JP3143050B2 - 安定化されたグルコース6リン酸脱水素酵素 - Google Patents
安定化されたグルコース6リン酸脱水素酵素Info
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Description
素酵素を用いた臨床検査法において、グルコース6リン
酸脱水素酵素を化学修飾により安定化する方法と、およ
び安定化されたグルコース6リン酸脱水素酵素からなる
安定性のより高い臨床検査用測定試薬とその測定方法に
関する。
酵素NAD又はNADPの存在下でグルコース6リン酸
及びNADH又はNADPHを生成する反応、あるいは
この逆の反応を触媒する性質の酵素で、動植物界に広く
分布している。この性質を利用してグルコース6リン酸
脱水素酵素は分析試料中のグルコース関連物質の定量や
関連酵素の酵素活性等に使用されているが安定性に問題
がある。
6リン酸脱水素酵素を用いたグルコース6リン酸を生成
物とする液状臨床検査試薬において該酵素の安定性を向
上させる技術を提供することを目的とする。
来の問題点に鑑みグルコース6リン酸脱水素酵素(以下
G6PDと略す)について鋭意研究の結果、乳酸菌の一
種であるロイコノストック属由来のG6PDにおいて、
2価性架橋試薬にて化学修飾することにより、該酵素の
安定性を向上させる技術を見いだし、グルコース6リン
酸(以下G6Pと略す場合もある)を生成物とする液状
臨床検査試薬とその測定系方法を完成するに至った。
定化されたG6PDの作製方法の一例を以下に示した。
由来精製G6PD、6mg蛋白を2.4mlの20mM
K−PO4緩衝液(pH7.0,0.2M NaC
l,0.5mM EDTAを含む)に溶解した。つい
で、ミキサーにて激しく攪拌しながら最終濃度0.05
%になるように12μlの10%グルタルアルデヒド溶
液(和光純薬社製、電子顕微鏡用)を滴下した。その後
25℃にて30分間静置した。
て等量の0.2M グリシン溶液(pH7.0)添加混
合し、架橋化反応を停止した。その後さらに30分間静
置した。
ら、低分子量のものを除去するために、市販カラム(バ
イオラッド社製、Biogel−10DG)を用いて1
0mM K−PO4緩衝液(pH7.0、0.5mM
EDTA、0.02%NaN3を含む)にて脱塩処理を
行った。もしくは、脱塩操作の代わりに上記リン酸緩衝
液中にて透析を行っても良い。
れたG6PDのみを得ることを目的とし、未修飾酵素や
架橋が不十分に行われたものを失活させ除去するため
に、上記の2)の段階、もしくは3)の段階で熱処理操
作を行っても良い。また、イオン交換クロマトグラフィ
ー等の分離精製手段を3)の段階以降に講じても良い。
もちろん熱処理とクロマトグラフィー操作とを組み合わ
せることもできる。また、2価性架橋試薬によるG6P
D架橋化反応時に、酵素活性部位を保護する目的で用い
た2価性架橋試薬とは実質上反応しえない基質及び基質
アナログ、もしくは阻害剤を添加しても良い。
菌体培養より精製して得られた酵素標品でも、ロイコノ
ストック属由来のG6PD遺伝子を大腸菌等に形質導入
して得られた組換え酵素であっても良い。
ついてロイコノストック・メンセントロイデス等任意の
ものを使用すればよい。又この微生物の代表菌株とし
て、ロイコノストック・メンセントロイデスはATCC
12291である。
し30℃における1分間あたり1μmoleのNADH
生成量を酵素活性(1単位)とした。
6PDの安定化操作中の各工程段階での総活性値及びに
収率を表1に示した。
G6PDの熱安定性の測定方法については例えば下記の
要領で簡単に試験することが可能である。
G6PDの酵素的な性状をゲル濾過法による架橋化酵素
のの分子量の測定や基質であるG6Pに対する反応度合
より、未処理酵素との比較分析を行った。G6Pに対す
るKm値測定のための組成について、上記したG6PD
酵素活性試薬組成に準じたものと、臨床化学(199
0)第19巻第2号185−208記載のCK(クレア
チンキナーゼ)活性を測定する為の最終反応液組成に準
じて行った。得られた比較分析結果を表2に示した。
用される2価性の架橋試薬は種々の物が挙げられる。そ
の一例と共に、修飾酵素の熱安定性試験結果を表3に示
した。また、下表に挙げた架橋試薬以外にも、ジスクニ
ミジルグルタレート(DSG)、ジスクシニミジルタル
タレート(DST)等が挙げられる。
件; G6PD :ロイコノストック属由来 1.4mg蛋白/ml(約1000U/ml) 架橋化試薬濃度:5mM 反応液組成 :20mM K−PO4緩衝液(pH7.0) 0.2mM NaCl 0.5mM EDTA 0.02% NaN3 反応条件 :25℃、20分間 反応停止剤 :0.1M グリシン(pH7.0)を添加混合後、 15分間静置する
する。なお、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
PD、6mg蛋白を2.4mlの20mM K−PO4
緩衝液(pH7.0、0.2mM NaCl、0.5m
M EDTAを含む)に溶解した。ついで、ミキサーに
て激しく攪拌しながら最終濃度0.05%になるように
12μlの10%グルタルアルデヒド溶液)和光純薬社
製、電子顕微鏡用)を滴下した。その後、25℃にて3
0分間静置した。
て等量の0.2M グリシン溶液(pH7.0)添加混
合し、架橋化反応を停止した。その後さらに30分間静
置した。
ら、低分子量のものを除去するために、市販カラム(バ
イオラッド社製、Biogel−10DG)を用いて1
0mM K−PO4緩衝液(pH7.0、0.5mM
EDTA、0.02%NaN3を含む)にて脱塩処理を
行った。
デヒド架橋化反応混合液中には、架橋化反応が形成され
なかった未修飾酵素及び不十分な状態にあるものなどが
混在しているため、安定化されたG6PDのみを得るこ
とを目的とし、上記2)の反応混合液に対して55℃、
15分間の熱処理を行った。
ものを修飾酵素(#1)と称し、架橋化反応後あわせて
熱処理を行ったものを修飾酵素(#2、熱処理)と表記
することにした。
G6PDの熱安定性の測定方法については下記の要領で
試験した。
K活性測定試薬組成中における保存安定性を下記の要領
で調査した。結果を図2に示した。
K活性測定時における追随酵素性能を下記の要領で調査
した。CPK活性測定するために組み立てた試薬組成
は、臨床化学(1990)第1巻第2号185−208
ページ記載のCK(クレアチンキナーゼ)活性を測定す
るための最終反応液組成に準じて行った。結果を図3に
示した。
おける検量線を作成した。
いたCPK検量線の作成に際しては、第1試薬組成中に
2U/mlの安定化されたG6PDを添加した。それ以
外のCPK活性測定条件は実施例4と同様に行った。結
果を図4に示した。
とする生体物質の測定方法に用いる液状臨床検査測定試
薬において、2価性架橋試薬にて化学修飾されたG6P
Dを用いることで、該酵素の安定性を顕著に向上させる
ことができる。
ストックG6PDの熱安定化を示す図表である。
0mM グルコース添加時の、架橋化処理により安定化
されたG6PDのCPK活性測定試薬組成における保存
安定性を示す図表である。
PK活性測定時における追随酵素性能を示す図表であ
る。
いたCPK活性測定試薬の検量線を示す図表である。
Claims (3)
- 【請求項1】グルコース6リン酸脱水素酵素を用いた測
定試薬において、該グルコース6リン酸脱水素酵素が、
2価性架橋試薬にて化学修飾して安定化されたグルコー
ス6リン酸脱水素酵素であることを特徴とする測定試
薬。 - 【請求項2】グルコース6リン酸脱水素酵素を用いた測
定試薬において、該グルコース6リン酸脱水素酵素が、
2価性架橋試薬にて化学修飾した後、熱処理することに
より安定化されたグルコース6リン酸脱水素酵素である
ことを特徴とする測定試薬。 - 【請求項3】請求項1ないし2のいずれか1項記載の安
定化されたグルコース6リン酸脱水素酵素を用いた測定
試薬により、生体成分を測定する方法。
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JP07245244A JP3143050B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 安定化されたグルコース6リン酸脱水素酵素 |
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JP07245244A JP3143050B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 安定化されたグルコース6リン酸脱水素酵素 |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH0965877A JPH0965877A (ja) | 1997-03-11 |
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JP07245244A Expired - Fee Related JP3143050B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 安定化されたグルコース6リン酸脱水素酵素 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006271257A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Cci Corp | 熱安定性に優れたポリオール脱水素酵素およびその製造方法 |
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1995
- 1995-08-31 JP JP07245244A patent/JP3143050B2/ja not_active Expired - Fee Related
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JP2006271257A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Cci Corp | 熱安定性に優れたポリオール脱水素酵素およびその製造方法 |
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JPH0965877A (ja) | 1997-03-11 |
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