cantidad de 0.5 I x 107 células/ratón y los PBLs y las células después de la expansión se suspendieron cada uno en el solvente en una cantidad de 1.0 x 108 células/ratón para que cada uno tenga un conteo de células necesario, como células para administración. Todos los ratones se irradiaron con rayos X (0.090 C/kg) antes de la administración de las células y 0.3 mL de las células proporcionadas se administraron en la cavidad abdominal, iniciando secuencialmente desde el Grupo A. ¡ (5) Administración de IL-2 Humana La IL-2 Humana utilizada en la expansión de las células T se preparó en uña solución con solución salina fisiológica a la cual se agregó HSA al 0.4% para tener una concentración de 2 x 104 U/ratón y 0.2 mL de la solución se I administró a la cavidad abdominal del ratón iniciando a i partir de aquellos ratones ' a los cuales se suministró la administración de las células en el punto (4) del Ejemplo 11. La IL-2 administró una vez al día por 4 veces consecutivas desde el día de la administración de las células . ! (6) Cambio con el Tiempo en el Peso Corporal de Ratones Después de la Administración de Células ! I Los pesos corporales se determinaron en un i I intervalo apropiado desde el día de la administración hasta el vigésimo primer día. Como resultado, en el Grupo B administrado con PBLS, se observó una pérdida de peso desde el octavo día y un ratón murió en el decimotercer día. En los otros Grupos ningún ratón murió hasta el vigésimo primer día y todos los casos sobrevivieron. Cuando se observó un porcentaje de pérdida de peso, aunque se encontraron algunas fluctuaciones en el Grupo A y el Grupo C durante el curso de la administración, el peso corporal original se mantuvo en el vigésimo primer día y en el Grupo D se observó una ligera tendencia de pérdida de peso. En la reacción Xeno-GVHD en la cuál se utiliza la pérdida de peso I como un índice, se mostró que la reacción se encontró dominantemente en PBLs, ¡ mostrando que las células expandidas bajo las condiciones de inmovilización con CH-296 fueron más efectivas que aquellas bajo las condiciones sin la inmovilización. (7) Injerto de Células T Humanas en el Bazo Los Grupos diferentes del Grupo B se sujetaron a la extirpación del bazo de la anatomía en el vigésimo primer día desde el inicio de la administración de las células y un porcentaje de las células CD3-positivas humanas en el bazo se analizó por medio de la citometría de flujo. Puesto que un ratón murió en el decimotercer día en 1 el Grupo B, este ratón se sujetó a la extirpación del bazo inmediatamente después de ila muerte y el ratón restante también se sometió a la autopsia en el decimotercer día y se sujetó a la extirpación i del bazo. El bazo extirpado se homogeneizó con un portaobjetos de vidrio y el bazo homogeneizado se filtró con ¡una malla de nailon y se sujetó I a un procedimiento de centrifuga. El sobrenadante se retiró, el residuo se sqmetió a la hemolisis con el amortiguado ACK y después se lavó con el medio RPMI 1640 para preparar las células. La tinción se llevó a cabo I utilizando un anticuerpo¡ anti-CD3 humano de ratón etiquetado con FITC (manufacturado por DAKO DENMARK A/S) . Como resultado, se mostró que el porcentaje de las células CD3-positivas de las células esplénica en el Grupo B analizadas en el decimotercer día fue aproximadamente 70% y que en el Grupo D analizado en el vigésimo primer día fue aproximadamente 59%. El porcentaje de células positivas fue menor que 1% en el Grupo A y varios porcentajes aún en el i Grupo C. Se pudo observar a partir de los resultados que las células expandidas bajo las condiciones de la inmovilización con CH-296 tuvieron un alto porcentaje de injerto en el bazo en comparación con aquellas bajo las condiciones sin la inmovilización e incrementaron el porcentaje durante 21 días. ' Ejemplo 12: Expansión de Linfocitos con la Adición de IL-2, IL-12, IFN-? o Anticuerpo Anti-IL-4 (1) Inmovilización de Anticuerpo Anti-CD3 Humano y Fragmento CH-296 j I Se llevaron a cabo los mismos procedimientos como en el punto (2) del Ejemplo 1, excepto que se utilizó una i solución ACD-A (pH 5.0) en la inmovilización del anticuerpo I anti-CD3 humano y el fragmento CH-296 y que la cantidad de la solución ACD-A agregada a la placa de cultivo de células de 12 pocilios se cambió a 0.45 mL. i (2) Expansión de una Población de Células T i Utilizando el Medio GT-T503 ¡ Las PBMCs preparadas en el punto (1) del Ejemplo I 1 se suspendieron en GT-,T503 al 0.5% para tener una densidad de 0.25 x 106 células/mL y después un medio GT-T503 al 0.5% se agregó previamente a la placa inmovilizada con el anticuerpo anti-CD3 I humano o la placa inmovilizada con el anticuerpo anti-CD3 humano y CH-296, preparado en el punto (1) del Ejemplo 12 en un volumen de 0.5 mL/pocillo. i Las suepeneión de células se agregó en un volumen de 1 mL/cada pocilio y estas placas se cultivaron a 37°C en C02 al 5% (día cero de cultivo) . En el cuarto día desde el inicio del cultivo, el medio de cultivo de cada grupo se diluyó aproximadamente 14 veces con el medio GT-T503 al 0.5% y J 6.3 mL de la dilucióin se transfirieron a un matraz de cultivo de células de 25' cm totalmente nuevo al cual no i se inmovilizó nada. El cultivo continuó y en el séptimo ! día, el medio de cultivo de cada grupo se diluyó ! aproximadamente 2 veces con1 el medio GT-T503 al 0.5% y 6.3 i mL de la dilución se transfirieron a un matraz de cultivo I de células de 25 cm2 totalmente nuevo al cual no se I I inmovilizó nada. En el undécimo día desde el inicio del i cultivo, el medio de cultivo de células de cada grupo se diluyó aproximadamente 2 veces con el medio GT-T503 que contenía HSA al 0.2% y 12.6 mL de la dilución se transfirieron respectivamente a un matraz de cultivo de i células de 25 cm2 totalmentei nuevo al cual no se inmovilizó I nada. En este punto, la IL-2 se agregó desde el día cero de i cultivo para tener una concentración final de 100 U/mL. i Además, en cuanto a los agentes diferentes de IL-2, en el cuarto día de cultivo, la (IL-12 (manufacturada por R & D Systems) se agregó para tener una concentración final de 50 I U/mL, el IFN-? (manufacturado por R & D Systems) se agregó para tener una concentración final de 20 ng/mL o un I anticuerpo anti-IL-4 humano (manufacturado por Becton I Dickenson) se agregó para tener una concentración final de i 2 µg/mL; en el séptimo díaj y el undécimo día de cultivo, cada citocina y anticuerpo se agregaron al medio recientemente agregado para tener la concentración final mencionada anteriormente. En el decimocuarto día desde el inicio de cultivo, el número de células vivas se contó por medio del método de tinción1 con azul de tripano y el doblez i de expansión se calculó en una comparación del número de las células contadas con el i número de células al inicio del i cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 31. i I I Tabla 31 i i i Doblez de Expansión (veces) __________ i Control (Sin Inmovilización de CH-296) ] x 388 CH-296 ! X416 I Como se muestra e? la Tabla 31, en el grupo en el 1 cual se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana dé la expansión de células T, el doblez de expansión de la población de células T fue alto, en comparación con aquel del grupo de control. (3) Análisis de Células T CD45RA+ CCR7+ y Células T CD45RA+ CD62L+ ' ! I Las células preparadas en el punto (2) del Ejemplo 12 se tiñeron con cada anticuerpo y se analizaron de la i misma manera que en el punto (4) del Ejemplo 1, con la condición de que las combin ciones de los anticuerpos fueran i de la siguiente manera. Concretamente, la tinción se llevó a cabo con la IgGl de ratón etiquetada con FITC/lgGl de ratón etiquetada con RDl/IgGl de ratón etiquetada con PC5 + IgGl de ratón etiquetada con ECD como control negativo, el i anticuerpo ant?-CD45RA humano de ratón etiquetado con 1 RDl/anticuerpo anti-CCR7 humano de ratón etiquetado con FITC/anticuerpo anti-CD4 humano de ratón etiquetado con ECD/anticuerpo anti-CD8 humano de ratón etiquetado con PC5 o anticuerpo anti-CD45RA humano de ratón etiquetado con RDl/anticuerpo anti-CD62L humano de ratón etiquetado con FITC/anticuerpo anti-CD4 humano de ratón etiquetado con ECD/anticuerpo anti-CD8 humano de ratón etiquetado con PC5. Estas células teñidas se sujetaron a la citometría de flujo y se calcularon los porcentajes de célula T CD45RA+ CCR7+ y células T CD45RA+ CC62L+ en ¡la región completa de células T en la región de células T CD8+ o en la región de células T CD4+. Los resultados se muestran en la Tabla 32.

Tabla 32 Células T CD45RA+ Células T CD45RA+ CCR7+ (%) CD62L+ (%) Células T Enteras Control (Sin Inmovilización 13.8 25.8 de CH-296) j CH-296 40.2 58.4 Células T CD8+ Control (Sin Inmovilización i 17.1 33.4 de CH-296) ' CH-296 47.4 69.7 Células T CD4+ Control (Sin Inmovilización 7.7 11.6 de CH-296) CH-296 21.8 25.0 Como se muestra e? la Tabla 32, en el grupo en el cual se utilizó un equipo !de cultivo inmovilizado con el fragmento CH-296, se obtuvieron los resultados de la población de células T CD45RA+ CCR7+ más alta y la población I de células T CD45RA+ CD62L+ en las células T durante el I cultivo, en comparación co aquellos del grupo de control. i Se aclaró a partir de lo a?terior en el cultivo en el cual i la IL-2, IL-12, IFN-?, un anticuerpo anti-IL-4 humana se agregaron a un medio GT-T503 que la población de células T se podía expandir mientras que se incrementaba el porcentaje de la población de células T CD45RA+ CCR7+ o CD45RA+ CD62L+ de células T al permitir que el fragmento CH-296 coexistiera en una etapa temprana de la expansión. Ejemplo 13: MLR Alogénica de una Población de Células Expandida Utilizando una bolsa de Cultivo Permeable al Gas Después de la Estimulación en una Etapa Temprana de I CH-296 a Partir de PBMCs Separadas Recientemente i (1) Separación de PBMCS de Sangre Fresca Cincuenta mililitros de sangre se recolectaron de un donador individual normal humano del cual se obtuvo un consentimiento informado y ¡después las PBMCs se separaron de la sangre recolectada de ! la misma manera que en el punto (1) del Ejemplo 1. Las PBMCs recolectadas se sujetaron a los métodos de tinción con azul de tripano y tinción de Turk (solución de tinción de Turk: manufacturada por i Nakalai Tesque Inc.), calculando por lo cual el número de células y se sujetaron a cada experimento como estaban sin almacenamiento congelado. ! (2) Inmovilización de Anticuerpo Anti-CD3 Humano y CH-296 ! La inmovilización! se llevó a cabo de la misma manera que el punto (1) del 'Ejemplo 6. (3) Expansión de ¡una Población de Células T i Las PBMCs preparadas en el punto (1) del Ejemplo 13 se suspendieron en GT-T503 con plasma propio al 0.5% para tener una densidad de 0.5 x 106 células/mL para preparar una suspensión de Células. Después, el GT-T503 al 0.5% se agregó previamente a un matraz inmovilizado con el anticuerpo anti-CD3 humano o un matraz inmovilizado con el anticuerpo anti-CD3 humano; y el CH-296, preparado en el punto (2) del Ejemplo 13, en un volumen de 21 mL/matraz y la suspensión de células anterior se agregó al mismo en un volumen de 9 mL/matraz. Lá IL-2 se agregó al mismo para i tener una concentración final de 1000 U/mL y estos matraces se sujetaron al cultivo 37°C en C02 al 5% (día cero de cultivo) . En el cuarto día después del inicio del cultivo, 21 mL del medio de cultivo de cada grupo y 279 mL del GT-T503 con plasma propio al 0¿5% se transfirieron a una bolsa de cultivo permeable al gas (300 cm2, manufacturado por TAKARA BIO, INC., código comercial: KB610) a la cual no se inmovilizó nada y la IL-2 se agregó adicionalmente a la misma para tener una concentración final de 500 U/mL. El cultivo continuó y en el octavo día 150 mL del medio de cultivo de células de cada grupo se retiraron de la bolsa de cultivo, dejando 150 mL del medio de cultivo de células en la bolsa y el medio de cultivo restante se diluyó 2 veces con el GT-T503 con plasma propio al 0.5%, para conformar un volumen de 300 mL del medio de cultivo de células de cada grupo.; A cada grupo se agregó i adicionalmente IL-2 para tener cada uno una concentración final de 500 U/mL. En el undécimo día del inicio de i cultivo, 300 mL del medio GT-T503 al 0-5% que contenía HSA al 0.2% se agregaron a laj misma para diluir 2 veces el medio de cultivo de células¡ de cada grupo. A cada grupo se agregó adicionalmente la IL-2 para tener cada uno una concentración final de 500¡ U/mL. En el decimocuarto día desde el inicio del cultivo;, el número de células vivas se contó por medio del método de tinción con azul de tripano y el doblez de expansión se calculó al comparar el número de las células contadas con el número al inició de cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 33.

Tabla 33 ! Doblez de Expansión (veces) Control (Sin Inmovilización de CH-296) x 885 CH-296 X 1271 Como se muestra en la Tabla 33, aún en un caso ! I donde las células se cultivaron en una bolsa de cultivo i permeable al gas, en el grupo en el cual se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de las población de células T (referido en lo sucesivo como "el grupo CH-296"), doblez de expansión de la población de células T fue alto en comparación con aquel del grupo de control . I (4) Análisis de células T CD45RA+ CCR7+, células T CD45RA+ CD62L+, células T ¡CD45RA+ CD27+, células T CD45RA+ CD28+, células T CD27+ CD28+!y células T CD45RA+ CCR7+ CD62L+ i en una Población de Células T Cultivada en una Bolsa de Cultivo Permeable al gas. Las células preparadas en el punto (3) del Ejemplo 13 se tiñeron con cada anticuerpo y se analizaron de la misma manera que en el punto (3) del Ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Tabla 34.

Tabla 34 Control (Sin Inmovilización CH-296 de CH-296) Células T CD45RA+ CD62L+ 77.15% 85.21 % Células T CD45RA+ CCR7+ 50.46% 60.17% Células T CD45RA+ CD28+ 65.94% 72.88% Células T CD45RA+ CD27+ 70.93% 85.89% Células T CD28+ CD27+ 65.54% 76.42% Células T CD45RA+ CCR7+ CD62L+ 50.05% 59.32% Como se muestra e? la Tabla 34, en el grupo CH-296, los valores altos se mostraron en cualquiera de los marcadores de superficie i celular, en comparación con í aquellos del grupo de control. (5) Almacenamiento de Células Cultivadas. Las células en el decimocuarto día del cultivo preparadas en el punto (3) ,del Ejemplo 13 se sujetaron al almacenamiento congelado y se fundieron de la misma manera que en el punto (4) del Ejemplo 5. Las células se sujetaron i a cada experimento. ¡ (6) MLR Alogénic La MLR alogénica se llevó a cabo de la misma manera que en el punto (4) del Ejemplo 6 utilizando las células preparadas en el punto (5) del Ejemplo 13, excepto que las modificaciones se hicieron de la siguiente manera. I Las características incluyen las células estimuladoras y las células respondedoras se prepararon para tener una densidad de células de 1 o 2 x 106 células/mL; y en el quinto día, las células en cada pocilio se suspendieron, la suspensión entonces se dividió en dos pocilios de la mitad del volumen cada uno, 1 mL de 5HRPMI que contenía 1000 U/mL de IL-2 se agregó a cada 'pocilio y el cultivo continuó hasta el séptimo día. i (7) Determinación del Doblez de Expansión En cuanto a las células obtenidas en el punto (6) del Ejemplo 13, en el séptimo día desde el inicio del i i cultivo, el número de células vivas se contó por medio del I método de tinción con azul de tripano y se calculó un doblez de expansión al comparar el número de células contadas con el número de ¡células al inicio del cultivo. Estos resultados se muestran en la Tabla 35.

Tabla 35 Días de Cultivo Número de Células Sembradas Células Respondedoras al Inicio del Cultivo ¡ Control (Sin Inmovilización CH-296 Células/Pocilio con CH-296) Séptimo Día 0.5 x 10" x l .29 X 2.24 1.0 x 10° X 2.29 X 3.72 Como se muestra e? la Tabla 35 , en un caso donde la MLR alogénica se llevó a cabo utilizando el grupo CH- I 296, el doblez de expansión ¡después de la reacción fue alto en comparación con aquel del grupo de control. En otras palabras, se aclaró que cuando una MLR alogénica se llevó a cabo utilizando células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de expansión de una población de células T, las I células que reconocen un aloantígeno se hacen proliferar en una cantidad aún más grande. (8) Ensayo de Actividad Citotóxica La actividad citotóxica de las células en el i séptimo día desde el inicio de la inducción, preparadas en el punto (6) del Ejemplo 13 se sometió a ensayo de la misma manera que en el punto (6) del Ejemplo 6, excepto que como las células objetivo en la determinación, las PBMCs propias o las PBMCs no propias las cuales se sujetaron a la blastogenésis (destrucción), con PHA durante 7 días se utilizaron como células objetivo etiquetadas con calceína.

Durante el ensayo para la actividad citotóxica, se mezcló i una cantidad de 30 veces de ' células K562 y células objetivo i etiquetadas con calceína. ¡ Una relación de de E/T se i estableció de 90 a 3. Los resultados para el ensayo de la I actividad citotóxica se muestran en la Tabla 36.

Tabla 36 Número de Células Células Objetivo ! E/T Actividad Citotóxica (%) Sembradas al Inicio Control (Sin CH-296 del Cultivo I Inmovilización de Células/Pocilio CH-296) 0.5 x 106 Células no Propias 90 33.18 49.5 Destruidas con 30 17.17 28.31 PHA 10 6.13 10.81 3 3.66 6.12 Células Propias 90 2.01 2.78 Destruidas con 30 < 0 1.67 PHA 10 < 0 < 0 3 4.07 1.1 1.0 x 106 Células no Propias 90 69.5 73.42 Destruidas con 30 53.68 66.57 PHA 10 30.29 43.79 3 11.78 18.82 Células Propias 90 3.72 4.21 Destruidas con ¡ 30 2.08 3.59 PHA 10 < 0 1.14 3 < 0 < 0 Como se muestra en la Tabla 36, en un caso donde se llevó a cabo una MLR alogénica del grupo CH-296, la actividad después de la rea lla del grupo de células cultivadas cultivo inmoviliza de la expansión que una 1 población de células que tenía una actividad citotóxica específica para aloantígenios aún más fuerte se podría obtener por medio de la MLR ,alogénica. Ejemplo 14: MLR Alogénica e Inducción de CTLs i para MART-1 de una Población de Células Expandida i Utilizando una Bolsa de Cultivo Permeable al Gas con la Estimulación en una Etapa Temprana o el Cultivo Subsecuente de CH-296 j (1) Inmovilización de 'Anticuerpo Anti-CD3 y Fragmento CH-296 ¡ Un anticuerpo anti-CD3 humano y un fragmento CH- 296 se inmovilizaron en un l equipo de cultivo utilizado en i el siguiente experimento. Concretamente, 9 mL cada uno de i PBS que contenía un ¡ anticuerpo anti-CD3 humano i (concentración final: 5 µg/mL) se agregaron a una bolsa de cultivo permeable al gas! (área de cultivo: 75 cm2, manufacturada por TAKARA 'BIO, INC., código comercial: KB620) . Con la adición, el CH-296 se agregó a un grupo con I adición de CH-296, los mismos volúmenes de PBS que contenía I un anticuerpo anti-CD3 humano (concentración final: 5 µg/mL) y CH-296 (concentración final: 25 µg/mL). i Después de que ¡estos equipos de cultivo se incubaron a temperatura ambiente durante 5 horas, los equipos de cultivo se almacenaron a temperatura ambiente hasta el uso. Inmediatamente antes del uso, el PBS que contenía el anticuerpo y el CH-296 se retiraron con una jeringa de estos equipos de ¡cultivo y después cada bolsa se i lavó dos veces con PBS y lu¡ego una vez con el medio RPMI y las bolsas se sujetaron a cada experimento. (2) Expansión de una Población de Células T Se llevaron a cabo los mismos procedimientos que aquellos en el punto (3) del Ejemplo 13 excepto que la bolsa preparada en el punto (1) del Ejemplo 14, no el matraz de cultivo, se utilizó como i un equipo de cultivo en la estimulación con CH-296. Los resultados en el decimocuarto día después del inicio del ¡cultivo se muestran en la Tabla 37. ¡ Tabla 37 Doblez de Expansión (veces) Control (Sin Inmovilización de CH-296) x 500 CH-296 x 967 Como se muestra en la Tabla 37, aún en un caso donde las células se cultivaron utilizando una bolsa de i cultivo permeable al gas con la estimulación en una etapa i temprana o el cultivo subsecuente de CH-296, en el grupo en el cual se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con i CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la i población de células T (referido en lo sucesivo como "el i grupo CH-296"), el doblez de expansión de la población de células T fue alto en comparación con aquel del grupo de 1 control . i i (3) Análisis de células T CD45RA+ CCR7+, células T CD45RA+ CD62L+, células T¡ CD45RA+ CD27+, células CD45RA+ I CD28+, células T CD27+ CD28+ y células T CD45RA+ CCR7+ CD62L+ I en una Población de Célula Is T Cultivada en una Bolsa de Cultivo Permeable al Gas con la Estimulación en una Etapa Temprana o el Cultivo Subsecuente de CH-296 i Las células preparadas en el punto (2) del I Ejemplo 14 se tiñeron con cada anticuerpo y se analizaron de la misma manera que en el punto (3) del Ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Tabla 38.

Tabla 38 ¡Control (Sin Inmovilización CH-296 ¡ de CH-296) Células T CD45RA+ CD62L+ 71.73% 85.03% Células T CD45RA+ CCR7+ 47.49% 67.46% Células T CD45RA+ CD28+ - 59.81% 79.83% Células T CD45RA+ CD27+ ¡ 64.69% 85.37% Células T CD28+ CD27+ ¡ 59.99% 82.15% Células T CD45RA+ CCR7+ CD62L+ 46.14% 65.94% I Como se muestra en la Tabla 38, en el grupo CH- 296, se mostraron valores' altos en cualquiera de los I marcadores de superficie ¡ celular, en comparación con I aquellos del grupo de control (4) MLR Alogénica1 I La MLR alogénica , se llevó a cabo de la misma I manera que en el punto (4) del Ejemplo 6 utilizando las células preparadas en el punto (2) del Ejemplo 14. (5) Ensayo de Actividad Citotóxica La actividad citotóxica de las células en el décimo día desde el inicio de la inducción, preparadas en I el punto (4) del Ejemplo 14 se sometió a ensayo de la misma manera que en el punto (6) del Ejemplo 6, excepto que la relación de E/T de 90 días se estableció recientemente. Los resultados para el ensayo de actividad citotóxica se muestran en la Tabla 39.

Tabla 39 Células Objetivo E/T Actividad Citotóxica (%) -Control (Sin Inmovilización de CH-296 ' CH-296) Células no Propias 90 65.05 72.73 Destruidas con PHA 30 44.92 61.43 10 21.81 37.2 3 7.23 17.99 Células Propias 90 0.69 0.17 Destruidas con PHA 30 <0 <0 10 <0 <0 3 <0 <0 Como se muestra en la Tabla 39, en un caso donde se llevó a cabo la MLR alogénica del grupo CH-296, las actividades citotóxicas específicas para aloantígenos I después de la reacción fueron altas, en comparación con aquellas del grupo de control. En otras palabras, las células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH--296 en una etapa temprana de la i expansión de la población de células T, se aclaró que se podría obtener una población de células que tenía una actividad citotóxica específica para aloantígenos aún más fuerte por medio de la MLR alogénica. (6) Almacenamiento de Células Cultivadas Las células en el decimocuarto día del cultivo preparadas en el punto (2) del Ejemplo 14 se sujetaron a un I almacenamiento congelado y se fundieron de la misma manera i que en el punto (4) del Ejemplo 5. Las células se sujetaron i a cada experimento. j (7) Inducción dé CTLs Específicos para un Antígeno Asociado Antitumor , (MART-1) Utilizando las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 1 y el punto (6) del Ejemplo 14, la inducción de CTLs específicos para un antígeno asociado antitumor (MART-1) se llevó a cabo de ¡ la misma manera que en el punto (5) del Ejemplo 5 y el cultivo continuó durante catorce días, con la condición de que las modificaciones se hicieran de la siguient manera: Las características incluyen las células respondedoras que se suspendieron en 5HRPMI para tener una densidad de 1 x 106 células/mL y la suspensión se agregó a una ¡placa de cultivo de células de 24 pocilios en un volumen ¡de 0.5 mL/cada pocilio; en el tercer día desde el inicio del cultivo, la mitad del volumen del sobrenadante del cultivo se retiró y 1 mL de 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 entonces se agregó a cada pocilio; después de una semana, las células cultivadas se ajustaron a una densidad- de 1.5 a 3.0 x 106 células/mL y las células que presentaban un antígeno se ajustaron a una densidad de 1.0 x 106 células/mL y cada suspensión de células se agregó en un volumen de 0.5 mL/pocillo; y en el I décimo día desde el inicio del cultivo, la mitad del I volumen del sobrenadante de cultivo se retiró y 1 mL de I . I 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 entonces se agrego a i cada pocilio. i (8) Ensayo de Actividad Citotóxica - La actividad citotóxica de los CTLs en el I decimocuarto día desde el inicio de la inducción, preparados en el punto (7), del Ejemplo 14 se sometió a ensayo de la misma manera que en el punto (9) del Ejemplo 6. Los resultados del ensayo de actividad citotóxica se muestran en la Tabla 40. - Tabla 40 Células Objetivo E/T Actividad Citotóxica (%) PBMÓs Control (Sin Inmovilización CH-296 de CH-296) T2 90 3.92 < 0 < 0 30 < 0 < 0 < 0 10 < 0 < 0 < 0 3 < 0 < 0 < 0 T2 + Péptido 90 59.86 61.55 65.59 MART-1 30 61.78 56.21 64.66 10 44.21 43.64 51.79 I 3 7.26 20.36 27.06 Como se muestra en la Tabla 40, en la población de CTL producida a partir del grupo CH-296, la actividad citotóxica específica de la población de CTL fue alta, en comparación con aquella del grupo de control y el grupo de PBMC. En otras palabras,, se aclaró que las células cultivadas en las cuales sé utilizó un equipo de cultivo I inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la población de células T se podrían inducir a I una población de CTL que ¡tenía una actividad citotóxica i específica aún más alta. Ejemplo 15: Inducción de CTLs Anti-MART-1 a Partir de Células T CD45RA* CCR7+ CD8+ y Células T CD45RA' CCR7" CD8+ Derivadas de Células Expandidas Utilizando una Bolsa de Cultivo Permeable al Gas con la Estimulación en una Etapa Temprana o el Cultivo Subsecuente de CH-296 (1) Aislamiento de Células T CD45RA+ CCR7+ CD8+ y Células T CD45RA" CCR7" CD8+ ¡ Las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 1 y aquellas preparadas en el punto (6) del Ejemplo 14 se aislaron en una fracción CD45RA+ CCR7+ CD8+ y una i fracción CD45RA" CCR7" CD8+ respectivamente, de la misma i i manera que en el punto (1) del Ejemplo 7, obteniendo por lo cual una fracción que tenía de 93 a 99% de pureza. (2) Inducción de CTLs Específicos para un Antígeno Asociado Antitumor (MART-1) Utilizando las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 15, la inducción de los CTLs específicos para un antígeno asociado antitumor ¡ (MART-1) se llevó a cabo de la misma manera que en el punto (7) del Ejemplo 14 y el cultivo I i continuó durante catorce días, con la condición de que las I modificaciones se hicieran j de la siguiente manera: Las características incluyen las células respondedoras que se I I f-suspendieron en 5HRPMI para tener una densidad de 1 x 10 células/mL y la suspensión se agregó a una placa de cultivo i de células de 48 pocilios ¡en un volumen de 0.25 mL/cada pocilio; en el primer día desde el inicio del cultivo, 0.5 mL de 5HRPMI que contenía 60 ¡U/mL de IL-2 se agregó a cada I pocilio; en el tercer día desde el inicio del cultivo, la mitad del volumen del sobrenaídante de cultivo se retiró y 0.5 mL de 5HRPMI que contenía 60¡ U/mL de IL-2 entonces se agregó a cada pocilio; después de una semana, las células cultivadas se ajustaron a una densidad ¡de 0.2 a 1.7 x 106 células/mL y las células que presenta an! un antígeno se ajustaron a una densidad de 1.0 x 106 células/mL y cada suspensión de células se agregó a una placa de cultivo de células de 24 pocilios en un volumen de 0.5 mL/pocill¡o; y en el décimo día desde el i inicio del cultivo, la mitad! del volumen del sobrenadante de 1 cultivo se retiró y 1 mL de1 5HRPMI que contenía 60 U/mL de IL-2 entonces se agregó a cada pocilio. (3) Determinación del Doblez de Expansión En cuanto a las células obtenidas en el punto (2) del Ejemplo 15, en el decimocuarto día desde el inicio del I cultivo, el número de células vivas se contó por medio del I método de tinción con azul de tripano y se calculó un doblez de expansión al comparar el número de células contadas con el número de ¡células al inicio del cultivo. i Los resultados se muestran en la Tabla 41.

Tabla 41 ¡ i n ' ? Células del Inicio del Cultivo ' Doblez de Expansión Control (Sin Inmovilización CH-296 de CH-296) Células T CD45RA+ CCR7+ CD8+ (%) ¡ x 2.36 x 5.38 I Células T CD45RA" CCR7" CD8+ (%) ¡ x 3.14 x 4.96 15 Como se muestra en la Tabla 41, en la población de I CTL inducida utilizando las células T CD45RA+ CCR7+ CD8+ aisladas de células cultivadas en las cuales se utilizó un I equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa 20 temprana de la expansión de la población de células T (referido en lo sucesivo como "el grupo CH-296"), el doblez de expansión de la población de CTL fue alto, en comparación con aquel del grupo de control. En otras palabras, se aclaró que la población de CTL se obtuvo en una cantidad más grande 25 al llevar a cabo la inducción de CTLs de las células T CD45RA+ CCR7+ contenidas em un porcentaje alto de células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivo i inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la i expansión de la población del células T. (4) Ensayo de Actividad Citotóxica La actividad citotóxica de las células en el decimocuarto día desde el inicio de la inducción, i preparadas en el punto (2)¡ del Ejemplo 15 se sometió a ensayo de la misma manera que en el punto (9) del Ejemplo 6, excepto que una relación de E/T se estableció de 30 a 3.

Los resultados para el ensayo de actividad citotóxica se muestran en la Tabla 42.

Tabla 42 Células del Células E/T Actividad Citotóxica (%) Inicio del Cultivo Objetivo PBMCs Control (Sin CH-296 Inmovilización de CH-296) Células T T2 30 < 0 N.T. < 0 CD45RA+ 10 < 0 < 0 < 0 I CCR7+ CD8+ 3 < 0 < 0 < 0 T2 + Péptido 30 56.77 N.T. 73.96 I MART-1 10 45.7 64.91 73.62 35.36 58.58 58.49 j Células T T2 30 < 0 N.T. < 0 CD45RA" 10 ' < 0 < 0 < 0 CCR7 CD8* 3 < 0 < 0 < 0 T2 + Péptido 30 9.75 N.T. < 0 I MART-1 10 ¡ < 0 1.5 < 0 I 3 < 0 1.5 3.87 N . T . : No sometido a prueba . i | Como se muestra e? la Tabla 42, en la población I de CTL inducida utilizando las células T CD45RA+ CCR7+ CD8+ aisladas del grupjo CH-296, las actividades citotóxicas específicas dé la población de CTL fueron altas, en comparación con aquellas del grupo de control y el grupo de PBMC. Además^ las actividades citotóxicas específicas fueron altas én comparación con aquellas de I la población de CTL inducidas utilizando las células T CD45RA" CCR7" CD8+. En otras palabras, se aclaró que las células T CD45RA+ CCR7+ CD8 I + las cuales están contenidas en un alto porcentaje en ¡las células cultivadas en las ¡ cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la i i población de células T se podrían inducir a una población de CTL de la cual las actividades citotóxicas específicas eran aún más altas. i Ejemplo 16: Determinación de la Capacidad para Reconocer un Antígeno de los CTLs (1) Inducción de CTLs Específicos para un Antígeno Asociado Antitumor (MART-1) I Utilizando Las células preparadas en el punto (1) del Ejemplo 1 y el punto (6) del Ejemplo 14, la inducción de CTLs específicos para un antígeno asociado antitumor I (MART-1) se llevó a cabo de ¡la misma manera que en el punto (7) del Ejemplo 14 y el cultivo continuó durante quince días. J I (2) Determinación¡ de la Capacidad para Reconocer un Antígeno La capacidad para reconocer un antígeno de los CTLs en el decimoquinto ¡ día desde el inicio de la inducción, preparados en el punto (1) del Ejemplo 16 se I determinó de la misma manera que en el punto (2) del i Ejemplo 8. Los resultados de la determinación de la i capacidad para reconocer un antígeno se muestran en la Tabla 43. La capacidad para reconocer un antígeno se expresó como un valor relativo de la actividad citotóxica en cada concentración de1 péptido agregado cuando la actividad citotóxica a una concentración de un péptido agregado a las células objetivo de 10 µM se asumió que era 100.

Tabla 43 Concentración Final de Péptido Valor Relativo de Actividad Citotóxica a 10 µM de Agregado a Células Objetivo ¡ Péptido Agregado i (µM) PBMCs Control (Sin Inmovilización CH-296 de CH-296) .0 100 100 100 1.0 101.58 86.33 99.59 0.1 88.24 80.78 89.13 0.01 72.03 64.48 67.28 0.001 25.18 26.72 48.35 0.0001 11.47 2.45 21.59 0.00001 6.32 3.07 15.6 o 8.4 < 0 8.17 Como se muestra e? la Tabla 43, en la población de CTL inducida a partir del grupo CH-296, aún las células objetivo a las cuales se agregó un péptido de antígeno en una concentración aún más baja se eliminaron, en comparación con aquellas del grupo de control y el grupo de PBMC, de manera que la capacidad para reconocer un antígeno específico de la población de CTL fue alta. En otras palabras, se aclaró que las células cultivadas en las cuales se utilizó un equipo de cultivo inmovilizado con CH-296 en una etapa temprana de la expansión de la población 1 I de células T se podrían inducir a una población de CTL que tenía una capacidad para reconocer un antígeno aún más alta. Ejemplo 17: Evaluación de la Capacidad para Producir Citocinas de Células T CD45RA* CCR7* Derivadas de Células Expandidas Utilizando una Bolsa de Cultivo Permeable al Gas con la Estimulación en una Etapa Temprana y el Cultivo Subsecuente de CH-296 (1) Aislamiento de Células T CD45RA+ CCR7+ y Células T CD45RA" CCR7" ¡ Las células preparadas en el punto (6) del i Ejemplo 14 se tiñeron y se ¡sujetaron a la clasificación de ! la misma manera que en el punto (3) del Ejemplo 3. I (2) Inmóvilizació? del Anticuerpo Anti-CD3 Humano y el Anticuerpo Anti-CD28 Humano y Estimulación de Células ; A fin de estimul Iar las células aisladas, un i anticuerpo anti-CD3 humano y un anticuerpo anti-CD28 humano se inmovilizaron en una placa de cultivo de la misma manera que en el punto (4) del Ejemplo 3. Cada población de células obtenida en el punto (1) del Ejemplo 17 se suspendió en GT-T503 al 0.5%, las células se agregaron a cada pocilio de la placa preparada para tener una densidad de 2 x 105 células/0.2 mL yi se cultivaron a 37°C en C02 al %. Después de 24 horas, iel sobrenadante de cultivo se recolectó y se utilizó para el experimento para la determinación de citocina de acuerdo con un método de ELISA. I (3) Determinacióni de Producción de IL-2 de Acuerdo con un Método de ELISA En la expansión ¡de linfocitos para propósitos clínicos, se ha utilizado una bolsa de cultivo permeable al gas que es capaz de cultiyar las células en un sistema I cerrado. Aún cuando las células se expandieron utilizando i la bolsa en el Ejemplo ¡14, en el grupo CH-296, se obtuvieron los resultados d un porcentaje más alto de las células T CD45RA+ CCR7+, e? comparación con aquellos del grupo de control. A fin de confirmar que esta población de células T CD45RA+ CCR7+ mantenía su propiedad como células I tipo T naturales, la capacidad para producir IL-2 de las células T CD45RA+ CCR7+ y las células T CD45RA" CCR7" se evaluó de la misma manera que en el punto (6) del Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla 44.

Tabla 44 j Inmovilización de CH-296) ¡ IL-2 (pg/mL) Células T CD8+ Células T CD45RA+ CCR7+ 347.2 Células Ti CD45RA" CCR7" < 0 Células T CD8" Células T CD45RA+ CCR7+ 1686.7 Células T, CD45RA" CCR7" 215.6 ! Como se muestra eñ la Tabla 44, la producción de IL-2 en células T CD45RA+ CCR7+ fue dominante en tanto las células T CD8+ como las células T CD8d Como ya se mostró en el punto (6) del Ejemplo 3, se mostró también en este ejemplo que la población de células T CD45RA+ CCR7+ de i -células congeladas que se cultivaron en una bolsa utilizando CH-296 tuvieron propiedades que sirven como células tipo T naturales. ¡ Ejemplo 18: Análisis de células T CD45RA+ CCR7+ en una Población de Células T Expandida Utilizando H-296, CH- 271, H-271 o C-CSl | (1) Inmovilización del Anticuerpo Anti-CD3 Humano y un Fragmento H-296, CH-271, H-271 o C-CSl Se llevaron a cabo los mismos procedimientos que i en el punto (1) del Ejemplo^, excepto que no se utilizó el fragmento CH-296 sino que én cambio se agregó cada uno de i los fragmentos H-296, CH-271, H-271 o C-CSl en lugar del grupo con la adición del fragmento para tener una concentración final de 25 µg/mL. i (2) Expansión de una Población de Células T Se llevaron a cabo los mismos procedimientos que aquellos del punto (1) del Ejemplo 3 excepto que en el cuarto día desde el inicio del cultivo, el medio de cultivo i se diluyó aproximadamente 14 veces y 10 mL de la dilución se agregaron a un matraz de cultivo de células de 25 cm2 totalmente nuevo (manufacturado por Corning) y que el i subcultivo no se llevó a cabo en el séptimo día. El cultivo I continuó durante 9 días . Los resultados de las veces de expansión en el octavo día desde el inicio del cultivo se muestran en la Tabla 45.

Tabla 45 Doblez de Expansión (veces) Control (Sin Inmovilización de CH-296) x 207 H-296 x 264 CH-271 x 250 H-271 x 221 C-CS1 x 252 Como se muestra erí la Tabla 45, en el grupo en el I cual se utilizó un equipo ¡de cultivo inmovilizado con H- I 296, CH-271, H-271 o C-CSl en una etapa temprana de la i expansión de la población de células T (referido en lo sucesivo como "el grupo de fragmento"), el doblez de ! expansión de la población de células T fue alto en i comparación con aquel del grupo de control. (3) Análisis de Células T CD45RA+ CCR7+ Para las células preparadas en el punto (2) del Ejemplo 18, un porcentaje de células T CD45RA+ CCR7+ en el noveno día desde el inicio' del cultivo se calculó de la misma manera que en el punto (2) del Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la- Tabla 46.

Tabla 46 Células T CD45RA+ CCR7+ (%) Control (Sin Inmovilización de CH-296) I 38.7 H-296 ' 58.15 CH-271 56.3 i H-271 i 49.75 C-CS1 i 44.79 Como se muestra en la Tabla 46 , en el grupo de fragmento , se obtuvieron los resultados de la población de i células T CD45RA+ CCR7+ más alta en la población de células T durante el cultivo, en comparación con aquel del grupo de control .

APLICABILIDAD INDUSTRIAL De acuerdo con ' la presente invención, se proporciona un método para producir una población de i células T. El método se ¡utiliza adecuadamente en, por ejemplo, la inmunoterapia, como una población de células T que contiene un alto porcentaje de células T capaz de expresar CD45RA y por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7 , CD27 Y CD28. Por consiguiente, se espera que el método de la presente invención contribuya en gran medida a los campos médicos.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar una población de células T, en donde la población de células T expresa t CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo I que consiste de CD62L, CCR7, CD27 y CD28, caracterizado porque el método comprende el paso que consiste en cultivar una población de células , que comprende células T, en presencia de fibronectina, ,un fragmento de la misma o una mezcla de la misma. j I I
2. 2. El método j de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los días de cultivo totales que comprenden el ¡paso de cultivo son de 4 a 14 i días . I
3. 3. El método ; de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el cultivo en presencia de fibronectina, ,un fragmento de la misma o una mezcla de la misma se lleva a cabo por lo menos al inicio del cultivo.
4. 4. El método ' de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el cultivo en presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma se lleva a cabo durante por lo menos un día o más .
5. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el paso de cultivo en presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de la misma se lleva a cabo en presencia de un ligando de CD3.
6. 6. El método , de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el ligando de CD3 es un anticuerpo anti-CD3.
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el fragmento de fibronectina1 es un polipéptido (m) que i comprende por lo menos cualquiera de las secuencias de ! aminoácidos mostradas en l s SEQ ID NOs : 1 a 8 del listado i de secuencias o un polipéptido (n) que comprende por lo I menos una secuencia de ' aminoácidos que tiene una sustitución, supresión, inserción o adición de uno o el número plural de aminoácidos en cualquiera de las i secuencias de aminoácidos,' en donde el polipéptido (n) tiene una función equivalente a aquella del polipéptido (m) .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el fragmento de fibronectina es un polipéptido que comprende todas las I secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs: 1 a 3 y 5 a 8 del listado de secuencias .
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de ! las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque además comprende el paso que consiste en separar una población de I células que expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de CD45RA, CD62L, CCR7 , CD27 y CD28.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a ¡9, caracterizado porque además comprende el paso que consiste en transducir un gen extraño dentro de la población de células. I
11. 11. El método , de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el gen extraño se I transduce utilizando un vector de retrovirus, vector de I adenovirus, vector de virus adeno-asociado, vector de lentivirus o vector de virus de simio.
12. 12. Una población de células T obtenida por medio del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en! donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del i grupo que consiste de CD62L) CCR7, CD27 y CD28.
13. 13. Un medicamento, caracterizado porque comprende como ingrediente efectivo la población de células T obtenida por medio del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de CD62L, CCR7, CD27 y CD28.
14. 14. Un método para tratar o prevenir una enfermedad, caracterizado ¡porque comprende el paso que consiste en administrar a un sujeto una cantidad efectiva I de la población de células ,T obtenida por medio del método I de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la población j de células T expresa CD45RA y i expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consta de CD62L, CCR7, CD27 y CD28. ¡
15. 15. El uso de la¡ población de células T obtenida por medio del método de conformidad con cualquiera de las I reivindicaciones 1 a 11, en¡ donde la población de células T S expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de CD6.2L, CCR7, CD27 y CD28, en la i manufactura de un medicamentio.
16. 16. Un método para preparar una población de i células T, caracterizado porque el método comprende el paso que consiste en estimular la población de células T obtenida por medio del métodio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que ¡consiste de CD62L, CCR7, CD27 y CD28, con por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que! consta de una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3, ligando de CD28, citocina, quimiocina y célula capaz de producir una citocina.
17. 17. Una poblaci n de células T, caracterizada porque se obtiene por medió del método de conformidad con la reivindicación 16. i i
18. 18. Un medicamento, caracterizado porque comprende como ingrediente efectivo la población de células T obtenida por medio del ¡ método de conformidad con la I reivindicación 16. ¡
19. 19. Un método ¡para tratar o prevenir una r enfermedad, caracterizado ¡porque comprende el paso que consiste en administrar a ún sujeto una cantidad efectiva de la población de células ¡T obtenida por medio del método de conformidad con la reivindicación 16.
20. 20. El uso de la población de células T obtenida por medio del método de conformidad con la reivindicación 16 en la manufactura de un medicamento. I
21. 21. Un medicamento, caracterizado porque comprende: (a) una preparación que comprende como ingrediente efectivo, la población de células T obtenida por medio del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en¡ donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de CD62L, CCR7 , CD27 y CD28; y (b) una preparación que comprende como ingrediente efectivo por lo menos un factor de estimulación seleccionado del grupo que consiete de una célula capaz de presentar un antígeno, célula que ha presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3 , ligando de CD28, citocina, quimiocina y célula capaz de producir una citocina, en donde las preparaciones están comprendidas en el medicamento como dos preparaciones i separadas que se administran de manera simultánea o por separado .
22. 22. Un método ¡para tratar una enfermedad, caracterizado porque el método comprende los siguientes pasos (a) y (b) que consisten en: (a) administrar a un ! paciente la población de células T obtenida por medio del I método de conformidad j con cualquiera de las I reivindicaciones 1 a 11, enj donde la población de células T expresa CD45RA y expresa por lo menos uno seleccionado del I grupo que consiste de CD62L, CCR7, CD27 y CD28; y (b) i administrar a un paciente por lo menos un factor de i estimulación seleccionado del grupo que consiste de una célula capaz de presentar1 un antígeno, células que ha i presentado un antígeno, antígeno, ligando de CD3 , ligando de CD28, citocina, quimiocína y célula capaz de producir i una citocina. ' ¡