PL197939B1 - Liposomowy preparat zawierający przeciwnowotworową substancję aktywną, sposób jego wytwarzania i zawierająca go kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Abstract

1. Liposomowy preparat zawierający przeciwnowotoworową substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, znamienny tym, że kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową CmH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową. 7. Sposób wytwarzania liposomowego preparatu przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienny tym, że a) roztwór substancji aktywnej w rozpuszczalniku, korzystnie alkanolu, łączy się z roztworem składników lipidowych w rozpuszczalniku organicznym, przy czym składniki lipidowe stanowią mieszaninę co najmniej jednej pochodnej fosfolipidu i co najmniej jednej modyfikowanej pochodnej fitolipidu przedstawionej wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową CmH2m+1 przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową,................... 9. Kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego obejmująca farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub substancje pomocnicze i terapeutycznie skuteczną ilość przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienna tym, że zawiera liposomowy preparat substancji aktywnej zamkniętej w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1.....

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest liposomowy preparat zawierający przeciwnowotworową substancję aktywną, sposób jego wytwarzania i zawierająca go kompozycja farmaceutyczna.

Użyteczność liposomów w farmacji i medycynie, jako nośników substancji leczniczych, była postulowana od wczesnych lat sześćdziesiątych, kiedy poznano zjawisko zamykania niektórych związków chemicznych w mikropęcherzykach lipidowych. Jednak dopiero w ostatnich kilku latach uzyskano obiektywne dowody terapeutycznej skuteczności tego sposobu podawania substancji farmaceutycznych i wprowadzono do lecznictwa pierwsze liposomowe formy leków.

Korzystne skutki podawania substancji aktywnych farmakologicznie w postaci liposomów polegają na podwyższeniu biodostępności, obniżeniu toksyczności układowej i/lub narządowej, ukierunkowaniu działania do konkretnych obszarów, np. tkanki nowotworowej, wydłużeniu okresu półtrwania, czyli w sumie na polepszeniu selektywności działania i indeksu terapeutycznego.

Aktualny stan wiedzy na temat liposomów, szczególnie ich zastosowań farmaceutycznych, znany jest z opracowań literaturowych, m.in. D. D. Lasic, Liposomes: from physics to applications, Elsevier, Amsterdam 1995; D. D. Lasic, F. Martin Stealth liposomes CRC Press Boca Raton 1995, D. D. Lasic, D. Papahadjopoulos, „Medical applications of liposomes, Elsevier, Amsterdam 1998, Lian T., Ho R. J. Y. „Trends and developments in liposome drug delivery systems, J. Pharm.Sci. 90(6), 667-680, 2001.

Liposomy stanowią zamknięte struktury, jedno- lub wielowarstwowe, w których podwójna warstwa amfifilowego lipidu stanowi otoczkę mikrokropelki wody (liposomy jednowarstwowe) lub też błony lipidowe układają się koncentrycznie na przemian z warstwami wody (liposomy wielowarstwowe). Amfifilowe lipidy tworzące dwuwarstwę posiadają polarną grupę hydrofilową i jeden lub więcej hydrofobowych prostych łańcuchów wielowęglowych (>C8). Grupy polarne mogą stanowić pochodne fosforanów, siarczanów i związków azotu, ale najczęściej stosowane są fosfolipidy, zwłaszcza pochodzenia naturalnego, jak na przykład fosfatydylocholiny będące wynikiem rafinacji tłuszczów roślinnych, fosfolipidy syntetyczne, dostępne handlowo preparaty fosfolipidowe, w tym fosfolipidy modyfikowane chemicznie przy zastosowaniu pochodnych glikolu etylenowego i pochodne cholesterolu. Substancja lecznicza, zależnie od rozpuszczalności, umiejscowiona jest w warstwie wodnej lub w warstwie lipidowej liposomu.

Znanych jest szereg sposobów otrzymywania liposomów. Klasyczna metoda wytwarzania liposomów wielowarstwowych polega na odparowaniu roztworu lipid - rozpuszczalnik organiczny i rehydratacji filmu lipidowego wodnym roztworem substancji leczniczej (J. Mol. Biol. 13 (1965), 238-252). Inne techniki obejmują emulgowanie lipidu w dwufazowej mieszaninie fazy wodnej i organicznej zawierającej lipid, przy jednoczesnym odparowywaniu rozpuszczalnika organicznego (np. opisy patentowe US 4,522,803, 5,030,453 i 5,169,637), tworzenie emulsji woda w oleju, z której odparowywana jest faza organiczna do uzyskania żelu, następnie mieszanego do otrzymania liposomów oligowarstwowych (US 4,235,871) oraz wielokrotnie powtarzanych cykli zamrażania i rozmrażania (US 5,008,050). Liposomy jednowarstwowe otrzymuje się z liposomów wielowarstwowych działaniem ultradźwięków, metodą ekstruzji (np. US 4,975,282), homogenizacji, jak również wstrzykiwania eterowych lub etanolowych roztworów lipidów do fazy wodnej (Deamer R., Uster, P. „Liposome preparation; Methods and Mechanisms , w: „Liposomes, wyd. M. Ostro, Marcel Dekker, New York, 1987).

W przypadku wielu grup terapeutyków zarówno wydajność zamykania substancji czynnej w pęcherzykach jak i trwałość liposomów (in vitro i in vivo) stanowią poważny problem techniczny. W szczególności klasyczne preparaty liposomowe trudno rozpuszczalnych w wodzie taksoidów na bazie lecytyny sojowej lub syntetycznego analogu fosfolipidowego (Bartoli i in. J. Microencapsulation 7, 1990, 191-197, Riondel i in. In Vivo 6, 1992, 23-28), wykazują tendencję do agregowania, a także niestabilność, powodującą „wyciekanie substancji aktywnej z liposomu i jej krystalizację.

W wielu przypadkach sporządzenie liposomowych preparatów substancji przeciwnowotworowych o efektywnym stosunku lipid/lek wymaga stosowania specjalnych zabiegów, takich jak na przykład opisany w publikacji WO 9202208 i zgłoszeniu patentowym EP 546951 A1 dodatek ujemnie naładowanych fosfolipidów lub ujawnione w japońskim opisie patentowym JP 06254379 dodawanie alkoholu wielowodorotlenowego i czwartorzędowych soli amoniowych.

Udoskonalone postaci liposomowe, zapewniające większą trwałość poprzez steryczną stabilizację powierzchni sfery lipidowej, stanowią tzw. liposomy Stealth (D. D. Lasic, F.Martin „Stealth liposomes, CRC Press Boca Raton, 1995). Jedną z metod zmierzających do opracowania bardziej trwaPL 197 939 B1 łych form liposomowych stało się użycie do opłaszczania liposomów hydrofilowego glikolu polietylenowego, opisane m.in. w publikacji zgłoszenia międzynarodowego WO 9422429. Do lecznictwa została wprowadzona liposomowa postać doksorubicyny powlekanej glikolem polietylenowym pod nazwą handlową Doxil®. Preparat Doxil® zawiera doksorubicynę zamkniętą w liposomowych nośnikach Stealth, składających się z trzech składników lipidowych - uwodornionej lecytyny z soi, cholesterolu i karbaminianowego konjugatu distearynylofosfatydyloetanoloaminy z metoksylową pochodną glikolu polietylenowego 2000 w odpowiednim stosunku molowym.

Długi czas półtrwania liposomów Stealth, związany także z niskim wyciekiem leku, uzyskuje się stosując unikalne metody ładowania, które zapewniają wysoką wydajność ładowania i utrzymywanie leku we wnętrzu przez dłuższy czas. Metody te obejmują ładowanie gradientem elektrolitu (zgłoszenie EP 361894 A1) lub gradientem pH (publikacja WO 8806442).

W publikacji WO 8806442 składniki warstwy lipidowej stanowią klasyczne związki lipidowe, takie jak fosfatydylocholiny naturalne i syntetyczne, z ewentualnym dodatkiem cholesterolu, a w procesie enkapsulacji wykorzystuje się gradient pH. Zgodnie z opisem, ograniczona szybkość wyciekania zamkniętego składnika biologicznie aktywnego jest wynikiem różnic pH po dwu stronach błony lipidowej.

Metoda ładowania gradientem pH ograniczona jest jednak tylko do leków rozpuszczających się w fazie wodnej, będących słabymi kwasami lub zasadami.

Preparaty liposomowe zawierające topotekan i lipidy w proporcji 0,05:0,2, ładowane metodą gradientu pH lub jonoforetyczną, opisane są w publikacji WO 0202078. W skład warstwy lipidowej wchodzą sfingomielina i cholesterol.

W opisie zgłoszenia międzynarodowego WO 9915153 ujawnione są m.in. liposomy taksolu, charakteryzujące się stężeniem substancji aktywnej w liposomie nie wyższym niż 5 mg/ml i zawierające jako lipid syntetyczną lecytynę-dilauroilofosfatydylocholinę. Autorzy deklarują, że stosunek lek : lipid mieści się w zakresie od 1:1 do 1:2000, korzystnie 1 : 30, nie przedstawiają jednak informacji na temat trwałości tych preparatów liposomowych, przeznaczonych do podawania substancji przeciwnowotworowych drogą wziewną.

Stabilne preparaty liposomowe uzyskiwano dotychczas głównie dzięki stosowaniu specjalnych zabiegów bądź modyfikacji cząsteczek substancji aktywnej, np. przez dołączanie łańcuchów węglowodorowych, polimerycznych lub peptydowych.

W polskich patentach nr 190 077 i 190 078 wysoki poziom enkapsulacji doksorubicyny lub mitoksantronu przy korzystnym stosunku lek : lipid w preparacie liposomowym uzyskano w wyniku modyfikacji składu warstwy lipidowej, która zawiera oprócz klasycznych składników, lecytyny jajecznej i uwodornionej lecytyny jajecznej, wodorosiarczanową pochodną acylową rezorcyny.

Stabilne preparaty liposomowe paklitakselu uzyskano przez dodatek do kompozycji lipidowej kardiolipiny (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5,424,073, 5,648,090, 5,939,567 i 6,146,659). Z opisu patentowego US 6,146,659 wynika, że w tym przypadku wydajność zamykania paklitakselu w pęcherzykach liposomowych przekracza 90%, przy stosunku wagowym substancji aktywnej do nośnika lipidowego około 7%. Generalnie, możliwość inkorporowania paklitakselu do liposomów, wskutek jego wysokiej hydrofobowości, ograniczona jest do 1-10% (w/w), najczęściej 2-8% (w/w) w stosunku do nośnika lipidowego. Współczynnik ten tylko nieznacznie udaje się poprawić (do 12-14% w/w) w wyniku modyfikacji cząsteczki paklitakselu, np. przez dołączenie łańcuchów węglowodorowych (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5,919,815, 5,939,567, 6,118,011).

W dalszym ciągu istnieje zatem potrzeba opracowania liposomowych preparatów farmaceutycznych, zwłaszcza liposomowych preparatów zawierających hydrofobowe substancje przeciwnowotworowe, o korzystnym stosunku lipid/substancja aktywna, czyli umożliwiających przenoszenie takiej samej ilości substancji aktywnej przez mniejszą ilość lipidowego nośnika. W szczególności istnieje potrzeba opracowania liposomowych preparatów substancji przeciwnowotworowych, które mogłyby zostać użyte do wytwarzania leku podawanego drogą pozajelitową, charakteryzujących się wysoką wydajnością zamykania (stopniem enkapsulacji) substancji aktywnej i odpowiednią trwałością.

Nieoczekiwanie okazało się, że potrzebę tę zaspokaja preparat liposomowy substancji hydrofobowych, w którym wysoką wydajność zamykania substancji aktywnej i trwałość uzyskuje się w wyniku modyfikacji składu klasycznego nośnika lipidowego, polegającej na wprowadzeniu do kompozycji fosfolipidu modyfikowanych pochodnych naturalnych fitolipidów zawierających w cząsteczce nasycone łańcuchy węglowodorowe i grupy karboksylowe.

Istotę wynalazku stanowi liposomowy preparat zawierający przeciwnowotoworową substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych

PL 197 939 B1 w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, charakteryzujący się tym, że kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową.

Pochodne fitolipidu o wzorze 1 otrzymać można w wyniku przekształceń chemicznych naturalnych alkilofenoli, poprzez uwodornianie łańcucha węglowego, alkilowanie i karboksylację. Pochodne o wzorze I, w wyniku derywatyzacji naturalnych struktur, mogą różnić się charakterem chemicznym, jak również właściwościami fizykochemicznymi, na przykład rozpuszczalnością i lipofilowością.

Szczególnie korzystne pochodne mające zastosowanie zgodnie z wynalazkiem stanowią te, w których R3 w podstawniku R1 stanowi grupę karboksylową, n = 15, m = 1, a R₄ stanowi atom wodoru, czyli kwas 2-(3-pentadecyloofenoksy)octowy.

Korzystnie fosfolipid i pochodna fitoplipidu o wzorze I występują w kompozycji składników lipidowych w stosunku molowym około 9:1.

Substancję aktywną wchodzącą w skład preparatu liposomowego według wynalazku może stanowić dowolna substancja terapeutyczna wykazująca skuteczność i bezpieczeństwo przy podaniu ssakom, zwłaszcza ludziom. W szczególności należy rozważyć możliwość użycia trudno rozpuszczalnych substancji o aktywności przeciwnowotworowej, wybranych spośród antybiotyków antracyklinowych takich jak mitoksantron, daunomycyna, doksorubicyna, epirubicyna czy idarubicyna, związków alkilujących, pochodnych kamptotecyny takich jak irinotekan i kamptotekan, lignanów takich jak etopozyd oraz taksoidów takich jak paklitaksel i docetaksel, przy czym wymienione przykłady nie stanowią w żadnym stopniu ograniczenia wynalazku.

Preparat liposomowy według wynalazku oprócz substancji aktywnej i składników lipidowych może zawierać dodatkowe stabilizatory struktury pęcherzyka i ewentualnie inne dopuszczalne farmaceutycznie środki pomocnicze, wpływające na zwiększenie jego trwałości.

Kompozycja składników lipidowych według wynalazku zapewnia wysoki stopień zamykania substancji aktywnej w pęcherzykach lipidowych. Szczególnie korzystne rezultaty uzyskuje się w przypadku paklitakselu, gdzie stopień enkapsulacji wynosi ponad 95%.

Wynalazek obejmuje ponadto sposób wytwarzania preparatu liposomowego substancji przeciwnowotworowej o wysokim stopniu zamykania substancji aktywnej.

Zgodnie z tym sposobem:

a) roztwór substancji aktywnej w rozpuszczalniku, korzystnie alkanolu, łączy się z roztworem składników lipidowych w rozpuszczalniku organicznym, przy czym składniki lipidowe stanowią mieszaninę co najmniej jednej pochodnej fosfolipidu i co najmniej jednej modyfikowanej pochodnej fitolipidu przedstawionej wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R₄ oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową,

b) odpędza się rozpuszczalniki,

c) film lipidowy otrzymany w etapie b) rozprowadza się w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie alkanolu, i poddaje liofilizacji,

d) IlofHlzat z etapuc) hydratyzuje się wodą, otrzymując pierwotny preparat widowarstwowych llposomów,

e) preparat pierwotny poddajesię dodatkowymprocesom fizycznym. otι^^'^rm^u^cz^\^i^^i(^^ kantowanych liposomów dwuwarstwowych o wielkości 50-200 nm, korzystnie 100 nm, a następnie

f) zawiesinę liposomową z ewentualnym dodatkiem substancji pomocniczych, takich jak substancje krioochronne, poddaje się liofilizacji.

Zawiesinę w etapie c) zamraża się przez zanurzenie kolby z zawiesiną, ewentualnie z dodatkiem substancji krioochronnych, w ciekłym azocie, a następnie rozmrażanie w temperaturze 40°C. Czynności te powtarza się 7 do 10 razy. Badania przy użyciu elektronowego mikroskopu transmisyjnego Jeol 100C, przy powiększeniach 5.000-100.000x wykazują, że wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie zawiesiny liposomowej powoduje dwie istotne z punktu widzenia zastosowań farmaceutycznych zmiany: zmniejszenie warstwowości liposomów oraz ujednolicenie ich rozmiarów.

Podobne zadanie spełnia poddawanie zawiesiny liposomów krótkotrwałemu działaniu ultradźwięków, czyli sonikacja.

PL 197 939 B1

Właściwy liposomowy preparat substancji aktywnej otrzymuje się przez hydratację preparatu pierwotnego, polegającą na wytrząsaniu, mieszaniu mechanicznym, lub poddaniu preparatu działaniu ultradźwięków (sonikacji) w obecności wody, roztworu soli fizjologicznej, buforu i ewentualnie roztworu innych farmaceutycznie dopuszczalnych substancji.

Otrzymany w etapie d) hydratyzowany preparat liposomowy składa się z liposomów wielo- i jednowarstwowych o średniej wielkości 80-1500 nm. Dwuwarstwowe liposomy o korzystnej wielkości 100-200 nm można uzyskać poddając zawiesinę liposomową odpowiednim procesom fizycznym, takim jak wymrażanie, ekstruzja, homogenizacja wysokociśnieniowa lub sonikacja.

Odpowiednią metodę ujednolicania wielkości liposomów stanowi kilkukrotna ekstruzja zawiesiny przez membranę poliwęglanową o średnicy porów 50-200 nm, korzystnie o średnicy 100 nm. Przeprowadzona kilkukrotnie ekstruzja pozwala na przeprowadzenie w jednej operacji jednostkowej trzech procesów wytwarzania preparatu liposomowego: ładowania pęcherzyków substancją aktywną, kalibracji liposomów i sterylizacji preparatu.

Hydratacja liofilizatu substancji przeciwnowotworowej o ujawnionym składzie nawet w najprostszych warunkach, przez wytrząsanie składników lipidowych z wodnym roztworem substancji czynnej, zapewnia uzyskanie liposomowego preparatu o wysokim stopniu enkapsulacji, przekraczającym 95%.

Wynalazek stanowi ponadto kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego charakteryzująca się tym, że zawiera liposomowy preparat substancji aktywnej zamkniętej w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, przy czym kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową, oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub substancje pomocnicze.

Farmaceutycznie dopuszczalny nośnik stanowi dowolna znana z praktyki farmaceutycznej substancja lub mieszanina substancji nośnikowych nie wywierających własnego działania farmakologicznego, rozcieńczalnik lub substancja pomocnicza, przeznaczone do podawania substancji biologicznie czynnych. Korzystne do stosowania w związku z wynalazkiem nośniki odpowiednie do podawania kompozycji drogą dożylną obejmują na przykład wyjałowione roztwory wodne, takie jak roztwór soli fizjologicznej, roztwory węglowodanów, np. glukozy, mannitolu, dekstrozy, laktozy i roztwory wodne buforów, na przykład buforu fosforanowego. Ponadto kompozycja może zawierać inne substancje pomocnicze, tradycyjnie stosowane w celu zapewnienia izoosmotyczności, przeciwutleniacze, substancje konserwujące i inne, nie wykazujące niezgodności z substancją aktywną i ze składnikami dwuwarstwy lipidowej.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku, do kompozycji farmaceutycznej dodaje się glukozę, w ilości około 5:1 (w/w) w stosunku do składników llpidowych.

Glukoza pełni w kompozycji funkcję substancji wypełniającej i krioochronnej. Stosuje się ilość glukozy zapewniającą odpowiednią izoosmotyczność i izochydryczność kompozycji, tak że preparat przed użyciem można odtwarzać wyłącznie wodą do iniekcji, uzyskując roztwór o odpowiednim stężeniu glukozy (5%), bez konieczności stosowania dodatkowych rozcieńczalników substancji pomocniczych.

Kompozycja farmaceutyczna może mieć postać zawiesiny liposomowego preparatu substancji przeciwnowotworowej gotowej do podania, postać liofilizatu do odtwarzania ex tempore bądź też koncentratu do sporządzania wlewów dożylnych. Liofilizat występuje w jednostkowej postaci dawkowania, korzystnie w ampułce, zawierającej terapeutycznie skuteczną ilość substancji aktywnej. Kompozycję w jednostkowych postaciach dawkowania otrzymuje się przez rozdysponowanie jałowej zawiesiny w sterylnych warunkach do ampułek, liofilizację i szczelne zamknięcie. Liofilizat odtwarza się wodą do iniekcji lub innym farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem bezpośrednio przed użyciem.

Skład warstwy lipidowej według wynalazku umożliwia uzyskanie liposomowego preparatu przeciwnowotworowych substancji aktywnych o korzystnym stosunku lipid/substancja aktywna, charakteryzującego się wysoką wydajnością zamykania substancji aktywnej i odpowiednią trwałością. Preparat liposomowy znajduje zastosowanie do wytwarzania liofilizowanych kompozycji do podawania pozajelitowego, zawierających terapeutycznie skuteczną ilość substancji aktywnej. Liofilizowane kompozycje

PL 197 939 B1 według wynalazku zachowują stabilność w temperaturach przechowywania 4°C, 25°C i 30° w okresie do 2 lat.

Opis rysunków i wykresów

Figura 1

Analiza wielkości liposomów PC/KW-23.3 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS (Korelacyjna Spektroskopia Fotonowa).

Małe jednowarstwowe liposomy otrzymano poprzez kalibrację dużych wielowarstwowych liposomów za pomocą filtru o średnicy porów 100 nm. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 106,6 nm, szerokość piku: 65 nm, jakość: Pass, indeks polidyspersyjności: 0,118, temperatura pomiaru 21,3°C, lepkość ośrodka: 0,97, ilość zliczeń/sek: 312k.

Figura 2

Analiza wielkości liposomów PC/KW-28 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS.

Małe jednowarstwowe liposomy otrzymano poprzez kalibrację dużych wielowarstwowych liposomów za pomocą filtru o średnicy porów 100 nm. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 129 nm, szerokość piku: 81,8 nm, jakość: Pass, indeks polidyspersyjności: 0,142, temperatura pomiaru 21,6°C, lepkość ośrodka: 0,96, ilość zliczeń/sek: 345k.

Figura 3

Analiza wielkości liposomów PC/KW-18 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS.

Małe jednowarstwowe liposomy otrzymano poprzez kalibrację dużych wielowarstwowych liposomów za pomocą filtru o średnicy porów 100 nm. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 133,9 nm, szerokość piku: 70,9 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,133, temperatura pomiaru 21,5°C, lepkość ośrodka: 0,97, ilość zliczeń/sek: 343.9k.

Figura 4

Analiza wielkości liposomów PC/KW-23.3 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS.

A - liposomy po kalibracji przez filtr o porach 100 nm;

B - liposomy z punktu A poddane liofilizacji w obecności substancji krioochronnej (glukoza, substancja krioochronna/lipid =5:1) i odtwarzane wodą.

Warunki pomiaru:

A - Średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 111,7 nm, szerokość piku: 68.2 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,113, temperatura pomiaru 21,2°C, lepkość ośrodka: 0,97, ilość zliczeń/sek: 446k. B - Średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 111,7, szerokość piku: 72,8 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,121, temperatura pomiaru 21,1°C, lepkość ośrodka: 0,98, ilość zliczeń/sek: 421,7k.

Figura 5

Analiza wielkości liposomów PC/KW-23.3 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS. Liposomy otrzymane wg. przykładu 1 przechowywano w postaci zawiesiny w temp. 4°C przez okres 1 miesiąca. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości) : 107,2, szerokość piku: 68,5 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,123, temperatura pomiaru 20,7°C, lepkość ośrodka: 0,99, ilość zliczeń/sek: 296, 9k.

Sposób według wynalazku ilustrują, nie ograniczając jego zakresu, następujące przykłady.

P r z y k ł a d 1

Do zakręcanej probówki szklanej o pojemności 30 ml dodano 114 mg lecytyny jajecznej (PC) w chloroformie (10 mg/ml), 6 mg pochodnej KW-23.3 (kwasu 2-heksadecyloksy-4-pentadecylobenzoesowego) w chloroformie (10 mg/ml) oraz 4 mg paklitakselu w postaci roztworu metanolowego (5 mg/ml), po czym rozpuszczalniki organiczne odpędzono strumieniem czystego azotu, ogrzewając jednocześnie probówkę do temperatury 35°C. Mazistą pozostałość rozpuszczono następnie w 5 ml alkoholu tert-butylowego, zamrażano i liofilizowano przez noc.

Suchą pozostałość uwodniono, energicznie wytrząsając z 2 ml sterylnej soli fizjologicznej. Otrzymane wielowarstwowe liposomy zawierające paklitaksel poddano 10 cyklom ekstruzji przy użyciu ciśnieniowego ekstrudera zaopatrzonego w filtry poliwęglanowe 100 nm (fig. 3). Po ekstruzji pobrano 50 μΙ próbkę liposomów i oznaczono w niej metodą analizy HPLC zawartość paklitakselu i składników lipidowych. Wydajność zamykania substancji aktywnej w liposomach > 95%.

PL 197 939 B1

P r z y k ł a d 2

Do zakręcanej probówki odważono: 113,3 mg dimirystylofosfatydylocholiny (DMPC), 6,72 mg pochodnej KW28 (kwasu 2-(3-pentadecylofenoksy)octowego oraz 4 mg paklitakselu. Do odważonych substancji dodano następnie 5 ml alkoholu tert-butylowego. Całość wytrząsano na mikrowytrząsarce, aż do rozpuszczenia wszystkich składników. Następnie klarowny roztwór zamrożono i poddawano liofilizacji przez okres 24 godzin. Otrzymany suchy liofilizat uwodniono 2 ml sterylnej soli fizjologicznej wytrząsając energicznie probówką (10 min) przy pomocy miniwytrząsarki. Mleczną zawiesinę wielowarstwowych liposomów poddano 10 cyklom ekstruzji (fig. 4) i oznaczono wydajność zamykania paklitakselu jak w przykładzie 1. Wydajność zamykania > 95%.

P r z y k ł a d 3

Analogicznie jak w przykładzie 1 przygotowano preparat liposomowy paklitakselu o składzie:

KW-18 (kwas 2-hydroksy-4-pentadecylobenzoesowy) - 6 mg,

Lecytyna jajeczna - 114 mg,

Paklitaksel - 4 mg.

Analizę uzyskanych po kalibracji liposomów przedstawia fig. 5. Wydajność zamykania > 94%.

Badania stabilności

A. Baadnie stabilnośśi I ippsomoweeo preppratuppklitakkelu przzprowaadzno doddjąc do I milliltra zawiesiny kalibrowanych liposomów otrzymanych w przykładzie 1, 300 mg glukozy. Po rozpuszczeniu glukozy próbkę zamrożono i liofilizowano przez 12 godzin. Do pozostałego suchego liofilizatu dodano następnie 1 ml wody destylowanej i preparat odtworzono. Oznaczona średnia wielkość liposomów była identyczna jak w preparacie wyjściowym i wynosiła 111 nm (+/-4 nm) (fig. 4A i fig. 4B). Okres przechowywania preparatu po odtworzeniu w temperaturze 25°C wynosił 5 dni - w tym czasie nie zaobserwowano tworzenia się kryształów paklitakselu.

B. Ocenę stabiiności z^^i<^^ir^n< Ilp^c^^t^r^c^\^^j przeprowaddono na podotawie obserwacjj nia się kryształów paklitakselu w zawiesinie liposomowej w wyniku uwalniania wolnego związku do roztworu.

Zawiesinę liposomów przygotowanych jak w przykładach 1-3 przechowywano w temp. 4°C. Próbki preparatu oglądano codziennie pod mikroskopem świetlnym, poszukując zaczątków krystalizacji paklitakselu. Okres dwu dni przed pojawieniem się pierwszych niewielkich igłowatych kryształów substancji uznawano za maksymalny okres przechowywania zawiesiny liposomowej.

Okres ten wynosi co najmniej 3 tygodnie dla preparatu z przykładu 1 i 10 dni dla preparatów z przykładów 2 i 3.

Analiza wielkości liposomów nie wykazuje procesów degradacji zawiesiny liposomów w przeciągu 1 miesiąca (fig. 5).

C. Oceny stabiiności Ilofiilzowanej kompozyt Ilposomowej według przykładu 2 dokonano na podstawie analizy HPLC zawartości paklitakselu i kwasu 2-(3-pentadecylofenoksy)octowego po odtworzeniu wodą liofilizatu (dawka 5 mg/2,5 ml). Wyniki oznaczenia stabilności liofilizatów przechowywanych w temperaturach 4°C, 25°C i 30°C przedstawiono w tabeli. Rezultaty potwierdzają stabilność preparatu po 12 miesiącach przechowywania w temp. 25°C i po 24 miesiącach w temp. 4°C.

PL 197 939 B1

Tabela. Wyniki badań stabilności Iiofilizatu paklitakselu w dawce 5 mg/2,5 ml

24 m-ce		bialo- kremo- wy	zgodna z wzor- cem	zgodna z wzor- cem	0,7424 |	O Γή..	1 1	O0 O\	104
12 m-cy	o Γ<1	ciemno- kremo- wy	zgodna z wzor- cem	zgodna z wzor- cem	0,7489	4,24	1	00 o\	104
r-i	kremo- | wy	Ί s s o y υ & £ υ N N	zgodna i z wzór- i cem	0,7433	4,14	1 -	00 σ>	103
	bialo- kremo- wy	3 ś c o £ 1 N N	zgodna . z wzor- cem	m r* cT	4,20	i	0© σ\	102
9 m-cy	o> ΓΊ	ciemno- kremo- wy	-g s o o S o co ? O N N	zgodna z wzorcem	o· l> o'	4,22	1 1	σ\ ο\	66
ΐτΊ ΓΝ	kremo- wy	zgodna z wzorcem	zgodna z wzorcem	0,7421	4,15	i I	σ\ ο.	Ob o
	biało- kremo- wy	zgodna z wzorcem	zgodna z wzorcem	0,7415	00	1 1 1 1	100	105
6 m-cy |	Φ m	ciemno- kremo- wy	ca Λ 00 > U N N	o s C > U on > < N N	T* [-* o'		1 1	ο ο	rj o
CM	kremo- wy	zgodna z wzorcem	zgodna z wzorcem	0,7421 I i	4,24	!	100	o
	bialo- kremo- wy	zgodna z wzorcem	zgodna : z wzor- Ś cem	0,7415 |	Γ* T·	j	100	102
3 m-ce	O m	biało- kremo- wy	1 s s nN 3 N N	N | K o K o o > υ on SI	0,7626	4,08	1	O σ\	107
Mn Ol	biało- kremo- wy	zgodna j z wzor- i cem	zgodna z wzorcem	0,7591	4,04	J	100 !	104
Tt	biało- kremo- wy	zgodna z wzorcem	zgodna z wzorcem	0,7396	4,04	-	100	V) O
Po sporzą- dzeniu		bialo- kremo- wy	zgodna z wzorcem	zgodna z wzorcem	1 1 1 1 1	4,09	1 1 1 1 1	ο ο	O o r—
Oznaczenie	I Temperatura CC) 1	Wygląd krążka	Tożsamość paklitakselu (HPLC)	Tożsamość lipidów (lecytyna, KW.28)	Śr. masa Iiofilizatu (g)	pH zawiesiny wodnej	Zawartość wody w liofilizacie (mg)	Zawartość j paklitakselu w liofilizacie * (% w stos, do ilości początkowej)	Zawartość KW.28 w liofilizacie * (% w stos, do ilości początkowej)

Zawartość oznaczana wg. HPLC po odtworzeniu suchego Iiofilizatu wodą do 2,5 ml i rozcieńczeniu metanolem do 25 ml. Zawartość oznaczano względem wzorca.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Liposomowy preparat zawierający przeciwnowotoworową substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, znamienny tym, że kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH_2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową.
2. 2. Liposomowy preparat według zastrz. 1, tym, że kompozycja składników Ilpidowych obejmuje pochodną fosfolipidu i pochodną fitolipidu o wzorze I w stosunku molowym około 9:1.
3. 3. Liposomowy preparat według zastoz. 1, zi^^r^i^i^i^yy t^r^, że pochodna fitollpidu ma wzór k w którym R3 w podstawniku R1 stanowi grupę karboksylową, n = 15, m = 1, a R₄ stanowi atom wodoru.
4. 4. Liposomowy preparaa według 1, znamienny tym, że j ako substancję aktywnązawiera pochodną taksoidu.
5. 5. Liposomowypreparatwedług zastaz. 4, znamiennytym, że pochodnąlaksoidu ssanowi paklitaksel.
6. 6. Liposomowypreparat według zas^z. 4, znamiennytym, że pochodną laksoidu ssanowi docetaksel.
7. 7. Sposób wytwarzania liposomowego preparatu przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienny tym, że a) roztwór substancji aktywnej w rozpuszczalniku, korzystnie alkanolu, łączy się z roztworem składników lipidowych w rozpuszczalniku organicznym, przy czym składniki lipidowe stanowią mieszaninę co najmniej jednej pochodnej fosfolipidu i co najmniej jednej modyfikowanej pochodnej fitolipidu przedstawionej wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH₂-(R₂)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1 przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową,

   b) odpędza się rozpuszczalniki,

   c) Him Ilpidowy otrzymany w etapie b) się w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie alkanolu, i poddaje liofilizacji,

   d) IlofHlzat z etapu cc hydratyzuje się wodą, o-rzymując pierwoOny pr^^e^^r^^t ινίε^νθ^Λ^Λ^οΙη liposomów,

   e) preparaa pieιΓwo-nypodda-esię dodatkowymprocesom fizycznym, o^zyi-mując zawiesinę kalibrowanych liposomów dwuwarstwowych o wielkości 50-200 nm, korzystnie 100 nm, a następnie

   f) zawiesinę Ilposomową z ewentualnym dodatkiem substancji pomocniczych, takich lak substancje krioochronne, poddaje się liofilizacji.
8. 8. Sposób według zas^z. 7, znamienny tym, że w etapie θ- preparaa I lposomowy poddaj się ekstruzji przez membrany o średnicy porów 50-200 nm, korzystnie o średnicy 100 nm.
9. 9. Kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego obejmująca farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub substancje pomocnicze i terapeutycznie skuteczną ilość przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienna tym, że zawiera liposomowy preparat substancji aktywnej zamkniętej w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, przy czym kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH₂-(R₂)-(R3), gdzie R₂ stanowi grupę alkilową C_mH_2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową.
10. 10. Kompozycca farmaceujyczna według zas^z. 9, znamienna tym, że substancję pomocniczą stanowi glukoza.
11. 11. Kompozycca 1armaceujycznawedług zas^z. 9 albo 10, znamienna tym, że glukoza I składniki lipidowe występują w stosunku wagowym 5:1.
12. 12. Kompozycca farmaceujycznawedług zas^z. 9, znamienna tym, że występuje w wej postaci dawkowania.