DK175365B1

DK175365B1 - DNA-Konstruktioner indeholdende en kluyveromyces-alfa-faktor-leAdersekvens til at dirigere sekretion af heterologe polypeptider

Info

Publication number: DK175365B1
Application number: DK198804222A
Authority: DK
Inventors: Anthony J Brake; Johannes A Van Den Berg
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 1987-07-28
Filing date: 1988-07-28
Publication date: 2004-09-13
Also published as: HU213015B; DE3881776D1; NO180381B; FI883541A0; IE882313L; CA1327762C; FI101232B; FI101232B1; JPH01124390A; DK422288A; PT88115A; EP0301669A1; IL87255A0; DK422288D0; CN1045620C; NO180381C; KR970004940B1; PT88115B; IL87255A; HUT47638A

Description

i.k, '?«3»-.nM^—^^»^ar?roc-rpnTr-y-.-11 ~ * j » W& i '_·ι»·:;.ΐΕ:Μρ^ι^·3ίΡΜΠ^^^^·ΐΓΗ?ΡΒ·ΤίηΓ¥>ΒΜ:ΜΐΓ ' mmwinii·μ~.τ.«^τ—ε»^·κ»·«β—BB^»-mcpg[jiy^|pp—»imi w.re««»as»»·nw··»r. i DK 175365 B1 i

Opfindelsen angår rekombinant DNA-teknologi.

Nærmere angivet angår opfindelsen anvendelsen af Kluyveromyces-a-faktor-leadersekvenser til at dirigere sekretionen af heterologe polypeptider i gær.

5 US patentskrift nr. 4.546.082 beskriver a- faktor-precursorgenet fra Saccharomyces cerevisiae og angiver at vise DNA-konstruktioner for Saccharomyces cerevisiae-leadersekvensen og heterologe gener, der er anvendelige til sekretorisk ekspression af de heterolo-10 ge gener.

Europæisk patentpublikation EPA 0.116.201 beskriver den faktiske anvendelse af S.cerevisiae-a-fak-tor-leadersekvensen til opnåelse af sekretorisk ekspression af human epidermal vækstfaktor i gær. US patentan-15 søgning Serial nr. 522.909, indleveret 12. august 1983, beskriver anvendelsen af "spacer-løse" S.cerevisiae-α-faktor-leadersekvenser til opnåelse af mere effektiv sekretorisk ekspression af heterologe gener.

Science ( 1985) 229: 1219-1224, rapporterer om 20 anvendelsen af S.cerevisiae-a-faktor-sekvenser til at dirigere sekretion af prochymosin. Det er rapporteret, at det meste af det dannede prochymosin var til stede i en intracellulær uopløselig form i stedet for at blive sekreteret. Selvom invertase-leaderen var mere effektiv.

25 i henseende til at dirigere sekretion af aktiverbart prochymosin, var en ekstensiv mutant-screening nødvendig for at opnå rimelige mængder af prochymosin-sekretion.

Der er ikke tidligere demonstreret produktion af 30 parrings-pheromoner (α-faktor og a-faktor) ved hjælp af K.lactis-celler eller andre Kluyveromyces-arter. Denne manglende identifikation af sådanne peptider i K.lactis kan delvis skyldes den kendsgerning, at parring i K.lactis er inducerbar, mens parrings-pheromonerne i 35 S.cerevisiae produceres konstitutivt.

Uanset tilgængeligheden af de nævnte leadersek-venser til at dirigere sekretion af heterologe polypep-

DK 175365 B1 I

tider i gær, er der et fortsat behov for alternative I

sekvenser, der kan give roere effektiv eller mere prak- I

tisk produktion af særlige polypeptider. Ansøgerne har I

derfor søgt at fastslå, oro der eksisterer en I

5 K.lactis-a-faktor, og om den i så fald kan være anven- I

delig til at dirigere sekretion af heterologe polypep- I

tider, såsom prochyroosin, i gær. I

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer I

DNA-konstruktioner baseret på Kluyveromyces-a-faktor- I

10 leadersekvensen til at dirigere sekretion af heterologe I

polypeptider i gær. Kluveromyces-transformanter inde- I

holdende disse konstruktioner tilvejebringer effektiv I

sekretion af polypeptider, såsom prochymosin. I

Ifølge en udførelsesform for opfindelsen er der

15 således tilvejebragt en DNA-konstruktion, der indkoder I

et protein, hvis aminosyresekvens omfatter en I

sekretions-dirigerende Kluyveromyces-a-faktor- I

leadersekvens forbundet til en heterolog polypeptidsek- I

vens via gær-oparbejdningssignaler for oparbejdning af I

20 nævnte protein til det heterologe polypeptid. I

Ifølge en anden udførelsesform for opfindelsen I

er der tilvejebragt en ekspressionsvektor omfattende I

et replikativt eller integrativt system, der er funk- I

tionelt i en gærvært, og en DNA-konstruktion, der ind- I

25 koder et protein, hvis aminosyresekvens indeholder en I

sekretions-dirigerende Kluyveromyces-a-faktor- I

leadersekvens forbundet til en heterolog polypeptidsek- I

vens via et gær-oparbejdningssignal for oparbejdning af * I

nævnte protein til nævnte heterologe polypeptid. I

30 Ifølge endnu en udførelsesform for opfindelsen I

er der tilvejebragt en fremgangsmåde til fremstilling I

af et heterologt polypeptid i gær, hvilken fremgangsmå- I

de indebærer, at gær, der indeholder ovennævnte ek- I

spressionsvektor, dyrkes i dyrkningsmedium under betin- I

35 gelser, véd hvilke nævnte heterologe polypeptid ekspri- I

meres i og sekreteres af nævnte gær som et I

DK 175365 B1 I

"propolypeptid", og polypeptidet i det mindste delvis I

oparbejdes til nævnte heterologe polypeptid. I

I det følgende henvises til tegningerne, på I

hvilke I

5 Fig. 1 viser den strategi, der anvendes til at I

konstruere oligonucleotid-prober, som anvendes I

til at identificere K.lactis-a-faktor-DNA, I

Fig. 2 viser den komplette sekvens af et I

DNA-fragment, der indkoder K.lactis-a-faktoren, I

10 Fig. 3 viser en sammenligning mellem proteinsek- I

vensen for K-lactis- og S-cerevisiae-a-faktorer, I

Fig. 4 skematisk viser K-lactis- og S- I

cerevisiae-a-faktorer, I

Fig. 5 er en sammenligning mellem I

15 DNA-sekvenserne fra gener, der indkoder K- I

lactis- og S-cerevisiae-a-faktorerne, I

Fig. 6 skematisk viser tre plasmider, hvis kon- I

struktioner er beskrevet detaljeret i eksempler- I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Ifølge opfindelsen bliver gærceller anvendt til 35 fremstilling af modne heterologe polypeptider, hvor så danne polypeptider kan indhøstes direkte fra et

Fig. 7 er et reaktionsskema, der viser bindingen I

2

af DNA for K. lactis-a-f ak tor-lead er til dna for I

3 prochymosin, 4

Fig. 8 viser sekvensen af pAB309 5

BamHI/Sall-insertion i pUC18, 6

Fig. 9 er et diagram over plasmidet pGB901, 7

Fig. 10 er et diagram over plasmidet pGBTeG418, 8

Fig. 11 repræsenterer sekvenserne af de primere, 9 der anvendes til mutagenese af 10 K-lactic-a-faktor-leader-DNA, og 11

Fig. 12 repræsenterer DNA-sekvenserne omkring samlingerne i K.lactis-a-faktor-leader/prochymo-sin-DNA-fusioner.

I DK 175365 B1 næringsmedium. Polypeptiderne fremstilles ved at anven- H de en DNA-konstruktion, der koder for en Kluyveromyces- H α-faktor-leader og oparbejdningssignalsekvens forbundet til det tilsigtede heterologe polypeptid, der kan være 5 et enkelt heterologt polypeptid eller flere heterologe polypeptider adskilt ved oparbejdningssignaler. Den re-

suiterende konstruktion indkoder et præpropolypeptid, I

der vil indeholde signalerne for sekretion af præpropo- lypeptidet og oparbejdning af polypeptidet, enten in- 10 tracellulært eller ekstracellulært, til det modne poly- peptid.

De omhandlede konstruktioner vil omfatte en DNA-sekvens med følgende formel, der indkoder for et

H propolypeptid: I

I 15 (XY-(ZW)n-Gerie*)y hvor: X er en codon for lysin eller arginin, y er en codon for arginin, w er en codon for alanin eller prolin, H 20 Z er en codon for en aminosyre, fortrinsvis en co- don for serin, lysin eller asparagin, når w I indkoder prolin, og en codon for glutaminsyre, asparagin, asparaginsyre eller serin, når W ind- I koder alanin, I 25 y er et helt tal på mindst 1 og sædvanligvis højst 10, navnlig højst 4, tilvejebringende monomere og multimere, I Gene* er et gen forskelligt fra vildtype-Kluyveromyces- I -α-faktor associeret med leadersekvensen, og som

I 30 er fremmed for en gærvært, sædvanligvis et I

I plante- eller pattedyr-gen, I n er 0 eller et helt tal, der i almindelighed vil variere fra 1 til 8, sædvanligvis 3 til 7, hvor- I hos n fortrinsvis er 0.

I 35 I I denne formel definerer de aminosyrer, der ind- I kodes af X, Y, Z og w, a-faktor-oparbejdningssignalet, 5 DK 175365 B1 hvori de af X og Y indkodede aminosyrer definerer et dipeptid-kløvningssted, og de af Z og w indkodede definerer en oligopeptid-spacer. Som vist ved den kendsgerning, at n kan være 0, er spaceren valgfri. Hvis der 5 foreligger en spacer, vil konstruktionen typisk indholde yderligere sekvenser, der tillader fjernelse af N-terminale rester defineret af spaceren, for at tilvejebringe det af Gene* indkodede modne protein.

De omhandlede konstruktioner vil for de flestes 10 vedkommende have i det mindste følgende formel: L-(XY-(ZW)n-Gene*)y der indkoder et præpropoly peptid, hvor L er en 15 Kluyveromyces-leadersekvens, der sørger for sekretion af præpropolypeptidet, og de andre symboler er som ovenfor defineret. Enhver Kluyveromyces-leadersekvens kan anvendes, der tilvejebringer sekretion, hvorhos leadersekvenser i almindelighed er på ca. 20 til 120 20 aminosyrer, sædvanligvis ca. 30 til 100 aminosyrer, omfattende en hydrofob region og med en methionin som N-terminus.

Leadersekvensen, L, kan være en a-faktor-leader-sekvens af fuld længde fra enhver art til Kluyveromy-25 ces, såsom K.lactis og K.fragilis, eller et funktionelt (dvs. i stand til at dirigere sekretion) fragment, en funktionel mutation, enten konservativ eller ikke-konservativ, sædvanligvis højst 5, navnlig højst 3 forskellige aminosyrer, eller analoge deraf. Funktio-30 nelle fragmenter kan identificeres ved at fremstille konstruktioner med forskellige længder af vildtype-fuldlængde-sekvensen og screene dem for deres evne til at dirigere sekretion. Gen-sekvensen for vildtype-K-lactis-a-faktor er vist i Fig. 2, idet leadersekvensen 35 er det DNA, der indkoder aminosyrer 1-83. DNA-Sekvensen i fig. 2 er ikke essentiel. Enhver sekvens, der koder I DK 175365 B1

I I

I for et funktionelt Kluyveromyces-leader-oligopeptid, er I

tilstrækkeligt. Forskellige sekvenser vil blive trans- I

I lateret mere eller mindre effektivt. Det er ønskeligt, I

I at ihvertfald hovedparten af gær-foretrukne codoner an- I

I 5 vendes i sekvensen. I

I ved tilvejebringelse af anvendelige DNA- I

I sekvenser, der kan anvendes som kassetter til ekspres- I

I sion, kan der hensigtsmæssigt anvendes følgende sek- I

I vens: I

I 10 I

I Tr-L-(XY-(ZW)n-(Gene*)d)y I

I hvor: I

I Tr angiver en DNA-sekvens, er koder for de I

15 transkriptions-regulerende signaler, navnlig I

I promotoren og sådanne andre reguleringssignaler I

I som operatorer, aktivatorer, cap-signal eller I

anden sekvens, der er involveret i I

transkriptions- eller translationsstyring, I

I 20 d er 0 eller 1, idet det er 1, når y er større end I

1. I

I Tr-Sekvensen vil i almindelighed være på mindst I

I ca. 100 bp og højst ca. 2000 bp. Særligt anvendeligt er I

det at anvende Tr-sekvensen associeret med leadersek- I

I 25 vensen L, således at der kan anvendes et DNA-fragment, I

I der indeholder transkriptions- og translations- I

I signalsekvenserne associeret med den signalsekvens, der I

er endogen for værten. Alternativt kan der anvendes I

I andre transkriptions- og translations-signaler for at I

I 30 tilvejebringe forøget produktion af ekspressionsproduk- I

I tet. I

De øvrige symboler er som ovenfor defineret. I

31-Terminus'en af Gene* kan manipuleres langt I

I lettere i form af en konstruktion, der tillader inser- I

I 35 tion af Gene* i et unikt restriktionssted i I

konstruktionen. En sådan foretrukket konstruktion vil I

7 DK 175365 B1 tilvejebringe et restriktionssted, hvor insertion af Gene*’et i restriktionsstedet vil være i ramme med initiationscodonen. En sådan konstruktion kan symboliseres ved følgende: 5 (Tr)a-L-XY-(ZW)n-(SC)b-Te hvor: de tidligere definerede symboler har samme def-10 inition her, a er 0 eller l tilkendegivende, at konstruktionen kan have eller ikke have transkriptions- og translations-signalerne, SC repræsenterer et stopcodon, 15 Te er en transkriptions-terminationssekvens og kan indeholde andre signaler, f.eks. polyadenyle-ring, og b er et helt tal, der i almindelighed vil variere fra ca. 0 til 4, navnlig fra 0 til 3, idet det 20 skal forstås, at Gene* kan indeholde sin egen stop-codon.

Sekvensen opstrøms fra Gene* kan konstrueres således, at den tilvejebringer hensigtsmæssige restriktionssteder med henblik på at tillade en given art af 25 Gene* at blive erstattet med andre arter af Gene*.

Linkere og adaptorer kan anvendes, som nødvendigt, til at opnå sådan udskiftning.

Konstruktionen tilvejebringer en transportabel sekvens til insertion i vektorer, der tilvejebringer 30 det ønskede replikationssystem. Som allerede omtalt, kan det i nogle tilfælde være ønskeligt at erstatte vildtype-promotoren, der er associeret med signalsekvensen, men en anden promotor. I gær kan promotorer, der er involveret med enzymer i den glycoly-35 tiske vej, tilvejerbringe høje transkriptionsgrader.

Disse promotorer er associeret med sådanne enzymer som I DK 175365 B1

I I

phosphoglucoisomerase, phosphofructokinase, phospho- I

I triose-isomerase, phosphoglucomutase, enolase, pyro- I

druekinase, glyceraldehyd-2-phosphat-dehydrogenase og I

I alkoholdehydrogenase. Disse promotorer kan indsættes I

5 opstrøms fra signal-sekvensen. 5'-Flankeringsregionen I

I til leadersekvensen kan bevares eller erstattes med I

I 3'-sekvensen af den alternative promotor. Der kan frem- I

I stilles og er rapporteret om vektorer, der indeholder I

promotorer med hensigtsmæssige restriktionssteder ned- I

I 10 strøms fra promotoren til insertion af sådanne kon- I

struktioner, som beskrevet ovenfor. I

Den endelige ekspressionsvektor vil omfatte ek- I

I spressionskassetten og et replikativt eller integrativt I

system, der er funktionelt i og tilvejebringer stabil I

I 15 bevaring i gærværten. Vektoren kan eventuelt indholde I

et replikationssystem, der tillader kloning i en I

prokaryot. Endvidere vil én eller flere markører til I

selektion være inkluderet, hvilket vil tillade selek- I

tiv pression til bevaring i værten. Yderligere kan vek- I

20 toren være et højt eller lavt kopiantal, idet kopian- I

I tallet i almindelighed ligger fra ca. 1 til 200. Ved I

I højkopiantals-vektorer vil der i almindelighed være et I

kopiantal på mindst 10, fortrinsvis mindst 20 og sæd- I

vanligvis ikke over 150, for det meste ikke over ca. I

25 100. Alt efter Gene*'et kan det være ønskeligt med høje I

eller lave kopiantal, afhængigt af vektorens effekt på I

værten. Hvor tilstedeværelsen af vektorens ekspres- I

sionsprodukt kan have en skadelig indvirkning på vær- I

tens levedygtighed, kan det være passende med et lavt I

30' antal. I

Forskellige værter kan anvendes, navnlig mutan- I

ter med ønskede egenskaber. Alt efter produktionsha- I

stigheden for konstruktionens ekspressionsprodukt kan I

oparbejdningsenzymet være eller ikke være adækvat for I

35 oparbejdning ved nævnte produktionsniveau. Derfor kan I

en mutant med forøget produktion af oparbejdningsenzy- I

-— -------- ' -—-?' ....... .. .....^ DK 175365 Β1 9 met (dipeptidylaminopeptidase A og/eller lys-arg-endopeptidasen) være passende, eller forøget produktion af enzymet kan tilvejebringes ved hjælp af en vektor. I almindelighed skal produktionen af enzymet være af en 5 lavere orden end produktionen af det ønskede ekspressionsprodukt .

Alternativt kan der være situationer, hvor intracellular oparbejdning ikke er ønsket. I denne si-I tuation kan det være nyttigt at have en mutant, hvor I 10 der forekommer sekretion, men hvor produktet ikke I oparbejdes. På denne måde kan produktet derefter opar- I bejdes in vitro.

I Vært-mutanter, der tilvejebringer styret ek- I spressionsregulering, kan med fordel anvendes. Med de I 15 omhandlede konstruktioner, hvor et fusioneret protein I eksprimeres, har for eksempel transformanterne langsom I vækst, hvilket synes at være et resultat af toxicitet I hos det fusionerede protein. Ved at inhibere ekspres- I sion under vækst kan værten således dyrkes til høj tæt- I 20 hed, førend der skiftes til betingelser, der tillader I ekspression.

I Som allerede omtalt, kan endvidere Gene* have I flere sekvenser i tandem, enten den samme sekvens eller I forskellige sekvenser, med intervenerende I 25 oparbejdningssignaler. På denne måde kan produktet I oparbejdes helt eller delvis med det resultat, at man I vil opnå de forskellige sekvenser enten alene eller i I tandem til efterfølgende oparbejdning. I mange situa- I tioner kan det være ønskeligt at tilvejebringe forskel- I 30 lige sekvenser, hvor hver af sekvenserne er en underen- I hed af et særligt proteinprodukt.

I Gene* kan indkode enhever polypeptidtype af I interesse. Polypeptidet kan være så lille som et oligo- I peptid på 8 aminosyrer eller kan være på 100.000 dalton I 35 eller højere. Sædvanligvis vil enkelte kæder være mind- I re end ca. 300.000 dalton, oftere mindre end ca.

I DK 175365 B1 I 10

I 150.000 dalton. Af særlig interesse er polypeptidet på I

I ca. 5000 til 150.000 dalton, navnlig på ca. 5.000 til I

I 100.000 dalton. Illustrerende polypeptider af interesse I

I omfatter hormoner og faktorer, såsom væksthormon, soma- I

I 5 tomediner og epidermal vækstfaktor, de endocrine sekre- I

tioner, såsom luteiniserende hormon, thyroid- I

I stimulerende hormon, oxytocin, insulin, vasopressin, I

renin, calcitonin, follikel-stimulerende hormon, pro- I

I lactin, osv., hæmatopoiete faktorer, f.eks. erythro- I

I 10 poietin, kolonistimulerende faktor, osv., lymfokiner, I

I globiner, globuliner, f.eks. immunoglobuliner, albu- I

I miner, f.eks. serumalbuminer, såsom humant serumalbumin, I

I interferoner, såsom α, β og 6, repressorer, enzymer, I

I f.eks. chymosin eller dets zymogener, a- og β-amylase, I

I 15 glucoamylase, pullulanase, xylanase, glucoseisomerase, I

I cellulase, lipase, fosofolipase, osv., endorphiner, I

I f.eks. β-endorphin, enoephalin, dynorphin, osv. I

I Efter fremstilling af vektorerne indeholdende de I

omhandlede konstruktioner kan de derefter indføres i I

20 gærværten. Gær-slægten og -arten er ikke af kritisk be- I

I tydning. Eksempler på gærværter er Kluyveromyces og I

Saccharomyces. Indføringsmetoden er konventionel, idet I

der er mange forskellige måder til indføring af DNA i I

gærværten. Se for eksempel Hinnen et al, Proc. Acad. I

25 Natl. Sci. USA (1978) 75:1919-1933 eller Das et al., I

I J.Bacteriol. (1984) 158:1165-1167 eller Stinchcomb et I

I al., EPA 0.045.573. De resulterende transformanter kan I

I derefter dyrkes i et passende næringsmedium, idet der I

I eventuelt opretholdes selektivt tryk på I

I 30 transformanterne. Hvor ekspression kan induceres, kan I

I der sørges for vækst af gæren til høj tæthed, hvorefter I

ekspression induceres. I de situationer, hvor en bety- I

delig del af produktet kan bevares i det periplasmiske I

rum, kan produktet frigøres ved at behandle gærcellerne I

35 med et enzym, såsom zymolase eller lyticase. I

Produktet kan indhøstes på konventionel måde, I

I indkluderende rensning af proteinet ved chromatografi, I

I elektroforese, dialyse opløsningsmiddelekstraktion osv. I

11 DK 175365 B1 Følgende fremgangsmåde kan gennemføres med henblik på at opnå gener, der koder for α-faktorer fra Kluyveromyces-artstammer forskellige fra K.lactis-stammen eksemplificeret nedenfor. En radioaktivt mærket 5 oligonucleotid-probe med en af de i Fig.i viste strukturer fremstilles og anvendes til at probe digererings-produkter af genomisk DNA fra den anden stamme. Alternativt kunne et nick-translateret fragment af S-cerevisiae-a-faktorgenet anvendes som en probe. En an-10 vendelig teknik består i at indsætte segmenter fra en begrænset endonuclease-digerering af genomisk DNA i plasmid og anvende disse plasmider til at transformere E.coli eller anden bakteriestamme, således at der opnås et plasmidbibliotek. DNA fra kolonierne kan derefter 15 hybridiseres passende til proben på nitrocellulosefiltre.

DNA-Segmenter identificeret ved hybridisering til proberne identificeret ovenfor underkastes derefter digerering med forskellige restriktionsenzymer, og de 20 resulterende fragmenter analyseres ved Southern blot eller lignende analysemetode under anvendelse af de samme hybridiseringsprober med henblik på at identificere restriktionsfragmenter af en for DNA-sekvensanalyse passende størrelse. Identificerede 25 fragmenter renses derefter og klones under anvendelse af passende vektorer for at fremstille tilstrækkeligt DNA til en DNA-sekvensanalyse.

ved anvendelse af disse teknikker kan Kluyveromyces-a-faktor-gener opnås ud fra andre stammer 30 end de heri specifikt identificerede.

Ifølge opfindelsen kan der tilvejebringes sekretion af mange forskellige polypeptider, således at produktudbyttet forøges betydeligt, rensning simplificeres, nedbrydning af det ønskede produkt begrænses til 35 et minimum, og oparbejdning, udstyr og tekniske krav simplificeres. Endvidere kan udnyttelse af næringsmid- I DK 175365 B1

I 12 I

ler baseret på produktivitet forøges betydeligt, såle- des at der kan opnås mere økonomisk og mere effektiv produktion. Anvendelsen af gær har også mange fordele i henseende til at undgå endotoxiner, der kan foreligge 5 sammen med prokaryoter, og i henseende til anvendelse af kendt teknik, der gennem lange tidsperioder er udvi- klet for gær, hvilken teknik omfatter isolering af gær- produkter.

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende 10 eksempler.

Eksempler

Identificering og isolering af K.lactis-a-faktor I 15

Biologiske bestemmelser på kultur-supernatanter H gennemførtes som beskrevet af Julius et al., Cell (1983) 3^:839, under anvendelse som testerstamme af I S.cerevisiae Mat a sst2-3 stamme RC687. K. lactis stam- | 20 me CBS 141(a) blev dyrket i et medium bestående af 0,5% glucose, 0,17% gærnitrogenbase uden ammoniumsulfat (Difco), 0,002% ammoniumsulfat. Efter fjernelse af cel- ler ved centrifugering blev der til kultur- I supernatanten sat eddikesyre til en koncentration på 25 0,1 M, og kultur-supernatanten blev ledt over en søjle

I af Bio-Rex 70 (Biorad). Søjlen blev vasket med 0,1 M

I eddikesyre, og derefter blev α-faktoren elueret med 80% I EtOH/10 mM HCl. Eluatet blev inddampet til tørhed og derefter opløst i 0,1% TFA/20% acetonitril og overført 30 til en reversfase-HPLC-beskyttelsessøjle. Søjlen blev I vasket trinvis med opløsninger indeholdende 0,1% TFA og 20%, 40%, 60% og 80% acetonitril. 60%-Fraktionen, I indeholdende α-faktor-aktiviteten, blev derefter over- I ført til en analytisk C-18 HPLC-søjle og elueret med en I 35 gradient på 20% til 80% acetonitril i 0,1% TFA.

I Fraktioner blev opsamlet og undersøgt for DK 175365 B1 13 α-faktor-aktivitet. De α-faktor-holdige fraktioner blev tørret og underkastet aminosyre-sekvensanalyse under anvendelse af Applied Biosystems gasfase-proteinsekvensanalysator Model 470A koblet til en Model 5 12OA PTH-analysator.

Hybridlserlnqs-screeninq af plasmld-blblloteker

Puljer af oligonucleotider blev mærket under an-10 vendelse af γ [^^P]-ATP og T4 polynucleotid-kinase.

Disse oligonucleotid-prober anvendtes til at probe Southern blots eller bakteriekolonier ved 42 °C i følgende hybridiseringsopløsning: 4xSSC, 50 mM KH2P04 pH 7, 1% sarkosyl, 10% dex-15 transulfat, 200 pg/ml lydbehandlet, denatureret lakse-sperma-DNA. Filtre blev vasket i 2xSSC, 0,1% SDS ved 42 •c.

Et plasmid-bibliotek i kloningsvektoren pJS109 (i stedet for pJS109 kan anvendes andre standard-20 kloningsvektorer, såsom pUC18 og pBR322) indeholdende insertioner stammende fra en begrænset Sau3AI-digerering af genomisk DNA fra K. lactis stamme SD11 (a trpl lac4), størrelses-fraktioneret for at rense fragmenter >5000 bp, blev screenet med disse prober 25 ved at udplade transformanter af E.coli stamme HB101 i en tæthed på 500-2000 kolonier pr. 80 mm plade af L-agar indeholdende 100 pg/ml ampicillin. DNA blev overført fra kolonierne til nitrocellulosefiltre, og disse filtre blev hybridiseret som ovenfor beskrevet. Arealer 30 på de oprindelige plader svarende til regioner med hy-bridiseringssignaler på filtrene blev udprikket og igen udpladet og derefter igen testet ved hybridisering for j

at isolere enkelte kolonier med plasmider indeholdende I

hybridiserende sekvenser. Positive kolonier blev testet j 35 yderligere ved Southern blot-analyse af DNA renset fra ; små kulturer. ;

J

I DK 175365 B1

Plasmider renset fra hybridiserings-positive ko- I

I lonier blev digereret med forskellige restriktionsenzy- I

mer, og de resulterende fragmenter blev analyseret ved I

Southern blot-analyse under anvendelse af de samme hy- I

I 5 bridiseringsprober for at identificere restriktions- I

fragmenter af en størrelse egnet til I

DNA-sekvensanalyse. Således identificerede fragmenter I

blev renset ved agarosegel-elektroforese og klonet ind I

H i passende MP18- og MP19-vektorer, og der blev gennem- I

10 ført DNA-sekvensanalyse. I

Chymosin-bestemmelser på kultur-supernatanter I

Celler blev fjernet fra kulturer ved centrifuge- I

15 ring, og de resulterende supernatanter blev syrnet til I

pH 2 ved tilsætning af 1 M H2S04 og inkuberet i 2 timer I

ved rumtemperatur. Opløsningerne blev derefter neutra- I

liseret til pH 6 ved tilsætning af 2 M Tris-base. Et I

volumen på 50 yl af en passende fortynding blev sat til I

20 200 yl af en suspension af 12% ikke-fedtholdig tørmælk I

i 10 mM CaCl2 og inkuberet ved 37 °C, indtil der frem- kom en sammenløbning. En enhed af chymosin-aktivitet er defineret som den mængde aktiv chymosin, der kræves for I at frembringe en sammenløbning i løbet af 10 minutter 25 under disse betingelser.

Resultater I De første 10 aminosyrer fra K.lactis α-faktoren I 30 viste en tydelig homologi med aminosyresekvensen fra I S. cerevisiae, med 6 identiske rester. Denne sekvens er vist nedenfor.

I 35 15 DK 175365 B1

Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln.

Denne proteinsekvens anvendtes til at konstruere et sæt oligonucleotider deduceret til at være komple-5 mentære med det i fig. 1 viste strukturelle gen.

Oligonucleotider omfattende alle de mulige codoner for et segment af α-faktor-peptidet blev syntetiseret som to puljer af 96 og 48 forskellige molekyler.

Disse to puljer blev mærket radioaktivt under 10 anvendelse af y [32P]-ATP og T4 polynucleotid-kinase og blev hver anvendt til at probe en Southern blot af en restriktions-digerering af K.lactis DNA. Pulje 2 fandtes at give stærk hybridisering til et enkelt fragment i flere forskellige digereringer. Pulje 2 blev derfor 15 valgt til at screene plasmid-biblioteker af genomisk K.lactis-DNA.

Anvendelse af disse prober til at screene plasmid-biblioteker resulterede i isolering af en række hybridiserende kloner. DNA-sekvensanalyse af én af dis-20 se kloner afkl8b, viste, at den indkodede et a-faktor-beslægtet peptid, der viste stor lighed med precursoren for S. cerevisiae-a-faktor-peptidet. Det hybridiserende segment fandtes at være på et PstI-EcoRI-fragment på ca. 1000 bp. Sekvensen af dette fragment er vist i 25 fig.2.

Sammenligning af de deducerede a-faktor-precursore af dette fragment er vist i fig. 3 og 4. Som det fremgår, har de leadersekvenser (aminosyrer 1-83 i fig. 3) af samme længde med betydelig sekvenshomologi.

30 K. lactis-precursoren indeholder imidlertid kun to steder for addition af N-forbundne carbonhydratkæder (fig.4). Endvidere er spacerne for K. lactis-gentagelserne længere end spacerne for S. cerevisiae-gentagelserne og viser en mere forskelligar-35 tet sekvens med mønstret X-Ala/Pro i stedet for de i S. cerevisiae fundne sekvenser Glu/Asp-Ala. En sammenlig- I DK 175365 B1 I 16 B ning af DNA-sekvenserne (fig. 5) viser også en stærk I grad af homologi gennem hele kodningsregionen.

En række plasmider vist i fig. 6 blev konstrue- I ret for at tilvejebringe en fusion af B 5 K.lactis-a-faktor-leaderen til prochymosin eksprimeret I under transkriptionsstyring fra en stærk promotor.

Først blev et 673 bp SspI-EcoRI-fragment fra afkieb mo- dificeret ved fyldning af EcoRI-overhænget med Klenow- I enzym og addition af Bglll-llnkere til de stumpe ender.

I 10 Dette fragment blev derefter indsat i et Bglll-sted forbindende promotor- og terminator-regionerne af S- B cerevisiae-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-ge- B net (GAP). Denne kassette blev klonet som et B BamHI-fragment i pUC18 resulterende i pAB307.

B 15 Fusion af sekvenser, der indkoder α-leaderen og B bovin-prochymosin, blev derefter gennemført. Først blev B pAB307 digereret med Ncol, og de kohæsive ender blev B gjort stumpe ved behandling med mungobønne-nuclease.

B Det resulterende produkt blev derefter digereret med B 20 Sall. Hertil blev ligeret et 2000 bp B EcoRV-Sall-fragment (sekvenser vist i fig. 7 og 8) in- B deholdende sekvenser, der indkoder prochymosin og S.

B cerevisiae GAP-transkriptionsterminationsregionen. Det- B te fragment var afledt af plasmid pJSlll, hvori en B 25 Xbal-BamHI-adaptor var adderet til 5'-enden af et frag- B ment indeholdende prochymosin-cDNA fusioneret til B S.cerevisiae GAP-transkriptionsterminationsregionen.

Denne ligeringsblanding anvendtes til at transformere B E. coli stamme HB101, og en transformant bærende plas- 30 midet pAB309 blev isoleret. Sekvenserne omkring sammen- I fejningen af denne fusion er vist i fig. 7, og sekven- sen af hele BamHI-Sall-insertionen af pAB309 er vist i I fig. 8.

I For at muliggøre transformation af K. lactis- 35 stammer blev et 3560 bp HindIII-fragment, indeholdende I E.coli-kanamycin-resistensgenet under transkriptions- - ^111^1^11^^6^^^:-^-/ "»-·~*Τ _;_>: "* *™ 111111 *" ~~' DK 175365 Β1 17 styring fra S. cerevisiae ADHl-promotoren indsat i 3'-regionen af K. lactis LÅC4-genet, indsat i pAB309 resulterende i plasmidet pAB3l2. Screening for inser-tionen foregik ved restriktions-digereringsanalyse og 5 blev cheket for den korrekte orientering.

3560 bp Hindlll-fragmentet var afledt af plasmidet pGB901, hvoraf et diagram er vist i fig. 9. Plasmid pGB901 var konstrueret ved at ligere (l) 3,6 kb

Xbal-Haell-fragment indeholdende lactase-promotoren til 10 ca. position -90 fra lactase-ATG-startcodonen isoleret fra pUCla56 (beskrevet nedenfor), (2) et

Haell-SalI-fragment med følgende nucleotid-sekvens: S· TIAAC ACTTGAAATT TAGGAAAGAG CAGAATIT66 CAAAAAAAAT ΑΑΛΑΑΑΑΑΑΑ TAAACACG 3' 15 3* CCCGAATTC TGAACTTTAA ATCCTTTCTC GTCITAAACC βΤΤΤΤΤΤΤΤΑ ΤΤΤΤΤΤΠΤΤ ATTTGTCCAC CT 5· (3) et 5,1 kb Sall-xbal-fragment indkodende prochymosin og et gen, der giver resistens over for antibioticet 20 G418 fra pGB900 (beskrevet nedenfor), og (4) pUC19 klø vet med Xbal.

Under konstruktionen af plasmidet blev CG-sekvensen fra Haell-stedet fjernet utilsigtet, hvorved skabtes et Hindlll-sted ved denne position.

25 Plasmid pUCla56 blev konstrueret som følger.

Chromosomalt DNA blev isoleret fra K. lactis stamme CBS 2360, kløvet med Xhol og separeret efter størrelse på en sucrosegradient. Fraktioner indeholdende lactase-genet blev fundet med en LAC4-probe efter udpletning af 30 DNA'et på et nitrocellulosefilter. DNA indeholdende LAC4-genet blev klonet ind i xhol-stedet af plasmid pPA153-215 (P.M. Adreoli, Mol. Gen. Genet. (1985) 199:372-380), hvorved blev opnået plasmidet pPA31. Et Xbal-fragment af pPA31 indeholdende lactase-genet blev 35 subklonet i XBal-stedet af pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103-119), hvilket giver plasmid pUCla56.

I DK 175365 B1

I 18 I

I Plasmid pGB900 blev konstrueret ved at ligere I

I (1) et 3,6 kb HindiII-Xbal-fragment fra plasmid I

pGBTeG418 (vist i fig. 10 og beskrevet nedenfor) inde- I

H holdende G418-resistensgenet og (2) et I

I 5 Sall-HlndIII-fragment fra plasmid pGB123 indeholdende I

prochymosin-genet i pl)Cl9 kløvet med Sall og Xbal. I

H Plasmid pGB123 er beskrevet i europæisk patentansøgning I

EPA 0 096 430. I

I Plasmid pGBTeG4l8 (fig.10) består af plasmidet I

10 pPA215 (som beskrevet af Andreoli, Mol. Gen. Genet. I

I (1985) 199:372-380) og et 5,6 kb fragment bestående af I

3,7 kb BamHI-K.lactis-lactase-terminatorfragmentet I

I (Breunig et al., Nucleic Acids Res. (1984) I

I 12^2327-2341) og Tn5-genet (Reiss et al., EMBO J. I

H 15 (1984) 3:3317-3322), der giver resistens mod G418 under I

styring fra promotoren alkoholdehydrogenase I (ADHI) I

fra gær, svarende til det af Bennetzen og Hall, J. I

H Biol. Chem. (1982) 257:3018-3025 beskrevne. Plasmid I

I pGBTeG418 er deponeret hos CBS den 26. februar 1987 un- I

I 20 der løbenummer CBS 184.87. I

I Plasmid pAB312 blev digereret med EcoRV ((for at I

I målrette integration til LAC4-regionen af K. lactis- I

I genomet) og blev derefter anvendt til at transformere I

I K. lactis stamme 2UV21 (a ura3 trpl lac4 f kil° ]) til I

I 25 G418-resistens under anvendelse af LiCl-teknikken be- I

I skrevet af Das et al., J. Bacteriol. (1984) I

I 158-1165-1167.

I En række af disse transformanter, såvel som en I

I ikke-transformeret kontrolstamme, blev dyrket i 36 ti- I

I 30 mer i 1 ml medium sammensat af 1% gærekstrakt, 2% pep- I

I ton, 2% glucose, 0,17% gærnitrogenbase, 50 pg/ml tryp- I

I tophan og 50 yg/ml uracil. Kultur-supernatanter blev I

I derefter undersøgt for chymosin-aktivitet efter I

I syreaktivering. Alle transformanter fandtes at sekret- I

I 35 kere mellem 100 og 120 enheder/ml af aktiverbart chymo- I

I sin. I

19 DK 175365 B1

Fjernelse af spacer-codoner ved In vitro-mutaqenese

Et 1900 bp Sacl-Hlndlll-fragment blev Isoleret fra pAB309 og klonet ind i MP19 (Yanisch-Perron et al., 5 Gene (1985) 3_3-103). Enkelt-strenget phag-DNA blev fremstillet og anvendt som template for in vitro-mutagenese med oligonucleotid-primere vist i fig. 11. M13-Phagerne MP19/akll.5 og MP19/akl2.2 blev fremstillet ved anvendelse af henholdsvis Primer #1 og Primer 10 »2.

Dobbelt-strenget RF-DNA blev fremstillet ud fra disse phager, og 1100 bp Sacl-Stul-fragmenter blev isoleret fra hver. Disse fragmenter blev ligeret til et 7100 bp Sacl-Stul-fragment fra pAB312. De resulterende 15 plasmider pAB313 og pAB314 blev isoleret med de i fig.

12 illustrerede sekvens-ændringer.

Plasmiderne pAB313 og pAB314 anvendtes til at transformere stamme 2UV21 til G418-resistens. Kulturer af transformenter 2UV21::pAB312, 2UV21::pAB313 og 20 2UV21::pAB314 blev dyrket, og kultur-supernatanter blev undersøgt for chymosin-aktivitet som ovenfor. Resultaterne af disse bestemmelser er vist i tabel I nedenfor.

Tabel I 25

Stamme Vært Plasmid Chymosin-aktivitet (enheder/ml kultur) 2UV21 2UV21 - <2 30 KRN303-1 2UV21 pAB312 256 KRN304-4 2UV21 pAB313 175 KRN305-2 2UV21 pAB314 206

Hver af transformanterne fandtes at sekretere en 35 enkelt prochymosin-relateret art, som vurderet ved SDS polyacrylamidgel-elektroforese af trichloreddikesyre- I DK 175365 B1 H fældede kultur-supernatanter. Det af pAB312-transformanterne sekreterede prochymosin- relaterede protein viste sig at være af lidt højere mo- lekylvægt end de af pAB313- og pAB314-transformanterne 5 sekreterede, som påvist ved elektroforese-mobilitet.

Celle-pelleterne fra de ovennævnte stammer blev analyseret for chymosin-aktivitet og fandtes at inde- holde mindre end 2% af den i supernatanterne målte aktivitet. Således er Kluyveromyces α-faktoren omtrent 10 98% effektiv i henseende til at dirigere sekretionen af prochymosin fra Kluyveromyces lactis.

Hovedarterne sekreteret af KRN303-1 og KRN304-4 blev renset ved præparativ SDS-polyacrylamidgelelektro- H forese og underkastet gasfase-aminosyresekvensanalyse.

H 15 De N-terminale sekvenser af disse arter er vist neden- for.

I KRN303-1 I 1 5 10 15

Glu-Ala-Asp-Ala-Ser-His-His-Met-Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile-Pro I KRN304-4 1 5 I Ala-Glu-lle-Thr-Arg-Ile I Disse resultater viser, at den prochymosin- I 30 relaterede art sekreteret af KRN303-1 ikke har under- I gået nogen oparbejdning af den amino-terminale spacer- sekvens, mens arten sekreteret af KRN304-4 har den au- tentiske modne prochymosin-aminoterminus.

De følgende organismer er deponeret hos the Ame- I 35 rican Type Culture Collection den 30. juni 1987: HB101 ΡΑΒ307, løbenummer ATCC 67454, HB101 pAB312, løbenummer ATCC 67455.

Fimr*?-: - ·»*. ntf^g-» - w-_'» ____- "^ΓΠΊΠΠΜΙΕ^ tit· ·— DK 175365 B1 21

Opfindelsen er ovenfor beskrevet ved illustration og eksempler med henblik på en nærmere forståelse af opfindelsen, men det vil være klart, at visse ændringer og modifikationer kan praktiseres inden for 5 rammerne af nedenstående patentkrav.

10 15 20 25 30 35 i

Claims

1. DNA-konstruktion, kendetegnet ved, I I at den indkoder et protein, hvis aminosyresekvens om- I I 5 fatter en sekretions-dirigerende Kluyveromyces-a- I I faktor-leadersekvens forbundet til en heterolog I I polypeptid-sekvens. I

2. DNA-Konstruktion ifølge krav 1,kende- I I tegnet ved, at Kluyveromyces-a-faktor- I I 10 leadersekvensen er forbundet til den heterologe poly- I I peptidsekvens via et gær-oparbejdningssignal for opar- I I bejdning af nævnte protein til nævnte heterologe poly- I I peptid. I

3. DNA-Konstruktion ifølge krav l,kende- I I 15 tegnet ved, at den yderligere omfatter en gær- I I promotor ved 5’-enden. I

4. DNA-Sekvens ifølge krav l, kendeteg- I I net ved, at leadersekvensen er en fuldlængde- I I leadersekvens fra vildtype-Kluyveromyces-a-faktor. I I 20

5. DNA-Sekvens ifølge krav 4,kendeteg- I I net ved, at leadersekvensen er den i fig. 2 viste I I leadersekvens. I

6. DNA-Sekvens ifølge krav l,kendeteg- I I net ved, at leadersekvensen er et funktionelt frag- I I 25 ment af fuldlænge-leadersekvensen fra vildtype- I I Kluyveromyces-a-faktor. I

7. DNA-Sekvens ifølge krav 6,kendeteg- I I net ved, at fuldlængde-leadersekvensen er den i I I fig.2 viste leadersekvens. I I 30

8. DNA-Sekvens ifølge krav l,kendeteg- I I net ved, at Kluyveromyces-a-faktor-leadersekvensen I I er en Kluyveromyces lactis-a-faktor-leadersekvens. I

9. DNA-Sekvens ifølge krav 2,kendeteg- I I net ved, at gær-oparbejdningssignalet omfatter et I I 35 basisk dipeptid-kløvninssted og en spacer. I

10. DNA-Sekvens ifølge krav 2, kendeteg- I I net ved, at gær-oparbejdningssignalet omfatter et I DK 175365 B1 basisk dipeptid-klovningssted direkte fusioneret til N-terminus1 en af det heterologe polypeptid og mangler en spacer.

11. DNA-Sekvens ifølge krav 9 eller 10, k e n - 5 detegnet ved, at det basiske dipeptid- kløvningssted er lysin-arginin eller arginin-arginin.

12. DNA-Konstruktion ifølge krav 3, kendetegnet ved, at gær-promotoren er en a-faktor-promotor eller en GAP-promotor, Kluyveromyces-a-faktor- 10 leadersekvensen er en Kluyveromyces lactis-a-faktor- leadersekvens, og Kluyveromyces lactis-a-faktor-leadersekvensen er forbundet til den heterologe poly-peptidssekvens via et gær-oparbejdningssignal, der omfatter et lysin-arginin-kløvningssted og en spacer.

13. DNA-Konstruktion ifølge krav 12, kende tegnet ved, at det heterologe polypeptid er pro-chymosin.

14. DNA-Konstruktion ifølge krav 3, kendetegnet ved, at gær-promotoren er en a-faktor- 20 promotor eller en GAP-promotor, Kluyveromyces-a-faktor-leadersekvensen er en Kluyveromyces lactis-a-faktor-leadersekvens, og Kluyveromyces lactis-a-faktor-leadersekvensen er forbundet til den heterologe poly-peptidsekvens via et gær-oparbejdningssignal, der om- 25 fatter et lysin-arginin-kløvningssted fusioneret direkte til det heterologe polypeptid og mangler en spacer.

15. DNA-Konstruktion ifølge krav 14, kendetegnet ved, at det heterologe polypeptid er pro-chymosin.

16. Ekspressionvektor, kendetegnet ved, at den omfatter et replikativt eller integrativt system til tilvejebringelse af stabil bevaring i gær og en DNA-konstruktion ifølge et hvilket som helst af kravene 1-15.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af et hetero logt polypeptid i gær, kendetegnet ved, at I DK 175365 B1 gær indeholdende en ekspressionsvektor ifølge krav 16 dyrkes i dyrkningsmedium under betingelser, ved hvilke nævnte heterologe polypeptid eksprimeres i og sekrete- res af nævnte gær som et propolypeptid, og propolypep- 5 tidet oparbejdes i det mindste delvis til nævnte hete- rologe polypeptid.

18. Fremgangsmåde til fremstilling af et hetero- logt polypeptid i gær, hvor det heterologe polypeptid sekreteres under direktion fra en gær-a-faktor- 10 leadersekvens, kendetegnet ved, at gær-a- H faktor-leadersekvensen er en Kluyveromyces-a-faktor- H leadersekvens.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kende- H tegnet ved, at Kluyveromyces-a-faktor- H 15 leadersekvensen er en Kluyveromyces lactis-a-faktor- leadersekvens. I 1 35 30