DK175531B1 - Leveringsvehikel med amphiphil-associeret aktiv bestanddel - Google Patents

Description

DK 175531 B1

Opfindelsen angår leveringsvehikelkomposi-tioner for aktiv bestanddel, hvilke kompositioner omfatter et ydre biokompatibelt indkapslende lag, et indre amphiphilt, med aktiv bestanddel associeret lag og et indkapslet materiale, der udgør en aktiv 5 bestanddel. Endvidere er tilvejebragt fremgangsmåder til fremstilling af sådanne kompositioner.

Disse kompositioner er egnede til opløseliggørelse af vand-uopløselige eller vandopløselige aktive bestanddele i opløsningsmidler af interesse, og navnlig til opløseliggørelse af aktive bestanddele til iji vivo-levering til legemsvæv eller andre legemssystemer. Specifik målretning eller levering af denne komposition til særlige væv, organer: eller celler er opnået tillige med langvarig cirkulation og serumstabilitet. Aktive bestanddele, der er egnede til anvendelse, omfatter superparamagnetiske og ferromagnetiske materialer, såsom magnetit til for eksempel NMR-billeddannelse, halogenerede forbindelser til for eksempel røntgenkontrast-billeddannelse, 20 radioisotope forbindelser til radiografiske formål, andre diagnostiske midler og terapeutiske midler omfattende proteiner, enzymer, antineoplastica, antifungale midler osv.

Phospholipid-micellepartikler i form af uni-25 laminære eller multilaminære vesikler, også kendt som liposomer, har i en række sammenhænge været: anvendt som vehikler til opløseliggørelse og levering af materialer med aktiv bestanddel. Liposomer har i nogle tilfælde vist sig meget fordelagtige 5° i iri vivo-leveringssystemer i henseende til biologisk kompatibilitet, evne til at isolere og opløseliggøre iøvrigt uopløselige og/eller toxiske aktive bestanddele og evne til selektivt at levere aktive bestanddele til specifikke væv eller systemer 35 af interesse.

Det har ihvertfald siden først i I960'erne været tilstræbt at opløseliggøre ferromagnetiske

DK 175531 B1 I

materialer i flydende bærere med henblik på at opnå

ferromagnetiske væsker. Et eksempel herpå er magnetit, I

et ferromagnetisk materiale med formlen Fe^O^ °f^e I

dannet ved fældning fra alkalisk opløsning af jern(II)-

og jern(III)-chlorider. Eksempler på sådanne fæld- I

ningsmetoder omfatter dem, der er beskrevet af Mann I

5 et al, J.C.S.Chem.Comm. 1979, side 1067-1068, Khala- I

falla et al, IEEE Trans. Magnetics, bind MAG-16, I

Nr. 2, side 178-183 (marts 1980), og Molday etal, I

J.Immunological Methods, bind 52, side 353-367 (1982). I

Magnetite evne til at fungere som et Tj-relaxations- I

10 forøgende middel ved NMR er omtalt i litteraturen. I

, . Se Ohgushi et al, J.Magh.Res., bind 29, side 599- I

601 (1978). I

Der er blevet udviklet en række gunstige I

teknikker til opløseliggørelse af magnetit, men I

15 ingen forud for den foreliggende opfindelse har I

vist sig egnet til i_n vivo-anvendelse som leverings- I

vehikel for magnetit med langvarig cirkulationstid, I

serumstabilitet og biokompatibilitet. For eksempel I

bliver partikelformet magnetit, hvad enten det er I

20 ubelagt eller har belægninger af kendt type, typisk I

fjernet fra blodet i løbet af meget kort tid, sæd- I

vanligvis mindre end en halv time og i mange til- I

fælde i løbet af fem minutter. Endvidere kan mangel

på passende opløseliggørelse af sådanne partikler I

25 føre til aggregation i legemet og deraf følgende I

skadelige virkninger. I

Opløseliggørelse af magnetit i ikke-vandig I

opløsning er opnået ved kugleformaling af materialet H

i nærværelse af et overfladeaktivt middel, såsom I

30 oliesyre, ved peptisering i det ønskede opløsnings- I

middel med et overfladeaktivt middel og ved dermed I

beslægtede metoder. I denne sammenhæng kan henvises I

til Charles et al, IEEE Trans.Magnetics, bind MAG- I

16, nr. 2 side 172-177 (marts 1980), Khalafalla I

35 et al, US patentskrift nr. 3.764.540 (1973), og I

Reimers et al, US-patentskrift nr. 3.843.540 (1974). I

Karakteristiske for sådanne ikke-vandige, ikke- I

DK 175531 B1 3 polære opløsningsmiddelsuspensioner af magnetit er vehikler omfattende en monolags-belægning af overfladeaktivt middel med det polære hoved deraf associeret med ferrit-overfladen og den lipophile carbonhydridhale deraf vendende udad for at opnå 5 kompatibilitet med det ikke-polære bæreopløsningsmiddel. Sådanne kompositioner er ikke egnede til opløseliggørelse i legemets vandige miljø.

Magnetitsuspensioner med vandigt eller polært opløsningsmiddel er også tilvejebragt. Monolag-be-10 lægninger på magnetit af sådanne overfladeaktive midler som dodecylamin eller dodecansyre har vist sig at føre til dispersioner af det ferromagnetiske materiale, idet sidstnævnte overfladeaktive middel giver en fortyndingsstabil dispersion. Khalafalla 15 et al, IEEE Trans. Magnetics, bind MAG-16, Nr. 2, side 178-183 (marts 1980). Vandige ferrofluider, der gør brug af petroleumsulfonater som dispergerings-midler, findes beskrevet. Kelley, US patentskrift nr. 4.019.994 (1977). Strukturen af sådanne med 20 monolag af overfladeaktivt middel belagte partikler svarer til strukturen af de ovenfor omtalte ikke-vandigt-opløseliggjorte magnetitpartikler, hvorhos modvirken af aggregation, men bevaring af vandopløse-lighed opnås ved hjælp af kortere (mindre hydrophobe) 25 carbonhydridhaler udsat for opløsningsmiddelfasen.

Stabile vandige suspensioner af magnetitpartikler er også opnået ved anvendelse af ioniske og ikke-ioniske overfladeaktive midler med henblik på fremstilling af et overflade-dobbeltlag. Sådanne 30 strukturer omfatter et indre lag af amphiphile molekyler som en belægning på magnetitpartikierne ligesom i monolag-tilfældet, og et ydre lag af overfladeaktivt middel orienteret med lipophile haler rettet indad og hydrophile hoveder udadtil udsat for det 35 vandige/polære opløsningsmiddel. Det indre lag består ofte af oliesyre. Materialer anvendt som ydre overfladeaktive midler omfatter fedtsyrer og I _j

I DK 175531 B1 I

I 4 I

deres salt, langkædede ethere eller estre, og alkyl- I

I aromatiske forbindelser, såsom alkylarylpolyethere. I

I Eksempler på sådanne bilags-kompositioner findes I

I i Shimoiizaka, japansk patentskrift nr. 51-44580 I

I (1976) og Sambucetti, IEEE Trans. Magnetics, bind I

I 5 MAG-16, nr. 2, side 364-367 (marts 1980). De over- I

I fladeaktive midler til det ydre lag, der hidtil I

I har vist sig anvendelige til opløseliggørelse af I

I magnetitpartikler, er imidlertid ikke egnede til I

I In vivo-anvendelse, da de i sig selv er toxiske I

I 10 og endvidere hurtigt nedbrydes i blodmiljøet med I

I deraf følgende opstået mulighed for skadelig aggre- I

I gation af de indkapslede materialer. I

I Alternative midler til fremstilling af magne- I

I tit til ijn vivo-anvendelse omfatter binding af par- I

I 15 tiklerne til carbonhydratmatricer af mikrometer- I

I dimension (Olsson et al, Proc. Soc. Magn.Res.Med., I

I side 889 (4th Ann.Mtg.Aug.1985) og Olsson et al, I

I Magn.Res.Imaging, bind 4, Nr. 2, side 142-143 (1986)), I

I og belægning af magnetit med mucopolysaccharidet I

I 20 chitosan (Yen et al, US patentskrift nr. 4.285.819 I

I (1981)). Det menes, at sådanne kompositioner, omend I

I muligvis stabile i serum, hurtigt vil blive fjernet I

I fra cirkulation af det reticuloendothele system. I

I Magnetiske lokaliserbare polymeriserede .liposomer I

I 25 indeholdende farmaceutica og et ferritmateriale I

I findes beskrevet af Chang, US patentansøgning nr. I

I 714.711 (12. marts 1985). Endvidere er indkapsling I

I af magnetit inden for det indelukkede volumem af I

I phosphatidylcholin-vesikel med enkelt bilag og et - I

I 20 forslag til anvendelse ved NMR-spektroskopi omtalt I

I af Mann et al, J.C.S.Chem.Comm.1979, side 1067-1068 I

I (1979). Anvendeligheden og sikkerheden af en sådan I

I vesikel i denne henseende er ikke demonstreret. I

I Yderligere ville den beskrevne komposition have I

I 35 begrænset in vivo-stabilitet, hvilket ville gøre I

I den uønsket som billeddannelsesmiddel. I modsætning I

I hertil har leveringsvehiklerne ifølge den foreliggende I

5 DK 175531 B1 høj stabilitet i serum ved 37°C, kan vise langvarig cirkulationstid og er biokompatible.

De problemer, der er forbundet med opnåelsen .af en opløseliggjort form af magnetit, der er egnet til in vivo-anvendelse, gælder ofte for andre 5 —— aktive bestanddele. Navnlig kan sådanne bestanddele være partikelformede, vanduopløselige eller af toxisk natur, eller det kan være nyttigt eller nødvendigt at levere dem til specifikke legemspositioner. Endvidere har hidtil kendte leveringsvehikler ofte 10 ikke tilstrækkelig serum-stabilitet til opnåelse af optimale resultater på sikker måde.

EP-A-0 198 765 beskriver liposomer, som ind kapsler et medikament eller andet terapeutisk middel, som er blevet associeret med et lipophil-chelerende middel. Strukturerne beskrevet i denne reference er alle konventionelle liposomale strukturer, der har et tosidet lag, som indkapsler en vandig, indre fase.

EP-A-0 186 616 beskriver tilsvarende konventionelle strukturer. __ . _ 20 Den foreliggende opfindelse angår derfor behovet for at udvikle forbedrede kompositioner og fremgangsmåder, der er i stand til sikkert og specifikt at levere aktive bestanddele, såsom terapeutiske midler eller diagnostiske midler, inklusive magnetiske eller andre billeddannende midler, til 25 legemet i mængder, der er effektive for opnåelse af gunstige resultater.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en leveringsvehikel for en aktiv bestanddel, hvilken leveringsvehikel har en størrelse på fra ca. 20 nm til 30 ca. 100 nm i diameter og omfatter et lipidmateriale, der indkapsler et amphiphil-associeret substrat i det væsentlige i fravær af opløsningsfase indre volumen, som omfatter en aktiv bestanddel, et amphiphilt mate-

I DK 175531 B1 I

I I

I riale, der er i stand til at associere med nævnte ak- I

I tive bestanddel og har en polær hydrophil del og en I

I lipophil del i den nævnte polyhydryphile del af nævn- I

I te amphiphile materiale associeret med nævnte aktive

I g bestanddelfase for at danne nævnte amphiphile associ- I

I erede substrat; I et enkelt biokompatibelt indkapslende monolag,

I der omgiver nævnte amphiphil-associerede substrat om- I

I fattende molekyler, der har lipophile haler associe- I

I ret med den lipophile del af det amphiphil- I

I associerede substrat. _ _ I

I Den foreliggende opfindelse angår biologisk I

I kompatible kompositioner, der er i stand til at I

I levere opløselige eller uopløselige aktive bestand- I

I dele inden i levende systemer. Kompositionerne omfat- I 15 I ter en aktiy bestanddel og et første lag omfattende

I et amphiphilt materiale, der er i stand til at I

I indkapsle eller associere med den faste aktive I

I bestanddel gennem associering af det polære hoved I

I af det eller de amphiphile molekyler med den aktive

I 20 bestanddel. Et andet ydre lag omfatter et materiale, I

I såsom et phospholipid, der er i stand til at ind- I

I kapsle eller associere -med den amphiphil-belagte I

I struktur på en måde, der gør leveringsvehiklet I som helhed biokompatibelt. Et passende "biokompatibelt"

I leveringsvehikel vil være ikke-toxisk og ikke-immuno- I

I gent for recipienten, både som en intakt komposition H

I og som nedbrydningprodukter, om foreliggende. Det

I indkapslende ydre lag i den intakte kompostition I

I skal således udvise en for recipienten biokompatibel H

I "overflade" og består fortrinsvis af et materiale, I

I 30 der i sig selv ville være biokompatibelt, hvis

I leveringsvehiklet blev nedbrudt i legemet. I tilfælde I

I af et phospholipid-yderlag associerer de lipophile H

7 DK 175531 B1 haler af phosphoglyceridet med den eller de lipophile haler af amphiphilet og stabiliserer således am-phiphil/(aktiv bestanddel)-strukturen inden for et phospholipidlag. De udsatte polære hoveder af 5 phosphoglyceriderne muliggør opløseliggørelse af kompositionen i iin vivo-miljøet. En sådan komposition er biologisk kompatibel som følge af phosphoglyce-rid-naturen af den udsatte overflade og er yderligere i høj grad stabil i serum og i stand til langvarig cirkulation i legemet.

10

Aktive bestanddele, der er egnede til anvendelse i de omhandlede kompositioner, er karakteriseret ved at være i stand til at blive effektivt indkapslet som et aggregat af det amphiphile lag, eller associeret på molekylniveau med ét eller flere amphi-15 phile molekyler. Mikrokrystallinske strukturer, såsom strukturen af magnetit, er egnede aktive bestanddele, ligesom også radionuclider, billed-dannende røntgenkontrastmidler og lignende. Terapeutiske lægemidler, såsom de antifungale lægemidler 2q amphoteracin B og miconazol, og de kemoterapeutiske lægemidler bisanthren og cisplatin, kan også med godt resultat indkapsles eller associeres med amphi-philer. Fasen af aktiv bestanddel kan have en størrelse fra individuelle molekyler til aggregater eller partikler med en diameter på 60 nm eller 25 mere. I tilfælde af individuelle molekyler af aktiv bestanddel kan hvert molekyle være associeret med så lidt som ét amphiphilt molekyle.

Det amphiphile materiale vil være karakteriseret ved, at det vil være i stand til at blive 30 indkapslet af det ydre kompatible materialelag.

Den særlige amphiphil-type, der er bedst egnet i en given komposition, vil afhænge af arten

I DK 175531 B1 I

I I

I af den aktive bestanddel og det omgivende biokom- I

I patible materiale. Mættede eller umættede fedtsyrer I

I med fra 10 til 28 carbonatomer i den hydrophobe I

I kæde er særligt anvendelige, hvorhos myristinsyre I

I (kædelængde med 14 C-atomer) er særligt foretrukken I

I 5 i det tilfælde, hvor den aktive bestanddel er magne- I

I tit. Dialkoylphosphatidsyrer er også anvendelige I

I amphiphiler. Både palmintinsyre og dis tearoylphos- I

I phatidsyre har vist sig at være effektive amphiphiler I

I i det tilfælde, hvor den aktive bestanddel er am- I

I 2.0 Photéracin B. I

I Når der anvendes et phospholipid-indkapslet I

I leveringsvehikel, kan målretning mod specifikke I

I organer, væv, celler eller andre systemer i legemet I

I opnås på en måde svarende til den, der ses med hid- I

I til kendte liposomer. Således kan specifikke celler, I

I såsom tumorceller, eller specifikke organer, såsom I

I lever eller milt, være selektive mål for levering I

I af spektrometriske, radiometriske, medicinske eller I

I andre midler. Endvidere kan, som følge af den effek- I

I tive isolering af den aktive bestanddel, der kan I

I 20 opnås ved hjælp af de indkapslende amphiphil- og I

I phospholipid-lag, enhver toxicitet af den aktive I

I bestanddel reduceres og/eller målrettes mod spe- I

I cifikke steder i legemet. Leveringsvehiklet udviser I

I langvarig cirkulationstid og stabilitet i serum I

I 25 ved 37°C. I

I Den foreliggende opfindelse tilvejebringer I

I således ifølge en af dens udførelsesformer hidtil I

I ukendte og anvendelige kompositioner, der er i stand I

I til sikkert at levere aktive bestanddele til menne- I

I skelegemet og andre pattedyrlegémer i mængder, der I

I er effektive til at opnå gunstige resultater. Det I

I skal imidlertid bemærkes, at jji vivo-anvendelse I

I ikke er den eneste anvendelsesmåde, der kommer på I

I tale, og at de med opfindelsen forbundne fordele, I

I omfattende forøget opløseligegørelse af aktive bestand- I

I dele, kan udnyttes i in vitro- og andre ikke-levende I

9 DK 175531 B1 systemer eller anvendelser.

Ifølge en anden udførelsesform for opfindelsen er der tilvejebragt kompositioner til levering til legemet af magnetiske eller radiometriske midler eller røntgenkontrastmidler eller andre biologiske 5 bilieddannende midler. Kompositionerne er navnlig anvendelige til levering af ferromagnetiske midler, såsom magnetit, med henblik på NMR-billeddannelse.

Ifølge endnu en udførelsesform er der med kompositionerne tilvejebragt midler til levering af ^ terapeutiske midler på sikker måde og i effektive mængder.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også fremgangsmåder til fremstilling af de omhandlede kompositioner.

Opfindelsen beskrives i det følgende under ^ henvisning til tegningerne, på hvilke

Fig. 1 er et forstørret skematisk billede af et typisk liposomalt leveringsvehikel,

Fig. 2 er et forstørret skematisk billede af et leveringsvehikel ifølge opfindelsen, hvor 20 en fase af aktiv bestanddel er associeret med amphi-phile molekyler og inkorporeret i intra-bilags-regionen af et indkapslende materiale,

Fig. 3 er et forstørret skematisk billede af et leveringsvehikel ifølge opfindelsen, hvor faser med enkelte molekyler eller småpartikler af aktiv bestanddel er associeret med enkelte molekyler af amphiphilt materiale og inkorporeret i intra-bilagsregionen af et indkapslende materiale,

Fig. 4 er et forstørret skematisk billede af et leveringsvehikel ifølge opfindelsen, hvor en fase af aktiv bestanddel er associeret med amphi-phile molekyler og indkapslet inden for et monolag af et indkapslende materiale,

Fig. 5 er en grafisk afbildning, der viser én korrelation mellem inkorporering af aktiv bestanddel (magnetit) eller NMR-relaxationsgradsforøgelse

I DK 175531 B1 I

I 10 I

I og koncentration af amphophil komposition, I

I Fig. 6 er en grafisk afbildning, der viser I

I korrelationen mellem NMR-relaxationsgradsforøgelse I

I og koncentration af inkorporeret aktiv bestanddel I

I 5 (magnetit), I

I Fig. 7 er en grafisk afbildning, der viser I

I tidsafhængigheden for NMR T2~relaxationsgradsfor- I

I øgeisen i forskellige biodistributionssystemer, I

Fig. 8 er en grafisk afbildning, der viser I

tidsafhængighedén for NMR T^relaxationsgradsfor- I

I øgeisen i forskellige biodistributionssystemer, I

I Fig. 9 er en grafisk afbildning, der viser I

I dosisafhængigheden for NMR T2-relaxationsgradsforøg- I

I elsen i forskellige biodistributionssystemer, I

I Fig. 10 er en grafisk afbildning, der viser I

I 15 dosisafhængigheden for NMR -relaxationsgradsfor- I

I øgeisen i forskellige biodistributionssystemer, I

I Fig. 11 er en grafisk afbildning, der viser I

I én korrelation mellem NMR-relaxationsgradsforøg- I

I else og amphiphil kædelængde, og I

I 2o Fig. 12 er en grafisk afbildning, der viser I

I tidsafhængigheden for fungal formering i nærværelse I

I af et levéringsvehikel ifølge opfindelsen for aktiv I

I bestanddel (miconazol). I

I 25 I

I 30 I

11 DK 175531 B1

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer kompositioner til indkapsling og forbedret levering i iji vivo-systemer af vandopløselige eller vanduopløselige aktive bestanddele. Kompositionerne udviser de fordele, der er forbundet med liposomale leveringsvehikler 5 eller -vesikler som følge af deres ydre phospholipid-belægning, selvom kompositionerne ikke behøver at være liposomale per se i strukturen eller består af phospholipid. Leveringsvehiklerne er i stand til at inkorporere og levere aktive bestanddele af ringe 10 opløselighed, eller som bevirker irritation, når de indgives på konventionel måde, eller som skal leveres efter et ændret biodistributionsskema.

Aktive bestanddele, der vil kunne indkapsles inden i de vesikulære leveringsvehikler ifølge opfindelsen, 15 omfatter et bredt område af terapeutiske og diagnostisk« midler. Egnede terapeutiske midler omfatter analgetica, antibakterielle midler, antibiotica, antifungale midler, anti-inflammatoriske midler, antineoplastica, antoparasitica, antivirale midler, cardiovasculære præparater, cellereceptorbindende molekyler, neuro- 2 0 transmittere, ophthalmologica, polysaccharider og proteiner inklusive enzymer, hormoner, glycoproteiner, immunomodulatorer osv. Egnede diagnostica-relaterede aktive bestanddele omfatter dem, der er anvendelige til angiografi, CT-scanbilleddannelse, NMR-billéddan-25 nelse, radiografi, røntgenkontrast-bilieddannelse, ultralyd, osv. Særlige diagnostisk aktive bestanddele omfatter supermagnetiske og ferromagnetiske materialer, såsom magnetit, halogenerede forbindelser, radioisotope forbindelser, fluorescerende forbindelser og farvestof- 30 £er·

Med henvisning til Fig. 1 har en typisk unilaminær liposomvesikel et phospholipid-bilag med et indesluttet indre volumen omgivet af bilaget. Aktive bestanddele

I DK 175531 B1 I

I 12 I

I kan være inkorporeret i og indkapslet inden i dette I

I indre volumen omgivet af, hvad der her vil blive I

I omtalt som et "indkapslende lag", der i dette tilfælde I

I er et phospholipid-bilag. En polær opløsning i denne I

I region er kompatibel med den stabile liposomstruktur I

I ^ på grund af tiltræknings-interaktioner mellem det I

I indre polære opløsningsmiddel og de indadtil-oriente- I

rede polære dele af phospholipidmolekylerne fra det j I

I indre .liposomale lag. Alternativt kan lipophile aktive I

I bestanddele være inkorporeret i og indkapslet inden I

I 10 i den hydrophobe intra-bilagsregion af liposomet I

I (dvs. inden i det indkapslende lag). I

I Fig. 2 viser én form for kompositioner ifølge I

opfindelsen. Ved denne udførelsesform er en aktiv I

I bestanddel associeret med et indkapslende ydre lag I

I ved inkorporering i og indkapsling inden i den hydro- I

phobe region inden i membran-phospholipidbilaget I

I af et liposom. For at opnå en stabil struktur af I

Η I

denne type, omfattende en associering mellem fasen I

I af aktiv bestanddel og det indkapslende lag af le- I

veringsvehiklet, er det væsentligt, at den aktive I

20 bestanddel er kompatibel med denne hydrophobe intrabi- I

lagsregion af det indkapslende lag. Den foreliggende I

opfindelse, opnår sådan kompatibilitet ved hjælp I

af et lag, eller anden med aktiv bestanddel associeret I

gruppe, af amphiphile molekyler anbragt på den aktive I

25 bestanddel på en måde, der blotlægger de liphophile I

dele af de amphiphile molekyler udadtil til interak- I

tion med den hydrophobe intra-bilagsregion. En sådan I

struktur omfattende en partikel af aktiv bestanddel I

og dens associerede amphiphile molekyler vil her I

blive omtalt som et "amphiphil-associeret substrat" I

30 I

eller "AAS". Den aktive bestanddel i et sådant magnetit- I

AAS er associeret med og stabiliseret inden i intrabi- I

lagsregionen ved hjælp af den intermolekylære kompatibi- I

litet og tiltrækningskræfterne mellem de lipophile I

dele af phospholipidmolekylerne eller andre indkapslende I

DK 175531 B1 I

13 I

molekyler og de amphiphile molekyler. Dette lag kan I

udgøre det ydre indkapslende lag af leveringsvehiklet, I

i hvilket tilfalde det vil omfatte et materiale, I

der gør leveringsvehiklet som helhed biokompatibelt. I

5Alternativt kan yderligere indkapslende lag foreligge, I

som i multilaminære vesikler, hvilke lag i sig selv I

kan være associeret med amphiphil-associerede substra- I

ter. Det ydre indkapslende lag af leveringshehiklet I

vil omfatte et materiale, der gør leveringsvehiklet I

som helhed biokompatibelt, dvs. udvisende et acceptabelt ^ niveau af ikke-toxicitet og ikke-immunogenicitet I over for recipienten. (Den aktive bestanddel kan I naturligvis vælges således, at den udviser styret I toxicitet, for eksempel over for cancer-målceller).

I Det ydre biokompatible indkapslende lag skal således I 15 vise en ikke-toxisk og ikke-immunogen "overflade" I mod recipienten. Hvis leveringsvehiklet nedbrydes I i legemet, skal endvidere komponenterne deraf være I ikke-toxiske og ikke-immunogene. Det foretrækkes I derfor, at det eller de indkapslende lag i sig selv I er sammensat af et materiale, der er biokompatibelt I efter nedbrydning i legemet, hvis en sådan indtræder.

I Det menes, at størrelsen af fasen af aktiv bestand- I del eller AAS, soro vist i Fig. 2, kan variere betyde- I ligt under stadig bevaring af et stabilt og effektivt I leveringsvehikle. I tilfalde af magnetit som den I aktive bestanddel har det således vist sig, at diamete- I ren af den eller de mikrokrystallinske magnetitpatikler I inden i bilaget kan være op til to eller flere gange I større end tykkelsen af et phospholipid-bilag, der I ikke er associeret med nogen inkorporeret fast aktiv I 30 bestanddel, som for eksempel i liposomet i Fig. 1.

I For eksempel kan et liposom med en størrelse, der I er anvendelig til levering af aktive bestanddele I til legemsvæv eller organer, have en total diameter I på ca. 35 nm til 100 nm, fortrinsvis 50 nm til 80 nro,

I DK 175531 B1 I

I 14 I

I og en "nominel" phospholipid-bilagstykkelse på ca. 4 I

I til 7 nm (målt mellem modsatliggende polære hovedgrupper I

I i membranen uden nogen aktiv bestanddel indelukket I

I deri). Det har vist sig, at en magnetit-mikrokrystal I

I 2 en gennemsnitlig diameter på ca. 5 til 20 nm, I

I og mest sandsynligt ca. 11 nm, kan være associeret I

I med passende amphiphile molekyler under dannelse I

af et AAS med en diameter på ca. 15 nm og derefter I

være indkapslet inden i bilaget af en phospholipid- I

I vesikel med en nominel bilagstykkelse på kun ca. I

I 10 I

5 nm og en total liposomal diameter på ca. 60 nm. I

I Det er sandsynligt, at bilagsstrukturen i et sådant I

tilfælde skal være i stand til betydelig forvridning I

for at akkomodere aktive bestanddele af sådan relativt I

stor størrelse. Ikke desto mindre er det ved frysefrak- I

15 tur- og negativfarvnings-elektronmikroskopiundersøgelser I

i forbindelse med den foreliggende opfindelse påvist, I

at sådanne strukturer er mulige. Deres effektivitet I

som leveringsvehikler er også demostreret. I

I Magnetit kan fremstilles under en række betingelser I

I 20 ve<* fældning fra ferro- og ferrichloridopløs- I

I ninger. For eksempel kan magnetiten umiddelbart efter I

I fældning opvarmes. Bundfaldet kan også få lov at I

I afsætte sig i nærværelse eller fraværelse af et magnetisk I

I felt. Alt efter magnetitfremstillingsmetoden kan maksi- I

mering af slutinkorporering i leveringsvehiklerne I

c I

kræve forskellige betingelser. Den maksimale inkorpo.T I

I rering, der kan opnås, kan også være afhængig af mag- I

I netitfremstillingsmetoden. I

Det er ofte nyttigt at maksimere mængden af aktiv I

I bestanddel, der er associeret med et vist leveringsvehi- I

I 30 kel, for at opnå passende aktivitetsniveauer inkluderen- I

I de magnetisk, radiografisk eller anden billeddannende I

I aktivitet såvel som terapeutisk lægemiddelaktivitet. I

I Total størrelse af leveringsvehiklet skal også tages i I

DK 175531 B1 I

betragtning, navnlig når der ønskes målretning af leve- I

ring til særlige områder eller celler i legemet. I

Det menes, at liposomale og andre phospholipid-beslægtede I

leveringsmidler beskrevet heri kan variere betydeligt I

i størrelse og stadig give effektive aktivitetsresulta-

5ter. Leveringsvehikler med en diameter på ca. 50 I

nm til 80 nm har vist sig at være særligt nyttige I

i tilfælde af målretning mod specifikke celler, såsom

tumorceller. Endvidere har NMR-billeddannelsesteknik I

under anvendelse af sådanne leveringsvehikler vist I

10 sig nyttig, hvor den aktive bestanddel er partikelformet I

magnetit med en diameter på ca. 11 nm eller mere, I

som omtalt ovenfor. I

Det er i denne henseende vigtigt at bemærke, I

at den foreliggende opfindelse kan praktiseres under I

^ anvendelse af en intakt liposomal vesikel med en I

effektiv mængde af en aktiv bestanddel inkorporeret I

i den hydrophobe intra-bilagsregion af den lipsomale I

membran. Da det indelukkede indre volumem af vesiklen I

er intakt i en sådan struktur, kan vesiklen indeslutte I

en anden aktiv bestanddel, som for eksempel et vandop- I

20løseligt medicinsk middel i opløsningsform, foruden I

den første lipid-bundne aktive bestanddel. En sådan I

struktur kan for eksempel være nyttig ved magnetisk I

målretning af et terapeutisk eller andet middel til særlige legemsregioner, eller ved enhver anvendelse, o 25hvor det er hensigtsmæssigt samtidigt at levere to eller flere aktive bestanddele, der kan indkapsles som heri beskrevet.

I visse tilfælde, hvor fasen af aktiv bestanddel er relativt stor sammenlignet med den nominelle phos- pholipid-bilagstykkelse, menes det, at et enkelt 30 partikelformet aggregat af aktiv bestanddel kan associere med et enkelt leveringsvehikel. Fig. 2 illustrerer et leveringsvehikle af denne type. Ikke desto mindre kan der også være tale om, at mere end ét aggregat af aktiv bestanddel kan være belagt med et amphiphilt materiale og inkorporeret i intra-bilagsregionen I DK 175531 B1

I 16 I

H stadig under bevaring af en intakt liposomal struktur. I

I Når størrelsen af det individuelle aggragat med aktiv I

I bestanddel aftager, bliver det muligt at inkorporere I

I flere individuelle aggregater i bilaget. Endvidere I

I vil der, når den aktive bestanddel er meget findelt, I

I 5 eller når den foreligger i form af enkelte uaggregerede I

I molekyler, kræves mindre amphiphilt materiale til I

I at associere med individuelle partikler eller molekyler I

I af aktiv bestanddel for at opnå stabilisering af I

I hver enhed af aktiv bestanddel eller AAS i den hydropho- I

I 10 be intra-bilagsregion. I

I I tilfælde af individuelle molekyler af aktiv I

I bestanddel kan i virkeligheden en monoassociering I

I mellem et enkelt amphiphilt molekyle og et enkelt I

molekyle af aktiv bestanddel være tilstrækkelig til I

I ^ at stabilisere den aktive bestanddel inden i bilaget. I

I I et sådant tilfælde kan et stort antal partikler I

I af amphiphil-associeret substrat være inkorporeret I

i bilaget. Fig. 3 viser en struktur af denne type. I

I Det menes, at de leveringsvehikler ifølge den forelig- I

I gende opfindelse, der inkorporerer det terapeutiske I

I antifungale middel amphotericin B, kan opbygges med I

en sådan struktur. I

Det fremgår imidlertid, at aktive bestanddele I

inklusive amphoteracin B kan foreligge i opløsning I

eller på anden måde i forskellige former varierende I

25 fra individuelle molekyler til partikelformede aggrega- I

ter, og hver sådan form ville kunne associeres eller I

belægges med et amphiphilt materiale og inkorporeres I

i et leveringsvehikle som heri beskrevet. De her beskrev- I

ne særlige strukturer er således kim anført som eksempler I

for bedre at beskrive bredden af den foreliggende op- I

30 I

findelse, og skal ikke begrænse området for den omhand-

lede opfindelse. I

Strukturerne omtalt ovenfor og illustreret i Fig. 2 I

og 3 er analoge med små unilaminære vesikler (SUV'er) I

og har en generel diameter på 20-100 nm. I

17 DK 175531 B1

Den foreliggende opfindelse påtænker også, at den aktive bestanddel kan inkorporeres i en phospholipid-overtrukket struktur som eksemplificeret i figur 4. I dette tilfælde er den amphiphil-overtrukkede, aktive 5 bestanddel eller AAS ikke indkapslet inde i det hy-I drofobe intra-dobbeltlagsområde af en liposomstruk- I tur, men snarere er det omgivet af et indkapslende I lag (i dette tilfælde et monolag), af phospholipidmo- I lekyler orienteret så de hydrofobe haler af phospho- I lipidmolekylerne er orienteret indad og associeret I med de lipophile dele af de amphiphile molekyler. De I polære, hydrophile hoveder af phospholipidmolekylerne I er orienteret udad for at tillade opløsning af leve- I ringsvehiklen i vandigt medium. Den phospholipide na- I 15 tur af det ydre overtræk tilvejebringer yderligere I biokompabilitet i virussystemer, som det er tilfældet I med strukturerne beskrevet med figurerne 1 til 3.

I Strukturen vist i Fig. 4 kan anvendes til at I akkomodere en fase af aktiv bestanddel, der er for I stor til at blive indelukket inden i intra-bilagsregioner.

I 20 I af en liposomal struktur. Det fremgår, at en større I fase af aktiv bestanddel vil give en højere koncentrati- I on af aktiv bestanddel for et givent antal leveringsvehSk- I ler.

I Leveringsvehikler af typen vist i Fig. 4 kan I 25 variere i størrelse alt efter størrelsen af fasen af I aktiv bestanddelfase og have en størrelse på fra ca.

I 20 nm til ca. 100 nm i diameter.

I Et eksempel på en struktur ifølge Fig. 4 er struk- I turen af mikrokrystallinsk magnetit med for eksempel I partikeldiametre på ca. 40 nm til 70 nm. Partikler I af denne omtrentlige størrelse vides at være anvendelige I ved målretning mod visse tumorceller til NMR-billeddan- I nelse eller andre anvendelser. Eksempler på anvendelsen I af magnetit ved NMR-billeddannelse af væv er beskrevet I DK 175531 B1 I 18 for eksempel i PCT-patentansøgning nr. PCT/N085/00017 (Jacobsen et al.), Saini et al, Magn.Res. Imaging, bind 4, Nr. 2, side 144 (1986), Renshaw et al, Magn.

I Res. Med., bind 3, side 217-225 (1986), og Dias et I al, Magn. Res. Med., bind 3, side 328-330 (1986),

H 5 I

hvis indhold her er medtaget ved henvisning. Passende doser kan let fastlægges således, at den billeddannende

H respons optimeres, således som omtalt for eksempel I

I i Eksempel 6 af nærværende beskrevelse, og kan gives I

ved brug af velkendt teknik, såsom i.v. eller lokal I

10 injektion eller oralt. Magnetitpartiklerne kan være I

belagt med et indre monolag af amphiphile molekyler I

I og et ydre indkapslende monolag af phospholipid-mole- I

I kyler til opnåelse, af en højkoncentreret vandopløselig I

form af magnetit, der samtidigt er biokompatibel I

I og i stand til at blive målrettet mod særlige legems- I

I 15 I

steder. I

I Belægning af den fremstillede aktive bestanddel I

I med et passende amphiphil, eller associering mellem I

I individuelle molekyler af aktiv bestanddel og amphiphil I

kan i almindelighed opnås ved hjælp af forskellige I

20 højforskydningsmetoder inkluderende lydbehandling I

I og homogenisering. I tilfælde af vanduopløselige I

I aktive bestanddele, såsom magnetit, vil det normalt I

I være muligt at opnå en vandig dispersion eller suspen- I

sion af det materiale, der er egnet for associering I

I 25 med amphiphilet,under lydbehandling. Den indledende I

I dispersion kan i sig selv vindes ved lydbehandling. I

I Phosphatpufret saltopløsning (PBS) er et særligt I

I velegnet vandigt opløsningsmiddel, når leveringsvehiklerne I

I er beregnet til iji vivo eller anden biologisk-relateret I

I anvendelse, og navnlig når den endelige belægning I

H 30 I

· med phospholipid eller andet materiale vil blive I

I opnået i samme opløsningsmiddelportion som anvendt I

I til amphiphil-belægningen. Andre pufrede vandige I

I opløsningsmidler, såvel som opløsninger indeholdende I

DK 175531 B1

I 19 I

I sådanne bestanddele som dextrose, kan anvendes til I

I opnåelse af en acceptabel dispersion af aktiv bestanddel. I

I Ikke-vandige opløsningsmidler eller blandinger af I

I vandige og ikke-vandige opløsningsmidler kan I

I anvendes til opnåelse af en acceptabel suspension I

I 5 af aktiv bestanddel og også til at muliggøre passende I

I belægning eller associering af den aktive bestanddel I

I med amphiphilet. For eksempel kan en vandig-organisk I

I blanding, såsom PBS-chloroform, anvendes, når der I

I skal foretages sprøjtetørring af blandingen af amphiphil I

I 10 og aktiv bestanddel. Tilsvarende kan en vandig-organisk I

I blanding anvendes, når der ønskes en tofase belægnings- I

I proces med amphiphil. I

I Valget af amphiphil til anvendelse i en speciel I

I komposition vil afhænge af forskellige forhold. Den I

I 15 ønske^e associering mellem amphiphil-molekylerne I

I og den aktive bestanddel opstår som følge af specifikke I

I interaktive kræfter mellem den polære del af amphiphil- I

I molekylerne og den aktive bestanddel, til forskel I

I fra simpel blandbarhed eller opløselighed af den I

aktive bestanddel i amphiphilet. Sådanne kræfter I

I kan for eksempel have karakter af ionisk eller elek- I

I trostatisk binding mellem amphiphilet og den aktive bestanddel, covalent binding, hydrogenbinding, kemisorp- I tive kræfter eller fysiosorptive kræfter. Arten af asso- I cieringen mellem magnetit og sådanne ioniske eller I 25 ikke-ioniske amphiphiler som fedtsyrer eller fedtsyre- I derivater findes omtalt i litteraturen. I denne sammen-

I hæng kan der henvises til Khalafalla et al, IEEE

I Trans. Magnetics, bind MAG-16, Nr. 2, side 178-183 (marts 1980). I tilfælde af andre aktive bestanddele, I ^ såsom amphoteracin B, menes det, at ioniske ladninger I på funktionelle grupper i molekylet af den aktive I bestanddel (såsom en positiv ladning på aminogruppen I i amphoteracin B) kan samvirke med negativt ladede I DK 175531 B1 I 20

hovedgrupper på for eksempel fedtsyrer eller phosphatid- . I

syre. Covalente bindinger mellem den aktive bestanddel H og amphiphilet kan også i passende tilfælde anvendes

H til at associere disse molekyler eller partikler. I

I Valget af et passende amphiphil vil afhænge af I

I ^ overvejelser i henseende til at opnå en associering I

med den aktive bestanddel og yderligere vedrørende I

I arten af den ikke-polære eller hydrophobe del af I I

amphiphilet. Et amphiphil betragtes som værende et I

I molekyle med både en hydrophil del og en hydrophob I

I 10 (eller lipophil) del. Et amphiphil, der er egnet I

I til anvendelse i forbindelse med den foreliggende I

opfindelse, vil være i stand til at associere via I

dets hydrophile gruppe med en aktiv bestanddel, som I

I ovenfor omtalt. Yderligere skal arten af amphiphilet I

I være en sådan, at den efter associering med den aktive I

I bestanddel resulterende amphiphilsubstratpartikel I

I (AAS) er kompatibel med, og associeret med, det indkaps- I

I lende lag. Denne associering kan have karakter af "op- I

løseliggørelse" af AAS'et inden i et (anphip&il-associeret I

substrat)-indkapslende materiale, som vist for eksempel I

20 I

i Fig. 2 og 3. Alternativt kan denne associering skyl- I

des hydrophobe eller lipophile interaktioner mellem de I

I hydrophobe dele af AAS'et og det indkapslende materiale, I

I som vist for eksempel i Fig. 4. Denne associative I

I interaktion adskiller sig fra for eksempel anvendelsen I

I 25 af et phospholipid-ublandbart materiale indeholdende I

en aktiv bestanddel, der danner en fase, som er ubland- I

I bar med det indkapslende lag, som beskrevet af Sears I

et al, US patentskrift nr. 4.298.594. I

I Den hydrophile del af amphiphilet kan være en I

20 ladet eller ikke-ladet gruppe inkluderende eksempelvis I

I carboxyl-,hydroxy-, amino-, phosphat- eller sulfatgrup- I

I per. Den hydrophobe del af amphiphilet kan eksempelvis I

I inkludere mættede og umættede aliphatiske carbonhy- I

DK 175531 B1 I

21 I

dridgrupper, inkluderende polyxyethylener, og aliphatiske I

grupper substitueret med mindst én aromatisk og/eller I

cycloaliphatisk gruppe. _ _ I

Specifikt foretrukne amphiphiler er fedtsyrerne, som I

omtalt nedenfor. Disse kan være enten naturligt fore- I

5 I

kommende eller syntetiske fedtsyrer, såvel som deri-

vater deraf. Andre egnede amphiphiler kan omfatte I

phospholipider og forbindelser beslægtede dermed, in-

kluderende for eksempel phosphatidylethanolaminer I

(cephaliner), phosphatidsyrer, phosphatidylseriner, I

10 phosphatidylinositoler, phosphatidylglyceroler, di- I

phosphatidylglyceroler (cardiolipiner), plasmaloge- I

ner, lysophosphoglycerider, og mættede syntetiske I

former af de foregående. Andre egnede ikke- I

I phospholipid-amphiphiler kan inkludere di- og trigly- I

I 15 I

cerider, hydrophobt-substituerede-alkoholer, -aminer, I

I -phosphater og -sulfater, alkyletheracylglyceroler, I

I glycosylacylglyceroler, sphingolipider inkluderende I

I sphingomyeliner, glycosphingolipider inkluderende ce- I

I rebrosider, phytoler, retinoler og vitaminer, såsom I

I 20 I

vitamin A, K, E og D. I

Fedtsyrer og fedtsyrederivater er blandt de fore- I trukne amphiphiler til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Carbonhydridkæden kan I være enten mættet eller umættet. Længden af carbonhy- I 25dridkæden i en fedtsyre eller andet amphiphil kan I optimeres med henblik på at forøge evnen hos det I ydre biokompatible materiale til at indkapsle amphiphil/ I (aktiv bestanddel)-strukturen. Denne kan på sin side I afhænge af arten af den hydrophobe del af for eksempel I et ^n<^^aPs^en<^e phospholipid. Yderligere vil den I totale størrelse af amphiphil/(aktiv bestanddel)- I strukturen afhænge af arten af amphiphilet og vil I påvirke evnen til at opnå et endeligt leveringsvehikel I DK 175531 B1

I 22 I

H af en ønsket struktur {se Fig. 2 til 4 og den tilhørende I

omtale ovenfor). I

Et i forbindelse med den foreliggende opfindelse I

foretrukket amphiphil er gruppen af fedtsyrer med I

carbonhydridkæder på fra ca. 10 til ca. 28 C-atomer. I

^Særligt foretrukne er fedtsyrer med 14 til 24 C-atomer. I

Når det ydre indkapslende materiale omfatter phospho- I

lipier, såsom disteaorylphosphatidylcholin og choleste- I

rol, og den aktive bestanddel er magnetit, er tetradecar»- I

syre (14 C-atomer), palmitinsyre (16 C-atomer), docosan- I

10 syre (22 C-atomer) og tetracosansyre (24 C-atomer) I

særligt foretrukne. I praksis kan koretere amphiphiler, I

såsom tetradecansyre og palmitinsyre, være at foretrække I

H af grunde vedrørende ikke-toxicitet. Palmitinsyre I

I foretrækkes også til den aktive bestanddel amphoteracin I

I 15B. Phosphatidsyrer med mættede eller umættede carbonhy- I

I dridkædelængder på fra ca. 10 til ca. 20 C-atomer I

I (to kæder pr. molekyle), og navnlig 16 til 18 C-atomer, I

er særligt foretrukne amphiphiler til amphoteracin I

B. Amphiphiler med positivt-ladede polære grupper I

vil være særligt anvendelige, hvor den aktive bestanddel I

2 0 I

kan være negativt-ladet eller er elektrondonaterende. I

Associering af amphiphilet med den aktive bestand- I

del kan opnås ved kendte metoder inkluderende borefor- I

maling, homogenisering og lydbehandling. I tilfælde I

af lydbehandling af opløsningsfase eller andre metoder, I

25 hvor det er ønskeligt at optimere koncentrationen I

og mængden af amphiphil, der skal kombineres med I

en given mængde aktiv bestanddel, kan en optimal I

koncentration indledningsvis vurderes ved at sammenlig- I

ne aggregat-overfladearealet af den aktive bestanddel, I

3Q der skal behandles, med den steriske størrelse af I

amphiphilet, når det okkuperer en del af den aktive I

bestanddels overflade. I praksis kan et koncentrations- I

område for amphiphilet være acceptabelt. Forsøg har I

vist, at en maksimering af koncentrationen af aktiv I

DK 175531 B1 I

23 I

bestanddel i det endelige leveringsvehikelpræparat I

i virkeligheden kan afhænge af optimering af den I

indledende amphiphil-koncentration. Fig. 5 viser I

i forbindelse med magnetit-leveringsvehikler ifølge I

den foreliggende opfindelse en bred spids i NMR I

5relaxationsgradsforøgelsen forekommende ved en indleden- I

de palmitinsyrekoncentration på ca. 6 mg palmitinsyre I

pr. 2,5 ml udgangsmagnetitdispersion. Tilsvarende I

optimering kan opnås for andre kompositioner ifølge I

opfindelsen. I

10 Lydbehandling af aktive bestanddele, amphiphil I

og biokompatible yderlagsmaterialer' kan foregå med I

for eksempel en Ultrasonics, Inc.-probe med en mikro- I

spids ved en effekt på ca. 50 W til 90 W. Tilfreds- I

stillende lydbehandling kan i almindelighed opnås I

på ca. 15 minutter. Lydbehandlingstemperaturen skal I

15 I

fortrinsvis ligge over smeltetemperaturen eller faseover- I

gangstemperaturområdet for amphiphilet. I

I Efter lydbehandling af den aktive bestanddel I

I med amphiphilet kan et eller flere passende, indkapslende I

I lag tilføres på tilsvarende måde ved hjælp af lydbehand- I

I 20 ling eller andre i og for sig kendte metoder til I

I opnåelse af et biokompatibelt leveringsvehikel. Særligt I foretrukne i forbindelse med den foreliggende opfindelse I som biokompatible materialer er phospholipider og I phospholipid-cholesterol-blandinger. Egnede phospholipider I 25 kan anvendes enkeltvis eller i kombination og omfatter I både naturligt forekommende og syntetisk fremstillede I phosphatidylcholiner, phosphatidsyrer, phosphatidylse- I riner, phosphatidylethanolaminer, phosphatidylglyceroler I og phosphatidylinositoler. Phospholipidmaterialer I kan vindes i naturligt-forekommende form, stammende I fra for eksempel renset æggeblomme, eller de kan I være af syntetisk art, som for eksempel med mættede I syntetiske carbonhydrid-sidekæder. Steroler, sterolestre | I eller andre materialer inkluderende choloesterol, I DK 175531 B1 I 24

H cholestanol, cholestan, tocopherol og lignende, kan I

også være inkluderet i det indkapslende lag for at I

forøge stabiliteten af leveringsvehiklet eller for I

at modulere membranpermeabilitet. Cholesterol er I

særligt foretrukket til dette formål. I

5 Navnlig er blandinger af distearoylphosphatidylcholin I

(DSPC) ogh cholesterol (CHOL) foretrukne materialer I

til leveringsvehikel-indkapsling. Blandinger i forholdet I

2:1 (DSPC:CHOL) er effektive i forbindelse med den I

foreliggende opfindelse. Andre foretrukne phospholipi- I

10^er omfatter dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), I

dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) og andre phospho- I

lipider med ca. 10 til ca. 20 C-atomer i deres carbon- I

hydridkæder. I

Koncentrationen og mængden af phospholipid, der I

^skal anvendes i en speciel komposition, kan variere I

betydeligt under stadig opnåelse af en tilfredsstillende I

slutkomposition. Typiske koncentrationer er anført I

i de følgende eksempler. Lydbehandling kan gennemføres I

under de samme betingelser som anvendt til amphiphilet. I

Blandingen kan derefter centrifugeres i ca. 10 minutter I

20 I

ved ca. 16.000 G, og supernatanten frafiltreres, I

hvorved vindes en opløsning indeholdende en komposition I

I ifølge den foreliggende opfindelse. I

Det forventes, at overfladen af leveringsvehiklet, I

I med henblik på at tilvejebringe en ændret In vivo- I

I 25 biodistributionsprofil, kan modificeres på i det væsentlige I

samme måde som liposomoverflader. Sådanne modifikati- I

I oner kan for eksempel bestå i binding af monoklonale I

I antistoffer eller af ligander med specifikke bindings- I

I egenskaber, eller inkorporering af glyoclipider. I

I 20 Sådanne modifikationer er beskrevet af Schmidt (Ed.), I

I Liposomes as Drug Carriers (Symposium Tubingen, Oktober I

I 1984, Georg Thieme Verlag (Stuttgart: 1986), Ostro I

I (Ed.), Liposomes, Marcel Dekker, Inc. (New York: I

DK 175531 B1 I

25 I

1983) og Gregoriadas (Ed.), Liposome Technology, I

bind III, CRC Press, Inc. (Boca Raton, Florida: 1984), I

hvis indhold her er medtaget ved henvisning. I

I Eeveringsvehiklerne ifølge den foreliggende opfindel- I

I se kan anvendes ved teknik, der er velkendt inden for I

I 5 medicinen, inklusive injektion {f.eks. i.v., i.p. I

I eller i.m.), inhalation, oral indgift, topisk anven- I

I delse, intraoculær anvendelse og lignende. Passende I

I doseringer kan også fastlægges ved anvendelse af I

I kendte dyretestmetoder og kliniske testmetoder, inklu- I

I 10 derende biodistributionsundersøgelser på vævprøver, I

I som heri beskrevet. I

I Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksem- I

I pier. I

I 15 I

I 20 I

I 25 I 30 I DK 175531 B1 I 26

Eksempel 1

Fremstilling af magnetit-leveringsvehikler.

Aliquoter på 25 ml af 15 mg/ml magnetit i PBS blev lydbehandlet {80W) med varierende mængder af palmitinsyre 5 (2,4 mg til 10 mg) ved 66°C i 15 minutter. De resulte- rende suspensioner blev derefter lydbehandlet under H 14 3 .

de samme betingelser med 46 mg af en C- og H-radiomær- ket 2:1 DSPC:CHOL-lipidfilm. Produktsuspensionen blev centrifugeret i 10 minutter ved 15600 G, og supernatanten blev ledt gennem et 220 nm filter.

H De endelige opløsninger varierede i udseende fra mælket hvid (2r4 mg palmitinsyre) - svarende til små unilaminære 2:1 DSPC:CH0L vesikler - til klar gyldenbrun (6 mg syre). Farvningsintensiteten nåede et maksimum ved 6 mg palmitinsyre, idet en farvegradue- 15 ring fandtes at stige til maksimet og aftage, til I hvid, ved højere palmitinsyrekoncentrationer. Klarheden af opløsningerne fulgte en tilsvarende tendens. 100 I yl's Aliquoter af opløsningerne blev fortyndet med 10 ml af et egnet opløsningsmiddel, og lipidkoncentra- I 20 ti·011611 blev bestemt ved anvendelse af en scintillations- tæller for at mængdebestemme radiomærkerne. På basis I af de således bestemte koncentrationer blev der frem- I stillet en 2 mg/ml lipidfortynding af hver opløsning.

I Et IBM Minispec PC/20 anvendtes derefter til at måle I T0 relaxationstiderne for disse fortyndinger. Resulta- 25 i terne er vist i Tabel I.

I 30

27 I

DK 175531 B1 I

I Tabel 1 I

I Palmitinsyre (mg) T^(msek) 1 /T^(sek ) I

I 5 2,4 162 6,2 I

I 3,6 70 14,3 I

I 4,8 60 16,7 I

I 6,0 46 21,7 I

I 7,2 92 10,9 I

I 1° 10,0 173 5,8 I

I Ovennævnte fremgangsmåde blev gentaget under an- I

I vendelse af 5, 10, 15, 20 og 50 mg/ml magnetit i PBS. I

I T2 relaxationsgraderne som funktion af mængden af I

I 15 palmitinsyre er optegnet i Pig. 5. I

I Prøver svarende til 10 mg/ml magnetit blev analyse- I

I ret for jern på følgende måde: En 100 μΐ aliquot I

I blev opvarmet under omrøring i 30 minutter ved 65°C

I med 900 μΐ 0r1M HN03, 100 μΐ 5M NH4SCN og 1,4 ml I 20 hePtano1· Efter oxidativ opløseliggørelse af det I tilstedeværende jern dannedes i den vandige fase I lyserødt Fe(SCN)4”, der derefter blev fuldstændigt I ekstraheret over i heptanol, som FeiSCN)^. Heptanol- I opløsningens absorptionsevne ved 498 nm anvendtes I til kvantitativ bestemmelse af Fe{SCN)3 under anvendelse I af en molær extinktionskoéffieient bestemt med FeCl^- I standarder. Heptanol er nødvendigt for syrekatalyseret esterificering og ekstraktion af palmitinsyre, der I ellers forbliver bundet som en beskyttende hydrophob belægning på magnetitpartikler. Fig. 6 viser korrelati- I 30 onen mellem relaxationsgrader U/Tj) og jernkoncentra- tion, med normalisering af sidstnævnte til konstant I lipidkoncentration.

I DK 175531 B1

I 28 I

Eksempel 2 I

I Fremstilling af magnetit-leveringsvehikler - Sprøjte- I

tørringsmetode. I

12 ml 250 mg/ml Magnetitsuspension blev fyldt I

H op til 30 ml med PBS og derefter lydbehandlet med I

I 512 vægt% palmitinsyre (dvs. 360 mg) i 5 ml chloroform. I

Den resulterende suspension blev sprøjtetørret ved I

200°C, hvorved vandtes et magnetit/amphiphil-associeret I

substrat(AAS)-materiale som et sort pulver. Af dette I

magnetit-AAS blev 50 mg lydbehandlet i 5 ml PBS for I

I 1Q at dispergere pulveret, og den resulterende suspen- I

I sion blev lydbehandlet med 92 mg 2:1 DSPC:CH0L under I

tidligere beskrevne betingelser. Efter centrifugering I

og 220 nm filtrering vandtes en klar gyldenbrun op- I

løsning. I

15 w I

Eksempel 3 I

I Fremstilling af magnetit-leveringsvehikler - Tofase- I

metode. I

I Fremstilling af det intermediære magnetit-AAS I

I blev også opnået ved anvendelse af en tofasemetode. I

I 20 19,6 mg Palmitinsyre blev opløst i 2 ml chloroform, I

og denne opløsning blev lydbehandlet forsigtigt i I

I et koldt vandbad i 15 minutter med 5 ml PBS indeholden- I

I de 62,5 mg magnetit. Den resulterende blanding blev I

I centrifugeret, hvorved vandtes en nedre organisk I

25 fase dækket med et bundfald af magnetit-AAS i den I

I øvre vandige fase. Chloroformen blev fjernet ved I

I pipettering og derefter gennembobling af tørt nitrogen I

I gennem den vandige fase og bundfaldet. Efter gendis- I

I pergering af AAS's ved lydbehandling blev det yderligere I

I lydbehandlet med 92 mg 2:1 D'SPC:CH0L, centr i fugeret I

I 30 I

og filtreret som i de foregående eksempler. Den efter I

I filtrering vundne opløsning viste sig dybt sort, I

I omend den betragtet som en tynd film havde en klar I

I mørk chokoladebrun farve. Analyse for jern viste I

I mere end 3,6 mM magnetit (Fe^O^). Fortyndinger af I

DK 175531 B1 29 denne opløsning i PBS med faktorer på 40, 100 og 250 gav relaxationsgrader som vist i Tabel II.

Tabel II

5 -1

Fortynding To(msek) 1/T2 forøgelse (sek ) 1 :250 15 66 I 1:100 6 166 I 1:40 <4 >250 I kontrol 1850 0 I 10 I Note: 1/T2 (forøgelse) = 1/T2 (obs) - i/r2 (kontrol); dvs.

I gradforøgelse = observeret grad minus kontrolgrad.

I Eksempel 4 I 15 MRI T2-kontrast.

I Magnetit opløseliggjort ved metoden fra Eksempel I 1 blev testet for "jln vivo*'-effekter på vævrelaxations- I tider. Ud fra 5 mg palmitinsyre, 2 ml 5 mg/ml magnetit I i PBS og 40 mg 2:1 DSPCrCHOL vandtes en gyldenbrun I opløsning indeholdende 17,5 mg/ml af lipid. En 2,5:1 I 20 fortynding af denne opløsning med PBS blev også frem- I stillet. EMT6-tumorvæv blev transplanteret subcutant I i flanken på Balb/c-hanmus og fik lov at vokse i I 10 dage. På den 10. dag fik musene i.v. injektion I med 200 yl opløseliggjort magnetitopløsning eller I 25 kontrolpuffer. Mus blev dræbt 24 timer senere, og I vævprøver blev udskåret, skyllet i PBS, trykket af, I vejet og forseglet i formstofposer. NMR relaxations- I tider blev derefter målt for de udskårne væv. Resul- I taterne er vist i Tabel III og demonstrerer klart I 30 forøgede relaxationsgrader (observeret grad minus I kontrolgrad), hvorhos T2 er påvirket mere end T^.

I DK 175531 B1

I .30 I

I Tabel III I

I Gradforøgelser—biodistributionsdata I

I Δ (Tp 1) (s 1): Lever Tumor Milt I

I 5 17,5 mg/ml 4,44 4,64* 9,23 I

I 7,0 mg/ml 2,16 2,40 6,78 I

I * gennemsnit af 5,75, 3,53 I

I . _ Δ_{T, 1)(s71) Lever Tumor Milt I

10 1 - —1

I 17,5 mg/ml 0,50 0,44 0,43 I

I 7,0 mg/ml 0,30 0,38 0,48 I

I 15 I

20 I

25 I 2 2

DK 175531 B1 I

31 I

Eksempel 5 I

Tidsforløb for biodistribution af magnetit-leverings- I

vehikler. I

Opløseliggjort magnetit blev fremstillet I

ved fremgangsmåden fra Eksempel 1, under anvendelse

S af 5 ml af 8 mg/ml magnetit i PBS, 12 mg palmitin- I

syre og 104 mg 2:1 DSPC:CHOL lipidfilm. Grupper I

på tre tumorbserende Balb/c-hunmus fik intravenøs I

injection med en kontrolopløsning, 200 μΐ PBS (én gruppe) eller I

200 μΐ magnetitopløsning (tre grupper). Magnetit-teerende dyr blev I

10 dræbt ved 4, 16 og 24 timer efter injektion. Kontrol- I

gruppen blev dræbt 27 timer efter injektion. Væv I

blev fjernet straks, og T2“og T^-relaxationstider I

blev bestemt ved 38°C under anvendelse af et IBM I

Minispec 20. De gennemsnitlige vævrelaxationsgrader I

I (1/T0 og 1/T.) er vist i fig. 7 og 8 som funktion I

I 15 1 1 I

af tid for hvert væv, med kontrolværdier»· ved t= I

I uendelig. Det er klart, at magnetit-leveringsvehik- I

I lerne fjernes fra blodstrømmen over en periode på I

I timer, hvis står i tydelig modsætning til magnetit- I

I partikler (med eller uden belægninger), der typisk I

I 20 fjernes fra blodet i løbet af ca. 5 minutter. I 1

Eksempel 6 I

I Dosisafhængighed for vævrelaxationstider.

I Liposomalt magnetit blev fremstillet som I 25 i Eksempel 1, fortyndet 50:1 i PBS, 0,80 mikron- I og 0,22 mikron-filtreret og derefter koncentreret I ved ultrafiltrering, hvorved vandtes en endelig

I opløsning indeholdende 8 mg/ml DSPC (ifølge HPLO

I bestemmelse). Varierende doser af denne opløsning I og 200 μΐ af en PBS-kontrolopløsning blev injiceret I 30 i.v. i tumorbærende Balb/c-mus. Ved 24 timer post- I injektion blev væv fjernet, og deres T2~og T^-re- I laxationstider blev bestemt. Dosisafhængigheden I for 1/T1 og for 1/T2 er.vist i fig. 9 og 10. En I signifikant 1/T^-forøgelse findes kun, hvor intakte I magnetitpartikler er tilstede, da opløsning af mag- I DK 175531 B1

I 32 I

I netit fjerner de cooperative interaktioner mellem I

I jernatomers magnetiskenanenter. Opløsel iggjort magnet it I

I forventes at give en 1/T1-stigning sammenlignet I

I med de paramagnetiske jernarter i opløsning (en I

I lille l/Tj-stigning er også mulig). Tumor-resultater I

5 i fig. 9 og. 10 lader formode, at ved lave doser I

I er alt magnetit, der kommer til tumoren, opløselig- I

I gjort, men ved højere doser er mekanismen for opløse- I

liggørelse af partiklerne mættet, og intakte partik- I

I ler bevirker T2~relationsforøgelse. Der er ingen I

I 10 signifikant T1-forøgelse for lever og blod, selvom I

I der observeres Tj-forøgelse. Dette er i overens- I

I stemmelse med intakte partikler. For milten lader I

I formen af dosis-afhængigheden formode nogen opløsning I

I af partikler uden mætning af mekanismen til at op- I

løseliggøre dem. I

I 15 I

I Eksempel 7 I

I Foretrukket område for fedtsyre-amphiphiler. I

I Magnetit-holdige leveringsvehikler blev frem- I

I stillet ved fremgangsmåden fra Eksempel 1 under I

I 20 anvendelse af ækvimolære mængder af et område af I

I forskellige fedtsyrer indeholdende fra 6 til 24 I

I carbonatomer. I hvert enkelt tilfælde blev et magne- I

tit-AAS fremstillet ved lydbehandling af fedtsyren I

ved 65°C med 5 ml 8 mg/ml magnetit i PBS og efter- I

25 følgende lydbehandling ved 25°C med 100 mg 2:1 I

DSPC:CHOL lipidfilm. En liposom-opløseliggjort mag- I

netitopløsning blev fremstillet i hvert enkelt tilfælde, I

som påvist ved opløsningsfarvning og ved den for- I

øgede T2~relaxationsgrad fundet for forskellig for- I

tynding i PBS. Repræsentative resultater er vist I

30 i fig. 11. I

Eksempel 8 I

Område for phospholipid-kompositioner. I

Liposom-opløseliggjort magnetit blev frem- I

stillet ved fremgangsmåden fra Eksempel 1 med 5 I

DK 175531 B1 33 ml af ca. 8 mg/ml magnetit i PBS og ca. 12 mg pal-mitinsyre. Afsluttende lydbehandling ved 65°C gennemførtes med ækvimolære mængder af lipidfilm, idet sammensætningen lå fra 1:1 DSPC:CHOL til 3:1 DSPC:CHOL.

Den molære mængde af lipid var ækvivalent med 100 5 mg 2:1 DSPC:CHOL. T2~Relaxationsgrader (R2) for de endelige opløsninger ved 10:1 fortynding i PBS er vist i Tabel IV.

Tabel IV

10 DSPC ϊ CHOL R2(sek.71) 1:1 23,8 1,5:1 23,3 2,0:1 29,4 2,5:1 10,0 15 3,0:1 6,8

Eksempel 9

Temperaturafhængighed.

Liposomalt magnetit blev fremstillet ved 20 fremgangsmåden fra Eksempel 1 ud fra 5 ml af 8 mg/ml magnetitopløsning i PBS og ialt 1.2 mg docosan(behen)-syre. I det afsluttende lydbehandlingstrin anvendtes et temperaturområde, der demonstrerede, at indfangnings-effektiviteten for magnetit er temperatur-25 afhængig. Relaxationsgraden for en 10:1 fortynding af endelig opløsning steg med faldende lydbehand-lingstemperatur. For en nominel 85°C lydbehandling (målt sluttemperatur 74°C) fandtes R, således at -1 ά -1 være 1,4 sek , stigende til R2 på 27,8 sek for 25°C nominelt (45°C sidst målte temperatur). En ^ yderligere stigning af R2 til 31,3 sek”^ blev noteret ved afsluttende lydbehandling i isvandbad (under 5°C), hvor den målte temperatur ved afslutningen var 41°C. I dette sidstnævnte tilfælde blev der imidlertid observeret filtreringsvanskelighed for slutproduktet gennem et 0,22 ym-filter.

I DK 175531 B1 I

I 34 I

I Eksempel 10 I

I Fremstilling af amphotericin B-leveringsvehikler. I

I 5 mg Amphotericin B, et antifungalt middel, I

I blev lydbehandlet i 5 ml 10 mM tris-HCl-pufret I

(pH 7,4) 5 vægtl's dextroseopløsning for at frembringe 1 I

5 en dispersion af det uopløselige lægemiddel. Denne I

I dispersion blev derefter lydbehandlet med 15 mg I

I palmitinsyre og derefter med 40 mg 2:1 DSPC:CH0L. I

Den fremstillede suspension blev centrifugeret ved I

I 18000 g i 15 minutter, og supernatanten blev 220 I

I io nm filtreret, hvorved vandtes en klar gul opløsning. I

I Spektrokemisk analyse for amphotericin B, ved absorp- I

I tionsevne ved 405 nm (E = 1,309 x 10^M cm”^), af I

I en 1:100 fortynding af opløsningen i methanol gav I

I en værdi på 0,4 mg/ml svarende til 40% inkorporering I

I af udgangsmateriale. I

15 I

I Eksempel It I

I Fremstilling og analyse af miconazol-leveringsve- I

I hikler. I

Miconazol {1-[2,4-dichlor-B“[2,4-dichlorben- I

20 zyl)oxy]phenethyl]imidazolnitrat) er et antifungalt I

middel af betydelig styrke. Dets anvendelighed er I

imidlertid noget begrænset af vandopløselighed og I

in vivo-toxicitet og leveringsproblemer. 10 mg Micona- I

zol blev dispergeret i 5 ml 10 mM Tris-HCl-pufret I

5% dextroseopløsning ved rumtemperatur-probelydbe- I

handling i 5 minutter. 10 mg Distearoylphosphatid- I

syre (DSPA) blev sat til denne suspension, og bland- I

ingen blev lydbehandlet ved 65°C i 15 minutter, I

hvorved vandtes en hvid miconazol-AAS-suspension. I

Denne blev derefter sat til 120 mg 2:1 DSPC:CH0L I

20 I

lipidfilm efterfulgt af lydbehandling i 15 minutter

ved 65°C. Den resulterende liposom-holdige opløsning I

blev centrifugeret ved 12500 rpm i 15 minutter oog I

successivt filtreret gennem 0,45 ym og 0,22 ym filtre. I

Den endelige opløsning blev undersøgt spektrofotome- I

trisk for miconazol ved inddampning til tørhed ved I

DK 175531 B1 I

35 I

reduceret tryk, DMF-ekstraktion og efterfølgende I

UV-absorptionsevnemåling ved 273 nm. Bestemmelsen I

viste mere en 95% lægemiddel-indfangning, jto vitro- I

effektiviteten af den endelige opløsning blev testet I

ved vækstinhibition af Candida Albicans under anvend- I

5 else af absorptionsevne ved 425 nm til at følge I

C.Albicans-koncentration i et vækstmedium. Fig. I

12 viser 425 nm-absorptionsevnen (i forhold til I

I indledende absorptionsevne) som funktion af tid I

I for tre identiske aliquoter af C.Albicans-kultur I

I 2.0 behandlet med 100 yg/ml frit lægemiddel, 100 ug/ml I

I liposomalt miconazol og intet miconazol. Denne figur I

I viser klart, at frit og liposomalt miconazol inhi- I

I berer jLn vitro-vækst lige godt. I

I Eksempel 12 I

15 I

Fremstilling af bisanthren-leveringsvehikler. I

I Bisanthren (9,1O-anthracendicarboxaldehyd- I

I bis-[4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)hydrazon]-dihydro- I

I chlorid) er et virksomt kemoterapeutisk middel, I

I der er opløseligt i sur vandig opløsning. I blod- I

I 20 strømmen er lægemidlet imidlertid uopløseligt og I udfælder med taxiske konsekvenser. En vandig opløsning I af dihydrochloridsaltet af bisanthren (20 mg læge- I middel i 5 ml destilleret vand) blev gjort alkalisk I ved dråbevis tilsætning af koncentreret (1M) natrium- I 25 hydroxidopløsning, resulterende i udfældning af I den uopløselige frie base. Dette bundfald blev fjernet

I ved centrifugering og vasket med PBS, indtil pH

I af PBS-suspensionen af lægemidlet faldt til ca.

I 7,4. Det totale volumen af suspensionen blev indstil- I let på 5 ml. Den blev derefter lydbehanbdlet med I 30 4 mg palmitinsyre. Lydbehandling gennemførtes i I ca. 5 minutter ved 65°C og resulterede i en bleggul I bisanthren-AAS-dannelse (analog med magnetit-AAS- I dannelse), Bisanthren-AAS'et blev gensuspenderet I i 5 ml PBS og lydbehandlet ved 65°C i 15 minutter I ved 80 W med 100 mg 2:1 DPSCrCHOL lipidfilm, hvorved

I DK 175531 B1 I

36 · vandtes en uklar gul-hvid opløsning. Denne opløsning blev 0,22 μιη-f iltreret, hvorved vandtes et endeligt j liposom-opløseliggjort præparat af bisanthren, hvorhos tilstedeværelsen af lægemidlet fremgik af opløsnings- farvning.

I 5

Eksempel 13

Fremstilling og analyse af cisplatin-leveringsve- hikler.

Cisplatin (cis-diamindichlorplatin (II)) er et velkendt kemoterapeutisk middel, dér lider H af ulempen ved større klinisk toxicitet, navnlig nephro-toxicitet. 10 mg Cisplatin blev opløst/sus- penderet i 2 ml 5% dextroseopløsning ved probe-lyd- behandling ved 80 W i 2 minutter ved 65°C. Nogen H cisplatin opløstes, mens det resterende blev suspende- 15 ret i opløsningsmidlet. Efter tilsætning af ca.

12 mg dipalmitoylphosphatidsyre (DPPA) blev suspen- sionen igen lydbehandlet ved 65°C og 80 W i 10 minut- ter, hvorved udvikles et blåfarvet cisplatin-AAS- materiale ud fra en indledningsvis gul opløsning - 20 °9 suspension. AAS-suspensionen blev fortyndet til 5 ml med 5% dextroseopløsning og derefter lydbehandlet I ved 25°C med 100 mg 2:1 DSPC-CHOL. Efter centrifu- gering ved 12500 rpm i 5 minutter blev produktop- løsningen 0,22 ym-filtreret, hvorved vandtes en opløsning, svarende i udseende til opløsninger af I 25 små unilaminære vesikler, hvilken opløsning var bleggul for transmitteret lys og blåfarvet ved be- I tragtning med spredt lys. Analyse for totalt platin i den endelige opløsning gennemførtes ved 2:1-kompleks- I dannelse med diethylthiocarbamat og UV-absorptions- I 30 evnemåling ved 254 nm af chloroformekstrakten af denne opløsning. Den endelige platinkoncentration I i 5 ml opløsning blev bestemt til 0,66 mg/ml, svarende I til ca. 51% lægemiddelindfangning. Associering af I lægemidlet med liposomer blev demonstreret ved chroma- I tografi på en Sephadex G50/80-søjle, på hvilken opløsningen vandrede som en enkelt bånd.

Claims (23)

1. 37 I DK 175531 B1 I PATENTKRAV I
2. 1. Leveringsvehikel for en aktiv bestanddel, I hvilken leveringsvehikel har en størrelse på fra ca. I 2. ntn til ca. 100 nm i diameter og omfatter et lipid- I 5 materiale, der indkapsler et amphiphil-associeret I substrat i det væsentlige i fravær af opløsningsfase I indre volumen, som omfatter: I en aktiv bestanddelfase, I et amphiphilt materiale, der er i stand til at I I 10 associere med nævnte aktive bestanddel og har en po- I I lær hydrophil del og en lipophil del, idet den nævnte I I polyhydryphile del af nævnte amphiphile materiale er I I associeret med nævnte aktive bestanddelfase for at I I danne nævnte amphiphile associerede substrat; og I I 15 et enkelt biokompatibelt indkapslende monolag, I I der omgiver nævnte amphiphil-associerede substrat om- I fattende molekyler, der har lipophile haler associe- I I ret med den lipophile del af det amphiphil- I I associerede substrat. I I 20 2. Leveringsvehikel ifølge krav 1, hvor nævnte I I aktive bestanddel omfatter et materiale valgt blandt I diagnostiske midler og terapeutiske midler.
3. 3. Leveringsvehikel ifølge ethvert af de forud- I gående krav, hvor nævnte amphiphile materiale omfat- I 25 ter mindst én af fedtsyrerne, phosphatidylglyceroler, I . phosphatidsyre, diglycerider og triglycerider, hydro- I fobsubstituerede alkoholer, aminer, phosphater I og/eller sulfater.
4. 4. Leveringsvehikel ifølge krav 3, hvor nævnte I 30 amphiphile materiale omfatter en fedtsyre eller en I phosphatidsyre. I DK 175531 B1 I 38
5. 5. Leveringsvehikel ifølge krav 4, hvor nævnte H amphiphile materiale omfatter en fedtsyre, der har en lipophil del af en aliphatisk kæde på fra 10 til 28 H carbonatomer i længde og/eller en phosphatidsyre, der H 5 har en lipophil del af en aliphatisk kæde eller kæder H på fra 10 til 28 carbonatomer i længde.
6. 6. Leveringsvehikel ifølge ethvert af de forud- gående krav, hvori nævnte hydrophile del omfatter en carboxyl-, hydroxyl-, amino-, phosphato- eller Η 10 sulphatogruppe. Η 7. Leveringsvehikel ifølge krav 6, hvori nævnte H lipophile del omfatter en aliphatisk carbonhydrid, cycloaliphatisk carbonhydrid, aromatisk substitueret aliphatisk carbonhydrid, cycloaliphatisk substitueret 15 aliphatisk carbonhydrid eller polyoxyethylengruppe.
7. 8. Leveringsvehikel ifølge krav 6 eller 7, I hvori nævnte lipophile del omfatter en aliphatisk kæ- de på fra 10 til 28 carbonatomer i længden.
8. 9. Leveringsvehikel ifølge ethvert af de for- 20 udgående krav, hvori nævnte biokompatible ind- kapslingsmonolag omfatter et phospholipidmateriale.
9. 10. Leveringsvehikel ifølge ethvert af de for- I udgående krav, hvori nævnte leveringsvehikel har en I størrelse på fra omkring 35 nm til omkring 100 nm i 25 diameter.
10. 11. Leveringsvehikel ifølge krav 10, hvori nævnte leveringsvehikel har en størrelse fra omkring 50 nm til omkring 80 nm i diameter.
11. 12. Leveringsvehikel ifølge ethvert af de for-30 udgående krav, hvori nævnte amphiphile materiale omfatter fedtsyrer, der har en aliphatisk kæde på fra 12 til 18 carbonatomer i længden, fedtsyrer der har en aliphatisk kæde på fra 22 til 24 carbonatomer i
12. 39 I DK 175531 B1 I I længden og/eller en phosphatidsyre der har en alipha- I I tisk kæde eller kæder på fra 12 til 18 carbonatomer i I I længden, og hvori I I nævnte biokompatible indkapslingsmonolag omfat- I I · 5 ter et phospholipidmateriale omfattende en aliphatisk I I kæde eller kæder på fra 10 til 20 carbonatomer i I I længden. I
13. 13. Leveringsvehikel ifølge krav 12, hvori I I nævnte amphiphile materiale omfatter mindst én fedt- I I 10 syre valgt fra laurinsyre, myristinsyre, palmitinsy- I I re, stearinsyre, oliesyre, docosansyre, tetracosansy- I I re, dimyristoylphosphatidsyre, dipalmitoylphosphatid- I I syre og distearoylphosphatidsyre , og hvori I I nævnte phospholipidmateriale omfatter en I I 15 phosphatidylcholin, der har en lipophil del af en I I aliphatisk kæde eller kæder på fra 10 til 20 carbona- I I tomer i længden. I
14. 14. Leveringsvehikel ifølge ethvert af de for- I I udgående krav, hvori det amphiphile materiale omfat- I 20 ter laurinsyre, myristinsyre eller palmitinsyre, og I nævnte biokompatible .indkapslingsmonolag omfatter en blanding af cholesterol og en phosphatidylcholin I valgt fra dimyristoylphosphatidylcholin, dipalmi- I toylphosphatidylcholin og distearoylphosphatidylcho- I 25 lin.
15. 15. Leveringsvehikel ifølge ethvert af de for- I udgående krav, hvori den aktive bestanddel er magne- I tit. I 1$. Leveringsvehikel ifølge ethvert af kravene I 30 1 til 14, hvori den aktive bestanddel er et terapeu- I tisk middel. I DK 175531 B1 I 40 I
16. 17. Leveringsvehikel if elge krav 16, hvori I I nævnte terapeutiske aktive bestanddel omfatter et an- I I tineoplastisk middel. I
17. 18. Leveringsvehikel ifølge krav 17, hvori I I 5 nævnte antineoplastiske middel er bisanthren eller I I cisplatin. I
18. 19. Leveringsvehikel ifølge krav 16, hvori I nævnte terapeutiske aktive bestanddel omfatter et an- I tifungalt middel. I I 10 20. Leveringsvehikel ifølge krav 19, hvori I I nævnte antifungale middel er amphotericin B eller mi- I conazol. I
19. 21. Fremgangsmåde til fremstilling af en leve- I I ringsvehikel som defineret i et hvilket som helst af I I 15 de forudgående krav, som omfatter I I dannelse af en associering mellem den aktive bestand- I I delfase og det amphiphile materiale i en vandig fase I I for at danne et amphiphil-associeret substrat, hvori I I den polære, hydriphile del af det amphiphile materia- I 20 le er associeret med den aktive bestanddel, og I I indkapsling af nævnte amphiphil-associerede substrat I I inde i et indkapslingsmonolag omfattende molekyler, I der har lipophile haler associeret med den lipophile I I del af nævnte amphiphil-associerede substrat for at I I 25 indkapsle det amphiphil-associerede substrat i fravær · I I af et opløsningsfase-volumen inde i nævnte monolag. I
20. 22. Leveringsvehikel ifølge ethvert af kravene I I 1 til 2 0 til anvendelse i en metode til behandling af I mennesker eller dyrelegemer ved terapi eller kirurgi I I 30 eller i en diagnostisk metode praktiseret på menne- I I sker eller dyrelegemer. I DK 175531 B1
21. 23. Leveringsvehikel ifølge krav 15 til anvendelse i en metode til nuklear magnetisk resonans billeddannelse praktiseret på det menneskelige eller dyriske legeme.
22. 24. Leveringsvehikel ifølge krav 17 eller 18 til. anvendelse i en fremgangsmåde til behandling af neoplastisk sygdom i det menneskelige eller et dyre-1egerne.
23. 25. Leveringsvehikel ifølge krav 19 eller 20 10 til anvendelse i en fremgangsmåde til antifungal behandling praktiseret på det menneskelige eller dyriske legeme. 15