JPH0616687A - ヘパリン不飽和4糖およびその製造法 - Google Patents
ヘパリン不飽和4糖およびその製造法Info
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Abstract
パリン4糖を提供することである。また、他の目的はこ
のようなヘパリン4糖を、ヘパリンを原料として酵素的
手段を用いて効率よく、簡便に得る手法を提供すること
である。 【構成】 下記化1の一般式(1)(式中、R1は、SO3
- またはCOCH3 を表し、R2は、SO3 - またはHを表す。)
で表されることを特徴とするヘパリン不飽和4糖および
その塩であり、ヘパリンを、フラボバクテリウム由来の
ヘパリチナーゼIIを少なくとも用いて分解し、この分解
生成物から分取する。 【化1】
Description
−硫酸を含む新規なヘパリン不飽和4糖に関する。該不
飽和4糖は、ヘパリンの抗凝血活性の中心となる機能領
域を構成する糖鎖である。また、本発明は、ヘパリンを
原料として酵素的方法によって該不飽和4糖を製造する
方法に関する。
品として広く用いられている。その活性は血液中に存在
するアンチトロンビンIII (ATIII)とヘパリンが複
合体を形成し凝固因子の活性を抑制するためであること
が知られている。このATIIIとヘパリンとが結合する
部分については詳しい研究がなされ、ヘパリンについて
は活性発現に必要な構造としてグルコサミンの3位の炭
素にO−硫酸エステルをもつ糖鎖を含む次の5糖(下記
(2))の構造が決定されている。
ルクロン酸を、GlcNはグルコサミンを、(3,6-di-SO3)は
3−O及び6−O−硫酸エステルを、IdoAはイズロン酸
をそれぞれ示す。) 本構造を特徴づける2糖(上記(3))、GlcA→GlcNSO
3(3,6-di-SO3) はヘパリン糖鎖の中では微量成分であ
る。この2糖(3)はATIIIへの結合には不可欠な成
分であるため、抗凝固活性を保有するヘパリンの最も適
切なマ−カ−となっている。
によって発現する凝固因子に対する抑制活性は、ATII
I結合領域の分子量によって変化することがわかってお
り、このサイズを調節することによって血液凝固Xa因
子(ファクタ−Xa)とトロンビンの活性抑制の程度を
変化させることが可能である。すなわち、ヘパリンの分
子量を小さくするこにより、トロンビンへの阻害活性を
低減して出血作用を抑え、Xa活性への阻害活性は温存
させて血栓形成を抑制するという考えがある。この考え
に基づいて、出血の副作用の少ない血栓予防薬、低分子
ヘパリンが発明されるに至っている。(例えば米国特許
第4,303,651号、米国特許第4,396,76
2号)。
(3)の構造を有する原料はヘパリン/ヘパラン硫酸の
他はあまり知られていない。しかしながら、ヘパリンか
ら2糖(3)を含むオリゴ糖を効率よく取り出す良い方
法はなく、また、化学合成によってこれを大量に得るこ
とは極めて困難であった。すなわち、これら低分子ヘパ
リンを、ヘパリンの限定的な化学処理によって製造する
場合、分子量が多分散でかつ多種構成糖からなる生産物
しか得られず、活性領域を含むオリゴ糖のみを調製する
ことは困難であった。
リウム・ヘパリナム(Flavobacterium heparinum)由来
のヘパリナ−ゼおよびヘパリチナーゼIを含むヘパリン
分解酵素を用いてヘパリンを徹底分解した後、2糖から
8糖までのオリゴ糖異性体の混合物を高速液体クロマト
グラフィ−(HPLC)で分離して、2糖(3)を還元
端側に含む不飽和6糖を得る方法(K. G. Rice & R. J.
Linhardt, Carbohydr.Res. 190, 219-233, 1989)が知
られている。ここで得られる不飽和6糖は、その純度が
80%程度とされている。しかしながら、この方法では
2糖(3)を含む不飽和4糖は生成していない。
間に存在する不飽和6糖が得られ、これを亜硝酸分解す
ることにより還元端がアンヒドロマンノ−ス体に変化し
た不飽和4糖が得られるとの報告がある(J. Choay, J.
C. Lormeau, M. Petitou, P.Snay & J. Fareed, Annals
of the New York Academy of Sciences, 370, 644-64
9, 1981)。
酵素を用いて2糖(3)を含む最小のオリゴ糖を得よう
としているが、これらの報告を含めて酵素分解法、化学
分解法、化学合成法のいずれによっても、現在までに上
記式(3)の2糖単位を含む不飽和4糖を調製した報告
はない。もし、このような4糖が得られれば、アンチト
ロンビンIII結合領域に関与する糖鎖の合成原料や新し
い血液凝固因子の阻害剤として活用することが期待でき
る。
は、グルコサミン−3−O−硫酸を含む新規なヘパリン
4糖を提供することである。また、他の目的はこのよう
なヘパリン4糖を、ヘパリンを原料として酵素的手段を
用いて効率よく、簡便に得る手法を提供することであ
る。
由来の2糖(3)を含む不飽和4糖を得るべく、ヘパリ
ン/ヘパラン硫酸系の分解酵素の特異性を研究し、その
応用を試みた結果、新規なヘパリン不飽和4糖を効率よ
く、簡易に製造できることを見出し、本発明を完成する
に至った。
(1)で表されることを特徴とするヘパリン不飽和4糖
およびその塩を提供するものである。
ル基; 以下「Ac」と略す。) を表し、R2は、SO3 - また
はHを表す。) 尚、一般式(1)の構造式において、末端不飽和糖残基
を4、以下他の糖残基を1〜3と番号を当て、各糖残基
の基本単位糖を示した。また、一般式(1)の構造式で
は電離した状態のみを記載したが、本発明は、これに限
定されないことは明らかであり、これにプロトンが付加
した構造のもの、あるいはアルカリ金属(ナトリウム、
カリウム、リチウム等)、アルカリ土類金属(カルシウ
ム、バリウム等)、あるいはアンモニウムイオン等との
塩を包含する。
リウム由来のヘパリチナーゼIIを少なくとも用いて分解
し、この分解生成物から分取することを特徴とする前記
一般式(1)で表されるヘパリン不飽和4糖およびその
塩の製造法を提供するものである。以下本発明を具体的
に説明する。
不飽和4糖は、好ましくは、一般式(1)において下記
置換基を選択した化合物I〜III である。 化合物I :ΔGlcA-GlcNAc(6S)-GlcA-GlcN(NS,3S) (R1はAc、R2はH の場合。) 化合物II :ΔGlcA-GlcNAc(6S)-GlcA-GlcN(NS,3S,6
S) (R1はAc、R2はSO3 - の場合。) 化合物III :ΔGlcA-GlcN(NS,6S)-GlcA-GlcN(NS,3S,6
S) (R1はSO3 - 、R2はSO3 - の場合。) (上記式においてΔは不飽和糖であることを、GlcAはグ
ルクロン酸を、GlcNはグルコサミンを、Acはアセチル基
を、NSはN−硫酸エステルを、3Sは3−O−硫酸エステ
ルを、6Sは6−O−硫酸エステルをそれぞれ示す。) これら本発明の不飽和4糖は還元端糖残基が3−O−硫
酸エステル化されたグルコサミンである共通構造を有し
ている。後述の実施例に示す通り、本発明の不飽和4糖
の、構造はプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H−NM
R)を測定することにより解析された。
らヘパリン不飽和4糖を切り出すために、活性領域にお
ける2糖(3)周辺の糖鎖構造に作用する酵素を活用す
る手段を検討した。すなわち、このような用途に使用で
きる可能性のある酵素として、二種類のフラボバクテリ
ウム属微生物によって生産された基質特異性の異なる6
種類(ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI、I0、II、IVお
よびV)のヘパリン分解酵素を選び、その種々の組合せ
について逐次または同時に用いてヘパリンを分解し、そ
の生成物の組成について調べた。具体的には、各酵素に
よるヘパリンの分解物について、生成オリゴ糖の分解パ
タ−ンをゲル濾過法で、その構成2糖組成の相違を陰イ
オン交換HPLCで検討した。
O3)-GlcNSO3(6SO3)のクラスタ−部分については、ヘパ
リナ−ゼがより早く分解して不飽和の2糖〜8糖の種々
のオリゴ糖を生じやすく、このオリゴ糖に対してヘパリ
チナ−ゼIおよびIIを同時に作用させると、本発明の
前記化合物I〜III の三種の不飽和4糖と一種の糖−蛋
白質結合部位の不飽和オリゴ糖(ΔGlcA-GlcNAc(6S)-Gl
cA-Gal-Gal-Xyl-Ser)の四種の不飽和オリゴ糖が残るの
みで、他のオリゴ糖は全て不飽和2糖となることが見出
された。このうち一種の不飽和オリゴ糖は、原料として
使用したヘパリンが還元端にペプチドが結合した構造で
ある場合のみ生じる。このオリゴ糖は、ヘパリチナーゼ
Vで2糖と4糖-Serに分解されたが、本発明の三種の不
飽和4糖は上記の6種のいずれのヘパリン分解酵素(エ
リミナーゼ)を作用させてもそれ以上は分解されず、不
飽和2糖を生じないことがわかった。なお、これらの6
種の酵素の性質、一般的な基質特異性等については「新
生化学実験講座3、糖質II、プロテオグリカンとグリ
コサミノグリカン」、244〜249頁(1991年、
株式会社東京化学同人発行)に記載されているが、AT
IIIとの結合に関与する2糖単位(3)周辺の構造に対
してどのように作用するかは不明であった。
(タンパクへの橋渡し構造を除く)については、グルコ
サミン−3−O−硫酸を含む部分(前記(3)の2糖構
造を含む)のみが酵素分解によって不飽和4糖として残
されるため、本発明の不飽和4糖だけを容易に濃縮、回
収することが可能であることが判明した。以上は本発明
に至る基礎実験であり、本発明のヘパリン不飽和4糖の
製造法はこの結果を基に完成された。
ゼIIを作用させることを必須要件とする。本発明ではヘ
パリチナ−ゼIIと組み合わせて種々のヘパリン分解酵素
を使用することができる。すなわち、ヘパリチナ−ゼII
を効率よく経済的に作用させるために、ヘパリナ−ゼ、
ヘパリチナ−ゼI、I0、IV、ヘパリチナーゼV等公知の
ヘパリン分解酵素を併用することができる。本発明にお
いて使用するヘパリン分解酵素としては、フラボバクテ
リウム属微生物(例えば、フラボバクテリウム・ヘパリ
ナム(ATCC 13125;米国特願第180,78
0号)、フラボバクテリウムsp.Hp206(微工研
菌寄第10207号;特開平2−57183号);Xth
International Symposium on Glycoconjugates(Proceed
ings),No228, p.330-331(1989))由来の酵素が例示され
るが、本発明の目的に適合する限り、他の起源の酵素
(例えば、バチルス属微生物由来;特開平2−1424
70、特願平3−63707)であってもよい。
は、これらの酵素を任意に組み合わせて混合し用いる
か、単独または二種以上を混合して任意の順序で別々に
作用させることができる。この場合、好ましくは、ヘパ
リチナーゼIIと(a:ヘパリナーゼ及びヘパリチナーゼ
IVからなる群)から選択される1種以上の酵素(a群酵
素)と(b:ヘパリチナーゼI、ヘパリチナーゼI0及び
ヘパリチナーゼVからなる群)から選択される1種以上
の酵素(b群酵素)とを併用することが挙げられる。な
お、ヘパリチナーゼIIとa群酵素およびb群酵素の一方
を併用することも可能である。
ヘパリチナーゼIと、ヘパリナーゼまたはヘパリチナー
ゼIVとを併用することが挙げられる。併用の態様として
は、例えばヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼIおよびIIを
混合してヘパリンに作用させる方法、ヘパリチナ−ゼ
I、IIおよびIVを混合してヘパリンに作用させる方法、
ヘパリンをヘパリナ−ゼまたはヘパリチナ−ゼIVで消化
した後、不飽和2糖を除去し、これにヘパリチナ−ゼI
およびIIを加えて再度徹底消化する方法などが例示さ
れる。しかし、いずれの場合においても、ヘパリチナ−
ゼIIの使用は必須である。
できるヘパリンであればよく、特に限定されない。例え
ば、ブタ、ウシ、ヒツジ、クジラ等の哺乳動物の臓器
(例えば、小腸、肺)由来のヘパリンを使用することが
できる。通常、市販ヘパリンはアルカリ処理を施された
ものであるため、還元端のペプチドや橋渡し構造を失っ
ている場合が多く、本発明による酵素処理を行っても糖
と蛋白質の結合部位の不飽和糖を生じない場合が多い。
件は各ヘパリン分解酵素について採用されている通常の
方法および条件であればよく特に限定されない。すなわ
ち、ヘパリンを含有する水性溶液(水溶液、任意の緩衝
剤(例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤
など)を含む溶液)に各種ヘパリン分解酵素を全て混合
して添加し、インキュベートするか、単独または二種以
上混合したヘパリン分解酵素を任意の順序で順次添加し
てインキュベートすることができる。更に、単独または
二種以上の酵素を通常の方法(米国特願第196,72
0号)で固定化た固定化酵素(例えば、セファロース
(ファルマシア・ファインケミカル社製)に固定化した
固定化酵素)を用いて反応させることもできる。
いるときは各酵素のそれぞれが作用し得る条件を設定す
る必要があるが、二種以上の酵素を別々に作用させると
きは各酵素の最適の反応条件を選択して反応させること
ができる。反応時間は、本発明の不飽和4糖の生成をH
PLC等のクロマトグラフィーで分析することによって
当業者であれば容易に決定することができる。各ヘパリ
ン分解酵素の最適の反応条件(pH、温度)は以下の通
りである。
適温度約40℃ ヘパリナーゼ:至適pH約7.0、至適温度約30℃ ヘパリチナーゼI:至適pH約6.5〜7.5、至適温
度約45℃ ヘパリチナーゼI0:至適pH約7.5、至適温度約45
℃ ヘパリチナーゼIV:至適pH約7.5、至適温度約40
℃ ヘパリチナーゼV:至適pH約7.0、至適温度約40
℃ 各酵素に共通する反応条件として、例えば、ヘパリン濃
度1.0〜100g/Lの基質溶液を用い、pH5〜
8、10〜40℃において0.1〜100時間反応させ
る条件が例示される。
の種類によって種々選択され得る。例えば、酵素とし
て、ヘパリチナーゼII、ヘパリチナーゼI、及びヘパリ
ナーゼまたはヘパリチナーゼIVを併用する場合、各酵素
量は、ヘパリン1gに対しヘパリチナーゼIIが10〜1
00ユニット、ヘパリチナーゼIが5〜50ユニット、
ヘパリナーゼまたはヘパリチナーゼIVが20〜200ユ
ニットが例示できる。ここで、ユニットとは、1分間に
1μモルの不飽和糖を生成せしめる力価を意味する。た
だし、力価測定にあたり、基質としては、ヘパリチナー
ゼI、I0、II、Vについては、ウシ腎臓由来のヘパラン
硫酸を用い、ヘパリナーゼおよびヘパリチナーゼIVにつ
いては、ブタ小腸由来のヘパリンを用いる。
解生成オリゴ糖は、通常の分離精製方法、例えば、各種
クロマトグラフィーによって精製され、目的のヘパリン
不飽和4糖を分離精製することができる。例えば、通
常、該分解生成物は、初めゲル濾過によりほぼ4糖近辺
のオリゴ糖を粗分画し、次いで、HPLC(例えば、ポ
リアミン結合シリカゲルカラムを使用するHPLC)に
より化合物I〜III を分離、分画することが挙げられ
る。この場合、分取される分画は、本発明の一般式
(1)を満足する化合物から構成されるのであれば、必
ずしも単一な化合物のみである必要はなく、例えば、化
合物I〜III から選択される2種以上の混合物であって
もかまわない。また、化合物1〜III の各単品を精製す
る場合は、上記混合物等を再度精製すること等により行
ってもよい。
0〜20,000のものが好ましい。また、HPLC
は、陰イオン交換クロマトグラフィーを採用することが
好ましい。 〔用途〕本発明の不飽和4糖は、化合物1〜III あるい
はその構成オリゴ糖、または単糖、特に残基1の3−O
−硫酸置換糖を貴重な各種試薬として提供できる。ま
た、ヘパリン不飽和4糖は、ATIII結合領域に関与す
る糖鎖の合成原料(素材)や血液凝固因子の新しい阻害
剤としての用途が期待できる。また、該不飽和4糖の還
元端または非還元端を他の糖類、リガンド、医用材料、
その他合成ポリマーに結合させた修飾物は、ATIII結
合性アフィニティー担体として各種クロマトグラフィー
や人工血管表面等の機能性素材として用いることが期待
できる。また、これらの修飾物は弱い抗凝固活性物質と
しての利用が可能である。
本発明は、これに限定されるものではない。また、各ヘ
パリン分解酵素の呼称は前述の「新生化学実験講座3、
糖質II、プロテオグリカンとグリコサミノグリカン」の
記載にしたがっている。 実施例1:ブタ小腸由来のヘパリン500mgを20m
L(ミリリットル)の20mM酢酸緩衝液(pH7.
0)(2mM酢酸カルシウム含有)に溶解した。この液
にフラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリナーゼ
30ユニット、ヘパリナーゼII 12ユニットおよび
ヘパリチナーゼI 6ユニットを加えて37℃で5時間
消化した。反応終了後、沸騰浴中にて3分間加熱して酵
素を変性させ、生じた不溶物を3000rpm、10分
遠心分離して除去した。
度とし、セルロファインGCL−90m(生化学工業株
式会社)カラム(4.5×105cm)に負荷して、
0.2M食塩溶液にてゲル濾過を行った。4糖相当画分
を分取して濃縮した後で2mLの蒸留水に溶解、セルロ
ファインGCL−25(生化学工業株式会社)カラム
(2×45cm)を用いて脱塩し、凍結乾燥した。 凍
結乾燥物を1mLの20mM酢酸緩衝液(pH7.0)
(2mM酢酸カルシウム含有)に溶解し、ヘパリチナー
ゼII 2ユニットを加えて37℃で3時間消化した。以
後、前記と同様に酵素を変性させ、生じた不溶物を30
00rpm、10分遠心分離して除去し、セルロファイ
ンGCL−90mカラム(3×100cm)で4糖を回
収し、セルロファインGCL−25カラム(2×45c
m)を用いて脱塩、凍結乾燥して化合物I、II、III を
含むヘパリン不飽和4糖の混合物を得た。
2水素ナトリウム溶液に溶解し、HPLCカラム(アミ
ノシリカゲルカラム、PA03 4.6×250mm、
YMC社製)に負荷して、HPLCでリン酸2水素ナト
リウム濃度を200mMから800mMまで直線的に上
昇せしめて溶出させ、紫外部吸収232nmで追跡して
3成分I、II、III を分取した(図1参照)。
留水に溶解、セルリファインGCL−25カラムで脱
塩、凍結乾燥してヘパリン不飽和4糖I、II、III を得
た。それぞれの乾燥物を蒸留水に溶解し、その1部を
0.01規定の塩酸溶液で希釈して、232nmにおけ
る紫外部吸収を求めた。この値を不飽和2糖のモル分子
吸光係数で除してモル濃度を概算した結果、ヘパリン5
00mgからの収量は、Iは、3.8mg、IIは、1
6.8mg、III は、2.8mgであった。得られたヘ
パリン不飽和4糖の500MHz 1H-NMR スペクトルとプロト
ンの帰属から構造が確認された。
まとめて示す。尚、各シグナルの帰属は、二次元HOH
AHA(Homonuclear Hartmann-Hahn Spectroscopy) 、
COSY(Corelation Spectroscopy; 同種核シフト相関
2次元NMR)で行った。
mgを20mL(ミリリットル)の20mM酢酸緩衝液
(pH7.0)(2mM酢酸カルシウム含有)に溶解し
た。この液にフラボバクテリウム sp. Hp206
由来のヘパリチナーゼIV 25ユニット、フラボバクテ
リウム・ヘパリナム由来のヘパリチナーゼII 15ユニ
ットおよびヘパリチナーゼI 5ユニットを加えて37
℃で5時間消化した。後は、実施例1と同様に処理し
た。ヘパリン500mgからの収量は、Iは、4.2m
g、IIは、17.5mg、III は、3.1mgであっ
た。
リン不飽和4糖を提供するものであり、これは還元末端
がグルコサミン−3−O−硫酸で非還元末端が不飽和グ
ルクロン酸を含む新規な構造であって、ヘパリンの抗凝
固活性の制御に係わる部位を含む非常に有用な構造を提
供する。このヘパリン不飽和4糖は、ヘパリンを本発明
による選択した酵素により分解し、生成した混合物を分
画することにより非常に容易に構造が単一な化合物とし
て大量に製造することができる。従って、本発明は、こ
の分野においては非常に高価な試薬の低コスト化が可能
であると共に本発明の化合物を基本とした各種医用材料
あるいは医薬の有用な原料を安価に提供できる。
トグラムである。
Claims (4)
- 【請求項1】 下記化1の一般式(1)で表されること
を特徴とするヘパリン不飽和4糖およびその塩。 【化1】 (式中、R1は、SO3 - またはCOCH3 を表し、R2は、SO3 -
またはHを表す。) - 【請求項2】 ヘパリンを、フラボバクテリウム由来の
ヘパリチナーゼIIを少なくとも用いて分解し、この分解
生成物から分取することを特徴とする請求項1記載のヘ
パリン不飽和4糖およびその塩の製造法。 - 【請求項3】 ヘパリチナーゼIIと下記aの群から選択
される1種以上の酵素とbの群から選択される1種以上
の酵素とを併用することを特徴とする請求項2のヘパリ
ン不飽和4糖の製造法。 a:ヘパリナーゼ及びヘパリチナーゼIV b:ヘパリチナーゼI、ヘパリチナーゼI0及びヘパリチ
ナーゼV - 【請求項4】 ヘパリチナーゼIIと、ヘパリチナーゼI
と、ヘパリナーゼまたはヘパリチナーゼIVとを併用する
ことを特徴とする請求項2または3のヘパリン不飽和4
糖の製造法。
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---|---|---|---|
JP19900492A JP3522775B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | ヘパリン不飽和4糖およびその製造法 |
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JP (1) | JP3522775B2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1070503A1 (en) * | 1999-07-23 | 2001-01-24 | Laboratorios Farmaceuticos Rovi, S.A. | Compositions comprising very low molecular weight Heparin |
JP2001187802A (ja) * | 1999-07-23 | 2001-07-10 | Lab Farmaceuticos Rovi Sa | 超低分子量ヘパリン組成物 |
JP2002327002A (ja) * | 2000-08-07 | 2002-11-15 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 硫酸基を有するオリゴ糖 |
US8153614B2 (en) | 2006-12-05 | 2012-04-10 | Glycoscience Laboratories, Inc. | Treatment of osteoarthritis |
-
1992
- 1992-07-03 JP JP19900492A patent/JP3522775B2/ja not_active Expired - Lifetime
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