DK162532B - Aminogruppeholdige acrylcopolymere - Google Patents

Description

DK 162532 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte amino-gruppeholdige acrylcopolymere opnået ved tilføring af funktionelle grupper med ethylendiamin på R^-substituen-ten i de copolymere, som er dannet ved at copolymerisere 5 tre forskellige bestanddele I, II og III, hvor bestanddel I består af: - 2-50 vægt-% af en monomer, som tværbindingsmiddel, som er til en N,N'-diacryldiaminoalkan med formlen: 10

CH9 * CH-C-NH-(CH«) -NH-C-CH=CHL Δ I Z n2 I Z

0 o hvori * 1 eller 2.

15 £

Disse forbindelser er anvendelige ved peptidsyntese i fast fase.

De hidtil ukendte acrylcopolymere ifølge opfindelsen er nr\ afledt af sådanne acrylcopolymere, som er omtalt i dansk patentansøgning nr. 5132/82, ved indførelse af funktionsdygtige grupper ved hjælp af ethylendiamin. De acrylcopolymere ifølge ovennævnte patentansøgning, som i det følgende vil blive betegnet A eller som P-COR, hvori R = H eller -CH^, er opnået ved copolymerisation af tre nærmere beskrevne monomere (I), (II) og (III).

De aminogruppeholdige copolymere ifølge opfindelsen er ejendommelige ved det i kravets kendetegnende del anfør-3° te.

Indførelsen af de funktionsdygtige grupper til opnåelse af de aminogruppeholdige acrylcopolymere ifølge opfindelsen gennemføres ved, at man danner en sidegren ved amid-33 reaktion med ethylendiamin til dannelse af forbindelsen B:

DK 162532 B

2 Q-C—OR (3~°—NH— (CH2} 2—NH2

O O

A B

5

Denne amiddannelse kan gennemføres ved hjælp af en af de i det følgende beskrevne synteseveje: 10 (a) ved kobling ud fra en syregruppe (A, R = H) med ethy- lendiamin ved hjælp af en af de i litteraturen omtalte reaktionskomponenter: dicyclohexylcarbodiimid (DCC) i nærvær af et aktiveringsmiddel, såsom 1-hy-droxybenzotriazol (HOBT) eller benzotriazol-l-yl-oxy-15 tris- (dimethylamino) -phosphonium-hexafluorphosphat (BOP); (b) ud fra ester-gruppen (A, R = CH^) ved omrøring af harpiksen ved stuetemperatur med et overskud af vand-20 frit ethylendiamin.

Under anvendelse af denne sidstnævnte metode har et systematisk forskningsarbejde vedrørende eksperiment-betingelserne ført til en begrænsning af de sekundære reaktio-25 ner med brodannelse og til bevaring af 90% af det oprindelige indhold af reaktionsdygtige grupper.

Peptidssyntese-metoden i fast fase, som er blevet udviklet siden 1962, hovedsagelig under anvendelse af poly-30 styren-baserede bærestoffer (såkaldte "Merrifield"-harpiks, benzhydrylamin-harpiks, alkoxybenzyl-harpiks, PAM-harpiks etc.) er velkendt, og den har været genstand for talrige omtaler (f.eks. Erickson & Merrifield i Neurath og Hili, The Proteins, Vol. 2, Academic Press, 1976, p.

35 255; Birr, Aspects of the Merrifield peptide synthesis,

Springer 1978; Barany og Merrifield, i Gross & Meienho-fer, The peptides : analysis, synthesis, biology, Vol. 2,

DK 162532 B

3

Part A, Academic Press, 1980, p. 1). Harpiksen, som på passende måde har fået tilført funktionsdygtige grupper, omdannes til ester form eller til amidform ved hjælp af en N-beskyttet aminosyre, som i det peptid, der skal synte-5 tiseres, indtager stilling ved det endestillede carbon-atom. Efter fjernelse af beskyttelsesgruppen fra amin-gruppen gennemføres koblingsreaktionen, idet man anvender en af de talrige metoder, som er omtalt i litteraturen, og idet den N-beskyttede aminosyre indtager den næstsids-10 te stilling i den sekvens, der skal syntetiseres. Disse behandlinger gentages, indtil man opnår på harpiksen den ønskede peptid-kædedannelse. 1 det sidste behandlingstrin fraspaltes peptidet fra sit bærestof.

15 Denne metode udviser visse fordele i forhold til syntese i opløsning: i særdeleshed processens enkelthed og hurtighed (det er ikke længere nødvendigt at isolere og at rense peptidet efter hver kobling), bekvem fjernelse af reaktionskomponenterne i overskud og af urenheder ved 20 filtrering og vask af bærestoffet, fravær af eller en kraftig formindskelse af racemiseringsdannelse. En begrænsning vedrører dog kravet om ved hver enkelt koblingsreaktion at nå til et praktisk talt kvantitativt udbytte; enhver ufuldstændig reaktion ville føre til en 25 ophobning af afskårne peptidkæder, som ville forurene slutproduktet. Herfra hidrører nødvendigheden af at anvende store overskud af reaktionskomponenter og af at gentage hver koblingsreaktion, indtil en passende analytisk afprøvning (f.eks. med ninhydrin) angiver fravær på 30 harpiksen af enhver fri N^-gruppe. Sådanne eksperimentale betingelser bliver imidlertid afskrækkende, når syntesen indebærer anvendelsen af ikke-naturlige aminosyrer, · som eventuelt kan være sjældne og kostbare.

35 For at drage nytte af de fordele, som er knyttet til reaktioner, der foregår i homogen fase, har man foreslået at anvende opløselige polymere (jvf. Mutter og Bayer, i

DK 162532 B

4

Gross og Meienhofer, The peptides: analysis, synthesis, biology, Vol. 2, Part A, Academic Press, 1980, p. 285), især polyethylenglycol. Denne teknik har imidlertid kun opnået en begrænset anvendelighed, sandsynligvis på grund 5 af de eksperimentelle problemer, som udgøres af: - den opløseligheds-formindskelse, som kan ledsage forlængelsen af peptidkæden, 10 - isolering af bærestoffet efter hver koblingsomsætning, som nødvendiggør en ultrafiltrering (Mutter, Hagenmaier og Bayer, Angew. Chem. Int. Ed., 1971, 10, 811; Bayer, Gatfield, Mutter og Mutter, Tetrahedron, 1978, 34, 1829) eller en udkrystallisation ved tilsætning af 15 ether efter eventuel fjernelse af opløsningsmidlet (Bayer og Mutter, Chem. Ber., 1974, 107, 1344; Mutter,

Uhmann og Bayer, Ann. Chem., 1975, p. 901; Corring og Jing, Ann. Chem., 1975, p. 1765 og 1776), 20 - fraspaltningen af peptidet fra dets bærestof (Tjoeng,

Tomg og Hodges, J. Org. Chem., 1978, 43, 4190; Tjoeng og Hodges, Tetrahedron Letters, 1979, p. 1273; Mutter,

Bayer og Gatfield, J. Org. Chem., 1980, 45, 5364).

25 Man møder de samme vanskeligheder, når det drejer sig om opløselige bærestoffer baseret på polystyren, som er svagt tværbundet eller slet ikke tværbundet, og som indebærer en gelfiltrering (Birr, i "Peptides 1972", North Holland Publ., 1973, p. 72; Andreatta og Rink, Helv.

30 Chim. Acta, 1973, 56, 1205), eller en udfældning ved hjælp af alkohol (Narita, Bull. Chem. Soc. Japan, 51, 1477).

Den alternerende teknik væskefase-fast fase (Frank, Meyer 35 og Hagenmaier, Chem. Zeit., 1977, 101, 188) er ligeledes kun i ringe udstrækning blevet udviklet.

DK 162532 B

5

Man har i den senere tid påvist overlegenheden af poly-acryl-baserede bærestoffer, såsom PAP ifølge Walter (J.

Arner. Chem. Soc., 1979, 101, 5383) og Sheppards harpiks (JCS Perkin I, 1981, p. 529 og 538), som har den 5 egenskab, at de kvælder op i et betydeligt større udvalg af opløsningsmidler end polystyrenerne (Atherton, Gait, Sheppard og Williams, Bioorg. Chem. 1979, 8, 774). Der foregår især: en lettere fraspaltning ved syntesens afslutning mellem polypeptidet og dets bærestof; en bedre 10 forenelighed mellem solvaterings-egenskaberne for bærestoffet og den peptiddel, der er i færd med at vokse, hvilket er af en sådan karakter, at det begrænser dannelsen af afskårne dele og afvigende koblingsreaktioner.

Man har især påvist den gunstige indflydelse af solvati-15 seringen af systemet harpiks-peptid på udbyttet af koblingsreaktioner se: (Atherton, Woolney og Sheppard,

Chem. Comm., 1980, p. 970). De kommentarer, som allerede er blevet anført i forbindelse med polystyrenharpikser med hensyn til anvendelsen af et stort overskud af reak-20 tionskomponenter (i størrelsesordenen 2,5 gange) og nød vendigheden af i almindelighed at gentage hver koblingsreaktion adskillige gange, forbliver dog stadig gyldige.

Det er i denne forbindelse signifikant, at de nyeste langkædede polypeptidsynteser igen anvender metoden i 25 opløsning (f.eks. Kenner, Rakaga og Sheppard, Tetrahe dron, 1979, 35, 2767; Nagaraj og Balarin, Tetrahedron, 1981, 37, 1263; Fujii og Yajima, JCS Perkin 1 1981, p.

789, 787 og 804).

30 For at mildne på de allerede ovenfor fremhævede forskelle i solvatiseringen mellem matricen og polypeptidkæden, som er i færd med at vokse, har man for nylig foreslået en hidtil ukendt polyacrylamidgel (R Epton og A Williams,

Inst. J. Biol. Macromol. 1981, 3, 334). På dette bærestof 35 er den steriske hindring af en sådan art, at denne type harpiks kun har kunnet anvendes ved syntesen af korte peptider. Den afsluttende fjernelse af beskyttelsesgrup-

DK 162532 B

6 pen medfører endelig en meget lang behandlingstid med bortrifluorid (adskillige dage).

Som det vil fremgå af det følgende, tillader bærestoffer-5 ne ifølge den foreliggende opfindelse en betydelig simplificering og forbedring af betingelserne for peptidsyntese.

Det er for at gennemføre en peptidsyntese dog nødvendigt 10 at tilvejebringe en modifikation af harpikserne ifølge opfindelsen gennem indføringen af et reversibelt forankringssystem. Det er f.eks. muligt at anvende en reaktionskomponent af typen C (Mitchell, Erickson, Ryabtsev,

Hodges og Merrifield) J. Amer. Chem. Soc., 1976, Stahl, 15 Walter og Smith, J. Amer. Chem. Soc., 1979, 101, 5383; Atherton, Logan og Sheppard, JCS Perkin I, 1981, p. 538; Atherton, Hubscher, Sheppard og Wooley, 2. Physiol. Chem.

1981, 362, 833).

20 °\ /=\ H0 N-'

C

25 hvori X = Cl, Br eller OH, Y er en gruppe -C^-O- eller en gruppe -C^-.

30 Omsætningen mellem B og C til dannelse af D: 35

DK 162532 B

7

Ø-C-NH- (CH2) 2-NH-C-Y-/ \—<ZE2X

5 ° O

B

kan i praksis gennemføres kvantitativt ved hjælp af et af 10 de tidligere nævnte koblingsmidler, eller ved indvirkning af forbindelsen II på en aktiveret ester (fremstillet med 2,4,5-trichlorphenol, pentachlorphenol etc.) på forbindelsen III i nærvær eller ikke i nærvær af en katalysator (HOBT, BOP).

15

Et andet reversibelt forankringssystem er blevet gennemført under anvendelse af en reaktionskomponent af typen E (R * H eller CH^), som kondenseres med B til dannelse af F: 20 (PVC—NH—(CH0 )„—NHL -> @-C-NH-( CH„ ) ^ -NH-C-CH-Br * 4 2 2 Hor_cH_.Br | 4 2 | |

0 Δ\ 0 OR

R

25 B E F

Denne forankringstype, som allerede er blevet anvendt på polystyrenharpikser (Mizoguchi, Shigezan og Takamura,

Chem. Pharm. Bull., 1970, 18, 1465; Wang, J. Org. Chem., 30 1976, 41, 3258), er original, når det drejer sig om et polyacryl-baseret bærestof.

Fikseringen af den C-endestillede aminosyre i det første trin, og den endelige fraspaltning af peptidet fra dets 35 bærestof, gennemføres under de samme reaktionsbetingelser, som ovenfor beskrevet.

DK 162532 B

8

De således med funktionsdygtige grupper forsynede harpikser, som anvendes ved peptidsyntesen, har et indhold af funktionsdygtige grupper på mellem 0,2 og 5 mækv. pr. gram, fortrinsvis mellem 1,0 og 1,2 mækv. pr. gram tørt 5 bærestof.

Fikseringen af den C-endestillede aminosyre på harpiksen, hvorved NH2 f.eks. er beskyttet med den syrelabile gruppe t-butyloxycarbonyl (Boc) eller ved den baselabile gruppe 10 fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), kan gennemføres på forskellige måder: - ved hjælp af et cæsiumsalt, hvor X = Cl eller Br, 15 - ved indvirkning af dicyclohexylcarbodiimid (DCC) i nær vær af 4-dimethylaminopyridin (DMAP) som katalysator, når X = OH, - eller også, når X = OH, ved midlertidig dannelse af det 20 symmetriske anhydrid af den N-beskyttede aminosyre og ved at lade dette omsætte sig med D i nærvær af DMAP.

Den afsluttende fraspaltning af peptidet fra dets bærestof gennemføres: 25 - ved hjælp af en uorganisk base i fortyndet opløsning, når Y er en methylengruppe, eller når man anvender F; eller NH^/CH^OH, hvorved det er muligt at opnå et endestillet C-amid; 30 - gennem anvendelse af en organisk syre, såsom trifluor- eddikesyre i fortyndet opløsning, når Y betegner en gruppe -CH2~0-.

Peptidsyntesens metodologi 35

De bærestoffer, som indgår i opfindelsen, har den egenskab, at de udviser en god permeabilitet, og at de i sær-

DK 162532 B

9 lig grad svulmer op inden for et stort område af protiske og aprotiske opløsningsmidler, såvel som i vandige bufferopløsninger med varierende pH.

5 Under disse betingelser, medens en kobling finder sted, opfører den harpiks, der er bærer af N-Boc eller af N-Fmoc-aminosyren i C-endestillingen (eller af peptidet under udvikling og på passende måde beskyttet) sig som en såkaldt "pseudo-opløsning", og den således sammensatte 10 gel lader sig ikke filtrere. Dette skaber særligt gunstige betingelser, som nærmer sig betingelserne for den homogene fase, for dannelsen af peptidbindingen. Når reaktionen er afsluttet, fremtvinger tilsætning af et tredje opløsningsmiddel (ether, THF, dioxan etc.) udstød-15 ningen af det opløsningsmiddel, som gennemvæder harpiksen, og bundfældningen af sidstnævnte i en bekvem og hurtig filtrerbar form, modsat det, der foregår under anvendelse af den kendte teknik.

20 Disse særlige og specifikke egenskaber knyttet til harpikserne ifølge opfindelsen fører til en signifikant forbedring af hastigheden (multipliceret mindst tre gange i forhold til det hidtil kendte) og af udbyttet af koblingsreaktionen. Som resultat heraf er det muligt for 25 hver individuel koblingsreaktion på mærkbar måde at formindske værdien af forholdet: antal mol N-beskyttet aminosyre/bærestoffets indhold af funktionelle grupper, til 1,1-1,2, medens de sædvanlige værdier er af størrelsesordenen 2,5. Derudover forekommer der aldrig tilstop-30 ning af kolonnerne under de mellemliggende filtreringer.

Afvekslingen mellem koblingsreaktionen i omtrent homogen fase og udfældningen af bærestoffet udgør således en hidtil ukendt, simplificeret og forbedret peptidsyntese-35 metodologi i fast fase.

DK 162532 B

10

Forsøgsbetingelserne i forbindelse med en koblingsreaktion kan f.eks. være følgende: 1. Tilsætning af et inert opløsningsmiddel, såsom CHClg, 5 CH2CI2 eller DMF til opsvulmning af den harpiks, som bærer N-Boc-aminosyre i C-endestillingen (eller det på passende måde beskyttede peptid); 2. vaskning ved hjælp af en lineær eller cyclisk ether, 10 såsom ethylether, isopropylether, THF eller dioxan; 3. tilsætning af trifluoreddikesyre til opløsningsmidlet til gennemførelse af fjernelse af beskyttelsesgruppen for NI^; 15 4. udfældning af harpiksen ved tilsætning af ether analogt med punkt 2; 5. filtrering efterfulgt af fire vask med ether analogt 20 med punkt 2; 6. neutralisation ved tilsætning af diisopropylethylamin 1 et inert opløsningsmiddel; 25 7. fire vask med ether analogt med punkt 2 og påfølgende tørring i en nitrogenstrøm; 8. kobling ved omrøring sammen med en opløsning i chlo-reret opløsningsmiddel af symmetrisk anhydrid (frem- 30 stillet umiddelbart før anvendelsen) af en N-Boc- aminosyre; 9. udfældning ved tilsætning af ether analogt med punkt 2 og påfølgende filtrering, samt 35 10. fire vask med ether analogt med punkt 2.

DK 162532 B

11

Man har med godt resultat afprøvet denne hidtil ukendte metodologi ved syntesen af peptider, som har særlig biologisk interesse, f.eks. et undecapeptid Ac-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Hla-Arg-Lys-Val-Leu-Homo-Ser.

5

Eksempel - Syntese af peptidet Ac-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Ala-Arg-Lys-Val-Leu-Homo-Ser

Peptidet syntetiseres på en acrylharpiks, som er opnået 10 ved at copolymerisere N-acrylylpyrrolidin, ethylen-bis-acrylamid og N-acrylderivatet af methylesteren af a-ami-nocapronsyre. Bærestoffet tilføres derpå funktionelle grupper på følgende måde: Man tilsætter til 1 g harpiks (som er forsynet med funktionsdygtige grupper ved hjælp 15 af CC^CHg) 32 ml redestilleret ethylendiamin, og der omrøres en nat ved omgivelsernes temperatur. Man filtrerer, vasker med demineraliseret vand indtil neutralitet, derpå med ethanol og med ether. Harpiksen tørres til sidst i 24 timer i vakuumovn; den indeholder 1 mækv. NH^ 20 pr. gram tør polymer.

Man anvendte 2 g harpiks, svarende til 2 mækv. NH2· Den behandlingscyclus, som er nødvendig for at fæstne en aminosyre til harpiksen, er som følger: 25 30 35

DK 162532 B

12

Opløsningsmiddel Volumen Tid eller reaktant Nr. Reaktion ml min.

Vandfri ethylether 1 Skylning 75 2 ------------------ 2 -------- 5 3 -------- ------------------ 4 -- .

Trifluoreddikesyre 5 Fjernelse 50 2 30/ CH9C1,70 (V/V) af beskyt- z Δ telses- gruppe ------------------ 6 50 30

Vandfri ethylether 7 Skylning 75 2 10 ------------------ 8 -------- ------------------ 9 ........

------------------ 10 --------

Diisopropylethyl- 11 Neutrali- 50 2 amin 10/ CH„Clo90 sation (V/V) ------------------ 12 — 30 15 Vandfri ethylether 13 Skylning 75 2 ------------------ 14 -------- ------------------ 15 -------- ------------------ 16 --------

Tilsætning af sym- 17 Kobling 50 60 metrisk aminosyre-anhydrid til kobling i 50 ml CH-C1«

Vandfri ethylether 18 Skylning 75 2 ------------------ 19 -------- ------------------ 20 -------- ------------------ 21 --------

Diisopropylethyl- 22 Neutrali- 50 2 amin 10/ CH9C1990 sation (V/V) 25 23 — 30

Vandfri ethylether 24 Skylning 75 2 ------------------ 25 -------- ------------------ 26 -------- ------------------ 27 --------

Tilsætning af sym- 28 Kobling 50 30 metrisk aminosyre-anhydrid til kob-30 ling i 50 ml CH9C19

Ethylether 29 Skylning 75 2 ------------------ 30 -------- ------------------ 31 -------- ------------------ 32 -------- 35 13

DK 162532B

En verificering af koblingsreaktionens afvikling foretages ved hjælp af den såkaldte "Kaiser"-test med ninhy-drin.

5 Som det kræves af den eksperimentelle fremgangsmåde, har man systematisk gennemført to koblinger for hver tilført aminosyre. Koblingsreaktionen gennemføres ved hjælp af symmetriske anhydrider, som fremstilles på følgende måde: 10 1 mmol af beskyttet aminosyre opløses i 20 ml vandfrit 0Η2012, opløsningen køles til 0 °C, og man tilsætter derpå 0,5 mmol dicyclohexylcarbodiimid i opløsning i 10 ml CH2C12· Efter 20 minutters omsætning ved 0 °C frafiltre-res bundfaldet af dicyclohexyl-urinstof, som vaskes med 15 20 ml CH2C12, idet opløsningerne forenes og bringes i kontakt med harpiksen i reaktoren.

Man har ved denne metode kunnet fremstille symmetriske anhydrider ud fra Boc Gly OH, Νβ Z Ne Boc Lys OH Boc Val

20 OH, Boc Leu OH, Boc Met OH, og Ac Gly OH. Når det drejer G CL

sig om N N02, N Boc Arg OH, opløses reaktionsproduktet i den mindst muligt mængde DMF, og rumfanget bringes op til 20 med tør methylenchlorid; derpå gennemføres omsætningen, som det er beskrevet ovenfor.

25

Harpiksen tørres efter tilkobling af den sidste aminosyre under højt vakuum i nærvær af Ρ205 i 24 timer, hvorpå den bringes i suspension i 50 ml trifluoreddikesyre. Derpå gennembobler man i 2 timer en langsom strøm af tørt HBr.

30 Man filtrerer og skyller i meget høj udstrækning med CH2C12 og Et20. Denne acidolyse fjerner beskyttelsen fra lysinemes sidekæder.

Det således opnåede orangerøde pulver bringes derpå i 35 suspension i 100 ml 2 M trifluoreddikesyre, og man tilsætter 5 g zink i pulverform. Efter 12 timers omrøring ved omgivelsernes temperatur vasker man i stort omfang

DK 162532 B

14 med 2 N HC1, med vand, med ethanol og til sidst med vandfri ethylether. Denne hydrogenolyse fraspalter nitrogruppen, som er båret af arginiens guanidinogruppe.

5 Efter tørring i 12 timer af harpiksen under kraftigt vakuum og over udtaSTer man 1 9 polymer, som behandles med 2,5 g cyanogenbromid i 70 ml propionsyre. Man lyofi-liserer efter 24 timers omsætning ved stuetemperatur, og man opnår det ønskede peptid med et udbytte på 45%.

10 15 20 25 30 35

Claims (2)

1. 30 Z = - (CH2)ni- raed = 4,5 eller 6, eller - (CH2>2 “ X “ (CH2}2” med x 0 eller N-CHg 35 DK 162532 B eller et N-acryldialkylamid med formlen: R, R0 |1 ! 2 CH0 = C - C - N (2) 5 \ R2 hvori R^ har den ovenfor anførte betydning, og R2 = -CHg eller -CgHj.; og 10 III - 2-65 vægt-% af en monomer som funktionsbærende middel, hvilken monomer består af N-acrylaminosyre eller -ester eller -racemat med formlen: 1B- CH« = C—C—N—(0Ho) —C—0Rq (4) 15 2 1 , 1 2 n3 , 3 ^0 H 0 hvori R1 = H eller -CHg Rg = H eller -CHg 20 n3 = 1, 2, 3 eller 5, eller en asymmetrisk N-acrylaminosyre eller -ester (L-serie) med formlen: 25 * CH0 = C—C—NH—CH—C—0Ro (5) Δ I i 1 1 3 Rx 0 R4 0 hvori = H eller -CHg
2. 30 Rg har den ovenfor anførte betydning r4 = -ch3, -ch(ch3)2, -ch2(ch3)2, -«2-Ό , -CH 2-^D -OH, -CH2-CH2-S-CH2 eller 35 DK 162532 B -(ch2)4-nh2, eller N-acrylyl(L)prolin eller dennes methylester med formlen: 5 -i 0 I *L c <6) CH0 = C - C - N"^ z * « OR- R1 0 3 10 hvori R1 = H eller -CHg, og R3 har den ovenfor anførte betydning. 15 20 25 30 35