DK157035B - Biologisk ren mikroorganismestamme samt fremgangsmaade til fremstilling af et dyrkningsprodukt heraf til anvendelse som et hudpraeparat - Google Patents

Description

DK 157035 B

Den fore!iggende opfindelse angâr en hidtil ukendt, biologîsk ren mikroorganismestamme, som er ejendommelig ved, at det er stammen Trichosporon kashiwayama, FERM-P nr. 4821.

5 Opfindelsen angâr yderligere en fremgangsmâde til fremstilling af et dyrkningsprodukt til anvendelse som hudpræparat, hvilken fremgangsmâde er ejendommelig ved, at Trichosporon kashiwayama, FERM-P nr.

4821 dyrkes pâ eller i et vækstmedium ved en pH-værdi pà fra 4,0 til 6,0 og en temperatur pâ fra 20 til 30°C, at cellerne eventuelt 10 fjernes fra dyrkningsvæsken til frembringelse af en cellefri, steril væske, et sterilt filtrat eller en steril supernatant, og at den cellefrie, stérile væske, det stérile filtrat eller den stérile supernatant eventuelt koncentreres eller t0rres.

15 Den virksomme substans, som udpver den medicinske virkning, er ukendt. Hvis en steril supernatant af en dyrkningsvæske af stammen eller et koncentrat eller et tprt produkt imidlertid pâfpres pâ huden som sâdan eller efter, at den er blevet blandet med en pas-sende bærer og tildannet til et præparat, der er egnet til pâf0ring 20 pâ menneskehud, f.eks. en salve, kan fplgende medicinske virkninger opnâs.

(1) Fermentationsvæsken er svagt sur (har en pH-værdi pâ fra 4,5 til 5,0) og er ikke-toksisk for huden, og den fremmer fedtmembranens 25 hudbeskyttende virkning, navnlig den til fedtmembranen knyttede bakteriekontrollerende virkning.

(2) Overdreven afskalning af keratin-stykker fra hornlaget forhind-res og samtidig opretholdes et hensigtsmæssigt vandindhold i hornlaget, og derfor kan hudens egenskaber, sâsom fugtighed og elastici-tet, bevares godt.

(3) Epidermalcellernes lipidmetabolisme styres til fremme af hen-sigtsmæssig keratindannelse og jævn formering og differentiering af epidermale celler.

(4) Navnlig for fedtet hud styres overdreven sekretion af hudfedt, og en fortykkelse af fedtmembranen forhindres. F0lgelig fremmes diffusion af hudfedt fra hàrfolliklen til hudoverfladen, og der

DK 157035 B

2 opnâs en præventiv virkning mod fedtdermatitis, sâsom acné.

(5) Eftersom det retikulære stratums kollagenfibre forstærkes eller opsvulmes til opretholdelse af et passende vandindhold i de 0vre 5 lag, opretholdes god og normal hârdhed og elasticitet i huden.

(6) Eftersom blodcirkulationen forbedres, fremmes hudens métabolisme, og transporten af hudaffaldsstoffer til venen samt udskil-lelse af affaldsstoffer fremmes. Samtidig fremskyndes udskillelsen 10 af melaninfarve.

(7) Over for hudsygdomme, der er fremkaldt ved oxidation under aktiniske strâler, virker fermentationsvæsken eller den stérile supernatant deraf som antioxidant i fedtmembranen og fremmer af- 15 farvningen af unormalt aflejret melaninfarve i hudpletter eller lignende. Nâr fermentationsvæsken eller den stérile supernatant deraf gives i kombination med infrarpd bestràlingsbehandling eller oral indgivelse af vitamin E kan der opnâs en præventiv eller helbredende synergistisk virkning pâ kontaktdermatitis, hudpletter 20 og unormal farveaflejring, som skyldes heliosensitivitet.

Mikroorganismen Trichosporon kashiwayama, FERM-P nr. 4821, som er en hidtil ukendt stamme, blev isoleret fra en mælkesyreholdig sundheds-drik. Denne drik er et fermentationsprodukt af en blanding, der 25 omfatter mælkesyrebakterier og gærarter. Efter omhyggelige undersp-gelser af de bakterier og gærorganismer, der forekom i fermentati-onsproduktet, blev der opdaget en hidtil ukendt substans, som blev frembragt af kashiwayama-stammen, og som havde en pâfaldende gunstig virkning pâ hudproblemer.

30

Trichosporon kashiwayama-stammen, FERM-P nr. 4821 blev isoleret pâ fplgende mâde: i) Stammen blev renset ved mere end tre ganges screening fra 35 mælkesyredri kken,

ii) stammen blev dyrket i et vallemedium med en hpj koncen-tration af mælkesyre (mælkesyre: 2,5-3% vægt/volumen; pH

3,0-3,3) ved 25°C i 48 timer i en omrprt fermentations- 3

DK 157035 B

beholder, og iii) stammen blev gentagne gange udvalgt pâ grundlag af mælkesyredehydrogenaseaktivitet og evnen til oxidativ 5 spaltning af mælkesyre.

Trichosporon kashiwayama, FERM-P nr. 4821 stammen har fplgende egenskaber: 10 (1) Morfolooiske eaenskaber: (1) Form og stprrelse (maltekstrakt-MY flydende medium):

Efter 3 dages dyrkning ved 25°C observeres celler med en rektangulær 15 eller oval form og med en stprrelse pâ fra (3 til 4 m) x (3 til 20 m), og nâr dyrkningen udfpres i 5 dage eller længere bliver formen af cellerne uregelmæssig, og til slut bliver cellerne mycelie-formede.

20 2) Dannelse af pseudomycelie (objektglaskultur pâ kartoffel- ekstraktagarkulturmedi um):

Cellerne er pseudohyfe- eller pseudomycelieformede, og de har karakteristiske zig-zag arthrosporer, men ingen konidier.

25 3) Ascosporer: Cellerne har ingen ascosporer.

4) Ballistosporer: Cellerne har ingen ballistosporer.

30 (2) Karakteristiske eaenskaber pâ dvrkninqsmedium: 1) Koloni pâ agarstregkulturmedium (maltekstrakt-MY agarkul-turmedium): mat, hvid, hâret og ujævn overflade, meget blpd, ikke ophævet men fl ad, ciliatperiferi.

35 2) Film pâ flydende kulturmedium (maltekstrakt-MY flydende kultur-medium): Der dannes en hvid, hâret, flokkulent og sej film.

DK 157035 B

4 (3) Fvsioloqiske eqenskaber: I) Saccharidfermentation: 5

Fermenterer ikke glucose, galactose, sucrose, lactose, trehalose, raffinose og i nuli n.

2} Saccharidudnyttelse (assimilation): 10 D-glucose +, D-galactose +, maltose -, raffinose -, sucrose -, lactose -, natrium!actat +, D-xylose +, erythritol -, D-mannitol +, L-sorbose +, inositol -, trehalose -, D-arabinose -, L-arabinose -, natriumsuccinat +, natriumcitrat +, natriumacetat +, inulin -, 15 opl0selig stivelse -, éthanol +, glycerol +, cellobiose -.

Note: + : udnyttes - : udnyttes ikke 20 3) Udnyttelse af nitrater: Udnyttes ikke 4) Udnyttelse af ni tri ter: Udnyttes ikke 5) Udnyttelse af ethylaminhydrochlorid: Udnyttes ikke.

6) Sdnderdeling af glucosid (arbutin): Sdnderdeles.

25 7) Dannelse af stivelsesanaloger: Dannes ikke.

8) Dannelse af pigment: Dannes ikke.

9) Dannelse af estere: Dannes.

10) Lakmusmælkereaktion: Koagulerede ikke.

II) Vitaminkrav: Kræves ikke.

30 12) Saltbestandighed: Kritisk koncentration pâ fra 6 til 8% (w/v) 13) Optimal temperatur: 25°C.

14) Optimal pH-værdi: 5,0.

15) Spnderdeling af urinstof: Spnderdeles ikke.

35 16) Vækst pâ 50% (w/w) glucoseagar eller 60% (w/w) gærekstraktagar- medium: Ingen vækst.

17) Vækst ved 37°C: Ingen vækst.

18) Dannelse af syre fra glucose: Dannes ikke.

DK 157035 B

5 19) Resistens mod cycloheximid: Résistent.

20) Spnderdeling af olie og fedt: Spnderdeles.

(4) André mvkologiske egenskaber: 5 1) Frembringelse af duft:

Den foreliggende stamme er ejendommelig ved frembringelse af en duftkomponent. Ud fra gaskromatografiresultater blev det konsta-10 teret, at duftkomponenten hovedsagelig er sammensat af éthanol, ethylacetat, isopropylal kohol, isopropylacetat, isobutylal kohol, isobutylacetat, isoamylalkohol og isoamylacetat. Duften er en sâkaldt æbleduft. Den foreliggende stamme er i forhold til kendte gærarter med duftfrembringende egenskaber ejendommelig ved at 15 frembringe ikke alene hpjere alkoholer men ogsâ estere deraf i store omfang.

Optimale betingelser for frembringelsen af disse neutrale duft-bestanddele er som fplger: 20 a) En begyndelses-pH-værdi pâ fra 4,0 til 5,0 og opretholdelse af en lav pH-værdi under fermentationen.

b) Et totalt nitrogenindhold pâ fra 400 til 500 mg pr. liter kul- 25 turmedium.

Som den uorganiske nitrogenkilde anvendes fortrinsvis ammoniumsul-fat, ammoniumnitrat og ammoniumchlorid, og som den organiske nitrogenkilde anvendes fortrinsvis gærekstrakt, casaminosyre og pepton.

30 Ydermere opnâs der gode resultater, nâr der tilsættes aminosyrer, sâsom leucin, isoleucin, val in og phenylalanin.

c) Udvælgelse af carbonkiîde: Glucose, galactose, éthanol og glycerol er egnede. En foretrukken saccharidkoncentration er 35 5%.

d) Celleinokuleringsforhold pâ fra 1 til 2%.

e) Dyrkningstemperatur pâ fra 25 til 30°C. Stationær kultur

DK 157035 B

6 foretrækkes.

2) Dannelse af organiske syrer: Myresyre, propionsyre, n-butansy-re, ravsyre og citronsyre dannes ud fra glucose.

5

Kort forklarino af teaninaer

De tilhprende tegninger (fotografier) illustrerer væksten af stammen Trichosporon kashiwayama, FERM-P nr. 4821, som anvendes ved den 10 foreliggende opfindelse, pâ et kartoffelekstraktagarvækstmedium, nâr dyrkning pâ objektglas udfprtes ved 25°C i 3 dage. Figur 1 er et mikroskopfotografi (75 ganges forstprrelse), der viser adhæsions-tilstanden af arthrosporer fra hyfeceller under aerobe forhold. Af figur 1 fremgâr det, at arthrosporer ikke er hæftet til conidiopho-15 rer, men strækker sig lateralt i kæder fra hyfecellernes skillevægs-dele. Figur 2 er et forstprret mikroskopfotografi (300 ganges forstdrrelse), der viser arthrosporer. Figur 3 er et mikroskopfotografi (300 ganges forstprrelse), der viser cellerne og cellernes knopskydning under anaerobe forhold.

20

Stammen antages pâ grundlag af ovennævnte egenskaber at tilhdre gærslægten Trichosporon. Skulle stammen imidlertid betragtes som en imperfekt svamp, vil den være at henfdre til en af slægterne Geotri-cum eller Endomycopeis.

25

Til fremstilling af et hudpræparat under anvendelse af stammen Trichosporon kashiwayama, FERM-P nr. 4821 ifplge den foreliggende opfindelse kan der anvendes sædvanlige gærdyrkningsmedier. If0lge en foretrukken udf0relsesform udf0res rystekulturer eller stationære 30 kulturer ved en temperatur pâ fra 20 til 30°C i ca. 24 timer pâ et fast eller flydende medium omfattende 0,3% (w/v) glucose, 0,5% (w/v) skummetmælk og 0,05% (w/v) gærekstrakt og med en pH-værdi pâ fra 4,0 til 6,0, og det samme vækstmedîum som nævnt ovenfor inokuleres med det fremkomne kulturprodukt som podemateriale, og dyrkningen af den 35 stationære kultur eller rystekulturen udfpres ved 20 til 30°C i 3 til 7 dage.

Vækstmediet udsættes for filtrering og fjernelse af celler ifdlge sædvanlige metoder, f.eks. under anvendelse af et membranfilter, og

DK 157035 B

7 den cellefrie supernatant koncentreres, f.eks. under reduceret tryk, fortrinsvis med en koncentreringsrate pâ fra 4 til 25. Det fremkomne koncentrat sterilisérés ved hjælp af sædvanlige metoder og opbevares ved stuetemperatur eller i et kpleskab.

5

Et eksempel pâ den cellefrie supernatant, der er frerastillet ifplge den foreliggende opfindelse, har de i tabel 1 viste egenskaber.

TABEL 1 10

Et cellefrit, renset filtrat af supernatanten af dyrkningsproduktet af den foreliggende stamme omfatter smâ mængder aminosyrer, saccha-rider og lipider. Nâr filtratet analyseres kvantitativt konstateres det, at det totale nitrogenindhold er pâ fra 0,005 til 0,015%, og 15 det totale phosphorindhold er pâ fra 0,004 til 0,014%.

1. Natur oa tilstand:

Filtratet er en farvelps til svag gui1ig transparent væske og 20 har en svag duft.

2. Bekræftende prover: (1) 20 ml Af filtratet inddampes pâ et vandbad, indtil volumi- 25 net er reduceret til ca. 5 ml. Derefter sættes 1 ml ninhydrin-testoplpsning til koncentratet. Nâr blandingen opvarmes i 30 minutter, fâr væsken en violet farve.

(2) 5 ml Salpetersyre sættes til det koncentrat, der er 30 fremkommet ved udfprelse af fordampning pâ samme mâde som beskrevet under (1) ovenfor, og blandingen koges i 20 minutter. Efter at blandingen er afkplet, neutraliseres den med en 10% natriumhydroxidoplpsning. Derefter sættes 2 ml ammoniummolybdat-testopldsning til blandingen. Hvis 35 blandingen opvarmes, bliver væsken gullig. Hvis der sættes en 10% natriumhydroxidoplpsning til væsken, bliver den farvel0s.

(3) 10 mg Indol og 2 ml saltsyre sættes til 5 ml af fil-

DK 157035 B

8 tratet, og blandingen rystes tilstrækkeligt. Nàr blandin-gen derefter opvarmes i 10 minutter, bliver væsken r0d.

3. Fvsiske eaenskaber: 5 (1) Vægtfylde (d||): 1,000 til 1,015 (2) Brydningsindex (n^5):1,330 til 1,340 10 (3) pH (25°C): 4,5 - 5,5 4. FordaïïiDninasrest: 0.5 til 2.0%

Analyseværdier for et eksempel pâ koncentratet (koncentrations-15 forhold pâ 2) af den cellefrie supernatant, der er fremstillet ifdlge den foreliggende opfindelse er anfprt i tabel 2.

TABEL 2 20 Vandindhold (ved tdrringsmetode ved atmosfærisk tryk): 98,7%

Protein (koefficient pâ 6,25): Spor.

Lipidindhold (ved Soxhlet-ekstraktionsmetode): 0,2%

Fiberindhold: 0%

Askeindhold: 0,1% 25 Sukkerindhold: 1,0%

Totalt tdrstofindhold 1,3%

Nitrogenindhold i aminoform: 10 mg%

Titreringsaciditet: 0,6 Nitrogenindhold i flygtig baseform: 1 mg% 30 Arsen {som ASgO^): ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,1 ppm}.

Tungmetal (som Pb): ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 1 ppm).

Total kviksplv: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,01 ppm).

Cadmium: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,01 ppm).

Calciumindhold: 14,7 mg% 35 Phosphorindhold: 9,8 mg%

Myresyre: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,1%).

Eddikesyre: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,01%).

Butyrsyre: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,01%).

Mælkesyreindhold: 0,06%

DK 157035 B

9

Citronsyreindhold: 0,02%

Levende cellétal: Mindre end 30 celler pr. ml.

E. coli : (-) 5 Staphvlococcus aureus: {-)

Antal svampe: (-)/ml Antal gær: (-)/ml

Propionsyre: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,02 g/kg)

Sorbinsyre: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,005 g/kg) 10 Benzoesyre: 0,42 g/kg.

p-Hydroxybenzoesyreester: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,005 g/kg) Vitamin Bj: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,01 mg %)

Vitamin Bg: 0,02 mg%

Total vitamin C: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 2 mg%) 15 Vitamin Bg: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 5mg%)

Vitamin ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,05 mg %)

Pantothensyre: 0,09 mg%

Cholin: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,03%)

Folsyre: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 1 mg %) 20 Niacin: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,03 mg%)

Total caroten: ikke pâvist (pâvisningsgrænse: 0,02 mg%) pH-værdi: 4,9 •kirk

Aminosyresammensætning

Arginin: under 0,01 25 Lysin: under 0,01

Histidin: under 0,01

Phenylalanin: under 0,01

Tyrosin: under 0,01

Leucin: under 0,01 30 Isoleucin: under 0,01

Methionin: under 0,01

Val in: under 0,01 Alanin: under 0,01

Glycin: under 0,01 35 Prolin: under 0,01

Glutaminsyre: 0,01

Serin: under 0,01 Threonin: under 0,01

Asparaginsyre: under 0,01

DK 157035 B

10

Tryptophan: under 0,01 Cystin: under 0,01

Note 5 * : % baseret pâ vand.

** : antal ml IN alkali titreret til neutral isering af 100 g prpve.

*** : g aminosyre i 100 g prdve (cystin: permyresyreoxida- tionsmetode, tryptophan: mikroorganismeprdvning).

10

Den cellefrie stérile supernatant kan naturligvis anvendes som hudpræparat uden koncentrering. Af hensyn til opbevaring eller lig-nende foretrækkes det imidlertid, at den cellefrie, stérile supernatant koncentreres. Ydermere kan et stærkt koncentrat med et 15 koncentreringsforhold pâ mere end 25 eller et tprt produkt anvendes.

Et sâdant koncentrat, stærkt koncentrat eller tprt produkt kan anvendes som hudpræparat som sâdan. Ydermere kan et hudpræparat fremstilles ved blanding af et sâdant koncentrat, stærkt koncentrat eller tprt produkt med en creme, salvebasis eller anden bærer.

20 Nâr et koncentrat, der er fremkommet ved koncentrering af den ovenfor nævnte cellefrie, stérile supernatant med et koncentreringsforhold pâ 4, analyseres, ses de forskellige aminosyrer og vitaminer at være til stede.

25

Toksicitetsprpver pâ kyllingeembryo har vist, at det ovenfor nævnte cellefrie, stérile koncentrat (koncentreringsforhold pâ 4) ikke er toksisk. Ydermere viste pletprpver pâ mennesker og kontinuerlig irritation af menneskehud, at koncentratet overhovedet ikke var 30 toksisk for menneskehud. Desuden viste pjenirritationsprpver pâ kaniner, at koncentratet overhovedet ikke var irritativ. Yderligere antibiotiske prpver viste, at koncentratet ikke indeholder antibio-tiske substanser.

35 Det er blevet bekræftet, at hudpræparatet fremstillet ifplge den foreliggende opfindelse har helbredende virkninger pâ hudpletter, revnet hud, kontaktdermatitis og brændt hud. Disse helbredende virkninger vil nu blive beskrevet under henvisning til de efter-f0lgende forspg.

DK 157035 B

11

Pletprover pà mennesker.

Til afpr0vning udvalgtes 50 kvinder i alderen 23 til 44 àr (som havde en eller anden hudsygdom og som havde kontakt med et dermato-5 logisk hospital). Piastre med en storrelse pâ 4 cm gange 4 cm, og som indeholdt ca. 0,2 g af koncentratet fremstillet ifolge den foreliggende opfindelse (koncentreringsforhold pâ 2), pâfprtes indersiden af den venstre overarm og det paravertebrale omrâde af ryggen, og efter 48 timer fjernedes plastrene, og det pâgældende 10 omrâde undersogtes. Pà aile patienterne var indersiden af venstre overarm og det paravertebrale omrâde ikke pâvirlcet pâ ugunstig mâde.

Kontinuerlia irritation af menneskehud.

15 Steriliserede gazestykker, der har et areal pâ 10 cm , imprægneredes med ca. 5 ml af koncentratet fremstillet ifolge den foreliggende opfindelse {koncentreringsforhold pâ 2), og de blev i 15 minutter pâfprt hojre kindomrâde hos 45 kvinder i alderen fra 23 til 45 âr (35 kvinder led af en eller anden hudsygdom og modtog medicinsk 20 behandling pâ et dermatologisk hospital og de resterende 10 kvinder var ansatte pâ dette hospital). Denne behandling blev udfprt i 40 sammenhængende dage. Der konstateredes ingen reaktion hos disse kvinder, og problemer, sâsom hudrpdme, fremkaldtes slet ikke.

25 0,ienirritationsor0ve hos kaniner

Som forsdgsdyr anvendtes 3 hvide kaniner. Det blev pâ forhând konstateret, at deres 0jne ikke havde tegn pâ unormalheder. î hpjre 0je pâ hver kanin dryppedes 0,1 ml af koncentratet fremstillet 30 if0lge den foreliggende opfindelse (koncentreringsforhold pâ 2), gg 0,1 ml af en blindvæske dryppedes i det venstre 0je. Umiddelbart efter pâdrypningen og 3, β, 24, 48 og 72 timer efter pâfdrïmgen unders0gtes begge 0jne under anvendelse af en spaltelampe. Unormale tegn, sâsom kongestion (forpget blodtilf0rsel) til hornhinden, iris 35 eller 0jets bindehinde (conjunktiva) observeredes slet ikke.

Behandling af hudpletter

Der udvalgtes 521 kvinder med hudpletter i ansigtet, og som behand-

DK 157035 B

12 ledes pâ dermatologiske hospitaler for afhjælpning af hudpletterne, eksklusive patienter med 1eversygdomme eller kvindesygdomme og gravide kvinder. Efter afvaskning af ansigtet âbnedes hudporerne med ozon og damp, og gaze imprægneret med koncentratet (koncentrerings-5 forhold pâ 2) af den cellefrie supernatant fremstillet ifplge den foreliggende opfindelse pâfprtes pâ de pletvis forekommende omrâder.

Den pâfprte gaze dækkedes med Saran-Wrap tape, og der udfprtes infrarpd bestrâling i 15 ti1 20 minutter for at fâ koncentratet til at trænge ind i huden. Denne behandling udfdrtes en gang om ugen og 10 blev fortsat i 3 mâneder. Det konstateredes, at tilstanden blev meget forbedret hos 363 kvinder (58,4%), tilstanden var relativt forbedret hos 122 kvinder (19,8%), ingen forbedring blev observeret hos 133 kvinder (21,4%), tilstanden blev forværret hos 1 kvinde (0,01%), og der blev observeret kontaktdermatitis hos de resterende 15 2 kvinder (0,03%) (det formodes, at kontaktdermatitis fremkaldtes af grunde, der er irrelevante for denne behandling). Antallet af patienter, hos hvilke tilstanden blev meget eller relativt forbedret, var sa hpj som 80%. Hos 60% af 365 kvinder, hos hvilke tilstanden var meget forbedret, forsvandt hudpletterne ydermere fuldstæn-20 dig.

Behandling af revnet hud oa fine rvnker

Kvinder over 25 til 30 âr er almindeligvis nervdse for revner i 25 huden og fine rynker, og hos kvinder i alderen 35 til 40 âr er denne tendens tydelig, skpnt kvinder pâ over 40 âr ligeledes er nervpse for revner i huden og fine rynker. Til denne prpve udvalgtes 962 kvinder, som havde kontakt med dermatologiske hospitaler (150 kvinder i alderen 25 til 30 âr, 218 kvinder i alderen 30 til 35, 248 30 kvinder i alderen 35 til 40, 172 kvinder i alderen 40 til 45 og 174 kvinder over 45 âr. Efter vask af ansigtshuden, âbnedes hudhuller ved hjælp af ozon og damp, gaze imprægneret med koncentratet (kon-centreringsforhold pâ 2) af den cellefrie supernatant fremstillet ifplge den foreliggende opfindelse pâfprtes tæt pâ ansigtshuden, og 35 gazen dækkedes med Saran-Wrap tape. Infrarpd bestrâlingsbehandling blev udfprt i 15 til 20 minutter for at fâ koncentratet til at trænge ind i huden. Det blev konstateret, at efter 1 behandling, var tilstanden med revnet hud meget forbedret hos 698 kvinder (73%), tilstanden med revnet hud var relativt forbedret hos 156 kvinder

DK 157035 B

13 (16%), tilstanden var ikke ændret hos 72 kvinder (7%), og tilstanden var ikke forværret hos nogen af de undersdgte kvinder, idet det resterende antal kvinder er 36 (4%). Da revnet hud gâr forud for fine rynker antages det, at koncentratet fremstillet if0lge den 5 foreliggende opfindelse, som er effektiv til afhjælpning af revnet hud, har en forebyggende virkning over for dannelsen af fine rynker.

Undersaaelse af helbredende virkning pâ kontaktdermatitis 10 Der udvalgtes en 21 ârig kvinde, som havde lidt af udslæt og klpe pâ begge pjenlâg fra dagen efter udskiftning af en pjenskygge fra selskab A med en 0jenskygge fra et selskab B, og hos hvem diagnosen kontaktdermatitis var stillet. Gaze imprægneret med koncentratet (koncentreringsforhold pâ 2) af den cellefrie supernatant fremstil-15 let ifplge den foreliggende opfindelse pâfdrtes de pâvirkede omrâder af en dermatolog. Der blev ikke anvendt steroid-medicin, antiinflam-matorisk middel eller antihistaminmiddel. Ca. 20 ml af koncentratet blev givet til patienten, og koncentratet blev pâlagt eller tilfort i 30 minutter 2 gange om dagen, nemlig om morgenen og om aftenen. 48 20 Timer efter start af behandlingen var kloen ophort, og 96 timer efter pâbegyndelsen af behandlingen forsvandt udslættet praktisk taget. Efter 1 uge observeredes ingen udslæt.

Behandling af brandsàr og skoldningssàr 25

En 47 ârig kvinde, der var blevet skoldet af varmt vand pâ den ydre de! af venstre underarm (forbrændingsgrad 2) med udslæt og opsvulm-ning af en "plam"-lignende stdrrelse og med smâ blærer, bes0gte en dermatolog ca. 1 time efter at hun var blevet skoldet. Det angrebne 30 omrâde blev straks afkolet med rindende vand, og gaze imprægneret med koncentratet (koncentreringsforhold pâ 2) af den cellefrie, stérile supernatant fremstillet if0lge den foreliggende opfindelse pâf0rtes det angrebne omrâde, og der blev lagt oliepapir ovenpâ. Derefter blev det angrebne omrâde forbundet. Efter 24 timer blev det 35 konstateret, at de smâ blærer var fuldstændig forsvundet, skdnt der stadig var udslæt og opsvulmning tilbage, og patienten havde ingen smerter.

En 30-ârig mand, som var blevet skoldet af varmt vand pâ bagsiden af

DK 157035 B

14 h0jre ben (forbrændingsgrad 2) med udslæt og opsvulmning af hpnseæg-stprrelse, behandledes med koncentratet (koncentreringsforhold 2) af den cellefrie, stérile supernatant fremstillet if0lge den forelig-gende opfindelse pâ samme mâde som ovenfor beskrevet. Efter 24 timer 5 var opsvulmningen forsvundet, skpnt der stadig var udslæt tilbage, og patienten havde ingen smerter.

Det blev sâledes bekræftet, at koncentratet fremstillet ifplge den foreliggende opfindelse har en stor helbredende virkning pâ brandsâr 10 og skoldningssàr.

Opfindelse vil nu blive beskrevet yderligere under henvisning til de efterfdlgende eksempler.

15 EKSEMPEL 1

En gennemluftningsfermentationstank med omrdring, som havde en kapacitet pâ 1 kiloliter, pâfyldtes 800 liter af et vækstmedium med den ovenfor beskrevne sammensætning, og efter varmesterilisering og 20 naturlig afkpling inokuleredes dette vækstmedium med det podema-teriale, der blev dannet ved udfprelse af en primær dyrkning ved 28°C i 30 timer i 10 liter af det samme vækstmedium i en lille gennemluftningsfermentationstank med omrpring. Dyrkningen udfprtes derefter ved 28°C i ca. 70 timer under gennemluftning og omrpring.

25 Efter afslutning af fermentationen fortes dyrkningsvæsken gennem et filtreringsapparat model MP 293-16 forhandlet af Naigai Shokuhin Kogyo Kabushiki Kaisha (filterpapir GL-90 forhandlet af Toyo Roshi; 0,5 m) og gennem et filtreringsapparat model MP 293-4 forhandlet af det samme selskab (membranfilter TM-2 forhandlet af Toyo Roshi; 0,45 30 m) til fjernelse af faste parti kler og celler. Det opnâede filtrat koncentreredes ved omvendt osmose under anvendelse af et apparat til omvendt osmose model R0-T10 forhandlet af Bioengineering Co., sâledes at volumenet reduceredes til 200 liter. Det opnâede koncen-trat steriliseredes ved hjælp af en varmeveksler af pladetype 35 forhandlet af Iwai Kikai Kogyo Kabushiki Kaisha), pakkedes sterilt i glasbeholdere og opbevaredes i koleskab (5°C).

DK 157035 B

15 EKSEMPEL 2

Det i eksempel 1 opnâede stérile [concentrât frysetorredes, og det 5 opnâede pulver blandedes med en steril salvebasis ti1 frembringelse af en hudsalve.

EKSEMPEL 3 10 Der fremstilledes et kosmetisk præparat ved at inkorporere 1 g af det i eksempel 1 opnâede steriliserede koncentrat i en kosmetisk basis omfattende 1 g stearinsyre, 7 g bivoks, 4 g selvemulgerende glycerolmonostearat» 30 g flydende paraffin, 0,1 g vandholdig lanolin og 40 g renset vand, og ved at ælte blandingen if0lge 15 almindelige metoder. Sammensætningen udhsldtes og pakkedes i ampul-ler, og de pakkede ampuller blev markedsf0rt.

EKSEMPEL 4 20 Et middel til behandling af hud blev fremstillet ved at inkorporere passende mængder af pyridoxinhydrochlorid, q-oryzanol, allantoin, DL-a-tocopherol (vitamin E) og mynteolie i den i eksempel 3 frem-stillede sammensætning.

25 30 35

Claims (3)

1. Biologisk ren mikroorganismestamme, kendetegnet ved, 5 at det er stammen Trichosporon kashiwayama, FERM-P nr. 4821.

2. Fremgangsmâde til fremstilling af et dyrkningsprodukt til anvendelse som hudpræparat, kendetegnet ved, at Trichosporon kashiwayama, FERM-P nr. 4821 dyrkes pâ eller î et vækstmedium 10 ved en pH-værdi pâ fra 4,0 til 6,0 og en temperatur pâ fra 20 til 30°C, at cellerne eventuelt fjernes fra dyrkningsvæsken til frem-bringelse af en cellefri, steril væske, et sterilt filtrat eller en steril supernatant, og at den cellefrie, stérile væske, det stérile filtrat eller den stérile supernatant eventuelt koncentreres eller 15 tprres.

3. Fremgangsmâde ifplge krav 2, kendetegnet ved, at dyrkningsmediet omfatter glucose, skummetmælk og gærekstrakt, og at stammen dyrkes under aerobe betingelser. 20 25 30 35