DK173952B1

DK173952B1 - Anvendelse af spergualinderivater til fremstilling af lægemidler med immunosuppressiv virkning

Info

Publication number: DK173952B1
Application number: DK198505216A
Authority: DK
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Masaaki Ishizuka; Teruya Nakamura; Fuminori Abe; Akio Fujii
Original assignee: Microbial Chem Res Found
Priority date: 1984-11-13
Filing date: 1985-11-12
Publication date: 2002-03-04
Also published as: DE3586649D1; IE852823L; ATE80613T1; JPS61129119A; JPH0414643B2; DE3586649T2; EP0181592A3; DK521685D0; ZA858659B; IE59251B1; DK521685A; EP0181592B1; EP0181592A2

Description

DK 173952 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af spergualinderivater til fremstilling af et lægemiddel med immunosuppressiv virkning.

Man kender et antal lægemidler roed immunosuppessive 5 virkninger. De omfatter alkyleringsroidler, antimetaboliter, antibiotica, steroider, folsyre-antagonister og plante-alkaloider.

Spergualin er en forbindelse, som er isoleret fra filtratet af en dyrkningsbouillon af spergualinproducerende 10 mikroorganismer af slægten Bacillus. Spergualins strukturformel er vist nedenfor:

NH

H2N-C-NH-(CH2)4-CHCH2C0NH-CHC0NH-(CH2)4-NH-(ch2)3-nh2 15 OH i)H

Spergualin er ikke kun virksomt mod museleukærai L-1210, museleukæmi EL-4, Ehrlich carcinom og sarcom 180, man viser også lovende aktivitet inden for kontrol af 20 ondartede tumorer, jvf. JP offentliggørelsesskrift nr.

48957/1982.

Der er blevet syntetiseret talrige spergualinfor-bindelser, som er mere stabile og har en stærkere antitumorvirkning, jvf. JP offentliggørelsesskrifter nr.

25 62.152/1983, 42.356/1984 og 76.046/1984. Blandt disse forbindelser er de forbindelser, der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse.

Det menes, at den immunosuppressive virkning af r steroider hovedsageligt opnås ved den antiinflammatoriske 30 virkning og opløsningen (lysen) af lumphocyter. Som det imidlertid er bekendt, har steroider varierende farmakologiske virkninger og forårsager mange bivirkninger. De andre immunosuppressive stoffer klassificeres som "cyto-toksiske" stoffer, og deres virkning er blandt andet rettet 35 imod nucleinsyresyntesevejene og kan ofte forårsage alvorlige bivirkninger på bloddannende organer. Man ønsker 2 DK 173952 B1 derfor at udvikle immunosuppressive lægemidler, der virker selektivt på lymphocyter og andre celler af immunologisk vigtighed, medens de samtidigt medfører minimale bivirkninger.

5 Den foreliggende opfindelse angår i overensstemmelse

hermed anvendelsen af spergualinderivater med formlen I

NH

H

1Q NH2-C-NH-H1-R2-CONH-R3-CONH-(CH2)]i-NH-(CH2)3-NH2 (I) hvori Rx er -(CH^g-, -^^-CH2-, -^Q^-(CH2)2- ler -CH2-/QV ; R2 er -(CH2)2- ler -CH=CH-; og Rj er

N—' OH

15 el- -CH-, -CHo- ler -CH- i d i OCH3 ch2oh eller farmakologisk acceptable salte deraf til fremstilling 20 af et lægemiddel med immunosuppressiv virkning.

Fortrinsvis anvendes forbindelser med formel I, hvori RX er -(CH2)4- eller -(CH2)6-; R2 er -(CH2)2-; (S) og R3 er -CH-, -CH2~ eller -CH- ;

25 OH OCH3 CH20H

forbindelser, hvori er -CH2~^Q^.- eller t 30 2~' , ' (S) R2 er -(CH2)2-; og R3 er -CH2~ eller -CH- · ch2oh eller forbindelser, hvori er -(CH2)4- eller -(CH2)6-·, r er 35 -CH=CH-(trans) og R3 er -CH- eller -CH-.

OH 0CH3 3 DK 173952 B1

Specifikke eksempler på de forbindelser, der kan anvendes som immunosuppressive midler ifølge den foreliggende opfindelse, er opført på nedenstående lister (1) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(7-guanidinoheptan- 5 amido)-2-hydroxyethanamid; (2) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(7-guanidinoheptan-amino)-2-methoxyethanamid; (3) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(9-guanidinononan-amido)-2-hydroxyethanamid; 10 (4) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(7-guanidinoheptan- amido)-ethanamid; (5) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(7-guanidinoheptan-amido)-(S)-2-hydroxymethylethanamid; (6) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[4-(p-guanidino- 15 phenyl)butanamido]ethanamid; (7) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[4-(p-guanidino-phenyl)-butanamido]-(S)-2-hydroxymethylethanamid; (8) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(3-(p-guanidino-methylphenyl) propanamido]- (S) -2-hydroxymethylethan- 20 amid, (9) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-[5-(p-guanidino-phenyl) -pentanamido] - (S) -2-hydroxymethylethanamid; (10) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[7-guanidinohepta--2-enamido]-2-methoxyethanamid; og 25 (11) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[7-guanidinohepta- • -2-enamido]-2-hydroxyethanamid.

Disse forbindelser har de strukturformler, der er vist i'tabel I.

30 35 4 DK 173952 B1

Tabel I

Kemiske strukturformler for typiske eksempler på forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse

NH

NH2-é-NH-R1-R2-CONH-R3CO-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2 Forbindelse nr. R·^ R2 R3 (1) -(CH2)il- -(CH2)2- -CH-

OH

(2) -(CH2)4- -(CH2)2- -CH- och3 (3) -(ch2)6- -(ch2)2- -ch-

OH

(il) -(CH2)r -(CH2)2- -CH2- (S) (5) -(ch2)4- -(ch2)2- -ch- ch2oh (6) -<g>H2- -(ch2)2- -ch2- /—\ (S) (7) \0/ H2" "(CH2)2" "fH" N-' ch2oh /—Λ (S) (8) "(CH2)2“ "?H" v ch2oh /—\ <s) (9> -tCH2)2- -CH-

V^7 CHjOH

5 DK 173952 B1

Forbindelse nr. ^2 ^3 5 (10) -(CHgV -CH=CH- -CH-

(trans) OH

(11) -(ch2)6- -CH=CH~ -ch-

(trans) OH

10

Forbindelserne med formlen I kan danne salte med syrer. Salt-dannende syrer kan være uorganiske eller organiske, hvis de er fysiologisk acceptable. Foretrukne uor-15 ganiske syrer er saltsyre, svovlsyre, salpetersyre og phos-phorsyre; foretrukne organiske syrer omfatter eddikesyre, propionsyre, ravsyre, fumarsyre, maleinsyre, æblesyre, vinsyre, glutarsyre, citronsyre, benzensulfonsyre, toluen--sulfonsyre, methansulfonsyre, ethan-sulfonsyre, propan-20 sulfonsyre, aspartinsyre og glutaminsyre.

Blandt de forbindelser, der er opført på ovenstående liste, er 1 og 3 kendte og beskrevet i japansk offentliggørelsesskrift nr. 62.152/1983; forbindelserne 4 og 5 er også kendte og beskrevet i japansk offentliggørelses-25 skrift nr. 42.356/1984; forbindelserne 10 og 11 er også kendte og beskrevet i japansk offentliggørelsesskrift nr. 76.046/1984. Disse kendte forbindelser kan syntetiseres ved kendte fremgangsmåder.

T

Når forbindelserne, der kan anvendes ifølge den forelig-30 gende opfindelse, anvendes som immunosuppressive stoffer, indgives de enten hver' for sig eller i blanding med strækkemidler og bærere til dannelse af injektionsvæsker, orale præparater eller suppositorier. Farmaceutisk acceptable strækkemidler og bærere bør udvælges ved og deres art og sammen-35 sætning er bestemt af indgiftsvejen og -fremgangsmåden. Il- 6 DK 173952 B1 lustrative eksempler på væskebærere omfatter vand, alkoholer samt animalske, vegetabilske og syntetiske olier, såsom sojabønneolie, jordnøddeolie, sesamolie og mineralolier. Eksempler på fåste bærere omfatter sukkerarter såsom mal-5 tose og saccharose/ aminosyrer, cellulosederivater såsom hydroxypropylcellulose, og organiske syresalte såsom mag-nesiumstearat. Bærere, der er egnede til anvendelse ved fremstilling af injektionsvæsker, omfatter fysiologisk saltvand, pufferopløsninger, opløsninger af sukkerarter såsom 10 glycose, inositol og mannitol, og glycoler såsom ethylen-glycol, propylenglycol og poly(ethylenglycol). Alternativt kan man fryse-tørre forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse sammen med strækkemidler såsom sukkerarter (eksempelvis inositol, mannitol, glycose, mannose, maltose 15 og saccharose) og aminosyrer (eksempelvis phenylalanin).

Forud for intravenøs injektion opløses sådanne fryse-tørrede forbindelser i egnede opløsningsmidler såsom steriliseret vand, fysiologisk saltvand, glycoseopløsning, elek-trolytopløsning og aminosyre-opløsning. Indholdet af for-20 bindeiserne ifølge den foreliggende opfindelse i det immunosuppressive middel varierer med den specifikke type præparat, og det varierer almindeligvis fra 0,1 til 100 vægt-%, fortrinsvis fra 1 til 98 vægt-%. For injektionsvæsker varierer indeholdet af den aktive bestanddel almindeligvis 25 fra 0,1 til 30 vægt-%, fortrinsvis fra 1 til 10 vægt-%.

Til oral indgift kan forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, blandes med en hvilken som helst af de faste eller væskeformige bærere, der er angivet ovenfor, f og anvendes i form af tabletter, kapsler, pulvere, granula-30 ter, væsker eller tørre sirupper ("dry syrups"). For kapsler, tabletter, granulater og pulvere varierer indeholdet af den aktive bestanddel almindeligvis fra 5 til 100 vægt-%, fortrinsvis fra 25 til 98 vægt-%.

Doseringen af det immunosuppressive stof, der indeholder 35 forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, som den aktive bestanddel, bør fastsættes på rette må- 7 DK 173952 B1 de, afhængig af patientens alder og legemsvægt, samt sygdommens alvorlighed og art. Den effektive dosis varierer almindeligvis fra 1 til 100 mg pr. kg pr. dag ved parenteral indgift, og fra 5 til 500 mg pr. kg pr. dag ved o-5 ral indgift.

Forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, karakteriseres ved relativ lav toksicitet og lille akkumulering af toksicitet ved kontinuert indgift. LD5o-vær-dierne for forbindelserne 1 til 11 ved en enkelt intraperito-neal indgift til mus er vist i tabel II.

Tabel II

Giftighed over for mus 15 Forbindelse nr. LD50 (mg/kg) (1) 25 - 50 (2) - 12.5 - 25 (3) 12.5 - 25 20 (il) 12.5 - 25 (5) 12.5 - 25 (6) 25 - 50 (7) 25 - 50 (8) 25 - 50 25 ( 9 ) 25 - 50 (10) 25 - 50 (11) 25 ~ 50 30 Forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, udøver hæmmende virkninger på funktionen af lympho-cyter af immunologisk betydning. Forsøg ved fremgangsmåden ifølge Waithe et al., (Waithe et al., Handbook of Experimental Immunology, side 26.1, 1978), viser, at forbindelserne, der kan 35 anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, mærkbart hæmmer den med concanavalin A (Con A) stimulerede T-lymphocytbiastoge- 8 DK 173952 B1 nese og har virkning på den med lipopolysaccharid (LPS) stimulerede B-lymphocytbiastogenese. Derfor har man udført in vivo forsøg for at undersøge virkningerne af forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, på T-lym-5 phocyter. Først undersøges forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, i overensstemmelse med Lagrange et al. fremgangsmåden (Lagrange et al., Journal of Experimental Medicine, 139, 528-542, 1974), for deres virkninger på langsomt reagerende allergiformer hos mus, som er blevet 10 sensibiliserede med røde blodlegemer fra får. Den langsomt reagerende allergiform kan blokeres ved indgift af forbindelsen i tre på hinanden følgende dage efter sensibiliseringen med røde blodlegemer fra får. Yderligere kontrolleres forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, i 15 overensstemmelse med Jerne et al. fremgangsmåden (Jerne et al., Cell-bound Antibodies, s. 109-122, 1963), for deres virkninger på den plaque-dannende evne hos miltceller fra mus, der er sensibiliserede ved hjælp af antigene røde blodlegemer fra får. Forbindelserne, der kan anvendes ifølge den forelig- ΡΠ gende opfindelse^ viser også blokerende virkninger ved denne afprøvning. Det er derfor godtgjort, at forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, viser hæmmende virkning på antistof-produktionen med B-lymphocyter.

De ovennævnte data viser evnen hos forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, til at hæmme B- og T-lymphocyternes funktioner. De hæmmede B- og T-lym-phocyter er ensbetydende med henholdsvis suppressionen af humoral immunitet og suppressionen af celle-formidlet immuni-

T

tet. Derfor er de immunosuppressive stoffer, der indeholder forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, som den aktive bestanddel, særdeles effektive med hensyn til undertrykkelse af vævsafstødning, som følger en organ- eller hudtransplantation, sandsynligvis på grund af en unormal forøget humoral eller cellulær immunitet. Forbindel-35 serne kan også anvendes til behandlingen af sygdomme, der først og fremmest forårsages af forskellige former for au- 9 DK 173952 B1 i [ toimmunitet, som rheumatisme og allergiske sygdomme. Forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, har tilsyneladende en anden virkningsmekanisme end de immunosuppressive stoffer, der tilhører den kendte teknik, og har 5 derfor ikke de alvorlige bivirkninger, såsom fremkaldelse af sygdom i bloddannende organer, der fremkaldes af alle immunosuppressive stoffer, der er klassificerede som cyto-toksiske stoffer, eller udviklingen af mavesår og catarac-ter, som ofte følger indgiften af steroide hormoner.

10 De følgende forsøgsresulater er tilvejebragt til yderligere belysning af de farmakologiske virkninger af forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse.

15 Afprøvning-eksempel 1

Hamming af langsomt reagerende allergiform hos mus, sensibiliseret af røde blodlegemer fra får.

Hun-CDFl mus (8 uger gamle) sensibiliseres ved 5 hjælp af intravenøs indsprøjtning af 1 x 10 røde blod-20 legemer fra får. Fire dage senere injiceres de sensibiliserede mus subcutant i en trædepude på en pote med 1 x

Q

10 røde blodlegemer fra får for at inducere den langsomt reagerende allergiform. Hævelsen af trædepuden under poten måles 24 timer efter med et mikrometer. Hver af for-25 søgsforbindelserne indgives intraperitonealt i de mængder (mg pr. kg), der er angivet i tabel III, i en periode på 3 dage, som starter dagen efter den første sensibilisering.

Graden af hævelse i trædepuden under poten angives i re- % lative værdier, idet værdien for et kontroldyr, der har 30 fået fysiologisk saltvand i stedet for forsøgsforbindelserne, sættes til 100%. Resultaterne er vist i tabel III, ud fra hvilke man kan se den store evne hos forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, til at hæmme den langsomt reagerende allergiform.

35 10 DK 173952 B1

Tabel III

Hæmning af den langsomt reagerende allergiform

Forbindelse TrædepudehæveIse (%)_ 5 ! nr. 0.20 1θ.39 0.78 1.56 3.13 16.25 ' 12.5_ 25 i i _U)___72___87 29__15 _ (2) __99_____49__5*5______ (3) 55_ 32 11 10 7?) 99 Hl " 46' (5) ~~8T~ 117 ' ~58__~ (6) _’ _______________________102J___33 (7) ______________J54j___42 "(8) ________50__20 _ 15 J9)__ 45 52 '_ (10) ________37__6«0_ (11) _“______, 40 _

Spergualin 106 28 20 ________________

Sontroldyr 100 100 100 100 IOO 100 100 100 (fysiologisk saltvand) 25

Afprøvnings-eksempel 2 Hæmning af virkningen på den med Con A inducerede t T-lymphocytblastogenese.

30 Miltceller fra BALB/C mus fordeles mellem fordyb ninger i en mikroplade, således at hvert rum indeholder 2 x 105 celler pr. 0,2 ml. Hver af de udvalgte forsøgsforbindelser sættes til alle fordybninger undtagen en, idet den sidstnævnte anvendes som kontrol. 5 mikrogram pr. ml 35 Con A sættes til alle fordybninger, og de således fremstillede celle-suspensioner dyrkes i et 5%' s CC^-varmeskab 11 DK 173952 B1 i 72 timer ved 37°C. 8 timer før, at inkuberingen er til-endebragt, sættes l^uCi H-thymidin til hver fordybning, og optagelsen af thymidinet i de dyrkede celler måles med en væske-scintillations-tæller for at vurdere forløbet af 5 virkningen af T-lymphocytblastogenesen. Den procentvise hæmning af genesen med hver af forsøgsforbindelserne beregnes ved: (1 - Bdpm/Adpm) x 100, hvori Adpm angiver det samlede tal for optagelsen ved tilsætning' af udelukkende Con A, og Bdpm angiver det samlede tal ved tilsæt-10 ning af både Con A og forsøgsforbindelsen. Resultaterne er vist i tabel IV.

Tabel IV

Hæmning af virkningen på den med Con A inducerede T-lympho-15 cytblastogenese Hæmning, % deufnr?rbin' W0 »«*1 (D 93 100 20 99 100 ¢5) 96 100 (6) 99 100 (8) 79 100 (11) 88 100 25

Kontrol 0 0 (ikke tilsat nogen forbindelse)

Som det ses ud fra tabel IV, har forsøgsforbindel-30 serne nr. 1, 4, 5, 6, 8 og 11, der anvendes ifølge den fore-liggende opfindelse, en stærk evne til at hæmme virkningen af T-lymphocytblastogenesen.

Afprøvning-eksempel 3 35 Hæmning af virkningen på den med LPS inducerede B-lymphocytblastogenese.

Optagelsen af 3H-thymidin i B-celle-blaster måles 12 DK 173952 B1 i overensstemmelse med den. fremgangsmåde, der er anvendt i afprøvnings-eksempel 2, bortset fra, at induceringsmidlet Con A ombyttes med lOOyug pr. ml LPS fra E.coli. Den procentvise hæmning af blastogenesen med udvalgte forsøgsforbin-5 delser bestemmes også ved den samme fremgangsmåde, som er anvendt i afprøvnings-eksempel 2. Resultaterne er vist i tabel V, ud fra hvilken man kan se, at forbindelserne nr. l, 4, 5, 6 og 11r der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, er yderst effektive i undertrykkelse af den LPS-induce-10 rede genese af B-lymphocytblaster.

Tabel V

Hæmning af med LPS induceret genese af B-lymphocyt-blaster 15 Forsøgsforbin- Hæmning, ^ delse nr. 10 ug/ml 100 ug/ml (1) '98 100 O) 100 100 20 (5) 88 100 (6) 96 100 (11) 98 100

Kontrol 0 0 25 (ikke tilsat nogen forbindelse)

Afprøvning-eksempel 4 Hæmning af produktion af antistoffer mod røde blodlegemer fra får.

30

Hun-CDFl mus (fra 6 til 10 uger gamle) immunisere

O

ved intravenøs injektion af 1 x 10 røde blodlegemer fra får. Til musene indgives der intraperitonealt 12,5 mg pr. kg pr. dag af udvalgte forsøgsforbindelser i en periode på 3 dage, som starter dagen efter den intravenøse injektion.

35 4 dage senere isolerer man miltceller fra musene, og antallet af plaque-dannende celler tælles. Den procentvise hæm- 13 DK 173952 B1 ning af antistofproduktionen beregnes ved (1 - B:A) x 100, hvori A er optællingen for en kontrolgruppe (der har fået fysiologisk saltvand) og B er optællingen for den behandlede gruppe, forbindelserne nr. 1, 2, 4, 5 og 6 viser 5 hænninger på henholdsvis 98,5%, 95,9%, 89,4%/ 89,4% og 92,9%.

Som det tydeligt fremgår af den ovennævnte beskrivelse, har forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse,' en relativ lav toksicitet (LD5Q-værdien ligger mellem 12,5 og 50 mg pr. kg) og viser gode immunosup-10 pressive virkninger, såsom hæmningen af den langsomt reagerende allergiform, hæmningen af T- og D-lymphocyters funktioner og hæmningen af produktionen af antistoffer mod røde blodlegemer fra får. Forbindelserne, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, har tilsyneladende en anden virknings-15 mekanisme end de immunosuppressive stoffer, der tilhører den kendte teknik, og på grund af denne kendsgerning kan man fremstille immunosuppressive midler med færre bivirkninger ud fra forbindelserne,-der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse.

20 De følgende eksempler er tilvejebragt til yderli gere belysning af den foreliggende opfindelse.

Eksempel 1.

Tredive vægtdele af et hydrochlorid af forbindel-25 se nr. 1 blandes med renset vand til i alt 2000 dele. Opløsningen sendes igennem et millipore-filter af GS-typen til sterilisation. To gram af filtratet hældes i 10 ml hætteglas og fryse-tørres til fremstilling af injektionsvæsker, der hver indeholder 30 mg af hydrochloridet af 30 forbindelse nr. 1 pr. hætteglas.

Eksempel 2: Granula

En omhyggelig blanding af 50 vægtdele af et hydrochlorid af forbindelse nr. 2, 600 dele lactose, 330 dele 35 krystallinsk cellulose og 20 dele hydroxypropylcellulose komprimeres med Roller Compactor® og formales til partikler, som sigtes til tilvejebringelse af granula med en 14 DK 173952 B1 størrelse på mellem 16 og 60 mesh.

Eksempel 3: Tabletter

En blanding af 30 vægtdele af et hydrochlorid af 5 forbindelse nr. 3/ 120 dele krystallinsk lactose, 147 dele krystallinsk cellulose og 3 dele magnesiumstearat forarbejdes i en V-type tabletmaskine til fremstilling af tabletter, der hver vejer 300 mg.

De følgende sammenligningseksempler er angivet 10 for at vise fremgangsmåderne til syntetisering af de her omhandlede forbindelser, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse. I sammenligningseksemplerne er diZ, TAD og GP hhv. dibenzyloxycarbonyl, triazadecan og guanidinophenyl.

15 Sammenligningseksempel· 1 N- [4- (3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[4-(p-guanidinophenyl)-butanamido]-2-hydroxymethylethanamid (forbindelse nr. 7) (1) N- [4- (3-benzyloxycarbonylaminopropyl) benzyloxy- 20 carbonylaminobutyl]-2-[4-(p-guanidinophenyl)butan-amido]-2-benzyloxymethylethanamid 1,26 g (4,89 mmol) brunt krystallinsk 4-(4-GP)-bu- tyrathydrochlorid opløses i 20 ml dimethylformamid. Til den 25 is-afkølede opløsning sættes der 0,68 g (5,87 mmol) N-hy-droxysuccinimid og 1,20 g (5,87 mmol) N,N*-dicyclo-hexyl-carbodiimid, og blandingen henstår natten over ved stuetemperatur. Det udfældede Ν,Ν'-dicyclohexylurinstof filtreres fra, og filtratet anvendes straks i den følgende -30 reaktion. 3,54 g (6,00 mmol) af en bleggul olie af 10-(0--benzyl-L-ceryl)-1,5-diZ-l,5,10-TAD opløses i 30 ml dime thylformamid. Til den is-afkølede opløsning sættes der 0,61 g (6,00 mmol) triethylamin. Efter tilsætning af den særskilt fremstillede dimethylformamid-opløsning af N-hy- 35 droxysuccinimidesteren af 4-(4-GP)butyrathydrochlorid henstår blandingen natten over ved stuetemperatur. Reak 15 DK 173952 B1 tionen inddampes under vakuum, og den olieagtige remanens opløses i en blanding af 150 ml ethylacetat og 150 ml chloroform. Opløsningen vaskes på hinanden følgende med 5%'s vandig natriumcarbonat-opløsning, 0,5 N saltsyre og 5 mættet vandig natriumchlorid-opløsning. Det organiske lag tørres over vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet filtreres fra. Ved inddampning af filtratet under vakuum får man slutforbindelsen som en bleggul olie i en mængde på 4,10 g (udbytte: kvantitativt).

10 Tyndtlagschromatografi (T.L.C.) (chloroform/metha- nol/17%'s vandig ammoniak-opløsning i volumenforholdet 6:1,5:0,25)

Rf = 0,16.

4-(4-GP)butyrathydrochloridet fremstilles ved den 15 følgende fremgangsmåde.

1,60 g (8,93 romol) brunt krystallinsk 4-(4-amino-phenyl)smørsyre opløses i 40 m^ tetrahydrofuran. Til opløsningen sættes der 2,70 g (13,4 mmol) af et nitratsalt af l-amidino-3,5-dimethylpyrazol og 2,19 g (17,0 mmol) 20 Ν,Ν-diisopropylethylamin, og blandingen underkastes opvarmning natten over ved tilbagesvaling. De udfældede krystaller isoleres ved filtrering og vaskes på hinanden følgende med acetone, methanol og tetrahydrofuran. De tørrede brune krystaller suspenderes i 10 ml destilleret 25 vand, og der tilsættes 1 N saltsyre, indtil krystallerne er fuldstændigt opløste. Efter inddampning til tørhed under vakuum vaskes remanensen to gange, hver gang med ether og acetone, hvorved der fås 1,54 g brune krystaller (udbyt- t te: 67,0%) . Smeltepunkt 157-160°C.

30 (2) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[4-(p-guanidino- phenyl)butanamido]-2-hydroxymethylethanamid 4,06 g (4,89 mmol) af en bleggul olie af N-[4-(3-35 -benzyloxycarbonylaminopropyl)benzyloxycarbonylaminobutyl]--2-(7-guanidinophenyl)butanamido]-2-benzyloxymethylethan-amid hydrochlorid opløses i en blanding af 50 ml methanol 16 DK 173952 B1 og 30 ml eddikesyre. Efter tilsætning af 0,4 g palladium--sort opvarmes opløsningen til 55°C, og ved denne temperatur gennemføres katalytisk reduktion i 6 timer ved atmosfærisk tryk! Efter at reaktionen er tilendebragt, 5 filtreres katalysatoren fra, og filtratet inddampes under vakuum, hvorved man får 2,80 g af et olieagtigt produkt. Olien opløses i 25 ml 0,3 molær natriumchlorid-op-løsning i 60 volumenprocent vandig methanol, og opløsningen ledes gennem en søjle med 350 ml CM-Sephadex^ C-25 10 (Na+), som er ækvilibreret med det samme opløsningsmiddel.

Søjlen elueres med graduentelueringen mellem 2,000 ml 0,3 molær natriumchlorid-opløsning i 60 volumenprocent vandig methanol og 2,000 ml 0,1 molær natrium-chlorid i 60 volumenprocent vandig mehtanol. De fraktio-15 ner, der indeholder slutforbindelsen, opsamles og inddampes til tørhed under vakuum. Der sættes methanol til remanensen, og det uopløselige natriumchlorid filtreres fra.

Den fremkomne o-Lie renses ved den følgende fremgangsmåde.

For at fjerne den lille mængde resterende natrium-20 chlorid opløses olien i 5 ml methanol, og opløsningen ledes gennem en søjle, fyldt med 100 ml Sephadex® LH-20, fulgt af eluering med methanol, opsamling af de aktive fraktioner og inddampning heraf under vakuum. For at fjerne den lille mængde stadigt tilbageblevne urenheder op-25 løses olien i 5 ml destilleret vand, og opløsningen ledes gennem en søjle, fyldt med 80 ml HP-20® {produkt fra Misubishi Chemical Industries Limited), fulgt af eluering med destilleret vand, opsamling af de aktive fraktioner og inddampning deraf under vakuum. Den fremkomne olie op-30 løses i 5 ral destilleret vand, og det uopløselige stof filtreres fra. Filtratet frysetørres, hvorved man får 1,17 g af slutforbindelsen (udbytte: 44,0%).

T.L.C. (n-propanol/pyridin/vand/eddikesyre i .volumenforholdet 6:4:3:2).

35 Rf = 0,34.

ra]J9'5-13,0°C (C = 1,17, H20) 17 DK 173952 B1

Sammenligningseksempel 2 N-[4- (3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[4-(p-guanidinophenyl)-butanamido]-ethanamid (forbindelse nr. 6)

5 (1) 10-(N,N1-phthalylglycyl)-1,5-diZ-l,5,10-TAD

12,4 g (30,0 mmol) 1,5-diZ-l,5,10-TAD opløses i 200 ral tetrahydrofuran. Til den is-afkølede opløsning sættes der 4,90 ml (35,0 mmol) triethylamin og 10,6 g 10 (35,0 mmol) af en ester af phthalylglycin og N-hydroxysuc- cinimid, og blandingen henstår natten over ved stuetemperatur.

Reaktionsblandingen inddampes til tørhed under vakuum, og remanensen opløses i 1200 ml ethylacetat. E-15 thylacetat-opløsningen vaskes på'hinanden følgende med 5%’s vandig natriumhydrogencarbonat-opløsning, 0,5 N saltsyre og mættet vandig natriumchlorid-opløsning. E-ethylacetat-laget tørres på vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet filtreres fra, mens filtratet inddampes un-20 der vakuum. Til den fremkomne remanens sættes der ethyl-acetat og ethylether, og de fremkomne krystaller isoleres ved filtrering og tørres, hvorved man får 14,6 g af slutforbindelsen (udbytte: 81,0%). Smeltepunkt 102-104°C.

T.L.C. (chloroform/methanol/eddikesyre i volumen-25 forholdet 95:5:3).

Rf = 0,4.

(2) 10-glycyl-l,5-diZ-l,5,10-TAD

5° Til 14,4 g (24,0 mmol) 10-(Ν,Ν-phthalylglycyl)- -1,5-diZ-l,5,-10-TAD sættes der 370 ml ethanol og 6,00 g (120 mmol) hydrazinhydrat, og blandingen tilbagesvales i 2 timer. Efter at reaktionen er tilendebragt, filtreres det uopløselige stof fra, og filtratet inddampes un-35 der vakuum. Den fremkomne olie opløses i 300 ml ethylace-tat, og opløsningen vaskes på hinanden følgende med 5%'s 18 DK 173952 B1 vandig natriumhydrogencarbonat-opløsning og destilleret vand. Ethylacetat-laget tørres på vandfrit natriumsulfat.

Efter frafiltrering af tørremidlet inddampes filtratet under vakuum, hvorved man får 12,5 g af slutproduktet som 5 en olie (udbytte: kvantitativt).

T.L.C. (chloroform/methanol/eddikesyre i volumenforholdet 95:5:3).

Rf = 0,10.

10 (3) N-[4-(3-benzyloxycarbonylaminopropyl)benzyloxy carbonylaminobutyl]-2-[4-(p-guanidinophenyl)butan-amido]ethanamid 1,56 g (6,05 mmol) af et brunt krystallinsk 4-(4-15 -GP)-butyrathydrochlorid opløses i 20 ml dimethylformamid.

Til den is-afkølede opløsning sættes der 0,84 g (7,26 mmol) N-hydroxysuccinimid og 1,50 g (7,26 mmol) N,N'-dicyclohexyl-carbodiimid, og. blandingen henstår ved stuetemperatur natten over. Det udfældede N,N'-dicyclohexylurinstof filtreres.

20 fra, og filtratet anvendes straks i den følgende reaktion.

2,59 g (5,5 mmol) af en bleggul olie af 10-glycyl--1,5-diZ-l,5,10-TAD opløses i 30 ml dimethylformamid. Til den is-afkølede opløsning sættes der 0,61 g (6,05 mmol) triethylamin. Efter tilsætning af den særskilt fremstillede 25 dimethylformamid-opløsning af esteren af 4-(4-GP)butyrathydrochlorid og N-hydroxysuccinimid henstår blandingen ved stuetemperatur natten over. Reaktionsblandingen inddampes under vakuum, og den fremkomne olieagtige remanens opløses i en blanding af 200 ml ethylacetat og 60 ml etha-30 nol. Opløsningen vaskes på hinanden følgende med 5%'s phos-phorsyre, 5%'s vandig natriumcarbonat-opløsning og mættet vandig natriumchlorid-opløsning. En hvilken som helst olie, der udskilles af opløsningen under vaskningen, opløses ved tilsætning af en lille mængde ethanol. Det or-35 ganiske lag tørres på vandfrit natriumsulfat. Efter fra-filtrering af tørremidlet, inddampes filtratet under vakuum, hvorved man får 3,30 g af slutforbindelsen som en 19 DK 173952 B1 bleggul olie (udbytte: 89,1%).

T.L.C. (chloroform/methanol/17%'s vandig ammoniak--opløsning i volumenforholdet 6:3,5:1).

Rf = o;59.

5 (4) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[4-(p-guanidino-phenyl)-butanamido]-ethanamid 3,30 g (4,90 mmol) a£ den bleggule olie, der er 10 fremstillet i 3), opløses i 40 ml eddikesyre. Til opløsningen sættes der 0,3 g palladium-sort, og blandingen opvarmes til 50°C, og ved denne temperatur gennemføres katalytisk reduktion i 10 timer ved atmosfærisk tryk. Efter at reaktionen er tilendebragt, filtreres katalysa-15 toren fra, og filtratet inddampes under vakuum, hvorved man får 2,10 g af en olie.

Olien opløses i 10 ml destilleret vand, og opløsningen ledes gennem en søjle, pakket med 220 ml CM-Sepha-dex® C-25 (Na+) . Søjlen elueres derpå ved hjælp af gra-20 dientelueringen mellem 1,100 ml destilleret vand og 1,100 ml af en vandig opløsning af 1,0 molær natriumchlorid-op-løsning. De fraktioner, der indeholder slutforbindelsen, opsamles og inddampes til tørhed under vakuum. Der sættes methanol til det tørre produkt, og det uopløselige natrium-25 chlorid filtreres fra.

Ved rensning ved hjælp af den samme fremgangsmåde, der er anvendt i sammenligningseksempel 1, fås 0,89 g af slutforbindelsen (udbytte: 35,3%).

T.L.C. (n-propanol/pyridin/vand/eddikesyre i vo-30 lumenforholdet 6:4:3:2).

Rf = 0,26.

35 20 DK 173952 B1

Sammenligningseksempel 3 N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- [4- (p-guanidinomethyl-phenyl)propanamido]- (S)-2-hydroxymethylethanamid (forbindelse nr. 8) 5 (1) N- [4- (3-ben'zyloxycarbonylaminopropyl) benzyloxy- carbonylaminobutyl]-2-]3-(p-guanidinomethylphenyl)-propanamido]-(S)-2-benzyloxymethylethanamid 10 Et gram (4,52 mmol) bleggule krystaller af 3—(4 — -guanidinomethylphenyl)propionsyre sættes i 4 til 5 små portioner til 3 ml is-afkølet thionylchlorid. Derefter underkastes blandingen en reaktion i 15 minutter under is-afkøling. Derefter inddampes reaktionsblandingen til 15 tørhed under vakuum. To gram (3,38 mmol) 10-(O-benzyl--L-ceryl)-1,5-diZ-l,5,10-TAD opløses i 10 ml dimethyl-formamid. Til den is-afkølede opløsning sættes der 0,92 g (9,04 mmol) triethylamin. Efter tilsætning af en opløsning i 4 ml dimethylformamid af det særskilt fremstillede 3- 20 -(4-GP)propionylchloridhydrochlorid underkastes blandingen en reaktion i 30 minutter under is-afkøling.

Reaktionsblandingen inddampes under vakuum, og den olieagtige remanens opløses i en blanding af 300 ml ethyl-acetat og 50 ml ethanol. Opløsningen vaskes på hinanden ΛΓ følgende med 5%'s phosphorsyre, 5%’s vandig natriumcar-bonat-opløsning og mættet vandig natriumchlorid-opløsning.

En hvilken som helst olie, der udskilles af opløsningen under vaskningen, opløses ved tilsætning af en lille mængde ethanol. Det organiske lag tørres over vandfrit natrium-30 sulfat. Efter frafiltrering af tørremidlet inddampes filtratet under vakuum, hvorved der fås 2,67 g af slutforbin-delsen som en bleggul olie (udbytte: kvantitativt).

T.L.C. (chloroform/methanol/17%1 s vandig ammoniak--opløsning i volumenforholdet 6:1,5:0,25).

35 Rf = 0,27.

Den 3-(4-guanidinomethylphenyl)propionsyre, der anvendes som udgangsmateriale, fremstilles ved den følgende fremgangsmåde.

21 DK 173952 B1 a) Methylester af 3-(4-aminomethylphenyl)propionsyre 4,30 g (22,97 mmol) hvide krystaller af methyl--3-(4-cyanophenyl)propenat opløses i 350 ml methanol, mættet med ammoniak. Til opløsningen sættes der 3 g 5 Raney-nikkel, og der tilføres et hydrogen-tryk på 60 atmosfærer i 2 timer ved stuetemperatur. Efter at reaktionen er tilendebragt, filtreres katalysatoren fra, og filtratet inddampes i vakuum, hvorved man får 4,02 g af en olie (udbytte: 90,54%).

10 T.L.C. (chloroform/methanol i volumenforholdet 10:1

Rf = 0,16.

(6) 3-(4-guanidinophenyl)propionsyre 15 3,70 g (19,14 mmol) af den olieagtige methylester af 3-(4-aminomethylphenyl)propionsyre opløses i 150 ml te-trahydrofuran. Til opløsningen sættes der 5,80 g (28,71 mmol) l-amidino-3,5-dimethylpyrazolnitrat og 4,70 g (36,37 mmol) Ν,Ν-diisopropylethylamin, og blandingen opvarmes 20 natten over ved tilbagesvaling. Reaktionsblandingen inddampes under vakuum, hvorved man får en olie. Denne olie omsættes med 70 ml 5%'s saltsyre i 3 timer ved tilbagesvaling. Reaktionsblandingen ledes gennem et filter, og filtratet is-afkøles. pH-værdien af filtratet indstilles 25 til 6,4 ved tilsætning af 10%'s vandig natriumhydroxid--opløsning. Det således indstillede filtrat omrøres i 30 minutter under is-afkøling. De udfældede krystaller isoleres ved filtrering og vaskes på hinanden følgende med destilleret vand og tetrahydrofuran. Ved tørring får man 30 2,85 g bleggule krystaller (udbytte: 67,4%). Smeltepunkt £ 300°C.

35 22 DK 173952 B1 (2) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[4-(p-guanidino-methylphenyl)propanamido]-(S)-2-hydroxymethylethan-amid 5 2,60 g (3,27 mmol) af den bleggule olie, der fås i eksempel 1) , opløses i en blanding af 40 methanol og 30 ml eddikesyre. Efter tilsætning af 0,20 g palladium--sort opvarmes opløsningen til 55°C, og ved denne temperatur gennemføres katalytisk reduktion i 5 timer med et 10 tryk på én atmosfære. Efter at reaktionen er tilendebragt, filtreres katalysatoren fra, og filtratet inddampes under vakuum, hvorved man får 1,8 g af en olie. Olien opløses i 10 ml destilleret vand, og opløsningen ledes gennem en søjle, pakket med 220 ml CM-Sephadex® C-25 (Na+) , fulgt 15 af eluering med gradientelueringen mellem 1,100 ml destilleret vand og 1,100 ml af en vandig opløsning af 1,2 molær natriumchlorid-opløsning. Fraktionerne, der indeholder slutforbindelserne, opsamles og inddampes til tørhed under vakuum. Der sættes methanol til det tørre produkt, 20 og det uopløselige natriumchlorid filtreres fra.

Ved at rense olien i overensstemmelse med den fremgangsmåde, der er anvendt i sammenligningseksempel 2, får man slutforbindelsen i en mængde på 0,84 g (udbytte: 47,2%).

Rf = 0,25.

25 [a]^9'5- 24,8°C (C = 1,0, H20).

Sammenligningseksempel 4 N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[5-(p-guanidinophenyl)-pentanamino]-(S)-2-hydroxymethylethanamid (forbindelse 30 nr. 9 ) 1 N- [4-(3-benzyloxycarbonylaminopropyl)benzyloxy-carbonylaminobutyl]-2-[5-(p-guanidinophenyl)- pentanamido]-(S)-2-benzyloxymethylethanamid 35 0,80 g (3,40 mmol) bleggule krystaller af 5-(4-GP)~ pentansyre og 1,80 g (3,05 mmol) af en bleggul olie af 10- 23 DK 173952 B1 -(O-benzyl-L-ceryl)-1,5-diZ-l,5,10-TAD behandles som i sammenligningseksempel 3, hvorved man får 2,42 g af slut-forbindelsen som en bleggul olie (udbytte: kvantitativt).

T.L.C.'(chloroform/methanol/17%1 s vandig ammoniak-5 -opløsning i volumenforholdet 6:1,5:0,25).

Rf = 0,38.

5-(4-GP)pentansyren fremstilles ved den følgende fremgangsmåde.

7.42 g (35,80 mmol) af en olie af methyl-5-(4-ami-10 nophenyl)pentanat behandles som i sammenligningseksempel 3, hvorved man får 3,72 g af slutforbindelsen som bleggule krystaller (udbytte: 44,1%), smeltepunkt 254-256°C.

(2) N- [4- (3-aminopropyl)aminobutyl]-2-[5-(p-guanidino-15 phenyl)-pentanamido]-(S)-2-hydroxymethylethanamid 2.42 g (3,00 mmol) af den bleggule olie, der er fremstillet i 1), behandles som i sammenligningseksempel 3, hvorved man får 0,69 g af slutforbindelsen (udbytte: 20 41,1%).

T.L.C. (chloroform/methanol/17%'s vanding ammoniak-opløsning i volumenforholdet 4:4:2).

Rf = 0,50.

T

Claims

24 DK 173952 B1 PATENTKRAV .
1. Anvendelse af spergualinderivater med formlen I NH
5 NH2-C-NH-R1-R2-CONH-R3-CONH-(CH2)il-NH-(CH2)3«NH2 (I) hvori er ~(CH2)^-, *-(CH2)g-, -^0^·"(βΗ2)2~ eller -CH2~/q\-; R2 er -(CH2)2- eller -CH=CH-i og R3 er 10 '—' -CH-, -CH-, -CH2- eller -CH-OH OCH3 CH2OH eller farmalogisk acceptable salte deraf til fremstilling 15 af et lægemiddel med immunosuppressiv virkning.
2. Anvendelse af en forbindelse med formlen I ifølge krav 1, hvori er -(CH2)4- eller -{CH2)g-; (S) R2 er -(CH2)2- og R3 er -CH-, -CH2- eller -CH-20 OH OCH3 CH2OH.
3. Anvendelse af en forbindelse med formlen I ifølge krav l, hvori R1 er -Æi}-CH2·' "CH2'<^5}' eller '(0)',CH2) 2-· (S) R0 er -(CH-)--; og R, er -CH0- eller -CH-30 2 22 3 2 , ch2oh.
4. Anvendelse af en forbindelse med formlen I ifølge krav 1, hvori R1 er -(CH2)4~ eller -(CH2)g->
35 R2 er -CH=CH-(trans) og R, er -CH- eller -CH- ^ I V OH OCH3.