JPS59500952A

JPS59500952A - 安定なプルリラメラベシクル類

Info

Publication number: JPS59500952A
Application number: JP58501679A
Authority: JP
Inventors: レンク・ロバ−ト・パ−カ−; フアンウンテイン・ミツシエル・ウエイネ; ジヤノフ・アンドリユ−・スチユア−ト; オストロ・マルク・ジエフリ−; ポペシユ−・ミクレア・コンスタンチン
Original assignee: ザ　リポソ−ム　カンパニ−、インコ−ポレ−テッド
Priority date: 1982-03-29
Filing date: 1983-03-24
Publication date: 1984-05-31
Also published as: JPH0524133B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】安定なプルリラメラベシクル類１、発明の分野本発明は、リポゾーム類および投与系における担体上してその用途に関するものである。特に、増大した安定性および高い捕捉効率のごとき特別な利点を与える特異な性質を有する新規なタイプの脂質ベシクルに関するものである。

ここに記載の組成物および方法はキャリヤー系および目的とする投与系のような分野に広い範囲で適用性を有している。本発明の実用性は、プルセラ症の治療、眼疾感染の治療およびリンパ球髄膜炎ウィルス感染の治療の例により示される。

２、発明の背景２．１．リポソーム類は、捕捉水相を含有している完全に閉塞された二分子層膜である。リポソーム類は、ユニラメラベシクル（単層膜の二分子層を有する）またはマルチラメラベシクル（水の層により次からそれぞれ分離した同心状膜二分子層により特徴づ（プられる玉ねぎ状構造）のいかなる相違があってもよい。

パンガム（Ｂ　ａｎｇｈａｍ）’らの最初のリポソームの製造は、有機溶媒中に懸濁させたリン脂質を含み、該リン脂質はついで蒸発により乾燥して反応容器内に　リン脂質のラッタフ積昭５９−５００９５２（３）ス状堆積物が残す。ついで、適当量の水性相を加えて混合物を「膨潤」させ、かつマルチラメラベシクル類（ｎｌｕｌｔｉｆｆｌｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）　（以下、ＭＬＶｓという。）よるなる結果物であるリポソーム類を機械的方法で分散させる。得られる膜状二分子層の講造は、脂質の疎水性（非極性）「テール」が二分子層の中心に向って配向するのに対し、親水性（極性）「ヘッド」は水相に向って配向する。この技術は、パパハジョブーロスおよびミラー（Ｐ　ａｐａｈａｄｊｏｐ。

ｕｌｏｓ　ａｎｄ　Ｍｉｌｌａｒ　）　（１９６７、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３ｉｏｐｂｙｓ。

Ａｃｔａ　、１３５　：　６２４−６３８）により記載されている小さな音波処理されたユニラメラベシクル類（Ｓｍａｌｌ　３０ｎｉｃａｔｅｄ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）　（以下、５ＵＶｓという、）の開発用の基礎を提供している。しかしながら、これらの「古典的なリポソーム類」は、脂質の１モル当りの捕捉水性空間の低容積および巨大分子を被包する能力が制限されるという欠点が少からずある。　捕捉された空間を増大させる努力は、第１に逆ミセル類またはリポソーム前駆体を生成すること、すなわち脂質分子の単一層により囲繞されている水性層を含有するベシクル類が、極性ヘッド基が水性相に向（ように配向されることを含むものであった。リポソーム前駆体は、有機溶媒の極性脂質溶液に捕捉されるべき水性溶液を加えかつ音波処理することにより生成される。ついで、リポソーム前駆体は、過剰の脂質の存在下に蒸発される。脂質の二分子層により捕捉された水性層よりなる結果物としてのリポソーム類は、水性相に分散される（　Ｍ　、　３　ｃｌｎ＋ｅｉｄｅｒに対して１９８０年９月２３日に発行された米国特許第４，２２４，１７９号参照）。

補足効率の最大化の他の試みにおいて、パパハジョプーロス＜１９８０年１１月２５日発行の米国特許第４，２３５．８７１号〉は、オリゴラメラ脂質ベシクル類（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ　１ｉｐｉｄ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）　％進用の「逆相蒸発法」も逆相蒸発ベシクル類（以下、ＲＥＶｓという。）として知られていると記載している。この方法によれば、捕捉されるべき水性物質は、有機溶媒中の極性脂質の混合物に添７１０される。ついで、均質な油中水型のエマルジョンが生成し、かつ有機溶媒はゲルが生成するまで蒸発される。このゲルは、つぎに水性媒体中でゲル状混合物を分散することにより懸濁物に変換される。生成したＲＥＶＳは、主としてモノラメラベシクルおよび大きな内部水性空間を有する少い同心状二分子層のみにより特徴づけられる若干のオリゴラメラベシクルよりなるものである。ＲＥＶＳのある透過特性、ＭＬＶＳおよび５ｕｖｓの透過特性と同様であると報告されティる（　３　ｚｏｋａ　ａｎｄ　Ｐ　ａｐｃｉｈａｊｏｐｏｕｌｏｓ　、　１９７８　、　ｐｒｏｃ　、　Ｎａ口　、ハ、ｃ？ｄ　、　３ｃｉ、　（Ｊ、　Ｓ、　Ａ、　７　５　：４、１９　’Ｉ　−４１９８・）。

しかしながら、種々の化合物を捕捉するリポソーム類は、貯蔵が不変的に限られる間にリポソーム類の安定性がつくられる。安定性におけるこの損失は、リポソーム類から捕捉された化合物が周囲の媒体へ漏洩する結果となり、また物質の透過により周囲の媒体からリポソーム自体へのリポソーム分の汚染をする結果ともなる。結果として、従来のリポソーム類の貯蔵寿命は極めて限られたものである。安定性を改善する試みは、リポソーム膜内に脂質二分子層の物性に影響を与える物質（以下、「安定剤」という。）（例えばステロイド基）を含有させることを含んでいた。

しかしながら、これらの物質の多くは、比較的高価でかつこのようなリポソーム類の製造はコスｌ〜的に有効ではなかった。

従来のリポソーム類の貯蔵問題の他に、多くの化合物はこれらのベシクル類に含有させることが不可能であった。

Ｍ　Ｌ　Ｖ　Ｓは、脂質膜の相転移温度以上の条件下でのみ製造され得る。これは、所望の性質を発揮するが長くかつ高い飽和度の側鎖を有するリン脂質よりなるリポソーム頬内に熱不安定性分子の含有を防止する。

２．２．　リポソーム類の用途リポソーム類の治療用への適用は、［リポソーム類（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）　：　Ｆｒｏｍ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｔｅｓ　Ｔ。

Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　、　Ｋｎｉｇｈｔ　、　ｅｄ、　Ｅ　１ｓｅｖｉｅｒ　、　Ｎｏｒｔｈ　−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８１　Ｊに記載されている。このような系には数多くの問題が残っているとはいえ、医療投与系用にこれらの膜ベシクルを使用する可能性について多くのことが書かれている（例えば、’ｙ’ｎｅｈ　−４ｒｈ　ａｎｄ　ＥＩｉｚａｂｅｔｈ　Ａ、　Ｃｅｒｎｙに対して１９７６年１１月２３日に発行された米国特許第３，９９３゜７５４号およびＢ　ａｒｒｙ　Ｄ　、　Ｓ　ｅａｒｓに対して発行された米国特許第４，１４５，４１０号参照）。

リポソーム医薬投与系においては、薬剤はリポソーム生成中に捕捉され、ついで、治療されるべき患者に投与される。該薬剤は、水または非極性溶媒に可溶である。このような開示の代表例は、パパハジョプーロスおよびスゾカに対して１９８０年１１月２５日に発行された米国特許第４，２３５．．８７１号およびエム、シュナイダーに対して１９８０年９月２３日に発行された米国特許第４，２２４，１７９号である。

医薬投与系の若干の望ましい特徴は、医薬の作用を長くする医薬の徐放に伴なわれる医薬の急速な除去に対する抵抗である。これは、医薬の効果を増大させかつより少量の投、与での使用を可能にする。生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのリポソーム剤の使用時に生じる若干の問題は、つぎの点を含んでいる。（１）物質を捕捉しているリポソームは、該リポソーム類が体液内で生長する際に漏洩する。これは、他の理由の他に、血漿高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によるリポソームリン脂質の除青またはホスホリパーゼによるリポソーム膜の分解の原因となっていた。生体内でのリポソーム類の分解の結果は、はとんど全てのリポソーム分が短時間で放出され、このため、徐放性および医薬除去に対す奇抵抗は達成できない。（２）一方、生体内で極めて安定なリポソーム類を使用するとくすなわち、リポソーム類が体液内で生成する際に漏洩しないと）、リポソーム分は必要に応じて放出されない。結果として、これらの安定なリポソーム類は、徐放およびリポソーム分放出の能力が必要なとぎに達成されないので、生体内で治療物質の担体として無効である。しかしながら、細胞内感染を治療する場合、生体液内の安定性の維持は、リポソームが感染した細胞により内部移行する点までは臨界的である。（３）投与系で使用されるリポソーム担体のコストの影響。例えば、リポソーム含有の抗リーシュマニア剤を使用するリーシュマニア感染の化学療法の改良法は、１９８０年１月２９日に発行された米国特許第４，１８６，１８３号においてステックおよびアルピングにより報告されている。化学療法に使用されているリポソーム類は、生体内でリポソーム類の安定性を増大する多数の安定剤が含有されている。しかしながら、前記のように、これらの安定剤は高価であり、かつこれらの安定剤を含有するりポソーム類の生産は、コスト低下とならない。

（４）最後に、医薬投与系における担体としてのリポソーム類の使用で生じる問題は、治療されるべき病気の治療を助ける効果がないということである。急速排出に対する抵抗性に対する無効性および徐放性を助けるのに無効である他に、病気治療に対する無効性に対して数多くの他の説明が可能である。例えば、リポソーム類が目的の細胞または食作用細胞（例えば網内皮細胞）に内部移行する場合、これらはＲＥＳよりも含まれる細胞の病気に対して非常に無効な捕捉された医薬を与えて系内が急速に排出される。食作用後は、リポソーム分は、食作用細胞のリポソーム内にパックされる。非常にしばしばリポソーム内に含有されている分解性酵素は捕捉されている化合物を分解するかあるいはその活性点でその化合物を開裂するかあるいはその構造を変えることにより該化合物と不活性にする。

さらに、リポソーム類は、製造時に活性化合物のベシクルへの低い捕捉効率のために有効である投与量が投与できない。

リポソーム類は、研究者らによりモデル膜系として使用され、かつ捕捉輸送イムノアッセイにおける「標的細胞」として使用されてきた。しかしながら、このようなイムノアッセイに使用する場合、これらのアッセイがあるイムノグロブ′リンクラス（例えばＩ（ＩＭおよびＩ（ＩＧ分子）を含む免疫複合体生成により内情補体活性化の因子としてリポソーム分の放出を測るので、血清中に培養される際にリポソーム膜が漏洩しないことが重要である。

３、発明の開示本発明は、以後安定なプルリラメラベシクル類（ｓｔａｂｌｅｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　（Ｓ　Ｐ　Ｌ　Ｖｓ　）　）と称される新規かつ実質的に改良されたタイプの脂質ベシクル類を提供する。ことにある。マルチラメラベシクル類（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｆａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　（Ｍ　Ｌ　Ｖ　Ｓ　）　）とは構造的に異なる他に、５ＰＬＶｓはまたＭＬＶｓとは異なる方法で製造され、ＭＬＶｓと比較して特異な性質を有し、かつこのようなＭＬＶｓと比較して種々の異なる移点を有している。これらの差異の結果として、５ＰＬＶｓは従来から使用されてきた通常の脂質ベシクル類により代表される多くの問題を解決するものである。

脂質ベシクル類の不均質混合物は、ＳＰＬ’Ｖｓが合成されるときに生成する。

証拠は、該５ＰＬＶｓ中の脂質類が新規なスプラモレキュラール構造に形成されることを示している。脂質ベシクル類の多くは、非常に多くの二分子層、場合によっては１００程度の多くの層を有している。この高度の層形成は、その説明が理論的ではあるが、５ＰＬＶＳにより保有される数多くの驚くべき性質に寄与することが可能である。

５ＰＬＶｓの性質は、つぎのちのを含んでいる。（１）他の方法で治療不可能なある種の病気を治療する能力、〈２）緩衝液中で保存している間の５ＰＬＶｓの非常に大きな安定性、（３）苛酷な環境に耐え得る５ＰＬＶｓの大きな能力、（４）物質の高い捕捉効果、〈５）長時間にわたる組織および細胞に対する付着力、〈６）体液内での捕捉物質の徐放能力、（７〉標的細胞の細胞質ゾルを通じてのリポソーム分の投与および決定的な分散性、（８）製造における改良されたコスト低下、および（９）生体内におけるその生物活性形での化合物の放出。

Ｓ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　Ｓの特異、な性質のために、これらは排出に対して抵抗がありかつ徐放性であるので、生体内で投与系のキＡ・リヤーとして特に有用である。

生体内での生物活性化合物の投与および病気、例えば感染症の治療の方法が記載されている。

４、図面の簡単な説明第１図は種々の濃度で処理したＭＬＶｓとＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖｓどの間の膜安定性〈漏洩％で表わされている）の差異を示すグラフである。

第２図は、マウスの眼瞼組織における５ＰＬＶｓの脂質層および水性相の両者の保持力および生体内でＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖｓからのゲンタマイシンの徐放性を示すグラフである。

第３図は、Ｍ　Ｌ　Ｖ　Ｓの電子スピン共鳴吸収スペクトルと比較したＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　ｓの電子スピン共鳴吸収スペクトルを示す図である。

第４図は、５ＰＬＶＳおよびＭＬＶｓにおけるドキシルスピンブローブを減少させるアスコルビン酸塩の能力の差異を示すグラフである。

第５図は、感染したマウスの牌臓から回収され得るプルセラカニス（イヌ流産菌）に基づくストレプトマイシンを捕捉したＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖを使用したマウスにおけるプルセラヵニス感染症の二段階治療の効果を示すグラフである。

第６図は、感染したマウスの器官から回収され得るプルセラ力ニスに基づくストレプトマイシンを捕捉したＳＰＬ■を使用したマウスにおけるプルセラ力ニス感染症の二段階治療の効果を示すグラフである。

第７図は、ストレプトマイシンを捕捉した５ＰＬＶを使用したモルモットにおけるプルセラアボータス（ウシ流産菌）の二段階治療の効果を示すグラフである。

５、発明の詳細な説明Ｓ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　Ｓは、前記の他のいかなるリポソームとも異なる生成物を生じる方法により製造される。

５ＰＬＶｓは、数個ないし１００個以上の脂質二重層を有する脂質ベシクル類である。膜二分子層は、両極性脂質の二分子層よりなり、非極性の疎水性炭化水素「テール」点は二重層の中心に向い、また極性の親水性「ヘッド」点は水性相に向いている。水性相は二重層で閉塞されており、その一部はベシクルの内腔を形成し、かつ一部は隣接する層の間に位置する。該脂質二重層は種々のタンパク質類、糖タンパク質類、糖脂質類、ムコ多糖類およびその他の疎水性および／または両極性物質とコンプレックスを形成し得る。

５ＰＬＶｓは、っぎのようにして製造される。すなわち、両極性脂質または脂質の混合物を有機溶媒に混合する。多くの有機溶媒が適当であるが、ジエチルエーテル、フッ素化炭化水素類およびフッ素化炭化水素類とエーテルとの混合物が好ましい。この溶液に捕捉されるべき活性成分および水性相が添加される。この二層混合物は、溶媒を蒸発さぜながら該溶媒内の水性物質を乳化することにより５ＰＬＶＳに転化ざじる。蒸発は、音波処理中または処理後にいかなる蒸発技術、例えば混合物に不活性ガス流を通過させることによる蒸発、加熱による蒸発または真空蒸発により達成される。使用される溶媒の容量は、水性物質が混合物中で完全に乳化されるに充分な水性容量を越えるべきである。実際には、１容量の水性相に対して約３容量以上の溶媒が使用される。事実、溶媒の水性相に対する比率は、１容最の水性相に対して１００容量以下またはそれ以上で変えることができる。脂質の量は、■マルジョン液滴【水性相ｍｌ当り約４０ｍｇの脂質）をコートするに充分な量を越えるに充分でなければならない。上限は、コスト効果の実用性のみに限定されるが、Ｓ　Ｐ　Ｌ　Ｖｓは水性相のｍｇ当り１５ｍｇの脂質でつくることができる。

この方法は、従来のリポソーム類と異なり巨大分子構造を右Ｊる脂質ベシクル類を生成する。本発明によれば、全方法は、使用される脂質の相転移温度に関係なく４〜６０°Ｃの温度範囲で行なわれる。この後者の利点は、所望の性質を有する熱不安定性生成物、例えば変性タンパク質がジステアロイルホスファチジルコリンのようなリン脂質からつくられる５ＰＬＶＳと結合されるが、その相転移温度以上の温度でのみ従来のリポソーム類に生成するという点にあん。該ノーイムは、含４’４されるべぎ使用される水溶性物質の２０％以」−かつ含有されるべき使用された脂質可溶性物質の４０％以上を通常与える。

大抵の両極性脂質は、５ＰＬＶＳの構成成分である。好適な親水性基としては、ホスファト基、カルボキシル基。

スルファト基およびアミノ基があるが、これらに限定されるものではない。好適な疎水基としては、飽和および不飽和炭化水素基および少なくとも１個の芳香族基および／または脂環族基で置換された炭化水素基であるが、これらに限定されるものではない。好ましい両極性化合物はリン脂質および化学構造がこれに近いものである。これらの例としてはレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ボスファチルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルシオリビン、ホスファチジン酸およびセレブロシド類があるが、これらに限定されるものではない。５ＰＬＶｓの製造に特に有用な安定な脂質の例は、天然レシチン類（例えば、卵レシチンまたは大豆レシチン）および飽和合成レシチン類〈例えば、シミリストイルホスファチジルコリンまたはジパルミトイルホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスファチジルコリン）のような合成レシチン類および不飽和合成レシチン類（例えば、ジオロイルホスファチジルコリンまたはシリノロイルホスファデジルコリン）である。このＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　ｓの二重層は、コレステロール、コレスタノール、コレスタノール、コレスタン等のようなステロイド化合物を含み１ｑる。酸・准親水性基（ホスファト基、スルファト基等）を有する化合物を使用する場合、得られるＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖｓはアニオン性になり、またアミノ基のような塩基性基を有する化合物を使用する場合にはカチオン性リポソーム類が得られ、またポリエチレンキシ基またはグリコール基を有する化合物を使用する場合には天然のリポソーム類が得られる。５ＰＬＶｓのサイズは大幅に変わる。その範囲は約５００〜１０，０００ｎｍ（１０ミクロン）であるが、通常は約１，０００〜４．ＯＱＱｎｍである。

実質的には、いかなる生物活性化合物も５ＰｌｉＶｓ内に捕捉することができる（捕捉は、水性画分内または膜二重層内の捕捉として定義される）。こ・のような化合物としては、核酸類、ポリヌクレオチド類、抗菌性化合物類、抗ウイルス性化合物類、抗真菌性化合物類、駆虫性化合物類、抗腫瘍性化合物、タンパク質類、トキシン類、酵素類、ホリン類、免疫モジュレータ−類、色素、放射性標識、放射線不透過化合物、蛍光化合物、多糖類、細胞受容体結合分子類、抗炎症剤、抗緑内障剤、散瞳性化合物、局部麻酔薬等があるが、これらに限定されるものではない。

以下は、・５ＰＬＶｓの合成に使用される割合の例である。

すなわち、５ＰＬＶＳは５μ９のＢｌ−ＩＴ　（ブチル化ヒドロキシトルエン）を含有する５ｍｌのジエチルエーテルに５０ミクロモルのリン脂質を添加し、ついで、含有されるべき活性物質を含有する０、３ｍ　ｌの水性相を添加することにより生成する。捕捉されるべき物質を含む結果物として溶液および捕捉脂質は混合物に不活性ガスを流通させながら音波処理され、これにより大部分の溶媒が除去される。

この具体例は、部分的にはＢ　ｌ−Ｉ　Ｔのベシクル類への内蔵のために特に安定な５ＰＬＶｓを生成する。

音波処理しかつクロロホルムとエーテルとの混合物中で添加された水性相とともにコレステロールおよびホスファチジルコリンの溶液を蒸発することによるリポソーム内蔵抗体の製造方法を記載するが水性相に対する脂質の相対割合は規定していないレンダ（ｌｅｎｋ）らの１９８３　Ｅｕｒ。

Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　１２１　：　４７５−４８２を参照のこと。

５．２．　５ＰＬＶＳの特徴５ＰＬＶｓは、単一または数個のラメラを有するりボソーム類（例えば５ＵＶｓおよびＲＥＶＳ）とは、明らかにその性質が区別される。冷凍破壊電子顕微鏡は、５ＰＬＶ剤が実質的に５ＵＶｓおよびＲＥＶｓを含まず、すなわちベシクル類の２０％未満でユニラメラであることを示している。しかしながら、これらはその物性の多くが異なるとはいえ、電子顕微鏡的技術によってはＭＬＶ、ｓと区別できない。かくして、つぎの詳細な比較が５ＰＬＶＳをＭＬＶＳから区別する焦点となる。

５．２．１、　貯蔵中の５ＰＬＶｓの安定性脂質ベシクルの安定性は、長時間にわたって外部環境がらその吸臓された空間をキレート化するベシクルの能力に期する。有用な脂質ベシクルには、貯蔵および取扱い中に安定であることが好ましい。しかしながら、ある利用には使用時にベシクルがその内容物を徐々に漏洩することが望ましい。他の利用にはベシクルが作用の所望点に達するまで投与後に完全に残る。５ＰＬＶＳはこれらの望ましい特徴を示すのに対してＭＬＶｓは示さない。

ベシクルに漏洩を生じさせる原因は二つある。一つは、脂質の自動酸化であり、これにより炭化水素鎖は二重層を不安定にする過酸化物を生成する。この酸化はベシクル剤にブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような抗酸化剤を添加することにより急激に低下されることができる。

ベシクル類はまた、外部環境の薬剤は、脂質が完全に残るが膜が細孔を形成するような脂質の二重層構造を***さぜるので一漏洩する。

脂質ベシクル剤は製造当初は白色である。自動酸化により該薬剤は着色（茶色）する。同一脂質および水性成分を使用して製造した５ＰＬＶｓに対するＭＬＶＳの比較は、ＭＬＶｓが１〜２週間で着色するのに対して５ＰＬＶｓは少なくとも２個月間は白色のままである。これはＭＬＶＳにおける脂質の分解を示すが５ＰＬＶｓの脂質の分解は示さない脂質成分の薄層クロマトグラフィによって支持されている。これらのベシクル類がＢＨＴやその他の成分の添加により製造される場合、ＭＬＶｓは１個月以内に僅かな着色を示すが、５ＰＬＶｓは白色のままでありかつ少なくとも６個月以上安定である。

等張性の食塩水を含有する緩衝液中に中性のｐＨで入れた場合、抗生物質を含有する５ＰＬＶｓは、第１表に示すように４個月以上も安定である。これらのデータは、５ＰＬＶｓ内に最初から内蔵された抗生物質のいずれも実験期間中に漏洩しなかったことを示している。

他の証拠は、５ＰＬＶβが６個月以上にわたってカルシウムイオンはど小さい分子から内蔵された薬剤とキレート化し得ることを示している。アルセンアゾ■（ａｒｓｅｎａｚｏｌｌ［＞は、極めて少量の二価カチオンの存在で赤から青に変る色素である。５ＰＬＶＳにこの色素を内蔵させかつ塩化カルシウムを貯蔵する緩衝液に添加することにより色の変化を見ることによりベシクル類の安定性を測ることができる。

色は、色素が漏洩またはイオンの侵入のいずれも示すことなく少なくとも６．５個月間その最初の色から検出できないほど差貢しがなかった。

第　１　表最初の捕捉率　ｂ　捕捉医薬の生物捕　捉　薬　剤　（％）　上澄みへの漏洩　学的利用能（％）ストレプトマイシン　３４．１　０　’Ｙ７硫酸塩スペクチノマイシン　３７．２　０　８４クロラムフエニコール　３５．２　０　８９オキシテトラ　１８．８　０　９１サイクリンエリスロマイシン　０．４　０　９７スルフアメラジン　６．３　０　９３ａ　５ＰＬＶｓは１２７μＭの卵ホスフ１チジルコリジン（ＥＰＣ）および２５ μＭの医薬を使用して製造した。

４°Ｃで４．５個月間保存した終期に５ＰＬＶｓは遠心力により貯蔵緩衝液から分離された。５ＰＬＶＳ分の希釈物および上澄液は、標準希釈率の抗生物質と比較して生物学的活性を検定するために細菌叢に適用した。

り　Ｏは検出し得るレベル以下を示す。

７これらの実験は、５ＰＬＶｓが貯蔵および取扱いの問題に関して充分安定であることを示すものである。このような長さにわたって安定なＭＬＶｓをつくることは可能であるとはいえ、ＤＳＰＣのような合成脂質からつくる必要があり、必然的に高価となる。

５．２．２．　他の環境での５ＰＬＶＳの安定性膜摂動剤を含有する媒体中に脂質ベシクル類を入れることは、異なる分子構成を探査する方法である。該膜の構成の仕方により、異なるベシクル類がこのような薬剤に対して異なって応答する。

以下の実験において、閉塞した水性分画内で放射性トレーサ分子（３Ｈイヌリン）を含むベシクル類が調製される。

イヌリンおよび多糖類が水性相へ分配し、放射線標識されたときに脂質ベシクル類の水性分をトレースするのに使用される。所定の薬剤に適当な間隔で曝らしたのち、該ベシクル類を遠心力により媒体から分離し、該ベシクル類から媒体へ逃散した放射線の相当量が測定される。これらの結果は、第２表に報告されており、数値はベシクル類中に最初に内蔵されていた量に対する周囲媒体中の放射性物質の割合を意味する漏洩パーセントで現わされる。

５ＰＬＶＳは、塩酸中ではＭＬＶｓよりも安定である。

第２表は、卵レシチンからつくった場合に、ＭＬＶｓおよび５ＰＬＶｓの両者が０．１２５Ｎの塩酸に１時間曝されたときの不安定化度を示す。しかしながら、５ＰＩＬＶｓはＭＬＶｓよりも酸に対して著しく感じ難いことは特筆すべきである。多分、この異なる応答はその環境で脂質が相互作用する場合の固有の差異を反映するものである。

塩　酸　９０．５　５５．２尿　素　２１．７　４４．８グアニジン０．５Ｍ　５．７　７．４１．０Ｍ　８．３　１０．１酢酸アンモニウム０１５Ｍ　、２７，０　６７．０１．０Ｍ　２５．９　５４．７−６３．１血　清　７６．２　５７．８ａ）培養時間はＨ（ｌ中での培養時間を１時間とした以外は２〜４時間である。

５ＰＬＶＳは、尿素に曝らした場合ＭＬＶｓとは異なって応答する（第１図および第２表）。尿素はカ第１ヘローブ効果（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）　（水の構造を***させる）および強い双極子モーメントの雨音を有する分子である。ＳＰ　ｌ−Ｖ　Ｓは、同一１ｌｉｉ１度で塩化ナトリウムのような浸透剤対するよりも尿素に対する方がはるかに敏感であることが観察されたく第１図）。ＭＬＶｓは塩化ナリトゥム中でよりも尿素中での方がはるかに漏洩しない。

この異なる挙動に対する説明は理論的であるとはいえ、尿素と分子が近似しているグアニジンが５ＰＬＶｓを脱井安定にするので、この応答は双極子効果よりもカオトロープ性に基づくものであると思われる（第２表）。グアニジンも強いカオトロープ性であるとはいえ、強い双極子モーメントを有していない。

５ＰＬＶｓはまた、酢酸アンモニウムに対しても敏感であるのに対し、ＭＬＶｓは敏感ではない（第２表）。しかしながら、アンモニウムイオン（塩化アンモニウム中の）または酢酸塩〈酢酸ナトリウム中の）いずれも特に５ＰＬＶｓを脱安定にする効果はない。したがって、該イオン自体ではなく、誘引漏洩の要因となる酢酸アンモニウムの極性であることが判る。

最初、血清または血液のような体液中で培養した場合にＭＬＶｓよりも５ＰＬＶｓがはるかに安定であるので、このような結果は驚くべきことである。しかしながら、このような結果に対する理論的説明が提案されたくもちろん、他の説明も可能である）。５ＰＬＶｓの安定性が、膜脂質の極性基が配向した水分子の雲または水和シェルにより水和されるようにその膜二重層の特異な構造に基づくものである場合、には、このような水和シェルを***しあるいはこれと両立しないいかなる薬剤も、構造的な膜状態に変化するのを促進し、このため漏洩する。

尿素における５ＰＬＶｓの脱洪各安定化の理論的説明が正しいのとは関係なく、ＭＬＶＳと５ＰＬＶｓの橘造との間の特徴的な差異を前記結果は示すものである。この差異は、応用上極めて有用な目的に役立つ。下記のとおり、５ＰＬＶｓは、眼に適用された場合、徐々に漏洩性となる。

多分、この望ましい徐放性は、涙液に曝されたとき５ＰＬＶＳの同様な脱安電化によるものである。

血清内では５ＰＬＶＳはＭＬＶｓよりも安定である。脂質ベシクル類の数多くの応用には、プルセラ症治療用のような腹腔内的にこれらを投与することが含まれている。効果的にするには、ベシクル類はその所定の標識に達するに充分な時間生存しなりればならない。卵レシチンからつくられた５ＰＬＶｓおよびＭＬＶｓの両者は、活性補体を含有するウシの胎児の血清に曝らされた〈第２表〉。３７ °Ｃで４８時間曝らさしたのち、Ｓ　Ｐ　Ｌ　ＶｓはＭＩＶｓよりもはるかに安定であった。

５．２．３．　生体内に投与された５ＰＬＶｓの特徴５ＰＬＶＳは、生体内での投与系用のキャリヤーとして５ＰＬＶＳを特に好適にする数多くの特性を示す。

（△）ＳＰＬＶｓは、排出に対する抵抗がある。５ＰＬＶＳが生物に投与される場合、脂質成分および捕捉活性成分は組織内にかつ投与される細胞により保持される。

（Ｂ）ＳＰＬＶｓは徐放性を与えるよう輻設計できる。５ＰＬＶｓの安定性は、Ｓ　Ｐ　ｌ−Ｖ　Ｓが貯蔵中に極めて安定であり、かつ体液の存在下では安定であるが、生体内に投与されたときには活性成分のゆるヤがな漏洩が活性成分の徐放性を与える。

（Ｃ）投与されたときの高度の捕捉性および安定性のために、活性成分の有効な投与量が放出される。

（Ｄ）ＳＰＬＶＳの製造は、ベシクル類の安定性が二重層に高価な安定剤を含有させることなく行なわれるので、安価である。

つぎの実験は、供試動物の眼に投与したときの５ＰＬＶＳのこれらの性質のい（っがを示している。これらの実験において使用されるＳ　Ｐ　Ｌ　ＶＳは、脂質二重層および活性成分が期間中眼組織中にこれらの成分をトレースするためにそれぞれ放射線で指標された以外が前記のとおりであった。

５ＰＬＶｓは、１１００ｒｎのホスファチジルコリン〈ＥＰＣ）および１００ｍｑのゲンタマイシン硫酸塩を用いて製造された。脂質成分は痕跡量の１Ｊｆ、− ホスファチジルエタノールアミン〈メｒ−ＰＥ）を二重層に結合することにより放射線で指標され、水性層中の活性成分はメＩ−ゲンタマイシン硫酸塩（Ｉ−ＧＳ）の添加により放射線指標づけされた。この５ＰＬＶｓは、未結合または未内蔵物質を効果的に除去するために緩衝液で繰返し洗浄した。

５ＰＬＶｓ剤の一部分は、水性相から有機相を除去するために除去されかつ抽出された。各相の放射性は、５ＰＬＶｓに結合された（脂質相中のｃｐｍ　（カウント７分）：水ｒｒ性相中のｃｐｍ　）である　ｌ−ＰＥ：メｌ−Ｇ５の最初の比率を決定するために測定された。

抽出はつきのようになされた。０．８ｍ　ｌの０．４ＭのＮａＣ１（水性）、１ｍｌのクロロホルムおよび２ｍｌのメタノールは混合されて脂質相を形成された。ついで４μｍの放射線標識付けされた５ＰＬＶＳが添加されて混合された。この５ＰＬＶＳ分は有機相および水性相に溶解しているので、最初は濁っていた混合物が透明になった。これらの相は１ｍｌの０．４ＭのＮａｃ！（水性）おＪ：ヒ１ｍ１のクロロホルムを添加しかつ混合し、ついで２．８００ｘｇで５分間遠心分離することにより分離した。各相の一部分（１ｍｌ）を除去し、放射性を（Ｃｐｍ　）で測定した（ｌ肖−ＰＥ：１−ＧＳの最初の比率は１．５５：１であった）。

１５匹の雌の成スイスウェーブスターマウスを、これらがその眼をめぐうのを防止するために）麻酔をして監禁した。懸濁液中の放射線標識された５ＰＬＶＳの同量の部分（２μｍ）を冬眠に局部的に使用した。ついで、三つの動物群をつぎの点、すなｐち１，２，３．１８および２４時間でそれぞれ犠牲にした。９匹の雌スイスウェブスターマウス（対照）を、放射線標識されたゲンタマイシン硫酸塩の水溶液の同量の部分（２μｍ）を−各ｕＲに局部的に使用した以外は同様に処理した。

犠牲直後に、該動物の眼瞼を除去し、刻み、かつ脂質成分から水性相を分離するために〈前記方法を用いて）抽出した。該相の放射性は測定され、同様に放射性カウントの総量が回収された。脂質相で測定された放射線は、眼組織による５ＰＬＶｓの保有量の表示であり、水性相で測定された放射線は、眼組織によるＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖｓの保有量の表示であり、水性相で測定された放射線は、眼組織中のゲンタマイシンの保有量の標示である。第２図は、眼に対して使用されたｃｐｍの最初の数値のパーセントとしＣ表現した）眼瞼組織中の各成分の保有量を示すグラフである。

第２図は、２４時間にわたる眼瞼組織中の５ＰＬＶＳ脂質成分の保有量および（期間中に眼瞼組織中に保有されるゲンタマイシンのパーセントとして表わされる）２４時間にわたる５ＰＬＶｓからのゲンタマイシンの徐放性を明確に示している。第２図はまた、未含有ゲンタマイシン（局部的に投与された水性ゲンタマイシン）が眼瞼組織から急速に消失することを示している。例えば、溶液中のゲンタマイシン（対照）は、４時間以内に眼瞼組織から消失した（眼瞼組織中に５％未満のゲンタマイシンが残存）。他方、５０％を越えるゲンタマイシンを内蔵した５ＰＬＶｓは、この４時間に眼瞼組織により保有されており、事実２４ＦＲ間後には２５％を越えるゲンタマイシンを内蔵した５ＰＬＶＳが眼瞼組織中に保有されていた。これは、約８５％のゲンタマイシンを内蔵した５ＰＬＶｓが２４時間にわたって放出され、９５％の未内蔵のゲンタマイシン硫酸塩が消失した。

第３表は、各点で眼瞼組織中に保有されている５ＰＬＶＳ脂質相と水性相の比率を比較するものである。この比率の増大は、５ＰＬＶｓのからのゲンタマイシンの放出を示すものである。

眼瞼組織により保有されているゲンタマイシン硫酸塩を内蔵しているＳＰ、ＬＶＳの生物学的活性も評価された。ゲンタマイシン硫酸塩は、ゲンタマイシン硫酸塩を内蔵する５ＰＬＶｓが眼に使用されてから３時間後に調製された眼瞼抽出物の水性相からの一部分を除去するこにより眼瞼組織から回収された。この水性相互は連続的に希釈され、２μｍの部分を寒天層上の黄色ブドウ球菌叢上に置き、２４時間培養したのち抑制域を測定した。ゲンタマイシン硫酸塩内蔵５ＰＬＶとで処理された動物の眼瞼組織抽出物から回収されたゲンタマイシン硫酸塩は、完全にその生物学的活性を保有していた。

角’Ｎ３−１− マウスの眼に局部的に使用した後のゲンタマイシン内蔵の５ＰＬＶＳの徐放性眼瞼に保有されている眼瞼から回収された　５ＰＬＶＳＳＰＬＶＳ成分　脂質：水相の比率０　’ｔｏｏ％　１．５５１ｂｒ　１００％　２．１３ｈｒ　１００％　２．８２１８ｈｒ　９４％　６，８９２４ｈｒ　８５．１％　７，１７５．２．４．　電子スピン共鳴５ＰＬＶＳとＭＬＶＳとは電子顕微鏡では同一に表われるとはいえ、ＥＳＲ（電子スピン共鳴）スペクトルは、そのスプラモレキュール構造上の差異を明らかにする。５ＰＬＶｓは、その増大する分子オーダー、増大する分子挙動およびアルコルビン酸塩への大きな浸透性による消去から明らかなように、その分子構造の点でＭＬＶｓとは区別できる。分子構造上のこれらの差異は、その異なる生物学的活性に寄与している。

電子スピン共鳴スペクトル法において、５−ドキシルステアレート（５ＤＳ）のようなスピンプローブは、脂質二重層中に配合される。ドキシル基の不対電子は、試料が磁場に挿入されたときにマイクロ波エネルギーを吸収する。

吸収のスペクトルは、三つの実験パラメータＳ、オーダーパラメータＡＯ，超微細カップリング定数および回転相関時間Ｔａｕの決定をさせる。代表的な読みは第３図に示され、ここにＡは５ＰＬＶＳの信号、ＢはＭＬＶｓの信号であり、両者は５−ドキシルステアレートで標識付けされる。スペクトルは、室温で行なわれ、スキャン域は１００ガウスであった。２Ｔ＋および２Ｔ１１の両者に依存するオーダーパラメータは、プローブの完全に均一な配向の場合からのＥＳＲ信号の誤りを測定する。均一に配向した試料Ｓ−１゜Ｏ○には、ラントム試料はＳ− ０である。２Ｔ＋および２Ｔ　ｔ＋　ｈｓ　ｒら計算され得る超微細カップリング定数ＡＯは局部的極性を表わずものと考慮され、かつ膜内のスピンプローブの位置を表わす。回転相関時間（ｗｏ、　ｈｏ、　ｈ　−１に従属する）は、その前の空間配向がめざす「忘れ＜ｆｏｒｇｅｔ）　Ｊに対して分子に要求される時間として考えられる。スピンプローブとして５−ＤＳを有フル８　Ｐ　Ｌ　Ｖｓ　トＭ　Ｌ　Ｖｓ　トの差異の代表的なＥＳＲ決定は、第４図に表示されている。

両者の場合、スピンプローブが二重層における同−深さから報告されるとはいえ、５ＰＬＶｓはＭＬＶＳよりも極めて大きな分子オーダーおよび分子挙動を有している。

５ＰＬＶＳとＭＬＶｓの差異の他の説明は、ドキシルスピンプローブを減少させるアスコルビン酸塩の能力にある。

アスコルビン酸塩が恐らく磁場でマイクロ波エネルギーを吸収しないヒドロキシルアミン類へキトキシル部分を還元することはしばしばしられている。水溶液中では、還元はＥＳＲ信号の随伴損失を伴なって急速に起こる。スピンプローブが脂質二重層のような保護環境にある場合には、親水性アルコルビン酸塩によりさらに徐々に減少するかあるいは全く還元されない。したがって、ニトロキサイド還元の速度は、アスコルビン酸塩の脂質二重層への浸透の速度研究に使用され得る。第３図は、アスコルビン酸塩溶液中に懸濁している５ＰＬＶＳおよびＭ　Ｌ　Ｖ　Ｓ残留スピンパーセント対時間の関係を示す。９０分でアスコルビン酸塩はＭＬＶｓ中に入れられたプローブの２５％を減少させるが、５ＰＬＶｓ中では入れられたプローブの６０％を減少させる。５ＰＬＶｓは、ＭＬＶＳの場合より劇的に大きなアスコルビン酸塩の浸透を可能にする。

Ｓ　Ｐ　Ｉ　Ｖ　Ｓ　２，６５ｘｉＯ’　Ｓ　ｅｃ　Ｏ，６１４１４，９Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ　３，６５ｘ１０’　Ｓ　ｅｃ　Ｏ，５６５１４，９５，２，５，５ＰＬＶｓによる活性物質の捕捉従来のＭＬＶｓに対する５ＰＩＶＳの利点を示ず他の基本的例として、５ＰＬＶｓは使用する活性物質を大きなバ−センテージで捕捉し、これにより該物質を保持する（第５表参照）。

５．２．６’、５ＰＬＶｓと細胞との相互反応５ＰＬＶｓのさらに他の利点は、５ＰＬＶＳがベシクルの内側に内蔵された物質の比較的大きな部分が食作用ベシクル類に対して限られているよりも細胞の細胞質全体に分散しているような細胞と相互反応すφことである。５ＰＬＶｓが細胞と混合する場合には、三者は連合する。連合によりＳ　Ｐ　Ｌ　ＶｓはＭＬＶｓとは異なり、試験管内で細胞と相互反応するので、全ての細胞が５ＰＬＶｓに最初から補足されていた少なくとも若干（４）を含む。この物質は各細胞に分布されるようであるが、食作用ベシクルのみに限定されるものではない。これは、５ＰＬＶｓ剤の水性相内のフェリティン（ｆｅｒｒｉｔｉｎ）を配合することにより示すことができる。カルチャー内の細胞との連合後、超微細構造分析は、細胞質ゾル全体にフェリティンが分布しかつ細胞内膜により境界されるものではないことを示している。この現象はＭＬＶｓととも起こすこともできるが、多量の物質は５ＰＬＶｓにより転移される。

週Ｋ　５　Ｒ驚− ＭＬＶｓと５ＰＬＶＳ　、！：（７）比較捕捉された有効な物質（％）内蔵物　Ｍ　Ｌ　Ｖｓ　Ｓ　Ｐ　Ｌ　Ｖｓイヌリン水性空間形成剤　２−６％　２０−３０％牛血清アルブミン　１５％　２０−５０％ストレプトマイシン　１２−１５％　２０−４０％ポリビニルピロリドン（水性空間）　５％　２３−３５％５．２．７．　５ＰＬＶＳ（７）浮遊密度さらに、５ＰＬＶｓはＭＬＶｓよりも低い浮遊密度を有している。これは、フィコル勾配内でバンディングにより測定される（第６表参照）。

５．２．８．　５ＰＬＶｓの容積さらに、１．０００〜１００．ＯＯＯｘｇ＋７）遠心力でペレット中に集めた場合、５ＰＬＶｓはＭＬＶｓよりも実質的に大きなペレットが同一リン脂質濃度を与える。１６，０ｏｏｘａの遠心力では、５ＰＬＶｓはＭＬＶｓより約１／３大きいペレットを形成する。

５．２．９．　５ＰＬＶｓ　ｃ７）浸透特性リン脂質二重層は水透過性であるので、高張性環境内に入れられたＭＬＶｓは浸透力により水を締め出す。５ＰＬＶＳはＭＬＶＳよりも収縮する。さらに、内部塩８度よりも２０倍高い緩衝液中で１６時間収縮させたのち、５ＰＬＶｓはＭＬＶＳと同一の最終容積には収縮しなかった（ＳＰＬＶｓの沈澱はＭＬＶｓのペレットよりも１／３大きく残った）。

Ｂ＋Ｆ、ペレットサイズの差異が水性内蔵容積の違いによるものでないことを示している。

５．３．　３ＰＬＶｓ　の用途５ＰＬＶＳは、つぎのようなファクターが重要である系において特に有用である。すなわち、貯蔵中および体液との接触時の安定性、比較的高い内蔵性、コスト低下、およびその生物学的に活性な形での捕捉化合物の放出。

フィコル中　１％以上の層　１％以上の層Ｑ　７ｍ　１で　１．０７１　１．０２７４さらに、生体内の投与形体に応じて５ＰＬＶｓは急速排出に抵抗を有しく例えば徐放性が重要な場合）あるいはＲＥＳの細胞に対して与えることができる。

結果として、本発明のＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖｓは、広い範囲の系に使・用できる。これらは治療の医療効果を高めるため、感染症与を高めうため、試験管内または正体内の細胞に遺伝子情報を導入するため、ワクチン類の製造のため、遺伝子交換のデオキシリボ核酸セグメントを細胞内に導入するため、または捕捉された「リポータ」分子の放出する臨床試験用診断剤として使用することができる。この５ＰＬＶｓはまた、化粧料、殺菌剤、植物成長剤を徐放させる化合物等を内蔵させるのに使用できる。

５ＰＬＶｓの用途に関して述べたが、該方法は５ＰＬＶＳまたはその他のリポソームまたは５ＰＬＶＳのそれと同様な官能性を有する脂質ベシクルの使用をも可能にする。

５．３．１．　生物学的活性化合物の投与試験管内での細胞（例えば動物細胞、植物細胞、原生動物類等）に対する化合物の投与は、カルチャー内の細胞に該化合物を含有する５ＰＬＶｓの添加を通常必要とする。

しかしながら、５ＰＬＶＳはまた動物（ヒトを含む）、植物および原生動物類の生成内に対して該化合物を投与するため使用できる。投与目的に応じて、該５ＰＬＶＳは、数多くのルートにより投与できる。すなわち、ヒトおよび動物においてはこれは注射（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内。

皮下、耳介内、***内、尿道内等）、局部的使用〈例えば、苦痛部位）、および上皮または粘膜（例えば服上皮１ロ粘膜、直腸または膣粘膜、気道膜、鼻咽頭粘膜、腸粘膜等）で使用できるが、これに限定されるものではなく、また植物および原生動物類においては、これは生物に直接、生物の棲息環境に分散して、周囲の水または環境に添加する等して行なうこともできるが、これらに限定されるものではない。

使用のモードはまた、該化合物が投与される生物の部位または細胞を決定する。

例えば、感染の特定個所に対する投与は局部的使用（感染が外的である場合）、により容易になされる。循環系（したがって、網内細胞）への投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下注射により極めて容易に行なうことができる。

５ＰＬＶｓは該化合物の徐放を可能にするので、生物に対して毒性がなければ、投与量は該生物に対して１回またはそれ以上の投与で使用できる。

この項は５ＰＬＶｓが使用できる総体的な記載を行なうものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。

５．３．２．　病気の治療ヒト、動物および植物において生じる数多くの病理学的状態は、適当な化合物を５ＰＬＶｓに内蔵させることにより有効に治療できる。これらの病理学的状態としては感染症（細胞内または細胞外）、嚢、腫瘍および腫瘍細胞、アレルギー等があるが、これらに限られるものではない。

このような病気の治療に５ＰＬＶＳを使用するには種々の方法が可能である。生体内に投与された場合にマクロファージによりＳ　Ｐ　Ｌ　ＶＳが内部移行する事実を特徴とする特に有用ないくつかの計画の概略を示す。

一つの計画では、５ＰＬＶｓは細胞内感染の部位に治療薬剤を投与するために使用される。ある病気は、網内系。

例えばプルセラ症の細胞の感染を含んでいる。これらの細胞内感染症は、数多くの理由から治療が困難である。（１）感染微生物が網内系の細胞内に存在するので、治療上充分な′ｍ度で細胞膜を通過できない治療薬剤を循環から止め、このため治療に対して高い抵抗がある。（２）治療薬剤の毒性レベル投与はこのような感染症を防ぐのにしばしば必要である。（３）治療は、治療後に残留するいかなる感染も宿主生物を再感染するかあるいは他の宿主に伝染できるので完全に有効でなければならない。

本発明の一つのモードによれば、適当な生物学的活性化合物を含有する５ＰＬＶＳは、（好ましくは腹腔内または静脈内で）宿主生物または可能性のある宿主生物に投与される。（例えば獣群において、　未感染動物が感染動物と同様に治療できる。）食作用細胞はＳＰ’ＬＶｓを内部移行するので、微生物感染に対して生物学的に活性な物質を内蔵させた５ＰＬＶの投与は、感染部位へ該生物学的活性化合物の直接到達をめざず。かくして、本発明方法は、種々の微生物、バクテリア、寄生虫、開門、ミコプラズマ類、ウィルス類等により生じる感染症を除くために使用され、これらの微生物としてはブラセラｓ、ｐｐ　、ミコバクテリウムｓｐｐ　、サルモネラＳｔ）＋１　、リステリア５ｔ）Ｉ）　、フランチセラｓｐｐ、ヒストプラズマｓｐｐ　、コリネバクリテリウムｓｐｐ　、コクシジオデスＳｐｐおよびリンパ性脈絡髄膜炎菌があるが、これらに限定されるものではない。

選定される治療剤は、感染症を生じる微生物による。例えば、バクテリア感染症は、抗生物質の内蔵により除去できる。該抗生物質は、５ＰＬＶＳの水性液体内に含有されかつ／またはベシクル二重層内に挿入される。適当な抗生物質としては、ペニシリン、アンピシリン、ヘタシリン。

カルベンシリン、テトラサイクリン、テトラサイクリン塩酸塩、オキシテトラサイクリン塩酸塩、クロルテトラサイクリン塩酸塩、７−クロロ−６−シメチルテトラサイクリン、ドキシサイクリン−水塩、メタサイクリン塩酸塩、モノサイタリン塩酸塩、ロリテトラリ”イクリン、ジヒドロストレプトマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン。

カナマイシン、ネオマイシン、エリス［１マイシン、カルｄζマイシン、オーレオマイシン、ドローレオマイシン、月文ＩＪミキシンＢコリスチン、セファロチンナトリウム、セファロリジン、セファログリシンニ水塩およびセファレキシン −水塩がある。

我々は、プルセラ症治療におけるこのような処置の効果を示す（以下の実施例参照）。本発明方法により作用の効果および期間は増大覆る。この系は、ＭＬＶｓに捕捉された抗生物質のような公知の処置に応答しな（１感染症の＞Ｆ３療に有効である。いかなる少量の残留する感染症も広力くり、かつ感染サイクルは再び開始するので、成功するような＞ｆｉ療法は期待できなかった。我々は、リンパ性脈絡髄炎ウィルス感染症における成功例を示す。

もちろん、本発明は細胞内感染症の治療のみに限定されるものではない。この５ＰＬＶｓは、細胞内であれ細胞外であれ、種々の感染部をめざしている。例えＧｆ１本発明の他の実施態様において、系統的な細胞外感染の部位に番よ活性薬剤をもたらすためにマクロファージが使用される。この計画によれば、５ＰＬＶｓは生体内で５ＰＬＶＳを好ましくは腹腔内または静脈内）投与することにより未感染マクロファージ類に治療物質を投与するために５ＰＬＶｓＬま使用される。

このマクロファージは、５ＰＬＶＳと連合し、ついで治療物質で１負荷」される。一般に、このマクロファージは該物質を３〜５日間保持する。「負荷された」マクロファージがいったん感染部位に到達すると、病原体はマクロファージにより内部移行する。この結果、病原体（まマクロファージ内に含有されている治療物質と接触し、破壊される。本発明のこの実施態様は、ヒＩ〜および家畜の黄色ブドウ球菌炎の治療に有用である。

感染または会合の部位が外部または動きやす（、Ｘ場合に（よ、医療薬剤を捕捉した５ＰＬＶｓは局部的に使用できる。特に有用な応用は、眼痛の治療を含むものである。眼痛の場合、１種またはそれ以上の適当な活性成分を含有する５ＰＬＶｓが痛みのある眼に局部的に施される。数多くの微生物が動物およびヒトの眼感染症を引き起す。このような微生物としては、つぎのちのがあるが、これに限定されるものではない。モラクセラｓｐｐ　、クロストジウムｓｐｐ　、コリネバクテリウムｓｐｐ　、ジブロコツカスｓｐｐ　、エラボバクテリウムｓｐｐ　、ヘモフィリスｓｐｐ　、クレブシェラｓｐｐ　、レストスビラｓｐｐ　、ミコバクテリウムｓｐｐ　、ナイスセリアｓｐｐ　。

プロピオニバクテリウムｓｐｐ　、プロテウスｓｐｐ　、シュードモナスｓｐｐ　、セスチア５ｌｉｔ）　、■スケリキアｓｐｐ　、スタフアロカッカスｓｐｐ　、ストレプトコッカスｓｐｐ　、およびミコプラズマＳｐｐおよびリケツィアＳｐｐを含むバクテリア様微生物。これらの感染使用は、治療後に残留する感染症が涙分泌により再感染するので、従来法によって除去することは困難である。

我々は、モラクセラボビスによって生じた服感染症の治癒における５ＰＬＶＳの使用を示す。（下記実施例参照）ＳＰＬＶｓは排出に対する抵抗であり、それらの中味の持続された放徐の有能であるゆえ、５ＰＬＶｓはまた活性処理物質との延長された接触より要望されるいくつかの問題の処理にも有用である。例えば、緑内障は辺縁的視野の進行的消失を引きおこす眼内圧の段階的上昇により特徴ずけられる病気で、失調すると中心部視野の消失および最終的な盲目となる。緑内障の処置に用いられる薬剤は原則的に点眼として使用される。しかしながら時には、眼窩からの薬剤の迅速な除去による１５分毎の投薬滴下が処置に必要となる。緑内障のような問題が本発明で処理されるとすると、ピロカルピンフロロピリルルコリン、アセタゾールアミド，エトゾールアミド、ジクロロフエナミド，カルバコール、臭化デメカリウム，シイツブＯビルホスフォフルオリデート、沃化エコチオプレー　、ト，フィソスチグミンまたはネオスチグミンなどのような治療物質が、病気におかされた眼に与えられるＳＰＬＶＳ中に内蔵されることが可能である。

ＳＰＬＶｓ中に内蔵され得、そして局所的に用いられる他の作因はこれに限定されるわけでないが、瞳孔拡大作因（エピネフリン、フェニルエピネフリン、ヒドロキシアンフェタミン、シクロベントレート、トロピックアミド、エンカトロピン等）、局所麻酔，抗ウイルス性作因（イドクスウリジン，アデニンアラビノシド等）、抗真菌性作因（アンフォテラシンＢ，ナタマイシン，ピマリシン、フルシトシン、ナイスクチン，チメローサル，サルファメラジン，チオベンリ゛ゾール、１〜ルナフテート，グリシオフルピン等）、駆虫性作因くスルフォンアミド、ピリメタミン。

タリンダマイシン等）および抗炎症性作因（ＡＣＴＨのようなコルチコステロイド、ハイドロコーチシン、プレドニゾン、メトリシン、ベータメタシン、デキサメサゾン、フルオロメタロン、トリアンシナロン等）が含まれる。

以下の実施例は例証のために与えられるが、本発明の視点をここに限定するものではない。

６、　実施例　ＳＰＬＶｓのａＭ第５．１節の説明したように、ｓ　ｐ　ｌ−　ｖ　ｓの調製の基本的な方法は脂質あるいは脂質の混合物を有機溶媒中へ溶解すること、水性相と被包される物質を加えることおよび該混合物を音波処理することを包含するが、有機溶媒は音波処理の間またはその後に任意の蒸発法によって除去される。

本発明のすべての実施例に用いられるＳＰＩ　Ｖｓは次の分節に述べられるようにして調製される。（しかしながら、ＳＰＬＶＳを生産する任意の方法が使用可能である。〉６、１．　抗生物質を含むＳＰＬＶｓｉｏｏｍｑレシチンの５ｍｌジエチルエーテル溶液が調製された。該混合物は丸底フラスコ中に入れられた。次に５ｍＭヘツプス（ＨＥＰＥＳ）（４−　［２− ヒドロキシエチルコピペラジノ２−■タン　スルホン１１０．０７２５Ｍ　Ｎａ　Ｃｌ　１０．０７２５Ｍ　ＫＣｌ中に硫酸ストレプトマイシン１００ｍｇをｐＨ７．４で含む溶液（０．３ｍｌ）が、脂質のジエチルエーテル溶液を含むガラス容器へ滴状滴下される。該混合物は１０５３６タイプのパスソニケーター（ラボラトリ−サブライズ　カンパニー、インコーポレーーｒツド［　ｌ−　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓ　ｕｐｐｌ　ｉｅｓ　Ｃ　ｏ　、　。

Ｉｎｃ．］製）中に数分間入れられ、（周波数８０ｋＨｚ：出力８０ワツト）で、同時に窒素のゆるやかな蒸気を通すことにより粘着性のペース１−に乾燥させる。

粘着性のペーストの残っているところへ、５ｍＭヘツブスの１０ｍ１が加えられた。ストレプトマイシンを含む生成ＳＰＬＶの調製は、緩衝溶液中に懸濁され、渦動混合器で数分間攪拌され、１２０００ＸＯで１０分間，２０℃で遠心分離することにより被包されなかったストレプトマイシンを解放させる。生成ケークは５ｍＭヘツブスの０．５ｍ１に懸濁されていた。

上記の手順は、ストレプトマイシンを、ジヒドロストレプトマイシン、硫酸ゲンタマイシン、アンピシリン、塩酸テトラシリンおよびカナマイシンのいずれか一つで取り代えられたこと以外同様に行なわれた。

６、２．　他の膜成分を含有するＳＰＬＶＳ第６．１節で述べられた手法が次の任意の１つが卵レシチンと共に加えられる以外同様に行なわれた。（１　）　８　：２（レシチン；ジセチルホスフエート）のモル比を与えるホスファチジン酸，（２＞８：２（レシチン；ステアリルアミン）のモル比を与えるステアリンアミン、　、７　：　２　：　１（レシチン：コレステロール；ステアリルアミン）のモル比を与えるコロステロールとステアリルアミン、（３）７：２：１〈レシチン：ホスファチジン酸：コレステロール）のモル比を与えるホスファチジン酸とコレステロロール。

６、３．　ピロカルビンを含有するＳＰＬＶｓ第６．１節の手順が、抗生物質ストレプトマイシンをピロカルビンに代える以外同様に行なわれた。

６、４．　ＢＨＴを用いるおよびこれを用いないで調製されたＳＰＬＶｓ蒸留されていないエーテルは、貯蔵の目的のために抗酸Ｔ）を含む。第６．１節の手順が、Ｓ　Ｐ　Ｌ　Ｖ調製中にＢＨＴを結合させるように溶媒として蒸留されていないエーテルを用いて同様に行なわれた。

５ＰＬＶｓをＢＨＴに結合させないで調製するように、第６．１節の手順が、溶媒として蒸留されたエーテルを用いて同様に行なわれた。

７、　実施例　ガラス容器中の５ＰＬＶの仲介した放出数の実施例において、培養器中においてマイクロファージへの抗生物質の５ＰＬＶの仲介した放出が示された。

腹膜のマイクロファージがＣ５ヮＢＬＫ成体の雄のマウスから腹膜洗浄によって得られ、１０％熱不活性化された胎児の子牛の血清を含む最小必須培地（Ｍ、Ｅ、Ｍ）ｐ　Ｈ７゜２中に懸濁される。細胞は１Ｘ１０６個／ｍｌの濃度で９６− ウェル（９６−ｗｅｌｌ）組織培養器中に懸濁される。粘着性の腹膜のマイクロファージを含む培養器に、１Ｘ１０６ＣＦｔＪ　（集落形成単位）７ｍ１の濃度でイヌ流産筒（３，ｃａｎｉｓ　）が加えられた。１２時間後に、腹膜のマイクロファージに吸入されなかったバクテリアはＩｖｌ、Ｅ、Ｉｖｌでの洗浄の繰り返したにより除去された。腹膜のマイクロファージの培養器の洗浄後、これらは１つのグループ当り１２個の複製培養を含む５つのグループに別けられた。グループ１は照査標準を示し、何ら処理も加えられていない。グループ２は水性Ｉｉｉ！を酸ストレプトマイシンを１　ｍ　ｉｌｌ　／ｍｌの濃度で受ける。グループ３は緩衝液に入れられた５ＰＬＶｓを受ける。グループ４は水性硫酸ストレプトマイシン（１１１１ｇ／ｍ１）と前もって作られた緩衝液に入れられた５ＰＬＶｓを受ける。グループ５は硫酸ストレプトマイシン（１ｍ（１／ｍ１）を含む５ＰＬＶｓを受ける。２４時間後に、上澄みは洗浄をくり返すことにより除去され、腹膜のマイクロファージは凍結と解凍をくり返することにより粉砕される。

粉砕されたマイクロファージの一連の希釈物は、プルセラの寒天培地上に置かれ、４日後に、与えられるイヌ流産筒は希釈方法の限定により決定される。第７表に示される結果は５ＰＬＶに内蔵のストレプトマイシンは試験管中における殺菌および細胞内イヌ流産菌感染の除去に総合的な影響をもつことを示す。

実験がウシ流産菌（Ｂ、　ａｂｏｒｔｕｓ　）で、白子モルモットの雌の成体から腹膜洗浄によって腹膜のマイクロファージを得る以外は上述と同様に行なわれた。結果は、また第７表に示される。

（以下余白）第　７　表感染マイクロファージのストレプトマイシン含有５ＰＬＶＳでの処理後の細胞内の照査標準　２．６±　１．１３ｘ１０３　３．１±０．８１ｘ１０４懸濁液に入れられた５ＰＬＶｓ　２．８２±０．１０ｘ１０３　２．９±０．１７ｘ１０’１遊離ストレプトマイシン　３．１１±０，４０ｘ１０３　３．３±０，２５ｘ１０４ストレプトマイシンと懸濁液に入れられた５ＰＬＶＳ　２，７６±０，２０ｘ１０３　２．８±　０．４２ｘ１０４ＳＰＬＶｓ内蔵のストレプトマイシン　００ａ　あらかじめ感染されたマウス（Ｃｓ；７Ｂｌｋ）腹膜マイクロファージの等数から分離されたイヌ流産筒の集落形成単位（ＣＦＵ）（１２個の複製の平均± 標準偏差）ｂ　あらかじめ感染されたモルモット腹膜マイクロファージの等数から分離されたウシ流産菌の集落形成単位（ＣＦＵ）（１２個の複製の平均上標準偏差２Ｃストレプトマイシン１ｍｇ／ｍｌの濃度８、　実施例　細胞内感染の処置次の実施例は５ＰＬＶＳが細胞内感染の処理方法を表わすものである。本データは、（１）病気の処理におけるＳＰ　Ｌ　Ｖ　Ｓに被包された抗生物質の使用の影響力および（２）ＳＰＬＶ調製品の多量の投薬により得られるより大きな能力を表わす。調書中に用いられたＭＬＶＳの５ＰＬＶＳとの賦形剤としての比較が述べられる。

プルセラ症は世界的な経済的９国家的健康問題である。

プルセラ病はプルセラＳｐｐによってひきおこされる。これは、人間を含む咄乳種、家畜および種々の野生動物に発病する。６つのプルセラＳｐｐが動物でプルセラ病をひきおこし、これらは、ウシ流産筒、イヌ流産菌、マルタ熱菌（Ｂ。

ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）　、プルセラ・ネオトメ（Ｂ　、　ｎｅｏｔｏｍａｅ）　、プルセラ・オビス（Ｂ　、　ｏｖｉｓ）　、ブタ流産筒（Ｂ、５ｕｉｓ）である。家畜と野生動物のいずれもプルセラ病を他の動物や人間に広げる保有体どして取扱う。

該感染生体が網内皮糸の細胞中に存在し、抗生物質の殺菌性作用に対し高い抵抗力をもつため、このような感染は抗生物質によって解消することができない。必要とされる抗生物質の量と処置の長さは、動物に対し有毒であるか動物細胞中に受け入れられない高い濃度の抗生物質であるかのいずれかである。この病気の処置のさらに困難なことは、いくらか残っている感染は容易に広がり、循環を再度くり返し始めるため、処置は完全な効果でなければならないことである。こような病気の経済的影響は自然流産による各年に失なわれる何百万ドルもの価値の牛によって示されている。このような感染の突発に対処する唯一可能な方法は、隔離とその時点での感染動物の畜殺である。

抗生物質を５ＰＬＶＳ中に結合することを次に感染動物の腹腔内に摂取することにより動物に被包性活性物質を投薬することによりこの実施例は構成される。

８．１．　５ＰＬＶに内蔵された抗生物質を用いるイヌ流産菌感染の単一処置の効果８０匹の雄のスイスマウスの成体は腹膜腔内に（１，Ｐ、）イヌ流産菌△ＴＣＣ２３３６５（１Ｘ　１０７ＣＦＵ）で感染され、各々１０匹のマウスをもつ８つのグループに分けた。イヌ流産菌接種後７日目に、各グループは次の処置を受けた。グループ１は照査標準を示し、何の処置も受けなかっｇ０グループ２は緩衝液に入れられた５ＰＬＶｓ　（０゜２１１１１　１、Ｐ、）を受けた。グループ３は水性硫酸ストレプトマイシン（０，２ｍ　ｌ　ｒ、Ｐ、の全投薬量中の１ｍ　（１／Ｋ（＋体重）を受けた。グループ４は０．２ｍｌ　［。

Ｐ、の全投薬量中に水性硫酸ストレプトマイシン（５ｍ９／に９体重）、を受けた。グループ５は０．２ｍｌ　１．Ｐ。

の全投薬量中に水性硫酸ストレプトマイシン（１０ｍｇ／Ｋ（］体重）を受けた。グループ６は０．２ｍｌ　１．Ｐ。

の全投薬量中の硫酸ストレプトマイシン（１ｎ＋　ａ　／Ｋ（１体重）を含む５ＰＬＶＳを受けた。グループ７は０．２ｍ１１、Ｐ、の全投薬量中の硫酸ストレプトマイシン（５ｍａ　／ＫＧ体重）を含む５ＰＬＶｓを受けた。グループ８は０．２ｍｌ　１．Ｐ、の全投薬量中の硫酸ストレプトマイシン＜１０ｍｏ／Ｋ（＋体重）を含むＳ　Ｐ　ｌ−Ｖ　ｓを受けた。

イヌ流産菌接種後１４日目に、すべての動物が犠牲とされ牌臓が無菌処理的に除去された。牌臓は均質化されプルセラ寒天培地で連続的希釈され、処置後に牌臓に生き残っている数を決定する。４日の潜伏期間後の結果を第８表に示す。

（以下余白）第８表遊離あるいは５ＰＬＶに内蔵されたストレプトマイシンの種々の濃度での牌臓１個あたりのイヌ流産菌の集落形成単位５緩衝液に入れられた非処理　５ＰＬＶｓ照査標準　３．’４６ｘ１０±２，７ｘ１０　４．１ｘ１０６±０．６６ｘｌＯストレブ１へマイシン濃度　遊離ストレプト　５ＰＬＶに内蔵された（　Ｗ（１／　ｋｉｌ１体重）　マイシン　ストレプトマイシン１１．５±０，４５　ｘｌｏ　６　１．０１±０．２５Ｘ１０３５２．１２±　１．７１ｘ１０５１，５２±０．１３１ｘｌＯ４１０９，６６±３．６８ｘ１０４　１，３２±　１．００ｘ１０４ａ　総員Ｑ、２ｍｌの腹膜腔内注入（殺菌塩水〉ｌ）　生残するイヌ流産菌は牌［１ｍ１個あたりのＣＦＵ分離の数として決定され、１つの実験当りの１０匹の平均上標準偏差として表わされる。（三重の実験）８．２．　イヌ流産菌感染の５ＰＬＶに内蔵された抗生物質を用いての多重処理の効果８０匹のスイスマウスの雄の成体はイヌ流産菌ＡＴＣＣ２３３６５（ＩＸ１０７　ＣＦＵ、１．Ｐ、）で感染され、各々１０匹のマウスをもつ８つのグループに分けた。イヌ流産菌の接種後７日および１０日に、各グループは次の処置を受りた。グループ１は照査＠準を示し、何の処理もされない。グループ２は緩衝液に入れられた５ＰＬＶｓ　（０゜２ｍｌ、１．Ｐ、）を受けた。グループ３は０．２ｍ、１１、Ｐ、の全投薬量中水性硫酸ストレプトマイシン（１ｍ（１／ｋｇ体重）を受けた。グループ４はｏ、２＋ｚ　ｒ、Ｐ。

の全投薬量中に水性硫酸ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｋ（１体重）を受けた。

グループ５は０．２ｍ（］　１．Ｐ、の全投薬量中に水性硫酸ストレプトマイシン（１０ｍｏ／ｋｇ体重）を受けた。グループ６は０．２ｍ（］　１．Ｐ、の全投薬量中の硫酸ストレプトマイシン（１ｍ９／ｋｇ体重）を含む５ＬＰＶＳを受けた。グループ７は０．２ｍｌ　１．Ｐ。

全投薬量中の硫酸ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｋ（］体重）を含む５ＬＰＶｓを受けた。グループ８は０．２ｍ１ｌ。

Ｐ、全投薬量中の硫酸ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｋ（１体重）を含む５ＰＬＶＳを受けた。イヌ流産菌の接種後１４日目に、すべての動物が犠牲とされ、牌臓が無菌処理的に除去された。牌臓は均質化されプルセラ寒天培地上で連続的に希釈され、処理後の牌臓中に生残しているイヌ流産菌の数が決定された。４日の潜伏期間後の結果を第５図に示す。

第５図に表わされるように生体中のイヌ流産菌感染における種々の二段階処置摂生は、接種後７日および１００日目水性ストレプトマイシンを受けているグループは、牌臓中において生残するイヌ流産菌はほとんど還元されないで観察された。接種後７日および１００日目１Ｑｍ（１／ｋ（１体重投薬された５ＰＬＶに内蔵されたストレプトマイシンを受【プているグループのみが、接種された動物の牌臓からすべての生存できるバクテリアの削除がなされた。

上述の実験の伯に、５ＰＬＶに内蔵されたストレプトマイシンで三爪処理された後のイヌ流産菌感染マウスからの種々の細胞は次のように試料とされた。

３０匹のスイスマウスの雄の成体はイヌ流産菌△ＴＣ０２３３６５（１ｘ　１０７　ＣＦＵ、１．Ｐ、）で接種された。

接種後７日目に動物は、各々１０匹のマウスを持つ３つのグループに分けられた。グループ１は照査標準を示し、何の処置も受けなかった。グループ２は、水性硫酸ストレプトマイシン（１０ｍＱ／ｋｇ体重）を各々の０．２ｍ１Ｉ。

Ｐ、投薬中に（接種後７日および１００日目）受けた。グループ３は各々の０．２ｍ　ｌ　Ｔ、Ｐ、の投薬中の硫酸ストレプトマイシン（１０ｍｑ／ｋ（１体重）を含んで（する５ＰＬＶｓを（接種後７日および１００日目）受けた。イヌ流産菌接種後１４日〜７０日に、すべての動物は犠牲とされ、イヌ流産菌に感染した心臓、肺、牌臓、肝臓、腎臓、皐丸を分離するためにプルセラ寒天培地で連続的に希釈した。

４日の潜伏期間の後の臓器１個あたり生残するイヌ流産菌の結果を第６図に示す。

第６図において表わされるようにストレプトマイシンで三爪の処置摂生後のイヌの流産菌感染マウス中の種々の組織の試料摘出結果は、５ＰＬＶに内蔵されたストレプトマイシンで処理された動物においては、イヌ流産菌接種後１４日〜７５日に試料摘出されたすべての組織が生存できるイヌ流産菌体の全くない状態であったことを示している。

処置をされなかった動物あるいは５ＰＬＶに内蔵されたストレプトマイシンを受けるものとｉｇ度および投薬計画を全く同一に水性ストレプトマイシンで処置さ、れた動物においては、生存できるイヌ流産菌体はイヌ流産菌接種後１４〜７５日に試料摘出されたすべての組織中において分離できた。

８．３．　５ＰＬＶｓと比較のためのＭｌ−ＶＳを用イタ処置の効果１５匹のスイスマウスの雄の成体がイヌ流産菌ＡＴＣＣ２３３６５（１ｘ　１０７　ＣＦＵ、１．Ｐ、）で接種された。

接種後７日目に動物は各々５匹のマウスをもつ３つのグループにわけられた。グループ１は照査標準を示し、何らの処理も受けなかった。グループ２は硫酸ストレプトマイシン（１０ｎ＋ａ／ｋｇ体重、ｒ、ｐ、＞を含むＭＬＶＳを（接種後７日および１００日目）受けた。ＭＬＶｓは１００ｍ（］卵ホスファチジルコリンくＥＰＣ）と硫酸ストレプトマイシン＜　１　ｏｏｍ　（＋　／ｍｌ）を含む殺菌ヘツブスの２ｍ＋を使い一般的な方法で調製された。脂質と硫酸ストレプトマイシンの比は２ｍ＋の最終生成ＭＬＶ懸濁液中で１００ｍａＥＰｃに対し２８ｍ９ストレプトマイシンであった。グループ３は、１００ｎ＋　（ｌ　ＥＰＣを１００ｍ０硫酸ストレプトマイシンを含むヘツブスの３ｍｌととも用いる変更を行って第６．１節で述べた如く調製された硫酸ストレプトマイシン（１０ｍｏ／ｋ（１体重、１．Ｐ、）を含むＳ　Ｐ　Ｌ、　Ｖ　ｓを（接種後７日および１０日後に）受ける。５ＰＩＶｓ中の脂質と硫酸ストレプトマイシンとの比は、２ｍｌの最終生成５ＰＬＶｓｌ濁液中で１００ｍ（ＩＥＰｃに対し２８＋ｎｇ硫酸ストレプトマイシンであった。イヌ流産菌接種後１４日目に、すべての動物は犠乳とされ、膵臓が無菌処置的に除去され、同一化され、そしてプルセラ寒天培地上でイヌ硫酸菌を分離するために連続的に希釈された。４日の潜伏期間の後の臓器１個当りの生残しているイヌ流産菌の結果は第９表に表わされる。

第　９　表２回の処理の後の生体内のイヌ流産閑の殺菌にお【プる硫酸ストレプトマイシンを牌臓１個当りのイヌ流産菌照査標準　２．７±　１，０ＸＩＯ４Ｍ１−Ｖｓｏ　１，８±０．４Ｘ１０４ＳＰＬＶｓｃ　Ｏａ　１Ｑｍｇ／ｋｇ体重の腹膜腔内注入が３目間隔で保たれた。照査標準は何の処置もされなかった。

ｂ　生残するイヌ流産菌は牌臓１個あたりのＣＦＵ分離の数として決定され、１グループ当りの５匹の平均上標準偏差として表わされる。（実験動物１匹当り二重の決定）Ｃ卵ホスファチジルコリンと硫酸ストレプトマイシンの比は１００．ｎ＋ｇ脂質に対し２８ｍｇ硫酸ストレプトマイシンである。

８．１　感染処置における５ＰＬＶに内蔵された種々の抗生物質の効果５０匹のスイスマウスの雄の成体はイヌの流産菌ＡＴＣＣ２３３６５（ＩＸ　１０７ＣＦＵ、［、ｐ、）で接種された。接種後７日目に、実験動物は各々５匹のマウスをもつ１０個のグループに分けられた。グループ１は照査標準を表わ゛し、何の処置も受けなかった。グループ２は緩衝液に入れられた５ＰＬＶｓ　（０，２ｍ　ｌ　、１．Ｐ、）を接種後７日および１０日目に受けた。グループ３，４．５および６は、ジヒドロストレプトマイシン、ゼンタマイシン、カナマイシンあるいはストレプトマイシンの１０ｍ（１／ｋｇ体重、ｉＰ、の水性注入（０，２ｍｌ　［、ｐ、）を接種後７日および１０日目に受（プた。（注：これらの抗生物質はそれぞれ試験管中でイヌ流産菌を殺菌することが示されている。）グループ７．８．９および１０はジヒドロストレプトマイシン、センタマイシン、カナマイシンあるいはストレプトマイシンの１Ｏｎ＋ｏ／ｋｇ体重を含む５ＰＬＶｓを接種後７日および１０日目に受ける。イヌ流産菌接種後１４日目に、すべての動物は犠牲とされ、膵臓が無菌処理的に除去され、均質化され、そしてプルセラ寒天培地上でイヌ流産菌を分離するために連続的に希釈された。４日の潜伏期間の後の臓器１個当りの生残しているイヌ流産菌の結果は第１０表に表わされる。

第１０表に示されるイヌ流産菌マウスにおける種々の抗生物質の試験の結果は、試験管中（すなわち、懸濁溶媒中）でイヌ流産菌殺菌の効果がある抗生物質は、これらが５ＰＬＶｓに被包された場合において生体中でイヌ流産菌殺菌における効果のみを示す。他の水性抗生物質または緩衝液に入れられた５ＰＬＶｓを受けるあるいはなにも処置を受（プなかった動物は、感染牌臓組織に残存するイヌ硫酸菌の削除は起こらなかった。

（以下余白）第　１０　表２回の処理の後の生体内でのイヌ流産菌の牌臓１個あたりのイヌ流産菌集落形成単位５ＰＬＶに被包された水性溶液　抗生物質未処理　３．９３±　１．５１ｘ１０６　４．６６±０．８７ｘ１０６抗生物質０ジヒドロストレプトマイシン１．１３±０．３０×１０５０ゼンタマイシン７．０６±２．５３Ｘ１０５０カナマイシン　２．７２±０，９１ｘ１０５０ストレブ＋マイシン　１．０１±０．１７ｘｌＯ５０８１０ｍ（１／に！１１体重の腹膜腔内注入が３目間隔で保たれた。照査標準は何の処置もされなかった。

ｂ　生体１個当りに生残するイヌ流産菌は牌臓１個あたりのＣＦＵ分離の数として決定され、１グループ当りの５匹の平均上標準偏差として表わされる。

（実験動物１匹当り二重の決定）Ｃ懸濁溶媒中の・イヌ流産菌の殺菌における抗生物質の効果８．５．　イヌ流産菌に感染した犬の処置雌ビーグルの成人は、イヌ流産菌ＡＴＣＣ２３３６５（１ｘ１０７　ＣＦＵ）で口腔内および膣腔的接種された。

接種後７日目に、犬は３つのグループに別けられた。グループ１は、照査標準を示し、何の処置も受けなかった。グループ２は、１０ｍｇ／ｋｇ体重くそれぞれの投与ハ５．０ｍ、ｌ　１．Ｐ、であった。）の水性硫酸ストレプトマイシンを（接種後７日および１０日目）に受（プた。グループ３は、１０＋ｚ／ｋｏ体重くそれぞれの投与は３．Ｏｍｌ、Ｉ。

Ｐ、であった。）の硫酸ストレプトマイシンを含む５ＰＬＶｓを（接種後７日および１０日目）に受けた。犬の膜洗浄とヘパリン化した血液試料が研究の前、間および終了時に通常の間隔で集められた。イヌ流産菌を分離するためにこれらはプルセラ寒天培地上で溶媒された。結果は第１１表に示す。血清試料はイヌ流産菌に対する血清抗体の決定のための研究の前、間および終了時に集められた。これらの結果も第１１表に示す。イヌ流産菌の接種後２１日目に、すべての実験動物は犠牲にされた。以下の組織が無菌処置的に除去され、均質化され、そしてイヌ流産菌を分離するためにプルセラ寒天培地上へ連続的に希釈された。ヘパリン化した血、ｌ！滲出液、肺、牌臓、滑膜液、子宮、卵巣。

膝窩すンパ節、唾液線、扁桃、＠隔リンパ節、腸間膜リンパ節、骨髄、浅頚リンパ節および補助リンパ節。４日の潜伏期間の後の組織１つ当りに残存するイヌ流産菌の結果は第１２表に示される。

（ｙ又王余白）浄書（内容に変更なし）第　１２　表２回の抗生物質摂生処理がなされたイヌ流産菌感染大における組織試料ストレプトマイシンストレプト１１窒綿棒　Ｑ　十十肺　Ｏ＋　＋牌臓　Ｑ　＋　＋滑腹膜　Ｎ、Ｄ、　＋　＋子宮　Ｑ　十十卵巣　Ｑ　＋　＋膝窩リンパ節　Ｎ、Ｄ、　＋　十唾液線　ＯＯＯ扁桃　Ｑ　＋　＋縦隔リンパ節　Ｑ　Ｎ、Ｄ、　＋腸間膜：リンパ節　Ｎ、　Ｄ、Ｏ０第　１２　表（続　き）ストレプトマイシンストレプト組　織　を含む５ＰＬＶｓ　マイシン　照査標準骨髄　０　＋　＋ａ　感染後７日および１０日目に処置した実験動物ｂ　剖検時に取られた試料はプルセラ寒天培地上で希釈された。＋は１　ＣＦＵに等しいかあるいはこれよりも大きい場合、０は集落のない場合を示す。

Ｃ硫酸ストレプトマイシンを１Ｏｎ＋ｏ／に９偉績、■。

Ｐ、で含むＳ、ＰＬＶＳｄ　１０ｍ（］／ｋｇ体重、１．Ｐ、のＭ酸ストレプトマイシンｅ　照査標準は何の処置も受けていない。

培養の結果と二段階の抗生物質投薬の前１間および後のイヌ流産菌感染大の血清学試験の結果が第１１表に示される。全部の実験動物は、負の血清価により測られたものゆえ、イヌ流産菌にさらす以前は血清学的に負であり、面培養面および膣綿棒搾取の培養地から培養負である。すべての実験動物は、処理前の７日および１０日１に血および膣の培養地の両方で培養正であると報告された。水性ストレプトマイシンで処置された犬あるいは何の処置も受けなかった犬は、２１日口の試験終了前の処理後の期間中、血および膣の培養地で培養正をとどめた。ストレプトマイシンを含むリポゾームを受（プたグループ３は最初の処理がなされた１日後に培養正となり、処置後の期間を通して負をとどめた。何の処置もうけなかったまたは水性ストレプトマイシンを受けた犬は、感染後の２１日口のでにイヌ流産菌抗原に対して探知できる血清価に発展するが、抗生物質を含む５ＰＬＶｓで接種後７日および１０日１に処置されたものは、イヌ流産菌抗原に対して何ら探知できる血清価へ発展がなかった。

第１２表に示される二段階の抗生物質投薬処理がなされた感染犬からのイヌ流産菌の分離よりの結果は、犬において、ストレプトマイシンを含む５ＰＬＶｓの処理だけがすべての臓器の試料からすべての組織におけるいかなる生存できるイヌ流産菌をも削除する効果をもたらすということを示している。

８．６．　モルモッｉ〜中のウシ流産菌の処置１５匹のモルモットの雌の成体は、ウシ流産菌ＡＴＣＣ２３４５１（ｌｘ　１０７　ＣＦＵ、Ｅ、Ｐ、）で接種された。

接種後７日日に、実験動物は各々５匹をもつ３つのグループに分けられた。グループ１は照査標準を示し、何の処置も受けなかった。グループ２は、１．Ｐ、注入（０，２ｍ１）に１０ｍ（］／に９体重で水性硫酸ストレプトマイシンを、ウシ流産菌接種後７日および１０日１に受けた。グループ３は、１．Ｐ、注入（０，２ｍ　ｌ　）に１０ｍｏ／ｋｏ体重の水性硫酸ストレプトマイシンを含むＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　ｓをウシ流産菌接種後７日および１０日１に受けた。ウシ流産菌接種後１４日日にすべての実験動物が犠牲にされ、牌臓が除去され、無菌処置的に均一化され、ウシ流産菌を分離するためにプルセラ寒天培地上へ連続的に希釈される。４日の潜伏期間の後の牌臓１個あたりの生残しているウシ流産菌の結果は第７図に示される。ストレプトマイシンを含む５ＰＬＶｓだけがモルモットの牌臓中に属しているウシ流−産菌を削除する効果があった。水性ストレプトマイシンを受けたあるいは何の処理も受けていない実験動物においては、生存できるウシ流産菌バクテリアが識別された。

８．７．　ウシ中のウシ流産菌の処置９頭の重度感染の動物が本実験に利用された。乳および膣綿棒搾取からのウシ流産菌細菌分離はストレプトマイシンを含む５ＰＬＶｓでの処理のあと負となり６週間負にとどめた。これらの実験動物に感染が再発した場合、細菌分離は、処置以前に正である***の象限にのみ見られた。

９頭の交差交配（ヘレンフォード種−ジャージ一種−プランカス［３ｒａｎｇｕｓ］　）の、２２齢の妊娠していないウシ流産菌培養正しいと確認された雌牛が用いられた。研究開始の少なくとも４力月前に、該動物は、中間懐胎の前にウシ流産菌種族２３０８のＩＸ　１０７　ＣＦＵで結膜において実験的に試みられ、これにより流産および／または、乳あるいは子宮分泌物および／または胎児組織のウシ流産菌培養正となる。牛は個々の隔離牛舎で養なわれ、３つのグループに分けられた。３目間隔で行なわれる２回の投薬摂取からなる処置は以下の通りである。（１）３頭の牛は生理食塩水を腹腔内的に注入される。（２）３頭の牛は、水性抗生物質（１０ｎｚ／ｋｇ体重スト・レプトマイシン〉とあらかじめ作られた緩衝液に入れられたＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　ｓを腹腔内的に注入される。（３）３頭の牛は５ＰＬＶＳに内蔵されたストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）腹腔内的に注入される。注入１回当りの総量は１頭当り１００ｍ１であった。

最初の２力月の開孔分泌物および子宮分泌物の複製細菌培養地は週１回の供与分泌を行なわされた。次に、すべての牛はペンタビシバ１−−ルナトリウムの過投薬で薬殺され、次の臓器が細菌培養地から複製に集められる。（１）リンパ節；左および右耳下リンパ節、左および右咽頭上リンパ節、左および右耳下リンパ節、左および右耳下腺リンパ節。

左および右肩甲骨前リンパ節、左および右大腿前リンパ節。

左および右耳下リンパ節、左および右耳下リンパ節、左および右腸骨すンパ説、左および右***すンパ説、左および右の腎臓、気管支、縦隔膜、腸間膜および肝のリンパ節。

（２）腺：４つのすべての***の乳腺、左および右副腎。

胸腺（存在すれば）。（３）臓器および他の組織；牌臓。

肝臓、左および右の子宮の角状部、（子宮）頚、膣、腎臓。

扁桃。

剖検の後、すべての組織は凍結され、輸送時は一７０℃で取扱われる。組織は、軽量の前に凍結され、アルコール炎にあてられ、無菌処置的に形整される。重量が記録される（０．２ないし１．０グラム）とたたちに組織は無菌食塩水１ｍｌ中で均質化され、最初のホモジネート懸濁液の１１０−１に無菌食塩水で連続的に希釈される。一連の懸濁液からの各々の希釈液のアリコツト（２０μｍ〉がプルセラ寒天培地上にのせられ３７°Ｃで培養された。各々の組織に関し、複製の決定が行なわれた。

細菌成長に関し、プレートは毎日読み取られ記録された。

３日以前にすべての出現集落は分離され、***されそして同一性決定のためダラム染色された。培養中の５．６および７日日に形態、成長度、およびウシ流産菌でのダラム染色特性の存在で集落が数えられ、ＣＦＵ／（Ｉ組織が決定された。

典型的集落はウシ流産菌の細菌確認のため再度なされた。

細菌学的分離はすべての組織になされ、組織のダラム当りのバクテリアの数が計算された。４匹の実験動物〈１匹の偽薬（ρＩａｃｅｂｏ　）照査標準と３匹のＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖｓに内蔵されたストレプトマイシンで処置された動物〉から得られた結果が第１３表に示される。

（以Ｔ−息臼）第１３表ウシ流産菌感染のウシの組織試料からの培養地の結果５ＰＬＶに内蔵された左副腎　ｏ　ｏｏ。

右１）　＋　＋　ＯＯ十右環椎リンパ節　十＋　＋　０　十右　ｎ　ＯＯＯ十右腋窩リンパ節　＋＋＋　Ｑ　−１−Ｑ左　ｔｔ　＋＋ＯＯＯ気管支リンパ節　ｏ　ｏｏ。

〈子宮）頚　ｏ　ｏｏ。

扁桃リンパ節　＋＋＋＋　ＯＯＯ左子宮角状部　ｏ　ｏ’　ｏ　＋６　〃　０　０　０　０右賜内骨リンパ節　＋＋　０００左　ｎ　＋＋＋＋　Ｏ＋　０腎臓　ｏ　ｏ’ｏ。

肝臓　ｏ　ｏ−ｏ。

肺　ｏ　ｏｏ。

左前乳腺　０　＋−ｊＱ左後ｎ　Ｑ　Ｑ　Ｏ＋右前ｎ　十＋　ＯＯＯ右後ｎ　＋　＋　ＯＯＯ右下顎リンパ節　＋＋＋０００左下顎リンパ節　十＋＋　Ｑ　’ＯＯ縦隔膜リンパ節　＋＋ｏ−１−０腸間脱リンパ節　＋＋＋　Ｑ　Ｑ　Ｑ左耳下線リンパ節　＋＋＋　０００右　Ｉｌ　十＋＋　ｏ　ｏ　。

左膝窩リンパ節　＋　０００右　／／　＋　ＯＯＯ左大腿前リンパ節　＋　０００右　ＩＩ　Ｏｏ　ｏ　。

第　１３　表（続き）ＳＰＬＶに内蔵された左肩甲骨前リンパ節　０　０．　０　＋右　ｕ　＋＋＋　＋　ＯＯＯ腎臓リンパ節　ｏ　ｏｏ。

牌臓　十十＋ＯＯＯ左***リンパ節　十＋→−＋ＯＯ右　Ｉｌ　ＯＯＯＯ左咽頭上リンパ節　十　ＯＯＯ右　！ｊ　ＯＯＯＯ胸腺　ｏ　ｏｏ。

膣　＋＋＋　ＯＯＯＯ：組織の０．３〜ｉｑｍの培養地では識別細菌なし十：２００集落／９ｍ（組織）より少ない。

＋＋：３００集落／ｑｍ　（組織）より多い。

＋＋＋＋　１０００集落／ｒｉｍ　（組織）より多い。

＋＋＋＋：　１００００集落／ｇｌＩｌ〈組織）より多い。

９、　実施例　眼病の処置細菌および類似の感染は、他の多くの眼病と同様に世界コな経済的１国家的問題で、もし何ら処置されないか処置ズ可能であると失明や敗血症による死の危険性を生じる。

動物や人間の眼の細菌感染は、クロストリジウムｓｐｐ　、コリネバクテリウムｓｐｐ　、レプトスピラｓｐｐ　、モラクセラｓｐｐ、ミ］バクテリウムｓｐｐ　、ネイセリア５ｔ）ｌ）　、プロピオニバクテリウムｓｐｐ　、プロテウス５ｔ）ｌ）　、プはイドモナスｓｐｐ　。

セラチアｓｐｐ　、イー・コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１　）　５ｌｉｐ　、　、スタフイロカツカスｓｐｐ　、を含む（これに限定されるわけではない。）バクテリアおよびミコプ、ラズマｓｐｐ　、およびリケツィアｓｐρを含むバクテリア様微生物により引き起こされることが報告されている。動物と人間の両方とも感染性細菌を互いに広げる能力のある保有体として取扱われる。この５ような細菌感染は、いくらか感染された人間において２０分毎というひんばん処置、あるいは組織において受（プいれらないほど抗生物質の高濃度という結果になる冗長な厄介な処置計画なしでは抗生物質によって処置できない。現存の処置方法は多くの理由から困難である。眼病の表面組織における感染性微生物は、ある場合に抗生物質の細菌殺菌作用に高い抵抗力を持ち、抗生物質の局所的投薬はまちまちの接触時間を生じる眼窩からの該薬剤の急速な除去という結果となる。一般的にいって、眼感染の処置は、少しでも感染が残っていると、涙液分泌を通して寸ぐに再感染し循環をもう一度くり返すことになるため、完全な効果でなければならない。

さらに多くの場合において、感染を取り除くのに必要な′ａ度は視力の減退をひきおこし、ある場合には全盲をひきおこす。家畜におけるこのような病気の経済的影響は、このような伝染性の病気に対処する唯一可能な方法が持続的な療法と隔離であるゆえ各年に失なわれる何面゛万ドルもの金額により示されている。

以下実験は、目のモラクセラボビス（Ｍ、　１）ｏｖｉｓ　）感染に対するグリセリン中に遊離した抗生物質を用いた処置の効果を５ＰＬＶＳ中に内蔵された抗生物質を比較して評価するものである。

モラクセボビスは牛に伝染性の角結膜炎（ピンクアイ）を引き起こすものである。この状態は、眼瞼痙撃、流涙。

結膜炎および隔膜の混濁と潰瘍のまちまちの度合によって特徴ずけられる。館の成牛は若干の食欲減退と乳生産の減退を伴なう微熱を発するかもしれない。いくらかの抗生物質がモラクセラボビスに対して効果はあるが、これらは局所的付着あるいは粘膜上注射によって早期にそしてひんばんに繰り返して投薬されなければならない。ここに述べられた実施例によると、治療物質の作用の効果と持続圧が延長される。このような感染が抗生物質を用いての単なる普通の処置には応答しないゆえに、本体系がたったー、二三爪投薬で効果的であることは驚くべきことである。一般的な処置は、もし感染が数多くの処置の繰り返しによって完全に根絶さないと、目に際感染し感染サイクル再度くり返す若干の残留感染をしばしば残す。

９．１．　マウスにおける伝染性向結膜炎の処置Ｃ５７ブラツクマウス（１６０匹）が８つのグループにわけられた、各々のグループの半分が両眼を紫外線照射にさらされた（角膜障害を起こす目的ため）。次にすべての実験動物が１眼当り１ｘ１０６細菌個数の濃度で右眼に点滴されるモラクセラモビスを接種された。

接種後２４時間目にすべての実験動物は角膜の混濁の度合で点数づけされた。８つのグループは両眼に次のような局所性付着により処置される。グループ１および２は５ＰＬＶに内蔵されたストレプトマイシン（３０ｍ　（］　／１１１１）の１０μｍを受けた。

グループ３および４はストレプトマイシン（３０ｍ９／ｍ１）の１０μｍを受けた。グループ５および６は水性ストレプトマイシン（１００ｍ　ｌ　／ｎ１ｌ）に懸濁された緩衝液入れられたＳＰＩ　Ｖｓの１０μｍを受けた。グループ７および８は無菌食塩水の１０μｍを受けた。（注：未感染の左目は５ＰＬＶｓが目に刺激的かどうかみるために同じ局所的溶液により処理された。刺激性は見られなかった。）毎日−回、隔膜障害の進行あるいは後退に関し記録され、処置後３、および７日目に右目は綿棒でぬぐわれ、典型的実験動物においてモラクセラボビスの分離が行なわれた。モラクセラモビス集落は集落形態学およびモラグラボビス線毛に対する螢光抗原への反応性により決定された。第１４表に示される結果は、５ＰＬＶに内蔵されたストレプトマイシンのみが感染の除去に効果的であることを表わしている。

（以下余白）浄書（内容（こ変更なし）浄シ（内容に夏更なし）弓　Ω　Φ ９．２．　５ＰＬＶに内蔵された抗生物質を用いてのウサギの粘膜の処置モラクセラボビスＡＴＣＣ株１０９００は無菌食塩水（０，０８５％　Ｎａｃｉ）中で１Ｘ１０７細胞数／−ＩｒＬｌの濃度に希釈される。細菌懸濁液のアリコツト（０，１ｍｌ＞が１０匹の雌のウサギの成体の目に局所的に接種された。

培養地に関する試料が結膜を綿棒でぬぐうことにより毎日取られ、血液寒天平板上に置かれた。接種後３日目に、ウサギは３つのグループに分けられ、２匹の実験動物（照査標準）は何の処置も受けず、４匹の実験動物は無菌食塩水中のストレプトマイシン（１０ｍ（］／ｋｇ体重の濃度）を受けおよび４匹の実験動物は無菌食塩水溶液中で５ＰＬＶに内蔵されたストレプトマイシン（１０１＋１！＋ストレプトマイシン／ｋｉｌ１体重の濃度）を受【プた。すべての溶液は局所的に両眼に投薬された。２４時間後に、すべてのウサギの結膜を綿棒でぬぐうことが再び始められ、７日間毎日続（プられた。モラクセラボビスの血液寒天平板上での分離の結果は第１５表に示される。

浄書（内容に変更なし）ｉｉ店（内′ｔ、（こ変更な１−）の　り０フ０９．３．　皮下感染による角結膜炎の処置モラクセラ小ビスＡＴＣＣ株１０９００は無菌食塩中にｌＸ１０７細胞個／蛮ｌに希釈された。細菌懸濁液のアリコツト（０，１ｉ１）が、第９．２節で述べてようにしてずでに感染されたウサギの成体の眼に接種され、そしてＳＰ　Ｌ　Ｖ　ｓで処理されなかった。９匹すべてのウサギの右眼は、皮下的の結膜組織中にモラクセラボビスの０．１ｎｌで接種され、すべてのウサギの左眼は局所的にモラクセラボビスの０．１ｎｌで接種された。培養菌はすべてのウサギの両方の眼の結膜から毎日取られ、モラクセラボビスの分離のため血液寒天培地上におかれた。感染後３日目に。

ウサギは３つのグループに分けられ、２匹の実験動物は何の処置も受けず、３匹の実験動物は標準オフサルミングリセリン懸濁液中のストレプトマイシン（１０ｍｆｌ／ｋｇ体重のストレプトマイシンの濃度）を受け、４匹の実験動物は５ＰＬＶに内蔵されたストレプトマイシンの食塩水懸濁液〈体重１ｋｑ当りストシブ１〜マイシン１０ｎｚ）を受けた。

懸濁液あるいは溶液は局所的に両方の眼に局所的に投薬（０，１ｍｆｆ１）された。２４時間後およびその後５日後ごとに、結膜を綿棒でぬぐうことが、すべてのウサギについておこなわれた。血液寒天培養地上でのモラクセラボビスの分離の血管を第１６表に示す。実験の終了時にすべての実験動物において解剖が行なわれ、すべての動物から粘膜が除去された。これらは、血管新生に関し記録され、そして細かに切刻まれ、均質化されそしてモラクレラボビスの分離のために血液寒天平板上に置かれた。結果は第１７表に示す。

（以下余白）第１６表結膜＠織中へのモラクセラボビスの接種およびオノサルミングリセリン溶液中のストレプトマイシンまたは食塩水中の５ＰＬＶ被包されたス［へレプトマイシンでの照査標準　１　＋＋　＋＋＋５ＰＩ−Ｖ＋＋さｈたｅ　１　＋　＋　ＯＯ（−）ストレプトマイシン　２　＋　４−　〇　〇　〇ａ　ｉ８養菌は３７℃で、２４１１狂、１１？の血液寒天平板上のモラクセラボビス集落の存在で記録された。プラス（→−）は１分離物あたりモラクセラボビスが１ＣＦＵ、Ｊ：り多いか等しいことを示し、Ｏは態別できる集落のないことを示す。

ｂ　全実験動物は、両眼にモラクセラボビス１Ｘ１０６ＣＦＵで局所的に接種されるが右眼においてはモラクセラポビス１×１０６ＣＦＵは結Ｉｌ！５絹織中に注入され、左眼においてはモラクセラボビス１ｘ１０６ＣＦＵは局所的に付着された。

プｉ〜マイシン（１０ｍＱ／ｋｇ体重）で局所的に処理された。

ｅ　実験動物は両眼に無菌食塩水溶液中の５ＰＬＶ被包されたストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｋｃ＋体重）で局所的に処理されｔ二。

第１７表結膜組織中へのモラクセ゛う・１スヒスの接種およびオフサルミングリセリン溶液中のストレプトマイシンまたは照査標準　Ａ＋２＋ａ　使用符号の説明は第１２表に同じであり接種後５日めに行なわれた。

ｂ　血管新生は次の」：うに得点つりされた。Ｏ−標準血管、１−少しの血管が限定的に膨張し微細な血管で侵入されたもの、２・・個々の血管が容易に大別できない赤い充血のもの、３−血管漏洩と粘膜中への血液滲出で濃赤色の充血のもの。

９．４．　眼感染の処置における５ＰＬＶＳの効果のりボゾーム調製物と比較しての評価モラクセラボビス（ＡＴＣＣＴｌ２Ｏ３００）は無菌食塩水中でｌＸ１０７細胞数／７ｒＬ久のｍ度に希釈された。細菌％濁液のアリコツ１〜（０，１ｍｆｆ１）は、ウサギの成体の両眼の結膜組織の皮下的に接種された。ずべてのウサギの両眼の結膜から綿棒でぬくうことが毎日行なわれ、モラクセラポビスの分離のため血液寒天平板上に置かれた。接種後４日目に、ウリーギは６つのグループに分けられ、２匹の実験動物は何の処置し受けず（照査標準）、３匹の実験動物は１：１００に希釈されると○、　［）　、４８０　（４８０ｍｍＴ１７）光学＠度）で０．９２８である５ＰＬＶ被包されたストレプトマイシンの懸濁液（体重１ｋｏ当リストレプトマイシン１０ｔｚ）を受り、３匹の実験動物は１：１００に希釈されるとｏ、Ｄ、’４８０で０．４９９Ｔある５ＰＬＶ被包サレタストレブ１〜マイシンの懸濁液（体重１　ｋａ当りストレプトマイシン１０ｍｇ＞を受け、３匹の実験動物は１：１００に希釈されると○、Ｄ、４８０で０．２４２である５ＰＬＶ被包されたストシブ１〜マイシンの懸濁液（体重１ｋｇ当りストレプトマイシン１０ｍＱ）を受け、３匹の実験動物は１：１００に希釈されると０．Ｄ、４８０で０．１９９であるＳＰ　Ｌ　Ｖ被包されたストレプトマイシンの懸濁液〈体重１にｇ当りストレア１〜マイシン１０ｍｇ）を受け、そして２匹の実験動物ば１：１００希釈でＱ、［）、４８０が０．９４０であるストレプトマイシン含有マルチラメラベシクル類（ＭＬＶｓ　）の懸濁液（体重１１（ｇ当りストレプトマイシン１０＋２）を受けた。ＭＬＶｓは、ファウンテイン（Ｆ　ｏｕｔａｉｎ）らのＣｕｒｒ、Ｍｉｃｒｏ、６：３７３（１９８１）の手順により、１ｉｉｌＩ酸ストレプトマイシンを乾燥脂質薄膜に加えて渦動運動させ、そして２時間膨張させることにより作られ、内蔵されなかったストレプトマイシンは遠心分離を繰り返して除去した。

懸濁液は、両眼に局所的に投薬された。２４時間後、すべてのウサギの結膜をぬぐうことが９日間毎日行なわれ、血液寒天培地上に置かれた。血液寒天平板上でのモラクセラホヒスの分離の結果は第１８表に示される。すべての動物で解剖が行なわれた。これらは涙分泌に関し記録され、そして結膜がすべての動物から無菌処理的に除去された。

これらは血管新生に関し記録され、そして細かに切刻まれ、均質化され、モラクセラボビスの分離のために血液寒天平板上に置かれた。結果は第１９表に示される。

浄書（内容（こ変更なし）第１９表レプ１へマイシンあるいは５ＰＬＶ被包されたストレプトＭＬＶ被包された　１　＋　１＋　１＋ストレプトマイシン　２　０　１−１−　０３ＰＬＶ被包された　１０００ストレブ１〜マイシン　２　．０　１＋０〈未希釈）　３　０　００ＳＰＬＶ被包された　１　＋　２−１−　２＋ストレプトマイシン　２　０　００（１：２希釈）　３　０　１＋０３ＰＬＶ被包された　１　０　００ストレプトマイシン　２　０　１十〇＜１：４−＃！釈）　３　＋　１＋　０８ＰＬＶ被包された　１　＋　１＋　１＋ストレブ１へマイシン　２　０　１＋　０〈１：６希釈＞　３　＋１＋Ｏａ　符号説明は第１４表に同じであり、接種後１４日日目行なわれた。

ｂ　血管新生は次のように１ａ点づ（プされた。〇−標準面管、１−少しの血管が膨張し微細な血管で浸入されたもの、２−個々の血管が容易に識別できない赤い充血のもの、３−血管漏洩と結膜中への血液流出で濃赤色の充血のもの。

Ｃ分泌は次のように得点づ（〕された。〇−分泌なし、１−眼瞼と眼瞼隣接の毛が濡れる程度の分泌、２−眼瞼と目に隣接の毛およびその範囲が濡れる程度の分泌。

１０、実施例：ウィルス感染の処置アレナウィルス族の１種であるリンパ球脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）は人間に病気を起させるものとして知られ、Ｌ　ＣＭ　Ｖ感染は、このウィルスでの脳内的に接種されたマウスにおいては致命的である。このマウスの死亡原因はウィルス感染細胞に対して反応する免疫細胞によるものである。該ウィルスは、増殖している細胞中ひ殺せないので、マウス中で使用される治療剤は、免疫細胞が活性化しないようにウィルスの増殖を抑止し、および／または免疫細胞の活性化を抑止しなければならない。

以下の実施例は５ＰＬＶ被包された抗ウィルス化合物の投薬によるウィルス感染処置め効果を表わすものである。

１０．１　マウスの致命的リンパ球脈絡髄膜炎ウィルス感染の処置２齢のスイスマウスは、１０Ｍウィルスの致死量、ツーすわちマウス１匹当り０．０５ｍｆｆ接種物中の１００プラーク形成中位（ＰＦＵ）を脳内的に接種された。マウスは各々７匹を持つ４つのグループに分けられ、接種後２日、３日および４日日に０．１７／Ｌｌ／薬量／マウスの以下の腹腔内注入により処置を受けた。（１）ｒＳＰＬＶ−Ｒグループ」は３ｍ９リババリン（Ｒ１ｂａｖａｒｉｎ）　／　ｖＬ（ｌを含む卵ホスフ１チジルコリン５ＰＬＶｓＴ−処置された。５ＰＬＶＳは脂質１００＋＋ｚ＋と１０ＣＨＩ１ｇ／ｎｕ薬剤の０．３＊１をＰＢＳ　（燐酸緩衝食塩水）緩衝液中で用いて調製され、薬剤の内蔵は１０％であった。＜２）ｒＲ〜グループ」はＰＢＳ中のりババリン３ｍｇ／ｖｔ＃の溶液で処理された。

（３）ｒｓＰＬＶ−グループ」は緩衝液に入れられた５ＰＬＶｓで処理された。

（ずなわち、５ＰＩＶｓはリババリンを用いない以外は上記と同様にして作られた。）（４）［照査標準−グループ」はＰＢＳで処理された。接種後５白目に各々のグループから２匹のマウスが犠牲とされ、これらの牌臓が均質化された。（１グループ当りの２個の牌臓は緩１！ｉｅ、の容積当り１／２０重量でＰＢＳ中で均質化される。）プラーグ形成用（ＩＮ（ＰＦＵ）／ｍλがそれぞれの懸濁液に関し決められた。各々のグループに残っている５匹のマウスは致死率に関して２日毎に３０日間観察された。

結果は第２０表に表される。

第２０表は感染動物からの致死率の減少およびビールス再性能の減少を明らかに示している。本発明者らは、これらの結果が５ＰＬＶｓより解放されたリバハリンの抗ウィルス活性によるものかどうか、あるいは５ＰＬＶｓからのりババリンの解放を受ける間のマウス宿主の免疫転調によるものかはまだ決定しなかった。

第　２０　表牌臓から回復したウィルス照査標準　５１５　７．０クループ　５１５　６．９Ｒ−グループ　５１５　５．２ａ　第２月齢マウスはそれぞれ致死量、すなわら０．０５ｍ１接種物中ノｌ−ＣＭウィルス１ｏｏＰＦＵを腹腔内的に接種された。

ｂ　致死率は死亡数／グループ中の総数で表わされる。

Ｃ感染後５８目にそれぞれのクループから２匹のマウスが犠牲とされ、これらの牌臓が１　ｍａｎ臓／２Ｏ−ＩｒＬｌ、ホモシネ−１への１ｍで均質化された。

浄づｙ（内容り一変更なし）。。１　０１１第２・図第５厘ＭＧ７ＫＧ第６図Ａ：丈す巧、　Ｂ：ズトレフ・ＦマイシンＣ：　Ｅ；ＰＬＶ（スＦし）・ＬマヅンシＪめ覇す第７図手続ネ市正書（方式ン昭和５９年３月１５日特許庁長官　若　杉　和　夫　殿１、事件の表示ＰＣＴ／１Ｊｓ８３１００４１９２、弁明の名称安定なプルリラメラベシクル類３、補正をする者事件どの関係　特許出願人住　所　アメリカ合衆国　ニューシャーシー州　０８５４０プリンス（ヘン　プリンストシフ４レスタルセンターワン　リサーチ　ウェイ（番地なし〉名　称　ザ　リポソーム　カンパニー、インコーホレーテッド代表者　モツク　ケニス　アイ４、代理人住所〒１０２東京都千代田区二番町１１番地９ダイアパレス二番町５、補正命令の日イ」昭和５９年２月９日　（発送日：昭和５９年２月１４日〉６、補正の対象（１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の［特許出願人の代表者、１および［発明者の住所Ｊの欄（２）委任状、法人国籍証明書およびその訳文（３）図面の翻訳文（４）明１ｆＩＩＩ書の翻訳文７、補正の内容（１〉別紙添付の訂正された特許法第１８４条の５第１項の規定による書面のとおり。

（２）別紙添付委任状、法人国籍証明書およびその訳文のとおり。

〈３〉図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）のとおり。

（４）明細書の翻訳文の第５８頁第１１表、第７２頁第１４表、第７４頁第１５表および第８１頁第１８表をそれぞれ別紙のとおり補正する。

Claims

【特許請求の範囲】

１．　安定なプルリラメラベシクル類。２、ＭＬＶｓ　、５ＵＶｓおよびＲＥＶｓを実質的に含まない安定なプルリラメラベシクル類。３、　低い浮遊密度およびＭＬＶｓより約３分の１大きい容積を有し、同一成分からつくられる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。４、　緩衝液中に保存している間に自動酸化に対してより安定で、同一成分からつくられる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラヘシクル類。５、　同一成分からつくられたＭｔＶｓ　、５ＵＶｓおよびＲＥＶｓよりも体液内でより安定である請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。６、　尿素に曝されたときに捕捉されている化合物を放出するものである特許請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラヘシクル類。７、　生体内に投与されたときにいかなる捕捉されている化合物をも徐々に放出する請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。８、　カルチャー内の細胞に投与したときにベシクル類の内容物が細胞の細胞内ゾ御に分配されてなる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。９、　生体内の細胞に投与されたときに、ベシクル類の脂れてなる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１０、ベシクル類の主要な脂質成分がホスファチジルコリンである請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１１、抗酸化剤がベシクル類の成分である請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１２、抗酸化剤がブチル化ヒドロキシトルエンである請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１３、タンパク質がベシクル内に捕捉してなる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１４、抗菌性化合物、抗真菌性化合物、駆虫性化合物および抗ウイルス性化合物よりなる群から選ばれた化合物がベシクル内に捕捉されてなる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１５、抗腫瘍性化合物、トキシン、細胞受容体結合分子および免疫グロブリンよりなる群から選ばれた化合物がベシクル内に捕捉されてなる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１６、抗炎潤性化合物、抗緑内障性化合物、瞳孔拡張化合物および局部麻酔剤、よりなる群から選ばれた化合物がベシクル内に捕捉されてなる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１７、酵素、ホルモン、神軽伝達物質、免疫変換剤、ヌクレオチドおよび環状アゾン・シンモノホスフェートよりなる群から選ばれた化合物がベシクル内に捕捉されてなる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１８、色素、螢光化合物、放射性化合物および放射線不透過化合物よりなる群から選ばれた化合物がベシクル内に捕捉されてなる請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類。１９、　（ａ）有機溶媒中の少なくとも１種の両極性脂質の分散体を生成し、（ｂ）該分散体を充分な量の水性相と混合して水性相が完全に乳化している二相混合物を形成し、かつ（Ｃ）該水性相を乳化しかつ該二相系混合物の有機溶媒を蒸発することを特徴とするＭＬＶｓ、５ＵＶｓおよびＲＥＶｓを実質的に含マない安定なプルリラメラベシクル類の製造方法ヶ２０、溶媒の容量と水性相の容量との比が約３：１〜約１００：１である請求の範囲第１項に記載の方法。２１、該方法が行なわれる温度が約４〜６０℃である請求の範囲第１９項に記載の方法。２２、該方法が行なわれる温度が少なくとも１種の該脂質の相転移温度より低いものである請求の範囲第１９項に記載の方法。２３、溶媒がフルオロカーボンまたはジエチルエーテルまたはその混合物である請求の範囲第１９項に記載の方法。２４、溶媒が抗酸化剤を含有してなる請求の範囲第２３項に記載の方法。２５、該抗酸化剤がブチル化ヒドロキシトルエンである請求の範囲第２４項の方法。２６、乳化は蒸発の前に行なわれるものである請求の範囲第１９項に記載の方法。２７、乳化は蒸発と同時に行なわれるものである請求の範囲第１９項に記載の方法。２８、ベシクル内に捕捉されるべき物質が水性相とともに添加されるものである請求の範囲第１９項に記載の方法。２９、少なくとも２０％の該化合物がベシクル内に捕捉されてなる請求の範囲第２８項に記載の方法。３０、該物質がタンパク質である請求の範囲第２８項に記載の方法。３１、前記化合物を含有する請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類を生物に投与することを特徴とする生体内細胞に化合物を投与する方法。３２、安定なプルリラメラベシクル類が局部的、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下または耳内に投与されてなる請求の範囲第３１項に記載の方法。３３、感染症の治療に有効な化合物を含有する請求の範囲１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類を投与することを特徴とする動物または植物の感染症の治療方法。３４、感染症が細胞内である請求の範囲第３３項に記載の方法。３５、感染症が寄生虫によってひき起されるものである請求の範囲第３４項に記載の方法。３６、感染症がプルセラｓｐｐによってひき起、されるものである請求の範囲第３５項に記載方法。３７、投与が腹腔内である請求の範囲第３６項に記載の方法。３８、感染症が細胞外である請求の範囲第３３項に記載の方法。３９、感染症がバクテリアによってひき起されるものである請求の範囲第３８項に記載の方法。４０、感染症が黄色ブドウ球菌にによってひき起されるものである請求の範囲第３９項に記載の方法。４１、投与が腹腔内である請求の範囲第４０項に記載の方法。４２、感染症が眼感染症である請求の範囲第３３項に記載の方法。４３、感染症がモラクセラＳｐｐによってひき起されるものである請求の範囲第４２項に記載の方法。４４、感染症が局部的である請求の範囲第４３項に記載の方法。４５、感染症がウィルスによりひき起されるものである請求の範囲第３３項に記載の方法。４６、＠染症がリンパ性脈絡髄炎ウィルスによってひき起されるものである請求の範囲第４５項に記載の方法。４７、投与が腹腔内である請求の範囲第４６項に記載の方法。４８、前記化合物を含有する請求の範囲第１項に記載の安定なプルリラメラベシクル類を投与することを特徴とする痛みを治療するに有効な化合物の必要な徐放を動物または植物における痛みの治療方法。４９、痛みが眼病である請求の範囲第４８項に記載の方法。５０、痛みが緑内障である請求の範囲第４９項に記載の方法。５１、投与が局部的である請求の範囲第５０項に記載の方法。