DK162287B - Fremgangsmaade til koncentrering af en oploesning af et beta-lactamantibiotikum - Google Patents

Description

i

DK 162287 B

Den foreliggende opfindelsen angår en fremgangsmåde til koncentrering af en fortyndet vandig opløsning af et 3-lactam-antibiotikum, som er varmefølsomt.

Med andre ord angår opfindelsen en fremgangsmåde til effektiv 5 koncentrering af den fortyndede vandige opløsning ved at underkaste den en permeeringsproces med en permeabel membran i nærværelse af en lavere alkohol, uden at der sker sønderdeling af β-lactamantibiotikumet.

Ved rensning af 3-lactamantibiotika eller mellemprodukter til 10 fremstilling derved ved fermenteringsprocesser anvendes ofte kromatografi på forskellige adsorberende materialer,hvorved 3-lactamantibiotika sædvanligvis fås i form af meget fortyndede opløsninger. De på denne måde fremstillede fortyndede opløsninger koncentreres sædvanligvis ved anvendelse af 15 et inddampningsanlæg med opvarmning til fordampning af vandet. Størsteparten af 3-lactamantibiotika er imidlertid ustabile ved varmepåvirkning og undergår særdeles let termisk sønderdeling under koncentreringen. På den anden side kræver koncentrering ved en relativt lav temperatur meget store mæng-20 der energi, f.eks. som damp.

Det er kendt at foretage lavtemperaturkoncentrering eller koncentrering uden opvarmning med anvendelse af en permeabel membran indenfor forskellige områder af den kemiske industri, fødevareindustrien og den farmaceutiske industri, og det er 25 blevet gængs teknik at fjerne alt opløsningsmiddel bortset fra vand inden koncentreringen ved anvendelse af en permeabel membran, når en sådan findes. Ved koncentrering af en fortyndet opløsning af et 3-lactamantibiotikum i vandigt methanol dannet ved kromatografi er det således kendt først at fjerne 30 methanolet ved fordampning ved en relativt lav temperaur og derefter at koncentrere den tilbageblevne vandige opløsning ved anvendelse af en permeabel membran. Denne fremgangsmåde giver imidlertid ofte ringe koncentrationsudbytter og medfører en større grad af sønderdeling.

DK 162287 B

2 På denne baggrund er det blevet forsøgt at foretage direkte koncentrering med anvendelse af en permeabel membran af en fortyndet opløsning af et β-lactamantibiotikum.i vandigt methanol fremkommet ved kromatografi, og det har. overraskende 5 vist sig, at koncentrationen kan gennemføres med godt resultat, samt at sønderdelingen af β-lactamantibiotikumet ikke blot reduceres, men at endvidere udsivningen deraf til den permeerede væske formindskes.

Angående adskillelsen ved permeering af ultrafortyndede 10 vandige alkoholopløsninger er blandt andre følgende data rapporteret: 0,001-0,006 g mol/liter, 0,002-0,1% (rumfang/rum-fang) i tilfældet af methanol (i det følgende angives opløsningsmidlerne i rumfang/rumfang %), jf. Journal of Applied Polymer Science, bind 15 (1971), side 2905-2927, 700 ppm = 15 0,07% i tilfælde af ethanol, jf. R.L. Relay et al., ved mem- branseparationteknologikonferencen på Clemson University fra den 2. til 6. august, 1976, men disse to rapporter, viser, at alkoholer ikke permeerer gennem membranen. Ved forsøg på at foretage koncentrering i nærværelse af et opløsningsmiddel 20 ved hjælp af en permeabel membran har man i forbindelse med den foreliggende opfindelse undersøgt virkningerne af methanol på membranen med en fortyndet opløsning af deacetyl-cephalosporin C (DCPC) i methanol (DCPC: ca. 5000 yg/ml, 15%'s methanol) anvendt som et repræsentativt eksempel, idet 25 man som permeable membraner har valgt en celluloseacetatmembran (Daicel Ltd.), B-9 (E.I. Du Pont de Nemours & Co.) og PA-300 (Universal Oil Products Co.) som membraner fremstillet af henholdsvis celluloseacetat, polyamid og poly(ether/amid).

Det blev herved bekræftet, at selv om flade celluloseacetat-30 membraner og polyamid B-9-membraner går itu efter anvendelse i flere dage, har poly(ether/amid) PA-300-membranen nok modstandsevne mod ethanol til,at den kan anvendes i længere tidsrum. Det har endvidere vist sig fordelagtigt ved industriel anvendelse, at methanol ikke forhindres frat.,·· . 35 permeere og frit kan bevæge sig i den permeerede væske, og at udsivning af DCPC til den permeerede væske formindskes i større udstrækning ved nærværelse af ethanol end i en vandig opløs-

DK 162287 B

3 ning. Der opnåedes således lovende resultater med henblik på koncentrering af en permeabel membran i nærværelse af et opløsningsmiddel, og der blev derfor foretaget yderligere forskning angående typen og koncentrationen af opløsningsmidler, 5 3-lactamantibiotika og andre anvendelige betingelser med hen blik på at færdigudvikle opfindelsen.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til koncentrering af β-lactamantibiotikaopløsning, ved hvilken man koncentrerer en vandig fortyndet 3“lactamantibiotikumop-10 løsning, som indeholder 2-20% af en lavere alkohol, ved hjælp af en permeabel membran fremstillet af poly(ether/amid) eller polybenzimidazolon.

Som den lavere alkohol i den vandige udgangsopløsning kan der først og fremmest anvendes methanol, ethanol, propanol 15 og butanol. Hvad angår koncentrationen af den lavere alkohol er 2-20% den lettest håndterbare koncentration, hvorimod koncentrationer på højst 2% fører til kraftigere sønderdeling af det opløste stof, og koncentrationer på mindst 20% bevirker mange vanskeligheder ved koncentreringen. Selv om 20 ethanol kan permeere frit gennem permeable membraner, falder permeeringsforholdet med stigende molekylvægt for alkoholen, som det er tilfældet med propanol, butanol etc. Dette bevirker en gradvis forøgelse af alkoholkoncentrationen bortset fra methanol i den koncentrerede væske efterhånden som kon-25 centrationen skrider frem, selv når koncentrationen i udgangsopløsningen er lav, og det foretrækkes derfor at indstille begyndelseskoncentrationen på en sådan passende værdi som ikke fremkalder vanskeligheder.

Det opløste stof, som skal koncentreres ved den foreliggende 30 fremgangsmåde, kan teoretisk være af en vilkårlig type, men et af de typiske og mest effektive eksempler, hvor fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes, er et termisk ustabilt 3-lactamantibiotikum dannet ved fermentering, især et sådant i et fortyndet eluat, som er fremkommet ved rensning ved kro-35 matografi.

DK 162287 B

4

Især er f.eks. cephalosporin C (CPC) , deacetylcephalosporin C (DCPC), deacetoxycephalosporin C (DACPC)og de i 7-stillin-gen deacylerede forbindelser, især når deacyleringen gennemføres ved anvendelse af en mikrobiologisk fremgangsmåde, eg-5 nede materialer til anvendelse ved denne fremgangsmåde. Koncentrationsområdet for disse opløste stoffer er ikke specielt begrænsede, og det er normalt 0,01-5% (vægt/rumfang)fortrinsvis 0,1-1% (vægt/rumfang).

Den permeable membran, som kan anvendes ved fremgangsmåden 10 ifølge opfindelsen, skal være modstandsdygtig for lavere alkohol, da den skal anvendes i nærværelse af højkoncentrerede lavere alkohol, og der kan eksempelvis anvendes permeable membraner fremstillet poly(ether/amid) (P-300, PEC-1000 fremstillet af Toray Industries, Inc., etc.) og polybenzimid-15 azolon (PBIL fremstillet af Teijin Limited). Poly(ether/amid)-menbranen kan f.eks. fremstilles ved en grænsefladepolymerisationsteknik. Kort beskrevet fremstilles membranen ved at anbringe et tyndt lag af en vandig opløsning af et epichlor-hydrin-ethylendiaminkondensat på en polysulfonbæremembran med 20 finporet overflade og derefter at kontakte poly(ether/amin)-laget med en med vand ikke-blandbar opløsning af isophthalyl-dichlorid. Ved grænsefladen dannes en tynd semipermeabel folie, en tværbundet poly (ether/amid)-copolymer.. Derefter tørres membranen ved forhøjet temperatur.

25 Koncentreringen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemføres Ved stuetemperatur, f.eks. 10-35°C, fortrinsvis 25-30°C. Andre betingelser for koncentreringen ved hjælp af permeable membraner kan vælges hensigtsmæssigt under hensyntagen til sædvanligvis anvendte betingelser. Den ved fremgangs-30 måden ifølge opfindelsen fremkomne koncentrerede væske kan om nødvendigt efter gentagelse af den omhandlede fremgangsmåde underkastes en konventionel rensningsfremgangsmåde til isolering af det opløste stof.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses i de følgende eksempler.

DK 162287 B

5

Eksempel 1.

50 kg krystallinsk DCPC-natriumsalt (vandindhold 14,81%) opløses i 8000 liter 10%'s vandig methanol. De 8000 liter opløsning (25°C) sættes til et koncentreringsapparatur, hvori der 5 anvendes permeable membraner [poly(ether/amid)-membran, spiralviklede elementer med en diameter på 15,2 cm og en længde på 91,4 cm fra firmaet Universal Oil Products Co., med varemærket 1501PA] med en cirkulationsstrømningshastighed på 2 5000 liter pr. time ved et tryk på 40 kg/cm G. Koncentrerin-10 gen gennemføres kontinuerligt i 24 timer, hvorved der fås 800 liter koncentrat og 7200 liter permeat. Indholdet af DCPC i koncentratet og i permeatet er henholdsvis 49,2 mg/ml og 0,078 mg/ml.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde gennemføres i alt ti gan-15 ge. I nedenstående tabel er anført DCPC-indholdet (%) i koncentratet, DCPC-indholdet (%) i permeatet og mængden (%) af DCPC, som er sønderdelt under koncentreringen.

Tabel

Koncen- DCPC i kon- DCPC i per- DCPC

trering centrat % meat % sønderdelt, % nr.

20 1 97,8 1,4 0,8 2 97,4 1,5 1,1 3 98,1 1,3 0,6 4 99,0 1,0 0 5 98,3 0,7 1,0 25 6 97,2 1,9 0,9 7 97,0 1,7 1,3 8 96,4 2,1 1,5 9 98,2 1,0 0,8 10 97,6 0,9 1,5 30 Til sammenligningsformål gennemføres koncentreringsfremgangsmåden med anvendelse af en permeabel membran gentagne gange under de samme betingelser med en opløsning af 50 kg krystallinsk DCPC-natriumsalt i 8000 liter rent vand, og der opnås

DK.162287 B

6 følgende resultater:

Tabel

Koncen- DCPC i kon- DCPC i per- DCPC søn- trering centratet, % meatet, % derdelt, % 5 nr.

1 82,9 2,4 14,7 2 69,7 3,1 27,2 3 88,3 3,6 8,1 4 83,8 2,9 13,3 10 5 86,7 3,3 10,0 6 93,1 2,5 4,4

Eksempel 2.

1000 ml dyrkningsmedium indeholdende 3,0%saccharose, 1,5% kødekstrakt, 0,5% majsstøbevand og 0,15% CaCO^ hældes i to 15 lige store portioner i to 2-liters Sakaguchi-flasker og steriliseres. Dyrkningsmediet inoculeres med Cephalosporium acremonium K-121 (en skriftlig ansøgning om deponering og opretholdelse af mikroorganismen i Fermentation Research Institute har kvitteringsnummer 2285), og dyrkningen gen-20 nemføres på et frem- og tilbagegående rysteapparatur ved 28°C i 3 dage. Separat sættes 100 liter dyrkningsmedium indeholdende 6% saccharose, 5% glucose, 3% jordnøddekage, 3% sojamel, 1,0% DL-methionin og 0,15% CaCO^ til en 200 liter fermenteringsbeholder af rustfrit stål, og mediet 25 steriliseres og afkøles på konventionel måde. Dyrkningsmediet inokuleres under sterile betingelser med den ovenfor fremstillede kultur, og dyrkningen gennemføres med tvungen beluftning ved 28°C. Efter dyrkning i 190 timer filtreres dyrkningsvæsken til fjernelse af faste stoffer. Blandingen 30 af det'fremkomne filtrat og vaskevæskerne (192 liter) analyseres, og der fås et CPC-indhold på 4900 ug/ml. Blandin-

(B

gen (192 liter) ledes først gennem en søjle med Amberlite IRA 402 (acetattype) til adsorbering af CPC. Det adsorbere-de CPC elueres med en ammoniumacetatpuffer (pH-værdi 5,0, 35 0,2 M), hvorved der fås en CPC-fraktion. Denne eluatfrak-

DK 162287 B

7 tion ledes gennem en søjle af aktivt kul (50 liter) til ad-sorbering af CPC.

Efter fuldstændig vaskning af søjlen med vand foretages elue-ring med 10%'s vandig ethanol indeholdende 0,01 N NaOH, hvor-5 ved der fås 198 liter CPC-fraktion indeholdende 432 g CPC.

Den vandige 10%'s ethanolopløsning (198 liter) indeholdende 432 g CPC .-indstilles på pH-værdien 7,0, hvorefter opløsningen ledes til et koncentreringsapparatur, hvori der anvendes en permeabel membran (PA 300-membran fremstillet af Universal 10 Oil Products Co., spiralopviklet type med et membranoverfla-deareal på ca. 0,3 m ) med en cirkulationshastighed på 450 liter pr. time og under et tryk på 40 kg/cm G, og koncentreringsoperationen gennemføres i ca. 20 timer ved 30°C, hvorved der fås 5,8 liter koncentrat og 192 liter permeat. Bestemmel-15 se af CPC-indholdet giver 98,4% i koncentratet, 0,9% i permeate t og 0,7% svind (antages at være sønderdelt).

Eksempel 3.

1000 ml podedyrkningsmedium indeholdende 3,0% saccharose, 1,5% kødekstrakt, 0,5% majsstøbevand og 0,15% CaC03 hældes 20 i to 2-liters Sakaguchi-kolber og steriliseres. Hvert af disse dyrkningsmedier inokuleres med Cephalosporium acremo-nium C-132 (ATCC-20371) og dyrkes på et rystebord med frem-og tilbagegående bevægelse ved 28°C i 3 dage. Til en 200 liter fermenteringsbeholder af rustfrit stål sættes 100 liter 25 dyrkningsmedium indeholdende 3,0% saccharose, 3,2% rå sojamel, 0,5% DL-methionin og 0,16% CaCO^. Dyrkningsmediet er steriliseret og afkølet på konventionel måde inden tilsætningen til beholderen. Dyrkningsmediet inokuleres med den ovenfor beskrevne podekultur under sterile betingelser, og der 30 foretages dyrkning under tvungen beluftning ved 28°C. Efter 132 timers fermentering filtreres dyrkningsvæsken, og blandingen af det fremkomne filtrat og vaskevæskerne (168 liter i alt) analyseres, hvorved der bestemmes et DCPC-indhold på 850 yg/ml.

DK 162287 B

8

Blandingen (84 liter) ledes gennem en søjle af Amberlite IRA-900 (acetattypen) til adsorption af DCPC. Det adsorbere-de DCPC elueres med en ammomiumacetatpuffer (pH-værdi 5/0, 0,2 M) og DCPC-fraktionerne hældes sammen. De samlede DCPC-5 fraktioner ledes gennem en søjle med aktivt kul (15 liter) til adsorption af DCPC. Derefter vaskes søjlen fuldstændigt med vand, og elueringen gennemføres med 15%'s vandig methanol, hvorved der faff en DCPC-fraktion på 30 liter med et indhold af DCPC på 2620 ug/ml.

10 Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde gentages flere gange, indtil man ender med 200 liter eluatopløsning (indeholdende 500 g DCPC) indeholdende 15% methanol, og opløsningen koncentreres under anvendelse af et koncentreringsapparatur, idet der anvendes samme membran og samme betingelser som i eksempel 2.

15 Koncentreringen gennemføres i ca. 20 timer ved 25°C, hvorved der fås 7 liter koncentrat og 193 liter permeat. Bestemmelse af DCPC-indholdet viser, at indholdet af DCPC-koncentratet er 97,9%, DCPC-indholdet i permeatet er 1,3%, hvorved tabet af DCPC bliver 0,8%.

20 Eksempel 4.

500 g krystallinsk DCPC-natriumsalt opløses i 200 liter vandig opløsning indeholdende henholdsvis 2% ethanol, 2% propanol og 2% butanol, hvorefter der foretages koncentrering under anvendelse af permeable membraner og under anvendelse af sam- 25 me apparatur og samme betingelser som. i eksempel 2. Der opnås følgende resultater.

DCPC i DCPC i DCPC

koncentrat permeat sønderdelt 2%'s vandig ethanol 97,1% 2% 0,9% 30 2%'s vandig propanol 92,2% 1,3% 1,5% 2%'s vandig butanol 97,1% 1,9% 1,0%

DK 162287 B

9

Sammenligningseksempel 1.

En 15%'s (rumfang/rumfang) vandig methanolopløsning indeholdende 0,7% DCPC koncentreres i et koncentreringsapparatur under anvendelse af en permeabel membran (celluloseacetat-5 membran fra Daicel Co., flad membran med en diameter på ca.

15 cm) under et tryk på 30 kg/cm2G ved 25°C, hvorved perme-eringshastigheden falder brat efter ca. 30 timers forløb, hvorved det bliver umuligt at holde apparaturet i drift.

Sammenligningseksempel 2.

10 200 liter 15%'s (rumfang/rumfang) vandig methanolopløsning indeholdende 0,6% DCPC sættes til et koncentreringsapparatur, hvori der anvendes en permeabel membran (polyamidbaserede hule fibre, type B-9, fra E.I. Du'Pont de Nemours Co., elementdiameter 10 cm, elementlængde 90 cm) ved 25°C og en cir-15 kulationsstrømningshastighed på 250 liter pr. time under et tryk på 28 kg/m G, hvorved der fås 19 liter koncentrat og 181 liter permeat efter 65 minutters forløb. Bestemmelse af DCPC-indholdet i disse væsker viser et DCPC-indhold i koncentratet på 87% og i permeatet på 11,2%. Ved gentagelse af pro-20 cessen tre gange efter hinanden er de hule fibre revet itu, og de kan ikke anvendes.

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til koncentrering af en β-lactamanti-biotikumopløsning, kendetegnet ved, at en fortyn-f det vandig opløsning af et β-lactamantibiotikum indeholdende 5 2-20% (rumfang/rumfang) lavere alkohol koncentreres ved hjælp af en permeabel membran fremstillet af poly(ether/amid) eller polybenzimidazolon.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den lavere alkohol er valigt blandt methanol, ethanol, 10 propanol og butanol.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den lavere alkohol er methanol.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at den fortyndede vandige opløsning af β-lactamantibio- 15 tikumet indeholder 0,01-5% (vægt/rumfang) af β-lactamåntibio-tikumet.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at β-lactamantibiotikumet er valgt blandt cephalosporin C, deacetylcephalosporin C, deacetoxycephalosporin C og de i 20 7-stillingen deacylerede forbindelser.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den permeable membran er fremstillet af poly(ether/ amid).

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at den permeable membran er fremstillet ved at anbringe et tyndt lag vandig opløsning af et epichlorhydrin-ethylendi-aminkondensat på en polysulfonbæremembran med finporet overflade og derefter at kontakte poly(ether/amin)-laget ved en i vand ikke-blandbar opløsning af isophthalyldichlorid.