JPS6384500A - ヒト20k成長ホルモンの製造方法 - Google Patents
ヒト20k成長ホルモンの製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、約20にダルトンの分子量を有するヒト成長
ホルモン(ヒト2OK成長ホルモン)の製造方法に関す
る。
ホルモン(ヒト2OK成長ホルモン)の製造方法に関す
る。
ヒト成長ホルモンは、成長促進作用を有する蛋白質で、
ヒト下垂体前葉あるいは血中に見出される。このヒト成
長ホルモンとしては、191個のアミノ酸からなり、2
2にダルトンの分子量を有する成長ホルモン(以下22
KhGHと略称する)が知られていたが、近年この22
KhGl(の他に約20にダルトンの分子量を有するヒ
ト20に成長ホルモン(以下20KhGHと略称する)
が存在することが判明した。
ヒト下垂体前葉あるいは血中に見出される。このヒト成
長ホルモンとしては、191個のアミノ酸からなり、2
2にダルトンの分子量を有する成長ホルモン(以下22
KhGHと略称する)が知られていたが、近年この22
KhGl(の他に約20にダルトンの分子量を有するヒ
ト20に成長ホルモン(以下20KhGHと略称する)
が存在することが判明した。
この20KhG)Iは、ヒト成長ホルモン中に正常人お
よび末端肥大症患者を問わず、5〜10%程度存在して
おり、そのアミノ酸配列は、22KhGHの配列のN−
末端より32番目から46番目までの配列が欠落した第
1図に示す配列を有すると推定されている(Lewis
、 U、T、 et al、、 Biochem、 B
iophys、 Res。
よび末端肥大症患者を問わず、5〜10%程度存在して
おり、そのアミノ酸配列は、22KhGHの配列のN−
末端より32番目から46番目までの配列が欠落した第
1図に示す配列を有すると推定されている(Lewis
、 U、T、 et al、、 Biochem、 B
iophys、 Res。
Coau++un、、 92.511−518 (19
80)およびChapman。
80)およびChapman。
G、E、 et al、、 J、 Biol、 Che
ll、、 256.2395−2401(1981)参
照)。
ll、、 256.2395−2401(1981)参
照)。
この20KhCHは、成長促進作用においては22Kh
CHと同様であるが、22KhGHが有している初期イ
ンスリン様活性、後期脂質分解作用および糖尿病原性活
性などに由来する副作用がなし゛という特長を有してお
り、小人症、火傷、潰瘍、骨折等の治療薬として22K
hGHより優れた性質を有するものと期待されている。
CHと同様であるが、22KhGHが有している初期イ
ンスリン様活性、後期脂質分解作用および糖尿病原性活
性などに由来する副作用がなし゛という特長を有してお
り、小人症、火傷、潰瘍、骨折等の治療薬として22K
hGHより優れた性質を有するものと期待されている。
しかしながら、20KhG)lを天然から得ることは、
次の点で困難であり、収率も極めて悪い。
次の点で困難であり、収率も極めて悪い。
(1) 20KhGHを含むヒト成長ホルモンを充分な
量をもって得るには、ヒト下垂体が大量に必要であるが
、ヒト下垂体の入手は容易でない。
量をもって得るには、ヒト下垂体が大量に必要であるが
、ヒト下垂体の入手は容易でない。
(2)加えて、ヒト成長ホルモンから20KhGHを単
離するには、これを性質の近似した22KhGHから分
離しなければならず、収率が悪い。
離するには、これを性質の近似した22KhGHから分
離しなければならず、収率が悪い。
これらの事情から、従来、20KhGHは、その優れた
性質が治療薬として期待されているにもかかわらず、入
手することが困難であった。
性質が治療薬として期待されているにもかかわらず、入
手することが困難であった。
本発明者等は、20KhG)Iを大量生産することがで
きる技術を提供すべく研究を重ね、ヒト細胞から20K
hGHをコードするDNAを得ることに成功し、このD
NAを用いて遺伝子組換え技術に基づき微生物に20K
hGHを生産せしめることに成功して本発明を完成する
に至った。
きる技術を提供すべく研究を重ね、ヒト細胞から20K
hGHをコードするDNAを得ることに成功し、このD
NAを用いて遺伝子組換え技術に基づき微生物に20K
hGHを生産せしめることに成功して本発明を完成する
に至った。
本発明は、20KhG)lをコードするヒト細胞由来の
DNA配列を含む発現ベクターにより形質転換された微
生物を培養し、培養物中にヒト20に成長ホルモンを生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする20K
hGHの製造方法を提供するものである。
DNA配列を含む発現ベクターにより形質転換された微
生物を培養し、培養物中にヒト20に成長ホルモンを生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする20K
hGHの製造方法を提供するものである。
本発明の製造方法に用いる20KhGH遺伝子は、ヒト
下垂体前葉から得たポリ囚” RNAを用いてcDNA
のライブラリーを作成し、このライブラリーから22K
hGH遺伝子の断片をプローブに用いてハイブリダイゼ
ーション法により得られたものである。この20KhG
H遺伝子は、22KhGHが有している32番目のトリ
プレットコドン力)ら46番目のトリプレットコドンま
での45bpのDNA配列が欠落している点で22Kh
GH遺伝子とは異なる。
下垂体前葉から得たポリ囚” RNAを用いてcDNA
のライブラリーを作成し、このライブラリーから22K
hGH遺伝子の断片をプローブに用いてハイブリダイゼ
ーション法により得られたものである。この20KhG
H遺伝子は、22KhGHが有している32番目のトリ
プレットコドン力)ら46番目のトリプレットコドンま
での45bpのDNA配列が欠落している点で22Kh
GH遺伝子とは異なる。
ヒト下垂体前葉からのポリ(N” RNAの調製は、オ
リゴdTクロマトグラフィ等により行なうことができる
。 cDNAは、ポリ(A) ” RNAよりオリゴd
Tをブライマーとして逆転写酵素を用いて合成すること
ができる。このcDNAに必要に応じてdC連鎖を付加
し、適当な制限酵素により前記cDNAを含む断片を得
、これをリンカ−[INAと共に環状化せしめることに
より前記cDNAを含む組換えプラスミドを得ることが
できる。
リゴdTクロマトグラフィ等により行なうことができる
。 cDNAは、ポリ(A) ” RNAよりオリゴd
Tをブライマーとして逆転写酵素を用いて合成すること
ができる。このcDNAに必要に応じてdC連鎖を付加
し、適当な制限酵素により前記cDNAを含む断片を得
、これをリンカ−[INAと共に環状化せしめることに
より前記cDNAを含む組換えプラスミドを得ることが
できる。
このプラスミドを大腸菌等に導入して形質転換体を得、
この形質転換体からハイブリダイゼーション法等を使用
して前記20KhGH遺伝子が組込まれたプラスミ1を
有する菌株を選択することにより、20KhGH遺伝子
のライブラリーが得られる。ハイブリダイゼーション法
を適用する場合には、22KhGH遺伝子のcDNAま
たはその断片をプローブとして使用することができる。
この形質転換体からハイブリダイゼーション法等を使用
して前記20KhGH遺伝子が組込まれたプラスミ1を
有する菌株を選択することにより、20KhGH遺伝子
のライブラリーが得られる。ハイブリダイゼーション法
を適用する場合には、22KhGH遺伝子のcDNAま
たはその断片をプローブとして使用することができる。
このプローブを用いてクローンを選択した場合、そのプ
ラスミドは20KhGH遺伝子をもつものと22KhG
H遺伝子をもつものとが混在しているため、更にハイブ
リッドダイゼーション法等による選択が必要である。
ラスミドは20KhGH遺伝子をもつものと22KhG
H遺伝子をもつものとが混在しているため、更にハイブ
リッドダイゼーション法等による選択が必要である。
本発明においては、20KhGH遺伝子と22KhG)
I遺伝子とを分離するために、22KhGH遺伝子では
欠落していると推定されているDNA配列中のMb。
I遺伝子とを分離するために、22KhGH遺伝子では
欠落していると推定されているDNA配列中のMb。
■とPstrとで切断される31bpの断片をプローブ
として用いた。そしてこのプローブにハイブリダイズし
ないプラスミドを有する菌株を選択し、目的とする20
KhGH遺伝子を有する形質転換体を得た。
として用いた。そしてこのプローブにハイブリダイズし
ないプラスミドを有する菌株を選択し、目的とする20
KhGH遺伝子を有する形質転換体を得た。
上記のクローニングにより得られた20KhGH遺伝子
の塩基配列は、例えばMaxam−G11bert法(
Maxam、 A and G11bert、 W、、
Method in Enzy−mology 65
.499−560 (1979))ニJニッチ決定する
ことができる。
の塩基配列は、例えばMaxam−G11bert法(
Maxam、 A and G11bert、 W、、
Method in Enzy−mology 65
.499−560 (1979))ニJニッチ決定する
ことができる。
得られたクローンから20KhGH遺伝子の全部または
一部を取り出し、適当なプロモーター、SD配列等の制
御因子の下流に位置するように発現ベクターに組込み、
このベクターで適当な宿主微生物を形質転換することに
より、20KhG)l産生能を有する形質転換体が得ら
れる。この形質転換体を適当な培地で培養し、培養物か
ら20KhGHを単離することにより20KhGHを得
ることができる。
一部を取り出し、適当なプロモーター、SD配列等の制
御因子の下流に位置するように発現ベクターに組込み、
このベクターで適当な宿主微生物を形質転換することに
より、20KhG)l産生能を有する形質転換体が得ら
れる。この形質転換体を適当な培地で培養し、培養物か
ら20KhGHを単離することにより20KhGHを得
ることができる。
前記発現ベクターに用いるプロモーターとしては、 t
rpプロモーター、Iacプロモーター、SV40プロ
モーター、入ファージプロモーターおよびそれらのハイ
ブリッドプロモーターなどが使用できる。また、宿主と
しては、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、昆虫細胞、動
物細胞等が挙げられ、前記発現ベクターに用いたプロモ
ーターに対して適切な宿主を選択して使用できる。
rpプロモーター、Iacプロモーター、SV40プロ
モーター、入ファージプロモーターおよびそれらのハイ
ブリッドプロモーターなどが使用できる。また、宿主と
しては、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、昆虫細胞、動
物細胞等が挙げられ、前記発現ベクターに用いたプロモ
ーターに対して適切な宿主を選択して使用できる。
形質転換体の培養は、宿主に対して適切な公知の培地を
用いて行なうことができる。
用いて行なうことができる。
培養物からの20KhGHの単離、精製は、例えば培養
物から微生物を実収し、超音波処理、塩酸グアニジン処
理等を用いて微生物を破壊して遠心分離等により細胞蛋
白質を含む上澄を得、これに公知の蛋白質の精製方法を
適用して行なう。この蛋白質の精製は1例えば、塩析、
HPLC等のクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を組
合わせて行なうことができる。
物から微生物を実収し、超音波処理、塩酸グアニジン処
理等を用いて微生物を破壊して遠心分離等により細胞蛋
白質を含む上澄を得、これに公知の蛋白質の精製方法を
適用して行なう。この蛋白質の精製は1例えば、塩析、
HPLC等のクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を組
合わせて行なうことができる。
本発明により得られる20KhGHは、22KhGHを
含まないヒト成長ホルモンである。この20KhGHは
、産生に使用する宿主によっては、そのN−末端に翻訳
開始コドンに対応するアミノ酸メチオニンが結合した蛋
白質として得られるが、このN−末端のメチオニンが、
宿主微生物内で発現後切断され、成熟蛋白として得られ
る場合もある。
含まないヒト成長ホルモンである。この20KhGHは
、産生に使用する宿主によっては、そのN−末端に翻訳
開始コドンに対応するアミノ酸メチオニンが結合した蛋
白質として得られるが、このN−末端のメチオニンが、
宿主微生物内で発現後切断され、成熟蛋白として得られ
る場合もある。
本発明により、20KhG)Iを大量に入手することが
可能となり、22KhGHが有するインスリン様活性、
糖尿病原性などに由来する副作用を低減し得るヒト成長
ホルモンとして臨床への応用が可能となる。
可能となり、22KhGHが有するインスリン様活性、
糖尿病原性などに由来する副作用を低減し得るヒト成長
ホルモンとして臨床への応用が可能となる。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、
本発明は実施例に限定されるものではない。
本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例1
ヒト 寸−か の ポリI10” RNA ・
。
。
ヒトの脳下垂体前葉1.7層5gを液体窒素中で凍結さ
せた後、乳ばち中で組織を粉砕し、これを消泡剤、 5
Mグアニジン−塩酸、2zザルコシル、50mM )リ
ス−塩酸(pH7,9)、50mM EDTA 、 5
%β−メルカプトエタノールからなる溶液50戚中に分
散せしめた。ポリトロン ホモジナイザーを用いて2分
間処理し1組織を完全に破砕した。これを室温に30分
間放置し、泡が消失した後、7mQの5.7M塩化セシ
ウム溶液を含むクイックシールチューブに2層になるよ
うに注入した。その上層には、パラフィンオイルを注入
し、クイックシールを完全に満たし、チューブを封じた
。ベックマンVTi 50ローターを用いて20℃、4
0000rpmで20時間遠心分離を行なった。
せた後、乳ばち中で組織を粉砕し、これを消泡剤、 5
Mグアニジン−塩酸、2zザルコシル、50mM )リ
ス−塩酸(pH7,9)、50mM EDTA 、 5
%β−メルカプトエタノールからなる溶液50戚中に分
散せしめた。ポリトロン ホモジナイザーを用いて2分
間処理し1組織を完全に破砕した。これを室温に30分
間放置し、泡が消失した後、7mQの5.7M塩化セシ
ウム溶液を含むクイックシールチューブに2層になるよ
うに注入した。その上層には、パラフィンオイルを注入
し、クイックシールを完全に満たし、チューブを封じた
。ベックマンVTi 50ローターを用いて20℃、4
0000rpmで20時間遠心分離を行なった。
遠心分離後、得られた沈殿を5戚蒸留水に45℃で溶解
した。得られた全RNAを遠心チューブに移し、 3M
酢酸ナトリウム(pH7)O,,5mQとエタノール1
2.511Qを加え、−20℃に1時間放置した。これ
をベックマンJS−130−ターを用いてeooorp
+i、4℃、30分間遠心分離を行ない、得られた沈殿
を減圧下で乾燥させた。得られた全RNAを、50℃で
5雄蒸留水に溶解した。
した。得られた全RNAを遠心チューブに移し、 3M
酢酸ナトリウム(pH7)O,,5mQとエタノール1
2.511Qを加え、−20℃に1時間放置した。これ
をベックマンJS−130−ターを用いてeooorp
+i、4℃、30分間遠心分離を行ない、得られた沈殿
を減圧下で乾燥させた。得られた全RNAを、50℃で
5雄蒸留水に溶解した。
次に、Maniatis等の方法(Maniatis他
編、 No−1ecular Cloning、 A
Laboratory Manual、197−199
頁参照)を用いて、上記の全RNAからポリ■“RNA
の分離を行なった。これには、まず全RNAを2mM
EDTAと0.5M酢酸ナトリウム(pH5,8)から
なる溶液に溶解し、2mg/aQの濃度に調製した。こ
れを6−のオリゴdTセルロースを詰めたカラムに通し
ざらにカラムバッファー(0,5M酢酸ナトリウムPH
5,6,0,5%う’71J ル硫酸ナトリウム、2m
M EDTA)で洗浄した6次に蒸留水を用′いてポリ
■十RNAを溶出した。この操作を再度繰り返した後、
溶出したポリ■+RNAをエタノール沈殿により回収し
、最終的に24.5Jj9の全ポリIAI” RNAを
得た。
編、 No−1ecular Cloning、 A
Laboratory Manual、197−199
頁参照)を用いて、上記の全RNAからポリ■“RNA
の分離を行なった。これには、まず全RNAを2mM
EDTAと0.5M酢酸ナトリウム(pH5,8)から
なる溶液に溶解し、2mg/aQの濃度に調製した。こ
れを6−のオリゴdTセルロースを詰めたカラムに通し
ざらにカラムバッファー(0,5M酢酸ナトリウムPH
5,6,0,5%う’71J ル硫酸ナトリウム、2m
M EDTA)で洗浄した6次に蒸留水を用′いてポリ
■十RNAを溶出した。この操作を再度繰り返した後、
溶出したポリ■+RNAをエタノール沈殿により回収し
、最終的に24.5Jj9の全ポリIAI” RNAを
得た。
実施例2
ポリ囚+RNAから2 DNA !ポリ(A3
”RNAから2本鎖DNAの作製は、H,0ka−ya
maとP、 Bergに報告されている方法(Nol
ecularand Ce1lular Biolog
y、 2L181−170頁(19B2))を用いた。
”RNAから2本鎖DNAの作製は、H,0ka−ya
maとP、 Bergに報告されている方法(Nol
ecularand Ce1lular Biolog
y、 2L181−170頁(19B2))を用いた。
zj二Lし1 cDNAc7)合を
実施例1で得た全ポリ■+RNA 1.4.を1.4叩
の3°−オリゴ(dT)−ティルトpcDV lプラス
ミド(3’−oligo(dT)−Tailed pc
DV 1 plasmid;7 フルマシア製の市販品
)と5単位の逆転写酵素を10蔵の反応液(50mMト
リス−塩酸(pl(8,3)、8mN塩化マグネシウム
、30mM塩化カリウム、0.3mMジチオス1/イト
ール、各2mMのdATP、 dTTP、 dGTPお
よびuCTP)に加え、400分間反応せた0反応は、
0.25M EDTA(pH8,0) I A ト10
$ ラウIJ ル硫酸ナトリウム0.5 dを加えるこ
とにより停止させた0次に。
の3°−オリゴ(dT)−ティルトpcDV lプラス
ミド(3’−oligo(dT)−Tailed pc
DV 1 plasmid;7 フルマシア製の市販品
)と5単位の逆転写酵素を10蔵の反応液(50mMト
リス−塩酸(pl(8,3)、8mN塩化マグネシウム
、30mM塩化カリウム、0.3mMジチオス1/イト
ール、各2mMのdATP、 dTTP、 dGTPお
よびuCTP)に加え、400分間反応せた0反応は、
0.25M EDTA(pH8,0) I A ト10
$ ラウIJ ル硫酸ナトリウム0.5 dを加えるこ
とにより停止させた0次に。
10dのフェノール/クロロホルム混液(1: 1)を
加えて振とうし、遠心分離を行い、水層を得た。これに
10dの4N#酸アンモニウムと40戚のエタノールを
加え、ドライアイス−エタノール中で15分間冷却し、
次に沈殿したデオキシヌクレオチド トリホスフェート
を溶解させるために10分間放置した後、遠心分# (
15QOOrpm 10分間)を行ナイ、沈殿を得た。
加えて振とうし、遠心分離を行い、水層を得た。これに
10dの4N#酸アンモニウムと40戚のエタノールを
加え、ドライアイス−エタノール中で15分間冷却し、
次に沈殿したデオキシヌクレオチド トリホスフェート
を溶解させるために10分間放置した後、遠心分# (
15QOOrpm 10分間)を行ナイ、沈殿を得た。
エタノール沈殿を再度繰り返し、沈殿をエタノールで洗
浄した。
浄した。
7.9シ仁メヱ dCテーリング
ステップ1で得られた沈殿を15戚の14h+Mカコジ
ルナトリウム、30mにトリス−塩酸(pHe、e)、
1mW塩化コバル)、0.1mMジチオスレードール、
および88ILMdCTP溶液に溶解した。 18単位
のターミナル デオキシヌクレオチジル転移酵素(市販
品:ファルマシア製)を加えて37℃、5分間反応させ
た後1反応を停止させた。 15dのフェノール/クロ
ロホルム混液(1:1)を加えて撹拌後、遠心分離を行
ない水層を得た。これに15蛾の4M酢酸アンモニウム
を加え、DNAを沈殿させた。沈殿を304の0.3M
酢酸ナトリウム(pH5,8)に溶解し、60戚の冷エ
タノールを加え、ドライアイス−エタノール中で10分
間冷却した後、遠心分離を行ない、DNAの沈殿を得た
。沈殿を更にエタノールで洗浄した。
ルナトリウム、30mにトリス−塩酸(pHe、e)、
1mW塩化コバル)、0.1mMジチオスレードール、
および88ILMdCTP溶液に溶解した。 18単位
のターミナル デオキシヌクレオチジル転移酵素(市販
品:ファルマシア製)を加えて37℃、5分間反応させ
た後1反応を停止させた。 15dのフェノール/クロ
ロホルム混液(1:1)を加えて撹拌後、遠心分離を行
ない水層を得た。これに15蛾の4M酢酸アンモニウム
を加え、DNAを沈殿させた。沈殿を304の0.3M
酢酸ナトリウム(pH5,8)に溶解し、60戚の冷エ
タノールを加え、ドライアイス−エタノール中で10分
間冷却した後、遠心分離を行ない、DNAの沈殿を得た
。沈殿を更にエタノールで洗浄した。
五iユlユ Hind [IIを用いた消化ステップ2
で得られた沈殿を2011Mトリス−塩酸(pH7,4
)、7mM塩化マグネシウム、60mM塩化ナトリウム
およびO,Iragのウシ血清アルブミンから成る溶液
IO戚に溶解した。次に、2.5単位の旧ndmを37
℃で1時間作用させた後、反応を停止させた。
で得られた沈殿を2011Mトリス−塩酸(pH7,4
)、7mM塩化マグネシウム、60mM塩化ナトリウム
およびO,Iragのウシ血清アルブミンから成る溶液
IO戚に溶解した。次に、2.5単位の旧ndmを37
℃で1時間作用させた後、反応を停止させた。
等容量のフェノール/クロロホルム(tit)混液を用
いて抽出を行なった後、水層を分離し、これに10dの
儲酢酸アンモニウムと40戚のエタノールを加え、10
分間ドライアイス/エタノール中で冷却し、遠心分離す
ることによりDNAの沈殿を得た。
いて抽出を行なった後、水層を分離し、これに10dの
儲酢酸アンモニウムと40戚のエタノールを加え、10
分間ドライアイス/エタノール中で冷却し、遠心分離す
ることによりDNAの沈殿を得た。
エタノールを加えて沈殿を洗浄し、10戚の1hM ト
リス−塩酸(pH7,3)とl mW EDTAに溶解
した。
リス−塩酸(pH7,3)とl mW EDTAに溶解
した。
ニニュフ」3°−オリゴ(dG) −ティルトpsv
1932H4ndI[Iリンカ−を用いたプラスミドの
環状化 ステップ3で得られたHind III消化オリゴ(d
C)ティルトプラスミド1戚(0,02pmol)を、
10IIM )リス−塩酸(pH7,5)、l mM
EDTAおよび7載gの3゛−オリゴ(dG)−ティル
トpSV 1932 HindIIIリンカ−(3’−
0!igo(dG)−Tailed pSV 1932
Hindm l1nker:市販品、ファルマシア製
)を含む溶液10戚に加え、65°Cで2分間加熱し、
次いで42℃に30分間保った後に0℃に冷却して両D
NAをアニールさせた。
1932H4ndI[Iリンカ−を用いたプラスミドの
環状化 ステップ3で得られたHind III消化オリゴ(d
C)ティルトプラスミド1戚(0,02pmol)を、
10IIM )リス−塩酸(pH7,5)、l mM
EDTAおよび7載gの3゛−オリゴ(dG)−ティル
トpSV 1932 HindIIIリンカ−(3’−
0!igo(dG)−Tailed pSV 1932
Hindm l1nker:市販品、ファルマシア製
)を含む溶液10戚に加え、65°Cで2分間加熱し、
次いで42℃に30分間保った後に0℃に冷却して両D
NAをアニールさせた。
次にlidのDNA溶液に最終的に20IIMトリスー
塩酸(pH7,5)、4鱈塩化マグネシウム、 10m
M硫酸アンモニウム、0.1M塩化カリウム、50q/
mウシ血清アルブミン、0.1mMβ−NADになるよ
うに、これらの試薬を加え、全量を100dとした。こ
れに1単位のE、coli DNA連結酵素(市阪品:
ニューイングランド バイオラポス)を加え、12℃で
一夜反応させ、両DNAを連結させた。
塩酸(pH7,5)、4鱈塩化マグネシウム、 10m
M硫酸アンモニウム、0.1M塩化カリウム、50q/
mウシ血清アルブミン、0.1mMβ−NADになるよ
うに、これらの試薬を加え、全量を100dとした。こ
れに1単位のE、coli DNA連結酵素(市阪品:
ニューイングランド バイオラポス)を加え、12℃で
一夜反応させ、両DNAを連結させた。
困えニア’5 RNA鎖のDNA鎖への着換プラスミ
ド上の挿入RNA鎖をDNA鎖に置換するために、4種
類のデオキシヌクレオチド トリホスフェート各1mM
を含む溶液4鴻、1.25wMβ−MAD、1単位のE
、coli DNA連結酵素、1単位のE、coli
RNase H(市販品: BRL製)およびQ、3
s C18単位)のDNAポリメラーゼ1を加え、12
℃で1時間反応させた。これに冷却101M )リス−
塩酸(pH7,3)を0.9緘加え、反応液を0.1m
Qづつエッペンドルフチューブに分注し、0℃で保存し
た。
ド上の挿入RNA鎖をDNA鎖に置換するために、4種
類のデオキシヌクレオチド トリホスフェート各1mM
を含む溶液4鴻、1.25wMβ−MAD、1単位のE
、coli DNA連結酵素、1単位のE、coli
RNase H(市販品: BRL製)およびQ、3
s C18単位)のDNAポリメラーゼ1を加え、12
℃で1時間反応させた。これに冷却101M )リス−
塩酸(pH7,3)を0.9緘加え、反応液を0.1m
Qづつエッペンドルフチューブに分注し、0℃で保存し
た。
実施例3
cONAライブラリーの
Cohen等(Proc、 Watt、 Acad、
Sci、υ、S、A、 。
Sci、υ、S、A、 。
柱、 2110−2114(1972))による方法に
従って大腸菌HBIOIのDNA取込能力を有する細胞
(competentcells)を調製した。大腸菌
HBIOIを37℃で100畦のし一ブロスを用いて8
00dmの吸光度0.5となるまで培養し、遠心分離に
より集菌した0次に50mQのfOmN トリス−塩酸
(p)I 7.3)、50顛塩化カルシウムに菌液を懸
濁し、0℃で5分間遠心分離を行った。沈殿した大腸菌
を2薊の上記緩衝液に懸濁した後、5分間θ℃に放置し
た。 0.2m1lの大腸菌HB101懸濁液と0.
1載の実施例2のステップ5で調製したDNAとを混合
し、0℃に15分間放置した。
従って大腸菌HBIOIのDNA取込能力を有する細胞
(competentcells)を調製した。大腸菌
HBIOIを37℃で100畦のし一ブロスを用いて8
00dmの吸光度0.5となるまで培養し、遠心分離に
より集菌した0次に50mQのfOmN トリス−塩酸
(p)I 7.3)、50顛塩化カルシウムに菌液を懸
濁し、0℃で5分間遠心分離を行った。沈殿した大腸菌
を2薊の上記緩衝液に懸濁した後、5分間θ℃に放置し
た。 0.2m1lの大腸菌HB101懸濁液と0.
1載の実施例2のステップ5で調製したDNAとを混合
し、0℃に15分間放置した。
次に、この混合液を37℃で2分間培養し、室温に10
分間放置した後、0.5m1lのL−ブロスを添加して
37°Cで30分間培養した。菌液を42℃に保持した
2、5戚のL−/ロス軟寒天と混合し、50s/nff
1のアンピシリンを有するし一プロス寒天上にスプレッ
ドし、37°Cで14時間培養した。10枚のプレート
から合計5000株のアンピシリン耐性株を得ることに
より、ヒト脳下垂体前葉のmRNAに由来するcDNA
ライブラリーを作製した。
分間放置した後、0.5m1lのL−ブロスを添加して
37°Cで30分間培養した。菌液を42℃に保持した
2、5戚のL−/ロス軟寒天と混合し、50s/nff
1のアンピシリンを有するし一プロス寒天上にスプレッ
ドし、37°Cで14時間培養した。10枚のプレート
から合計5000株のアンピシリン耐性株を得ることに
より、ヒト脳下垂体前葉のmRNAに由来するcDNA
ライブラリーを作製した。
実施例4
4枚のプレートから形質転換体1700株を0.45竿
のボーアサイズを有するニトロセルロースフィルターに
移した。このフィルターを0.5N水酸化ナトリウムと
1.5M塩化ナトリウムとを浸した口紙上に30分間行
き、次に0.5M l−リス−塩酸p)+7,1M塩化
ナトリウムを浸した口紙上に置いて溶菌と中和を行った
。フィルターを風乾した後、80℃減圧下に2時間放着
し、 DNAをフィルターに固定した。
のボーアサイズを有するニトロセルロースフィルターに
移した。このフィルターを0.5N水酸化ナトリウムと
1.5M塩化ナトリウムとを浸した口紙上に30分間行
き、次に0.5M l−リス−塩酸p)+7,1M塩化
ナトリウムを浸した口紙上に置いて溶菌と中和を行った
。フィルターを風乾した後、80℃減圧下に2時間放着
し、 DNAをフィルターに固定した。
22KhG)l遺伝子(Goeddel et al、
、 Nature 281544−548(1979)
参照)の500塩基対からなるPvu■断片をニックト
ランスレーション法(Rigby。
、 Nature 281544−548(1979)
参照)の500塩基対からなるPvu■断片をニックト
ランスレーション法(Rigby。
et al、、 J、 Mo1. Biol、、 11
3.237−251(1977)参照)を用いて22P
−dCTPで標識することによりDNAプローブを作成
した。
3.237−251(1977)参照)を用いて22P
−dCTPで標識することによりDNAプローブを作成
した。
次いで、公知の方法により、以下のようにしてヒト成長
ホルモン遺伝子を有するクローンを選択した(Mole
cular Cloning (前出) 312−32
3頁参照)。
ホルモン遺伝子を有するクローンを選択した(Mole
cular Cloning (前出) 312−32
3頁参照)。
DNAプローブを95℃で5分間加熱して変性せしめ、
これを10fiのハイブリダイゼーション緩衝液(5o
zホルムアミド、5倍濃度デンハート溶液、5倍濃度5
SPE溶液、0.1zラウリルvt、mナトリウム。
これを10fiのハイブリダイゼーション緩衝液(5o
zホルムアミド、5倍濃度デンハート溶液、5倍濃度5
SPE溶液、0.1zラウリルvt、mナトリウム。
10047mQ変性サケ***DNAを含む)に加え、ビ
ニルバッグに入れた4枚のニトロセルロースフィルター
(プレウォッシュしたもの)と共に37℃で一晩振とう
した。フィルターを取り出し、O,15M塩化ナトリウ
ム−0,05Mクエン酸ナトリウム溶液中で振とうしな
がらフィルターの洗浄を行った。このフィルターをX線
フィルムと密着させ、−80℃で1日放置後、X線フィ
ルムを現像した。この結果、500 b、p、のPマu
II断片とハイブリダイズするプラスミドを持った53
株を選出した。
ニルバッグに入れた4枚のニトロセルロースフィルター
(プレウォッシュしたもの)と共に37℃で一晩振とう
した。フィルターを取り出し、O,15M塩化ナトリウ
ム−0,05Mクエン酸ナトリウム溶液中で振とうしな
がらフィルターの洗浄を行った。このフィルターをX線
フィルムと密着させ、−80℃で1日放置後、X線フィ
ルムを現像した。この結果、500 b、p、のPマu
II断片とハイブリダイズするプラスミドを持った53
株を選出した。
これらの53株は、20KhGH遺伝子および22Kh
GH遺伝子のいずれかを含む大腸菌であるため、更に2
0KhGH遺伝子を有するクローンを選別する必要があ
る。そこで、2QKhGH遺伝子には欠けており、22
KhGH遺伝子にのみ見出される32番目から46番目
までのアミノ酸をコードする塩基配列からMbolTと
Pst Iで切断される31塩基対の断片を調製した。
GH遺伝子のいずれかを含む大腸菌であるため、更に2
0KhGH遺伝子を有するクローンを選別する必要があ
る。そこで、2QKhGH遺伝子には欠けており、22
KhGH遺伝子にのみ見出される32番目から46番目
までのアミノ酸をコードする塩基配列からMbolTと
Pst Iで切断される31塩基対の断片を調製した。
この断片を前述した方法と同様にしてニックトランスレ
ーション法により32P−dC:TPを用いて標識した
。これにより得られたDNAプローブを用い、前述した
53株についてハイブリダイゼーション法により検討し
た結果、このDNAプローブとハイブリダイズしないプ
ラスミドを持った菌株8個が得られた。これらの菌株は
、いずれも20KhG)I遺伝子が組込まれた第3図に
示すプラスミドphGH20−fltを有していた。
ーション法により32P−dC:TPを用いて標識した
。これにより得られたDNAプローブを用い、前述した
53株についてハイブリダイゼーション法により検討し
た結果、このDNAプローブとハイブリダイズしないプ
ラスミドを持った菌株8個が得られた。これらの菌株は
、いずれも20KhG)I遺伝子が組込まれた第3図に
示すプラスミドphGH20−fltを有していた。
実施例5
20KhGHプラスミド DK2−
20KhGH発現用プラスミドを第4図及び第5図に示
す方法により構築した。
す方法により構築した。
20KhGHの5゛末端近傍をコードする下記11式に
示す57塩基のオリゴヌクレオチドと、それに相補的な
下記m式に示す51塩基のオリゴヌクレオチドとを化学
合成した。
示す57塩基のオリゴヌクレオチドと、それに相補的な
下記m式に示す51塩基のオリゴヌクレオチドとを化学
合成した。
5°値紅筐匝TTCCCAACCATTCCCTTAT
CCAGGCT丁TTTGACAACGCTAGTGT
CCGC:G−3° (II)5°
−CGGAGACTAGCGTTGTCAAAAACC
CTGGATAAGGGAATGGTTGGGAACA
TG−3° (m)これらをそれぞれ
下記成分を有する反応液1において37℃で30分間反
応させることにより5°末端をリン酸化した6反応液l
を水飽和フェノール/クロロホルム混液及び水飽和エー
テルで抽出した後、エタノール沈殿によりリン酸化オリ
ゴヌクレオチドを得た。
CCAGGCT丁TTTGACAACGCTAGTGT
CCGC:G−3° (II)5°
−CGGAGACTAGCGTTGTCAAAAACC
CTGGATAAGGGAATGGTTGGGAACA
TG−3° (m)これらをそれぞれ
下記成分を有する反応液1において37℃で30分間反
応させることにより5°末端をリン酸化した6反応液l
を水飽和フェノール/クロロホルム混液及び水飽和エー
テルで抽出した後、エタノール沈殿によりリン酸化オリ
ゴヌクレオチドを得た。
合成[]NA (1即)10戚0.
1mMATP 2戚キナーゼ
バツフγ富 5戚ポリヌクレオチドキ
ナーゼ(4単位)2戚H201戚 寡キナーゼバツフアは、0.2Mグリシン(pH11,
5)、0.04M MgCl□、 0.02Mジチオス
レードールを含む。
1mMATP 2戚キナーゼ
バツフγ富 5戚ポリヌクレオチドキ
ナーゼ(4単位)2戚H201戚 寡キナーゼバツフアは、0.2Mグリシン(pH11,
5)、0.04M MgCl□、 0.02Mジチオス
レードールを含む。
次に1両DNAを7ニールさせた後、プラスミドphG
H20−8をHha IとHinfIとで切断して得ら
れた78bpの断片と下記成分を有する反応液2中で4
℃にて一晩反応させることにより連結し、さらに得られ
たDNAをEcoRIと旧nfIとで消化し、131b
pの断片を得た。
H20−8をHha IとHinfIとで切断して得ら
れた78bpの断片と下記成分を有する反応液2中で4
℃にて一晩反応させることにより連結し、さらに得られ
たDNAをEcoRIと旧nfIとで消化し、131b
pの断片を得た。
〔反応液2〕
phGH20−8HhaI/Hinf I断片(78b
p)約1100n 4Jアニー
ルさせた合成りNA 4成10倍濃度リ
ガーゼ バッファ木本1戚T4 [INAリガーゼ
1戚*本10倍濃度リガーゼ バッフ
ァは1mM ATP、0、EtM トリス−塩酸(pH
7,5)、0.1M MgCl2 。
p)約1100n 4Jアニー
ルさせた合成りNA 4成10倍濃度リ
ガーゼ バッファ木本1戚T4 [INAリガーゼ
1戚*本10倍濃度リガーゼ バッフ
ァは1mM ATP、0、EtM トリス−塩酸(pH
7,5)、0.1M MgCl2 。
0.1Mジチオスレードールを含む。
次いで、上記131bp (7)断片と、phGH20
−6を旧nfIとAcc Iとで消化して得られた?!
30bpの断片とを反応液3中で4℃にて一晩反応させ
ることにより連結した。
−6を旧nfIとAcc Iとで消化して得られた?!
30bpの断片とを反応液3中で4℃にて一晩反応させ
ることにより連結した。
〔反応液3〕
131bp EcaRI /Hinf I断片(約50
ng) 3JphGH20−8、Hinf I /A
cc I断片、7aobp (約300ng)
5m10倍濃度9ガーゼ バッファ
IJJ!IT4 DNAリガーゼ(1000単位
) 1戚これにより得られたDNAをEcoR
IとAcc Iとで消化し、 920bpの断片を得た
。この断片は、20KhGH遺伝子をATG (開始コ
ドン)に続き有している。
ng) 3JphGH20−8、Hinf I /A
cc I断片、7aobp (約300ng)
5m10倍濃度9ガーゼ バッファ
IJJ!IT4 DNAリガーゼ(1000単位
) 1戚これにより得られたDNAをEcoR
IとAcc Iとで消化し、 920bpの断片を得た
。この断片は、20KhGH遺伝子をATG (開始コ
ドン)に続き有している。
次いで、920bPの断片と、pBR322をEcoR
IとAcc Iで切断して得られた2、IKbのベクタ
ープラスミド断片とを、下記反応液中で、 4℃にて一
晩反応させることにより連結した。
IとAcc Iで切断して得られた2、IKbのベクタ
ープラスミド断片とを、下記反応液中で、 4℃にて一
晩反応させることにより連結した。
〔反応液4〕
920bp EcoRI /Acc I断片(約101
00n 5JpBR322EcoRI /Acc I
断片(約5ong) Dm10倍濃度9ガーゼ バッ
ファ 1dT4 DNAリガーゼ(1000単
位) 1戚連結反応後、70℃にて5分間加熱
し、酵素を失活させた。次に、PBR322に由来する
形質転換株の出現を抑えるために、 HindIIIを
用いて37℃にて1時間処理し、これを用いてE、co
li PRIを形質転換した。その結果、 3700株
の形質転換体が得られた。これらのうち、24個の菌株
についてミニブレツブ法によりプラスミドDNAを抽出
し、 EcoRIとAcc Iとによる消化で820b
pの断片を生ずるプラスミドをスクリーニングした結果
、1クローンが目的のプラスミド(第4図中のpDKO
)を有していた。
00n 5JpBR322EcoRI /Acc I
断片(約5ong) Dm10倍濃度9ガーゼ バッ
ファ 1dT4 DNAリガーゼ(1000単
位) 1戚連結反応後、70℃にて5分間加熱
し、酵素を失活させた。次に、PBR322に由来する
形質転換株の出現を抑えるために、 HindIIIを
用いて37℃にて1時間処理し、これを用いてE、co
li PRIを形質転換した。その結果、 3700株
の形質転換体が得られた。これらのうち、24個の菌株
についてミニブレツブ法によりプラスミドDNAを抽出
し、 EcoRIとAcc Iとによる消化で820b
pの断片を生ずるプラスミドをスクリーニングした結果
、1クローンが目的のプラスミド(第4図中のpDKO
)を有していた。
20KhGH発現ベクターとして、trpプロモーター
を有するpDR720(市販品:ファルマシア製)を用
いた。trpプロモーターの作用の最適化のために、以
下に詳述するように20KhGHをコードする塩基配列
の上流と下流とにそれぞれSD配列とターミネータ−を
挿入した。
を有するpDR720(市販品:ファルマシア製)を用
いた。trpプロモーターの作用の最適化のために、以
下に詳述するように20KhGHをコードする塩基配列
の上流と下流とにそれぞれSD配列とターミネータ−を
挿入した。
SD配列として、5alIとEcoRI部位を有する下
記(IV)式のDNAと合成した。
記(IV)式のDNAと合成した。
5’ −TCGACGGAGGAGG (
IV)GCCT(C:TTCTTAA−5’ また、ターミネータ−としてAcc IとBawl I
部位を有する下記(V)式のDNAを合成した。
IV)GCCT(C:TTCTTAA−5’ また、ターミネータ−としてAcc IとBawl I
部位を有する下記(V)式のDNAを合成した。
5’ −ATACAGCCCGCCTAATGAGTG
TCGCGCGGATTACTO CGGGCT丁TTTTTTG
(V)GCCCGAAAAAAAACCTAG−5’
まず、上記のターミネータ−と、pDKoをEcoRI
とAccIとにより切断して得られた20KhGHをコ
ードする920bpの断片とをリガーゼ バッファ中で
74 DNAリガーゼを用いて連結し、さらに得られた
DNAをEcoRIとBamHIとを用いて消化し、
asobpのEcoRI / Bawl I断片を得た
。次いで、の950bPの断片と、pBR322をEc
oRIとBamHIとで切断して得た4Kbのベクター
プラスミド断片とをリガーゼバッファ中で74 [IN
Aリガーゼを用いて連結した。
TCGCGCGGATTACTO CGGGCT丁TTTTTTG
(V)GCCCGAAAAAAAACCTAG−5’
まず、上記のターミネータ−と、pDKoをEcoRI
とAccIとにより切断して得られた20KhGHをコ
ードする920bpの断片とをリガーゼ バッファ中で
74 DNAリガーゼを用いて連結し、さらに得られた
DNAをEcoRIとBamHIとを用いて消化し、
asobpのEcoRI / Bawl I断片を得た
。次いで、の950bPの断片と、pBR322をEc
oRIとBamHIとで切断して得た4Kbのベクター
プラスミド断片とをリガーゼバッファ中で74 [IN
Aリガーゼを用いて連結した。
得られた反応液を用いてE、coli 0H−5株を形
質転換し、2000株の形質転換体を得た。
質転換し、2000株の形質転換体を得た。
上記の形質転換体について、(V)式に示したターミネ
ータ−をコードする33塩基からなるDNAをプローブ
としてハイブリダイゼーション法を適用した結果、ター
ミネータ−を含むプラスミドを有する形質転換体15株
を同定した。これらの形質転換体について、ミニプレツ
ブ法でプラスミドを抽出し、 EcoRIとBamHI
による消化テロ50bpノ断片が生ずるプラスミドを検
索した結果、すべてのクローンが目的のプラスミド(第
5図中に示すpDKl)を有していた。
ータ−をコードする33塩基からなるDNAをプローブ
としてハイブリダイゼーション法を適用した結果、ター
ミネータ−を含むプラスミドを有する形質転換体15株
を同定した。これらの形質転換体について、ミニプレツ
ブ法でプラスミドを抽出し、 EcoRIとBamHI
による消化テロ50bpノ断片が生ずるプラスミドを検
索した結果、すべてのクローンが目的のプラスミド(第
5図中に示すpDKl)を有していた。
上記クローン中の1株(大腸菌DH−5株)よりプラス
ミドpDK lを調製した。こc7)pDKlをEco
RIとBamHIを用いて消化した後、アガロースゲル
電気泳動により950bPの断片を分離し、これをEl
u−t i p (S&S社製、 DNA精製用カラ
ム)を用いて精製し、20KhGHをコードする遺伝子
とターミネータ−とを有するasobpのEcoRI
/ BamHI断片を得た。
ミドpDK lを調製した。こc7)pDKlをEco
RIとBamHIを用いて消化した後、アガロースゲル
電気泳動により950bPの断片を分離し、これをEl
u−t i p (S&S社製、 DNA精製用カラ
ム)を用いて精製し、20KhGHをコードする遺伝子
とターミネータ−とを有するasobpのEcoRI
/ BamHI断片を得た。
次に、前記EcoRI / BamHI断片(950b
p)を(IV)式に示したSD配列を有するDNA断片
(SalI部位とEcoRI部位を有する)とをリガー
ゼ バッファ中で丁4 DNAリガーゼを用いて連結し
た。この反応液を5alIとBa+*HIとにより処理
し、エタノール沈殿により DAMを回収した。得られ
た5alI/Bamh工断片(9BObp) と、プラ
スミドpDR720を5alIとBamHIにより消化
して得られた約4Kbの断片とをリガー−1/ /<
ッファ中で↑411NAリガーゼを用いて連結した。
p)を(IV)式に示したSD配列を有するDNA断片
(SalI部位とEcoRI部位を有する)とをリガー
ゼ バッファ中で丁4 DNAリガーゼを用いて連結し
た。この反応液を5alIとBa+*HIとにより処理
し、エタノール沈殿により DAMを回収した。得られ
た5alI/Bamh工断片(9BObp) と、プラ
スミドpDR720を5alIとBamHIにより消化
して得られた約4Kbの断片とをリガー−1/ /<
ッファ中で↑411NAリガーゼを用いて連結した。
上記の反応液を用いてE、cali DH−5を形質転
換せしめ、2520株の形質転換体を得た。これらの形
質転換体について前述と同様な方法でコロニーハイブリ
ダイゼーション法により目的とするクローンの選択を行
った。ここではプローブとして前述したターミネータ−
をコードする33塩基からなるDNAを32pで標識し
たものを用い、このプローブとハイブリダイズしたクロ
ーン12個を選択した。
換せしめ、2520株の形質転換体を得た。これらの形
質転換体について前述と同様な方法でコロニーハイブリ
ダイゼーション法により目的とするクローンの選択を行
った。ここではプローブとして前述したターミネータ−
をコードする33塩基からなるDNAを32pで標識し
たものを用い、このプローブとハイブリダイズしたクロ
ーン12個を選択した。
これらのクローンからミニプレツブ法でプラスミドII
NAを抽出した。BamHIとEcoRIによる消化で
950bPの断片を生じ、かつBamHIと5alIに
よる消化で980bpの断片を生ずるプラスミドを検索
した結果、10株のクローンが目的とするプラスミド(
第5図中に示すpDK−2)を有していた。
NAを抽出した。BamHIとEcoRIによる消化で
950bPの断片を生じ、かつBamHIと5alIに
よる消化で980bpの断片を生ずるプラスミドを検索
した結果、10株のクローンが目的とするプラスミド(
第5図中に示すpDK−2)を有していた。
実施例6
20KhGH−プラスミド DK 3 の(築トリプ
トファンプロモーターの塩基配列に関してはBenne
tt等による報告がある(Bercr+ett eta
l、、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci
、 73.2351−2355(197[1))、
この塩基配列に基づき、トリプトファンプロモーターの
一10%域とSO配列とを含む下記(vr)式に示され
るDNA断片を合成法により作成した。
トファンプロモーターの塩基配列に関してはBenne
tt等による報告がある(Bercr+ett eta
l、、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci
、 73.2351−2355(197[1))、
この塩基配列に基づき、トリプトファンプロモーターの
一10%域とSO配列とを含む下記(vr)式に示され
るDNA断片を合成法により作成した。
5°−AACTAGTACGCAAGTTCACGT3
’ −TTGATCATII、CGTTCAAGTGC
A上記のHpaI部位とEcoR1部位とを有するII
NA断片と、 pDKlより調製した950bPのEc
oRI / BamH工断片とをリガーゼ バッファ中
でT4 DNAリガーゼを用いて連結した0反応液から
エタノール沈殿によすDNAを回収し、このDNAにつ
いて、 Hpa IおよびBamHIを順次用いて消化
し、反応液から水飽和フェノール−クロロホルム混液お
よび水飽和エーテルで抽出を行ない、エタノール沈殿に
より980bp (1) Hpa I /BamHI断
片を得た。このHpa r/ Ba11)I I断片と
、p[]R720とHpa IとBamHIとで切断し
て調製したベクター断片とをリガーゼ バッファ中で7
4 DNAリガーゼを用いて連結した。
’ −TTGATCATII、CGTTCAAGTGC
A上記のHpaI部位とEcoR1部位とを有するII
NA断片と、 pDKlより調製した950bPのEc
oRI / BamH工断片とをリガーゼ バッファ中
でT4 DNAリガーゼを用いて連結した0反応液から
エタノール沈殿によすDNAを回収し、このDNAにつ
いて、 Hpa IおよびBamHIを順次用いて消化
し、反応液から水飽和フェノール−クロロホルム混液お
よび水飽和エーテルで抽出を行ない、エタノール沈殿に
より980bp (1) Hpa I /BamHI断
片を得た。このHpa r/ Ba11)I I断片と
、p[]R720とHpa IとBamHIとで切断し
て調製したベクター断片とをリガーゼ バッファ中で7
4 DNAリガーゼを用いて連結した。
これにより得られた連結反応液を用いてE、coliO
H−5株を形質転換したところ、形質転換体約5000
コロニーが得られた。これらの中からランダムに24株
を選択し、ミニブレツブ法でプラスミドDNAを抽出し
た。 HpaIとBamHIによる消化で980bP
の断片が生ずるプラスミドを検索した結果、19クロー
ンが目的のプラスミド(pDK3と命名、第5図参照)
を有していた。
H−5株を形質転換したところ、形質転換体約5000
コロニーが得られた。これらの中からランダムに24株
を選択し、ミニブレツブ法でプラスミドDNAを抽出し
た。 HpaIとBamHIによる消化で980bP
の断片が生ずるプラスミドを検索した結果、19クロー
ンが目的のプラスミド(pDK3と命名、第5図参照)
を有していた。
なお、上記p[lK3と実施例5で得たpDK2とは、
開始コドン(ATG)より上流側のSD配列を含む塩基
配列において、下記(rv’)式および(Vl’)式に
示す差異がある。
開始コドン(ATG)より上流側のSD配列を含む塩基
配列において、下記(rv’)式および(Vl’)式に
示す差異がある。
pDK2 : 5’ −GTTAACTAGT、A
CGGAGCT丁CGCTGCAGGTCGACGGA
GGAAGAATTG困 (IV’) pDK3 : 5’ −GTTAACTAGTACGC
AAGTTCACGTAAAAAGGGTAGAATT
C回(vr゛)(上記式中上線を付した部分はSD配列
を示す、) 実施例7 による20KhG)Iの 実施例5で得られたpDK2を用いてE、coli C
fiOOgalK−株を形質転換し、形質転換体E、c
oli 0800galK−(pDK2)を得た。また
、実施例6で得られたpDK3を用いてE、coli
Cl300 galK−株およびE、coliHB 1
01株を形質転換し、形質転換体E、coli C80
0gC80O(pDK3)およびE、coli HBI
OI(pDK3)を得た。
CGGAGCT丁CGCTGCAGGTCGACGGA
GGAAGAATTG困 (IV’) pDK3 : 5’ −GTTAACTAGTACGC
AAGTTCACGTAAAAAGGGTAGAATT
C回(vr゛)(上記式中上線を付した部分はSD配列
を示す、) 実施例7 による20KhG)Iの 実施例5で得られたpDK2を用いてE、coli C
fiOOgalK−株を形質転換し、形質転換体E、c
oli 0800galK−(pDK2)を得た。また
、実施例6で得られたpDK3を用いてE、coli
Cl300 galK−株およびE、coliHB 1
01株を形質転換し、形質転換体E、coli C80
0gC80O(pDK3)およびE、coli HBI
OI(pDK3)を得た。
これらの形質転換体をそれぞれ500緘三角フラスコに
含まれる100mQのMacConkey培地を用いて
22Orpm回転振とう培養器により37℃で培養し、
800nmの0.D、値0.5まで増殖させた1次いで
、各培養液ニインドーJl/ 7 ’) リに% (I
AA)を501L9/aQの濃度となるように添加し、
さらに培養を続けた。 pDK2を有するE、coli
C800galK−株は、18時間培養後、2.8謄
/mQの20KhGHを生成した。 pDK3を有する
E、coli C6tOOgalK−株は、6時間培養
後1’l’ 、h9 / IIIQ +7) 20Kh
GI(を生成した。マタ、p[lK3を有するE、co
li 08101株は、21時間培養後、lI3.4即
/戚の20KhGHを生成した。
含まれる100mQのMacConkey培地を用いて
22Orpm回転振とう培養器により37℃で培養し、
800nmの0.D、値0.5まで増殖させた1次いで
、各培養液ニインドーJl/ 7 ’) リに% (I
AA)を501L9/aQの濃度となるように添加し、
さらに培養を続けた。 pDK2を有するE、coli
C800galK−株は、18時間培養後、2.8謄
/mQの20KhGHを生成した。 pDK3を有する
E、coli C6tOOgalK−株は、6時間培養
後1’l’ 、h9 / IIIQ +7) 20Kh
GI(を生成した。マタ、p[lK3を有するE、co
li 08101株は、21時間培養後、lI3.4即
/戚の20KhGHを生成した。
実施例8
跋■四辺潴1
2文のMacCankey培地を有する5文三角フラス
コを用い、18(lrpmの回転振とう培養器にてpO
K3を有するE、coli C800galK−株を培
養した。 Boonsの0.D、値が0.5に到達した
時にIAAを50JIQ/緘になるように加え、さらに
6時間培養を行なった。
コを用い、18(lrpmの回転振とう培養器にてpO
K3を有するE、coli C800galK−株を培
養した。 Boonsの0.D、値が0.5に到達した
時にIAAを50JIQ/緘になるように加え、さらに
6時間培養を行なった。
培養液から遠心分離により菌体を実収し、80戚の30
mMリン酎カルシウム+1緩衝液(pH7,0) −1
mM PH9Fに懸濁し、超音波処理を2分間づつ4回
行なった。この溶液に最終濃度0.22になるようにポ
リエチレンイミンを加え、4℃t、 30,0OOrp
11で1時間遠心分離を行なった。
mMリン酎カルシウム+1緩衝液(pH7,0) −1
mM PH9Fに懸濁し、超音波処理を2分間づつ4回
行なった。この溶液に最終濃度0.22になるようにポ
リエチレンイミンを加え、4℃t、 30,0OOrp
11で1時間遠心分離を行なった。
次に、上澄から20%飽和ないし60%飽和の硫安で沈
殿する両分を集め、これを40緘の30mMリン酸カリ
ウム緩衝液(pH7,0) −1mM PMSFに溶解
し、透析チューブに入れ、同溶液に対して透析を行なっ
た。得られた標品をONセファ0−スCL−68のカラ
ムに供すると、非吸着画分と0〜0.13M Na1l
で溶出される両分とに20KhGHが検出された0両両
分について、それぞれDEAEセファロース0L−8B
、セファロースCL−f3Bおよび逆相カラムを用いた
HPLCのクロマトグラフィーにより精製を行なった。
殿する両分を集め、これを40緘の30mMリン酸カリ
ウム緩衝液(pH7,0) −1mM PMSFに溶解
し、透析チューブに入れ、同溶液に対して透析を行なっ
た。得られた標品をONセファ0−スCL−68のカラ
ムに供すると、非吸着画分と0〜0.13M Na1l
で溶出される両分とに20KhGHが検出された0両両
分について、それぞれDEAEセファロース0L−8B
、セファロースCL−f3Bおよび逆相カラムを用いた
HPLCのクロマトグラフィーにより精製を行なった。
5OS−ポリアクリルアミドゲルで判定した結果、8
5z以上の輔度を有する20KhGHを高収量で得るこ
とができた。
5z以上の輔度を有する20KhGHを高収量で得るこ
とができた。
第1図は、20KhGHのアミノ酸配列を示す図、第2
図は、20KhGHをコードするDNAの塩基配列を示
す図、第3図は20KhGH遺伝子のクローこングに用
いたプラスミドを示す図、第4図および第5図は、20
KbGHを発現するベクターの構築方法を示す図である
。
図は、20KhGHをコードするDNAの塩基配列を示
す図、第3図は20KhGH遺伝子のクローこングに用
いたプラスミドを示す図、第4図および第5図は、20
KbGHを発現するベクターの構築方法を示す図である
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ヒト20に成長ホルモンをコードするヒト細胞由来
のDNA配列を含む発現ベクターにより形質転換された
微生物を培養し、培養物中にヒト20に成長ホルモンを
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒト
20に成長ホルモンの製造方法。 2、ヒト20に成長ホルモンをコードするDNAが式(
I )で示されるDNAまたはその機能的に同等な誘導
体であることを特徴とする特許請求の範囲第1項に記載
の製造方法。 【遺伝子配列があります】 (式中XはTAA、TAGなたはTGTを表す。) 3、微生物が大腸菌であることを特徴とする特許請求の
範囲第1項または第2項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22951086A JPS6384500A (ja) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | ヒト20k成長ホルモンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22951086A JPS6384500A (ja) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | ヒト20k成長ホルモンの製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6384500A true JPS6384500A (ja) | 1988-04-15 |
Family
ID=16893306
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP22951086A Pending JPS6384500A (ja) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | ヒト20k成長ホルモンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6384500A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0753307A2 (en) * | 1995-06-29 | 1997-01-15 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Human growth hormone agent for adults |
EP0787497A3 (en) * | 1996-02-02 | 1999-04-14 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Pharmaceutical preparation containing human growth hormone |
-
1986
- 1986-09-30 JP JP22951086A patent/JPS6384500A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0753307A2 (en) * | 1995-06-29 | 1997-01-15 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Human growth hormone agent for adults |
EP0753307A3 (en) * | 1995-06-29 | 1999-06-09 | Mitsui Chemicals, Inc. | Human growth hormone agent for adults |
EP0787497A3 (en) * | 1996-02-02 | 1999-04-14 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Pharmaceutical preparation containing human growth hormone |
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