DK166031B - Gaeringsproces, gaeringssubstrat samt anvendelse af det ved koagulering af frugtvand opnaaede kartoffelprotein - Google Patents

Description

i

DK 166031 B

Opfindelsen angår en gæringsproces og et gæringssubstrat , samt anvendelse af det ved koagulering af frugtvand opnåede kartoffelprotein.

Med udtrykket "gæringsproces" betegnes enhver 5 fremgangsmåde, som tager sigte på ved forgæring at fremstille sådanne stoffer som enzymer, organiske syrer, antibiotiske stoffer, polysaccharider, aminosyrer eller vitaminer.

Ved udførelsen af sådanne fremgangsmåder anvendes 10 gæringsmedier, hvori der er inkorporeret uundværlige næringsstoffer hørende til gruppen af carbonhydrater, mineralsalte, mikronæringsstoffer, vitaminer og proteinmaterialer, der tilfører aminosyrer, polypeptider og proteiner.

15 De hidtil anvendte proteinmaterialer har i almin delighed været sojakager, gær og gærekstrakter, majs-udblødningsvæske eller majsstøbevæske, blodmel, mælkeproteiner og/eller såkaldte "pharmamedia", der almindeligvis har givet tilfredsstillende resultater.

20 Ved opfindelsen tilsigtes det imidlertid at til vejebringe en gæringsproces og et substrat af den omhandlede art, som medfører forbedrede resultater, navnlig med hensyn til gæringsudbyttet, og som gør det muligt i meget høj grad at forøge værdien af et udgangs-25 materiale, hvis kendte anvendelser ikke udnytter alle fordelene.

Det har vist sig, at kartoffelprotein, der er opnået ved koagulering af plantevandet eller "frugtvandet" -, som er et velkendt produkt fra kartoffelmelsfabrik-30 ker og fremkommet ved udvinding af stivelse og pulp fra kartoffelknolde - anvendt som protein-næringsstof har gjort det muligt at forøge udbyttet ved visse gæringsprocesser betydeligt og har medført en række andre fordele, som vil blive omtalt nærmere i det følgende.

35 Det fortjenstfulde i denne erkendelse er så meget større, som alt hidtil har ført til den antagelse, at anvendelse af det omhandlede kartoffelprotein ville være nytteløs, navnlig på grund af, at proteinet forekommer 2

DK 166031 B

i en fuldstændig uopløseliggjort og denatureret form, og selv om det allerede var kendt som proteinkilde ved gæringsprocesser direkte at udnytte mere eller mindre koncentreret eller delvis deproteiniseret frugtvand, og 5 desuden pulvere, som indeholder de samme proteiner i opløselig form, hvilke pulvere eksempelvis er blevet opnået ved forstøvning af koncentreret frugtvand.

Dette gælder især også med henblik på Chemical Abstracts, vol. 53, spalte 641 e-g, B. Mica et al.

10 "Vegetative water from potatoes as nutritive medium in fermentative processes.", 1959, hvorfra man kender anvendelse af kartoffelfrugtvand med samtlige dets bestanddele ved en gæringsproces. Heraf kan man ikke udlede noget om proteiner, der er opnået ved koagulering 15 af kartoffelfrugtvand, eller anvendelse af sådanne proteiner ved en gæringsproces. Fra US patentskrift nr.

2.594.309 kendes endvidere udvinding af kartoffelprotein ved koagulering af frugtvand og anvendelse af dette protein som næringsmiddelprodukt. Herved er anvendelse 20 ved en gæringsproces imidlertid ikke taget i betragtning.

I overensstemmelse med det ovenstående er gæringsprocessen ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man som proteinholdigt næringsstof i gæringsmediet anvender en effektiv mængde kartoffelprotein, opnået 25 ved koagulering af frugtvand.

Gæringssubstratet ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at det som proteinholdigt næringsstof indeholder en effektiv mængde kartoffelprotein, opnået ved koagulering af frugtvand.

30 Endvidere tager opfindelsen sigte på som hidtil ukendt anvendelse af kartoffelprotein, opnået ved koagulering af frugtvand, at udnytte dette ved sammensætningen af et gæringssubstrat.

Opfindelsen vil blive nærmere forklaret i den 35 efterfølgende beskrivelse med udførelseseksempler, navnlig i forbindelse med fordelagtige udførelsesformer.

3

DK 166031 B

Til udførelse af gæringsprocesser går man frem på efterfølgende eller på lignende måde, idet man som u-undværligt proteinmateriale til god afvikling af gæringen gør brug af en effektiv mængde kartoffelprotein, op-5 nået ved koagulering af frugtvand.

Ved "effektiv mængde" forstås den mængde kartoffelprotein, som tages i arbejde ifølge opfindelsen, og som tilfører samme mængde virkelig protein som de hidtil anvendte proteinkilder.

10 Koaguleringen af proteinet i frugtvandet kan opnås ad termisk, kemisk eller termokemisk vej.

Proteinet indeholder over 70 % protein, regnet som N x 6,25, baseret på tørstoffet, og almindeligvis fra 72 til 75 % protein.

1 R

Ved termokemisk koagulering opnås et produkt, som er tilfredsstillende, og som efter tørring og formaling forekommer i form af et fint pulver med grå til grønlig farve, og med en typisk sammensætning som følger: 20 - Vand ........................... 8 til 9 % - Proteiner (N.x-6,25) ............75 til 82 % - Kalcineringsrest ................ 1 til 3 % - Vand-ekstrakt ................... 3 til 7 % - Ether-ekstrakt .................. 4 til 6 % 25 Etherekstrakten udgøres for størstedelen af fedtsyrer.

Mængden af visse af disse fedtsyrer kan være som følger: - Laurinsyre ..................... 1 % - myristinsyre ................... 1 % - Palmitinsyre ...................27 % 30 _ - Stearinsyre .................... 7 % - Oliesyre ....................... spor - Linolsyre ......................60 %

Indholdet af de forskellige aminosyrer i det om- 35 handlede protein kan fordele sig som følger: 4

DK 166031 B

„ vægt% af amino- ^ nitrocren - Asparaginsyre............. 12,6 - Glutaminsyre ............. 10,2 5 - Alanin .................... 4,6 - Arginin ................... 4,8 - Cystin ............'........ 1,5 - Glycin .................... 4,8 - Histidin .................. 1,8 1 o - Isoleucin ................. 5,9 - Leucin .................... 10,0 - Lysin ..................... 7,5 - M^thionin ................. 2,1 - Phenylalanin .............. 6,2 15 - Prolin .................... 4,8 - Sérin ..................... 5,3 - Threonin ................. 5,7 - Tyrosin .................. 5,2 - Valin ................... 7,0.

20

Med henblik på opnåelse af det omhandlede protein kan man gå frem som følger:

Frugtvandet bringes på en pH-værdi på fra 4,6 til 5,2 ved tilsætning af en uorganisk eller organisk syre, 25 hvorefter det bringes op på en temperatur, der er tilstrækkelig til at fremkalde flokkulering af proteinerne, almindeligvis en temperatur mellem 90 og 110°C. Denne temperatur holdes i et tidsrum, som er tilstrækkelig til afslutning af flokkuleringen, dvs. til afluftning af 20 flokkulatet og til at befri det for den væske, hvori det er suspenderet. Almindeligvis holdes temperaturen i et tidsrum på omkring 5 til 15 minutter. Derpå frasepareres det opnåede flokkulat, eksempelvis ved centrifugering, hvorpå det tørres i et pneumatisk tørreapparat.

25 Dette protein repræsenterer blot omkring 25 til 30 % af tørstofindholdet i frugtvandet og indeholder kun en ringe mængde af de essentielle biologiske bestanddele, som oprindelig er tilstede i frugtvandet, hvilket 5

DK 166031 B

har skabt en yderligere uheldig fordom imod udnyttelsen af dette protein i gæringsfremgangsmåder.

For fuldstændigheds skyld erindres om, at frugtvandet fremkommer, når man, med henblik på udvinding 5 af stivelsen og pulpen af kartofler, i kartoffelmelsfabrikker sønderdeler kartoffelknoldene på en sådan måde, at cellerne i knoldene brydes itu, og at man derefter skiller stivelsen og pulpen fra den således opnåede grød eller raspemasse. Det derved opnåede resterende 10 plantevand eller "frugtvand" indeholder i opløsning størstedelen af de fra stivelsen og pulpen forskellige bestanddele og omfatter altså foruden de tilstedeværende proteiner i overvejende mængde et meget stort antal forbindelser af høj biologisk værdi, såsom vitaminer, 15 mineralske stoffer, organiske syrer, carbonhydrater og fedtstoffer.

Udover at kartoffelproteinet muliggør en væsentlig forøgelse af udbyttet ved visse gæringsprocesser, medfører det for disse processer følgende vigtige fordele: 20 - Meget lettere sterilisation af gæringsmediet, - mindre viskositet af gæringsmediet, med deraf følgende væsentligt lettere omrøring og luftning, - let rensning af kulturvæsken, og 25 - nedsættelse af forureningen, hvilket vil blive nærmere omtalt i det følgende.

Således kan der eksempelvis ved fremstilling af α-amylase opnås udbytter på over 50 % ved erstatning af det sædvanligt anvendte sojaprotein med koaguleret 30 kartoffelprotein.

Da indholdet af virkeligt protein i det ifølge opfindelsen anvendte proteinmateriale er tilnærmelsesvis dobbelt så stor som i sojakager, kan der opnås samme nitrogenmængde ved anvendelse af en halv så stor ^ mængde kartoffelprotein. Heraf følger en meget mindre viskositet af mediet såvel som en meget lettere luftning og omrøring.

6

DK 166031 B

Rensningen af kulturvæsken er desuden lettere på grund af den manglende tilstedeværelse af indifferente stoffer, som f.eks. cellulosematerialer, hvilket medfører en formindskelse i tab af værdifulde produkter i 5 filterkagen eller centrifugeringsslammet.

Da kartoffelproteinet efter formalingen har en meget fin kornstørrelse, under 200 ym og almindeligvis under 50 ym,dispergeres det meget let i vand, hvilket letter sterilisationen af mediet.

10 Da produktet er opnået ved varmekoagulering og på følgende tørring i et fødemiddelapparatur, har det desuden et meget ringe bakteriologisk forureningsniveau, hvilket er af stor interesse i gæringsprocesser.

De forøgede gæringsudbytter, som opnås ved anven-15 delsen af kartoffelprotein medfører endelig en bedre produktivitet af materiellet og muliggør betydelig nedsættelse af forureningen per produceret biologisk enhed.

Udnyttelsen af dette kartoffelprotein i gærings-20 processen ifølge opfindelsen eller i sammensætningen af gæringssubstrater realiseres ved indføring af proteinet i gæringsmediet under omrøring, medens alle de andre foranstaltninger i forbindelse med fremgangsmåden er analoge med de i de allerede kendte fremgangsmåder an-25 vendte foranstaltninger.

De efterfølgende eksempler vedrører fordelagtige udførelsesformer.

Eksempel 1 3Q Fremstilling af bakterielt g-amylase.

To gæringsbeholdere B. og B0 af typen d?) ^ BIOLAFITTE ]?å hver 20 liter påfyldtes gæringsmedier indeholdende følgende bestanddele: „ _ B1 B2

Malto-dextrin 750g 750g 35 NH4N03 60 g 60 g

Kartoffelprotein 590 g Og

Sojakager 0 g 1050 g 7

DK 166031 B

Det anvendte, ved varmekoagulering flokkulerede kartoffelprotein var i form af et meget fint pulver, hvor 99 vægt% af partiklerne havde en størrelse på under 50 ym. Det viste et tørringstab på 6,2 % og viste 5 84,9 % proteiner, beregnet på tørstofindholdet, (N x 6,25) .

Dette proteins kalcineringsrest var på 2,7 %, procentmængden af totale lipider var 3,5 %, og ekstrakt med vand var på 6,0 %, hvilke tre sidstnævnte procent-1 o satser er beregnet på det kommercielle materiale som sådan.

De i det foreliggende eksempel anvendte sojakager indeholdt ca. 48 % protein (N x 6,25).

Indholdet i hver af de to gæringsbeholdere ind-15 stilledes på 15 liter. De podedes hver især med 300 ml af en 48 timers forkultur af Bacillus subtilis, dyrket på et substrat indeholdende 2 % gærekstrakt og 5 % malto-dextrin.

Gæringsbetingelserne i gæringsbeholderne og 20 var som følger:

Luftning : 1 rumfang luft per minut, altså 22 1/minut.

Omrøring : 700 omdrejninger/minut.

Temperatur : 35°C.

25

Produktionen af α-amylase fulgtes i hver af gæringsbeholderne ved måling af aktiviteten ved UBR-metoden (Unite Bactérienne RAPIDASE). Ifølge denne metode bedømmes bakterieamylasers dextrindannelses-aktivi-30 tet ved måling af den tid, der er nødvendig til fremkomst af en ændring i en iodfarvning af substratet, hvilken ændring svarer til en omdannelse af dette til dextrin. UBR-enheden er defineret som den mængde enzym, der omdanner 1 mg stivelse til dextrin i løbet af 1 mi-35 nut.

Efterfølgende tabel I angiver de opnåede resultater.

DK 166031 B

8 '

Tabel I

Gæringstid Aktivitet i Aktivitet i _ B 1 (i UBR)_B 2 (i UBR) 5 19 h 400 190 26 h 620 300 43 h 785 550 67 h 1300 700 10 Dette forsøg blev gentaget fem gange efter hinan den- De efter et tidsrum på 67 timer opnåede aktiviteter under disse feir. forsøg er angivet i tabel II.

Tabel II 15

Forsøg Aktivitet i Aktivitet i __B 1 (i UBR)_ B 2 (i UBR) 1 1 300 700 2Q 2 1 150 750 3 1 220 800 4 1 380 730 _ i 210 770 25 Af talangivelserne i tabel II udledes en middel aktivitet på 1250 UBR ved anvendelse af kartoffelprotein og på 750 UBR ved anvendelse af sojakage. Det fremgår altså, at der er en aktivitetsforøgelse på 500 UBR, eller ca. 66,7 %, i forhold til den med soja-30 kage opnåede aktivitet.

Foruden denne meget betydelige forbedring af aktiviteten viser anvendelsen af kartoffelprotein flere andre vigtige fordele i forhold til anvendelsen af sojakager .

35 Viskositeten af gæringsmediet er ikke så stor i gæringsbeholderen B 1, hvilket letter luftningen.

Flokkuleringen af bakterieorganismerne såvel som filtreringen er lettere, når det drejer sig om mediet 9

DK 166031 B

på basis af kartoffelprotein. Efter opvarmning til 50°c og efter indstilling til 15 liter filtreredes således de to medier på Biichner-laboratoriefilter. Filtreringshas- 2 tigheden, henført til 1 m filtreringsoverflade, udgør 5 omkring 250 liter per m og per time for mediet på basis af kartoffelprotein, medens den kun udgør 180 liter per 2 m og time for mediet på basis af sojakage.

Vægten af den fugtige filterkage var på den anden side, i tilfældet med mediet på basis af sojakage, tre 10 gange så stor som i tilfældet med mediet på basis af kartoffelprotein. Rumfanget af det udvundne filtrat var på sin side 14 liter for det første mediums vedkommende og 12 liter for det andet mediums vedkommende.

15 Eksempel 2

Fremstilling af varmebestandig g-amylase.

Med det formål at fremstille en varmebestandig α-amylase dyrkedes en stamme af Bacillus licheniformis ATCC 6598 i tre forskellige medier i tre forskellige 20 gæringsbeholdere, der indeholdt en maltosesirup som carbonkilde foruden følgende bestanddele: - sojamel eller - varmekoaguleret kartoffelprotein eller - majsstøbevæske og kartoffelprotein 25 som nitrogenkilde.

Dyrkningen af mikroorganismen gennemførtes i alle tilfælde ved 43°C, og aktiviteten af den dannede a-amy-lase bestemtes efter SKB-metoden som beskrevet i "Cereal Chemistry", 16, 172 (1939).

30 Første gæringsbeholder.

Bacillus licheniformis-stammen dyrkedes i Erlenmeyer-kolber, anbragt på rotations-rysteapparat, der roterer med 220 omdrejninger/minut, hvilke Erlenmeyer-kolber indeholdt 4 00 ml af et medium med føl-35 gende sammensætning: 10

DK 166031 B

- Maltosesirup ............... 100 g/1 - Sojamel .................... 30 g/1 - Na2HP04, 12 H20 ............ 5 g/1 - kh2po4 ..................... i g/1· 5 - Spækolie ................... 0/5 ml/1.

Efter 30 timers forkultur indførtes de 400 ml i en produktions-gæringsbeholder på 20 liter indeholdende et medium med en sammensætning, der var analog med sammensætningen af mediet i forkulturen.

Dyrkningsbetingelserne var som følger: - Omrøring : 1200 omdrejninger/ minut - Luftning : 0,8 rumfang/minut

- Temperatur : 43°C

15 - Tid : 120 timer - Start-pH var 6,7, hvorefter pH stabiliseredes på 7.

Den målte slut-aktivitet var:

4 140 SKB ved 37°C

20 15 525 SKB ved 85°C.

Anden gæringsbeholder.

Der anvendtes samme fremgangsmåde som før, med undtagelse af, at medierne under forkulturen og produktionen havde følgende sammensætning: 25 - Maltosesirup ........................ 110 g/1 - Kartoffelprotein (det samme som i eksempel 1) 15 g/1 - Na2HP04, 12 H20 ..................... 5 g/1 - KH2P04 ............................... 1 g/1 30 - Spækolie ............................. 5 ml/1.

Dyrkningsbetingelserne var de samme som dem der benyttedes i første gasringsbeholder.

Den målte slut-aktivitet var: 5 000 SKB ved 37°C 35 18 735 SKB ved 85°C, hvilket altså var en forøgelse af aktiviteten på omkring 20 %, opnået ved blot at erstatte sojamel med kartoffelprotein.

11

DK 166031 B

Tredie gæringsbeholder.

Man gik frem på samme måde og med anvendelse af samme dyrkningsbetingelser som ved de to foregående gæringsbeholdere.

5 Dyrkningsmediet havde her følgende sammensætning: - Maltosesirup .................... 110 g/1 - Kartoffelprotein (identisk med det i eksempel 1 anvendte) ...................... 15 g/1 - Majsudblødningsvand (majsstøbe- 10 væske med 50 % tørstof) ......... 5 g/1 - Na2HP04 ......................... 5 g/1 - Spækolie ........................ 5 ml/1.

Den målte slut-aktivitet var: 5 000 SKB ved 37°C 15 19 000 SKB ved 85°C, altså en aktivitet, der er næsten den samme som den i den anden gæringsbeholder opnåede.

Eksempel 3 20 Fremstilling af en neutral bakteriel protease fra Bacillus subtilis._

Dette eksempel viser en sammenligning mellem de udbytter, der opnås ved produktion af en neutral bak-terieprotease fra Bacillus subtilis på et medium inde-25 holdende kartoffelprotein og på et medium indeholdende et soja-isolat.

Der anvendtes to gæringsbeholdere på hver 20 liter, indeholdende omkring 15 liter af det nedenfor angivne medium. Sammensætningen af de to produktionsmedier var 30 som følger: 12

DK 166031 B

Gæringsbeholder Gæringsbeholder nr. 1_ nr. 2_

Malto-dextrin med DE = 17 3 750 g 3 750 g H3 P04 62/5 ml 62,5 ml

Sojaprotein 525 g 5 (N x 6,25 * 92 %) Tørgær 37,5 g 37,5 g (N x 6,25 = 45 %)

Majsstøbevæske (med 50 % tørstof.) 125 g 100 g

Varmekoaguleret kartoffelprotein - 615 g 10 (79,2 % N x 6,25) (NH4)2 HP04 125 g 125 g

MjS04 7 H20 12,5 g 12,5 g

Zn S04 0,5 g 0,5 g.

^5 To forkulturer på 50 ml, altså omkring 0,33 % podningsmateriale, tilvejebragt på forkultur-medier med sammensætninger, der var identiske med sammensætningerne af produktionsmedierne, benyttedes til podning af de to gæringsbeholderes medier.

2o Til fremstilling af disse podningsmaterialer og til gennemførelse af produktionsprocessen anvendtes de samme dyrkningsbetingelser, nemlig følgende: - pH : 6,9 til 7,2

- Temperatur : 37°C

25 - Luftning : 1 liter luft/1 medium/mi- nut - Omrøring : 180 omdrejninger/minut.

Fra de to gæringsbeholdere udtoges fra den 16.time prøver med henblik på at fastslå den enzymatiske aktivi-30 tet, og dette fortsattes, indtil aktiviteten havde været konstant i to til tre timer.

Metoden til måling af den enzymatiske aktivitet er baseret på det princip, at enzymet, idet det indvirker på casein, frigør hydrolyseprodukter, som ikke er 35 fældbare med trichloreddikesyre, hvorved der med Folin's reagens opnås en blåfarvning, der måles med spektrofoto-meter ved 660 nm. Denne metode er en modifikation af den såkaldte Anson-metode (J. Gen. Physiol. 22, 79 (1938)), 13

DK 166031 B

idet casein anvendes som substrat i stedet for hæmoglobin.

De med de to gæringsbeholdere opnåede resultater var følgende: Gæringsbeholder Gasringsbeholder nr. 1_ nr. 2_ Gæringens varighed 19 timer 18 timer

Styrke ved ophør 27 500 aktivitets- 31 000 aktivi- enheder/ml tetsenheder/inl 10 (caseinolytisk evne) (caseinolytisk evne)

Den enzymatiske aktivitet, der opnås på mediet indeholdende kartoffelprotein, er altså ca. 10% større end den enzymatiske aktivitet, der opnås med mediet på basis af soja-isolat.

15 J

Eksempel 4

Fremstilling af bacitracin.

Den til fremstilling af bacitracin anvendte mikroorganisme er Bacillus licheniformis deponeret i ATCC 20 (American Type Culture Collection) under nr. 10 716.

Stammen opbevares i fryser i form af en suspension af sporer i tryptonsalt-medium, hvortil der er sat 15 % glycerol, eller i agariseret trypticase-soja-medium.

Til fremstilling af bacitracin i en gæringsbeholder på 25 20 liter podedes en forkultur af det nedenfor angivne medium med en sporesuspension i en Erlenmeyer-kolbe på 500 ml, indeholdende 60 ml af følgende flydende medium: - 1 % pepton - 1 % gærekstrakt 30 - 1 % malto-dextrin med DE på 21-23.

Erlenmeyer-kolben anbragtes på rysteapparat ved 37°C i 18 - 24 timer.

Der tilvejebragtes derefter en underkultur i samme pepton-væske som før angivet (Erlenmeyer-kolbe på 5 li-35 ter indeholdende 500 ml), og under de samme betingelser i 6 timer.

To gæringsbeholdere på hver 20 liter indeholdende medier med den nedenfor angivne sammensætning podedes derpå med 200 ml af den nævnte underkultur.

14

DK 166031 B

Gæringsbeholder 1 Gæringsbeholder 2 - 4 % sojamel - 2,5 % kartoffelprotein (identisk med det i eksempel 1 anvendte) 5 - 0,5 % CaC03 - 0,5 % Ca<X>3 - 0,5 % stivelse - 0,5 % stivelse

De i de to gæringsbeholdere anvendte betingelser holdtes strengt identiske og var:

- Tanperatur : 37°C

10 - Luftning : 1 rumfang/rumfang/famut _ - Omrøring : 500 ondrejninger/minut.

Gæringstiden var i begge tilfælde 24 timer.

En bacitracin-enhed defineres som den mængde antibiotikum, der i fortynding på 1 : 1024 i en bouillon-15 kultur (kendt under betegnelsen "beef infusia broth") hæmmer væksten af Streptococcus hemolyticus af gruppe A under de betingelser, som er defineret i Biochemical Engineering (R. Steel, ed.) side 185 - Mac Milian New York.

20 De ved to på hinanden følgende forsøg opnåede resultater var som følger: Gæringsbeholder 1 Gæringsbeholder 2_ Første forsøg : 328 enheder/ml 385 enheder/ml 25 Andet forsøg : 312 enheder/ml 374 enheder/ml

Ved sammenligning af disse tal fremgår det, at anvendelsen af kartoffelprotein også her meget klart forbedrer produktionsudbytterne.

Claims (3)

1. Gæringsproces, kendetegnet ved, at man som proteinholdigt næringsstof i gæringsmediet anvender en effektiv mængde kartoffelprotein, opnået ved koagulering af frugtvand. 5

2. Gæringssubstrat, kendetegnet ved, at det som proteinholdigt næringsstof indeholder kartoffelprotein, opnået ved koagulering af frugtvand.

3. Anvendelse af kartoffelprotein, opnået ved koagulering af frugtvand, i fremstillingen af et gæ-10 ringssubstrat.