DK173385B1 - Analogifremgangsmåde til fremstilling af oligosaccharidfraktioner eller oligosaccharider med specifik anti-Xa-aktivitet - Google Patents

Description

DK 173385 B1

Den foreliggende opfindelse angår én analogifremgangsmåde til fremstilling af oligosac-charidfraktoner eller oligosaccharider med specifik anti-Xa-aktivitet (Yin-Wessier).

Opfindelsen angår nærmere bestemt en analogifremgangsmåde til fremstilling af oligosaccharider (og de oligosaccharidfraktioner, som udgør dem), der har en meget selektiv 5 aktivitet over for aktiveret faktor X eller blodets faktor Xa, nemlig en kraftig antiihrom-botisk virkning uden at medføre blødningsrisici for patienten. Udtrykket "oligosac-charidfraktion" anvendes i beskrivelsen og kravene til betegnelse af en relativt homogen blanding af oligosaccharidfragmenter eller oligosaccharidkæder, der udgøres af et variabelt antal saccharidmolekyldele.

10 Med opfindelsen har man konstateret værdien af biologisk aktive oligcsaccharidfraktio-ner og oligosacchariderne selv, således som de fås fra heparin.

Det skal bemærkes, at udtrykket "heparin" anvendes i beskrivelsen og kravene i sin bredeste betydning til uden forskel at betegne et industrielt heparinpræpatat til farmaceutisk kvalitet og et råt heparin, som fås ved ekstraktion af biologiske materialer, især 15 pattedyrvæv.

Det er kendt, at heparin er et heterogent polysaccharid, for så vidt angår både sammensætningen af oligosaccharidkæderne og molekylvægten af disse kæder.

Det er ligeledes kendt, at det omfatter hovedsagelig 2-0-sulfat-L-iduronsyremolekyldele og N-sulfat-D-glucosamin (eventuelt 6-0-sulfateret)molekyldeIe og i mindre grad D-20 glucuronsyremolekyIdele, L-iduronsyremolekyldele og N-acetyl-D-glucosair in (eventuelt 6-0-sulfateret)molekyldele. Man ved desuden, at heparin udøver sin antikoagulerende virkning ved at forstærke inhibitorvirkningen af antitrombin ΠΙ (AT ΙΠ), som er et plasmaprotein, over forden række enzymatiske reaktioner, der igangsættes under koagulationen.

2 DK 173385 B1

Da heparin er i stand til samtidig at undertrykke et stort antal koagulationsfaktorer, der medvirker til skabelsen og opretholdelsen af forskellige former for hyperkoagulerbarhed, synes dets aktivitet ikke at være specifik, men derimod altomfattende.

Denne antikoagulerende virkning er ganske vist værdifuld, men gør det dog vanskeligt 5 at genskabe ligevægten i systemet koagulation-fibronolyse hos patienter under behandling, hvilket skyldes den altomfattende karakter af dets virkning. Følgen heraf er, at administration (med det formål at forebygge risiko for hyperkoagulation, f.eks. fremkomst af postkirurgiske tromboser) af meget store doser antikoagulerende lægemiddel eller utilstrækelig selektivitet af dette lægemiddel til slut kan føre til alvorlige blødnin-10 ger.

Dybtgående undersøgelser af de varierende betingelser for depolymerisation af heparin og af de fremkomne depolymerisationsblandinger har overraskende vist, at det er muligt, ved at arbejde under bestemte betingelser, at få blandinger, der omfatter oligosaccharider med værdifulde antitrombotiske egenskaber. Disse oligosaccharider er bedre end he-15 parin, for så vidt angår specificiteten af deres aktivitet. De er især i stand til at forøge den specifikke aktivitet af AT ΠΓ over for et mindre antal koagulationsfaktorer, mere specielt over for blodets faktor Xa. Specielt er det i forbindelse med opfindelsen konstateret, at sådanne fraktioner og oligosaccharider har en svag altomfattende antikoagulerende virkning som målt ved fremgangsmåden ifølge USP. Som følge heraf viser det 20 sig, at forholdet mellem deres anti-Xa-aktivitet, udtrykt i Yin-Wessler, og deres USP-titer er forhøjet. Det er faktisk mindst lig med 30.

Det vil erindres, at Yin-Wessler-aktiviteten nærmere betegnet er et udtryk for de aktive fraktioners evne til at forstærke hæmningen af blodets faktor Xa med AT ΙΠ ved den tilsvarende prøve, og USP-titeren er de aktive fraktioners evne til at hæmme den totale 25 koagulation af blod eller plasma.

3 DK 173385 B1

Yin-Wessler-titeren måles ved metoden, der er beskrevet i J. Lab. Clin. Med. 1976, 81, 298-300, og USP-titeren ved fremgangsmåden, der er beskrevet i "Pharmacopoeia of the United States of America", side 299 og 230 (se også andet supplement, U.S.P.-NF, side 62, og fjerde supplement, U.S.P., side 90, med titlerne henholdsvis "Drug Substances" 5 og "Dosage Forms").

Uventet har det således vist sig, at denne ønskede specifikke anti-Xa-aktivitet genfindes i korte oligosaccharidkæder, nemlig de, der ikke omfatter mere end 8 molekyldele, og som kan isoleres fra depolymerisationsblandinger under anvendelse af visse rensnings-operationer, der udføres under bestemte betingelser.

10 Det skal bemærkes, at udtrykket "saccharidmolekyldel", som anvendt i beskrivelsen og kravene, betegner de monosaccharider, der er indeholdt i heparinets kæder.

Undersøgelse ifølge opfindelsen af disse fraktioner og oligosaccharider har endvidere vist et aspekt af stor interesse, nemlig at denne anti-Xa-aktivitet, som målt ved Yin-Wessler-prøven, var ensbetydende med en antithrombotisk virkning in vivo.

15 Opfindelsen tilvejebringer derfor hidtil ukendte oligosaccharider og de fraktioner, som de omfatter, der har en forhøjet anti-Xa-aktivitet, og som med hensyn til faktor Xa har en bemærkelsesværdig selektivitet inden for rammerne af de på hinanden følgende enzymatiske reaktioner, som er karakteristiske for koagulationsprocessen.

Forbindelserne, som tilvejebringes ifølge opfindelsen, er aktive lægemiddelstoffer, der 20 især er i stand til at hæmme faktor Xa med en høj selektivitetsgrad, medens deres aktivitet ovei for den samlede koagulation kan holdes på et meget lavt niveau. Disse lægemidler kan med fordel anvendes til antithrombotiske behandlinger uden at medføre blødningsris ici.

4 DK 173385 B1

Analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at (a) heparin (eller heparinfraktioner), som har en antikoagulerende aktivitet og som omfatter kæder med molekylvægte på ca. 2.000-50.000, depolymeriseres eller fragmenteres til opnåelse af en reaktionsblanding, som indeholder oligosaccharid- 5 fragmenter eller oligosaccharidkæder, der består af højst 8 saccharidmolekyler og indeholder en specifik anti-Xa-aktivitetsansvarlig sekvens af højst 7 saccharidmole-kyldele, (b) reaktionsblandingen bringes i kontakt med AT ΙΠ for at absorbere eller tilbageholde i det mindste størstedelen, fortrinsvis praktisk taget alle oligosaccharideme, som har 10 en sekvens med en specifik struktur over for AT ΙΠ, og (c) de tilbageholdte oligosaccharidfragmenter og oligosaccharidkæder frigives.

De omhandlede oligosaccharider kan karakteriseres ved, at de har en specifik struktur, der er i stand til at forbinde sig med AT ΙΠ. De har en anti-Xa-aktivitet, som er større end heparinet og en meget svag samlet antikoagulerende virkning.

15 Produkterne, der har en affinitet til AT ΙΠ som udvundet ved den omhandlede analogi -fremgangsmåde, underkastes et eller flere trin for selektivt at fraskille de ovenfor defi-nrede oligosaccharider med korte kæder.

Denne adskillelse opnås hensigtsmæssigt ved fraktionering af blandingen af eluerede produkter, der har en affinitet til AT ΙΠ, efter deres molekylvægt og/eller deres iontæt-20 hed, og derefter ved udvinding af de ønskede fraktioner.

I en variant af fremgangsmåden kan man udføre fraktioneringen direkte på depolymeri-sationsblandingen. På dette stadium kan fraktionerne omfattende de korte oligosaccharidkæder, med fordel selve oligosaccarideme som sådanne, isoleres. Fraktionerne, eventu- i — 5 DK 173385 B1 elt oligosaccariderne, som har en høj affinitet til AT ΙΠ, fraskilles derefter, idet man benytter sig af et trin, der omfatter at bringe fraktionerne i kontakt med AT ΙΠ, som vist ovenfor.

01 igosacc harid fraktionerne fremstillet ifølge opfindelsen er af den type, der fås ved 5 anvendlese af de foran beskrevne forskellige trin. De er karakteristiske ved, at de er fri for oligosaccharider omfattende mere „end 8 saccharidmolekyldele, og at de udgøres af oligosaccharider, der ikke omfatter mere end 8 saccharidmolekyldele indeholdende en

O

sekvens, der omfatter mindre end 8 saccharidmolekyldele, som, i det mindste i vidt omfang, er ansvarlige for deres anti-Xa-aktivitet.

10 I en udføre Ises form ifølge opfindelsen er de opnåede fraktioner af den type, som kan fås ved en fremgangsmåde, ved hvilken heparinmaterialet depolymeriseres ved en kemisk proces, især med salpetersyrling (HN02) i vandigt medium.

Heparinkædeme overskæres så mellem en N-sulfat-glucosaminmolekyldel og den efterfølgende uronsyremolekyldel, hvilket medfører dannelse af kæder indeholdende en 2,5-15 anhydromannosegruppe i deres reducerende ende.

I en anden udførelsesform foretages depolymerisationen ad enzymatisk vej, med fordel med en højt renset heparinase, og især en heparinase af bakterieoprindelse.

Dette enzym fremkalder en overskæring af heparinkædeme mellem det uregelmæssige carbonatom i en N-sulfatglucosaminrest og den følgende uronsyremolekyldel.

20 Dets virkning frembringer en blanding af oligosaccharider (di-, tetra-, hexa-, octasac-charider), der har i det væsentlige et lige antal saccharidmolekyldele, og som er afsluttet i deres ikke-reducerende ende med en α,β-umættet uronsyre.

6 DK 173385 B1

Man udfører med fordel depolymerisationen med heparin, der er renset under betingelser, som muliggør opnåelse af de nævnte biologisk aktive oligosaccharider omfattende ikke mere end 8 saccharidmolekyIdele og, for visse af dem, ikke mere end 6 eller endog færre.

5 Disse forhold bevirker, at man når grænsen for den enzymatiske reaktion. De fremkomne oligosaccharider er med andre ord ikke mere følsomme for virkningen af højt renset heparinase.

De biologisk aktive oligosaccharider svarer således til de, der kan udskilles af de nævnte depolymerisationsblandinger (fremkommet ad kemisk eller enzymatisk vej) ved adsorp-10 tion på AT III, fikseret på en bærer, f.eks. AT III fikseret på agarose, under betingelser, der muliggør fiksering af produkterne, der har en affinitet til AT HI, medens de, der ikke har en sådan affinitet, fjernes, f.eks. ved vask.

Efter denne opration foretager man en eluering af de tilbageholdte eller adsorberende produkter for at udvinde og fraktionere dem med henblik på at isolere de korte kæder, 15 som har en anti-Xa-aktivitet.

Før denne operation, baseret på fraktionernes affinitet til AT HT, underkaster man eventuelt depolymerisationsblandingen en fraktionering, som allerede nævnt, for at fraskille de ønskede kæder. Man udfører med fordel en sådan separation ved gelpermea-tion (gelfiltrering).

20 Størstedelen af oligosaccharidkædeme som isoleret ovenfor er, foruden ved deres forhøjde affinitet til AT ΠΙ og som følge heraf deres anti-Xa-aktivitet, karakteristiske ved NMR-spektre, som bl.a. omfatter et karakteristisk signal i området ved det uregelmæssige carbonatom i stilling 2 i N-sulfat-glucosaminresteme (dette signal er mærket med en stjerne på fig. 5 og 6). Dette signal fremkommer ikke med heparin. Det kan sandsyn- 7 DK 173385 B1 ligvis tilskrives tilstedeværelse af en substituent på oxygenatomet i stilling 3, og især en 3-0-sulfatgruppe på N-sulfat-D-glucosaminresten.

Disse oligosaccharider er desuden karakteristiske ved en Yin-Wessler-titer og en USP-titer, som står i et forhold på mindst 30, fortrinsvis mindst 100.

5 De foretrukne oligosaccharidfraktioner og oligosaccharideme omfattende disse har en affinitet til AT ΠΙ og en anti-Xa-aktivitet (Yin-Wessler), som er større end hos heparin.

En sådan aktivitet kan være 10 gange større end hos heparin.

Aktiviteter større end 100 ui/mg kan iagttages for visse oligosaccharider. Værdier større end 700 ui/mg, eller endog mindst 1000 ui/mg, selv 1200, og som kan nå 2000 ui/mg 10 eller mere, er blevet iagttaget for andre oligosaccharider.

De aktive oligosaccharider fremstillet ifølge opfindelsen har en N-sulfat-D-glucosamin-rest, fortrinsvis 3-0-sulfateret (betegnet med F i den nedenfor anførte formel).

Andre oligosaccharider omfatter desuden en N-acetyl-D-glucosaminrest (D) og/eller en D-glucuronsyrerest (E) og/eller en 2-0-sulfat-L-iduronsyrerest (G) og/eller en N-sulfat-15 D-glucosaminrest (H).

Hos andre oligosaccharider iagttager man tilstedeværelse af følgende saccharidmolekyl-dele, nemlig 2-0-sulfat-4,5-umættet uronsyre (A) og/eller N-sulfat-D-glucosamin (B) og/eller L-iduronsyre (C).

De foretrukne oligosaccharider opnået ifølge opfindelsen har en N-sulfat-D-glucosamin-20 rest i deres reducerende ende. Denne rest er sulfateret eller ikke-sulfateret i stilling 3 og/eller 6.

Visse oligosaccharider indeholder alle de ovenfor angivne rester.

8 DK 173385 B1

Kolorimetrisk måling af N-acetylglucosaminmolekyldelene ved metoden ifølge Smith & Gilkerson, Annal. Biochem. 1979, 98, side 478-480, viser således tilstedeværelsen af ca. et molekyle N-acetylglucosamin pr. oligosaccharidkæde.

Måling af glucosamin før og efter sur hydrolyse gør det muligt at bestemme de respekti-5 ve mængder af N-sulfatglucosaminmolekyldele og N-acetylglucosaminmolekyldele.

Visse oligosaccharider fremstillet ifølge opfindelsen synes således karakteristiske ved tilstedeværelse af en N-acetyl-D-glucosaminmolekyldel til to N-sulfat-glucosaminmole-kyldele.

Andre oligosaccharider er karakteristiske ved tilstedeværelse af en N-acetyl-D-glucosa-10 minmolekyldel til tre N-sulfat-D-glucosaminmolekyldele.

Et oligosaccharid af denne type udgøres af et octasaccharid, der svarer til det, der har følgende rækkefølge ABCDEFGH: 9 DK 173385 B1 JL w /—V k «° Is ok D I w *-k. oy 5° 'cf 10 8 Μ I ° 15 li^jp o /V k o >o 20 '§ w w "V.

.^S-a 25 O k o

Li oJ

χ\ w p> r 30 - [8 « U O ^ 1 ro >» O Jr w w o ^V53 35 O K «

l_i O

Å o" §Os ‘ 10 DK 173385 B1 I denne formel er R et hydrogenatom eller en sulfatgruppe S03'.

Et andet octasaccharid har rækkefølgen ABGHCDEF.

Aktive hexasaccharider fremstillet ifølge opfindelsen omfatter ligeledes molekyl-dele blandt de nævnte A, B, C, E og H. Et af disse hexasaccharider har rækkefølgen 5 ABCDEF.

Et andet hexasaccharid har rækkefølgen CDEFGH, hvor C er en umættet uronsyre.

Endnu et andet hexasaccharid har rækkefølgen CDEFGH (hvor S er en iduronsyrerest).

Andre aktive oligosaccharider er pentasaccharider, især det, der har strukturen DEFGH.

Kortere oligosaccharidkæder, der stadig er biologisk aktive, kan ligeledes fremstilles 10 ifølge opfindelsen.

Analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af de ovenfor beskrevne fraktioner og oligosaccharider omfatter depolymerisation af heparin og behandling af den fremkomne depoIymerisationsbJanding for at fraskille fraktioner omfattende oligosaccharider, der består af højst 8 saccharidmolekyldele (fortrinsvis selve disse oligo-15 saccharider), som har en affinitet til AT ΠΙ, en forhøjet anti-Xa*aktivitet (Yin-Wessler) og en meget svag USP-titer.

Depolymerisationstrinnet udføres under forhold, der er indrettet til ikke at nedbryde oligosaccaridkædeme fuldstændigt og til at bevare de molekyldele, som i vidt omfang er ansvarlige for anti-Xa-aktiviteten (Yin-Wessler).

11 DK 173385 B1

Depolymerisationsbetingelserne ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde indstilles fortrinsvis på en sådan måde, at man bevarer evnen hos i det mindste en del af de fremkomne oligosaccharider til at blive tilbageholdt specifikt på immobiliseret AT ITT.

Disse betingelser vælges således, at man bevarer en anti-Xa-aktivitet (målelig ved Yin-5 Wesrler-prøven) hos i det mindste en del af de fremkomne oligosaccharider, idet deres antikoagulerende aktivitet ifølge USP-prøven er praktisk taget nul.

Naturligvis kande ovenfor beskrevne depolymerisationsbetingelser modificeres, men de synes fordelagtige, når man ønsker at opnå høje udbytter af oligosaccharider, der har en anti-Xa-aktivitet (Yin-Wessler).

10 Når man depolymeriserer heparin med HN02, synes det fordelagtigt at udfore reaktionen i et vandigt medium ved en pH-værdi af størrelsesordenen 2-4, fortrinsvis 3, og ved en temperatur i nærheden af omgivelsernes temperatur.

Når man depolymeriserer med en heparinase, anvendes fortrinsvis en højt renset hepari-nase, især en heparinase af bakterieoprindelse, og specielt en, der stammer fra Flavobac-15 terium heparinum. Man regulerer betingelserne for at opnå de korteste fragmenter, der stadig har en affinitet til AT ΙΠ og en anti-Xa-aktivitet (Yin-Wessler).

Man arbejder med fordel ved en pH-værdi af størrelsesordenen 6-8, især i nærheden af neutialitet, og ved en temperatur i nærhed af omgivelsernes. Man tilsætte) heparinase portionsvis til reaktionsblandingen, indtil hydrolysen er fuldendt.

20 Depolymerisationen med heparinase kan eventuelt udføres med fraktioner, der er fremkommet af oligosaccharidfraktioner, fremstillet efter nedbrydning af heparin med HN02.

Man kan ligeledes udføre den med oligosaccharider med højere molekylvægt, som er tilbageholdt på immobiliseret AT III, samtidig med de aktive oligosaccharider omfatten- 12 DK 173385 Bl de mindre end 8 molekyldele, og som er elueret med disse oligosaccharider med korte kæder.

Fraskillelsen og udvindingen af fraktioner indeholdende de ønskede oligosaccharider udføres med fordel ved kromatografi i en søjle indeholdende immobiliseret AT ΠΙ.

5 Tilfredsstillende resultater er opnået ved anvendelse af en industriel agarosegel under betegnelsen Sepharose, hvorpå der er immobiliseret AT ΠΙ-molekyldele.

For at opnå den ønskede adskillelse af størstedelen af produkterne indeholdt i polymerisationsblandingen, som har en høj affinitet til AT ΙΠ, bringes søjlen med fordel i ligevægt med en buffer, som har en ionstyrke på ca. 0,2 M, fortrinsvis over 0,1 M, ved en 10 pH-værdi på 6-8, fortrinsvis nær ved eller lidt over neutralpunktet.

Produkterne, der ikke har affinitet til AT ΙΠ, eller som kun har en meget svag affinitet til AT ΙΠ, fjernes ved vask med en buffer, der fortrinsvis er af samme type som den, der anvendes til at indstille ligevægten i søjlen.

En foretrukken udførelsesform til udvinding af produkterne, der er tilbageholdt eller 15 adsorberet på AT ΙΠ, og som har anti-Xa-aktivitet (Yin-Wessler), omfatter desorption og udvinding af alle oligosaccharideme ved eluering med en buffer, der har en tilstrækkelig ionstyrke til dette.

Bufferen, der anvendes til denne eluering, vælges så med fordel blandt dem, der ikke generer de endelige udvindingstrin (især alkoholudfældningen) af oligosaccharideme 20 indeholdt i de udvundne fraktioner.

En egnet buffer indeholder et calciumsalt såsom calciumchlorid, som forbliver opløseligt i nærværelse af en alkoholkoncentration (enhver egnet alkohol, f.eks. ethanol), der fremkalder udfældning af oligosaccharideme. Man kan ligeledes anvende et natriumsalt.

i 13 DK 173385 B1

Efter eluering af produkterne med affinitet til AT III er det fordelagtigt at udføre en alkoholudfældning for at udvinde produkterne, idet deres fraskillelse derpå udføres f.eks.ved centrifugering.

For at få oligosaccharidfraktioner, der har en kraftig anti-Xa-aktivitet (Yin-Wessler) og 5 en tilfredsstillende homogen karakter, bliver blandingen af alle oligosacchariderne der oprindeligt er tilbageholdt på AT ΙΠ, underkastet en fraktionering, fortrinsvis ved gelfiltrering eller ved ionbytningskromatografi eller begge dele eller ved enhver anden metode, som vil føre til lignende resultater.

Man udfører fortrinsvis gelfiltreringen således, at man først eluerer de største molekyler 10 og siden udvinder de mindste molekyler, idet man begynder med de fraktioner, der har en Yin-Wessler-titer og en USP-titer i et forhold på mindst 30 eller selv mindst 50, fortrinsvis 100 eller mere, idet udvindingen udstrækker sig til alle de resterende fraktioner, som endnu har en antikoagulerende virkning, i det mindste ved Yin-Wessler-prøven.

15 I afhængighed af de mængder opløsning, som underkastes gelfiltrering, vil man naturligvis vælge rumfangene af de i rækkefølge eluerede fraktioner for at tilbageholde de fraktioner, som er mest egnede til den ønskede anvendelse.

I en variant af fremgangsmåden fjerner man fra depolymerisationsblandingen før fikseringen på AT ΙΠ de oligosaccharider, som omfatter mere end 8 saccharidmolekyldele, 20 og dette gøres fortrinsvis ved gelfiltrering eller ved en lignende teknik, som ovenfor anført.

Af de fraktioner, der er elueret som ovenfor beskrevet, kan man fraskille de biologisk aktive oligosaccharider, nemlig octa-, hepta-, hexa-, penta-, tetra- og trisacchanderne.

14 DK 173385 B1

Farmakologiske undersøgelser af fraktionerne af oligosaccharider fremstillet ifølge opfindelsen har vist, at der eksisterer et forhold mellem deres anti-Xa-aktivitet, således som det er udtrykt i Yin-Wessler-enheder, og deres antithrombotiske aktivitet.

Disse fraktioner og oligosaccharider ser ud til at være i stand til at udøve en kraftig 5 antithrombotisk aktivitet. Som følge af deres svage antikoagulerende aktivitet, som praktisk taget endog kan være nul, er risikoen for blødninger med fordel praktisk taget elimineret.

Blandt de prøver, der er udført in vivo for at undersøge deres antithrombotiske aktivitet, er følgende prøve blevet udført på kaniner efter metoden ifølge Wessler m.fl. i J. of.

10 Appr. Physiol. 1959, 14, 943-946.

Man fremkalder dannelse af blodkoageler i halsvenen på kaniner ved at injicere et kompleks af aktiveret protrombin.

Man undersøger den forebyggende virkning af octasaccharidet ABCDEFGH, som har en Yin-Wessler-titer på 2000 enheder pr. mg. på dannelsen af blodkoageler ved at 15 injicere octasaccharidet før injektion af 25 enheder pr. kg af det trombogene kompleks.

Når man injicerer oligosacchariderne før det aktiverede protrombinkompleks i doser på 15-250 ui/mg (Yin-Wessler), får man en betydelig beskyttelse mod dannelse af blodkoageler.

Dette octasaccharid har altså en kraftig antitrombotisk aktivitet. Meget fordelagtigt kan 20 man ikke påvise nogen altomfattende antikoagulerende virkning.

Oligosaccharidfraktioneme opnået ifølge opfindelsen har ingen toksicitet. Administration med 10.000 u/kg (Yin-Wessler-titer) af en af fraktionerne opnået ifølge opfindelsen fremkalder ingen i 15 DK 173385 B1 toksisk reaktion hos kaniner og heller ingen pyrogen virkning ved prøven for pyrogenici -tet på kaniner ifølge den franske farmakopé.

Midlerne fremstillet ifølge opfindelsen er derfor særligt egnede til specifik kontrol med visse trin i koagulationen hos mennesker eller dyr, især når man ønsker at bevirke en 5 selektiv kontrol med aktiviteten af blodets faktor Xa (f.eks. hos patienter, som har været underkastet eller skal underkastes en operation i tilfælde af ateromatøse sygdomme, forstyrrelser af koagulationsmekanismen fra bakterieaktivatorer eller enzymatiske aktivatorer etc.).

Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen kan derfor anvendes til frembringelse af 10 farmaceutiske præparater, som indeholder de nævnte oligosaccharidfraktioner, eller oligosaccharideme selv med høj anti-Xa-aktivitet.

Der er især tale om farmaceutiske præparater, som ikke har pyrogene stoffer, og som indeholder en effektiv mængde af de aktive faktorer i forbindelse med farmaceutiske hjælpestoffer.

15 Især er der tale om midler, hvori den farmaceutiske bærer er egnet til administration ad oral vej. Administrationsformer, der er egnede til administration ad oral vej, kan med fordel være gastroresistente kapsler, tabletter eller piller.

Andre farmaceutiske midler omfatter disse oligosaccharider eller oligosaccharidfraktio-ner sammen med hjælpestoffer, der er egnede til administration ad rektal vej. Sådanne 20 administrationsformer udgøres af suppositorier.

Andre administrationsformer udgøres af aerosoler eller salver.

Med opfindelsen kan der også tilvejebringes injicerbare farmaceutiske midler, der er sterile eller steriliserbare.

16 DK 173385 B1

Disse opløsninger indeholder med fordel 1000-100.000 u (Yin-Wessler)/mI af oligo-saccharider eller oligosaccharidfraktioner, fortrinsvis 5000-50.000, f.eks. 25.000 u/ml, når disse opløsninger er beregnet til injektion ad subkutan vej. De kan indeholde f.eks. 500-10.000, især 5000 u/ml oligosaccharider eller oligosaccharidfraktioner, når de er 5 beregnet til injektion ad intravenøs vej eller ved perfusion.

Med fordel er sådanne farmaceutiske præparater i form af en éngangssprøjte, som er parat til brug.

Opfindelsen kan ligeledes føre til farmaceutiske midler indeholdende de nævnte oligosaccharider sammen med et andet aktivt stof, der især er anvendeligt til forebyggelse og 10 behandling af trombose, såsom et venotonisk middel som dihydroergotamin, et salt af nikotinsyre eller et trombotisk middel som urokinase.

Oligosaccharidfraktioneme og oligosacchariderne fremstillet ifølge opfindelsen er med fordel i form af salte af mindst et fysiologisk anvendeligt metal såsom natrium og/eller calcium og/eller magnesium.

15 De farmaceutiske midler er særligt egnede til kontrol (forebyggelse eller helbredelse) af visse trin i blodets koagulation hos mennesker eller dyr, især i tilfælde, hvor patienten er udsat for risikoen for hyperkoagulerbarhed, der især skyldes organismens frigørelse af tromboplastiner, f.eks. vævsangribende tromboplastiner (kirurgiske operationer, ateromatøse processer, udvikling af tumorer og forstyrrelser af koagulationen som følge 20 af bakterielle eller enzymatiske aktivatorer etc.).

For at illustrere opfindelsen vises i det følgende et eksempel på en posologi, der kan anvendes til mennesket. Denne posologi omfatter f.eks. administration til patienten af 1000-25.000 u ad subkutan vej to eller tre gange om dagen, afhængende af niveauet for risiko for hyperkoagulerbarhed eller patientens trombotiske tilstand, elleraf 1000-25.000 25 u/24 timer ad intravenøs vej i diskontinuerlige administrationer med regelmæssige 17 DK 173385 B1 mellemrum eller kontinuerligt ved perfusion, eller af 1000-25.000 u (tre gange om ugen) ad intramuskulær vej (disse enheder er udtrykt i Yin-Wessler-enheder). Disse doser kan naturligvis indstilles til hver patient, afhængende af resultaterne og de forud udførte blodanalyser, karakteren af patientens sygdomme og, generelt, hans sundhedstilstand.

5 Oligosacchariderne fremstillet ifølge opfindelsen og fraktionerne, som indeholder disse, kan ligeledes anvendes til dannelse af biologiske reagenser, der kan anvendes i laboratoriet, især som sammenligningsstoffer til undersøgelse af andre stoffer, hvis antikoa-gulerende aktivitet man ønsker at prøve, især til hæmning af faktor Xa.

Desuden kan fraktionerne og oligosacchariderne benyttes inden for kememedicin samt 10 endvidere i radiofarmaceutiske produkter. Oligosaccharidrene og fraktionerne, der er defineret ovenfor, mærkes med tracere valgt blandt sådanne, der almindeligvis benyttes inden for dette område, især ved hjælp af technetium 99 m.

Til dette formål omdanner man technetium 99 m, fremkommet fra industrielle anlæg, i form af ikke-reaktionsdygtigt natriumpertechnetat med valensen 7 til reduceret techne-15 tium med valensen 4, som er den mest reaktionsdygtige form af technetium. Denne omdannelse udføres ved hjælp af et reduktionssystem på basis af tinsalte (stannochlorid), jemsalte (ferrosulfat), titansalte (titantrichlorid) eller andre salte.

For det meste er denne simple reduktion af technetium tilstrækkelig til under de givne pH-betingelser at realisere fikseringen af technetium på det pågældende molekyle.

20 Man kan anvende produkterne ifølge opfindelsen, som på en måde udgør en bærer, i doser af størrelsesordenen 100-200 ut Yin-Wessler.

Til udarbejdelse af disse radiofarmaceutika kan man gå frem ved metoden ifølge P.V. Kulkami m.fl. i The Journal of Nuclear Medicine 21, nr. 2, side 117-121.

18 DK 173385 B1

De således mærkede produkter kan med fordel anvendes til prøver in vivo til påvisning og diagnose af omfanget af tromboser og trombotiske tilstande.

Andre egenskaber og fordele ved opfindelsen vil fremgå af de følgende eksempler og tegningerne.

5 Eksempel 1

Fremgangsmåde til fremstilling af oligosaccharidfraktioner, omfattende følgende trin: I - Depolymerisation af heparin med HN02.

II - Fraskillelse af biologisk aktive oligosaccharider ved kromatografi på Sepharo- se - AT III.

10 III - Gelfiltrering af eluerede fraktioner og udvinding af de ønskede produkter.

I. Pepolvmerisation af heparin i nærværelse af salpetersyrling

Man opløser 20 g heparin (USP-titer 150 Ul/mg, Yin-Wessler-titer 150 Ul/mg) i 800 ml vand ved omgivelsernes temperatur.

Man tilsætter 200 ml 0,5 M svovlsyre og derefter 13,8 g natriumnitrit (endeli-15 ge molaritet af svovlsyre 0,1 M og af nitrit 0,2 M).

Reaktionen er ledsaget af en udvikling af luftformigt nitrogen. Man standser reaktionen efter 15 minutter og indstiller pH-værdien til 7-7,2 med 5 N natriumhydroxid.

Depolymerisationsprodukterne udfældes med ethanol (7 rumfang), hvilket i 20 dette tilfælde er 7 liter.

19 DK 173385 B1

Bundfaldet centrifugeres fra, vaskes med alkohol og tørres i vakuum.

Man udvinder 24,8 g produkt, som har en USP-titer på 0 og en Yin-Wessler-titer på 7 Ul/mg.

Den øjensynlige vægtforøgelse af bundfaldet skyldes delvis udfældning af 5 natriumsulfat sammen med depolymerisationsprodukterne.

II. Kromatografi på Sepharose - AT m

De fremkomne depolymerisationsprodukter underkastes en kromatografi på Sepharosegel, hvorpå der tilbageholdes AT ΙΠ-molekyldele.

Med en buffer, der udgøres af 0,2 MNaCl, 0,05 M tris-HCI, pH 7,2, indstil-10 les ligevægten i en søjle (diameter 2,6 cm og længde 40 cm) indeholdende 200 ml Sepharose-AT ΙΠ (ca. 10 mg bovint AT III immobiliseret pr. ml Sepharose).

Man opløser 1,6 g af ovennævnte depolymerisationsprodukter i 16 ml af en 0,2 M NaCl-buffer og leder denne opløsning gennem en søjle med en hastig-15 hed på 50 ml pr. time, og derefter skylles søjlen med 500 ml af en 0,2 M

NaCl-buffer.

De tilbageholdte oligosaccharider elueres derefter fra søjlen ved hjælp af en buffer, som er i stand til at desorbere alle oligosaccharideme, der er tilbageholdt på det immobiliserede AT ΙΠ (0,2 M CaCI2, 0,05 M tris-HCI, pH 7,2).

20 Man udvinder den del af udløbet, som indeholder oligosaccharideme, og man fælder disse oligosaccharider ved hjælp af 10 volumener ethanol.

20 DK 173385 B1

Efter vask med ethanol og tørring i vakuum udvindes 5 mg produkt, der har en USP-titer på 66 UI/mg og en Yin-Wessler-titer på 1600 UI/mg.

De således fremkomne produkter udgøres af en blanding af mucopolysaccha-rider med høj molekylvægt og oligosaccharider med lav molekylvægt.

5 ΠΙ. Gelfiltrering I 2 ml destilleret vand opløses 90 mg af en blanding af mucopolysaccharider og oligosaccharider, fremkommet ved en fremgangsmåde som beskrevet ovenfor. Denne opløsning sættes til foroven på en gelfiltreringssøjle (højde 1 m, diameter 2,6 cm), dannet af yderst fine partikler, der forhandles under beteg-10 nelsen Sephadex G 50, hvilken kolonne er anbragt i ligevægt med destilleret vand. Man foretager eluering med destilleret vand med en hastighed på 26 I pr. time. Man opsamler udløbet fraktionsvis (6 ml pr. glas). Man bedømmer indholdet af mucopolysaccharider i hvert glas ved UV-absorption ved 206 nanometer.

15 Glassenes indhold forenes til dannelse af fraktionerne, der er nummereret 1-5 nedenfor.

Mucopolysacchariderne indeholdt i hver af disse fraktioner udfældes med alkohol og tørres.

Nedenfor er angivet vægten og de antikoagulerende egenskaber af disse 20 fraktioner.

Fraktion 1: Vægt: 15 mg USP-titer: 156 UI/mg

Yin-Wessler-titer: 190 U/mg 21 DK 173385 B1

Fraktion 2: Vægt: 16 mg USP-titer: 139UI/mg

Yin-WessIer-titer: 520 U/mg

Fraktion 3: Vægt: l7mg 5 USP-titer: 50,3 Ul/mg

Yin-Wessler-titer: 390 U/mg

Fraktion 4: Vægt: 40 mg USP-titer: 7 Ul/mg

Yin-Wessler-titer: 870 U/mg 10 Fraktion 5: Vægt: 1 mg USP-titer: Nul

Yin-Wessler-titer: 150 U/mg

Man undersøger molekylvægtsområdeme for de således fremkomne fraktioner, især fraktion 4 og fraktion 5, både ved papirkromatografi og ved høj-15 tryks væskekromatografi (HPLC), og man foretager en sammenlignende under søgelse ved at se på resultaterne, der fremkommer under samme forsøgsbetingelser, med et decasaccharid af heparin og ved papirkromatografi med de sammenligningsprodukter, der er beskrevet i artiklen af Silva & Dietrich (M.E. Silva & C.P. Dietrich, J. Biol. Chem., 20 bind 250 (1975), side 6841-6846), og ved HPLC på silicagel med en række polystyrennatriumsulfonater med kendte stigende molekylvægte og heparinprøver med kendte molekylvægte.

22 DK 173385 B1

Herved viser fraktion 4 sig at bestå af et oligosaccharid, der har mindre end 8 saccharidmolekyldele og sandsynligvis ikke mere end 6 saccharidmole-kyldele, og fraktion 5 at bestå af et oligosaccharid, der har mindre end 6 saccharidmolekyldele, mest sandsynligt ikke over 4 saccharidmolekyldele.

5 Eksempel 2

Fremgangsmåde til fremstilling af oligosaccharidfraktioner, omfattende følgende trin: A - Depolymerisation af heparin ved behandling med en heparinase.

B - Fraktionering af depolymerisationsblandingen ved gelfiltrering på DEAE

Sephadex A 25.

10 C - Isolering af de biologisk aktive produkter ved kromatografi på agarose-AT III.

A. Depolvmerisation af-heparin ved behandling med en hearinase, 1. Fremstilling af heparinase:

Til nedbrydningen af heparin anvendes enzymer fra Flavobacterium heparinum.

15 Enzymerne fra Flavobacterium heparinum dyrkes ved fremgangsmåden ifølge Payza & Korn, beskrevet i J. Biol. Chem. 1956, 223, side 853-858. De lyofiliserede celler formales tørt i nærværelse af aluminiumoxid og ekstraheres derefter med en acetatbuffer ved neutral pH-værdi.

20 De uopløselige dele fjernes, og den fremkomne opløsning kromatogra- feres i rækkefølge på DEAE og derefter på to agaroser såsom de, der 23 DK 173385 B1 findes i handelen under betegnelserne CM Sepharose, CL 6B og Ultro-gel ACA 54.

Man får derved 20 mg heparinase, som har en renhedsgrad på 90% (denne renhed bedømmes ved elektroforese) og en titer på 30.000 enhe-5 der pr. mg (8333 enheder som målt ved metoden ifølge Hovingh m.fl.

(1970), J. Biol. Chem. 245, 6, 1970).

2. Depolvmerisation af heparin: 150 ml vand opløses 1 g heparin til terapeutisk anvendelse. Man tilsætter 1 g natriumacetat og 100 mg calciumchlorid. pH -værdien indstilles 10 til 7,2 ved tilsætning af 1 N HOC1.

Man tilsætter derefter 1 mg af en højt renset heparinaseopløsning såsom den ovenfor fremstillede, og man underkaster blandingen inkubation i 15 timer ved 30°C. Efter udfældning med 10 volumener ethanol ved 100°GL tørrer man det således fremkomne depolymeriserede produkt.

15 Dette produkt betegnes i det følgende "P".

B. Fraktionering på DEAE Sephadex A 25

Med en 0,1 M NaCl-buffer, pH 7,0, indstiller man ligevægten i en søjle med en diameter på 16 ml, indeholdende 50 ml gel, kendt under betegnelsen, der er vist under B. Man påhælder 20 ml af en opløsning indeholdende 180 mg af 20 nævnte produkt P i bufferenheden, og derefter eluerer man med en NaCl- gradient, ifølge hvilken man først anvender 250 ml af en 0,1 M NaCl-buffer og derefter en 0,5 M CaCl2-buffer, pH 7,0. Elueringshastigheden indstilles til 30 ml pr. time. Man udvinder på hinanden følgende volumener på 10 ml.

24 DK 173385 B1 På figur 1 er vist elueringsdiagrammet, fremkommet ved måling af den optiske tæthed ved 232 nanometer. De udvundne volumener forenes i fraktioner 1, 2, 3 og 4 efter målingerne af optisk densitet, som vist på figur 1. Deres respektive optiske densiteter er anført i den følgende tabel.

5 Tabel I

Fraktion Vægt Udbytte i vægt% af [a]20 (c=l, DO”2 nm nr. 120,8 mg udgangs- D H2° produkt vand) på D-bån- (kone.: det af natrium 1 mg/ml) 1 22 mg 18% +33° 2,1 2 69 mg 57% +30° 3,2 10 3 20 mg 16% +30° 2,6 4 9,8 mg 8%_ +21°_ 1,7_ C. Affinitetskromatografi på agarose-AT ITT af den anden fraktion

Med en buffer af NaCl og tris-HCl, 0,025 M, pH 7,4, indstilles ligevægten af en søjle, der har en diameter på 2,5 cm og indeholder 50 ml agarose, hvor-15 på der er immobiliseret molekyler af AT ΙΠ (agarose-AT III).

I 6 ml af bufferen opløses 60 mg af fraktion nr. 2 (P 2) fra tabel I, og derefter sættes opløsningen til foroven på søjlen. Man foretager eluering med følgende opløsninger i rækkefølge:

Den første eluent er den samme som ovenfor anført (man fraskiller således et 20 udløb indeholdende 50 mg produkt, betegnet P 2 (6), indeholdt i den første påviste top af optisk densitet ved 232 nanometer). Ved at udskifte eluenten og anvende NaCl og 0,2 M tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, desorberes igen aktiv fraktion fra gelen. Ved derefter som eluent at anvende 2M CaCl2 fås en top (de volumener, der indeholder fraktionerne, som giver anldning til denne top, 25 DK 173385 B1 udfældes med alkohol og giver 5 mg fraktion med forhøjet aktivitet (produkt betegnet P2 (A)).

De fysiske og biologiske egenskaber af denne sidste fraktion er følgende:

Yin-Wessler-titer: 1400 enheder pr. mg 20 5 a — = + 24° (c = 1, vand) 235 rim DO = 4,5

HCl 0,03 N

Analyseresultaterne for P 2 (A) er anført nedenfor.

10 1. Kemisk analyse:

Man analyserer bestanddelene af P2 (A) som følger:

Uronsyreme efter fremgangsmåden ifølge T. Bitter m.fl., Anal. Bio-chem. 4 (1962), 330-334.

Hexosamineme, dels ved fremgangsmåden ifølge Elson-Morgan, som 15 modificeret af C.A. Antonopoulos m.fl., Biochem. Biophys. Acta 83 (1964), 1-19 (efter hydrolyse af P 2 (A) med 6 N HCI i 4 timer ved 110°C under en nitrogenatmosfære) og dels ved fremgangsmåden ifølge R.L. Smith & E. Gilkerson, Anal. Biochem. 98 (1979), 478-480, i både hydrolyserede og ikke-hydrolyserede prøver af P 2 (A).

20 Sulfaterne ved fremgangsmåden ifølge T.T. Terho m.fl., Anal. Bio chem. 41 (1971), 471-476.

26 DK 173385 B1

Resultaterne vedrørende sammensætningen er opsummeret i følgende tabel II, udtrykt i vægtprocenter (første linie), i molært udbytte i forhold til glucosaminmolekyldelene efter hydrolyse (H+) ef-5 ter teknikken ifølge Smith & Gilkerson (anden li nie) .

TABEL II.

Bexos amlner

Smith/Gilk. Antoncpoulos 10 Uronsyrer Sulfater P 2 (A) 15,2% 18,7% 12,8% 12% 0,9 1,0 0,7 1,4

Resultaterne viser, at oligosacchariderne ifølge opfindelsen i det væsentlige omfatter: 15 1 mol uronsyre pr. mol hexosamin, 1,4 mol sulfat pr. disaccharidmolekyle (omfattende en uronsyremolekyldel og en hexosaminmolekyl-del), 2 N-sulfatglucosaminmolekyldele pr.1 N-acetylgluco= 20 saminmolekyldel.

2. Høj tryksvæskekromatografis 50 yl af en opløsning af 0,5 mg pr. ml af P 2 (A) underkastes en eluering ved hjælp af 0,02 M Na2SC>4 (1 ml/minut) gennem en første og derefter en anden 25 søjle (250 x 4,6 cm), indeholdende henholdsvis kiselsyreanhydrid, der findes i handelen under betegnelsen Lichrophospher Si 100, og en tredie søjle (250 x 3 cm), fyldt med et materiale, der fås i handelen (fra Waters & Associates) under beteg-30 nelsen Micro-Bondagel. Molekylvægten af fraktionen 27 DK 173385 B1 ifølge opfindelsen bedømmes som funktion af elue-ringstiden (eller tilbageholdelsen på søjlerne) ved sammenligning med de lineære variationer i tilbageholdelsestiderne for standard polystyren-5 sulfonater af kendt molekylvægt (henholdsvis 4.000, 6.500, 16.000 og 31.000) og med et tetra= saccharid, der har en kendt molekylvægt på 700 -900, der underkastes samme bestemmelser, og som er udtrykt i logaritmiske værdier, svarende til de 10 nævnte molekylvægte. Målingerne blev udført på en kromatograf, Spectraphysics 3.500, og påvisningen af fraktionerne ved UV-spektrofotometri(200 my og 230 my).

Denne bestemmelse, ligesom de øvrige kemiske be-15 stemmelser ved fremgangsmåden ifølge A.Linker & P.Hovingh, Biochem., bind 11, nr. 4, 1972, side 563 - 567, bekræfter, at de aktive oligosaccharider ikke omfatter mere end 8 saccharidmolekyldele.

3. Ultraviolet absorption: 20 Man foretager målinger af UV-absorption på en op løsning af 100 γ/ml af P 2 (A) i et UV-bånd på 215 - 260 nanometer. Den maksimale absorption iagttages ved 230 - 235 nanometer.

EKSEMPEL 3.

25 Fremgangsmåde til fremstilling af oligosaccharidfraktioner, omfattende følgende trin: I - Enzymatisk depolymerisation af heparin.

II - Isolering af biologisk aktive produkter ved kromatogra fi på Sepharose-AT III.

30 in - Gelfiltrering af de eluerede fraktioner og udvinding af de ønskede produkter.

28 DK 173385 B1 I. Enzymatisk depolymerisation af heparin.

Man opløser 2 g heparin til terapeutisk anvendelse 1 100 ml af en acetat-buffer (NaOAc 0,15 M,

NaCl 0,15 M, CaCl2 0,005 M, pH 6,9).

5 Man underkaster opløsningen inkubation i 24 timer ved 30°C.

Den tidligere fremstillede højt rensede heparinase sættes til opløsningen som følger: 0,4 mg (en mængde baseret på måling af proteinerne) 10 til tidspunktet t « 0, 0,2 mg til tidspunktet t = + 8 timer, 0,2 mg til tidspunktet t = + 24 timer.

På tidspunktet t + 36 timer fremkalder en yderligere tilsætning af heparin ikke nogen forøgelse af den op-15 tiske tæthed ved 232 nanometer. Reaktionen anses for afsluttet, og produkterne udvindes ved udfældning med alkohol og tørres (udbytte i vægtprocent 90%).

II. Affinitetskromatografi på Sepharose-AT III af de depo-lymeriserede produkter.

20 Med en buffer af NaCl og 0,1 M, tris-HCl 0,5 M, pH 7,5, indstilles ligevægten i en kromatografisøjle (5 x 18 cm), indeholdende 10 mg AT III, immobiliseret pr. ml Sepharose.

2 g af nedbrydningsprodukterne af heparin tilsættes 25 foroven i søjlen.

Man vasker søjlen med bufferen, hvorved de ikke-fikse-rede fraktioner kan fjernes (de tilsvarende produkter er 1 det følgende betegnet "UP").

29 DK 173385 B1

De fikserede produkter (betegnet FP) elueres derefter med en opløsning af 1 M CaCl2, pH 7,2.

Produkterne fældes med alkohol og udvindes ved centrifugering. Man udvinder dels 1,6 g UP og dels 8 mg 5 FP, som har en aktivitet (Yin-Wessler) på 800 ui/mg.

III. Gelfiltrering.

Produkterne UP og FP underkastes separat en gelfiltrering. 25 mg af hvert af produkterne filtreres på en søjle (200 x 0,6 cm) af en gel, Sephadex G 50 10 Superfine.

Man foretager eluering ved hjælp af en opløsning af 0,2 M NaCl. Man opsamler fraktioner på 0,65 ml. Efter fjernelse af saltene på Sephadex G 25 lyofiliseres produkterne.

15 På figur 2 er vist elueringsdiagrammerne af UP-frak- tionerne (fuldt optrukken kurve) og FP-fraktionerne (punkteret kurve).

Elueringen kontrolleres ved måling af den optiske densitet ved 230 nanometer (længden af absorptionsbølgen af 20 dobbeltbindingen skabt af heparinasen).

I overensstemmelse med målingerne af optisk tæthed fraktionerer man UP i di-, tetra-, hexa- og octasaccha= rider (UP2, UP4, UPg og UPQ), og et andet produkt, der har en større polymerisationsgrad (UP+g). UPg og 25 UP+8 er *^ke vist på elueringskurverne på figur 2, da de udgør en meget lille procentdel (henholdsvis 3,4 og 1,3%) og påvises alene ved forhøjet følsomhed.

Fraktionen FP adskilles i fire fraktioner, betegnet henholdsvis FPa, b, c og d efter aftagende eluerings- 30 DK 173385 B1 volumen. Størstedelen af FP-fraktionerne elueres lidt før UPg-fraktionen.

I følgende tabel III er vist resultaterne for hver af fraktionerne UP og FP.

5 Resultaterne omfatter: Elueringsvolurnenet (ml) af hver af de nævnte fraktioner, stammende fra fraktionerne UP og FP, procenten af hver af disse fraktioner i blandingen af fraktionerne, henholdsvis UP og FP, 10 den specifikke rotationsevne af hver af fraktionerne (målt med et elektronisk polarlmeter i vandig opløsning, i almindelighed 1%), absorbansen ved 230 nanometer (målt i en 0,01% opløsning af 0,03 M HCl), idet resultaterne er udtrykt i optisk densitet af en opløsning 15 1:1.000, og anti-Xa-aktiviteten i humant plasma af fraktionerne FP, målt ved Yin-Wessler-prøven, der er nævnt ovenfor.

31 DK 173385 B1 TABEL III.

SS t -H 3 o 'Π o o c -PS o c ro ro •3 I I I I I CM rø σ> I ro $£ "g Μ 9·ϊ S3 s* i« oo oo co tn o« in lv Γ0 N <b % % v v cm K id rr co cm cm ro cm i i 8

•H

P

-G

Ώ Π3 G C

> N-l ___ ir ro in in 13 v s *

H +i tn ro iH cn rH

dj cm ro tj1 i co i i o|+ + + + + +

Sai 2 &

20 I “I * "I

H cm o co ro iH Q ro m Ό in OO iH in CM ri Ή <#> Λ fe.

c _ o cm r- ro o in ot »f to

pc Φ l/l ^ ^ M* CO CO CM

25 8 s n. cn h ό i h i J> Λ

r-j in <f Ί <if CO M· CO CM CM

dg 3 30 § ra +J CN "ί Φ OO + 32 DK 173385 B1

Det fremgår af resultaterne i foranstående tabel, at hver af fraktionerne FP har en anti-Xa-aktivitet, idet den største aktivitet forekommer i fraktionen FPa. Det vil bemærkes, at denne fraktion udgør 50 - 60% af blandingen 5 FP.

Fraktionen FPa underkastes flere behandlinger for at belyse dens struktur. Der fremkom følgende analytiske resultater:

Nedbrydning af FPa ved behandling med salpetersyrling.

10 FPa-fraktionerne, der er udvundet efter gelfiltrering, inkuberes med HN02 i vandigt medium under betingelser, som muliggør nedbrydning af oligosaccharidkæderne. Nedbrydningen udføres ved metoden ifølge Shiveley & Conrad, beskrevet i Biochemistry 1976, 15, 3932 - 3942.

15 Under indvirkning af HN02 fragmenteres oligosaccharid kæderne til di- og tetrasaccharider, idet overskæringen sker efter N-sulfatglucosaminmolekyldelene, hvilke molekyl-dele omdannes til 2,5-anhydromannosegrupper.

Ved kromatografi på Sephadex G 50 fraskilles di- og tetra-20 sacchariderne, der derved fremkommer (200 x 0,5 cm, 0,2 M NaCl).

Elueringsdiagrammet er vist på figur 3.

Man foretager følgende målinger på hver af fraktionerne: Den optiske tæthed ved 230 nanometer (kurven a), mængden af 25 uronsyre (kurven b), af 2,5-anhydromannose (kurven c) og af glucosamin (før og efter sur hydrolyse), radioaktiviteten, når de analyserede produkter er blevet tritieret før nedbrydning med HN02.

33 DK 173385 B1 Målingen af den optiske densitet af fraktionerne viser, at størstedelen af de umættede molekyler er disaccharider, idet 90% af den optiske tæthed forekommer i disaccharid-toppen, medens 10% forekommer i tetrasaccharidfragment-5 toppen.

Man kan så se, at tetrasaccharid-enheden ikke omfatter uronsyremolekyldele med en dobbeltbinding. En sådan molekyl-del udgør en del af disaccharidet, som desuden indeholder en N-sulfatglucosamin, hvilket disaccharid GH er lokali-10 seret i den ikke-reducerende ende af oligosaccharidet før dets nedbrydning med salpetersyrling.Ved at bestemme 2,5-anhydromannosegrupperne i disse fraktioner (kurven c på figur 3) finder man desuden 33% af 2,5-anhydromannosegrupper-ne i tetrasaccharidfragmenterne og 66% i disaccharidfragmen-15 terne. I betragtning af, at oligosaccharidkæderne er afsluttet med N-sulfatglucosamingrupper, kan man slutte af disse resultater, at FPa-fraktionen indeholder to disaccha= ridkæder til en tetrasaccharidkæde (se kurven b på figur 3). Disse resultater bekræftes ved måling af uronsyrerne 20 (kurven b) ifølge Bitter & Muir i Annal.Biochem. 1962, 4, 330 - 334, og af glucosaminmolekyldelene i de nedbrudte produkter, stammende fra FPas Disse nedbrydningsprodukter omfatter dobbelt så mange disaccharidmolekyldele som tetra-saccharidmolekyIdele.

25 Reduktion af fraktionen FPa med natrlumborhydrld, efter fulgt af en salpetersyrlingnedbrydning.

Man reducerer fraktionen FPa før salpetersyrlingnedbrydningen. Kædernes reducerende ender bliver således ikke omdannet til 2,5-anhydromannosegrupper under salpetersyrenedbryd-30 ningen.

Man foretager reduktionen med en natriumborhydrid-buffer med pH 9,5. De reducerende ender af oligosaccharidkæderne FPa omdannes så til tritlerede hexitoler. Det reducerede 34 DK 173385 B1 produkt skilles fra salte, der findes i blandingen, ved filtrering på Sephadex G 25. Man underkaster produktet en nedbrydning med salpetersyrling og derefter en gelfiltrering som ovenfor beskrevet. Bestemmelsen af 2,5-5 anhydromannosegrupperne udføres så og viser en tydelig nedgang i forekomsten af disse grupper i disaccharidfraktionen, medens tetrasaccharidfraktionerne forbliver praktisk taget uændrede.

Ved reduktion med tritieret borhydrid genfindes 70 - 80% 10 af radioaktiviteten i disacchariderne og 20 - 30% i tetra= sacchariderne. Desuden iagtager man efter denne behandling, at mængden af 2,5-anhydromannose formindskes mere i disaccharidet end i tetrasaccharidtoppen: Et sådant re sultat er til gunst for tilstedeværelse af et disaccharid= 15 fragment med reducerende ende (70% af molekylerne) og også et tetrasaccharid (30%).

Nedbrydning med salpetersyrling af fraktionen FPa under meget skånsomme betingelser.

Fraktionen FPa underkastes en nedbrydning med salpetersyr= 20 ling under meget skånsomme betingelser.

Det er så muligt efter gelfiltrering og affinitetskromatografi at isolere en oligosaccharidfraktion indeholdende hovedsagelig de to hexasaccharider, som har rækkefølgerne ABCDEF og CDEFGH t 25 Ved denne procedure underkaster man FPa indvirkning af salpetersyrling ved fremgangsmåden, der er beskrevet af Cifonelli & King (Carbohydrate Res. 1972, 21, 173 - 186), idet reaktionen dog standses efter 1-5 minutter, fortrinsvis efter 3 minutter.

30 Man fjerner saltene i de således fremkomne fragmenter ved gelfiltrering på Sephadex G 25, og derefter underkastes de opsamlede fraktioner affinitetskromatografi under de 35 DK 173385 B1 foran beskrevne betingelser.

De foran beskrevne analytiske metoder til undersøgelse af fraktionen FPa viser, at man i de eluerede fraktioner har to hovedtyper, nemlig CDEFGH og ABCDEF. Disse.fraktioner 5 har stadig en anti-Xa-aktivitet (Yin-Wessler).

NMR-karakteriserlnq af en octasaccharidfraktion.

Man isolerer en octasaccharidfraktion ved at gå frem som beskrevet ovenfor. Denne fraktion har en Yin-Wessler-titer på 2.000 enheder pr. mg og en APTT-titer på 4 ui/mg.

10 NMR-spektret C af dette produkt er vist på figur 5. Det bekræfter, at produktet er et octasaccharid. Det bekræfter ligeledes, at det har den struktur, der tilskrives rækkefølgen ABCDEFGH.

De iagttagne signaler er karakteristiske for henholdsvis: 15 Et uregelmæssigt carbonatcm i stilling 1 i de forskellige molekyldele (ABCDEFG og H) i strukturen (den tilsvarende molekyldel er nævnt for hver top på figuren for at muliggøre identifikation ved ca. 90-105 ppm).

Carbonatomer i stilling 6 (signal C^) ca. 60 og 70 ppm 20 og i stilling 2 (signal C2) i glucosaminmolekyldelene 5 5 - 60 ppm.

CH3 i gruppen -NHAc i D ca. 25 ppm.

Desuden iagttages tilstedeværelse af et resonanssicnal i området C-2 i N-sulfat-aminoglucosaminresten (signal (x)% 25 dette signal svarer ikke til noget resonanssignal i de fremkomne NMR-spektre, når man går frem under lignende betingelser med et sædvanligt heparin.

i 36 DK 173385 B1 EKSEMPEL 4.

Isolering af en hexasaccharidfraktion, der er aktiv over for faktor Xa.

I en anden række forsøg blev den fremkomne blanding efter affinitetskromatografi-trinet (80 mg) kromatograferet på 5 en søjle (200 x 2,5 cm) af en superfin gel af Sephadex G 50.

Man udfører eluering med 0,2 M natriumchlorid. Produkterne påvises ved UV-absorption ved 232 nanometer (se figur 4).

Størstedelen af produktet elueres i octasaccharidområdet 10 og viser samme egenskaber som det tidligere beskrevne produkt .

Hexasaccharidfraktionen samles, og saltene fjernes. Det således fremkomne produkt tørres ved frysning, og udbyttet er 2 mg.

15 Denne forbindelse har en høj Yin-Wessler-aktivitet på 510 ui/mg. Dens APTT-titer er 3 ui/mg.

Da denne hexasaccharidfraktion er fremkommet efter nedbrydning med heparinase, indeholder den resterne A og H, som er karakteriseret i octasaccharidfraktionen. Da endvidere 20 dette produkt har en affinitet til AT III, må det indeholde tetrasaccharidrækkefølgen CDEF.Det kan derfor repræsenteres ved strukturen ABCDEF.

Man kan imidlertid ikke udelukke tilstedeværelse i dette materiale af små mængder af et produkt, der har strukturen 25 CDEFGH, hvor C er en umættet hexuronsyrerest (gruppen 2-OH er sulfateret eller ikke sulfateret).

Analytisk undersøgelse af denne hexasaccharidfraktion, udført som ovenfor beskrevet for octasaccharidet (nemlig nedbrydning med salpetersyrling og undersøgelse af fragmenter- DK 173385 B1 37 ne) viser tilstedeværelse af både ABCDEF og CDEFGH.

EKSEMPEL 5.

Nedbrydning af octasaccharidet ABCDEFGH og de fremkomne oligosaccharider.

5 1. Ved at gå frem som beskrevet af L.A.Fransson i Carbo hydrate Research 62, 235 - 244, 1979, underkaster man octasaccharidet ABCDEFGH en oxidationsreaktion ved hjælp af natriumperiodat l phosphatmedium ved pH 7 og 37°C i ca. 14 timer. Man hæver derefter pH-værdien 10 til 11 - 12 ved tilsætning af natriumhydroxid for at fremkalde en alkalisk hydrolyse, og derpå neutraliserer man reaktionsblandingen. Kromatografi på Sepha-dex G 50-gel gør det muligt at fraskille et trisaccha= rid, som man kan tillægge strukturen FGH.

15 Undersøgelse af anti-Xa-aktiviteten ved Yin-Wessler- prøven gør det muligt at påvise en aktivitet af størrelsesordenen 100 - 200 ui/mg ifølge prøverne.

2. Man lader en renset heparinase, udvundet af Flavobacteri-um heparinum, indvirke på ovennævnte octasaccharid.

20 Driftsbetingelserne,især vedrørende pH-værdi, temperatur og varighed, svarer til de til den enzymatiske nedbrydning ifølge eksempel 2 anvendte. Ved filtrering på en Sephadex gel G 50j, udført som i eksempel 2, udvindes af depolymerisationsblandingen to tetrasaccharider, som 25 man kan tilskrive strukturerne EFGH og ABCD.

Passage af disse produkter på en søjle af Sepharose AT III gør det muligt at tilbageholde EFGH, medens ABCD fjernes. Man udvinder derefter EFGH ved eluering med en 1 M NaCl-opløsning. Yin-Wessler-aktiviteten, 30 målt i forskellige prøver, er af størrelsesordenen 100 - 200 ui/mg.

38 DK 173385 B1 3. Man underkaster octasaccharidet ABCDEFGH en skånsom nedbrydning med salptersyrling. Man tager 1 mg octa= saccharid pr. ml opløsning og frembringer salpeter= syrling (i en koncentration på ca. 1 m M) in situ ved 5 tilsætning af N/1000 natriumnitrit og HC1. Man ind stiller pH-værdien til 3. Efter 10 minutter ved omgivelsernes temperatur indstilles pH-værdien til 7. Reaktionsblandingen underkastes en gelfiltrering, fulgt af en affinitetskromatografi under de betingel-10 ser, der er beskrevet i de foregående eksempler.

Ved eluering med en opløsning af 1 M NaCl eller 1 M CaCl2 opsamles et produkt, som man kan tillægge en hexasaccharidstruktur CDEFGH.

Dette hexasaccharid underkastes indvirkning af en a-L-15 iduronidase, udvundet af menneskenyre. Dette enzy matiske nedbrydningstrin udføres ved pH 7 og 37°C ved filtrering af depolymerisationsblandingen på en søjle af Sephadex G 50, og man isolerer et oligosaccharid, som man kan tillægge strukturen af et pentasaccharid 20 DEFGH. Yin-Wessler-aktiviteten af dette produkt viser sig at være af størrelsesordenen 400 ui/mg ved de udførte prøver.

EKSEMPEL 6.

NMR-karakterisering af oligosaccharidfraktionen, fremkommet 25 i eksempel 1.

13 NMR-spektret (C ) af denne fraktion viser tilstedeværelse af et signal (*) i området ved C-2 af glucosaminmolekyIdele (se figur 6). Dette signal kan tilskrives en glucosamin, som er N-sulfateret og substitueret i stilling 3 med en 30 gruppe -OSO^”.

Denne glucosaminmolekyldel er sulfateret eller ikke sulfa-teret i stilling 6.

39 DK 173385 B1

Integrationskurven bekræfter desuden, at produktet har et middelantal molekyldele under 8 og omfatter en større andel hexasaccharid-og octasaccharidtyper.

Ved at gå ud fra heparin fra okseblod kan man efter kontrol-5 leret nedbrydning, fulgt af en affinitetskromatografi og en gelfiltrering, som foran beskrevet, isolere et ccta= saccharid, som har strukturen ABCFGHGH, hvilket produkt er højaktivt ved anti-Xa-prøverne.

Man udvinder ligeledes, i ringe mængde, et hexasaccharid 10 ABCFGH, der også viser sig aktivt i anti-Xa-prøverne.

Opfindelsen omfatter naturligvis oligosaccharider, der kan fås ved anden teknik til depolymerisation af heparin eller heparinforbindelser, fulgt af udvinding af oligosacc:hari= der med lav molekylvægt, som har en antikoagulerende ak-15 tivitet, der kan måles ved Yin-Wessler-prøven.

Som eksempel på anden teknik til depolymerisation af hepa= rin eller beslægtede forbindelser kan nævnes periodsyre-oxidation. Man kan ligeledes nævne den teknik, der består i at fremkalde en α,β-eliminationsreaktion ad kemisk vej 20 på heparin eller heparinestere, som giver lignende resultater, eller følgende fremgangsmåde:

En heparinfraktion bringes i kontakt med AT III, der er immobiliseret på en Sepharose-gel, for at fiksere de bestanddele af heparinfraktionen, som er i stand til at fik-25 seres på AT III.

Man behandler de således fikserede bestanddele af heparin med en heparinase, især af bakterieoprindelse.

Man eluerer gelen af fragmenterne med affinitet til AT III og behandler med fordel eluenten, der indeholder disse 30 fragmenter, ved de ovenfor"beskrevne trin.

Claims (4)

40 DK 173385 B1

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af oligosaccharidfraktioner eller oligosac-charider med specifik anti-Xa-aktivitet (Yin-Wessler), kendetegnet ved, at 5 (a) heparin (eller heparinfraktioner), som har en antikoagulerende aktivitet og som omfatter kæder med molekylvægte på ca. 2.000-50.000, depolymeriseres eller fragmenteres til opnåelse af en reaktionsblanding, som indeholder oligosaccharid-fragmenter eller oligosaccharidkæder, der består af højst 8 saccharidmolekyler og indeholder en specifik anti-Xa-aktivitetsansvarlig sekvens af højst 7 saccharidmole-10 kyldele, (b) reaktionsblandingen bringes i kontakt med AT III for at absorbere eller tilbageholde i det mindste størstedelen, fortrinsvis praktisk taget alle oligosacchariderne, som har en sekvens med en specifik struktur over for AT m, og (c) de tilbageholdte oligosaccharidfragmenter og oligosaccharidkæder frigives.

2. Analogi fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at at heparinet depolymeriseres ad kemisk vej, fortrinsvis med HN02 i vandigt medium ved en pH-værdi af størrelsesordenen 2-4, fortrinsvis 3, og ved en temperatur i nærheden af omgivelsernes temperatur, eller ad enzymatisk vej med en højt renset heparinase af bakterieoprindelse, især stammende fra Flavobacterium heparinum, ved en pH-værdi på 6-8, 20 især i nærheden af neutralitetspunktet og ved en temperatur i nærheden af omgivelsernes temperatur.

3. Analogi fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man udfører trin (b) og (c) ved affmitetskromatografi på en søjle indeholdende immobiliseret AT ΠΤ, hvilken søjle med fordel er bragt i ligevægt med en buffer, som har en ionstyrke i 41 DK 173385 B1 på ca 0,2 M, fortrinsvis større end eller lig med 0,1 M, ved en pH-værdi på 6-8, fortrinsvis i nærheden af eller lidt over neutralitetspunktet, idet produkterne, der ikke har nogen affinitet til AT III, eller som kun har en svag aktivitet over for AT III, fjernes ved vask med en buffer, der med fordel er af samme type som den, der anvendes til at 5 indstille ligevægten i søjlen, og at der til udvinding af produkterne tilbageholdt eller adsorberet på AT ΙΠ, som har en anti-Xa-aktivitet (Yin-Wessler), fortrinsvis anvendes desorptionstrin og udvindingstrin for alle oligosacchariderne ved eluering med en buffer, der har en ionstyrke, som er tilstrækkelig til dette formål, idet den til denne eluering anvendte buffer er valgt blandt sådanne, der ikke forstyrrer de følgende udvindingstrin 10 (især med alkoholisk fældning) for oligosacchariderne indeholdt i de udvundne fraktioner, og idet man før fikseringen på AT ΙΠ fra reaktionsblandingen eventuelt fjerner de oligosaccharider, som har mere end 8 saccharidmolekyldele, fortrinsvis ved gelfiltrering eller ved en lignende metode.

4. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at den omfatter 15 fraktionering, f.eks. ved gelpermeation, af blandingen af alle oligosacchariderne, der forud er tilbageholdt på AT III, hvilken fraktionering fortrinsvis udføres for først at opnå eluering af de største molekyler og derefter de mindre molekyler, idet man går ud fra fraktioner, som har en Yin-Wessler-titer og en USP-titer, der står i et indbyrdes forhold på mindst 30, fortrinsvis 100, idet udvindingen udstrækker sig til alle de resterende 20 fraktioner, som endnu har en anti-Xa-aktivitet, i det mindste ved Yin-Wessler-prøven.