DK172877B1 - Analogifremgangsmåde til fremstilling af fra heparin afledede mucopolysaccharider med biologiske egenskaber - Google Patents

Description

i DK 172877 B1

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte mucopolysaccharidprodukter, som har biologiske egenskaber, der især gør det muligt, at de på meget specifik måde kan regulere visse trin i blodets koagulering.

Opfindelsen angår mere specielt en analogifremgangsmåde til fremstilling af fra heparin 5 afledede mucopolysaccharidprodukter (i det følgende betegnet med forkortelsen MPS), som har en mere selektiv virkning end heparin over for blodets aktiverede faktor X eller faktor Xa og derfor en kraftigere antitrombotisk virkning uden at medføre forøget blødningsrisi ci for patienten, der behandles med produktet.

Søgningen efter måder til fremstilling af produkter af oven-10 nævnte type, lettere udføreIsesformer og højere udbytte har foranlediget de respektive opfindere til at undersøge specielt depolymerlseringen af heparin ad kemisk vej.

Det vil bemærkes, at udtrykket "heparin" anvendes i den foreliggende beskrivelse og kravene i sin bredeste betydning, til uden forskel at betegne et industrielt heparinprsparat af farmaceutisk kvalitet og et råt heparin, således som det fås ved ekstraktion af biologiske materialer, især væv fra pattedyr.

Man ved, at heparin udøver sin antikoagulerende virkning ved at forstærke inhibitorvirkningen af antitrombin III (AT III), som er et plasmaprotein, over for den række enzymatiske reaktioner, der udspiller sig under koagulationen.

20

Da heparin er i stand til samtidig at undertrykke et stort antal koagulationsfaktorer, der griber ind i skabelsen og vedligeholdelsen af forskellige former for hyperkoagulerbar-hed, syntes dets virkning ikke at være specifik, men derimod universel.

r DK 172877 B1 2

Selv om denne antikoagulerende virkning er værdifuld, gør den dog genskabelse af ligevægt i systemet koagulation/fi-brinolyse følsom hos patienter i behandling på grund af den universelle karakter af dens virkning. Det følger her-5 af, at administration (med det formål at forebygge risiko ! for hyperkoagulerlng, for eksempel forekomst af post-kirur- ! giske tromboser) af meget store doser af antikoagulerende j lægemiddel eller utilstrækkelig selektivitet af dette læge- middel til slut kan være årsag til alvorlige blødninger.

10 Opfinderne har derfor søgt efter sammensætninger af MPS, som har kæder af MPS, afledt af de i heparin forekommende, . men mere tilfredsstillende end heparinets kæder med hensyn til deres biologiske egenskaber.

Dybtgående undersøgelser af de forskellige betingelser for 15 depolymerisation af heparin har fået opfinderne til at konstatere, at det er muligt ved at arbejde under visse regulerede betingelser at depolymerisere heparinets kæder delvis _ indtil en grad, der svarer til opnåelse af en sammensætning af MPS, som har værdifulde antitrombotiske egenskaber. Dis-20 se MPS er i stand til at hæmme faktor Xa med en højere selektivitetsgrad end heparin samtidig med, at deres universelle antikoagulerende virkning er svagere end heparinens. De har derfor et fordelagtigt forhold mellem deres Yin-Wessler-titer og deres USP-titer.

25 Det vil erindres, at Yin-Wessler-aktiviteten specielt repræsenterer de aktive produkters evne til at forstærke hæmningen af blodets faktor Xa med AT III ved den tilsvarende prøve, og USP-titeren er de aktive produkters evne til at hæmme den totale koagulation af blod eller af plasma.

? 30 Yin-Wessler-titeren måles på den måde, der er beskrevet af ; : forfattere i J. Lab. Clin. Med. 1976, 81, 298-300, og UPS- titeren på den måde, der er beskrevet i "Pharmacopea of the 51 ri DK 172877 B1 3

United States of America", side 229 og 230 (se ligeledes 2. supplement, USP-NH, side 62, og 4. supplement, USP, side 90, under titlerne henholdsvis "Drug Substances" og "Dosage Forms").

Fra GB-A-2.002.406 kendes oligosaccharidsammensætninger med molekylvægte på 5 2000 til 5000 dalton, der er dannet ved depolymerisation af heparin. Endvidere indeholder de herfra kendte oligosaccharidsammensætninger funktionelle grupper, især sulfat-grupper, i mængder og i stillinger i molekylet, som er karakteristisk for naturligt forekommende heparin. Endelig har disse kendte sammensætninger en Yin-titer i intervallet 17,5-47,7 i modsætning til de ifølge opfindelsen fremstillede mucopolysaccharider, der 10 har en titer, som er fastholdt om ikke forøget i forhold til titeren for heparin.

Opfindelsens formål er således at tilvejebringe hidtil ukendte sammensætninger af MPS med forhøjet anti-Xa-aktivitet, og som over for faktor Xa har en bemærkelsesværdig selektivitet blandt de på hinanden følgende enzymatiske reaktioner, som er karakteristiske for koagulationsprocessen.

15 Opfindelsen angår således en analogi fremgangsmåde til fremstilling af produkter af den omtalte type ud fra heparin.

Sammensætningerne af MPS fremstillet ifølge opfindelsen kan fås ud fra heparin eller fraktioner, der omfatter heparinbestanddele med molekylvægte, der især ligger fra ca. 2.000 til 50.000, såsom de der fås ved ekstraktion af pattedyrvæv.

Sammensætningerne er især karakteristiske ved følgende træk:

De er opløselige i et vandigt/alkoholisk medium (vand/ethanol) med en styrke på 55 - 62°, de bliver mere uopløselige i et medium af vand og ethanol, som har et højere indhold af alko= hol, og de er uopløselige i ren alkohol. De har YW- og 25 USP-titere i et forhold, der er lig med mindst 2, især mindst 3 og med fordel over 6, nemlig over 10. Forholdene YW/APTT er ækvivalente, men lavere.

DK 172877 B1 4

Sammensætningerne fremstillet ifølge opfindelsen er isar karakteristiske ved, at de har kæder af MPS med endestillede molekyldele, som har strukturen af basen 2,5-anhydro-D-manno, hvis primære alkoholgruppe 6 er substitueret eller ikke substitueret ! 5 me<3 en -SO^-gruppe.

! ( Den endestillede molekyldel er karakteristisk ved følgende al- I mene formel: CH-OR_ : · £ : hvor R^ er en funktionel gruppe, valgt især blandt aldehyd-15 grupper, alkoholgrupper eller carboxylsyregrupper eller deres derivater, især acetaler, amider, ethere, estere eller tilsvarende salte, og Rg er et hydrogenatom eller en SO^-gruppe.

~ Det foretrækkes, at R^ er en aldehydgruppe, carboxylsyre- j gruppe eller alkoholgruppe.

na 20 De foretrukne sammensætninger ifølge opfindelsen er karakteristiske ved forholdene YW/USP af størrelsesordenen 10 eller mere med en Yin-Wessler-aktivitet højere end 200 ui/mg, eller med fordel over 250 ui/mg.

Produktet fremstillet ifølge opfindelsen udgøres endvidere med fordel af 25 en større mængde typer med molekylvægte fra ca. 2.000 til 8.000 dalton, hvilket svarer til strukturer, der har 8-40 saccharid-enheder.

^] Disse produkter kam fås ved depolymerisation af heparin ved den i det følgende beskrevne fremgangsmåde.

i :---1 DK 172877 B1 5

Til dette formål underkaster man heparin af den i krav l's indledning angivne art en depolymerisationsreaktion, som angivet i krav l's kendetegnende del.

Ved omhandlede depolymerisation af heparin-udgangsmaterialet fås en blanding, der for størstedelens vedkommende er dannet af produkter, som har Yin-Wessler- og USP-titere 5 i et forhold på over 2, især mindst 3, med fordel over 6, endog over 10 og en anti-Xa (Yin-Wessler)-aktivitet af størrelsesordenen mindst 200 ui/mg og med endestillede, reducerende grupper af strukturen 2,5-anhydro-D-mannose:

CH,OH

År K\ x:ho

Disse endestillede grupper fremkommer ved indvirkning af salpetersyrling på heparinets N-sulfat-glucosamin-molekyldele.

Depolymerisationen af heparin kan ligeledes med fordel udfø-10 res på en sådan måde, at der fås en sammensætning, som er dannet af molekyltyper, hvoraf størstedelen,fortrinsvis mere end 80 vægt% i forhold til udgangs-heparinet, er opløselige i et vandigt/alkoholisk medium (vand/ethanol), som har en styrke på 55 - 62°, fortrinsvis af størrelsesordenen 58°. De-polymerisationsbetingelserne kan ligeledes indstilles i for-15 hold til molekylvægtene af størstedelen af de typer, der findes i depolymerisationsblandingen. Disse betingelser skal så fastlægges for at få en majoritet af typer med molekylvægte på ca. 2.000 - 8.000 dalton (især fra 3.000 til 5.000 dalton), hvilket svarer til strukturer med 8-40 saccharid- * DK 172877 B1 6 molekyldele.

Når den ønskede depolymerisationsgrad er nået, skiller man fra depolymerisationsblandingen de MPS, som kan fældes med et alkoholisk opløsningsmiddel, og udvinder dem.

i 5 Med fordel drejer det sig om MPS, som udgør en slags "forbed- | ret" heparin. De har faktisk værdifulde biologiske egenska- s ber, især en mindre USP-titer end udgangs-heparinet, samtidig ! med, at den oprindelige Yin-Wessler-aktivitet, som findes i = heparinet, er bevaret, om ikke forøget.

: 10 Desuden kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen med fordel ud føres med et heparin af farmaceutisk kvalitet, således som - det findes i handelen, hvilket heparin er dannet af en majori tet af typer, som er uopløselige i et vandigt/alkoholisk medium med en styrke på 55 - 61°, fortrinsvis 58°.

15 Ved at udføre den partielle depolymerisation, som ovenfor vist, udvinder men heparinkæder, som har mere selektive biologiske egenskaber. Generelt udføres denne udvinding af aktive kæder med høje udbytter, indtil 80% eller mere i forhold til den behandlede mængde heparin.

20 Denne blanding af aktive kæder kan anvendes som sådan efter, under hensyntagen til de tilsigtede terapeutiske anvendelser, at være underkastet klassiske rensningsoperationer, såsom dialyse, kontakt med ionbytterharpikser, især kromatografiske operationer.

25 Ifølge en yderligere foranstaltning, der med fordel udføres 5 j for at tilvejebringe en blanding af MPS, som har endestillede grupper med større stabilitet, underkaster man den tidligere fremkomne blanding en behandling, som muliggør omdannelse af aldehydgruppen til en mere stabil funktionel gruppe, især en 30 syregruppe eller alkoholgruppe.

pi· ri k· as.f i i :i! DK 172877 B1 7 I en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes som udgangsmateriale med fordel et heparin, der har en molekylvagt på ca. 2.000 - 50.000.

Det kan dreje sig om et heparin af klassisk farmaceutisk kvalitet, som er injicerbart, eller et råt heparin, såsom 5 det, der fås ved udvinding af det aktive princip af vævs-organer fra pattedyr, især tarmslim eller lungeslim, for eksempel fra svin eller okse. Det kan også udgøres af de produkter, der normalt kasseres efter rensning af et heparin med henblik på at få et heparin af injicerbar kvalitet og med forhøjet specifik aktivitet.

10

Udgangs-heparinet underkastes indvirkning af salpetersyrling HN02. Denne syre virker på N-suIfat-glucosamin-molekyldelene i heparin og omdanner dem til grupper med strukturen 2,5-anhydro-D-mannose. Med fordel frembringer man salpetersyrlingen in situ ved tilsætning i regulerede mængder af en syre til et derivat af salpeter-^ syrling, især et salt eller et ethersalt. I en fordelagtig udførelsesform ifølge opfindelsen anvender man et alkalimetalsalt eller jordalkalimetalsalt, især natriumnitrit NaNC^.

For at udvikle salpetersyrlingen in situ tilsætter man regulerede mængder af en syre, som fortrinsvis har anioner, der er fysiologisk acceptable, såsom eddikesyre eller saltsyre.

Indvirkningen af salpetersyrling på heparin udføres fortrinsvis i vandigt medium.

Anvendelsen af disse foranstaltninger har især interesse med henblik på de tilsigtede biologiske anvendelser.

DK 172877 B1 8

Det vandige medium, hvori man udfører depolymerisationen, udgør faktisk et fysiologisk acceptabelt miljø, således at man kan undgå ethvert problem vedrørende fjernelse af et opløsningsmiddel, som er skadeligt for de nævnte anvendel-5 ser. Desuden er saltet, som dannes i mediet under produktionen af salpetersyrlingen, et vandopløseligt salt, nemlig natriumchlorid, hvis tilstedeværelse ikke er generende.

De senere rensningstrin af depolymerisationsblandingen, der er nævnt ovenfor, er derved lettet, idet der ikke er indført 10 nogen forbindelse eller organisk molekyltype i reaktions- j mediet.

® De forskellige parametre, som indgår i en kemisk reaktion, især koncentrationerne af reaktionsdeltagerne, varigheden, temperaturen og pH-værdien, indstilles med henblik på at få 15 de ønskede produkter under de mest tilfredsstillende forsøgsbetingelser.

Man ved i denne henseende, hvor snævert forbundne disse forskellige parametre i almindelighed er.

Det er klart, at ændring af en af disse faktorer kan medføre, „ 20 at en eller flere af de andre faktorer må indstilles.

Undersøgelse af disse forsøgsbetingelser for fremgangsmåden ifølge opfindelsen har vist, at det er fordelagtigt at anvende reaktionsdeltagere i mængder, som fører til en endelig koncentration af heparin af størrelsesordenen 1 - 10 g, fortrinsvis 1,5 - 5 g.

25 og især ca. 2 g, til 100 ml reaktionsmedium, idet den endelige koncentration af natriumnitrit kern variere fra 0,02 M til 0,1 M og fortrinsvis er af størrelsesordenen 0,05 M. Saltsyren anvendes i en tilstrækkelig mængde til at give en pH-værdi af reaktionsmediet af størrelsesordenen 2-3, fortrins-30 vis 2,2 - 2,7 og især 2,5.

Idet man arbejder ved en temperatur af størrelsesordenen 0 -i i DK 172877 B1 9 10°C, fortrinsvis af størrelsesordenen 4°C, lader man reaktionsdeltageme reagere i tilstrækkelig tid til at få den Ønskede depolymerisations-grad. Som eksempel kan nævnes, at en inkubation i ca. 10 minutter har vist sig tilfredsstillende, når man arbejder ved 5 4°C.

Mern afbryder så depolymerisationen.

Til dette formål benytter man med fordel en forøgelse af mediets pH-værdi.

Tilsætning af et alkalisk middel, for eksempel natriumhydrox= 10 id, i tilstrækkelig mængde til at give en pH-værdi på mindst neutralpunktet eller svagt alkalisk, muliggør den ønskede afbrydelse af depolymerisationsreaktionen.

Man fraskiller derefter mucopolysacchariderne, som udfælder med et alkoholisk opløsningsmiddel.

15 Anvendelse af absolut ethanol i en mængde på ca. 5 rumfang gør det muligt at få den ønskede adskillelse.

Bundfaldet udvindes og vaskes og tørres med henblik på anvendelsen.

Ved at anvende de ovennævnte foranstaltninger isolerer man 20 MPS, som har titere YW og USP i et forhold af størrelsesordenen 10/1, med en Yin-Wessler-aktivitetstiter større end 200 ui/mg, og dette ved at anvende et udgangs-heparin, som har YW/USP-forhold af størrelsesordenen 1.

Ifølge en supplerende foranstaltning omdanner man aldehyd-25 grupperne i de endestillede reducerende grupper til funktionelle grupper, der er mere stabile, såsom alkoholgrupper eller syregrupper, hvilket fører til MPS-kæder, der for størstedelens vedkommende er afsluttet af molekylgrupper med DK 172877 B1 10 strukturen 2,5-anhydro-D-raannitol eller 2,5-anhydro-D-mannon-syre.

For at omdanne de endestillede grupper 2,5-anhydro-D-mannose til 2,5-anhydro-D-mannitol-grupper, underkaster man de tid-5 ligere opsamlede produkter fra udfældningen indvirkning af et reduktionsmiddel, idet der benyttes betingelser, som gør ! det muligt at opnå i det mindste en del af den ønskede om dannelse.

i

Reduktionsmidlet vælges blandt dem* der traditionelt anven-10 des til omdannelse af aldehydgrupper til alkoholgrupper, i Blandt disse midler synes det fordelagtigt at anvende et metalborhydrid.

: Man udfører med fordel reaktionen i vandigt medium i nærværel se af natriumborhydrid eller kaliumborhydrid i flere timer.

~ 15 Ved at arbejde ved omgivelsernes temperatur, fortrinsvis un der omrøring, er det tilstrækkeligt at lade blandingen reagere i ca. 4 timer. Man iagttager en forøgelse af reaktions-- mediets pH-værdi. Denne pH-værdi kan nå en værdi af størrel sesordenen 10, hvor det drejer sig om anvendelse af NaBH^, i 20 hvilket tilfælde man iagttager en frigørelse af natriumhy= droxid.

For at ødelægge det borhydrid, som ikke har reageret, sænker man pH-værdien ved tilsætning af syre.

I de særligt betragtede tilfælde synes det fordelagtigt at 25 sænke pH-værdien ved tilsætning af for eksempel eddikesyre.

Man genindstiller derefter pH-værdien til en værdi i nærheden af neutraliteten, især af størrelsesordenen 7,5, ved tilsætning af et alkalisk middel, for eksempel natriumhydroxid.

n DK 172877 B1 11

Man udvinder af reaktionsmediet de produkter, som kan udfældes med alkohol, og man udvinder det dannede bundfald, som indeholder de søgte produkter, hvori endestrukturen 2,5-anhydro-D-mannose er omdannet til strukturen 2,5-anhydro-5 D-mannitol.

Den pågældende udfældning kan udføres ved tilsætning af absolut ethylalkohol, fortrinsvis i en mængde på 5 rumfang.

For at isolere de tilstræbte reducerede produkter foretager man med fordel en centrifugering og opsamler bundfaldet fra 10 centrifugeringen, som derefter eventuelt vaskes og tørres.

Undersøgelse af de således fremkomne MPS viser, at de har YW/USP-titere af størrelsesordenen 10 eller mere og Yin-Wessler-aktivitetstitere større end 200 ui/mg, fortrinsvis over 250 ui/mg.

15 I en udførelsesform omdanner man 2,5-anhydro-D-mannosegrup- peme til 2,5-anhydro-D-mannonsyregrupper.

Under de nødvendige betingelser for at opnå den ønskede omdannelse lader man produkterne med endestillede 2,5-anhydro-D-mannosegrupper reagere med et iltningsmiddel valgt blandt 20 dem, der sædvanligvis anvendes til omdannelse af aldehydgrupper til carboxylsyregrupper, især permanganater.

Reaktionen udføres med fordel i vandigt medium med en pH-værdi større end neutralitet.

Oxidationen af aldehydgrupperne til syregrupper medfører et 25 fald i pH-værdlen,scm det er fordelagtigt at indstille konstant under reaktionen.

Ved at arbejde ved omgivelsernes temperatur får man efter ca.

15 timer den ønskede oxidation. Man udvinder af reaktions- DK 172877 B1 12 blandingen de produkter, som udfælder med et alkoholisk opløsningsmiddel .

Bundfaldet bliver derefter med fordel vasket og tørret.

Det er klart, at de foregående angivelser af molekylvægte 5 (og de, der følger, især i eksemplerne) stammer fra målin ger af opholdstid af opløsninger, som har et bestemt indhold i af undersøgt stof, i gel-permeations-forsøg gennem en gel kolonne under elueringsbetingelser, der ligeledes er bestemt, ! idet logaritmerne til disse angivelser af molekylvægt står 10 i samme proportionalitetsforhold til de nævnte målte opholds-i tider san logaritmerne til molekylvægtene på henholdsvis I 4.000, 6.500, 16.000 og 31.000 af standard-natriumpoly= s styrensulfonaterne,især de der findes i handelen fra selska bet Chrompack (Orsay-les-Ulis, Frankrig), til deres respek-15 tive opholdstider, målt i et system og under identiske gel-permeationsbetingelser.

For så vidt som de behandlede produkter, uanset den opnåede rensningsgrad, findes som salte af et fysiologisk acceptabelt metal, såsom natrium, kan de derefter omdannes til blan-20 dede salte eller simple salte, indeholdende et andet metal, som er fysiologisk acceptabelt, såsom calcium, ved enhver fremgangsmåde, der er anvendelig til heparinsalte. Med fordel kan man benytte den fremgangsmåde, der er beskrevet i fransk patent nr. 73 13580, indleveret den 13.april 1973 25 af de respektive ansøgere. Det vil erindres, at denne fremgangsmåde i det væsentlige består i, når man for eksempel går ud fra et natriumsalt af heparin, at bringe dette i kontakt med et andet salt af et andet fysiologisk acceptabelt metal, for eksempel calciumchlorid, i en opløsning og der-30 efter fraskille de metalioner, som ikke er bundet til heparin (for eksempel ved alkohol-udfældning eller dialyse) og i det omfang, hvor den opnåede substitutionsgrad ikke er DK 172877 B1 13 tilstrækkelig, igen at bringe det ved den første kontakt fremkomne blandede heparinsalt i kontakt i en opløsning med en ny dosis af det andet salt, især calciumchlorid, afhængende af den ønskede endelige substitutionsgrad.

5 EKSEMPEL I.

Delvis depolymerisation af heparin og fremstilling af en blanding af MPS, som har yin-Wessler-aktiviteter på mindst 10 240 ui/mg, et forhold mellem YW-titeren og USP-titeren på mindst 14 og endestillede reducerende grupper med strukturen 2,5-anhydrod-D-mannose, nemlig: ch2oh

S

-0 ’-V.

XCH0 20 hvor den primære 6-hydroxylgruppe kan være substitueret på forskellig måde, især med en gruppe so”.

Man underkaster med fordel et heparin-udgangsmateriale en styret indvirkning af HN02 ved at gå frem som følger.

Man opløser 60 g industrielt heparin, som har et forhold 25 yw/usp på ca. 1 og en USP-titer på 160 ui/mg, i 3 liter destilleret vand ved +4°C.

Man tilsætter natriumnitrit NaN02 i en mængde tilstrækkelig til at give en opløsning på 0,05M, for eksempel 10,35 g, og indstiller derefter pH-værdien til 2,5 ved hjælp af ren salt-30 syre og omrører ved +4°C i 10 minutter. Han indstiller så DK 172877 B1 14 pH-værdien til 7,5 ved hjælp af 5N natriumhydroxid.

Ved tilsætning af 5 rumfang ren ethanol (for eksempel 15.500 ml) udfælder man reaktionsprodukterne. Man udvinder ved centrifugering det dannede bundfald. Man vasker 5 det med ethanol og tørrer det ved 60°C i højvakuum. Man opsamler 60 g produkt, som har følgende egenskaber: 1 USP-titer : 17 ul/mg, I YW-titer i 240 ul/mg, j APTT-titer x): 12 ul/mg.

! 10 x) Forkortelse for det engelske udtryk "activated partial i thromboplastin time" (ækvivalent med "Temps de Céphaline

Kaolin", J.Caen m.fl., L'lémostase, edit. Expansion - Scientifique (1976, 169-170).

= I et andet forsøg går man frem som ovenfor beskrevet, men an- 15 vender som udgangsmateriale et andet parti heparin med en I USP-titer på 165 ui/mg og et forhold YW/USP af størrelses ordenen 1.

i Man opløser 3 g deraf i 150 ml destilleret vand ved +4°C

og tilsætter derefter 517 mg Na NO2 til reaktionsmediet.

20 Efter den ovenfor beskrevne behandling udvinder man 2,8 g produkt, som har en USP-titer på 24 ui/mg og en Yin-Wessler-aktivitetstiter på 250 ui/mg.

Ifølge endnu et under de ovenfor definerede betingelser udført forsøg anvendes 50 g heparin med en USP-titer på 25 158 ui/mg og et forhold YW/USP på ca. 1.

Man opløser det i 2.500 ml destilleret vand ved +4°C og tilsætter 8,625 g Na NC^· Efter behandlingen udvindes 46 g produkt, som har følgende egenskaber: v r DK 172877 B1 15 USP-titer : 13 ui/mg, YW-aktivitetstiter : 270 ui/mg, APTT-titer : 7 ui/mg.

EKSEMPEL XI.

5 Partiel depolymerisation af heparin og fremstilling af en blanding af MPS, som har Yin-Wessler-aktiviteter på 250 ui/mg, et forhold mellem YW- og USP-titere på 15 og endestillede grupper, som har strukturen 2,5-anhydrid-D-mannitol, nemlig: ch2oh (fl -°N-^

CH20H

hvor den primære 6-alkoholgruppe kan være substitueret som 15 forklaret ovenfor.

Man opløser 47 g af det i eksempel I fremkomne produkt i 1.200 ml destilleret vand ved omgivelsernes temperatur. Under kraftig omrøring tilsættes 7 g kaliumborhydrid KBH^.

Denne omrøring opretholdes i 2 timer ved omgivelsernes tem-20 peratur, og derefter tilsættes eddikesyre til reaktionsmediet for at sænke pH-værdien til 4,0 og derved ødelægge KBH4, som ikke er blevet forbrugt.

Man omrører mediet i 30 minutter og indstiller derefter pH-værdien til 7,5 med 5N natriumhydroxid.

25 Man sætter 5 rumfang alkohol til reaktionsmediet.

Det dannede bundfald opsamles, lufttørres, vaskes med ren ethanol og tørres i vakuum ved 60°C.

DK 172877 B1 16

Man udvinder 46,5 produkt, som har følgende egenskaber: USP-titer : 17 ui/mg, YW-aktivitets- titer : 250 ui/mg, 5 APTT-titer : 11 ui/mg.

1 EKSEMPEL III.

Partiel depolymerisation af heparin og fremstilling af en I blanding af MPS, som har Yin-Wessler-aktiviteter på j 270 ui/mg, et forhold mellem YW-titeren og USP-titeren 10 på 22 og endestillede grupper, som har strukturen 2,5-an= , hydro-D-mannitol, nemlig:

CH-OH

: 15 fc\

COOH

= idet den primære 6-hydroxylgruppe kan være substitueret som . 20 allerede anført.

Man opløser 40 g produkt, fremkommet ved det sidste forsøg, der er beskrevet i eksempel I, i 400 ml destilleret vand ved omgivelsernes temperatur.

Man indstiller pH-værdien til 8,5 med 5N natriumhydroxid, og 25 derefter tilsættes 2 g kaliumpermanganat KMnO^, opløst i 40 ml vand.

Man underkaster reaktionsblandingen en kraftig omrøring i 15 timer. Under denne omrøring indstiller man konstant blandingens pH-værdi til 8,5 med 5N natriumhydroxid.

i F '1 DK 172877 B1 17

Efter 15 timer tilsætter man 0,2 rumfang alkohol (90 ml) for at fuldende reduktionen af KMn04, som ikke har reageret.

Man lader reaktionsblandingen hvile i 1 time. Man fjerner det dannede bundfald af Mn02 ved centrifugering. Ved udfæld-5 ning med ethanol udvinder man reaktionsprodukterne, som man vasker og tørrer. Man opsamler derved 35 g produkt, som har følgende egenskaber: USP-titer : 12 ui/mg, YW-aktivitetstiter < 270 ui/mg, 10 APTT-titer : 8 ui/mg.

De ifølge opfindelsen fremstillede produkter kan anvendes i alle de nyttige terapeutiske saltformer, især af fysiologisk acceptable metaller (såsom natrium-, calcium- eller blandede salte). Man omdanner eventuelt salt ti! et andet ved fremgangsmåden, der er 15 beskrevet i fransk patentansøgning 73 13580, indleveret den 13. april 1973 af de respektive ansøgere.

Farmakologisk undersøgelse af produkterne fremstillet ifølge opfindelsen har vist, at de har en virkning, der er tydeligt mere selek-20 tiv end virkningen af heparin, især til hæmning af faktor Xa.

Endvidere har de den fordel ikke at fremkalde blodpladeaggre— gation med blod fra patienter, hos hvem heparin fremkalder en sådan reaktion.

Som eksempel anføres i det følgende de resultater, der er opnået ved at afprøve 25 produkterne fremstillet ifølge opfindelsen i forskellige systemer.

DK 172877 B1 18 1) Man har undersøgt In vitro på menneskeblod deres virkning over for blodplader. Man har således konstateret/ at i doser ækvivalente med heparin-doser havde produkterne den fordel ikke at fremkalde en blodpladeaggregation af blodet fra patien- 5 ter, over for hvilket heparin fremkaldte en sådan reaktion.

2) Blødningstideme hos dyr, behandlet med MPS fremstillet ifølge opfindelsen, er blevet sammenlignet med dem, der fremkom med hepa- ‘ rin.

i i Til dette formål har man bevirket et sår på underlivet af en 10 rotte, der forud er anæstetiseret og barberet. Snitsåret blev bevirket ved afrivning af en hudlap, som blev dækket med gaze i 10 minutter. Efter ekstraktion af blodet med destil-ϊ leret vand har man målt hæmoglobinmængden ved en spektrofoto- metrisk metode. Man har udtrykt resultaterne i procent i 15 forhold til den udvundne mængde hæmoglobin fra et dyr, der modtog en placebo.

d Ved at administrere 5-10 mg/kg af produkterne fremstillet ifølge opfin- a delsen var den opsamlede mængde hæmoglobin 130% af den, der fremkom med en placebo, medens man med heparindoser på 1, 2 20 og 4 mg/kg har fået procentmængder på henholdsvis 170, 180 og 325%.

3) Endelig har man undersøgt den antitrombotiske virkning in vivo hos kanin efter Wessler's model: Man har administre ret 20 u/kg koncentreret protrombinkompleks (Konyne fra Laboratoire Cutter) til 25 kaninen, og derefter 0,5 ml hugormegift, Russel, for at fremkalde dannelse af trombin. Virkningen af produkterne fremstillet ifølge opfindelsen er undersøgt i sammenligning med heparin, når man administrerer dem 15 minutter før Injektion 30 af de trombogene produkter. De fremkomne resultater er følgende: r » i DK 172877 B1 19

Produkter fremstillet Dosis Heparin ifølge opfindelsen 500 u YW/kg total beskyttelse total beskyttelse 250 u YW/kg total beskyttelse total beskyttelse 125 u YW/kg delvis beskyttelse delvis beskyttelse 62,5 u YW/kg ingen beskyttelse lille beskyttelse 5 Man konstaterer altså af resultaterne af disse prøver, at produkterne fremstillet ifølge opfindelsen har en antitrombotisk virkning, der mindst er ækvivalent med virkningen af heparin og fordelagtigt udøver en mindre reaktion over for blodpladerne og muliggør nedsættelse af blødningstiden. Disse resultater be- 10 viser således, at produkterne ifølge opfindelsen udøver en meget svag virkning på den universelle antikoagulerende virkning, men har en antitrombotisk virkning af stor interesse.

Fordelagtigt har produkterne fremstillet ifølge opfindelsen ingen toksicitet.

15 Administration af for eksempel 10.000 u/kg (Yin-Wessler-titer) af produkterne ifølge eksempel I fremkalder hos kanin ikke nogen toksisk reaktion og heller ingen pyrogen virkning i pyrogenicitetsprøven på kanin ifølge den franske farmakopé .

20 25

Claims (11)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af fra heparin afledede mucopolysaccharider dannet af en blanding af mucopolysaccharidkæder, hvilken blanding har følgende egen-i 5 skaber: i den omfatter en større mængde bestanddele med molekylvægte fra ca. 2000 til ca. 8000 dalton, den er opløselig i et vandigt/alkoholisk medium (vand-ethanol) med en styrke på 55-61 °GL, fortrinsvis i størrelsesordenen 58°GL, 10. den bliver mere uopløselig i et medium af vand og alkohol, som har et højere ind-= hold af alkohol, = - den er uopløselig i ren alkohol, ΐ - den har YW- henholdsvis USP-titere i et forhold på mindst 3 med en YW-aktivitet, som er bibeholdt i forhold til heparin, hvis den ikke er forøget, 15. den omfatter en større mængde bestanddele med endegrupper, som har 2,5-anhydro- D-manno-basisstrukturen, hvori en primære alkoholfunktion i 6-stillingen eventuelt er substitueret med en -S03-gruppe, samt deres farmaceutisk acceptable salte, kendetegnet ved, at heparin med molekylvægte i intervallet fra ca. 2000 til 50.000 underkastes indvirkning af salpetersyrling, som dannes in situ ved tilsætning af 20 regulerede mængder af en syre til et uorganisk salt af salpetersyrlingen, idet denne reaktion udføres i et vandigt medium ved en temperatur fra ca. 0eC til omgivelsestemperatur, og når depolymerisationsgraden ved opnåelse af molekylvægte fra ca. 2000 til ca. 8000 dalton for mucopolysaccharideme er nået, afbrydes depolymerisationeme, og mucopolysaccharideme med en 2,5-arihydro-manno-struktur i kædens ende frasepareres.

2. Fremgangsmåde tfølge krav I,kendetegnet ved, at salpetersyrlingen dannes in situ ved tilsætning af regulerede mængder af en syre til et derivat af et mineralsalt af salpetersyrlingen, især et alkalimetalsalt eller jordalkalimetalsalt. * Ί " 1 i DK 172877 B1

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at mineralsaltet af salpetersyrlingen er natriumnitrit.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3,kendetegnet ved, at salpetersyrlingen dannes in situ ved tilsætning til natriumnitritet af en syre, som har fysiologisk acceptable anio- 5 ner, såsom eddikesyre og fortrinsvis salpetersyre.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2-4, kendetegnet ved, at den endelige koncentration af heparin fortrinsvis er 1-10 g, fortrinsvis 1,5-5 g og især ca. 2 g til 100 ml reaktionsmedium, idet den endelige koncentration af natriumnitrit kan variere fra 0,02 M til 0,1 M og fortrinsvis er ca. 0,05 M.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at man til dannelse af salpetersyrling In situ tilsætter saltsyre i reguleret og tilstrækkelig mængde til at give en pH-værdi af størrelsesordenen 2-3, fortrinsvis 2,2-2,7 og især 2,5.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, kendetegnet ved, at man arbejder ved en temperatur af størrelsesordenen 0-10eC, fortrinsvis 4°C, i tilstrækkelig tid til at opnå 15 den ønskede depolymerisationsgrad, hvilken tid er ca. 10 minutter, når man arbejder ved 4°C.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-7,kendetegnet ved, at man afbryder depoly-merisationen og forøger reaktionsmediets pH-værdi ved tilsætning af et alkalisk middel til værdier i nærheden af neutralitet eller svagt alkaliske værdier.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1-8, k e n d e t e g n e t ved, at man til udvinding af de søgte produkter med endestillede grupper 2,5-anhydro-D-mannose sætter alkohol til reaktionsmediet, fortrinsvis i en mængde på ca. 5 rumfang i forhold til rumfanget af mediet, og at man udvinder det dannede bundfald. DK 172877 B1

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1-9, k e π d e t e g n e t ved det yderligere trin, at man omdanner de endesrillede grupper med strukturen 2,5-anhydro-D-mannose ril grupper af strukturen 2,5-anhydro-D-mannitol ved reduktion ved hjælp af et reduktionsmiddel valgt blandt dem, der sædvanligvis anvendes til omdannelse af aldehydgrupper til alko- . 5 holgrupper, især ved hjælp af et metalborhydrid, og at man udvinder de fremkomne reducerede produkter. i

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1-10, kendetegnet ved det yderligere trin, at 1 man omdanner de endestillede grupper med strukturen 2,5-anhydro-D-mannose til grupper med strukturen 2,5-D-anhydromannonsyre ved at underkaste mucopoly-: 10 saccharidprodukteme indvirkning af et oxidationsmiddel valgt blandt dem, der sædvan ligvis anvendes til omdannelse af aldehydgrupper ril syregrupper. r =1