NL8102744A - Werkwijze voor het hydrolyseren van lactose. - Google Patents

Description

* β * VO 1983

Betr.: Werkwijze voor het hydrolyseren van lactose.

De uitvinding "betreft een werkwijze voor het hydrolyseren. van lactose, meer in het "bijzonder lactose aanwezig in wei, met "behulp van een geïmmobiliseerde lactase.

In 19ï6 "bedroeg de Franse kaasproduktie ongeveer een millioen 5 ton, gepaard gaande met de produktie van meer dan zes. millioen ton wei als "bijprodukt. Een der gelijke wei "bevat per Üter ca. 6 tot 9 g eiwit, 1*5 tot 50 g lactose, 6 tot 8 g minerale zouten en 1 tot 2 g vet. Over de hele wereld bedrgeg- de totale hoeveelheid lactose in wei alleen in 19T7 ongeveer 3,5· millioen ton.

10 In het verleden werd wei "beschouwd als een afvalprodukt en via het riool of de rivier afgevoerd. Vanwege de toenemende bezorgdheid over milieuvervuiling wordt veel wei verwerkt tot een reeks dierlijke en menselijke levensmiddelen. B.v. maakt de ontwikkeling van ultrafilters tegenwoordig de scheiding van wei-eiwit uit wei mogelijk. Een dergelijk 15 eiwit heeft een hoge waarde. B.v. kan een 35%'s concentraat wei-eiwit niet-vet droge melk in een groot aantal voedingsmiddelen vervangen, zoals bakkerijprodukten, dranken en bevroren dessertprodukten. Ongelukkigerwijze resulteert de afscheiding van eiwitten uit wei in een vloeistof-fractie, permeaat genoemd, die tot dusver nauwelijks enige waarde had.

20 Met de komst van geïmmobiliseerde enzymen is evenwel de hydro lyse van lactose in het permeaat al of niet met demineralisatie, commercieel toegankelijk geworden.

Vanwege de aanwezigheid van glucose en galactose is gehydro-lyseerde lactose veel zoeter en beter oplosbaar dan lactose alleen.

25 Het gehydrolyseerde produkt is dus een functioneel zoetmiddel, dat kan worden gebruikt bij de bereiding van pastavormige .produkten, desserten op melkbasis en bevroren produkten, zoals consumptieijs. Voorts is het gehydrolyseerde produkt een goed vergist baar mengsel, dat kan worden gebruikt als een fermentatiesubstraat bij b.v. brouwerijen en in de 30 farmaceutische industrie.

Diverse methoden voor het hydrolyseren van lactose zijn natuurlijk bekend aan deskundigen. Enzymatische hydrolyse is bijzonder bruikbaar bij de produktie van voedingsmiddelen en als gezegd is het gebruik van geïmmobiliseerde enzymen daarbij bijzonder attractief.

35 Bij wijze van illustratie kan worden verwezen naar Biotechnol.

81 0 2 7 4 4 V ί . .- ·· - ν - -2-

Bxoeng., 16, 295 (197*+), waarin dê bereiding van geïmmobiliseerde lac- i tase en zijn gebruik bij een enzymatische hydrolyse van zure wei wordt besproken. ’Het enzym, geïsoleerd uit schimmels en gisten, werd daarbij vastgehecht op met zircoonoxyde beklede poreuze glasdeeltjes. Het 5 substraat bestond uit een waterige lactoseoplossing of een zuur wei- · permeaat.

Voorts beschreef Wierzbicki in Eiotechnol. Bioeng, l6_, 397 (197*+)'een hydrolyse· van lactose in zure wei onder toepassing van lactase ( galactosidase), geïmmobiliseerd op poreuze glasdeeltjes waarbij 10 de nadruk lag op de bereiding en de karakterisering van een herhaald bruikbare katalysator voor de produktie van zuivelprodukten met een laag lactosegehalte. Speciaal gezuiverde lactasen uit Aspergillus niger, Lactobacillus helveticus en Saccharomyces lactis werden op poreuze glasdeeltjes vastgehecht. Het substraat bestond uit zure weipóeder, 15 dat in water was gereconstitueerd tot een passende .drogest of concentratie. In sommige gevallen werd de gereconstitueerde zure wei onteiwit door 5 minuten in een kokend waterbad te verhitten.

Tenslotte is in Biotechnol. Bioeng., 16, 689 (197*+) de bereiding van geïmmobiliseerde lactase beschreven als deel van een voortgezette 20 studie omtrent de enzymatische hydrolyse van lactose. Een schimmellactase werd gebruikt, die was geïmmobiliseerd op met zircoonoxyde beklede poreuze glas-en poreuze titaanoxydedeeltjes. De verkregen geïmmobiliseerde enzympreparaten werden gebruikt voor een hydrolyse van lactose in volledige zoete wei, volledige zure wei, zuur wéi ultrafiltraat 25 en zuivere lactose.

Het is tevens mogelijk de hydrolyse van lactose in wei uit te voeren zonder een voorafgaande ultrafiltratie en met of zonder deminè-ralisatiebehandeling. Het produkt, dat nog eiwitten bevat, komt overeen met gehydrolyseerd permeaat en kan dus worden gebruikt in de 30 levensmiddelenindustrie als eerder beschreven.

Ongelukkigerwijze is een hydrolyse van lactose in wei met behulp van geïmmobiliseerde enzymen zonder een voorafgaande ultrafiltratie-behandeling niet zonder problemen, vooral niet op technische schaal.

Deze problemen houden verband met de aanwezigheid in wei van 35 eiwitten, die de neiging hebben op het geïmmobiliseerde enzymbed neer 8102744 . * * -3- te slaan, d.w.z. het geïmmobiliseerde enzym te overdekken. Dit eiwit-laagje remt of verhindert de diffusie van lactose naar het enzym en de diffusie van de hydrolyseprodukten, zoals glucose en galactose, van het enzym af. Ja verloop van enige tijd zal dus de enzymactiviteit duidelijk 5 afnemen. Het netto-effect maakt het gebruik van een geïmmobiliseerde lactase voor een hydrolyse van lactose in volledige wei op grote schaal onpractisch voor een continu proces. Bovendien zalf Verwijdering van het eiwit door ultrafiltratie alvorens te hydrolyseren', de bacterie-contaminatie verwijderen, waardoor de bacteriegroei op het geïmmobili-10 seerde enzym wordt verminderd, hetgeen bijdraagt tot de duidelijke afname na enige tijd van de enzymactiviteit en het verstoppen van de reactor met geïmmobiliseerd ènzym.

Het zal echter duidelijk zijn dat een economisch technisch procédé voor de hydrolyse van volledige wèi de enzymactiviteit boven een 15 τητητιτιπ.Τ p> waarde gedurende een bevredigende tijdsperiode moet behouden. Daarom zijn diverse pogingen gedaan om te kernen tot een bevredigende procedure voor een wei-hydrolyse met geïmmobiliseerde enzymen, waarbij men zich heeft geconcentreerd op het gebruik van .gedemineraliseerd weipermeaat. Hoewel diverse behandelingen van het geïmmobiliseerde enzym-20 bed, zoals periodiek wassen en desinfecteren (met b.v. azijnzuuroplos-singen) zijn voorgesteld, bestaat er nog steeds grote behoefte aan een goed technisch procédé voor het hydrolyseren van volledige wei, d.w.z. een wei die niet tevoren is behandeld met een ultrafilter.

De uitvinding betreft derhalve een werkwijze voor het behandelen 25 van wei, waarbij tenminste een deel van de lactose daarin}tot glucose en galactose met behulp vaaeen geïmmobiliseerde lactase wordt gehydro-lyseerd. Tevens betreft de uitvinding een werkwijze voor het behandelen van wei, waarbij tenminste een deel van de lactose daarin tot glucose en galactose met behulp van een geïmmobiliseerde lactase wordt ge-30 hydrolyseerd zonder dat er behoefte bestaat aan een voorafgaande ultrafiltratiebehandeling. Bovendien betreft de uitvinding een werkwijze voor het behandelen van wei, waarbij de daarin aanwezige lactose althans gedeeltelijk tot glucose en galactose met behulp van een geïmmobiliseerde lactase wordt gehydrolyseerd, waarbij het geïmmobiliseerde 35 enzym tevens wordt schoongemaakt.

Daarnaast betreft de uitvinding een werkwijze als omschreven 8102744 is .

-4- waarbij het geïmmobiliseerde enzym wordt gedesinfecteerd. Ook betreft de uitvinding een werkwijze als omschreven, waarbij de voorafgaande ultra-filtratiebehandeling kan vervallen en wordt een werkwijze weergegeven voor een schoonmaken van geïmmobiliseerde lactase van daarop afgezet 5 wei-eiwit.

De uitvinding betreft dus een werkwijze voor hèt behandelen van wei, waarbij tenminste een deel van de lactose daarin tot glucose en galactose met behulp van een geïmmobiliseerde lactase wordt gehydro-lyseerd, welk procédé de volgende trappen omvat: 10 A. verhitting van de wei op een temperatuur tussen k5 en 90°C gedurende tenminste 15 seconden, B. het centrifugeren van de verwarmde wei terwijl deze nog warm is en C. het in contact brengen van. de gecentrifugeerde wei met een geïmmobiliseerde kctase onder zodanige voorwaardèn, dat. tenminste een 15 deel van de lactose daarin tot glucose en galactose wordt gehydrolyseerd.

De uitvinding betreft tevens een werkwijze voor het behandelen van zure wei, waarbij tenminste een deel van de lactose daarin tot glucose en galactose met*geïmmobiliseerde lactase wordt.gehydrolyseerd, waarbij men 20 A) de wei klaart, B) de wei op een temperatuur tussen k5 en 90°C gedurende tenminste 15 seconden verwarmt en C) de verwarmde wei met een geïmmobiliseerde lactase in contact brengt onder voorwaardèn waarbij tenminste een deel van de aanwezige 25 lactose tot glucose en galactose wordt gehydr olyseerd.

Voorts betreft de uitvinding een werkwijze voor het behandelen van wei waarbij tenminste.een deel van de daarin aanwezige eiwitten wordt verwijderd, welk procédé de volgende Stappen omvat: A. verwarming van de wei op een temperatuur van k5—90°C gedurende 30 tenminste 15 seconden en B. centrifugeren van de verwarmde wei terwijl deze nog warm is.

Voorts betreft de uitvinding een werkwijze voor het schoonmaken van een geïmmobiliseerde lactase met daarop afgezette weiproteïnen, welk procédé het in contact brengen van de geïmmobiliseerde lactase 35 met een oplossing van een protease omvat.

8102744 ti i -5-

De onderhavige werkwijze beoogt een behandeling van een lactase, die op een in water onoplosbare drager is vastgehecht. Zo wordt als bekend lactose voor tenminste ca. 80# tot glucose en yg&lactose ge-hydrolyseerd, wanneer een lactosehoudende waterige oplossing, b.v.

5 wei of weipermeaat, door een kolom met daarin een geïmmobiliseerde lactase, liefst bij een temperatuur beneden 60°^ wordt doorgeleid.

Als beschreven kan het effluent gedeeltelijk worden geconcentreerd tot een stroop, die als een zoetmiddel in diverse levensmiddelen kan worden gebruikt.

10 Een dergelijke werkwijze kan continu of discontinu worden uitge voerd. Vanzelfsprekend verdiént een continu procédé de voorkeur.

De bij de uitvinding gebruikte lactase wordt geproduceerd door een reeks microörganismen, zoals schimmels, bacteriën en gisten. Schimmellactasen zijn waarschijnlijk het meest gebruikelijk, b.v.

15 lactasen geïsoleerd uit Aspergillus niger en Aspergillus oryzae.

Technieken voor het isoleren van lactasen uit microörganismen zijn natuurlijk bekend.

Een immobilisatie van het enzym op een in water onoplosbare drager kan op diverse wijzen?die eveneens bekend zijn, plaatsvinden.

20 Voor een overzicht omtrent immobilisatietechnieken wordt verwezen naar I. Chibata: "Immobilized Enzymes", Ealsted Press, John Wiley & Sons,

Inc., New York, 1S78 , blz. 1-73. Nergens wordt gezegd, dat de immobilisa-tiemethode kritisch zou wezen. Desgewenst kunnen dit soort dragers poreus zijn, waardoor ze een verhoogde hoeveelheid enzym per gewichts-25 eenheiddrager mogelijk maken. Gewoonlijk worden enzymen vastgehecht op in water onoplosbare dragers door een fysische adsorptie, ionenbinding, een covalente binding of een combinatie daarvan.

De in water onoplosbare dragers zijn organisch of anorganisch. Voorbeelden van organische dragers zijn ó.m. polyesters, zoals poly-30 ethyleenglycoltereftalaat, polyamiden, zoals nylon 6 en nylon 6,6, polyacrylaten, polymethacrylaten, polyacrylamiden, polyacrylzuur, polymethacrylzuur, polygalacturonzuur, polyasparginezuur, etheen-maleïnezuuranhydride copolymer en, polyalkenen, zoals polyetheen, poly-propeen, polybuteen en polybutadieen, polystyreen, polyaminostyreen, 35 polyvinylchloride, polyvinylalcohol, polyvinylideenchloride, cellulose en 8102744 V 5 -6- derivaten daarvan, agar gelen, dextrangelën en derivaten daarvan, voorts polysacchariden, polypeptiden, collageen e.d.

c De anorganische dragers kunnen worden gekwalificeerd als silicium- of ni et - s i li ciummet aaloxyden. Voorbeelden van siliciumdragers 5 zijn o.m. glas,, silica, vollastoniet, bentoniet, cordieriet e.d. Voorheelden van andere metaaloxyden zijn alumina, spinel, apatiet, nikkeloxyde, titaanoxyde, zircoonoxyde e.d.

Over het algemeen kan de in water onoplosbare drager iedere gewenste vorm bezitten. De drager-kan van nature sterk verdeeld zijn,.

10 variërend van een fijnverdeeld poeder tot een grof granulaat of de drager kan een continu gevormd voorwerp wezen, zoals een vlak of gebogen. vel of korrel, danwel een driedimensionaal artikel, zoals, een rechthoeki'g of cylindervormig buisje of een. complexe monoliet.. In de practijk zal het dragermateriaal gewoonlijk fijnverdeeld zijn.

15 Voor voorbeelden omtrent het immobiliseren van enzymen op an organische dragers wordt o.m. verwezen naar Amerikaans octrooischrift 3.519.538, 3.566.9^5, 3.666.627 en 3.802.99T.

De eerste trap van de onderhavige, werkwijze is een verwarming van de wei op een temperatuur tussen U5 -en 90°C en wel gedurende ten-20 minste 15 seconden. Bij voorkeur zal 15 minuten tot één uur worden verwarmd. Door deze verwarming treedt een pasteurisatie van de wei op, waardoor de vorming van vaste colloxdale eiwitdeeltjes in suspensie wordt bevorderd, welke door centrifugeren kunnen worden gesedimenteerd.

De tweede trap omvat dan dit centrifugeren van de verwarmdfe wei, 25 terwijl deze nog warm is. De centrifugeringsvoorwaarden zijn niet kritisch vooropgesteld dat voldoende vast materiaal wordt neergeslagen. Deze voorwaarden zullen de deskundigen geen moeite kosten. Bij wijze van voorbeeld kan worden gezegd dat snelheden van 8000 tot 12000 tjm het meest geschikt zijn.

30 Bij de derde trap wordt de gecentrifugeerde wei in contact ge bracht met een geïmmobiliseerde lactase en wel onder voorwaarden dat tenminste een gedeelte van de lactose tot glucose en galactose wordt gehydrolyseerd. Een dergelijk contact is niet critisch bij de uitvinding en wordt gewoonlijk uitgevoerd volgens op zichzelf bekende 35 wijzen.

81 02 7 44 -7-

Liefst wordt de geïmmobiliseerde lactase vervolgens schoongemaakt cm daarop af gezet eiwit te verwijderen. Dit schoonmaken kan , op een op zichzelf bekende wijze worden uitgevoerd. Liefst evenwel wordt het schoonmaken uit gevoerd door het geïmmobiliseerde lactase-5 materiaal met een oplossing van een proteolytisch enzym of een protease in contact te brengen. Bij voorkeur zal een dergelijke oplossing een proteaseactiviteit bezitten van 0,1 tot 10 Anson-eenheden per liter.

Een Anson-analyse kan worden gebruikt voor het bepalen van de proteolytische activiteit van de meeste proteasen, waarbij gedenatu-10 reerd hemoglobine onder standaardvoorwasrden wordt ontleed. Het onomgezette hemoglobine wordt vervolgens geprecipiteerd met trichloor-azijnzuur en de hoeveelheid trichloorazijnzuur/oplosbaar produkt spectrofotametrisch met een fenolreagens bepaald, dat een blauwe kleur geeft met tyrosine en tryptofan. De kleurreactie wordt meestal 10 15 minuten bij een pH van 7,5 en een temperatuur van 25°C uitgevoerd.

Een Anson-eenheid wordt dan gedefinieerd als de hoeveelheid enzym, die onder deze voorwaarden hemoglobine met een aanvankelijke snelheid ontleédt, dat per minuut een hoeveelheid trichloorazijnzuur/oplosbaar produkt wordt vrijgesteld, die dezelfde kleur met het fenolreagens 20 geeft als een milliequivalent tyrosine.

Over het algemeen kan iedere protease die een eiwitbekleding van geïmmobiliseerde enzymen verwijdert zonder een schadelijk·.· effect op de enzymactiviteit worden gebruikt. Voorbeelden van passende proteasen zijn bij wijze van voorbeeld neutrale proteasen uit Bacillus 25 subtilis en alkalische proteasen uit Bacillus licheniformis.

Dergelijke proteasen behoren tot een groep bekende technisch gebruikte enzymen, die op grote schaal in waspreparaten worden toegepast. Voorbeelden van commerciële neutrale proteasen zijn Protease B 500, geleverd door Bapldase, een Frans filiaal van Gist Brocades en ïïeutrase 30 0,5 L van Hovo. Een voorbeeld van een alkalische protease is Alcalase 0,6 L van ïïbvo, dat ook wel aangeduid wordt als subtilisine A.

Het was hoogst verrassend en onverwacht dat deze proteasen, die voor eiwitmaterialen zeer agressief zijn, een geïmmobiliseerde lactase van hun eiwitbekleding bevrijden zonder deze lactase zelf, 35 die toch ook een eiwitstof is, aan te tasten. Dit is in het bijzonder 8102744

*' V

' -8- zo, cmdat van dit soort proteasen bekend is, dat ze zeer actief zijn tegen een opgeloste lactase, d.w.z. een lactase die niet is vastgehecht.

Een andere facultatieve trap, die eveneens voorkeur verdient, omvat het desinfecteren van de geïmmobiliseerde lactase. Hoewel een des-5 infecteren gewoonlijk op iedere gebruikelijke wijze kan worden uitge-voerd, verdient de methode volgens de Amerikaanse octrooiaanvrage | 206,.099 de voorkeur.

Als beschreven in deze Amerikaanse octrooiaanvrage wordt het , geïmmobiliseerde enzym gedesinfecteerd met een waterige oplossing van 10 tenninste een gesubstitueerd diëthyleentriamine in een concentratie en gedurende een tijdsbestek dat voldoende is om verontreinigende microorganismen te doden zander dat een ongewenst .effect op het geïmmobiliseerde enzym optreedt.

Dergelijke gesubstitueerde diëthyleentriaminen worden toegepast 15 in verdunde, waterige oplossingen, meestal met een concentratie van 0,1-0,5 gew.%, hoewel oök hogere en lagere concentraties kunnen worden gebruikt. Over het algemeen zal de concentratie aan gesubstitueerd diëthyleentriamine, de totale hoeveelheid waterige oplossing en de duur van de desinfectiebehandeling sterk variëren, afhankelijk althans 20 ten dele van de gebruikte diëthyleentriaminen, de mate van de microbe verontreiniging, de soorten microorganismen en de hoeveelheid geïmmobiliseerd enzym, niettemin kunnen deze behandelingsvoorwaarden of' parameters gemakkelijk door iedere deskundige worden bepaald. Gewoonlijk evenwel duurt de behandeling 15 tot 30 minuten met 5-10 liter van . 25 een 0,1 gew.% desinfectieoplossing van b.v. Te go Di octyl BS per kg geïmmobiliseerd enzym.

Volgens een uitvoeringsvorm wordt het geïmmobiliseerde enzym-materiaal eenvoudigweg in een bad van de desinfectieoplossing gebracht. Desgewenst kan worden geschud, geroerd, rondgepompt of anderzijds ...

30 de vloeistof bewogen.

Volgens een andere uitvoeringsvorm wordt de desinfectieoplossing door de kolom of de reactor met geïmmobiliseerd enzym gecirculeerd. Bij voorkeur vindt een dergelijke circulatie van de desinfectieoplossing plaats in een richting tegengesteld aan de richting van de voedings-35 oplossing door de kolom of de reactor. Waar het enzym op.een goed ver- 81 0 2 7 4 4 ... < »» -9- deelde drager is geïmmobiliseerd en de kolom of de reactor dit mogelijk maakt is de snelheid van de tegengesteld gerichte stroming van de des-infectieoplossing liefst zodanig, dat de deeltjes geïmmobiliseerd enzym worden gefluidiseerd. Een dergelijke fluxdisatie voorkomt de vorming 5 van kanalen en garandeert een volledig contact van het geïmmobiliseerde ' enzym met de desinfectieoplossing.

De wei die bij de uitvinding wordt toegepast behoeft niet voorbehandeld te worden. Bij voorkeur echter wordt de wei wel geklaard, b.v. door te centrifugeren. Na dit klaren kan de wei desgewenst worden ge-10 deminèraliseerd en wel voor ten hoogste 90% en/of aangezuurd tot een pH

3,5-6* Een demineralisaüe kan op een bekende wijze worden uitgevoerd, b.v. door eleetrodialyse of ionenuitwisseling. Aanzuren kan eveneens op een bekende wijze plaatsvinden met behulp van liefst zoutzuur. Desgewenst kan worden aangezuurd alvorens te klaren.

15 Of al of niet wordt aangezuurd hangt tenminste gedeeltelijk af van het pH-profiel van de geïmmobiliseerde lactase en de pH van de gebruikte wei. B.v. heeft zure wei van boerekaas een pH van ca. 4,5-4,7, terwijl zoete wei, afkomstig van de produktie van cheddarkaas een pH heeft van 6-6,6, zodat de laatste bij voorkeur wordt aangezuurd. De-20 mineralisatie kan vanzelfsprekend eveneens de pH van de wei beïnvloeden.

Terwijl de warmtebehandeling van de wei gewoonlijk wordt gevolgd door een centrifugeren kan soms een dergelijk later centrifugeren achterwege blijven. Gewoonlijk is achterwege laten van dit centrifugeren mogelijk indien (l) de wei voor de warmtebehandelingstrap is geklaard en 25 (2) de wei een zuur produkt is met een pH bij of omstreeks het optimum voor de geïmmobiliseerde lactase, b.v. ca. 4,5, welke wei dus niet behoeft te worden aangezuurd alvorens de daarin aanwezige lactose wordt gehydrolyseerd.

Het zal deskundigen duidelijk zijn, dat de onderhavige werkwijze 30 discontinu of continu kan ver-lopen. Een continu procédé verdient de voorkeur, hoewel daarbij het schoonmaken en/of desinfecteren niet continu kunnen worden uitgevoerd, omdat in dat geval de derde trap niet zou kunnen worden uitgevoerd; daar cm warden de genoemde twee trappen periodiek, meestal dagelijks uitgevoerd. Bovendien is het voor 35 een continu procédé beslist niet nodig dat de trappen A en B ook continu 81 02 7 44 * * : -ιο- worden uitgevoerd. Desgewenst kunnen de trappen A en B wel degelijk discontinu plaatsvinden.

Desgewenst kunnen twee of meer reactoren met geïmmobiliseerde lactase parallel worden opgesteld. Wanneer het tijd is voor een periodiek 5 schoonmaken en desinfecteren van de gelmmobiliseerde lactase in de ene reactor, wordt de derde trap in de tweede of de andere, reactor voortge-' zet om een afbreken van het proces te voorkomen. Andere variaties kunnen worden uitgevoerd, zoals deskundigen onmiddellijk zullen onderkennen.

Als reeds gezegd, kan de volgens de uitvinding behandelde wei 10' -worden ontzuurd of geneutraliseerd en vervolgens geconcentreerd tot een stroop, b.v. door in te dampen. Een dergelijke stroop die eiwit., glucose, galactose en een restant niet gehydrolyseerd lactose bevat, heeft een zoetmakend vermogen. Dit zoetmakend vermogen gecombineerd met de voedings-en functionele eigenschappen (zoals emulgeren, zwellen ên combinatie-15 eigenschappen) van het eiwit maakt de behandelde wei bijzonder attractief en waardevol als levensmiddeltoeslagstof.

Toorts is de onderhavige werkwijze economisch omdat het gebruik van ultrafiltratie handelingen en droogbehandelingen die .energie kosten worden vermeden.

20 Het zal duidelijk zijn, dat de warmtebehandeling en de centri- fugeringshandelingen die hierboven zijn beschreven, het mogelijk maken tenminste een deel van het eiwit in de wei daaruit te verwijderen. Dergelijke handelingen zijn van belang voor toepassingen, waarbij het gewenst is tenminste een deel van het eiwit in de wei te verwijderen 25 zonder te behoeven te ultrafiltreren.

De uitvinding wordt nader toegelicht door de volgende voorbeelden. Voorbeeld I:

Lactase afkomstig uit Aspergillus rdger werd geïmmobiliseerd op een fijnverdeelde siliciumoxydedrager volgens de methode van Amerikaans 30 octrooi schrift 3.519*538. Drie kolommen werden vervolgens gevuld met nagenoeg gelijke hoeveelheden van het verkregen geïmmobiliseerde lactasemateriaal. .

Volledige wei werd door centrifugeren geklaard en voor 50$ gedemineraliseerd door een electrodialyse. Dé mate van demineralisatie 35 werd bepaald door een rest-asmeting en gecontroleerd door geleidingsme- 81 0 2 7 4 4 ν' Λ 4 » -11- •hingen onder standaardvoorwaarden. De verkregen gedeminèrali seerde wei werd op pH 3»5 met zoutzuur aangezuurd. Deze wei had aanvankelijk een temperatuur van 2-U°C, en werd in ca. 1 uur onder roeren op 80°C verwarmd. De wei werd warm met 8000-10000 tpm gecentrifugeerd met een 5 Alpha-Laval (LAEX 202)-separator onder continu afvoeren van het vaste materiaal. De bovenstaande vloeistof werd opgevangen en afgekoeld en daarna opgeslagen alvorens te hydrolyseren.

Hydrolyse van de verwarmde wei vond plaats hij temperaturen van 20, 35 en 50°C (een kolcm per temperatuur) om de stabiliteit 10 van de geïmmobiliseerde lactase na te gaan. De warmte-behandelde wei bevatte U,53 gsv.% lactose en had een pH van 3,5. De gevormde glucose werd. op een op zichzelf bekende wijze bepaald bij de afvoer van elke kolcm of reactor. Het glucosegehalte werd vervolgens gebruikt om de mate van omzetting van de lactose te berekenen alsmede de enzymatische 15 activiteit van de geïmmobiliseerde lactase.

De werkwijze voorwaarden en resultaten bij elke temperatuur zijn weergegeven in tabel A.

Tabel A

Hydrolyse van eerder-verwarmde wei met U,53 % lactose bij een 20 pH van 3,5 bij diverse temperaturen._

Temperatuur 20° 35° 50° O»

Composiet-materiaal (g) h-,93 U,78 U,90 A. Ha 2 uren 25 stroomsnelheid (cmVu) 91 107 92 % omzetting ^ Ui· 62-80

Eg (e/g) 79,6 210 377' B. Ha 6 uren

O

stroomsnelheid (cm /u) 92 107 93 30 % omzetting ^ UU 62 8l

Ege 82 2lU 396 C. Ha 21,5 uren stroomsnelheid (cm^/u) 82 lOU 90 •u % omzetting U7 62 79 35 EgC 82 212 355 31 0 2 7 44 -12- a Hoeveelheid in gram geïmmobiliseerd lactasepreparaat (droog gewicht).

*b 0 Percentage lactose omgezet in glucose.

c Specifieke activiteit van de geïmmobiliseerde lactase uitgedrukt in eenheden per gram.

5 Een voortreffelijke stabiliteit van de geïmmobiliseerde lactase werd waargenomen bij 20 en 35°C; ook na meer dan 20. uren amzetten werd geen verlies waargenomen vergeleken met de aanvankelijke enzymactiviteit berekend op omzetting of specifieke activiteit. Bij 50°C was de stabiliteit van de geïmmobiliseerde lactase nog steeds zeer goed. Hoewel de 10 specifieke activiteit dan 6% was gedaald, bleek bij de omzettingscijfers de activiteit slechts voor 1-2% te zijn gedaald.

Of al of niet een enzymatische inactivering plaats heeft gevonden kan het beste worden gezien door een vergelijking van de specifieke activiteiten na 2 en na 6 uren. Een dergelijke vergelijking 15 is weergegeven in tabel B.

Tabel B

Eigenschappen wat betreft de inactivèring van geïmmobiliseerde lactase tijdens een hydrolyse van door warmte behandelde wei bij pH 3,5 en bij., diverse temperaturen._ 20 Temperatuur a 2(£' 35^ 50^

Eg2 79,6 210 377 *£5e 82 2iu 396

Eg 97 d 82 212 355 25 Eg2-Eg6 0 0 0 • 0 mate mact. 0 0 0 f schijnbare, halveringstijd oc cc cc 2 Pi s

Eg -Eg *3 0 0 22 mate inact. ® 0 0 1,1 f 30 schijnbare.halveringstijd cc cc 171

Eg6-Eg21,5 0 2 1*1 mate inact. 0 0,1 2,6 f schijnbare halveringstijd oc 1980 76 a . . ....

specifieke activiteit in eenh. per gram na 2 uren.

35 specifieke activiteit in eenh. per gram na 6 uren.

31 02 7 44 -13- c · · specifieke activiteit in eenh. per gram na 21,5 uren.

^ indien het algebraïsch verschil negatief is wordt dit verschil op nul gesteld.

e (Eg - Eg)/4, uitgedrukt als (E/g)/u.

5 m uren.

δ (Eg2-Eg21’^)/19,5, uitgedrukt als (E/g)/u.

11 (Eg^-Eg21*^)/15,5, uitgedrukt als (E/g)/u.

Voorbeeld II:

Vergelijkende experimenten 10 Vijf geïmmobiliseerde lactasekolcmmen werden vervaardigd als weergegeven in voorbeeld I en elk werd gebruikt voor het hydrolyseren van wei. De voeding voor kolcm 1 was volledige of ruwe wei, aangezuurd op pH 3,5 met zoutzuur. De voeding voor kolcm 2 was wei die door centrifugeren was geklaard en vervolgens met zoutzuur op pH 3,5 gebracht.

15 De voeding voor de kolommen 3, 4 en 5 was een wei die door centrifugeren·· was geklaard, door electrodialyse voor 50% was gedemineraliseerd en met zoutzuur op pH 3,5 was ingesteld. Tijdens de hydrolyse.werden de glucose-metingen uitgevoerd als in- voorbeeld I.

Ha 6 uur continu werken (proef A) werden de experimenten be-20 eindigd en elke kolom onder standaardvoorwaarden met water uitgewassen.

In elk geval werd de geïmmobiliseerde lactase 20 minuten met een l#’s waterige azijnzuuroplossing onder fluxdiserende terugstroomvoorwaarden schoongemaakt. De hydrolyse werd vervolgens hervat (proef B) onder dezelfde voorwaarden als tevoren.

25 De verkregen cijfers zijn weergegeven in de tabellen C-E.

Tabel C

Hydrolyse van volledige wei bij pH 3,5 en 50°C

Proef A Proef B

O

Stroomsnelheid (cm /u) 102 103 30 Geïmmobiliseerd enzympreparaat (g) 4,68 4,68

Lactosegehalte, % 4,26 4,26

Ha 2 uren glucosegehalte 17 16,25 % omzetting 78 76 35 Eg 402 350 8102744 " Ϋ ψ / ' ψ ' \. , -14-

Na 6 uren glucosegehalte, 11^8 11,4 % omzetting 5¾ 53

Eg lte 133 & cijfers van kolom T* . '

Tahel 331 O £t

hydrolyse van geklaarde wei met pH 3,5' en van 50 C

Proef A Proef B

• Stroomsnelheid (cm3/u) 110 111

Enzympreparaat (g) 4,8 4,8 lactosegehalte, % 4,0¾ 4,0¾

Na 2 uren glucosegehalte (g/l) 17,5 17,6 % omzetting 85 85

Eg 520 543

Na 6 uren

Glucosegehalte l4,l l4,4 % omzetting 68 70

Eg 251 269 8i cijfers van kolom 2.

Tahel E

Hydrolyse van geklaarde en gedemineraliseerde wei met een pH van 3.5 en hi,i diverse temperaturen_ 20°0(a) 30° (¾) 50° (c)

Proef A ProeFB Proef A Proef BA B Stroomsnelheid (cm^/u) 98 91 107 107 92 92 enzympreparaat (g) 4,93 4,93 4,78 4,78 4,90 4,90 lactosegehalte, % 4,q4 4,o4- 4,04 4,04 4,04 4,04

Na 2 uren glucosegehalte (g/l) 9,8 10,9 14,1 14,2 l6d 15,9 % omzetting 1).8 53 68 69 78 77

Eg 96 HO 247 ' 257 3 05 295

Na 6 uren glucosegehalte 10,1 10,7 12,3 12,7 12,8 12,8 % omzetting I4.9 52 60 62 62 62

Eg 97 103 175 186 160 160 8102744 -15- *κ * r (a) cijfers van. kolom. 3 (b) cijfers van kolom (c) cijfers van kolom (a) na 3 uren.

5 Voor het gemak zijn de karakteristieken ontrent de enzymin- activering in tabel F samengevat.

Tabel F

Karakteristieken ontrent inactivering van geïmmobiliseerde lactase tijdens een hydrolyse van diverse vei soort en. bij pH. 3,5 en bij diverse 10 temperaturen.

mate in- schijnbare halve- . _ 2a _ 6° C activ. ringstijd temp Eg Eg_<Eg _ e _

Volledige vei proef A 505 b02 ikz 260 65 3,1 15 proef B 50° 350 133 21T 5b 3,2

Geklaarde vei proef A 50° 520 251 269 67 3,9

proef B 50° 5^3 269 27^ 68,5 M

Geklaarde en gedemineraliseerde vei 20 proef A 20° 9β 97 0 0 cc

proef B 20° 110 103 7 1,75 31,U

proef A 35° 2U7 175 T2 18 6,9 proef B 35° 257 186 71 17,8 7,2 proef A 50° 305f l6o 1U5 W,3S 3,2 25 proef B 50° 295 l60 135 33,8 btb a) specifieke activiteit na 2 uren b) specifieke activiteit na 6 uren g g 2 c) Eg^-Eg (indien Eg groter is dan Eg vordt het verschil gesteld 30 op nul).

d) <EgA, uitgedrukt als (e/g)/u, d.v.z. de afname per uur in spe cifieke activiteit uitgedrukt als eenheden per gram.

e) in uren.

f) gebaseerd op een glucosemeting na 3 uren 35 g) <Eg/3.

3102744 • -IJg-

Gebaseerd op een onderzoek van deze cijfers kunnen de volgende conclusies worden getrokken: (1) de afname in enzymactiviteit was snel, behalve hij 20°C (voor elke 6 2 “ proef, vergelijk Eg met Eg); 5 (2) het effect van toenemende temperatuur was marginaal, omdat de percentages omzettingen zich egaliseerden terwijl de enzymatische activiteiten piekwaarden hadden en namen vervolgens weer af; (3) de afname in. enzymactiviteit was omkeerbaar omdat een schoonmaken de activiteit op de aanvankelijke waarde terugbracht (vergelijk de spe-10 cifieke activiteiten voor de proef en A en B na 2 en na 6 uren); (1+) bij 35° en 50° hadden ook de geïmmobiliseerde enzymen een korte halveringstijd bij technische toepassingen en (5) bij 20°C bleek het geïmmobiliseerde enzym een halveringstijd te hebben die bijzonder bevredigend was voor technische toepassingen, 15 maar ditmaal was de specifieke activiteit te laag.

Alles tezamen tonen de voorbeelden I en II duidelijk het voordeel van de onderhavige warmtebehandeling en centrifugering aan, alvorens wei te hydrolyseren met een geïmmobiliseerde lactase. Dit voordeel • wordt duidelijk zichtbaar uit tabel G, die de resultaten van de tabellen 20 B en F samenvoegt en vergelijkt.

Tabel G

Vergelijking van inactivering van geïmmobiliseerde lactase tijdens een hydrolyse van geklaarde en gedemineraliseerde wei met of zonder warmtebehandeling_- 25 Mate van in- Schijnbare

Temp_activering_halver ing s t i j d

Zonder warmtebehandeling 35° 17,9a 7a met warmtebehandeling 35° 0,1° 1980° zonder warmtebehandeling 50° ^la 3,8a 2Q met warmtebehandeling 50° 1,8C 12k

EL

Een gemiddelde van de cijfers verkregen bij de proeven A en B

Omdat twee van de drie berekeningen resulteerden in een nul-inacti-vering en een oneindige halveringstijd zijn de gemiddelde waarden eenvoudig aangenomen als kleiner dan en groter dan de enkele eindige waarden, verkregen voor de inactiveringsmate en de halverings-25 tijd.

81 02 744 -17- c Omdat een van de drie "berekeningen resulteerde in een nul-inactivering en een oneindige halveringstijd zijn de gemiddelde vaarden aangenomen als kleiner dan en groter dan de gemiddelden van de twee eindige vaarden verkregen voor de mate van inactivering en de halveringstijd.

Zoals tabel G· duidelijk aantoont, leiden de warmtebehandeling en het centrifugeren van de geklaarde en gedèmineraliseerde vei alvorens te hydrolyseren tot een verbeterde stabiliteit’ van het geïmmobiliseerde enzym, gemeten in termen van halveringstijd en vel met een 10 factor van ca. 30 tot 300, afhankelijk van de temperatuur. Een dergelijke verbetering is een bijzonder gunstige voor het gebruik van een geïmmobiliseerde lactase voor het hydrolyseren van volledige vei op technische schaal.

Voorbeeld III: 15 Dit voorbeeld toont de verdere voordelen aan, die men verkrijgt bij het schoonmaken en desinfecteren volgens de uitvinding.

Elke veek verd ca. 100 liter volledige vei van een kaasfabriek ontvangen. Bij ontvangst verd de vei geklaard door te centrifugeren met een Alpha-Laval LAEX 202-separator en vel. bij 11000-12000 tpm en 20 een stroomsnelheid van 30-35 l/u. De geklaarde vei verd gedemineraliseerd voor ca. 50$ in ^a' Stackpack electrodialyse module (ionics). De ver- v kregen geklaarde en gedemineraliseerde vei verd op pH 3,5 aangezuurd door een toevoeging van ca. 0,7-1 g geconcentreerd zoutzuur per liter vei. De aangezuurde vei verd vervolgens bij 2-k°C opgeslagen.

25 Elke dag verd ca. 10 liter aangezuurde vei uit de opslag ge nomen en h-5 minuten op 8o°C verwarmd. Deze warme vei verd vervolgens onder de boven weergegeven voorvaarden gecentrifugeerd en daarbij geklaard. De vei verd vervolgens veer afgekoeld en bij ca. k°C opgeslagen. Deze vei verd vervolgens gebruikt als voeding voor drie geïmmobiliseerde 30 lactase-vei-hydrolysekolaamen.

Elke kolom verd gevuld met ca. k,T-5 g van het geïmmobiliseerde lactasepreparaat volgens voorbeeld I. De stroomsnelheid tijdens hydrolyse bedroeg ca. 100-110 cm^/uur, De hydrolysetemperatuur was 35°C en de hydrolyse duurde bij continu verken ca. 18 uren.

35 Ha. de hydrolysefase verd elke kolom U5 minuten met water uitge spoeld. Elke kolom verd vervolgens schoongemaakt en/of gedesinfecteerd, en vel als volgt:

Kolom 1 8102744 -18-

Deze kolom -werd schoongemaakt door door deze kolom een oplossing van Alcalase 0,6L met een pïï 7,5 en 6 Anson-eenheden per liter te leiden. Een dergelijke oplossing werd 20 minuten doorgevoerd, en wel in tegengestelde richting onder fluidiserende voorwaarden.

5 De kolom werd vervolgens gedesinfecteerd door een zelfde circulatie door deze kolom van een 0,1#' s oplossing van Tego Diocto BS een mengsel van di octyldiëthyleentriami ne en trioctyldiëthyleentriamine van de Ea. Th. Goldschmidt A.G.

Uiteindelijk werd de kolom wederom met water gespoeld.

10 Kolcm 2

Deze kolcm werd schoongemaakt als beschreven hij kolom 1, met dit verschil dat de schoonmaakoplossing een waterige azijnzuuroplossing was met een pH 3 * -

Kolom 3 15 Ook deze kolom werd gedesinfecteerd en schoongemaakt als beschreven voor kolom 1.

De hydrolyse-en schoonmaak.resp. desinfectiecyclussen werden vervolgens gedurende 17 tot 26 dagen herhaald afhankelijk van de kolcm. Het gedrag van de kolommen werd. elke dag op diverse tijdstippen als 20 eerder beschreven bepaald. De.verkregen resultaten zijn weergegeven in tabel H, hoewel voor de eenvoud slechts de specifieke activiteiten zijn weergegeven. Tabel I bevat de stabiliteiten en halveringstijden berekend uit de verkregen cijfers samen.

Tabel H

25 Hydrolyse van met warmte behandelde wei bij pH 3,5 en tij 35°C in ccm-binatie met schoonmaak- en/of desinfecteringshandelingen_

Kolom 1 . kolcm 2° , kolom 3 -5--yfa-5«---γγ°-ö-® rp3 dag Eg Eg Eg1' Egl Eg Eg'1.. Egf. Eg_ Eg ...

1 23¼ 235 222 273 258 206 193 17¼ 155

3Q 5 238 296 273 231 202 ITT 139 lfc3 lUO

10 210 233 219 182 163 UI 123 125 98 15 222 220 - 162 117 91 11¼ 122 96,5 17 20¼ 223 210 81 36 13 112 107 97 20 223 213 203 117 10¼ 10¼ 35 26 198 203 175 103 98 90 - 81 0 2 7 4 4 «19-

SL

Gemiddelde specifieke activiteit in eenheden per gram gedurende 15 uur continu produceren.

y

Specifieke activiteit in eenheden per gram na 17 uren.

Hydrolyse "beëindigd op de 17e dag.

5 Tabel I

Samenvatting omtrent stabiliteiten en halveringstijden bij een hydrolyse van met warmte behandelde wei bij pH 3,5 en "bij 35°C in combinatie met schoonmaak- en/of desinfecteringstrappen._

Alleen azijnzuur Alleen Tego Diocto Protease en _ BS_ Tego Diocto BS

10 Halveringstijd 9 35 55 in dagen

Stabiliteit, % a 60 -90 95 &

Stabiliteit in de gemiddelde statistische verhouding, uitgedrukt als percentage van de activiteit na 17 uren werken tot de activiteit na 2 uur werken gedurende alle dagen dat werd gewerkt.

^ Uit de tabellen H en I blijkt; (1) dat de met azijnzuur gedesinfecteerde kolom een duidelijk snellere afname in activiteit vertoonde als gemeten met de specifieke activiteit van de geïmmobiliseerde lactase. Deze afname in activiteit per eenheid tijd werd significant groter na de 15e dag, waardoor de kolom na de 17e 20 dag moest worden stilgelegd; (2) vergeleken met de met azijnzuur gedesinfecteerde kolcm had de kolom die werd schoongemaakt met Tego Diocto BS een duidelijk verbeterde stabiliteit en halveringstijd. De bestrijding van een microbencontamina-tie binnen deze kolom leidt dus tot duidelijke voordelen; en 25 (3) de beste resultaten werden verkregen door het schoonmaken te combine ren met het gebruik van een proteaseoplossing, in welk geval wederom een duidelijke verbetering van de halveringstijd en de stabiliteit werden verkregen.

Voorbeeld IV: 30 Het doel van dit voorbeeld is een bepaling van de wijziging in het gedrag van de geïmmobiliseerde lactase gebruikt voor het hydro-lyseren van volledige wei als een functie van het aantal hydrolyse/ schoonmaakcyciussen. De geïmmobiliseerde lactase werd bereid als beschreven in voorbeeld I. Elke hydrolysefase duurde 18 uren en 35 de zes cyclussen werden uitgevoerd. De voorwaarden voor hydrolyse en 8102744 V- * -20- schoonmaken luiden als volgt:

Hydrolyse

De voeding was een volledige wei met pH 3»5 ("bereikt door zoutzuur). De temperatuur bedroeg 32°C en kt2 g (droge stof) geïmmobiliseerde 5 lactase werd toegepast.

. Schoonmaken

De kolom werd eerst gewassen met water gedurende \5 minuten en daarna schoongemaakt met azijnzuur als beschreven in voorbeeld III.

Een uiteindelijke waterspoeling werd gedurende 3 minuten uitgevoerd.

10 De verkregen resultaten zijn weergegeven in tabel <T.

label J

Multipele hydrolyse/schoonmaakcyelussen onder toepassing van volledige wei met -pH 3,5 en bij. 32°C alsmede· een azijnzuur schoonmaak oplossing

Gemiddeld gedrag tijdens hydrolyse a_ 15 stroomsnelheid (cm~Yu) % omzetting Eg (e/g)

Cyclus Ho.

1 llU 1+9 »3 lUil· 2 98 56 l!+9 3 99 b6 98 20 ^ 9^ h0 , 71 5 96 b2,6 83 6 . 9k 35 55 a Het gemiddelde werd berekend over 15,5 uur continu hydrolyseren (de eerste 2,5-uur periode werd uitgesloten).

25 Bekijkt men deze cijfers dan blijkt dat: (1) de'halveringstijd van de geïmmobiliseerde lactase was bijzonder laag (iets minder dan 5 dagen, berekend op specifieke activiteitswaarden); (2) een azijnzuurschoonmaak garandeert geen passende stabiliteit van de geïmmobiliseerde lactase tijdens de volgende hydrolyse/schoonmaak- 30 cyclussen; en (3) de verkregen resultaten leiden niet tot de conclusie, dat deze hydrolyse/schoonmaakcyclussen op technische schaal kunnen worden gebruikt, omdat er sprake is van een snel verlies aan ènzymactiviteit.

8102744

Claims (24)

1. Werkwijze voor het "behandelen van wei, waarbij tenminste een deel van de lactose daarin tot glucose en galactose met een geïmmobiliseerde lactase wordt gehydr olyseerd, welk procédé de volgende trappen omvat: A) verwarming van de wei op U5-90°C gedurende tenminste 15 seconden,

5 B) het centrifugeren van de verwarmde wei terwijl deze nog warm is en C) het in contact brengen van de gecentrifugeerde wei met een geïmmobiliseerde lactase onder voorwaarden die. een hydrolyse van tenminste een deel van de lactose daarin tot glucose en galactose mogelijk maken.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij in trap A 15 minuten tot 10. uur wordt verwarmd.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat trap A wordt uitgevoerd met een tevoren gedemineraliseerde wei en wel een demineralisatie tot voor ten hoogste 90%. k. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat voor 15 trap C de wei op een pH van 3,5 tot 6 wordt aangezuurd. 5. "Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat v66r trap A de wei wordt geklaard.

6. Werkwijze voor het behandelen van wei, waarbij tenminste een deel van de daarin aanwezige lactose tot glucose en galactose met behulp 20 van een geïmmobiliseerde lactase wordt gehydrolyseerd, waarbij de volgende trappen worden toegepast: A) verwarming van de wei op U5-90°C gedurende tenminste 15 seconden, B) het centrifugeren van deze verwarmde wei terwijl hij nog warm is, C) het in contact brengen van de gecentrifugeerde wei met een ge- 25 immobiliseerde lactase onder voorwaarden die een hydrolyse van tenminste een deel van de lactose daarin tot glucose en galactose mogelijk maken, D) schoonmaken van de geïmmobiliseerde lactase en E) desinfectie van de geïmmobiliseerde lactase.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij de verwarmingstijd gedurende 30 trap A 15 minuten tot 1 uur bedraagt.

3. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, met het kenmerk, dat trap D wordt uitgevoerd door de geïmmobiliseerde lactase in contact te brengen met een protease-houdende oplossing.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat cfeprotease-35 oplossing een enzymactiviteit heeft van ca. 0,1-10 Anson-eenheden per 81 02 744 -+ 'Sr -22- liter oplossing.

10. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, waarbij trap E wordt uitgevoerd door de geïmmobiliseerde lactase in contact te brengen met een oplossing van tenminste een gesubstitueerd, diëthyleentriamine.

11. Werkwijze volgens conclusies 6 of 7, waarbij trap A wordt uitge voerd met een wei die tevoren voor ten hoogste 90% is gedeaineraliseerd.

12. Werkwijze volgens conclusies 6 of 7> waarbij voör trap C wei wordt aangezuurd tot een pH van 3,5-6.

13. Werkwijze volgens conclusies 6 of 7, waarbij vóór trap A de wei 10 wordt geklaard. ih-. Werkwijze voor het behandelen van zure wei waarbij tenminste een deel van de daarin aanwezige lactose tot glucose en galactose met behulp van een geïmmobiliseerde lactase wordt gehydrolyseerd, welk procëde de volgende trappen omvat:

15 A) het klaren van de wei; B) het verwannen van de wei op U5-90°C gedurende tenminste 15 seconden en C) het in contact brengen van de verwarmde wei met een geïmmobiliseerde lactase onder voorwaarden die een hydrolyse van tenminste een deel van de lactose daarin tot glucose en galactose mogelijk maken.

15. Werkwijze volgens conclusie lH, waarbij de verwarmingstijd tij dens trap B 15 minuten tot 1 uur bedraagt.

16. Werkwijze volgens conclusies lU of 15, waarbij trap B wordt uitgevoerd met een tevoren tot voor ten hoogste 90% gedemineraliseerdè wei.

17. Werkwijze voor het behandelen van zure wei, waarbij tenminste 25 een deel van de daarin aanwezige lactose met behulp van een geïmmobiliseerde lactase tot glucose en galactose wordt gehydrolyseerd welk procédé de volgende trappen omvat: A) het klaren van de wei; B) het verwarmen van de wei op b5-90°C gedurende tenminste 15 seconden; 30 c) het in contact brengen van deze verwarmde wei met een geïmmobiliseerde lactase onder voorwaarden die tenminste een deel van de daarin aanwezige lactose tot glucose en galactose mogelijk maken; D) schoonmaken van de geïmmobiliseerde lactase en E) desinfectie van de geïmmobiliseerde lactase.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat tijdens 8102744 -23- trap B 15 minuten tot 1 uur wordt verwarmd.

19. Werkwijze volgens conclusie 17-18, waart ij trap B wordt uit gevoerd door de geïmmobiliseerde lactase met een proteaseoplossing in contact te brengen.

20. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat de protease oplossing een enzymactiviteit heeft van 0,1-10 Ansoneenheden per liter oplossing.

21. Werkwijze volgens conclusies IT-18, waarbij trap E wordt uitgevoerd door de geïmmobiliseerde lactase met een oplossing van tenminste 10 een gesubstitueerde diëthyleentriamine in contact te brengen.

22. Werkwijze volgens conclusie 17 of 18, waarbij trap B wordt uitgevoerd met een tevoren voor ten hoogste 90¾ gedemineraliseerde wei.

23. Werkwijze voor het behandelen van wei om daarvan tenminste een deel van het daarin aanwezige eiwit te verwijderen, welk proces 15 de volgende trappen omvat: A) het verwarmen van de wei op een temperatuur van ^5-90°C gedurende tenminste 15 seconden en B) het centrifugeren van de verwarmde wei terwijl deze nog warm is. 2h. Werkwijze volgens conclusie 23, waarbij de verwarming tijdens 20 trap A 15 minuten tot 1 uur duurt.

25· Werkwijze voor het schoonmaken van een geïmmobiliseerde lactase met daarop af ge zette weieiwitten, met het kenmerk, dat men de geïmmobiliseerde lactase in contact brengt met een oplossing van een protease.

26. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk,dêt de 25 proteaseoplossing een enzymactiviteit heeft van 0,1-10 Anson-eenheden per liter oplossing. 81 0 2 7 4 4