DK153499B

DK153499B - Enzymoploesning, fremgangsmaade til fremstilling af denne, samt anvendelse heraf

Info

Publication number: DK153499B
Application number: DK212182A
Authority: DK
Inventors: Gustaaf Johannus Annokkee; Berend Philippus Ter Meulen
Original assignee: Tno
Priority date: 1981-05-13
Filing date: 1982-05-11
Publication date: 1988-07-18
Also published as: DE3265789D1; NL8102346A; EP0065800B1; EP0065800A1; ATE15224T1; DK153499C; DK212182A; JPS5886084A

Description

DK 153499 B

i

Den foreliggende opfindelse angår en enzymopløsning, en fremgangsmåde til fremstilling deraf og en fremgangsmåde til udførelse af en enzymatisk proces.

Til anvendelse af enzymer, især i enzymatiske industriprocesser, er 5 stabilisering nødvendig. Af økonomiske årsager er en lang levetid vigtig i denne henseende. Der har hidtil været kendt to basale fremgangsmåder til dette formål. Den ene fremgangsmåde omfatter immobiliseringen af et enzym på en bærer, der egner sig til dette formål, dvs. en katalysator på en bærer. Den anden fremgangsmåde består i 10 stabilisering i opløsning. Opfindelsen angår denne anden mulighed. Forskellige modifikationer af stabilisering i opløsning er beskrevet i artiklen "Enzyme stabilization without carriers", Enzyme Microb. Technol. 1979, bind 1, april, side 74-82. Som eksempel på et egnet stabiliseringsmiddel til dette formål nævnes albumin, som er et protein 15 fra hønseæg. Deri er et enzym opløst i en pufferopløsning, til hvilken der er sat albumin. På trods af en forbedret stabilitet af de således vundne opløsninger synes stabiliteten at formindskes væsentligt med tiden.

Det har nu vist sig, at de begrænsninger, som er forbundet med de 20 ovennævnte enzymopløsninger, kan formindskes eller undgås.

Ifølge opfindelsen har det vist sig-, at den fuldstændige, ikke-denatu-rerede æggehvidefraktion fra æg (æggehviden) er en fremragende stabilisator for enzymer, fx oxiderende, reducerende og hydrolyserende enzymer. Æggehviden frembyder ikke særlige fordele som stabili-25 sator for proteolytiske enzymer.

Den foreliggende opfindelsen angår derfor en enzymopløsning, der omfatter ét eller flere ikke-proteolytiske enzymer, der ikke normalt er tilstede i ikke-denatureret æggehvide, og, som stabilisator, ikke-de-natureret æggehvide. Æggehviden fra hønseæg har vist sig at være 30 særlig velegnet til dette formål.

2

DK 153499B

Stabile enzymopløsninger er vigtige til forskellige anvendelser såsom fx omdannelsen af ma kromolekylære substrater, hvor anvendelsen af et enzym, som er immobiliseret på en bærer, sædvanligvis påvirkes uheldigt af fysiske, især steriske, hindringer, hvilket fører til en 5 uønskeligt lav enzymaktivitet. En bærermatrix kan endvidere have en forstyrrende virkning, hvad angår enzymaktiviteten, især ved medicinske anvendelser.

Enzymopløsningen ifølge opfindelsen er særlig vigtig til anvendelse i enzymreaktionsbeholdere, hvor der anvendes opløste enzymer. Et 10 eksempel på enzymreaktionsbeholdere er membranreaktionsbeholdere, hvor membranen kun lader det dannede produkt trænge igennem.

Opfindelsen angår yderligere en fremgangsmåde til fremstilling af en enzymopløsning af den ovenfor angivne art, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at ét eller flere ikke-proteolytiske enzymer, der 15 ikke normalt er til stede i ikke-denatureret æggehvide, opløses i et opløsningsmiddel, der består af eller omfatter ikke-denatureret æggehvide. Æggehviden er fortrinsvis æggehvide fra hønseæg.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til udførelse af en enzymatisk proces, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 20 der som katalysator anvendes en enzymopløsning som ovenfor beskrevet, eller en enzymopløsning, der fås ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler. I disse eksempler er der anvendt ikke-denaturerede æggehvidefraktioner, der 25 stammer fra henholdsvis hønseæg, gåseæg og andeæg.

EKSEMPEL 1

Hydrolyse af lactose ved hjælp af lactase lactase

Lactose glucose + galactose

DK 153499 B

3

Lactase (β-galactosidase) i en mængde på 250 mg blev opløst i æggehvidefraktioner fra henholdsvis hønseæg, andeæg og gåseæg på hver 50 ml, hvilke fraktioner alle var blevet neutraliseret til en pH-værdi på 7 med mælkesyre. Efter tilsætning af nogle dråber toluen til be-5 skyttelse mod mikrobiel infektion holdtes opløsningerne ved 5°C. Disse enzymopløsninger blev med ugentlige intervaller blandet i en mængde på 0,5 ml med 25 ml af en lactoseopløsning (5 g lactose opløst i en blanding af 90 ml afmineraliseret vand og 10 ml af en 0,05M phosphat-puffer, pH-værdi 7). Efter omsætning i 5 timer ved 25°C blev om-10 dannelsen i alle tilfælde bestemt ved hjælp af en Auto-Analyzer-me-tode, hvorved den samlede reduktions kapacitet måles.

Til sammenligning blev der fremstillet en opløsning af 250 mg lactase i 50 ml af en 0,05M phosphatpuffer, pH-værdi 7, og opløsningen blev lagret under de samme betingelser, og der blev taget prøver, som 15 blev målt hver uge.

I tabel A nedenfor er vist de forskellige resultater for de forskellige lagringstider startende med 2 uger, hvilke resultater fås for den målte omdannelse efter 5 timer.

Tabel A

20 ______________

Lagringstid i dage Omdannelse målt efter 5 timer (i % af tilstedeværende lactose)

Lactase i æggehvide fra Lactase i phos- 25 høns gæs ænder phatbuffer 0 55 50 52 60 14 55 50 52 40 21 55 50 52 32 30 28 55 50 52 25 35 55 49 51 15 42 55 49 51 15 49 55 49 50 12 56 55 48 50 10 35 ---

DK 153499 B

4

Af den ovennævnte tabel fremgår det, at aktiviteten af lactase i æggehvidefraktionerne af henholdsvis hønse-, gåse- og andeæg holdes ubeskåret, hvorimod aktiviteten af lactase i phosphatpuffer efter 8 uger kun når op på 1/6 af den oprindelige aktivitet.

5 EKSEMPEL 2

Oxidering af ethanol til ethanal ved hjælp af al kohol-dehydrogenase (ADH)

En mængde på 2 mg ADH blev opløst i 10 ml æggehvidefraktion fra hønseæg, neutraliseret til en pH-værdi på 7. Denne opløsning blev 10 lagret ved 5°C, og med regelmæssige intervaller blev en mængde på + 0,2 ml deraf sat til en blanding af 0,2 ml NAD -opløsning (0,01 milli-mol NAD /10 ml), 0,1 ml ethanol og 2 ml af en 0,1M phosphatpuffer-opløsning med en pH-værdi på 7. Hele denne opløsning blev hurtigt homogeniseret, og derefter blev enzymaktiviteten bedømt ved at måle 15 omdannelsen af NAD til NADH ved 340 nm.

Til sammenligning blev identiske mængder af ADH også opløst i 10 ml af en 0,1M phosphatpuffer, pH-værdi 7, med tilsætning af varierende mængder albumin. Der blev taget prøver af disse opløsninger, som blev målt for enzymstabilitet på den ovenfor beskrevne måde.

20 For at forhindre mikrobielle infektioner i de enzymopløsninger, der skulle testes, blev der tilsat en lille mængde butylacetat til lagring.

Målingerne af aktiviteten blev udført ved 20°C. De opnåede resultater er vist i tabel B.

5

DK 153499B

Tabel B

Lagringstid i dage Målt indledende aktivitet af ADH (i % af den indledende aktivitet) 5 - ADH i ADH i phosphatpuffer + x mg/IO ml hønse- albumin æggehvide x=0 0,5 1,0 2,0 5,0 10 - 0 100 100 100 100 100 100 1 98 96 96 96 96 96 2 96 94 90 92 92 91 5 91 90 85 86 86 87 15 10 80 75 78 80 81 80 15 72 67 52 55 58 59 20 60 56 34 40 40 43 30 45 30 8 12 13 14 20 Af denne tabel fremgår det tydeligt, at stabiliteten af ADH forbedres væsentligt med æggehvidefraktionerne fra hønseæg.

EKSEMPEL 3

Reduktion af cortison til 20-3-dihydrocortison ved hjælp af 20-fS-hy-droxysteroiddehydrogenase C20-$-HSDH) 25 En mængde på 0,9 mg 20^-HSDH blev opløst i 10 ml æggehvidefraktion fra hønseæg, neutraliseret til en pH-værdi på 7. Denne opløsning blev lagret ved 5°C, og med regelmæssige mellemrum blev en mængde på 0,1 ml af denne opløsning tilsat en blanding af 0,2 ml af en NADH-opløsning, som omfatter 0,01 millimol NADH/10 ml, og 2 ml af 6

DK 153499B

en 0,1M phosphatpufferopløsning med en pH-værdi på 7, som omfatter cortison opløst deri i en koncentration på 150 mg/liter. Hele denne opløsning blev hurtigt homogeniseret, og derefter blev enzymakti- + viteten målt ved at bestemme omdannelsen af NADH til NAD ved 340 5 nm.

Til sammenligning blev en identisk mængde på 20-p-HSDH opløst i 10 ml af en 0,1M phosphatpuffer med en pH-værdi på 7 under tilsætning af varierende mængder af albumin, idet aktiviteten blev bestemt på den ovenfor beskrevne måde.

10 For at forhindre mikrobielle infektioner i de opløsninger, der skulle undersøges, blev en lille mængde butylacetat tilsat til lagring.

Alle malinger af aktiviteter blev udført ved 20°C. De opnåede resultater er vist i tabel C.

Tabel C

15 _

Lagringstid i dage Målt indledende aktivitet af 20-&-HSDH (i % af den indledende aktivitet) 20-β- 20“3“HSDH i phosphatpuffer + 20 HSDH i x mg/10 ml albumin hønse ægge- hvide x=0 0,5 1,0 2,0 5,0 25 0 100 100 100 100 100 100 1 98 53 94 94 96 95 2 96 38 90 91 93 93 5 92 9 65 66 68 68 10 88 1 32 34 36 38 30 15 83 0 12 18 19 22 20 79 0 3 2 8 14 30 70 0 1 0 1 4

DK 153499 B

7

Af denne tabel fremgår det, at stabiliteten af 20-&-HSDH klart forbedres med æggehvidefraktionen fra hønseæg.

EKSEMPEL 4

Reduktion af cortison tit 20-|5-dihydrocortison ved hjælp af 20-p-HSDH 5 med regenerering af coenzymet NADH fra NAD+

En enzymopløsning blev fremstillet ved opløsning af en suspension af 50 yliter 20-3-HSDH (0,5 enheder), 5 mg ADH (2000 enheder) og 5 + t mg NAD i 10 ml æggehvidefraktion fra hønseæg, neutraliseret til en pH-værdi på 7 med mælkesyre, ved 25°C, og opløsningen blev lagret 10 ved denne temperatur. For at forhindre mikrobiel infektion tilsattes nogle få dråber toluen. For at bestemme aktiviteten som en funktion af tiden (idet temperaturen blev holdt ved 25°C under bestemmelserne) sattes 0,5 ml af denne enzymopløsning til 25,0 ml substratopløsning-og blandedes med denne. Sammensætningen af substratopløsnin-15 gen var følgende: 0,1 g cortison + 10 ml ethanol pr. liter afminera-liseret vand.

Til sammenligning blev en lignende enzym-coenzymopløsning fremstillet i 10 ml af en 0,05M phosphatpufferopløsning med en pH-værdi på 7 ved 25°C, og opløsningen blev lagret ved samme temperatur. Akti-20 viteten som en funktion af tiden ved en temperatur på 25°C blev bestemt på tilsvarende måde for denne opløsning.

Claims

1. Enzymopløsning, 20 kendetegnet ved, at den omfatter ét eller flere ikke-pro-teolytiske enzymer, der ikke normalt er til stede i ikke-denatureret æggehvide, og, som stabilisator, ikke-denatureret æggehvide.

2. Enzymopløsning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den ikke-denaturede æggehvide er 25 hønseæggehvide. DK 153499B

3. Fremgangsmåde til fremstilling af enzymopløsningen ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ét eller flere ikke-proteolytiske enzymer, der ikke normalt er til stede i ikke-denatureret æggehvide, opløses i et opløsningsmiddel, der består af eller omfatter ikke-dena-5 tureret æggehvide.

4- Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at æggehviden er hønseæggehvide.

5. Fremgangsmåde til udførelse af en enzymatisk proces, kendetegnet ved, at enzymopløsningen ifølge krav l eller 2 10 eller en enzymopløsning, der er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 3 eller 4, anvendes som katalysator.