CN113046394B - 一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺 - Google Patents

一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺 Download PDF

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Abstract

一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺，包括两个步骤，首先，配制种子和发酵培养基；其次，在培养过程中采取静置微氧培养的方式，最后通过过滤的方式得到覆膜酵母发酵滤液。其特点在于发酵中采用微氧发酵，相较于有氧发酵更能刺激覆膜酵母产生丰富的次级代谢产物；同时静置培养不仅简化发酵工艺与操作流程，更营造了微氧的发酵环境，利于覆膜酵母的发酵，此方法适用于一般生物实验室，操作简单，成本低廉，产量较大。

Description

一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺
技术领域
本发明属于发酵技术领域，尤其涉及一种覆膜酵母发酵物的制备工艺。
背景技术
皮肤对物理或化学刺激具有明显的敏感性，外源刺激（如紫外光照、化学物质等）引发炎症反应的同时，损害了皮肤屏障自我修复的能力，往往还诱发黑色素沉积，加速角质生成与皮肤老化。目前已有大量报道显示，某些益生菌不仅可以积极影响肠道菌群的组成，还可以在局部和全身水平调节免疫***，从而改善免疫防御机制或下调免疫功能。
覆膜酵母是一种生香酵母，覆膜酵母相较于酿酒酵母来说，具有更丰富的次级代谢。在发酵过程中，覆膜酵母不仅能够消耗培养基中的营养物质，产生小分子有机酸、维生素、低聚糖等，还向发酵滤液中分泌蛋白酶、将大分子蛋白质分解为小分子氨基酸和多肽等，这些小分子物质，除了一小部分会被酵母自身吸收利用外，大部分将留在发酵滤液中。覆膜酵母发酵产物是一种蕴含丰富维生素、氨基酸、矿物质及有机酸的淡黄色透明液体，不仅能促进丝聚蛋白的表达，还可以防止丝氨酸蛋白酪氨酸介导的丝聚蛋白的减少。除此之外，覆膜酵母发酵滤液还可以增加表皮角质形成细胞中的caspase-14在3D模型中的表达，而caspase-14的表达参与受损皮肤屏障的修复。因此，覆膜酵母的发酵滤液，这种天然的混合成分能明显地改善肌肤表皮层的代谢过程，抑制自由基的产生，保护细胞免受损伤，提升肌肤抗衰老的能力，使肌肤维持透亮、柔嫩及细滑。这些功效在大量的体外实验中得到了证实，并广泛应用于护肤产品中。
目前已有报道中，专利（CN 112353714A与CN109355216A)中均采用了有氧发酵的条件，操作步骤过于繁琐，约8-10步，设备要求比较高，需要进行发酵罐发酵，对于一般实验室实施有困难，且生产成本较高。覆膜酵母为兼性厌氧型菌，在有氧条件下，可以大量的繁殖，快速增长，更利于菌体的生长与积累，但是不利于次级代谢产物的的产生与积累；在无氧条件或者微氧条件下，覆膜酵母为了抵抗外界的不良环境，会产生更为丰富的次级代谢产物，来保护自身抵御外界环境的伤害。因此，亟需开发一种适合实验室条件培养，工艺简单，且能产生丰富代谢产物的工艺。
发明内容
本发明目的在于提供一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺，简化工艺流程，适合实验室小规模发酵培养，同时能产生丰富的次级代谢产物。为解决上述技术问题，本发明的的具体技术方案如下：
一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺，包括以下步骤：
步骤1：配制培养基
1）种子培养用YPD培养基
YPD培养基：将10 g酵母提取物，20 g的葡萄糖，20 g的蛋白胨，溶于1000 ml的去离子水中，115℃高压灭菌30 min，固体培养基添加2%的琼脂。
2）发酵表达用覆膜酵母发酵培养基
Figure DEST_PATH_IMAGE001
覆膜酵母发酵培养基分为第I部分与第II部分，分别进行配制及灭菌。第I部分与第II部分按1：1充分混合，即为所需培养基，混匀后pH为4-6。
步骤2：发酵表达
(1)菌种活化：
将覆膜酵母冻存菌接种于YPD培养基的无菌培养平皿中，在28℃条件下活化48-60h。
(2) 制备种子液：
从平板上挑取新鲜菌落，重悬至无菌水中，混匀后转接到100ml覆膜酵母发酵培养基中，摇床内28℃、200 rpm培养24 h。
(3)发酵培养：
将种子液接种在由0.05-5.0L的摇瓶盛装覆发酵培养基中，接种后的菌种浓度控制在OD600=0.2-1.0，装液量约为40%-70%，用瓶盖对瓶口密封，置于28℃培养箱，静置微氧发酵，连续培养共计60-96 h。
(4)制备发酵液：
发酵结束后，将上述培养液离心，14000 rpm常温离心5min，收集上清；用2张中速滤纸对上清液进行抽滤处理，之后将抽滤后的发酵滤液称重；按照质量百分比添加一定比例的防腐剂，并搅拌分散均匀；将加入防腐剂的上清液进行抽滤，依次经过0.45 μm及0.2μm滤膜，得到最终的可无菌保存的覆膜酵母发酵滤液。
进一步的，所述的防腐剂为0.5-1.5%PE9010和2-3%丁二醇。
进一步的，所述的接种后的菌种浓度控制在OD600=0.3-0.6。
进一步的，所述的静置微氧发酵方式为全程培养过程中静置发酵。
更进一步的，所述的静置微氧发酵方式为每隔24h或36h摇动一次，其余时间静置发酵。
本发明的具有以下优点：
（1）在发酵中采用微氧发酵，相较于有氧发酵更能刺激覆膜酵母产生丰富的次级代谢产物；
（2）将摇瓶密封，静置培养不仅简化发酵工艺与操作流程，更营造了微氧的发酵环境，利于覆膜酵母的发酵，此方法适用于一般生物实验室，操作简单，成本低廉，产量较大。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
本发明实施例中所采用的组分均来源于市售产品。
葡萄糖、脱脂奶粉购于生工生物工程（上海）股份有限公司，酵母提取物购于北京奥博星生物科技有限公司。葡萄糖为培养基的碳源，酵母提取物与脱脂奶粉为培养基的氮源，混合氮源更益于覆膜酵母的生长。
实施例1
一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺，包括如下步骤：
(1)将覆膜酵母冻存菌接种于YPD培养基的无菌培养平皿中，在28℃条件下活化48h，添加50%甘油至终浓度为25%，冷冻保藏备用；
(2)从平板上挑取新鲜菌落，重悬至15ml无菌水中，混匀后转接到100 mL覆膜酵母发酵培养基中，每瓶100mL种子液接种2ml，摇床内28℃、200 rpm培养24 h后，作为发酵种子液；
(3)种子液培养结束后，用紫外分光光度计分别测试其OD600=5.21，取新鲜种子液转接至2L发酵培养基于5L摇瓶内，使转接后的OD600=0.21，将转接后的摇瓶经瓶盖密封后置于28℃培养箱，全程静置发酵，共计60 h；
(4)发酵结束后，将上述培养液离心，使用250mL离心瓶进行离心，14000 rpm常温离心5min，收集的发酵滤液上清，用抽滤的方法将离心后的上清液过2张中速滤纸，发酵滤液称重约2010 g，添加PE 9010 20.7 g，丁二醇41.4 g，二者混匀后添加至发酵滤液中，并搅拌分散均匀，将上述加入防腐剂的上清液进行抽滤，依次过0.45 μm及0.2 μm滤膜，即得到覆膜酵母发酵产物滤液。
所得滤液蛋白质含量1.2 mg/mL，还原糖含量8.1mg/mL，干物质含量0.7%，总计2L。
实施例2
(1)将覆膜酵母冻存菌接种于YPD培养基的无菌培养平皿中，在28℃条件下活化48h，添加50%甘油至终浓度为25%，冷冻保藏备用；
(2)从平板上挑取新鲜菌落，重悬至15ml无菌水中，混匀后转接到100 mL覆膜酵母发酵培养基中，每瓶100mL种子液接种2ml，摇床内28℃、200 rpm培养24 h，作为发酵种子液；
(3)种子液培养结束后，用紫外分光光度计分别测试其OD600= 6.0，取新鲜种子液转接至2L发酵培养基于5L摇瓶内，使转接后的OD600=0.45，将转接后的摇瓶经瓶盖密封后置于28℃培养箱，每隔36h摇动有一次，其余时间静置培养发酵，连续培养共计72 h；
(4)发酵结束后，将上述培养液离心，使用250mL离心瓶进行离心，14000 rpm常温离心5min，收集的上步发酵滤液上清，用抽滤的方法将离心后的上清液过2张中速滤纸，发酵滤液称重约2120 g，添加PE 9010共21.2 g，丁二醇63.6 g，二者混匀后添加至发酵滤液中，并搅拌分散均匀，将上述加入防腐剂的上清液进行抽滤，依次过0.45 μm及0.2 μm滤膜，即得到覆膜酵母发酵产物滤液。
所得滤液蛋白质含量1.4 mg/mL，还原糖含量8.0 mg/mL，干物质含量0.7%总计2L。
实施例3
(1)将覆膜酵母冻存菌接种于YPD培养基的无菌培养平皿中，在28℃条件下活化60h，添加50%甘油至终浓度为25%，冷冻保藏备用；
(2)从平板上挑取新鲜菌落，重悬至15ml无菌水中，混匀后转接到100 mL覆膜酵母发酵培养基中，每瓶100mL种子液接种2ml，摇床内28℃、200 rpm培养24 h后，作为发酵种子液；
(3)种子液培养结束后，用紫外分光光度计分别测试其OD600=7.3，取新鲜种子液转接至2L新鲜液体培养基于5L摇瓶内，使转接后的OD600=0.95，将转接后的摇瓶经瓶盖密封后置于28℃培养箱，每隔24h摇动有一次，其余时间静置培养发酵，连续培养共计96 h；
(4)发酵结束后，将上述培养液离心，使用250mL离心瓶进行离心，14000 rpm常温离心5min，收集的上步发酵滤液上清，用抽滤的方法将离心后的上清液过2张中速滤纸，发酵滤液称重约2025 g，添加PE9010 30.4 g，丁二醇60.7 g，二者混匀后添加至发酵滤液中，并搅拌分散均匀，将上述加入防腐剂的上清液进行抽滤，依次过0.45 μm及0.2 μm滤膜，即得到覆膜酵母发酵产物滤液。
所得滤液蛋白质含量1.3mg/mL，还原糖含量8.3 mg/mL，干物质含量0.9%总计2 L。
DNS法：即二硝基水杨酸法，利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS)与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，在540nm处有吸收，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系。
BCA法：在碱性环境下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+，BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有吸收，且在一定的浓度范围内颜色深浅与蛋白质含量成比例关系。
烘干法：在蒸发皿中加入1ml的产品，在105℃烘干1h，取出后冷却至室温，在此过程中，依次称取空皿重，皿加样品烘干前重，皿加样品烘干后重。则干物质含量=（皿加样品烘干后重-空皿重）/(皿加样品烘干前重-空皿重）。
采用DNS法测定产品中的还原糖含量，BCA法测定蛋白质含量，烘干法测定干物质含量，与采用有氧发酵方式得到的产品相比较，具体的参数如表2。
Figure 794304DEST_PATH_IMAGE002
实验结果表明，与竞品相比，实施例中，蛋白质的含量提高了30%，干物质的含量提高了27.8%，还原糖的含量稍有提高，但是不明显，只有1.6%。除了产品的各项指标均有提高之外，在整个的发酵流程及生产工艺中，采用将摇瓶密封静置培养的方法，不仅简化发酵工艺与操作流程，更营造了微氧的发酵环境，利于覆膜酵母的发酵，此方法适用于一般生物实验室，操作简单，成本低廉，产量较大。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (3)

1.一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺，按照下述步骤制备：
步骤1：配制培养基
配制YPD培养基和覆膜酵母发酵用培养基；
步骤2：发酵培养
(1)菌种活化：
将覆膜酵母冻存菌接种于YPD固体培养基的无菌培养平皿中进行活化；
(2) 制备种子液：
从固体平板上挑取新鲜菌落，重悬至无菌水中，混匀后转接到覆膜酵母发酵培养基中，摇床内28℃、200 rpm培养24 h后；
(3)发酵培养：
将种子液接种于覆膜酵母发酵培养基中进行静置微氧发酵培养，接种后的菌种浓度控制在OD600=0.2-1.0，装液量约为40%-70%，密封后静置于28℃培养箱中培养；所述的静置微氧发酵方式为每隔24h 或36h摇动一次，其余时间静置培养；
(4)制备发酵液：
发酵结束后，将上述培养液进行离心处理收集上清液，用2张中速滤纸对上清液进行抽滤处理，并将发酵滤液称重，按照质量百分比添加一定比例的防腐剂，并搅拌分散均匀，将加入防腐剂的上清液进行抽滤，依次经过0.45 μm及0.2μm滤膜，得到最终的可无菌保存的覆膜酵母发酵滤液。
2.根据权利要求1所述的一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺，其特征在于，所述的防腐剂为0.5-1.5%PE9010和2-3%丁二醇。
3.根据权利要求1所述的一种覆膜酵母发酵滤液的制备工艺，其特征在于，所述的接种后的菌种浓度控制在OD600=0.3-0.6。
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