DK175052B1 - Forbedret fremgangsmåde til fremstilling af Amphotericin B liposomer - Google Patents

Description

DK 175052 B1

Den foreliggende opfindelse angår en ny fremgangsmåde til opløseliggørelse af amphiphilinske lægemidler. Endvidere angår opfindelsen præparater indeholdende Amphotericin B liposomer og en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne, hvilke præparater har en reduceret giftighed og derfor egner sig til 5 behandling med liposomal Amphotericin B.

Systemiske fungale infektioner er hovedårsagen til dødeligheden af cancerpatienter og andre immunokompromiterede individer. Desværre unddrager fungale infektioner sig ofte behandling, fordi de få lægemidler, som bekæm-10 per svampe, er yderst giftige for værten. På grund af giftigheden af disse lægemidler bør der gives den lavest mulige effektive dosis. Da lægemidlerne fortyndes i blodet, og eftersom store mængder lægemidler nedbrydes, udskilles eller optages af ikke-inficeret væv, er det desværre nødvendigt at anvende store doser, hvis behandlingen skal være effektiv.

15

Den foretrukne behandling for systemisk fungale infektioner er primært begrænset til to grupper lægemidlen polyen-antibiotika, såsom Amphotericin B og nystatin, og imidazoleme, såsom ketaconazol og miconazol. Polyen anti-fungale antibiotika binder let til sterol-komponenter i værtens celler og forår-20 sager nedbrydning af membranen, cellepermeabilitet og lyse. Amphotericin B er således blevet forbundet med akut hæmolytisk krise. På grund af dette stofs særlige giftighed over for nyrevæv er det endvidere blevet forbundet med irreversibel renale beskadigelser og endog nyresvigt, anvendt i terapeutiske dosisstørrelser. Medoff, G., Kabayashi, G. (1980) Strategies ifl 25 treatment of systemic fungal infections. New England Journal of Medicine 302:145-55; Cohen, J. (1982) Antifungal chemotherapy. Lancet ii: 532-37; Graybill, J.R., Craveh, P.C. (1983) Antifungal agents used in systemic mycosis: activity and therapeutic use. Drugs 25:41-62.

30 Det er hovedformålet med medicinsk forskning at overvinde problemerne, som opstår af behovet for at indgå et kompromis mellem tilstrækkelig høje doser til at bekæmpe infektioner på den ene side og uacceptabel beskadigelse af sundt væv på den anden side. Det er for nylig blevet opdaget, at 2 DK 175052 B1 nødvendige medicindoser kan tilføres sygt væv uden om sundt væv, når man anvender visse liposomale præparater. Yderligere har det vist sig, at medicin kan inkorporeres i liposomer, mikroskopiske afgivelsesvesicler, som delvis består af phospholipider. Se U.S.A. patent nr. 4 663 167 - Composition and 5 Method for Treatment of Desseminated Fungal Infections in Mammals, og en løbende ansøgning tilhørende Vestar Research Inc. USSN 899 064, med titlen “Improved Treatment of Systemic Fungal Infections With Phospholipid Particles Encapsulating Polyene Antifungal Antibiotics”, som beskriver liposomale afgivelsesvesicler, delvis bestående af phospholipider.

10

Phospholipider danner lukkede væskefyldte kugler, når de blandes med vand. Phospholipid-molekyleme er polære, har et hydrophilt ioniserbart hoved og en hydrophob hale, bestående af lange fedtsyrekæder. Når til· strækkeligt mange phospholipid-molekyler findes sammen med vand, vil 15 halerne spontant vende ind mod hinanden og frastøde vandet, medens de hydrophile phosphat-hoveder danner bindinger med vandet.

Resultatet heraf er et dobbeltlag, hvori fedtsyrehaleme vender ind imod det indre af den nyligt dannede membran, og de polære hoveder vender ud mod 20 det vandige medium. De polære hoveder ved én overflade af membranen vender ind imod liposomets vandige indre, og de ved den anden overflade vender mod den ydre væske. Det er denne kemiske tilbøjelighed til dannelse af væskefyldte kugler, som gør det muligt for liposomer at blive ladet med medikamenter. Efterhånden som liposomeme dannes, vil vandopløselige 25 molekyler blive inkorporeret i det vandige indre, og lipofile molekyler vil have tilbøjelighed til at blive inkorporeret i lipid-dobbeltlaget. Liposomer kan enten være multilamellære i lighed med et løg med væske, der adskiller mange lipide dobbeltlag, eller unilamellære, dvs, med et enkelt dobbeltlag omgivende hele det væskeformede indre.

Ved studier med mus har det vist sig, at Amphotericin B, der er inkorporeret i liposomer, virker mere effektivt over for systemiske fungale infektioner, end hvis det gives som et frit lægemiddel. Liposomeme er ikke i sig selv giftige, 30 3 DK 175052 B1 og de beskytter deres indhold fra at blive nedbrudt eller fortyndet. Således antages, at liposomeme afgiver koncentrerede doser af antifungal antibiotisk stof ved det syge væv uden den giftighed, som ellers er knyttet til frit cirkulerende lægemiddel. Derfor vil liposomal Amphotericin B overskride den maksi-5 malt tolerable dosis af frit Amphotericin B. Mehta, R. (1982) Amphotericin B is toxic to fungal cells but not to mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta 770: 230-34. Liposomal indkapslet Amphotericin B har også vist sig at være en effektiv behandling for murine systemiske svampeinfektioner, herunder Candidiasis, Cryptococcosis og Histoplasmosis. Graybill, J.R. et al.

10 (1983) Treatment of murine cryptococcosis with liposomal associated Am photericin B. Journal of Infectious Diseases 145: 748-52; Taylor, R.L. et al. (1982) Amphotericin B in liposomes: A novel therapy for histoplasmosis. American Review of Respiratory Diseases 125: 610-611.

15 Liposomal Amphotericin B har også vist sig effektiv over for humane patienter og livreddende, når andre behandlinger har svigtet, herunder frit cirkulerende Amphotericin B. Systemiske fungale infektioner er hyppigst fundet på folk, hvis immunsystem er kompromitteret på grund af sygdom eller immunosupressive lægemiddel-terapi. Som ovenfor anført er disse infek-20 tioner en fælles årsag til død for ofre for erhvervet immundeficient syndrom (AIDS) og over for cancerpatienter, som underkastes chemoterapi. De kau-sative midler for disse fungale infektioner er ofte endogene svampe, som ville være harmløse, hvis ikke patientens modstandskraft var nedbrudt. Lopez-Berestein, G. et al. (1987) Treatment of hepatospienic Candidiasis with lipo-25 somal Amphotericin B. Journal of Clinical Oncology 5: 310-17.

Som følge af de kemiske egenskaber for polyen-antifungale antibiotika har det uheldigvis hidtil ikke været muligt at producere liposomal Amphotericin B i kommercielle mængder. Disse antifungale midler kaldes polyener, fordi de 30 indeholder tre til syv konjugerede dobbeltbindinger i den alifatiske kæde, som udgør en større lactonring. Dobbeltbindingerne er inkorporeret på den ene side af ringen af 26 til 44 carbonatomer.og langs den anden side af ringen findes 6 til 12 hydroxylgrupper. Disse molekyler indeholder yderligere sped- 4 DK 175052 B1 tikke carboxylsyregrupper og aminogrupper. For eksempel har Amphotericin B og nystatin både en aminosukkergruppe og en carboxylsyregruppe. Po-lyenregioneme i molekylerne er naturligvis hydrophobe og lipofile, medens polyolen og de ioniserbare regioner er hydrophile og lipofobe. Derfor kaldes 5 disse molekyler amphiphile. På grund af tilstedeværelsen af carboxylgrupper og aminogrupper kan Amphotericin B yderligere virke som en syre af typen Lowry-Brønsted eller en protondonor, eller som en Lowry-Brønsted base eller protonacceptor. Kombinationen af disse funktionaliteter gør polyeneme meget tungtopløselige i vand og de fleste organiske opløsningsmidler. Ben-10 nett, J.E. (1974) Chemotherapy of systemic mycoses. New England J. Medicine 290: 320-23.

Det har været det varige problem med uopløselighed af de polyene antifun-gale antibiotika i almindelighed og Amphotericin B i særdeleshed, som hidtil 15 har begrænset anvendelsen. Dannelsen af liposomal Amphotericin B har derfor hidtil generelt været begrænset til to metoder, beskrevet i det efterfølgende, idet ingen af disse har været egnet til produktion i kommerciel målestok, og ingen har udvist langtidsstabilitet eller så kraftig en reduktion af giftigheden som beskrevet for de omhandlede præparater.

20

En hidtil kendt fremgangsmåde går ud på først at opløse Amphotericin B i et stort rumfang flygtige organiske opløsningsmidler, såsom methanol. Til en sådan opløsning skulle derefter tilsættes lipid blandingen, opløst i et flygtigt organisk opløsningsmiddel, såsom methanol og/eller chloroform. Opløsning-25 smid lerne skulle så fjernes fra blandingen til dannelse af en film af lipid-Amphotericin B. Fjernelse af opløsningsmidlerne kunne opnås ved forskellige metoder, men sædvanligvis ved inddampning til tørhed i en rundbundet kolbe under vakuum eller nitrogen. Taylor, R.L. (1980) Amphotericin B in liposomes: A novel therapy for histoplasmosis. Am. Review Respiratory Disease 30 125: 610-11; Graybill, J.R. et al. (1982) Treatment of murine crytococcosis diseases. J. Infectious Diseases 145: 748—52; Lopez-Berestein, G. (1983) Treatment and prophulaxis in disseminated infection due to Candida albicans in mice with liposome-encapsulated Amphotericin B. J. Infectious Diseases 5 DK 175052 B1 147 939-45; U.S. Pat. No. 4,663,167 - Composition and method for treatment of disseminated fungal infections in mammals. De hidtil kendte metoder kræver således fjernelse af store rumfang organisk opløsningsmiddel og fremstilling af en film af lipid Amphotericin B, hvilket ekstra trin elimineres ved 5 den omhandlede opfindelse. Endvidere har de hidtil kendte metoder kun været praktisk anvendelige i særskilte portioner og har ikke kunnet tilpasses en kontinuert proces som fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Dette er to ulemper ved den kendte teknik, som man længe har søgt at overvinde.

10 Ved en anden metode til dannelse af liposomal Amphotericin B opløses lipid-blandingen i chloroform eller et andet opløsningsmiddel og aflejres og tørres på siderne af en rundbundet kolbe eller vesicel-overflade. En opløsning af Amphotericin B i en lille mængde dimethylsulfoxid blev derefter sat til den forud udfældede lipidfilm. Det dannede præparat skulle derefter dialyseres 15 over for en pufret saltopløsning eller en anden opløsning til fjernelse af di-methylsulfoxidet og ikke-indskudt Amphotericin B. Proceduren var yderst tidkrævende og kostbar og resulterede typisk i inkorporering af kun 70% af det oprindelige Amphotericin B. Tremblay, C. et al. (1984) Efficacy of liposome-intercalated Amphotericin B in treatment of systemic Candidiasis in 20 mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 26:170-73.

Forud for den foreliggende opfindelse var det ikke muligt at opløse Amphotericin B i små mængder flygtigt opløsningsmiddel på en måde, så der kunne ske en produktion i kommerciel målestok. Den foreliggende opfindelse mu-25 liggør endvidere en spraytørring af opløsninger indeholdende Amphotericin B og phospholipid-liposomer, således at der kan fremstilles kommercielle mængder på praktisk måde ved undgåelse af de arbejds- og tidkrævende trin, som er beskrevet ovenfor i enkeltheder.

30 Opfindelsen har således til formål at tilvejebringe en forbedret fremgangsmåde til opløseliggørelse af amphophile lægemidler. Et andet formål med opfindelsen er at angive en forbedret proces til indkapsling af poly-en-antifungale antibiotika i liposomer. Mere specifikt består opfindelsens for 6 DK 175052 B1 mål at tilvejebringe en forbedret proces til dannelse af liposomal Amphotericin B. Endnu et formål med opfindelsen er at tilvejebringe en kommercielt egnet proces til fremstilling af liposomal Amphotericin B.

5 Endnu et formål med opfindelsen er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af liposomal Amphotericin B med reduceret giftighed. Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe hidtil ukendte metoder til behandling med Amphotericin. B.

10 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har man elimineret de trin ved hidtil kendte processer, der består i inddampning af store rumfang flygtigt opløsningsmiddel, hvori det antibiotiske stof er i det mindste minimalt opløseligt, eller fjernelse af et ikke-flygtigt opløsningsmiddel, hvori det antibiotiske stof og lipidet er opløst, typisk ved dialyse. I stedet bliver der ved 15 fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebragt et hidtil ukendt og velegnet lipophilt ladet kompleks af Amphotericin B, som ikke udviser de ovenfor beskrevne problemer med uopløselighed. Yderligere tilvejebringer den foreliggende opfindelse en særlig fremgangsmåde til fremstilling af Amphotericin B liposomer, der er egnede for fremstilling i kommerciel målestok. Yderligere til-20 vejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af Amphotericin B liposomer med forbedret stabilitet og nedsat giftighed.

Ifølge et yderligere aspekt af opfindelsen er der tilvejebragt et tørret kompleks af et amphiphilt lægemiddel og et phospholipid dannet ved fjernelse af 25 opløsningsmidlet fra det ovenfor beskrevne opløselige kompleks.

Ifølge endnu et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt en fremgangsmåde til dannelse af liposomer indeholdende et amphiphilt lægemiddel omfattende hydratiseringen af det tørrede kompleks af det 30 amphiphile lægemiddel og phospholipidet dannet i et syrnet organisk opløsningsmiddel til dannelse af liposomer med en diameter på mindre end 0,2 pm dispergeret i vandig opløsning med et pH mindre end 5,5.

7 DK 175052 B1

Ifølge en foretmkken udførelsesform for opfindelsen dannes et hidtil ukendt opløseligt kompleks mellem Amphotericin B og de stearoylphosphatidylglyc-erol, som er blevet protoneret under opløsning i chloroform og methanol, der er gjort sur til en pH-værdi på mellem 1,0 og 3,0. Komplekset af Amphotericin 5 B-phosphoiipid kan, når det er i opløsning i en lille mængde surt chloroform og methanol, blandes med phosphatidylcholin og cholesterol og reproducerbart spraytørret under kontrollereede betingelser til opnåelse af et lipidpulver, der let forarbejdes til liposomer, idet man anvender en vandig pufferopløsning med en sådan pH-værdi, at pH-værdien af den endelige opløsning 10 ligger under 5,5, fortrinsvis mellem 4,5 og 5,5. Den foreliggende opfindelse muliggør således produktion i kommerciel målestok af hidtil ukendte materialer til liposomal produktion. Yderligere kan de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dannede liposomer lyofiliseres og opbevares for senere rehydra-tisering og injektion med betydelig ændring i størrelse eller giftighed. For-15 delene ved den foreliggende opfindelse fremkommer klart af den efterfølgende detaljerede beskrivelse.

Distearoylphosphatidylglycerol eller andre homologe phosphatidylglyceroler, såsom dilaurylphosphatidylglycerol eller dimyristoylphospatidylglycerol oplø-20 ses i samme rumfang opløsning af chloroform og methanol og gøres sur før dannelse af det beskrevne opløselige kompleks med Amphotericin B. Således sættes 2,5 N salt-syre til opløsningen af distearylphosphortidylglyc-erolnatriumsalt i methanolichloroform (1:1) til indstilling af pH-værdien af 1,0 og 3,0, målt med forud fugtet pH-papir, forud for blanding med Amphotericin 25 B, således at phosphoriipidet gøres surt. Amphotericin B eller en anden polyen, såsom tetraen, pentaen eller hexaen, suspenderes i samme rumfang opløsning af chloroform og methanol og sættes derefter til den sure opløsning af distearoylphosphatidylglycerol. Kompleksdannelsen lettes ved kort opvarmning af opløsningen til cirka 65°C. På dette trin udgør koncentra-30 tionen af Amphotericin B mere end 45 mg/ml.

I den resulterede opløsning kan også opløses yderligere mængder lipider, såsom phosphatidylcholiner. Cholesterol eller en anden sterol, såsom ergos- 8 DK 175052 B1 terol, sigmosterol eller adrosteron, tilsættes for at forbedre stabiliteten af de dannede liposomer og således opretholde liposomet intakt under cirkulation i blodstrømmen. Opløsningen er gennemskinnelig orange. Typisk er koncentrationen af Amphotericin B i slutopløsningen større end 25 mg/ml og den 5 totale mængde opløst faste stoffer udgør 15-20 vægtprocent.

Blandt yderligere phosphatidylcholiner, som kan opløses i den komplekse opløsning af Amphotericin B og sur phosphatidylglycerol, foretrækkes hydrogeneret phospatidylcholin fra æg, hydrogeneret soja-lecithin og distearoyl 10 eller dipalmotoylphosphatidylcholin. Hydrogenerede naturligt forekommende phospholipider eller mættede alifatiske phospholipider anses for at arbejde godt sammen, fordi de manglende dobbeltbindinger i sidekædeme anses for at gøre liposomeme resistente over for oxidation, ligesom de er mere fysisk stabile.

15

De organiske opløsningsmidler kan fjernes fra opløsningen ved rotationsind-dampning i en rundbundet kolbe, efterladende en tør film, der består af komplekset og andre lipide materialer. Andre ækvivalente metoder til fjernelse af opløsningsmiddel er egnede, såsom tørring under vakuum. I stedet kan 20 opløsningen indføres i et forstøvningstørreanlæg, og opløsningsmidlet kan fjernes kontinuerligt til fremstilling af store mængder frit strømmende gult pulver til liposom-præparater. Dette hidtil ukendte kompleks muliggør således den længe eftertragtede kontinuerlige produktionsmulighed, som industrien har efterspurgt.

25

Efter at de sidste spor af organisk opløsningsmiddel er fjernet, kan det tørrede pulver af lipidkompleks opbevares til senere anvendelse som udgangsmateriale for liposom-præparation. Dette produkt giver den nødvendige stabilitet for opbevaring, som hidtil ikke har været tilgængelig for in-30 dustrien. De indledende kemiske trin behøver ikke at blive udført hver gang, man ønsker liposomer.

9 DK 175052 B1

Liposomfremstillingen udføres først ved at hydratisere passende mængder af pulvere af lipidkompleks med en vandig puffer, fortrinsvis ved ca. 65°C. Vandige pufferopløsninger kan også indeholde salte, såsom natriumchlorid, eller saccharider, såsom dextrose eller lactose, til opnåelse af en ønsket osmolari-5 tet. Opløsningens pH-værdi kontrolleres omhyggeligt for at opnå en slutop-løsning med en pH-værdi på ca. 5,5 eller mindre, generelt mellem 2,0 og 5,5, fortrinsvis mellem 4,5 og 5,5.

Liposomer dannes derefter ved hjælp af forskydningskræfter. Typisk kan for-10 skydningskræfter påføres ved ultra-lyd eller homogenisering eller frysetørring og optøning, dialysering til fjernelse af detergentopløsning fra lipider, eller der kan anvendes andre kendte metoder til fremstilling af liposomer. Størrelsen af liposomeme, samt hvorvidt de er multilamillære eller unilamillære, kan kontrolleres ved forskellige kendte teknikker, herunder varigheden af ultra-15 lydbehandlingen. Se Gregoriadis, G.A. Simple Procedure to Preparing Liposomes Capable of High Encapsulation Efficiency under Mild Conditions. In Liposome Technology, Gregoriadis, G.A. (ed.) CRC Press: Boca Raton, Florida (1983). Den foreliggende opfindelse er især anvendelig til produktion i stor målestok af de små unilamillære liposomer, som er beskrevet i beskri-20 velsen til USA-patentansøgning nr. 899 064, hvis titel er Improved Treatment of Systemic Fungal Infections’with Phospholipid Particles Encapsulating Polyéne Antifungal Antibiotics. Sådanne små liposomer kan steriliseres ved filtrering, fordi deres diameter er mindre end 0,2 pm. Praktisk taget alt oprindeligt Amphotericin B bliver associeret med liposomfraktionen, når denne 25 teknik anvendes.

Disse liposompræparater, der er dannet i saccharidopløsninger, såsom 9% lactose, kan lyofiliseres i ampuller under egnede betingelser til dannelse af en tør gul kage eller prop af materiale. Senere kan der tilsættes vand til am-30 pullen for at genopløse den faste kage og danne en suspension af Amphotericin B liposomer, som er egnede til injektion. Lyofiliseringen medfører således væsentlige fordele, som lægen kan udnytte.

10 DK 175052 B1

Amphotericin B og andre polyene antifungale antibiotika er amphiphile. Den ene side af den macrocycliske forbindelse er sammensat af en række ikke-substituerede carbonhydrider med dobbeltbindinger, medens den modsatte side er substitueret med hydroxylgrupper. Molekylerne har derfor til-5 bøjelighed til at udvise polaritet, idet den ene side er lipophil og hydrophob, medens den anden side er lipophob og hydrophil.

Endvidere har Amphotericin B en carboxylgruppe, en Lowry-Brøndsted-syre og en aminogruppe, en Lowry-Brøndsted-base. Ved neutralt pH i området 5 10 til 9 har carboxylgruppen derfor tilbøjelighed til at afgive en proton, medens aminogruppen har tilbøjelighed til at optage protonen. Nettoresultatet er, at molekylet forbliver neutralt og ikke-ladet, samtidig med at der findes to ioniserede eller ladede grupper, en negativt ladet carboxylgruppe og en positivt ladet aminogruppe. Ved det samme neutrale pH-område er phospholipid-15 molekylerne, såsom distearoylphosphatidylglycerol, ladet. De har en ioniseret phosphatgruppe, der giver molekylet en negativ ladning. Endvidere er sådanne phospholipidmolekyler amphiphile, idet de lange alifatiske haler er hydrophobe og lipophile, medens det ioniserbare phosphathoved er, naturligvis, hydrophiit og lipophobt.

20 Når phospholipid molekylet er opløst i et protisk opløsningsmiddel ved en pH-værdi mellem 1,0 og 3,0, vil phospholipidmolekylet dog have tilbøjelighed til at acceptere en proton og derved danne et forholdsvis neutralt molekyle. Når Amphotericin B derpå sættes til den ovennævnte sure opløsning, vil protonen 25 af phosphatgruppen have tilbøjelighed til at overføres til carboxylgruppen i Amphotericin B. Resultatet er, at Amphotericin B molekylet vil have en netto positiv ladning. I tilknytning hertil vil phospholipidets phosphatgruppe afgive en proton og blive negativt ladet. De således dannede modsat ladede molekyler tiltrækker hinanden, idet deres modsat ladede grupper danner et 30 ionpar.

Molekyltiltrækningen mellem Amphotericin B og phosphatidylglycerol forøges således kraftigt. De alifatiske carbonhydrid kæder i phospholipideme tiltræk- 11 DK 175052 B1 kes ved hydrofobe interaktioner til den lange kæde af ikke-substituerede dobbeltbindinger i polyenen. I det specifikke tilfælde med Amphotericin B er molekylet en haptaen med syb dobbeltbindinger langs en ikke-substitueret sektion af 16 carbonatomer. I det specifikke tilfælde med distearo-5 ylphosphatidylglycerol er der 16 ikke-substituerede methylengrupper mellem estergruppen og den terminale methylgruppe.

Udover den hydrophobe interaktion, danner de ioniserede grupper en stærk association. I det ovenfor beskrevne protonerende miljø vil Amphotericin. B 10 have en positiv, ladning, og phosphatidylglycerolen vil have en negativ ladning.

Det således dannede kraftigt associerede kompleks er letopløselig i små mængder organisk opløsningsmiddel. På denne måde er ulemperne ved de 15 ovennævnte kendte metoder overvundet. De for eksempel USA-patent nr. 4 663 167, May 5,1987, Lopez-Berestein et al. Følgelig er der ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebragt en fremgangsmåde, som kan udnyttes i teknisk målestok.

20 Et særligt træk ved den foreliggende opfindelse består deri, at Amphotericin B-phosphatidylglycerol-komplekset vil associere med phosphatidylcholin og cholesterol under dannelsen af et præparat og ikke vil fælles ud af den organiske opløsning. Yderligere, hvis pH-værdien af dette organiske opløsningsmiddel opretholdes ved 4,5 eller derunder, vil komplekset 25 fortsætte med at være stabilt og stærkt associeret. Under liposom-hydratisering bliver pH-værdien af den vandige opløsning justeret til en slutværdi for pH-værdien på fortrinsvis mellem 4,5 og 5,5. Ved denne pH-værdi er Amphotericin B-lipid-komplekset meget stabilt og har en høj affinitet for lipiddobbeltlaget, hvor det bliver indsat. Resultatet er en nedsættelse af den 30 akutte giftighed, således som det fremgår af efterfølgende tabel 1: 12 DK 175052 B1

Præparat Liposom-præparatopløsning pH LD5Q (mg/kg)_ 1 4,6 30 2 4,8 >30* 3 5,1 >30+ 4 5,6 20 5 _613_<10_

Akut toxicitet-test på mus under anvendelse af de her beskrevne liposomale præparater ved varierende pH-værdi af liposom-præparatopiøsningen.

5 ^Formindskelsen af giftighed var, så overraskende stor, at ingen Øvre grænse blev nået.

Det fremgår heraf, at en væsentlig nedsættelse af giftigheden er opnået ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Formindskelsen af giftigheden gør det 10 muligt at forøge den terapeutiske dosis, som sikkert kan indgives, hvorved der opnås en stærkt forbedret metode til behandling med Amphotericin B. Se U.S. Pat. No. 4,663,167, 5. maj 1987, Lopez-Berestein et al.

Endvidere er det associerede kompleks meget stabilt ved opbevaring. Lipo-15 someme, som er dannet enten af en film eller et forstøvningstørret pulver efter hydratisering med en saccharidpuffer kan lyofiliseres. Den lyofiliserede kage kan opbevares fortrinsvis i en steril lyofiliseringsampul og derefter rehy-dratiseret med sterilt vand til injektion. De rekonstituerede liposomer forbliver terapeutisk effektive.

20

EKSEMPEL

Dannelse af Amphotericin B-phosphatidylglycerol-kompleks 25 632, 7 mg distearylphosphatidylglycerol, natriumsalt (Avanti Polar Lipids,

Birmingham, Alabama) opløstes i 4 ml afen opløsning af lige rumfang chloroform og methanol ved 65°C. 300 pi 2,5 M HCI blev sat til opløsningen. 375,9 DK 175052 B1 13 mg Amphotericin B (Squibb Pharmaceutical, New Brunswick, New Jersey) blev ført suspenderet i 4,0 ml opløsning af lige rumfang chloroform og methanol, og derefter blev suspensionen sat til den sure DSPG-opløsning. Amphotericin B - DSPG-lipophil kompleks blev dannet ved opvarmning til 65°C i 5 flere minutter til dannelse af en orange opløsning af opløst Amphotericin B-kompleks med en pH-værdi på ca. 1,5. Koncentrationen af Amphotericin B var ca. 45 mg/ml.

1598,4 mg hydrogeneret phosphatidylcholin fra æg (Avanti Polar lipider) blev 10 opløst i 4,5 ml af en opløsning af lige rumfang chloroform og methanol ved 65°C til opnåelse af en klar opløsning. 393 mg cholesterol (Sigma Chemical CO.) blev også opløst i en 4,5 ml opløsning af lige rumfang chloroform og methanol ved 65°C til opnåelse af en klar opløsning. Cholesterolet og de hydrogenerede phosphatidylcholin-opløsninger fra æg blev derefter blandet 15 med Amphotericin B-DSPG-kompleksopløsning til opnåelse af en gennemskinnelig orange opløsning. 175 pi NaOH, 2,5 M, blev derefter sat til denne opløsning til opnåelse af en pH-værdi på ca. 4,5. Totalvægten af opløste stoffer var mellem 15 og 20% efter vægt til rumfang.

20 Det i dette eksempel fremstillede præparat har følgende molfortiold:

Amphotericin B 0,4

Distearoylphosphatidylglycerol 0,8

Hydrogeneret æg-phosphatidylcholin 2,0 25 Cholesterol 1,0

Andre præparater er nævnt i tabel 1.

Disse præparater viser, at opfindelsen egner sig til flere forskellige 30 præparater. Det molære forhold mellem den primære komponent lipid til sterol kan variere fra mindst 1:1 til 4:1. Tilsvarende kan det molære forhold mellem polyen og ladet phospholipid variere i det mindste fra 0,5:1 til 4:1.

DK 175052 B1 14

Dannelse af forstøvningstorret pulver

Lipid-opløsningen indeholdende det omhandlede nye Amphotericin B-DSPG-kompleks indeholder kun små mængder organisk opløsningsmiddel og kan 5 følgelig forstøvningstørres til et pulver på en måde, som ifølge opfindelsen tillader en enesteådne hensigtsmæssig kontinuerlig fremstillingsproces i teknisk målestok. Det forstøvningstørrede pulver er lagerbestandigt.

Ifølge en foretrukken udførelsesform blev lipidopløsningen indeholdende 10 Amphotericin B-DSPG-kompleks pumpet som en fin tåge ind i forstøvning-størreapparatet med en indføringstemperatur på 45°C. Et frit strøimnende gult til lys-orange pulver opstod. Det således dannede pulver blev opsamlet og opbevaret ved -20°C i en ekssikator.

15 Amphotoericin B liposome-præparater

Det lagrede pulver kan hydratiseres i et vilkårligt mængdeforhold og anvendes når som helst til dannelse af liposomer for behandling af fungal infektion. Ifølge en foretrukken udførelsesform er det ønskeligt samtidigt at ster-20 ilisere det færdige liposompræparat. Man ønskede således unilamillare vesi-cler, som kunne steriliseres ved filtrering gennem et filter med en porestørrelse på 0,22 pm.

15 g forstøvningstørret pulver blev hydratiseret i 750 ml vandig puffer inde-25 holdende 9% (w/v) lactose indeholdende 10 millimolær natriumsuccinat ved pH = 5,5, opvarmet til 65°C i 40 til 60 minutter. Forskydningskræfter til dannelse af små unilamillære vesicler blev påført ved 10 minutters behandling ved en emulgeringsteknik med høje forskydningskræfter (se US-patentansøgning nr. 696,772) 30 15 DK 175052 B1

Karakterisering af liposomer

Koncentrationen af komponenterne ved den ovenfor beskrevne foretrukne udførelsesform blev bestemt ved high performance væskekromatograf i 5 (HPLC) og anført i det efterfølgende. Middeldiameteren af liposomeme blev bestemt til 38,3 nm ved dynamisk lysspredning.

Komponent Koncentration

Amphotericin B 1,86 mg/ml 10 Hydrogeneret æg PC 10,12 mg/ml

Cholesterol 2,21 mg/tal

Distearoyl-phosphatidyl-glycerol 4,29 mg/ml EKSEMPEL 2 15

Flere præparat-opskrifter for AMB liposomer

Der blev udført adskillige undersøgelser for at vurdere effekten af at ændre forholdet mellem de forskellige komponenter i liposome-præparatet. Disse 20 studier giver bevis for de enestående fordele ved Amphotenicin B-phosphatidylglycerol-komplekset i det omhandlede liposom-præparat. Præparation 1 i tabel 1, hvori phosphatidylglycerol blev udeladt, dannede således ikke AmB-liposom. Når distearoyl-phosphatidylglycerol blev tilsat i et molært forhold mellem 0,5 og 2,5 gange Amphotenicin B (præparaterne 2-6 i 25 tabel 1) blev der derimod dannet liposomer.

Betydningen af tilsat cholesterol er illustreret i præparaterne 7-10, tabel 1.

Skønt liposomer kunne dannes med Amphotenicin B-phosphatidylglycerol-kompleks i fravær af cholesterol (præparat 7) eller med koncentration af cho-30 lesterol (præparat 8), var disse præparater giftigere end præparaterne 9 eller 10, hvori cholesterol-indholdet var forøget. Således var det molære forhold mellem cholesterol og phospatidylcholin optimalt i området 1:4 til 1:1.

16 DK 175052 B1

Alternativer til hydrogeneret phosphatidylchoiin fra æg blev undersøgt, og resultaterne er opstillet i tabel, præparaterne 11 og 12. Hydrogeneret phos-phatidylcholin fra sojabønner og disteanoylphosphatidylcholin dannede tilfredsstillende Amphotericin B liposomer.

5

Præparat 13 i tabel 1 viser, at distearoylphosphatidylglycerol kan erstattes af dilauroylphosphatidylglycerol. Lipidopløselig kompleks med Amphotoenicin B blev dannet og tilfredsstillende inkorporeret i liposomer.

10 EKSEMPEL 3

Antifungal effektivitet af Amphotoericin B liposomer 360,1 mg af det forstøvningstørrede pulver blev hydratiseret ved 65°C i 40 15 minutter med 9% lactose indeholdende 10 mM succinatpuffer, pH = 5,62. Liposomer blev fremstillet, ved ultralydbehandling i 4 minutter med 1/2” sonde bev 65°C under en nitrogenatmosfære. Tre successive portioner liposomer blev fremstillet på tilsvarende måde. Efter steril filtrering blev koncentrationen af Amphotenicin B bestemt til at være 1,73 mg/ml.

20

Til studier af terapeutisk effektivitet fik en gruppe på otte mus intravenøse indsprøjtninger af 3,5 x 105 Candida albicans gærceller. Tre dage efter infektionen blev dyrene behandlet med en enkelt dosis af enten frit Amphotericin B eller liposomal Axaphotenicin 3. Alvorlige systemiske infektioner forekom 25 for dyrene, som ikke blev behandlet, indtil 3 dage efter infektionen. Hver successive gruppe blev behandlet med en stigende dosis af medikament for at etablere et dosis-respons-foi+iold. 29 dage efter injektionen blev optalt overlevende dyr. Alle ikke-behandlede kontroldyr var døde 8 dage efter infektionen med en middel-overleveisestid på 7 dage. Der var intet dosisniveau for 30 frit Amphotenicin B, som havde overlevende 29 dage efter infektionen. I modsætning hertil var alle dyr, som var behandlet med 10 eller 15 mg/kg liposomal Amphotericin B stadig i live 42 dage efter infektionen. Det komplette respons for fri og liposomal Amphotenicin B er vist i tabel 2.

17 DK 175052 B1 EKSEMPEL 4

Stabiliteten af liposome-Amphotericin B mod lyofilisering 5 Tilstedeværelsen af lactose eller andre sacchanider som fortyndingsmidler i præparater af liposom-Amphotericin B tjener til at stabilisere integriteten af den fysiske struktur af liposomet under lyofiliseningen. Således kan de beskrevne præparater lyofiliseres under passende betingelser, og den lyo-filiserede kage eller prop kan rekonstitueres med sterilt vand på et senere 10 tidspunkt.

Effekten af lyofiliseningen af fire separate præparater af liposom-Amphotenicin B er evalueret. I alle tilfæjde indeholdt præparatet 9% lactose som fortyndingsmiddel. I nogle tilfælde forårsagede lyofiliseningen og rehy-15 dratiseringen en forøgelse af den gennemsnitlige liposome diameter fra ca.

40 nm til ca. 70 nm. Akut giftighed forøgedes fra mere end 30 mg/kg til 20-25 mg/kg Amphotenicin B, når rehydratiseringen blev udført ved 22°C. Hvis samme præparat blev hydratiseret ved 65°Ct var der dog ingen væsentlig reduktion af giftigheden (se eksperiment 3 i tabel 3).

20

Flere resultater er opstillet i tabel 3.

Det vil forstås, at de angivne eksempler kun har til formål at illustrere opfindelsen, som kan varieres inden for rammerne af de foreliggende krav.

25 v DK 175052 B1 18 Ό φ O1 O' O' O1 O' O'

jC X X X X X X

H-> O' o ^ \ \ \ \ \ \

3 ·Η in JhPQQQQ O' O' O' O' O' O' D

j* .p α α> ζ ζ ζ ζ zeeeeeez < μ-i j ε _

CD -H ·—· O O O O O O O

ty> tn cm <n c> <n ro f>

Z S

Μ Οι

U H

Η I 1-1 Ή « E«i ω o +> — cq

Eh en <u £ SHiHvonoovor-rocomo'^a·

O O E C «C'a’T

S Q, tO ^ MtTiOroroovo^rMiH

Du tH-h <u

2 JO X

< X

1 Ή 2

O · »H

co · o· ω

O Λ M G

Οι E O cmr-tvrocNCNcom'TooO'sr

Η X (tJf^ONCTiOCOOOCOCO VDVDOOO

J C Q H ->

<#> -H

0$ o tu tu « (0 η· τ (D 0) ij ττ 'f <f ·- ΤΓ k Tf Tf ϋ OG «.».*·«.»·«···ο-θ-*·*· z rH V-l o o o o o o o ·· o .. ooo M O Q) ..............CO -00 ......

52 JS4J O fN 'T 00 T—I OO - CO » 00 CO 00 ^ ·· «. «. «. ^ ·* ^ o ^ o ^ ^ ^

1¾ 0 Φ iH O O O O rH O .. O - OOO

co *w C ..............m - in ......

Z 0<Ni—II—li—I rH CM O *>· Ή ·. i—I rH i—I

ω +j α ........ -o - η ......

S IhEs IN tN IN IN CM -CM - (N N N

g ftj O CM fM

< rH X

to o s w _ C3 ffl

H S CD

X ^ ^ - .......... s tjj CO 000U0C300UU CO cu

Du d!{li(liDiPi[liQ(|liØ<Q< OJ

0 cocotototococotocoto -D

tu QOQQQQQQDQcQ-H-

........ ·· ·· ·· ...... S O rH

Q rH i—I rH T—I ι-H rH rH rH rH *H >C O

ω οοοοοοοοοο-υΛ > g g g g g jcggggo-u OUUUUUUUUOftO - 01 CO Du u w OUUUUOUUUCJQ ft CD ftftftftftftftftftft — få <c *H -ro O' X O'b'O'O'O'O'O'O'O'O'OO O' CO · Z U c [ή c

O JH j-iJhJhJhVhJhJhJhJh^-MJh <D

w OOO'dOO'OO'OOftO'd -P

ZIKZZZZSKKQKZ 9> Λ d)

X X

nj X

P

Id fH (ΝΓΟχΤίΠνΟΓ^ΟΟσΝΟΗζΝΓΟ

P, »H r-i iH »—I II

» u g ft z 19 DK 175052 B1 TABEL 2 TERAPEUTISK EFFEKTIVITET AF LIPOSOMAL AMPHOTERICIN B 5

I C. albicans INFICEREDE MUS

Behandling AMB dosis 29 over- 3 dage efter infektionsterapi __mg/kg__levende 1__

Kontrol2__-__1

Frit AMB 0,5__ 0_ (0%) __70___0_(0%)_ __75___0_(0%)_

Liposom__70___0_(0%)_ AMB__75___3 (38%)_ __5I0___4_(50%)_ .__75___6_(75%) __170___8_(100%) __15^0___8_(100%) 120,0 I 4 (50%) n=8 dyr pr. gruppe.

10 2

Kontrol middel levetid var 7 dage.

20 DK 175052 B1 TABEL 3

EFFEKT AF LYOPHILISE.RING PÅ LIPOSOM AMPHOTERICIN B

5 _

Ekspert- Betingelser Liposom Ampho B Akut giftig- Rehydrering diam. kone. hed (LD50 temperatur (mg/ml) mus) ment (°C) _ (nm)_ 1 Førlyofil. 38,3 1,86 >30 mg/kg 65

Efter “ 69,9 1,60 >30 mg/kg 2 Før lyofil. 45,3 1,75 >30 mg/kg 65

Efter" 45,1 1,56 >30 mg/kg 3 Førlyofil. 42,4 1,72 >30 mg/kg 22

Efter “ 66,9 1,72 25 mg/kg 65

Efter" 61,8 1,69 >30 mg/kg 4 Før lyofil. 40,3 1,88 >30 mg/kg 22 _Efter"_70,6 1,90 20 mg/kg_ r

Claims (15)

1. Fremgangsmåde til opløseliggørelse af et amphiphilt lægemiddel, omfattende dannelse af et opløseligt kompleks mellem det amphiphile lægemiddel 5 og et phospholipid i et syrnet organisk opløsningsmiddel.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at komplekset dannes i et organisk opløsningsmiddel med et pH lavere ned 4,5.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at komplekset dannes i et organisk opløsningsmiddel med et pH fra 1,0 til 3,0.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at phospholipidet et en phosphatidylglycerol. 15

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at phosphoidyl-glycerolen er valgt fra gruppen bestående af distearoylphosphatidylglycerol, dilaurylphosphatidylglycerol og dimyristoylphosphatidylglycerol.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, ken detegnet ved, at det amphiphile lægemiddel er et amphiphilt polyen an-tibiotica.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, ken-25 detegnet ved, at det amphiphile lægemiddel er Amphotericin B.

, 8. Tørret kompleks af et amphiphilt lægemiddel og et phospholipid dannet ved fjernelsen af opløsningsmidlet fra det opløselige kompleks ifølge et hvilket som helst af de foregående krav.

9. Fremgangsmåde til dannelse af liposomer indeholdende et amphiphilt lægemiddel omfattende hydratisering af et tørret kompleks af det amphiphile lægemiddel og et phospholipid, der er dannet i et syrnet organisk opløsning- 30 DK 175052 B1 smiddel, for at danne liposomer med en diameter på mindre en 0,2 pm dis-pergeret i en vandig opløsning med et pH mindre end 5,5.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den vandige 5 opløsning har et pH fra 2,0 til 5,5. *

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9 eller krav 10, kendetegnet ved, at det amphiphile lægemiddel et et amphiphilt polyen antibiotica.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af krav 9till1,kende- tegnet ved, at det amphiphile lægemiddel er Amphotericin B.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af krav 9 til 12, k ende-tegnet ved, at phospholipidet et en phosphatidylglycerol. 15

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at phosphati-dylglycerol er valgt fra distearoylphosphatidylglycerol, dilaurylphosphatidyl-glycerol og dimyristoylphosphatidylglycerol.

15. Liposom opnået ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav til brug i en metode til behandling af det humane eller animalske legeme mod spredte fungale infektion (disseminated fungal infection). *