DK152222B - Fremgangsmaade til fremstilling af en carbohydrase til nedbrydning af et hoejmolekylaert kulhydrat - Google Patents

Fremgangsmaade til fremstilling af en carbohydrase til nedbrydning af et hoejmolekylaert kulhydrat Download PDF

Info

Publication number
DK152222B
DK152222B DK564282A DK564282A DK152222B DK 152222 B DK152222 B DK 152222B DK 564282 A DK564282 A DK 564282A DK 564282 A DK564282 A DK 564282A DK 152222 B DK152222 B DK 152222B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
sps
ase
protein
preparation
enzyme
Prior art date
Application number
DK564282A
Other languages
English (en)
Other versions
DK564282A (da
DK152222C (da
Inventor
Jens Lorenz Adler-Nissen
Georg Wilhelm Jensen
Steen Riisgaard
Henrik Guertler
Hans Aage Sejr Olsen
Martin Schuelein
Original Assignee
Novo Industri As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Industri As filed Critical Novo Industri As
Priority to DK564282A priority Critical patent/DK152222C/da
Publication of DK564282A publication Critical patent/DK564282A/da
Publication of DK152222B publication Critical patent/DK152222B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK152222C publication Critical patent/DK152222C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/10—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins
    • A23C11/103—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins containing only proteins from pulses, oilseeds or nuts, e.g. nut milk
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23F—COFFEE; TEA; THEIR SUBSTITUTES; MANUFACTURE, PREPARATION, OR INFUSION THEREOF
    • A23F5/00—Coffee; Coffee substitutes; Preparations thereof
    • A23F5/16—Removing unwanted substances
    • A23F5/163—Removing unwanted substances using enzymes or microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/14—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
    • A23J1/148—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds by treatment involving enzymes or microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/60—Drinks from legumes, e.g. lupine drinks
    • A23L11/65—Soy drinks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/70—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter
    • A23L2/84—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter using microorganisms or biological material, e.g. enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B61/00—Dyes of natural origin prepared from natural sources, e.g. vegetable sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/02—Pretreatment
    • C11B1/025—Pretreatment by enzymes or microorganisms, living or dead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
    • C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
    • C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

DK 152222 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en carbohydrase kaldet SPS-ase, som under passende betingelser er i stand til at nedbryde soja-SPS til nedbrydningsprodukter, der binder sig til protein i et vandigt medium i mindre omfang end soja-SPS før nedbrydningen ville have bundet sig til det samme protein under tilsvarende betingelser.
En fremgangsmåde til fremstilling af et renset vegetabilsk proteinprodukt (pvp) ved enzymatisk fjernelse af remanensen, uden opløsning og eenbundfældning af proteinet, er beskrevet i belgisk patentskrift nr. S62 769. Renheden af det pvp, som kan opnås under anvendelse af den kendte metode, er ikke tilfredsstillende, og det er derfor ønskværdigt, at den forbedres. Af eksemplerne fremgår, at man kan opnå en renhed af pvp på ca. 85%. Selvom det er muligt at opnå et pvp i en renhed på ca. 901 under anvendelse af den kendte metode, kan en sådan renhed kun opnås med visse forbehandlede udgangsmaterialer, f.eks. sojapro-teinkoncentrat. Det ville være ønskværdigt at være i stand til at opnå en ‘renhed af pvp på -omkring eller over 90% med et meget bredere spektrum af udgangsmaterialer, især afskallet og affedtet sojamel.
Opfindelsen er baseret på den overraskende erkendelse, at en vis del af det nedbrydningsprodukt af remanensen, som foreligger under den førangivne enzymatiske behandling, nemlig et vandopløseligt, højmolekylært kulhydrat, binder sig til en del af det vegetabilske protein, hvilket vil blive forklaret detaljeret senere i denne beskrivelse. Dette resulterer naturligvis i en lavere renhed af proteinet. Det har også
-2* DK 152222B
binde sig til proteiner ef animalsk oprindelse.
Det er således opfindelsens formål at angive en fremgangsmåde til fremstilling af et enzym til nedbrydning af det forangivne, højmolekylære kulhydrat, hvilket vil muliggøre, at man kan fremstille et pvp med større renhed.
Det grundlag, hvorpå opfindelsen bygger, han 4 beskrives på følgende måde, idet der henvises til fig. 1, hvorpå kun materialer, der foreligger som uopløste tørstoffer, er angivet, hvorimod alle supernatanter er udeladt. En portion sojamel blev delt i to lige store dele, del I og del II (søjle a på fig. 1). Del I blev nedbrudt proteolytisk ved en pH-værdi på ca. 8 ved hjælp af ALCALASE (et proteolytisk enzym fremstillet ved hjælp af B. licheni-formis og markedsført af NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsværd, Danmark), og derpå yderligere vasket ved pH ca. 8 for at eliminere hele proteinmængden, og remanensen blev separeret fra supernatanten og vasket (se del I, søjle a og b, fig. 1) På denne måde isoleredes en ren remanens (betegnet remanens I) (søjle b på fig. I). Del II af sojamelet blev ikke behandlet? for kortheds skyld betegnes remanensen i del II som remanens II (søjle b på fig. 1). Nu nedbrydes både remanens I og del II ved hjælp af én kommerciel pectinase, f.eks. PECTINEX (et pectolytisk enzym fremstillet af Schweizerische Ferment AG, Basel, Schweiz) (se søjle b og c på fig. 1).
Det viser sig overraskende, at den uopløste del af remanens I er meget mindre end den uopløste del af remanens II, på basis af massebalancer af nitrogen og tørstof, se fig.
1, hvor de skraverede arealer i søjle c svarer til uopløselige ikke-pro te inmate ri aler i det førangivne trin. Hvis y-derligere supernatanten fra den pectinasebehandlede rema-nens I bringes i kontakt med en sojaproteinsuspension ved 4 pH 4,5, bindes et polysaccharid i supernatanten til sojaproteinet. Dette polysaccharid i supernatanten fra remanens
'3' DK 152222 B
I# som cr del sf remanensnedbrydningsproduktet, og som er klart opløseligt i vand i fravar af sojaprotein, men som bindes til sojaprotein ved eller omkring sojaproteins isoelektriske punkt, hvis sojaprotein er til stede, betegnes SPS (soluble polysaccharide), se fig. 1. SPS har en molekylvagtsfordelinq .mellem 5 x 10^ og 4,9 x 10*. Fremstillingen af Isoleret SPS fremgår af det på fig. 2 viste strømningsdiagram, som også omfatter nogle af de processer, dér er afbildet på fig.
1. Problemet er således at finde et enzym, der er i stand til at nedbryde SPS på en sådan måde, at SPS-nedbrydnings~ produkterne ikke bindes til sojaprotein eller bindes til sojsprotein i et langt nindre omfang end SPS bindes til sojaprotein.
Det har ifølge opfindelsen vist sig, at det ved at screene for evnen til at dekomponere soja-SPS er muligt at selektere mikroorganismer tilhørende slægten Aspergillus, der er i stand til at fremstille en forbindelse, som udviser en enzymatisk aktivitet, der på effektiv måde kan nedbryde soja-SPS, i det følgende for kortheds skyld betegnet en SPS-ase.
Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af SPS-ase, der er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne. Dyrkningen kan foretages sub-merst eller som overfladegæring.
Det har vist sig, at denne SPS-ase, der er i stand til at nedbryde ébja-SPS, kan nedbryde polysaccharider, der er af lignende art san SPS, og scm hidrører fra grøntsager og frugter, mere fuldstændigt end kommercielle pectinasei og konnercielle cel lulaser.
'4- DK 152222B
Det er tilsigtet, at SPS-asen skal foreligge i anvendelig form, d.v.s. at det SPS-ase-holdige præparat ikke må indeholde toksiske bestanddele eller udvise en så lav SPS-ase-aktivitet, som nødvendiggør anvendelsen af over 10% SPS-ase-holdigt præparat, i forhold til vægten af SPS i substratet, i en reaktion, som gennemføres i 24 timer og ved 50WC, ved pH-optimum for den pågældende SPS-ase, for at opnå en nedbrydning af SPS af praktisk betydning .
Ved total eller partiel eliminering af SPS fra det sluttelige vegetabilske protein må renheden af det sluttelige vegetabilske protein nødvendigvis forbedres i sammenligning med renheden af det sluttelige vegetabilske protein, som er opnåeligt i henhold til den fremgangsmåde, der er kendt fra belgisk patentskrift nr. 882.769, fordi dette kendte vegetabilske produkt var kontamineret med SPS.
A
På nuværende tidspunkt vides det ikke, om den særlige SPS-ase, der beskrives i det følgende, afleder sin enzymatiske aktivitet fra et enkelt enzym eller fra et enzymkompleks omfattende mindst to enzymer. Visse undersøgelser synes at vise, at mindst to enzymer er ansvarlige for den SPS-ase-nedbrydende effekt, hvorved et af disse enzymer kun er i stand til at gennemføre en mindre nedbrydning af SPS, hvorefter et eller flere enzymer er i stand til at gennemføre en mere gennemgribende nedbrydning af SPS.
-5- DK 152222 B
»
En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 2 angivne. Det har vist sig, at Aspergillus aculeatus CBS 101.43 udover SPS-asen også frembringer meget potente remanaser, cellulaser, pectinaser og hemicellulaser. Det har desuden vist sig, at ikke alle stammer hørende til arterne Aspergillus aculeatus eller Aspergillus japonicus giver anledning til dannelsen af SPS-ase. Det fremgår således af et senere afsnit i denne beskrivelse (sektion 5), at det er påvist, at stammen Aspergillus japonicus ATCC 20236 ikke giver anledning til dannelse af sådanne mængder af en SPS-ase, som kan konstateres ved hjælp af den enzymetisk bestemmelsesmetode for SPS-ase, som er beskrevet i denne beskrivelse.
Da SPS-ase fremstilles ad mikrobiel vej, dannes den i blanding med adskillige ledsagestoffer, især andre enzymer. Om ønsket kan den pågældende SPS-ase renses, f.eks. ved hjælp af kromatografiske separationsmetoder, hvilket vil blive beskrevet senere i denne beskrivelse (sektion 6).
I Agr.6iol.Chem. 40 (1), 87 - 92, 1976 er det beskrevet, at en stamme af Aspergillus japonicus, ATCC 20236, producerer et enzymkompleks, der er i stand til at frembringe en partiel nedbrydning af et surt polysaccharid i sojasauce, betegnet APS, hvoraf en fraktion er betegnet APS-I. Dette
~6~ DK 152222 B
sure polysaccharid er ikke identisk med SPS, hvilket på mere detaljeret måde vil blive vist i sektion 3 i denne be- -skrivelse. HPLC-gelfiltreringskromatoorammerne af SPS og APS er således tydeligt forskellige, og yderligere er gelfiltreringskromatogrammerne af APS, som er nedbrudt ved hjælp af den kommercielle pectinase Pectolyase, og af SPS, der er behandlet med den kommercielle pectinase Pectolyase, tydeligt forskellige. Desuden fremgår det ikke af artiklen, at det sure polysaccharid bindes til soja-f proteinet, og at det nedbrudte sure polysaccharid ikke bindes til sojaproteinet eller bindes til sojaproteinet i en langt mindre udstrækning end det ikke-nedbrudte, sure polysaccharid. Det er også blevet vist, at denne stamme ikke danner SPS-ase i sådanne mængder, som kan konstateres ved hjælp af den enzymatiske bestemmelsesmetode for SPS-ase, der er beskrevet i denne beskrivelse. Dette skabte en fordom imod, at nogen stamme af Aspergillus japonicus skulle være i stand til at producere en SPS-ase, men det har overraskende ifølge opfindelsen vist sig, at nogle stammer af Aspergillus japonicus er SPS-ase-producenter.
t
·7' DK 152222B
En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 3 angivne.
En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 4 angivne.
En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 5 angivne.
En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 6 angivne.
Det har som nævnt vist sig, at Aspergillus aculeatus CBS 101.43 også frembringer meget potente remanens-solubilise-rende enzymer, cellulaser, pectinaser og hemicellulaser ved siden af SPS-asen, og at det enzymkomleks, der fremstilles ved hjælp af Aspergillus aculeatus CBS 101.43, er fremragende egnet som et middel til anvendelse til celle-vægs-desintegrering af vegetabilske materialer. Det enzymkompleks, der kan produceres på basis af Aspergillus aculeatus CBS 101.43, kan således anvendes i den næringsmid-delbehandlende industri til behandling af frugtpulp og vegetabilsk pulp og klaring og viskositetsreduktion ved - behandling af saft og vin med udmærkede resultater; det kan også anvendes som et afvandingsniddel (dvs. et middel til nedbrydning af polysaccharider og som følge deraf til frigørelse af det vand, der er bundet inden i polysaccharidernes polymere struktur) ved behandling af vegetabilske materialer.
·8' DK 152222 Β
Det har således vist sig, at SPS-ase-præparater er værdifulde enzympræparater til partiel eller total forflydning eller nedbrydning af adskillige materialer, fortrinsvis vegetabilske materialer, f.eks. frugter og planteaffaid, der indeholder protein, cellulose, hemicellulose (f.eks. glucaner, _ tylan, ga laet aner og araban), gummiarter, pectin, lipider, inulin, polyphenoler, stivelse og alginater, og til dermed beslægtede formål, jfr. den senere i denne beskrivelse viste tabel. Som eksempler på dermed beslægtede formål kan anføres alle formål, i forbindelse med hvilke kommercielle pectinaser og cellulaser anvendes i dag. Adskillige eksempler vil blive angivet senere i denne beskrivelse.
I relation til den ekstraktionsproces (isolationsproces), som f.eks. er beskrevet i eksempel 2, kan det bemærkes, at SPS-ase-præparatet i det væsentlige er proteinasefrit, p.g.a., at det ønskede slutprodukt, d.v.s. proteinet, ellers ville blive nedbrudt. Hvis det på lignende made ønskes at ekstrahere (isolere) andre biologiske materialer end protein fra -et råt biologisk materiale, skal det anvendte SPS-ase-præparat i det væsentlige være frit for ethvert enzym, der nedbryder dette andet biologiske materiale. Sådanne modificerede SPS-ase-præparater kan fremstilles ved selektiv inaktivering af det uønskede enzym, ved fraktionering eller ved andre metoder, der er kendt per se.
Det har således vist sig, at de modificerede SPS-ase-præparater (modificeret i den forstand, at de i det væsentlige er frie for enzymer, der er i stand til at nedbryde det biologiske materiale, der skal ekstraheres eller isoleres) er værdifulde enzympræparater til ekstraktion (isolation) af specifikke biologiske materialer, f.eks. stivelse, lipider, lugtsfoffer, farvestoffer og safte, fra rå biologiske materialer. Adskillige eksempler vil blive angivet senere i denne beskrivelse.
For at tydeliggøre naturen af opfindelsen skal der henvises til de følgende sektioner 1-10, som alle be skriver detaljer i forbindelse med opfindelsen:
DK 152222B
1. Fremstilling af SPE.
2. Karakterisering af SPS, især molekylvægtsfordelingen deraf.
3. Dokumentation for, at SPS og APS er forskellige.
4. Screening for SPS-ase-producerende mikroorganismer.
5. Karakterisering af nogle EPS-ase-dannende mikroorganismer.
6. Generel beskrivelse af overlejringsteknik i forbindelse med immunelektroforese.
7. Immunelektroforetisk karakterisering af SPS-ase med polyspecifikt antistof.og overlejring.
8. Rensning af et SPS-ase-præparat.
9. pH-aktivitets-afhængighed, temperatur-aktivitetsafhængighed og stabilitet af en SPS-ase.
10. Enzymatiske aktivitetsbestemmelser.
DK 152222B
- 10 - SEKTION 1.
PRODUKTION AF SPS.
Som før anført kan udgangsmaterialet til fremstilling af SPS være sojaremanens. Derfor beskrives fremstillingen af sojaremanens først.
Sojaremanens er den proteinfri kulhydratfraktion (der i praksis kan indeholde mindre mængder lignin og mineraler) i affedtet og afskallet sojamel, hvilken kulhydratfraktion er uopløselig i et vandigt medium ved pH 4,5, og den kan fremstilles på følgende måde, hvorved der også henvises til strømningsdiagram 1.
Affedtet sojamel (sojamel 13 fra Aarhus Oliefabrik A/S) suspenderes i afioniseret vand ved 50°C i et vægtforhold sojamel:vand = 1:5 i en tank med pH-stat og temperaturkontrol. pH indstilles på 8,0 med 4 N NaOH (I). Nu gennemføres en pH-stat-hydrolyse med ALCALASE 0,6 L (et proteolytisk enzym på basis af B. licheniformis med en aktivitet af 0,6 Anson-enheder/g, hvorved aktiviteten bestemmes i henhold til Anson-metoden, som beskrevet i NOVO ENZYME INFORMATION IB nr. 058 e-GB), hvorved forholdet enzym/substrat er lig med 4% af proteinmængden i sojamelet (II). Efter en hydrolyse på 1 time separéres slammet ved centrifugering (III) og vaskning (IV), hvorved denne operation gennemføres to gange (V, VI, vil).
Det således behandlede slam hydrolyseres endnu en gang i 1 time med ALCALASE 0,6 L (VIII, IX) på lignende måde som angivet i det foregående. Derpå separeres slammet ved centrifugering (X) og vaskes to gange (XI, XII, XIII,XIV), hvorved det sluttelige slam (6) sprøjtetørres (XV). Det således fremstillede, sprøjte tørrede pulver er den sojaremanens, der tjener som råmateriale til fremstilling af SPS.
DK 152222B
- 11 - SPS er den vandopløselige polysaccharidfraktion, der fremkommer ved konventionel behandling af den ovenfor angivne sojaremanens med pectinase. SPS fremstilles på følgende måde under anvendelse af i det følgende angivne 14 reaktionstrin, idet der også henvises til strømningsdiagram 2.
1. Tørstofindholdet i den ovenfor angivne sojaremanens bestemmes, og sojaremanensen fortyndes med vand til 2% tørstof og holdes i suspension ved 50°C i en tank med temperaturkontrol.
i 2. pH-værdien indstilles på 4,50 med 6 N NaOK.
3. I en mængde af 200 g/kg tørstof tilsætter man Pectinex Super cone. L (en kommerciel pectinase fra Schweizerische Ferment AG, Basel, Schweiz med en pectinaseaktivitet på 750.000 MOU, bestemt i henhold til brochuren "Determination of the Pectinase Units on Apple Juice (MOU)" af 12.6.1981, som kan rekvireres fra Schweizerische Ferment AG, Basel, Schweiz), og tillige tilsætter man i en mængde af 20 g/kg tørstof Celluclast 200 L (en ' kommerciel cellulase, der er beskrevet i brochu ren NOVO ENZYMES, information sheet B 153 e-GB 1000 juli, 1981, som kan rekvireres fra NOVO INDUSTRI A/S, Novo Alle, 2880 Bagsværd, Danmark) .
4. Tankens indhold holdes ved 50°C i 24 timer under omrøring.
5. Enzymerne inaktiveres ved at hæve pH-værdien til 9t0 med 4 N NaOK. Reaktionsblandingen lades henstå i 30 minutter, og pH-værdien bliver derpå genindstillet til 4,5 med 6 N HC1.
' 12 ' DK 152222B
6. Reaktionsblandingen centrifugeres, og man opsamler både centrifugatet og slammet.
7. Centrifugatet fra trin 6 blankfiltreres på en filterpresse (filtret vaskes med vand før blankfiltreringen).
8. Blankfiltratet bliver ultrafiltreret, diafiltreret og endnu en gang ultraf iltreret på en membran med en skilleværdi (cut-off value) på 30.000 (DDS GR 60-P fra De Danske Sukkerfabrikker) , hvorved man anvender følgende parametre : 1. Ultrafiltrering svarende til en volumenkoncentration på 6.
2. Diafiltrering indtil tørstofprocenten i permeatet er 0 (~ 0° Brix).
3. Ultrafiltrering til ca. 15% tørstof i . koncentratet.
Temperaturen er 50°C, pH er 4,5 og det gennemsnitlige tryk er 3 bar.
9. Det ultrafiltrerede koncentrat afkøles til 5°C, og der tilsættes et ligeså stort volumen 96% ethanol.
10. Bundfaldet opsamles ved hjælp af en centrifuge.
11. Bundfaldet vaskes to gange med 50% v/v ethanol i I^O, svarende til voluminet af cen-trifugat fra trin 10, dvs. der foretages to eentri fugeringer.
12. Det vaskede bundfald genopløses i vand med et volumen, der er lig med voluminet af
DK 152222 B
- 13 - det ultrafiltrerede koncentrat fra trin 9.
13. Væsken fra trin 12 blankfiltreres på et glasfilter.
14. Det klare filtrat indeholdende rent SPS frysetørres.
)
-14- DK 152222B
STRØMNIHGSDIAGRA« MR. 1 Affedtet sojamel H-O NaOH til pH * 8 1 x
Hydrolyseblanding I
Ί'1 - ^ —— ~ —— . — .*—-
*Qcalase 0.6 L > Hydrolyse 1 time før viderebehandling, _T
JE/S = 4%) oK-stat (pH = 8. T - 50 C)_ , -----J* 'ir ’NaOH 1. centrifugering III _Centrifugat 1 y Affald _ ~ Slam 1
Ho0-? 1. vask IV
2 ± __ 2. centrifugering I V 1 Centrifngat 7 y Affald _,, Slam 2
H^O-3 2. vask VI
2 3Γ 13. centrifugering vil._Centrifngat 3 ^ Affald _,,_Slam 3
H,0-3 Ny hydrolyseblanding VIII
laOH til pH = 8——» " J,__ ilcalase 0.6 L JHydrolyse i 3 time fdr viderebphar.dl -i ng ^
N NaOH_v pH-s tat (pH = 8,0 T = 50 C) IX
*-------- ^— 14. centrifugering |X|-Centr-i fnga-t 4 ^ Affald _Slam 4
H,0 i 1. vask XI
^ --- 5. centrifugering Xllj-rpntrif^at ς Affald
Slam 5 _ik__
H-0-i 2. vask XIII
I-------- ^ - —i- 16. centrifugering IXIVj-Cent-ri fng*t ^ Affald
Slam 6 _*_
Spray-tørring__XV
DK 152222B
- 15 - STRgMNINGSDIAGRAM NR. 2 1000 g Pectinex Super Cone. L 5 kg sprøitetørret remanens 100 σ Celluelast 250 5·.
. . I-ύί_v ..........
Nedbrydning med pectinase og 247 1 H?0 wcellulase 1, 2, 3, 4, 5 5 50°C; pH = e,5; t = 24 timer X_______ .....
„ Centrifugering _____Slam ^ 6 X· ~~ 38 kg'
Blankfiltrering 4r ---—
Ultrafiltrering, diafiltrering, 18 1 H?0_; ultrafiltrerina _241 1 permeat ^ ' (GR 6OP) (19 - 26°C) 1 7* X — * - 5 1 50% C„K^OH v Bundfældnino _Supernatants 9 M *---------]_--- (Affald)
Centrifugering _Centrifucat^lO
0/ Ί Bundfældning 2 x vask _ _2 x centrifuoat^ll X . Bundfældning 2 1 H?Q_^ Genopløsning 12 C—- . —ak -.--.,,-
Blankf iltrerino_Proteinsi am,. 13 --(Affald) ---
Frysetørring j
310 g frysetørret SPS
PK 152222Β SEKTION 2.
- 16 - KARAKTERISERING AF' SPS, ISÆR MOLEKY.LVÆGTFORDELING DERAF.
Ved hjælp af gelkromatografi på HPLC-udstyr (Waters pumpe model 6000, Waters datamodul 730 og Waters ref rak tome ter R 4 01) bestemmes molekylvægtsfordelingen af det-SPS, hvis fremstilling er gennemført som angivet i denne beskrivelse (fig. 4). Ved hjælp af den samme metode bestemmer man også molekylvægtsfordelingen af de nedbrydningsprodukter af SPS, der er fremkommet ved hjælp af SPS-ase (fig. 5). Under anvendelse af den samme metode har man tillige påvist bindingseffekten mellem sojaprotein og SPS (fig. 6) og fraværet af bindingseffekten mellem soja-protein og SPS, der er nedbrudt ved hjælp af SPS-ase (Fig. 7).
Kalibreringskurven (logaritmen til molekylvægten afbildet imod R^, hvor R^-værdien for glucose arbitrært er defineret som 1 og R^-værdien for en specifik dextran er defineret som retentionstiden for denne dex-tran divideret med retentionstiden for glucose) er blevet etableret ved hjælp af adskillige standard-dextraner med kendte molekylvægte (T 4, T 10, T 40, T 70, T 110, T 500) fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Box 175, S-75104,
Uppsala, Sverige. Rf-værdien for maksimet for hver dextran-top er bestemt, og den tilsvarende molekylvægt er beregnet som ^Mw· Mn, hvorved Mw er den gennemsnitlige værdi for molekylvægten efter vægt og Mn er den gennemsnitlige værdi af molekylvægten efter antal. Som eluent for denne kromatografiske metode har man anvendt 0,1 M NaNO^. De søjler, der anvendes ved den kromatografiske metode, er 60 cm PW 5000 efterfulgt af 60 cm PW 3000 fra Toyo Soda Manufacturing Co., Japan. På denne måde har man etableret afhængighedsforholdet mellen molekylvægt og R, for de før
DK 152222B
- 17 - På basis af fig. 4 kan man beregne, at SPS har en molekylvægtfordeling, som svarer til en værdi af M på 5 - λ w ca. 5,4 x 10 og en værdi af på ca. 4,2 x 10 . Af denne figur fremgår det også, at kromatogrammet udviser to udprægede toppe ved retentiønstid 34,5 min. (6%) svarende til en molekylvægt på ca. 5 x 10^ og retentionstid 47,12 min.
4 (67%) svarende til en molekylvægt på ca. 4,9 x 10 . Det fremgår også af denne kurve, at der foreligger en skulder mellem disse to toppe ved retentionstiden 41,25 min. (27%) svarende til en molekylvægt på 2,8 x 105.
Efter nedbrydning af SPS med SPS-ase blev hydrolyseblandingen membranfiltreret, og filtratet blev kroma-tograferet. Det viste sig, at ca. 55% af SPS nedbrydes til mono-, di- og trisaccharider, og at de resterende 45% nedbrydes til en polymer med tre toppe med følgende molekylvægte: 5 x ΙΟ4, 104 og 4,4 x 10^, jfr. fig. 5.
Por at påvise bindingseffekten mellem sojaprotein og SPS og den væsentlige reduktion af bindingseffekten mellem sojaprotein og SPS, der er nedbrudt ved hjælp af en SPS-ase, udførte man følgende forsøg.
3% SPS i 0,1 M acetatstøapude ved pH 4,5 tilsættes til en opslemning af sojaisolat (Purina E 500) for at danne en suspension med et forhold isolat/SPS på 10:1. Denne suspension inkuberes i 18 timer på et rystebad ved 50°C. Efter inkubering centrifugeres suspensionen, og den klare supernatant analyseres på HPLC som tidligere beskrevet. Det fremgår af fig. 6 i sammenligning med fig. 4, at SPS adsorberes fuldstændigt til sojaisolatet.
Man gennemfører det samme.forsøg som angivet i det foregående afsnit med en 3% SPS-opløsning, der er hydrolyseret med en SPS-ase, som er fremstillet ved hjælp af CBS 101.43 (fig. 7). En sammenligning mellem fig. 7 og fig. 5 viser, at der ikke er nogen forbindelse i det hydrolyserede SPS med ______________ ____ ,.4 ______,__________________
DK 152222B
- 18 - 10 - 15% i forhold til bindingen af SPS til sojaprotein.
En NMR-analyse af SPS, hvis fremstilling er gennemført som angivet i denne beskrivelse, afslører følgende approksimative sammensætning af SPS: 1) Gi-galacturonsyre i en mængde af ca. 45%, hvorved ca. 40% af den totale mængde ct-galacturonsyre er tilstede som methylester, 2) rhamnopyranose i en mængde på ca. 20%, 3) galactopyranose i en mængde på ca. 15% og 4) /^-xylopyranose i en mængde på ca. 20%.
Bestanddelene synes at foreligge i en struktur, der omfatter et rhamnogalacturonisk skelet og sidekæder af xylose og galactose.
Fuldstændig syrehydrolyse af SPS (8 timer i 1 N H2S04) og påfølgende TLC-analyse afslørede, at der også forelå mindre mængder af monosacchariderne fucose og ara-binose i det hydrolyserede SPS.
En HPLC-analyse af det SPS, der er nedbrudt af det SPS-ase-enzymkompleks, der dannes af CBS 101.43, viser én kraftig reduktion af molekylvægten. I overensstemmelse dermed viser NMR-spektret af det SPS,'der er nedbrudt som angivet i det foregående, at hovedparten af estergrupperne er forsvundet, og at også indholdet af xylose og galactose i det højeremolekylære materiale er fomindsket. NMR-spektret af den del af SPS-nedbrydningsproduktet, der bundfældes ved tilsætning af et volumen ethanol til volumen SPS-nedbryd-ningsprodukt, er af lignende art som NMR-spektret af SPS, med de før angivne modifikationer hvad angår estergrupperne og indholdet af xylose og galactose.
DK 152222 B
SEKTION 3.
- 19 - DOKUMENTATION FOR, AT=SPS OG APS ER FORSKELLIGE.
APS blev fremstillet som angivet i Agr.Biol.Chem., vol. 36, nr. 4, p. 544 - 550 (1972).
Herefter blev dette polysaccharid og SPS hydrolyseret med forskellige enzymer, hvorefter nedbrydningsblandingen blev gelkromatograferet på HPLC-udstyr, som angivet i sektion 2, "Karakterisering af SPS, især molekylvægtsfordeling deraf".
Mere detaljeret anført blev hydrolyserne gennemført ved behandling af 25 ml opløsning af enten 2% APS eller 2% SPS i 0,1 M acetatstødpude med pH 4,5 med 10 mg KRF 68 eller 30 mg Pectolyase. KRF 68 er et SPS-ase-præparat, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 1. Resultaterne fremgår af den følgende tabel.
Polysac- HPLC-gel- _Polysaccharid_ charid Enzym kromatogram Nedbrudt ikke nedbrudt APS Pectolyase fig. 8 x APS KRF 68 fig. 9 x SPS Pectolyase fig. 10 x SPS KRF 68 fig. 5 x
DK 152222 B
SEKTION 4.
- 20 - SCREENING FOR SPS-ASE-PRODUCERENDE MIKROORGANISMER.
Den mikroorganisme, som skal undersøges, inkuberes på et skråagarsubstrat med en sammensætning, som muliggør vækst af mikroorganismen. Efter initial vækst på skråagarsubstratet overføres mikroorganismen til et flydende hovedsubstrat, hvori den hovedsagelige carbon-kilde er SPS (fremstillet som angivet), hvori nitrogenkilden er NO^ , NH4+, urinstof, frie aminosyrer, proteiner eller andre nitrogenholdige forbindelser, og som yderligere indeholder en blanding af nødvendige salte og vitaminer, fortrinsvis i form af gærekstrakt. Sammensætningen af hovedsubstratet afhænger af mikroorganismen idet det væsentligste kriterium er, at hovedsubstratet skal være i stand til at understøtte mikroorganismens vækst og metabolisme. Når væksten har fundet sted i et passende tidsrum, af størrelsesordenen 1-7 dage, afhængigt af den pågældende mikroorganismes væksthastighed, analyserer man en prøve af gæringsvæsken for SPS-ase i henhold til den enzymatiske SPS-ase-bestemmelsesmetode, der beskrevet i denne beskrivelse, eller i henhold til en hvilken som helst anden SPS-ase-bestemmelsesmetode, der er tilpasset andre specifikke anvendelser af SPS-asen end anvendelsen som en bestanddel af et middel til nedbrydning af sojaremanens.
For at opnå en følsommere metode til bestemmelse af enzymatisk aktivitet kunne temperaturen sænkes til 40°C, og inkubationstiden kunne hæves til 20 timer under bestemmelsen af SPS-ase-akti vi teten, hvorved man bør
Hl fiiffp sntihiotika til finhctrafpf- fnr at imHna SnfpVf -ion.
SEKTION 5.
"21‘ DK 152222 B
KARAKTERISERING AF NOGLE SPS-ASE DANNENDE MIKROORGANISMER.
I henhold til den her angivne screening for SPS-ase-producerende mikroorganismer har det vist sig, at de mikroorganismer, der er anført i den øvre del af den nedenfor angivne tabel, er SPS-ase-producenter.
Tabellen omfatter også en stamme, der hører til arten Aspergillus japonicus, og som ikke er nogen SPS-ase-producent.
SPS-ase
Pr?di??.el2i-- Vor identi- Officiel Første
Asp. Asp. ficerende identifi- depone-
Ja Ni iaP°” acule- betegnelse cerende ringsår e-^ nicus atus betegnelse X x A 805 CBS 101.43; DSM 2344 1943 XX A 1443 I FO 4408? DSM 2346 1950 XX A 1384 ATCC 20236? D3M 2345 1969
En kort identifikation af de ovenfor angivne stammer kan findes i følgende kulturkataloger:
List of Cultures 1978 Centraalbureau voor Schimmel-cultures, Baarn, The Netherlands.
DK 152222B
- 22 -
Institute for Fermentation Osaka, List of Cultures, 1972, 5. udgave, 17 - 85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku,
Osaka 532, Japan.
The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14. udgave 1980, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852.
Alle stammerne i den ovenfor anførte tabel svarer nøjagtigt til den taksonomiske beskrivelse af arterne Asp. japonicus og Asp. aculeatus, som er beskrevet i The genus Aspergillus af Raper and Fenneil, 1965 (se især side 327 - 330).
SEKTION 6.
GENEREL BESKRIVELSE AF OVERLEJRINGSTEKNIK I FORBINDELSE MED IMMUNELEKTROFORESE.
En metode, som betegnes top-agar-overlejringsteknik, er udviklet af ansøgeren med henblik på identifikation af individuelle komponenter i et enzymkompleks ved krydset immun-elektroforese med et polyspecifikt antistof imod alle enzymkomponenter i enzymkomplekset. Metoden er baseret på den kendsgerning, at enzymer stadig er aktive efter den specifikke enzym-antistof-binding, eller med andre ord, at det aktive enzymcentrum ikke er identisk med positionen for enzym-antistof-bindingen. Enzym-antistof-komplekserne bundfældes som tydeligt definerede buer i gelen under elektroforesen. Gelpladen dækkes med opløselig SPS i et top-agarlag. Efter
DK 152222 B
- 23 - opvarmning til 45°C i 20 timer i en atmosfære med relativ fugtighed på 100% vil de buer, som udviser SPS-ase-aktivi-tet, foreligge som klaringszoner i SPS-dæklaget efter bundfældning med en blanding af lige volumina ethanol og acetone, når de betragtes mod en sort baggrund. Buer, der ikke har nogen SPS-ase-aktivitet, er usynlige.
SEKTION 7.
IMMUNELEKTROFGRETISK KARAKTERISERING AF SPS-ASE MED POLY-SPECIFIKT ANTISTOF OG OVERLEJRING.
Man immuniserede kaniner med det SPS-ase-holdige enzymkompleks, som fremkom ved fermentation af Aspergillus aculeatus CBS 101.43, som angivet i eksempel 1 (KRF 68), og det polyspecifikke antistof blev udvundet på i og for sig kendt måde. Ved hjælp af dette polyspecifikke antistof gennemførte man en krydset immunelektroforese af det enzymkompleks, der fremkom ved fermentation af Aspergillus aculeatus CBS 101.43 som angivet i eksempel 1 (KRF 68), som beskrevet i N.H. Axelsen et al., "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis", 6. optryk 1977. Der henvises til fig. 11, som viser de buer, der svarer til de forskellige proteiner, som er fremstillet af mikroorganismen. Ved hjælp af den tidligere beskrevne top-agar-overlejrings-teknik viser det sig, at det skraverede areal svarer til SPS-ase.
Hvis den før angivne hypotese, som involverer den antagelse, at SPS-ase består af mindst to enzymer, er korrekt, er det skraverede areal det areal, hvori alle de enzymer, der er ansvarlige for SPS-ase-aktiviteteiv er til stede. Hvis disse enzymer i andre udførelsesformer for opfindelsen ved immunelektroforesen skulle være separeret nS An ima^A af 4 Wa ΛtaVVar f al 1 ae anaal
DK 152222 B
- 24 - kan en del af SPS-ase-aktiviteten alligevel identificeres ved hjælp af immunelektroforese, når man bruger en overlejring med både SPS og en kommerciel pectinase.
SEKTION 8.
RENSNING AF ET SPS-ASE-PREPARAT.
Rensningen af SPS-ase-præparatet KRF 92 (jfr. eksempel 1) blev udført ved ionbytning. Stødpuden er 50 mM Tris (tris-hydroxymethylaminomethan), hvis pH er indstillet på 7,0 med HCl. Søjlen er K 5/30 fra Pharmacia, Sverige. Ionbytningsmaterialet er DEAE-trisacryl fra LKB, Bromma,
Sverige (300 ml). Strømningshastigheden er 100 ml/time.
15 g af SPS-ase-præparatet KRF S2 blev opløst i 450 ml H2O ved 6°C, og alle de i det følgende angivne operationer blev gennemført mellem 6°C og 10°C. pH blev indstillet på 7,0 med 1 M Tris. Søjlen blev ækvilibreret med stødpuden, og derpå blev SPS-ase-prøven indført på søjlen.
OD280 og konduktiviten blev målt på eluatet, idet der henvises til fig. 12. Fraktion 1 er det eluat, der ikke er bundet til ionbyttermaterialet. Derpå vaskes søjlen med 2000 ml stødpude, hvilket giver anledning til fremkomsten af fraktion 2. Nu etableres der en 0 - 500 mM NaCl-gradient, hvilket giver anledning til dannelsen af fraktionerne- 3-9. Alle ni fraktioner blev koncentreret til 200 ml og dialyseret mod vand til en konduktivitet af 2 mSi ved hjælp af dialyse (Hollow Fiber DP 2 fra Amicon, Massachusetts, O.S.A.). Derpå blev de ni fraktioner frysetørret. Kun fraktionerne 1 og 2 udviste SPS-ase-aktivitet.
DK 152222B
- 25 -
Fraktion 1 blev yderligere renset ved gelfiltrering. 1,5 g af fraktion 1 blev opløst i 10 ml 50 mM natriumacetat med pH 4,5 (500 mK KC1). Søjlen er 2,5 x 100 cm fra LKB. Fyldstofmaterialet i gelfiltreringen er Sephacryl S-200 fra Pharmacia, Sverige. Strømningshastigheden er 30 ml/time. De fraktioner, der indeholder materialer med molekylvægte mellem 70.000 og 100.000, i henhold til kalibrering med globulære proteiner, indeholdt et enzymkompleks, som betegnes faktor G, og som ikke kan nedbryde SPS, når man undersøger i henhold til den kvalitative agartest; imidlertid nedbrydes SPS under udførelsen af den kvalitative agarprøve, når man blander faktor G med en pectinase.. Det har vist sig, at faktor G kan fraspalte galactose, fucose og noget galacturonsyre fra SPS, men størstedelen af nedbrydningsproduktet er i henhold til HPLC-analysen stadig et højmolekylært produkt, som har stor lighed med SPS.
SEKTION 9.
pH-AKTIVITETSAFHÆNGIGHED, TEMPERATUR-AKTIVITETSAFHÆNGIGHED OG STABILITET AF EN SPS-ASE.
Fig. 13 viser pH-aktivitets-afhængigheden af SPS-ase-præparatet KRF 68. Fra pH 2,7 til pH 3,5 anvendtes et myresyre-stødpudesystem, og fra pH 3,7 til 5,5 anvendtes et acetat-stødpudesystem.
Fig. 14 viser temperatur-aktivitets-afhængighed af SPS-ase-præparatet KRF 68.
Fig. 15 viser temperatur-stabiliteten af SPS-ase-præparatet KRF 68.
DK 152222B
- 26 - SEKTION 10.
Μ2ΪΜΤΜΕ MTIYITET3DE3TBMj5ERi
Den nedenfor angivne tabel er en oversigt'over de forskellige enzymatiske aktivitetsbestemmelser, som har relation til opfindelsen.
Definition af aktivitetsenhed og beskrivelse af enzymatisk aktivitetsbestemmelse ----,-
Beskrevet
Art af akti- senere vitet, kort Offent- i denne ' betegnel- lig til-;beskrivel-
Enzym se gængelig se Reference SPS-ase SPS-ase x
Remanens- SRU x 1 solubili---:---- serende SRUM-120 x
Protease HUT x
Cellulase C x 2 Λ _ PU x 3 PGE x 4
Pectinase----— UPTE x 5 PEE x 6
Hemicel- 7 lulase ___
De referencer, som er angivet i den sidste søjle .i den ovenfor angivne tabel, er beskrevet detaljeret i den følgende tabel.
DK 152222B
- 27 -
Referencen kan rekvireres fra NOVO INDU- Schwei-STRI A/S, zerische Novo Allé, Ferment ; 2880 Bag- AG, Ba-
Reference Identifikation af sværd, sel, Et bib- nr. reference Danmark Schweiz liotek , Analyseforskrift AF 154/4 fra 1981- x 12-01
Analytical Biochemistry 84, 522 - x 2 532, (1978)
Analytical method AF 14 9/6-GB fra x 1981-05-25
Determination of Pectinase Activi- 3 ty with Citrus x
Pectin (PU) fra 23.3.1976
Viskosimetrische . Polygalacturonase-
Bestimmung (PGE) X
fra 10.11.1977
Bestimmung der c Pectintranseli- minase (UPTE/g) x fra 24.Sept.1975
Determination of the Pectineste- 6 rase activity x
(udateret) med initialerne WJA/GW
_ Analytical method
' AF 156/1-GB X
I relation til cellulaseaktivitetsbestemmelsen kan det bemærkes, at analysen blev gennemført som angivet i AF 149/6-GB, og at principperne for bestemmelsen er forklaret i Analytical Biochemistry.
DK 152222B
- 28 - SEKTION 10 a.
ENZYMATISK BESTEMMELSE AF SPS-ASE.
Den enzymatiske bestemmelse af SPS-ase gennemføres i to trin, nemlig en kvalitativ agarplade-test og en kvantitativ SPS-ase-aktivitetsbestemmelse baseret på måling af mængden af totalt frigjort sukker. Hvis den kvalitative agarplade-test er negativ, er SPS-ase-aktiviteten lig nul, uanset den værdi, der hidrører fra den kvantitative SPS-ase-aktivitetsbestemmelse. Hvis den kvalitative agarplade-test er positiv, er SPS-ase-aktiviteten lig den værdi, der hidrører fra den kvantitative SPS-ase-aktivitetsbestemmelse.
I. Kvalitativ agarplade-test.
Man fremstillede en SPS-agarplade på følgende måde. En stødpude (B) fremstilles ved at indstille pH af en 0,3 M eddikesyre på en værdi af 4,5 ved hjælp af 1 N NaOH.
1 g SPS opløses i 20 ml B. 1 g agarose (HSB Litex) blandes med 80 ml B og opvarmes til kogepunktet under omrøring. Når agarosen går i opløsning, tilsættes SPS-opløsningen langsomt. Den resulterende 1% SPS-agarose-opløsning indføres i et vandbad på 60°C.
Pladerne støbes nu ved at hælde 15 ml af en 1% SPS-agarose-opløsning på en vandret glasplade med dimensionerne 10 cm x 10 cm.
Derpå udstanser man 9 huller med en afstand på 2,5 cm i det størknede lag af SPS-agarose.
I hvert hul indfører man 10 pi af en 1% opløsning af det enzymprotein, der skal undersøges for SPS-ase-aktivitet. Pladen inkuberes i 18 timer ved 50°c og med en relativ fugtighed på 100%. Nu bundfældes endnu ikke nedbrudt SPS med en opløsning af lige volumen-
DK 152222B
dele ethanol og acetone. SPS-ase-agar-pladetesten er positiv for en prøve, der er indført i et specifikt hul, hvis der omkring dette hul fremkommer en klar, ringformet zone.
II. Kvantitativ SPS-ase-aktivitetsbestemmelse.
Formålet med denne prøve er bestemmelsen af enzymatiske aktiviteter, som er i stand til at nedbryde SPS i et sådant omfang, at nedbrydningsprodukterne udviser en stærkt reduceret eller overhovedet ingen adsorptions- eller bindingsaffinitet til sojaprotein. Forsøg har vist, at den del af SPS-nedbrydningsprodukterne, som ikke bundfældes af en blanding af lige volumendele vand og ethanol, ikke har nogen adsorptionseller bindingsaffinitet til sojaprotein.
SPS-ase-bestemmelsen er baseret på en hydrolyse af SPS under standardbetingelser efterfulgt af en bundfældning af den del af SPS, som ikke er hydrolyseret, med ethanol. Efter bundfældningen bestemmer man indholdet af det kulhydrat, som ikke er bundfældet, ved kvantitativ analyse for totalt sukker (i henhold til AF 169/1, som kan rekvireres fra NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsværd).
Temperatur: 50°C
pH: 4,5
Reaktionstid: Kontrol 210 minutter, kun med substrat, efterfulgt af 2 minutter med tilsat enzym.
: Hovedværdi 212 minutter.
- 30 -
DK 152222 B
^Ξ£Υί£ίτ_2Π!ί 2 tter:
Rystevandbad termostatteret ved 50°C
Whirlimixer-omrører
Centrifuge
Isvandbad £222§2§2£52_omf§tter:
Stødpude : 0,6 M eddikesyre i afmineraliseret vand (a) 1,0 M NaOH (b)
Substrat : pH-værdien af 50 ml a indstilles til 4,5 med b, derpå tilsættes 4,0 g SPS, og efter opløsning af SPS bliver pH genindstillet på 4,5, og voluminet indstilles på 100 ml med afioniseret vand. Stopreagens: Absolut ethanol.
1 SPS-ase-aktivitetsenhed (SAE eller SPSU) er defineret som den SPS-ase aktivitet, som under de ovenfor angivne standardbetingelser frigør en så stor mængde kulhydrat, der er opløseligt i 50% ethanol, som er ækvivalent med 1 jamol galactose per minut.
Selvom den første del af enzymstandardkurven er en ret linie, bør det bemærkes, at den ikke skærer punktet 0,0.
SEKTION 10 b.
ENZYMATISK BESTEMMELSE AF REMANENS-SOLUBI LI SERENDE AKTIVITET ODTRYKT SOM SRUM 120.
Princip
Ved fremcanasmåden til bestemmelse af hvdrolvtisk - 31 -
DK 152222 B
aktivitet hydrolyseres den uopløselige del af affedtet, afproteiniseret og afskallet sojamel under standardbetingelser. Den enzymatiske reaktion standses med stopreagens, og den uopløselige del filtreres fra. Mængden af opløste poly-saccharider bestemmes"ad spektrofotometrisk vej efter syrehydrolyse i henhold til AF 169/1, som kan rekvireres frå NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsværd.
Man bestemmer både carbohydraser med endo- og med exo-aktivitet i henhold til denne metode.
Det substrat, som anvendes ved denne enzymatiske bestemmelse, er identisk med det remanens-substrat, der er beskrevet i forbindelse med SRU-metoden. Substratet opløses som en 3% opløsning i den nedenfor angivne citrat-stødpude: 0,1 N citrat-fosfat-stødpude med pH 4,5 5,24 g citronsyre-l-hydrat (Merck Art 244) 8,12 g dinatriumhydrogenfosfat-2-hydrat (Merck Art 6580)
Ad 1 1 med afmineraliseret ^0 pH 4,5 + 0,05 Stabil i 14 dage
Stopreagenset har følgende sammensætning:
100 ml 0,5 N NaOH
200 ml 96% ethanol
Skal holdes i køleskab indtil brug.
Standardbetingelser
Temperatur 50°C
pH 4,5
Reaktionstid, prøve 120 minutter - " - . , blindprøve 5 -
' 32 " DK 152222 B I
Enhedsdefinition
En sojaremanens-solubiliserende enhed (SRUM) 120 (M forkortelse for manuel) er den mængde enzym, der under de givne reaktionsbetingelser per minut frigør solu-biliserede polvsaccharider i en mængde, der eir ækvivalent med 1 ytmol galactose.
SEKTION 10 c.
ENZYMATISK BESTEMMELSE AF PROTEOLYTISK AKTIVITET.
HUT-metoden til bestemmelse af proteinase i surt medium.
Metoden er baseret på nedbrydningen af denatureret haemoglobin ved hjælp af enzymet ved 40® C og pH 3,2 i 30 min.
Det ikke nedbrudte hæmoglobin bundfældes med 14% trichloreddike-syre (vægt/volumen-%).
Alle enzymprøverne fremstilles ved at opløse dem i 0,1 M acetat-stødpude med pH 3,2.
Haemoglobinsubstratet fremstilles under anvendelse af 5,0 g lyophiliseret, bovint - hæmoglobinpulver, som er konserveret med 1% Thiomersalat og 100 ml afmineraliseret vand, som holdes under omrøring i 10 min., hvorefter pH indstilles på 1,7 med 0,33 N HC1.
Efter yderligere 10 min. omrøring indstilles pH .på 3,2 med 1 N NaOH. Voluminet af denne opløsning forøges til 200 ml med 0,2 M acetat-stødpude. Dette hæmoglobin-substrat skal afkøles, og i den afkølede tilstand vil det holde sig 5 dage.
- 33 -
DK 152222 B
Hæmoglobinsubstratet indstilles på stuetemperatur.
Ved tiden 0 tilsættes 5 ml substrat til et reagensglas, der indeholder 1 ml enzym. Efter rystning i 1 sekund indføres reagensglasset i et 40° C varmt vandbad, hvor det bliver i 30 min.
Efter nøjagtig 30 minutters forløb tilsættes 5 ml 14% trichlor-eddikesyre til reagensglasset, som derpå omrystes og indstilles på stuetemperatur, i hvilken tilstand det forbliver i 40 minutter.
Blindprøver fremstilles ved, at hæmoglobinsubstratet indstilles på stuetemperatur. Til tidspunktet 0 tilsættes 5 ml af substratet til et reagensglas, der indeholder 1 ml enzym. Efter omrystning i 1 sekund indføres reagensglasset i et 40° C varmt vandbad, hvor det forbliver i 5 min. Efter nøjagtig 5 minutters forløb tilsættes 5 ml 14% trichloreddikesyre til reagensglasset, som derpå omrystes og indstilles på stuetemperatur, i hvilken tilstand det forbliver i 40 minutter.
Efter 40 minutters forløb omrystes blindprøverne og prøverne, filtreres 1 eller 2 gange gennem Berzilius-filter nr. 0, og indføres i et spektrofotometer. Prøverne aflæses mod blindprøven ved 275 nm, idet man indstiller spektrofotometret mod vand.
Da absorbansen af tyrosin ved 275 nm er en kendt faktor, er det ikke nødvendigt at optegne en tyrosin-standard-kurve, med mindre det er påkrævet at kontrollere Beckman-spektro-fotometret.
1 HUT er den enzymmængde, som i løbet af 1 minut danner et hydrolysat, der hvad angår absorbans ved 275 nm er ækvivalent med en opløsning af 1,10 mikrogram tyrosin/ml i 0,006 N HC1. Denne absorbansværdi er 0,0084. Reaktionen skal foretages ved 40° C, pH 3,2 og i 30 minutter.
DK 152222B
- 34 - ΗϋΤ _ Prove - Blindprove Volumen i ml_ 0/0084 Reaktionstiden i minutter „r,m _ Prøve - Blindprøve „ 11 • HUT 0,0084 X Jo ~ (p " B) x 43'65 HUT/g enzym = i? ~ - 3 J g enzym i 1 ral
En undersøgelse af pH-stabilitets-afhængigheden af proteasen i KRF 68 udført ved hjælp af HUT-analysen med pH-værdier fra 2,0 - 8,0 viste, at stabiliteten af proteasen var meget lille over pH 8,0,jfr. fig. 16.
For at illustrere opfindelsen skal der henvises til dé følgende eksempler 1-8, hvor eksempel 1 illustrerer fremstillingen af SPS-ase, og hvor eksempel 2-8 illustrerer anvendelsen af SPS-ase med et på soja baseret råmateriale for at fremstille et renset, vegetabilsk protein. Andre anvendelser af SPS-ase fremgår af det afsnit, der ligger imellem eksempel 8 og figuroversigten.
- 35 -
DK 152222 B
Man gennemførte adskillige fermentationer med de her angivne stammer af Aspergillus aculeatus og Aspergillus japonicus i laboratorieskala. Herved fremkom der præparater, som indeholdt SPS-ase i henhold til den her angivne SPS-ase-test. Da man imidlertid kræver ret store mængder SPS-ase for at gennemføre anvendelsesforsøg, udførte man lignende fermentationer i pilot plant skala, jfr. det følgende eksempel 1.
Eksempel 1
Produktion af en SPS-ase i pilot plant skala.
En SPS-ase blev fremstillet ved submers fermentation af Aspergillus aculeatus CBS 101.43.
Et agarsubstrat med følgende sammensætning fremstilledes i en Fernbach-kolbe:
Pepton Difco 6 g
Aminolin Ortana 4 g
Glucose 1 g Gærekstrakt Difco 3 g Kødekstrakt Difco 1,5 g KH2P04 Merck 20 g
Maltekstrakt Evers 20 g
Ionbyttervand H20 ad 1000 ml pH blev indstillet på mellem 5,30 og 5,35. Derpå tilsattes 40 g agar Difco, og blandingen blev autoklaveret i 20 minutter ved 120°C (substratet benævnes E-agar).
DK 152222B
Stammen CBS 101.43 blev dyrket på et skråglas med E-agar (37°C). Sporerne fra skråglasset blev suspenderet i steriliseret skummetmælk, og suspensionen blev frysetørret i hætteglas. Indholdet i et frysetørret hætteglas blev overført til Fernbachkolben. Kolben blev " derpå inkuberet i 13 dage ved 30°C.
Et substrat med følgende sammensætning blev fremstillet i en 500 1 pode-f ermen tat ionsbeholder:
CaCO^ 1»2 kg
Glucose 7,2 kg
Rofec (tørstof fra maj sstøbevand) 3,6 kg
Sojabønneolie 1,2 kg
Man tilsatte ledningsvand til et totalt volumen på ca. 240 1. pH blev indstillet på ca. 5,5 før tilsætningen af CaCO^. Substratet blev steriliseret i podefermentationsbeholderen i 1 time ved 121°C. Det sluttelige volumen før podningen var ca 300 1.
Sporesuspensionen i Fernbach-kolben blev overført til pode-fermentationsbeholderen. Betingelserne for podefermentationen var som følger:
Type af fermentationsbeholder: Konventionel beluftet og omrørt fermentationsbeholder med et forhold højde/diameter på ca. 2,3.
Omrøringer: 300 omdrejninger/minut (to turbineskovle)
Beluftning: 300 normalliter luft/minut
Temperatur: 30 - 31°C
Tryk: 0,5 ato
Tid: Ca. 28 timer
-37- DK 152222B
Ca. 28 timer efter podning overførtes 150 1 fra podefermentationsbeholderen til hovedfermentationsbeholderen.
Man fremstillede et substrat med følgende sammensætning i en 2500 liter hovedfermentationsbeholder:
Ristet sojamel 90 kg KH2P04 20 kg
Pluronic® 150 ml
Der tilsattes ledningsvand til et totalt volumen på ca. 900 1. Det ristede sojamel blev suspenderet i vand. pH blev indstillet på 8,0 med NaOK, og temperaturen blev hævet til 50°C. Derefter tilsattes ca. 925 Ansonenheder af ALCALASE 0,6 L til suspensionen. Blandingen blev i 4 timer holdt ved 50°C og pH = 8,0 (tilsætning af Na2C03) uden beluftning, nul ato og en omrøring på 100 omdrejninger per minut. Derpå tilsattes de resterende substratbestanddele, og pH blev indstillet på ca. 6,0 med fosforsyre. Substratet blev steriliseret i hovedfermentationsbeholderen i 1½ time ved 123°C. Det sluttelige volumen før podningen var ca.
1080 liter.
Derpå tilsattes 150 liter podekultur.
Gæringsbetingelserne var:
Type af fermentationsbeholder: Konventionel beluftet og omrørt fermentationsbe-holder med et forhold højde/diameter på ca. 2,7.
Omrøring: 250 omdrejninger/minut (to turbineskovle)
Beluftning: 1200 normalliter luft per minut.
Temperatur: 30°C
Tryk: 0,5 ato
-38- DK 152222B
Fra den 24. fermentationstime til ca. den 116. fermentationstime tilsattes pectinopløsning aseptisk til hovedfermentationsbeholderen med en konstant hastighed af ca. 8 liter per time. Pectinopløsningen med følgende sammensætning blev fremstillet i en 500 1 doseringstank.
χ\
Pectin genu ' 22 kg
Koncentreret fosforsyre 6 kg
Pluronic® 50 ml 'Genu pectin (NF af citrustypen fra Københavns
Pectinfabrik) .
Man tilsatte ledningsvand til et totalt volumen af ca. 325 liter. Substratet blev steriliseret i doseringstanken i 1 time ved 121°C. Det sluttelige volumen før doseringens påbegyndelse var ca. 360 liter. Når denne portion var opbrugt, fremstilledes en anden, lignende portion. Det totale volumen af pectinopløsningen til en gæring var ca.
725 liter.
Efter ca. den 151. fermentationstime blev fermentationen afbrudt. De ca. 1850 liter kulturvæske blev afkølet til ca. 5°C, og enzymerne blev udvundet i henhold til følgende metode.
Kulturvæsken blev tromlefiltreret på et vakuum-tromlefilter (Dorr Oliver) , der var forovertrukket med diatoméjord (Hy-flo-super-cel, filterhjælpemiddel). Filtratet blev koncentreret ved fordampning til ca. 15% af kulturvæskens volumen. Koncentratet blev filtreret på en Seitz-filterplade (type supra 100) med 0,25% Hy-flo-super-cel som filterhjælpemiddel (i den følgende tabel betegnet filtrering I). Filtratet blev bundfældet med 561 g NH4S04/1 ved pH 5,5, og der tilsættes 4% diatomejord (Hy-flo-super-cel) som filterhjælpemiddel. Bundfaldet og filterhjælpemidlet separeres ved filtrering på et varroefilter. Filterkagen
-39- DK 152222 B
opløses i vand, og uopløselige dele separeres ved filtrering på et rammefilter. Filtratet blankfiltreres på en Seitz-filterplade (type supra 100) med 0,25% Hy-flo-super-cel som filterhjælpemiddel (i den følgende tabel betegnet filtrering II). Filtratet diafiltreres på et ultrafiltreringsapparat. Efter diafiltrering bliver væsken koncentreret til et tørstofindhold af 12,7% (i den følgende tabel betegnet tørstofindhold i koncentrat).
Man kan på dette stadium gennemføre en fakultativ basebehandling med henblik på partiel fjernelse af proteaseaktiviteten. Når man gør brug af basebehandlingen, gennemføres den ved pH på 9,2 i en time, hvorefter pH-vær-dien indstilles på 5,0.
Nu bliver væsken blankfiltreret og filtreret med henblik på kimtalsreduktion, og filtratet frysetørres på et frysetørringsapparat fra Stokes. Man gennemførte fire fermentationer på den i det følgende angivne måde, hvorved den stamme, der anvendes til fermentationen, anvendelsen af den fakultative basebehandling og andre parametre blev varieret, som angivet i den følgende tabel.
Tør-
Koncentration (%) af stof-filterhjælpaniddel i ind-forbindelse med hold 5^“ Fil- Bund- Fil- ,1 _ Basebehandling P3 tre- fæld- tre- on In?r" ** —^ΓΰΧ.— ν*ϊτγ"τ T niTifron ύ“ίτίπ XT CøTl" ΠΙΏ""
Mikroorganisme Anvendt Ikke anvendt kode 103 9 3 trat ger CBS 101.43 x KRF 68 0.5 5 0.2 28 ATOC 20236 x KRF 74 2.0 4 0.4 7.5 IPO 4408 x KRF 83 1.0 5 0.25 12.4 x) CBS 101.43 x KFR 92 0.25 4 0.25 12.7 Y Λ
Efter filtrering med henblik på kimtalsreduktion koncentreres filtratet ved fordampning i et forhold på 1:2,3. En mindre del af det koncentrerede filtrat blev sprøjtetørret, og den resterende del blev frysetørret.
DK 152222 B
For yderligere at reducere proteaseaktiviteten blev nogle af de ovenfor angivne præparater behandlet som angivet i det følgende, hvorved man kun anvendte et af de tre alternativer A, B og C.
A. 100 g SPS-ase-præparat opløses i 1 liter af-ioniseret vand under omrøring ved 10°C + 2°C. pH indstilles på 9,1 med 4N NaOH. Denne basebehandling gennemføres i 1 time. pH-værdien indstilles derpå til 4,5 med iseddikesyre, og der dialyseres mod iskoldt, afioniseret vand til en konduktivitet af 3 mSi. Derpå fryses og frysetørres.
B. 500 g SPS-ase-præparat opløses i 4 liter afioniseret vand under omrøring ved 10°C + 2°C. pH indstilles på 9,1 med 4NNaOH. Denne basebehandling gennemføres i 1 time. pH-værdien indstilles derpå på 5,0 med iseddikesyre. Det fremkomne materiale frysetørres.
C. 50 g SPS-ase-præparat opløses i 400 ml afioniseret vand under omrøring ved 10°C + 2°C. pH indstilles til 9,1 med 4 N NaOH. Denne basebehandling gennemføres i 1 time.
Derpå reduceres pH til 5,7 med iseddikesyre. Det fremkomne materiale frysetørres.
SPS-ase-præparat anvendt Anvendt basesom udgangsmateriale til behandling Præparat- basebehandlingen ABC kode
KRF 68 x KRF 68 BII
KRF 68 X KRF 68 Bill
KRF 92 x KRF 92 BI
De ovenfor angivne præparater karakteriseres i den følgende tabel ved aktiviteterne af de enzymer, der har relevans til opfindelsen.
-41- DK 152222 B
|—| οΓ-ΟΓ-ίΝΟΟΟΟΟ cQ mmmocrvooocno ^rr-omoooo'M-r-o ro + rH ro Ο CO (Μ Μ
σ, ο VD ΙΟ V
vo r~ [U ^ ¢21 PS _____________ ιονοοοοοοοοο
r-{N^rvooooooo + VO VO Cl t''· O OOOO
{N r-ilOLDOO^iHO
C\ O VO O
*3* H
(i, 00 Ή
Pi PS .___________- oororoooooooo
VOCOLnOO’OOOCTlO
rHlOr-OOOOVDOVDO
ro+ cm co o r- o
CO rH O VO (N O
in n cm
h r- N
Pi PS__________
OCMCOOOOOOOO
rrr'CocMOoror-o rHinvOrOOrHHfOO rg- rH rH Ο «3< ιΠ ΙΑ
p·* i H VO
oo
Ph
Pi
Pi σίΓ-Ηοσινοοοοοο H ^rcocMcoovooor^o Η ΓΟΤΓ'ΓΠΓΟΟΓ^σίΓ'Ο Η Η Ον Ο t-~ νο o fQ Ο t" Γ"· o + oo o
00 CO <-H
vo δ PS____________ rHf~Oin«3<00000
H OOVOO'O’OOOHO
h ηιηιηι-Ηοοοι^σνο CQ H 00 o CM m o + o r- oo o
00 OH
vo σ> H
!u
Pi {4__________ or-inooooooo
inncNOOOOO*TO mr'HOOO'3'HOOO 00+ CM CO O CT> 00 O
VD VO Ο Η Γ~ O
m η vd
t. OH
2 H
Pi O' +>
W
>H 0 0) +> >
+» iH
<U jj +> +» ω « •rl m +1
> 4J rl CM
•H 0) +> +» Ό C cn X (0 « o id h > cm æ É o< p« η a
& —£— s w D
N WDDH WEhWU
c *£ pipio XDOPiWa:
' 42 ' DK 152222 B
Eksempel 2 (anvendelseseksempel)
Dette eksempel beskriver produktionen af et p.v.p. fra et afskallet og affedter sojamel, "Sojamel 13" (kommercielt rekvirerbart fra Aarhus Oliefabrik A/S). Tørstofindholdet af dette mel var 94,0%, og indholdet af (N x 6,25) på tørstofbasis var 58,7%. Sojamelet blev behandlet med SPS-ase-præparatet KRF 68 BII (eksempel 1) på følgende måde: 85,2 g af sojamelet blev suspenderet og holdt under omrøring ved 50°C i 664,8 g vand, og pH blev indstillet på 4,5 ved hjælp af 7,5 ml 6 N HC1. 50 g af en opløsning indeholdende 4,00 g af det angivne SPS-ase-præ-parat blev tilsat, og reaktionsblandingen blev derpå holdt under omrøring i 240 minutter ved 50°C. Blandingen blev derpå centrifugeret i en laboratoriecentrifuge (Beckman Model J-6B) i 15 minutter ved 3000 x g. Super-natanten blev vejet og analyseret for Kjeldahl N og tørstof. Den faste fase blev derpå vasket med et volumen af vand, der var ækvivalent med massen af supernatant fremkommet ved den første centrifugering. Denne operation blev gennemført to gange. Den faste fase blev derpå frysetørret, vejet og analyseret for Kjeldahl N og tørstofindhold i Ovist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Danmark. Dette laboratorium er statsautoriseret for analyser af foderstoffer og mejeriprodukter. De ved forsøgene opnåede resultater fremgår af tabel 2.1:
Tabel 2.1 Opnåede resultater
Masse, N x 6,25 Tørstof Udbytte af Udbytte af Komponent g % % protein, % tørstof, %
Sojamel 85,2 55,2 94,0 100% 100% SPS-ase præparat 4,00 75,6 - 6,4% - 1. Centrifugat 666 1,50 5,04 21,2% 42,0% p.v.p. 44,5 87,5 95,7 82,7% 53,2% - 43 -
DK 152222 B
Der opnåedes således et p.v.p. med en proteinrenhed, d.v.s. N x 6,25 på tørstofbasis, på 91,4%, og med et totalt proteinudbytte på 83%.
Eksempel 3 (anvendelseseksempel)
Dette eksempel blev gennemført for at sammenligne proteinudbytterne, næringskvaliteten og visse funktionelle egenskaber af sojaproteinprodukter fremstillet under anvendelse af følgende tre metoder: A: Den traditionelle isoelektriske bundfældning til fremstilling af sojaproteinisolat.
B: Den traditionelle isoelektriske vask til fremstilling af sojaproteinkoncentrat.
C· Den isoelektriske vask omfattende et remanens-solubiliserende enzym til fremstilling af p.v.p.
For at frembringe en sand sammenligning mellem fremgangsmåde (C) og de konventionelle sojaproteinprocesser (A og B) har man i alle tre tilfælde anvendt det samme råmateriale. Desuden er forsøgene blevet gennmeført på en sådan måde, at tilsvarende temperaturer og behandlingstider er de samme i alle tre tilfælde. Det var kun pH-værdierne, der var forskellige p.g.a. de fundamentale forskelle mellem de tre forsøg.
A. Den traditionelle isoelektriske bundfældning til __fremstilling af sojaproteinisolat._.
425,8 g sojamei (Sojamel 13 produceret af Aarhus Oliefabrik A/S) blev ekstraheret i 3574,2 g ledningsvand ved - 44 -
DK 152222 B
50°C. pB blev indstillet på 8,0 med 20,1 g 4N NaOH. Efter omrøring i 1 time blev opslemningen centrifugeret ved 3000 x g i 15 minutter under anvendelse af fire ét-literbægre i en laboratoriecentrifuge (Beckman Model J-6B). Man vejede centrifugat I og bundfald I. Bundfald I blev genekstraheret med vand til en total vægt af 4000 g. Temperaturen blev holdt på 50°C, pH blev indstillet på 8 med 4N NaOH, og opslemningen blev holdt under omrøring i 1 time. Man gennemførte en centrifugering og vejning af centrifugat II og bundfald II som ovenfor angivet. Man udtog prøver fra centrifugat I og II og bundfald II med henblik på Kjeldahlbestemmelser og tørstofbestemmelser. Herefter blev centrifugaterne I og II blandet og holdt ved 50°C. Proteinet blev derpå isoelektrisk bundfældet ved pH 4,5 ved hjælp af 45 g 6N HC1. Efter omrøring i 1 time ved 50°C blev proteinet udvundet ved centrifugering ved 3000 x g i 15 minutter. Centrifugat III blev vejet og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Den faste fase III blev vejet og vasket med vand i en mængde svarende til vægten af centrifugat I. Vaskningen blev gennemført ved omrøring i 1 time ved 50°C. Det vaskede protein blev udvundet ved centrifugering ved 3000 x g i 15 minutter. Centrifugat IV og den faste fase IV blev vejet. Centrifugat IV blev analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Den faste fase blev suspenderet i 1550 g vand ved 50°C, og pH blev indstillet på 6,5 med 17 g 4N NaOH.
Blandingen blev holdt under omrøring i 1 time, og om nødvendigt blev pH genindstillet på 6,5. Slutteligt blev produktet frysetørret, vejet og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Massebalanceberegningerne er vist i tabel 3.1.
'45‘ DK 152222 B
Tabel 3.1 Massebalanceberegninger i forbindelse med den traditionelle isoelektriske bundfældning til fremstilling af sojaproteinisolat.
Masse af Protein, Tør- Udbytte Udbytte Operationer fraktion, % stof, af pro- af tør- og fraktioner g (N x 6,25) % tein, % stof, %
Ekstraktion:
Sojamel 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 '
Vand 3574,2 0 00 0 4 NNaOH__20,1__0__16,0 0__0,8 1. Centrifugering: £ 4020,1__5_£_9__10,0 100,9 100,4
Centrifugat I 3141,0 4,4 6,9 58,8 54,1
Bundfald I__805,0__-__-__-__-_
Gen-ekstrak tion:
Bundfald I 805,0 - -
Vand__3195,0__0__0__0__0 2. Centrifugering:
Centrifugat II 3104,0 0,5 0,9 6,6 7,0
Bundfald II__820,0_____17,2 31,7__35,2
Blanding og syrning:
Centrifugater I + II 6245,0 - - 6N HC1__45,0__0__21,3 0__2,4 3. Centrifugering: Σ 6290,0
Centrifugat III 5650,0 0,3 1,9 7,2 26,8
Bundfald III__308,0__-_ -__-__-_
Vask:
Bundfald III 308,0 - - -
Vand__3141,0__0__0__0__0 4. Centrifugering: Σ 3449,0
Centrifugat IV 3113,0 0,04 0,15 0,5 1,2
Bundfald IV__291,0__"_ -__g__-_
Neutralisation:
Bundfald IV 291,0 -
Vand 1550,0 000 0 4 NNaOH__17,0__0_ 16,0 0__0,7 - 46 -
DK 152222 B
B. Den isoelektriske vask til fremstilling af soja- _proteinkoncentrat._ 425,6 g sojamel (Sojamel 13 fremstillet af Aarhus Oliefabrik A/S) blev vasket i 3574 g vand ved 50°C. pH blev indstillet på 4,5 med 44,8 g 6 NHC1. Vasken blev gennemført i 4 timer under omrøring. Omrøringen blev derpå centrifugeret ved 3000 x g i 15 minutter i en laboratoriecentrifuge (Beckman Model J-6B) under anvendelse af fire ét-liter bægre. Centrifugat I blev vejet og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Den faste fase I blev vejet og genvasket med vand til en totalvægt af 4000 g. pH blev genindstillet på 4,5 med 1,7 g 6N HC1, og opslemningen blev holdt under omrøring i 30 minutter ved 50°C. Man gennemførte en centrifugering og vejning af centrifugat II og tørstofferne II som ovenfor angivet. Den faste fase II blev resuspenderet i 1575 g H20 ved 50°C, og pH blev indstillet på 6,5 med 34,5 g 4N NaOH. Blandingen blev holdt under omrøring ved 50°C i 1 time, og om nødvendigt blev pH genindstillet til 6,5. Slutteligt blev proteinproduktet frysetørret, vejet og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Massebalancen er vist i tabel 3.2.
DK 152222B
Tabel 3.2 Massebalanceberegninger i forbindelse med den isoelektriske vask til fremstilling af soja-proteinkoncentrat.
Masse af Protein, Tør- Udbytte Udbytte
Operationer fraktion, % stof, af pro- af tør- og fraktioner g (N x 6,25) % tein, % stof, %
Vask:
Sojamel 425,S 55,2 94,0 100,0 100,0
Vand 3574,0 000 0 6 H HC1__44,8__0__21,3__0__2,4 1. Centrifugering: Σ. 4044,6 -
Centrifugat I 3150,0 0,6 3,2 8,0 25,2 Tørstoffer I__846,0__-__-__-__-____
Genvask: Tørstoffer I 846,0 -
Vand 3154,0 000 0 6 NHC1__1/7__0__21,3__0__0,1 2. Centrifugering: Σ 4001,7
Centrifugat II 3130,0 0,1 0,4 1,3 3,2 Tørstoffer II 863,0__-__-__-__2__
Neutralisering: Tørstoffer II 863,0 - -
Vand 1575,0 000 0 4 N NaOH__34,5__0__16,0__0__1,4 Tørring: Pulver! 281,0 72,5 98,4 | 86,7 69,1 C. Den isoelektriske vask omfattende et remanens-so- _lubiliserende enzym til fremstilling af p.v.p.
425,8 g sojamel (Sojamel 13 fremstillet af Aarhus
Oliefabrik A/S) blev vasket i 3524,2 g vand ved 50°C. pH
blev indstillet på 4,5 under anvendelse af 43,7 g 6N HC1.
' 48 ' DK 152222B
24 g af SPS-ase-præparatet KRF 68 Bill (eksempel 1) blev opløst i 26 g vand og tilsat til vaskeblandingen.
Derpå blev rensningen gennemført som beskrevet for B, idet mængderne af 6 N HC1, 4 N NaOH og vand til resuspension er de eneste parametre med afvigende værdier. Massebalancen er vist i tabel 3.3.
Tabel 3.3 Massebalanceberegninger i forbindelse med den isoelektriske vask omfattende et remanens-so-lubiliserende enzym til fremstilling af p.v.p.
Masse af Protein, Tør- Udbytte Udbytte Operationer fraktion, % stof, af pro- af tør- og fraktioner g (N x 6,25) % tein, % stof, %
Vask:
Sojamel 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0
Vand 3540,2 0 000 6N HC1 43,7 0 21,3 0 2,3 SPS-ase:KKF 68
Bill__24,0__75,3__96,0__7^7__5,8 1. Centrifugering: 4043,7 - -
Centrifugat I 3420,0 1,7 5,2 24,7 44,4 Tørstoffer I 620,0__-__-__-__-_
Genvask: Tørstoffer I 620,0 - -
Vand 3380,0 0000 6N KCl__2^_3__0__21,3__0__0,1 2. Centrifugering: 4001,3
Centrifugat II 3400,0 0,2 0,6 2,9 5,1 Tørstoffer II 577,0__2!__I__I__I_
Neutralisering: Tørstoffer II 577,0 - -
Vand 1700,0 0 000 4N NaOH__25,3__0__16,0__0__1.0 Tørring: Pulver 211,0 87,3~j 96,7«! 78,2 51,1 _ 86,9^' i 97,0z;|__ 1) Analyseret i Det Biotekniske Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding, Danmark 2) Analyseret i Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C, Danmark.
"49" DK 152222B
Naringsvardimæsslge egenskaber
Man bestemte aminosyresammensætningerne af de tre proteinprodukter, jfr. tabel 3.4. Det totale indhold af essentielle aminosyrer, det kemiske karaktertal og index for essentielle aminosyrer (EAAI) beregnes under anvendelse· af FAO Reference Pattern fra 1957.
Indholdet af trypsininhibitor i de tre produkter blev bestemt ved hjælp af den metode, der er beskrevet i A.O.C.S. Tentative Method Ba 12 - 75 (A.O.C.S. er en forkortelse for American Oil Chemists' Society). Resultaterne er vist i tabel 3.5, der også inkluderer udbytterne og forholdene protein/tørstof i de tre produkter.
" 50 ' DK 152222B
Tabel 3.4 Aminosyresammentsætning og næringsværdimæssig evaluering af de tre proteinprodukter A., B og P C. s 1 ----j----- —f A. Sojaprotein- B. Sojaprotein- C. Sojaprotein- \ ! isolat koncentrat isolat (p.v.p.) \ I Aminosyre g/16 g J aa5P g/16 g s| aas11 g/16 g k| aas'11 j
Ikke-essentielle:
Asparaginsyre 12,4 - 11,3 - 11,9
Serin 4,62 - 4,69 - 4,81 -
Glutaminsyre 21,3 - 18,2 - 17,7
Prolin 6,07 - 5,19 - 4,76
Glycin 4,13 - 4,26 - 4,33
Alanin 3,54 - 4,27 - 4,55 jHistidin 2,83 - 2,78 - 2,50
Arginin 8,09 - 7,57 - 7,04 SEssentielle:
Isoleucin 4,87 >100 4,97 >100 5,19 >100
Leucin 7,80 >100 7,98 >100 8,09 >100
Lysin 6,24 >100 6,09 >100 5,57 >100
Phenylalanin 5,47 io3 10Q 5,35 400 >10Q 5,17 io^>]_oo lyrosin 3,38 >10(J 3,88 >100 4,44 >i0y Q-stin 1,29 64,a 56)4 1,32 66,01 1,44 72,9
Methionin 1,08 49,1 1,21 55,0 1,31 59,5|
Ihreonin 3,10 >100 3,60 >100 3,97 >100
Tryptophan 1,06 75,7 1,37 97,9 1,32 94,3
Valin 4,90 >100 5,23 >100 5,57 >100 % totalt indhold af essen— ^ .. .. . 38,36 41,31 42,21 tielle ammo- syrer
Kemisk karaktertal 56,4% 60,2% 65,5% EAAI 86,7% 90,2% 91,3% aas = aminosyre-karaktertal (amino acid score) baseret på FAO reference pattern (1957) - 51 -
DK 152222 B
Tabel 3.5 Procesegenskaber og indhold af trypsininhibitor i forbindelse med de tre proteinprodukter A, B og C.
A. Sojaprotein- B. Sojaprotein- C. Sojaprotein-isolat koncentrat isolat (p.v.p.)
Proces- W?s?o? 1 97'4i 73'7* 90'0% egen" Protein- skaber | udgytte S1·1* 86'7S 78'2% rer^TUI/c^produkt 34·000 21·000 19‘000 TUI/g protein 36.250 28.970 21.810
Funktionelle egenskaber
Niti22§2§2iB^ilitetsindex (NSI) blev bestemt i en 1% proteindispersion med pH = 7,0 i henholdsvis 0,2 M NaCl og destilleret vand. Efter omrøring i 45 minutter med en magnetisk omrører blev suspensionen centrifugeret ved 4000 x g i 30 minutter, og supernatanten blev analyseret for nitrogen. Nitrogen-opløseligheden blev beregnet som (% opløseliqt N/% total N). Resultaterne af denne evaluering af de tre produkter er vist i tabel 3.6.
blev bestemt tre gange på hvert produkt ved en let modificeret Swift titrering. 4,0 g (N x 6,25) af produktet blev blandet i 250 ml 0,5 M NaCl med en Sorval Gmnimixer ved lav hastighed. 50 ml af suspensionen blev overført til en glasblandebeholder, og der blev tilsat 50 ml sojabønneolie. Herefter vejedes den totale blanding. Olie-i-vand-blandingen blev derpå homogeniseret ved 10.000 omdrejninger/minut, medens beholderen var placeret i et isbad. Der tilsattes en supplerende mængde sojabønneolie med en hastighed af 0,3 ml per sekund, οτηπΐ βΐ nnen Vnl 1 aKorer. Den tntalp mspnodp hl i p. Rom
DK 152222 B
Emulgeringskapacitet blev beregnet som ml olie per g protein (N x 6,25). Det blev antaget, at oliens massefylde var 0,9 g/ml.
De gennemsnitlige resultater af bestemmelsen af emulgeringskapaciteten af de tre produkter er vist i tabel 3.6.
blev bestemt i en 3% proteinopløsning ved pH = 6,5. 250 ml af den vandige dispersion af proteinprøverne blev pisket med hastighed III i fire minutter i en Hobart-blander (model N-50) , hvori der var monteret et piskeris. Piskeekspansion blev beregnet i henhold til formlen
Piskeekspansion = x 100%, hvor V = slutteligt piskevolumen i ml.
V blev målt ved efterfølgende indfyldning af vand i blandebeholderen. Man udførte dobbeltforsøg i forbindelse med hver af de tre prøver. De gennemsnitlige resultater er vist i tabel 3.6.
Skumstabiliteten blev bestemt som forholdet mellem mængden af det skum, som blev tilbage efter dræning i 30 minutter, og den oprindelige skummængde. 1 g skum fremstillet under anvendelse af den ovenfor angivne metode blev indført i en formstofcylinder (diameter 7 cm, højde 9 cm) med et trådnet med en maskestørrelse på 1 mm x 1 mm. Cylinderen blev anordnet på en tragt ovenpå en glascylinder, og vægten (B) af drænet væske i glascylinderen bestemmes. Skumstabiliteten FS bestemmes ved hjælp af formlen FS = ft-:-* x 100% .
A
DK 152222
Resultaterne af bestemmelsen er vist i tabel 3.6.
er ^ denne beskrivelse defineret som Brookfield-viskositeten målt ved hjælp af T-spindler på et Brookfield Helipath stativ. Gelerne blev fremstillet ved varmebehandling af 12% proteinsuspensioner i 0,5 M NaCl. Varmebehandlingen blev gennemført i lukkede dåser, der havde en diameter på 7,3 cm og en højde på 5,0 cm, og som blev anbragt i vandbade, hvis temperatur blev holdt på 80°C og 100°C, i 30 minutter.
Dåserne blev afkølet og termostatteret til 20°C, før de blev åbnet og målt. Resultaterne af målingerne er vist i tabel 3.6.
Tabel 3.6 Funktionelle egenskaber af de tre proteinprodukter A, B og C.
Funktionalitet A. Sojaprotein- B. Sojaprotein- I C. Sojaprote n- isolat koncentrat isolat (p.v.;; . } % NSI i 0,2 M NaCl 39,5 20,3 25,6 % NSI i vand 53,9 25,1 28,6
Emulgeringskapacitet: ml olie/g 218 182 354 (N x 6,25)
Piskeekspansion, % 120 120 340
Skumstabilitet, % 50 .50 20
Gelstyrke (poise) 80°C (0,5 M NaCl) 1,7 x 10* 1,2 x loj 3,3 x 10* 100°C (0,5 M NaCl) 2,0 x 10* 4,0 x 10* 1,3 x 10*
DK 152222B
Eksempel 4 (anvendelseseksempel)
Man fremstillede et p.v.p. i henhold til den i eksempel 3 C angivne metode med undtagelse af, at cellu-laseaktiviteten delvist hidrørte fra Trichoderma reseei.
Det kommercielle cellulasepræparat CELLUCLAST fremstillet af NOVO INDUSTRI A/S blev behandlet med en base ved lav temperatur på følgende måde. pH-værdien af en 10% opløsning af CELLUCLAST i vand blev indstillet på 9,2 med NaOH, og den således resulterende opløsning blev afkølet til 5°C. Efter 1 time ved dette pH og denne temperatur blev pH genindstillet på 4,7 med 20% eddikesyre. Denne opløsning blev holdt ved 5°C natten over og derpå sterilf iltreret . Filtratet blev frysetørret. 4 g af det frysetørrede produkt blev tilsat sammen med SPS-ase-præ-paratet KRF 68 Bill (eksempel 1). De to enzymer blev opløst i 172 g vand før tilsætning til vaskeblandingen. Massebalancebestemmelserne svarende til dette eksempel er vist i tabel 4.1.
Forsøget viser, at dette særlige SPS-ase-præparat allerede indeholder en effektiv cellulase, fordi tilsætningen af CELLUCLAST ikke synes at påvirke forholdet protein/ tørstof. Imidlertid kan andre SPS-ase-præparater indeholde mindre cellulase, f.eks. KRF 92, jfr. den tabel, der figurerer umiddelbart før eksempel 2.
-55- DK 152222 B
Tabel 4,1 Massebalancebestemmelser i forbindelse med den isoelektriske vask omfattende et SPS-ase-præ- Æ) parat og CELLUCLAST til fremstilling af p.v.p.
Masse af Protein Tør- Udbytte Udbytte Operationer fraktion, % stof, af pro- af tør- og fraktioner g (N x 6,25) % tein, % stof, % j
Vask: f
Sojamel 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 [
Vand 3546,2 0 00 0 F
6NHC1 43,1 0 21,3 0 2,3 f SPS-ase: KRF 68
Bill 24,0 75,3 96 7,7 5,8 CELLUCLAST 4,0 43,6 96 0,7 1,0
Centrifugering -.Σ 4043,1 - - “I
Centrifugat I 3382,0 1,9 5,5 27,3 46,5 j Tørstoffer I 661,0 - - - | ____j
Genvask: ; Tørstoffer I 661,0 - - -
Vand 3339,0 0 00 0 5 N HCl 0 0 0 0 0 !
2. Centrifuge- I
ring:Σ 4000,0
Centrifugat II 3414,0 0,2 0,7 2,9 6,0 : Tørstoffer II 582,0 - - -
Neutralisering: Tørstoffer II 582,0 - - -
Vand 1691,0 0 00 0 4 nNaOH 25,3 0 16,0 0 1,0 Tørring: Pulver 206,0 88,8 98,9 77,8 50,9
Eksempel 5 (anvendelseseksempel)
Man fremstillede et p.v.p. i henhold til den metode, der er beskrevet i eksempel 3C, med undtagelse af, at alle masser var formindsket med en faktor 5, og at reaktionsbian-
' 56 " DK 152222 B
dingen blev afkølet til ca. 5°C før centrifugeringen. På basis af de analytiske resultatet i relation til centri-fugaterne opnås der et teoretisk udbytte af bundfældet protein, som er vist i tabel 5.1.
Tabel 5.1 Teoretiske proteinudbytter opnået ved fremstilling af p.v.p.
Protein Udbytte Eksempel 3 C
„ , . (N ? 6'25) ;f.Pro: Protein- UdbyttS--
Fraktioner g % tein, * (N x 6i25) af protein, _____%__%_
Sojamel 85,2 55,2 100 55,2 100 SPS-ase KRF-68 B-III 4,8 75,3 7,7 75,3 7,7 1. Centrifugat 639 0,99 13,5 1,7 24,7 2. Centrifugat 595 0,13 1,6 0,2 2,9 p.v.p. - 87,2a 92,6b 87,1 80,lb a Gennemsnit af 87,5 (Bioteknisk Institut) og 86,9 (Quist's Labo-torium); tørstofbestemmelserne er henholdsvis 97,6 og 98,0%.
b Beregnet som totalmasse af protein *r protein tabt i centrifu-gaterne.
Eksempel 6 (anvendelseseksempel)
Påyisning_af_proteinbinding_af_SPS
40 g (N x 6,25) fra et kommercielt sojaproteinisolat (Purina 500 E fra Ralston Purina) blev opløst i 680 g vand. Blandingen blev i et vandbad opvarmet til 50°C, og pH blev indstillet på 4,50 med 6 N HC1. 90 g af denne blanding blev overført til 5 x 250 ml Erlenmeyer-kolber, og man tilsatte 10 g af vandige opløsninger, der indeholdt henholdsvis 0 g, 0,2 g, 0,4 g,0,8 g og 1,6 g af det SPS, der er fremstillet som beskrevet tidligere i denne beskrivelse. Kolberne blev derpå
'57' DK 152222 B
holdt under omrøring med en magnet i et vandbad ved 50°C i 240 minutter.
Herefter blev opslemningerne centrifugeret ved 3000 x g i 15 minutter, og centrifugaterne I blev analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. De faste faser blev vasket i vand ved stuetemperatur og recentrifugeret. Denne proces blev gentaget. Derpå blev tørstofferne dispergeret i 50 ml vand, og pH blev indstillet til 6,50 ved dråbevis tilsætning af 6 N NaOH.
De neutraliserede produkter blev frysetørret og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Baseret på de analyser, der er vist i tabel 6.1,beregner man proteinudvindingen og den procentdel af SPS, der er blevet bundet til proteinet, ved hjælp af de formler, der er vist i relation til tabel 6.2.
Dette eksempel viser, at SPS bindes fast til proteinet, således at forholdet protein/tørstof aftager med voksende indhold af SPS. Et SPS-indhold, der omtrentligt svarer til 0,4 g i 10 g vand tilsat til 5 g proteinisolat, svarer til det forhold protein/SPS, som foreligger i sojamel.
Den procentiske binding af SPS er en beregnet værdi.
Den procentiske binding af SPS aftager på grund af mætning af proteinet med SPS ved de lavere forhold protein/SPS.
Tabel 6.1 Målinger i henhold til eksempel 6
Forhold Centrifugater I Tørret bundfald| protein/SPS %N % DM % N % N x 6,25 % DM % N x 90 0,068 0,62 13,2 82,5 93,1 88,6 25 0,045 0,49 13,4 83,8 97,3 86,1 12,5 0,038 0,45 13,0 81,3 97,9 83,0 6,25 0,031 0,45 12,6 78,8 98,1 80,3 3,125 0,026 0,61 11,8 73,8 97,9 75,3
DK 152222 B
- 58 -
Tabel 6.2 Proteinudvinding og procentisk binding af SPS
protein/SPS % udvinding af protein ^ % binding af SPS ^ 00 '91,5 0 25 94,4 77 12,5 95,3 90 6,25 96,1 70 3,125 96,8 60
^ % udvinding af protein = JjL - —1~-A100, hvor NC 1 = % N i centrifugat I
^ % binding af SPS = [5 x (% udvundet protein) 5 x (% udvundet protein)!
(% P/H) ~ (%P/H)eo I
Z_ _ χ [5/(forhold protein/SPSj (% P/H) er forholdet protein/tørstof i det tørrede bundfald, og (% P/HJjx, er det tilsvarende forhold for bundfaldet uden tilsætning af SPS.
Eksempel 7 (anvendelseseksempel)
Dette eksempel beskriver fremstillingen af et p.v.p. under anvendelse af SPS-ase-præparatet KRF 92 B-I i en dosering på 5% af tørstoffet. Fremstillingsmetoden var nøjagtig som angivet i eksempel 3 C, med undtagelse af, at alle masser var reduceret med en faktor 5. p.v.p. blev analyseret som beskrevet i eksempel 2. De resultater, der fremkom ved forsøget, figurerer i tabel 7.1.
' 59 ' DK 152222B
Tabel 7.1 Resultater opnået i eksempel 7.
Udbytte Udbytte Masse (N x 6,25) Tørstof af pro- af tør-Komponent g S % tein, % stof, %
Sojamel '85,2 55,2 94,0 100 100
Enzympræparat 4,0 71,2 - 6,1 1. Centrifugat 632 1,88 5,44 25,3 43,0 2. Centrifugat 673 0,30 0,80 4,3 6,7 p.v.p. 39,8 85,6® 98,1® 71,9 48,8 84,4° 98,1° ® Analyseret på Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding b Analyseret på Qvist’s Laboratorium, Karselis Boulevard 169,
DK-8000 Aarhus C
Eksempel 8 (anvendelseseksempel)
Dette eksempel viser virkningen af at forbehandle sojamelet ved jet-kogning før fremstillingen af p.v.p.
Forbehandling
En opslemning af sojamel i vand bestående af 10 kg sojamel (Sojamel 13 produceret af Aarhus Oliefabrik A/S) per 100 kg blev pumpet gennem en damp-ejector (type Kydroheater B-300) og blandet med damp med et tryk på 8 bar i en sådan mængde og med en sådan strømningshastighed, at man kunne opretholde en sluttelig temperatur på 150°C i 25 sekunder i en tubulær, under tryk stående reaktor. Herefter blev trykket frigjort i et trykudligningskammer (en cyclon), og herfra blev opslemningen sendt gennem en pladevarmeudveksler og afkølet til ca. 50°C. Den afkølede opslemning kunne anvendes direkte til fremstilling af p.v.p., men i dette tilfæde blev opslemningen sprøjtetørret med en indgangstemperatur på 200°C og en udgangstemperatur på 90°C. Det forbehandlede produkt viste sig at have et tørstofindhold på 96,5% og et proteinindhold på 56,9% (N X 6,25).
-6°- DK 152222 B
Fremstilling af p.v.p.
Denne produktion gennemførtes på følgende måde: 70 g tørstof af det jet-kogte og tørrede sojamel blev suspenderet og holdt under omrøring ved 50°C i 560 g vand, og pH blev indstillet på 4,50 ved hjælp af 6,5 ml 6N HC1. 6 x 90 g af denne suspension blev overført til seks 250 ml Erlenmeyer-kolber og holdt under omrøring i et 50°C vandbad ved hjælp af magnetiske omrørere.
Til hver beholder tilsattes 10 g af en opløsning indeholdende henholdsvis 0 g, 0,025 g, 0,050 g, 0,10 g, 0,20 g og 0,40 g af SPS-ase-præparatet KRF-68-B-III. Reaktionsblandingerne blev derpå holdt under omrøring i 240 minutter ved 50°C. Derpå gennemførtes en centrifugering ved 3000 x g i 15 minutter.
Supernatanten blev derpå analyseret for Kjeldahl-N, og den faste fase blev vasket med vand i lige store volumina og centrifugeret.
Denne metode blev gennemført to gange. Den faste fase blev derpå frysetørret og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof.
Et lignende forsøg blev gennemført med et ubehandlet sojamel (Sojamel 13 fra Aarhus Oliefabrik A/S) som udgangsmateriale. I dette tilfælde var forholdene enzym/substrat 0, 1%, 2%, 3%, 4% og 8%.
Baseret på proteinindholdet af supematanterne kan man beregne procentdelen af udvundet protein. Proteinudbyttet er baseret på den antagelse, at enzymproduktet er 100% solubi-liseret efter reaktionen. Den følgende tabel viser de resultater, som opnåedes ved begge forsøg.
- 61 - DK 152222 B
Tabel 8.1
Kogt sojamel Ubehandlet sojamel E o Protein- Protein af Protein” I Protein af ' udbytte % tørstof % udbytte % tørstof % 0 92,9 76,5 90,7 73,9 0,25 90,1 86,6 0,50 89,3 88,7 1.0 88,1 89,7 87,1 86,2 2.0 86,6 91,7 85,7 88,1 3.0 - - 84,3 89,5 4.0 84,7 92,2 82,6 90,9 8/0 - -_I 76,2 91,1
Tabel 8.1. Proteinudbytter og forhold protein/tørstof for p.v.p. fremstillet ud fra kogt eller råt sojamel.
1 forbindelse med enten ekstraktionsprocesserne (isolationsprocesserne) af andre materialer end proteiner eller forflydningsprocesserne og dermed relaterede processer skal der henvises til det generelle processkema for anvendelser, der er vist som strømningsdiagram nr. 3.
Substratet kan være et eller flere kulhydrater, der er tilstede i et råmateriale, eller det kan være hele råmaterialet.
Dette substrat kan udsættes for en forbehandling af kemisk eller fysisk natur, som det senere vil blive eksemplificeret, f.eks. sur eller alkalisk behandling, udblødning eller udtrækning og/eller kogning med eller uden damp.
Råmaterialet kan macereres, hugges i småstykker, vådformales og/eller homogeniseres (alle disse behandlinger - 62 -
DK 152222B
betegnes homogenisering i strømningsdiagram nr. 3), med eller uden tilsætning af vand, og andre additiver kan tilsættesi i dette trin. Homogeniseringen kan gennemføres med forskellig effektivitet, f.eks. forskellige tryk, der kun er en brøkdel af det maksimale tryk, der er angivet for den specifikt anvendte homogenisator. Der kan tilsættes forskellige additiver før eller under homogeniseringen, symboliseret ved b,·^ b2 . · . .bn i strømningsdiagram nr. 3.
Reaktionen med SPS-ase-præparatet gennemføres under specificerede betingelser, f.eks. hvad angår temperatur, tryk, tid, pH og enzymdosis; også anbefalinger i forbindelse med den anvendte reaktor (f.eks. diskontinuerlig, plug-flow) og om nødvendigt omrøring er relevante. Der kan angives et sæt additiver for forskellige råmaterialer, angivet som c c2, .....cR i strømningsdiagram nr. 3.
Også separationsprocesserne kan gennemføres med forskellige effektiviteter. Under mange processer undgår eller letter man separationen, f.eks. når råmaterialet forflydiges totalt.
Man kan anvende forskellige separationsapparater (f.eks. centrifuger, filtre , ultrafiltreringsapparater, hydrocykloner, tyknere, sigter eller simple dekanteringsapparater).
Separationseffektiviteten defineres som forholdet mellem det absolutte slamindhold i tørstoffasen og det absolutte slamindhold i reaktionsblandingen.
Man kan behandle de fremkomne flydende eller faste faser yderligere, f.eks. ved koncentration, tørring eller opløsningsmiddelekstraktion, for at fjerne visse komponenter, som fedt eller olie, eller ved fermentation med henblik på fremstilling af biomasse, alkohol eller andre produkter (enzymer, antibiotika eller andre værdifulde komponenter).
De. fremkomne produkter kan også sendes tilbage til gentagen behandling gennem strømningsdiagrammet.
i
DK 152222B
- 63 -
Strømningsdiagram nr. 3
Substrat 1->,-4*-- a9-^ Forbehandlinger . ^ _ -—-—— -T I-.. .....
*a ” n
K KW
1— t rz-.-:— (7? „ = o - 100%) k — ---> Homogenisering ^ Hom :b " n c _SPS-ase-præparat^ " v> 1 —---7 Reaktion fT1 , , . . , .
c--——------ -' (Reaktionsbetingelser . 2 ^---— skal specificeres) * c ——" n _.__
Homogenisering (som ovenfor anført) _>k_
Separation ( \ Sep ~ ® ~ 100¾)
Flydende Fast
Yderligere behandlinger (se tekst) eller fornyet anvendelse som substrat - 64 - I det følgende er der angivet nogle eks^ 2 2 2 2 B på anvendelser af SPS-ase-præparater, og en oversigt over disse anvendelser fremgår af den følgende liste.
I den derpå følgende tabel I er der også opført visse egenskaber i relation til strømningsdiagram nr. 3.
Liste over eksemplificerende anvendelser af SPS-ase-præparater
Art af SPS- Referen-ase-præparat ce nr.
SPS-ase-præ- A 1 Ekstraktion af stivelse fra majs, hvede parat, der i og kartofler det væsentli- A 2 Ekstraktion af lipider fra plantemateriale ge er fri for A 3 Ekstraktion af æteriske olier fra plante- en eller fle- materialer re uønskede A 4 Ekstraktion af naturlige farvestoffer fra enzymaktivi- plantemateriale teter A 5 Ekstraktion af gummi fra guayulbusken
Total Ba 1 Fremstilling af en mælkeerstatning til U- for- husdyr mo- flyd- Ba 2 Fremstilling af råmaterialer indeholdende di- ning forsukret stivelse fi- ^ Ba 3 Total forflydning af pærer og andre frugter ce- Ba 4 Fremstilling af saft ved behandling frugter re- lig- og grøntsager de nende Ba 5 Behandling i· relation til ekstraktion eller SPS- be- presning af sukkerrør eller sukkerroer ase- ha d- Ba ^ Fremstilling af sojamælk præ- lina Ba 7 Behandling for at forøge den udvindelige p "___mængde af opløseligt kaffemateriale._ £a_ Pro- Bb 1 Forhindring og/eller nedbrydning af æble- ter ces" uklarhed hjæl- Bb 2 Anvendelse som klaringsmiddel for hvidvin pe- Bb 3 Fremstilling af ISSPH eller andre vegetabil- mid- ske proteinhydrolysater ler Bb 4 Mæskeenzym i bryggeriindustrien
Bb 5 Enzymatisk additiv til anvendelse under øl gæring og/eller -lagring Bb 6 Frigørelsesmiddel til mandelhud
An- Be 1 Nedbrydning af forskellige affaldsmaterialer dre Bc 2 Forsukring og samtidig gæring an- Bc 3 Nedbrydning af cellulose ven- Bc 4 Anvendelse som bagehjælpmiddel del- Bc 5 Forbedring af alkoholudbytte og udbytte af ser biomasse under gæring af sulfitlud fra pa- produktion
Bc 6 Afvanding af biologiske slamprodukter
Bc 7 Ensileringshjælpemiddel ——— --—r-ι----—r*-—:- 65
g -S'l .2 dkl 52222 B
G) -Η *· k rH X> <—I +) W x> O' Q< 0 id O <d (tJ fl3 C t/1 —i XZ Ή ) i ^ ·Η Ο Ή Ο Η (0 k * Χί ·Η Λί Ή
4-) Οι · G) CX> rH χ) i—t+J
G G) G) (0 C <8 rø ΠΪ CO
H h (O Ή Ή O G) H 0 k k O' rH Ό . ΗΌ
Ό C C . O CL) d -H 1 -H
β HG) I 1 0) k ·Η χΐ - X* - (OXJCP -P -P k O' O'
jc £ c tn d k k d k C
G) O Ή (0 G) © ftj -H ft} -ri α,υ-PUk O k 0) k G)
O
•H i i k _ k χ) 0) X k d I Ό '2 <D in in t n as O u-irH l i ~ΰ Γχ i 0 <B ιί (0 OrH < Ό
>1 fc UH > O X> UH
G) rH ^ O' Dl J, ? Ό 0 £ d I O' + d d .5 d X3 -Η -Η Ό C -H J5 Π G) G) Ai d 0 -H Q) ~ C ^ J|i Όθ)ΓθΛ:θ)Γ0·ΗΌω I I i? Si ·
iHtn Cktn-HCrHCd C
rH(C H(D(0i-H-H 0(00) Xj ''I
tum —Γΰ>0> —>k ** 1-1
H
ω 1 ° " (0 dP in
Xl i. rv o o 2 (0 d o i 2 ° ° S ° μ (io ω 1-1 G) -H 'i o en -P ^ m
•H
d
G) O
Cn m O dP _ .
£ Di g i ° o I 1 I
0 d O
X! -H EC O
k ή • G) jr* cn m
•rH
d o G) m „ O' _ c*>
O <JP I ° O I 2 O
£ O' £ rH
o d o o
X3 ·Η DC CN
Jp^_________
H 0$H 0®H rH O G] H O 2 Η H
ku tdHCJ (d H O U u G) rH O U
G) 1Z (PS Z G) E E Z ω E Z 0) e K
> _ " -P -H d £ ei h ja id hi g1 i i
S > 1 ' & S
Ό-- - *“ ......
c *d CN Ό Ό Ό Ό d o d d d d -η id cn id <d id id id > i > > > >_
XI
id i k II k i cn i χ) in ω idii^ cuii i i k o G) (d ac id in in -Γ-l -o £ *i > i—I m Ό χ» Ό k uh k AS k G) Uh rH -nH £ d O GJ (0 *H O G) <d G) G) ©idOG) 30)0 OH O ft! «) G)
D S S a: cnE'-'Xix) cn a: x> rH cn a: k tmnnEkC
cn ___
s r-J W pJ N LO
- 66 -
A 1. Ekstraktion af stivelse fra majs, hvede og2 S
Ekstraktion af stivelse fra majs, hvede, kartofler og andre stivelsesholdige planter gennemføres under anvendelse af et eller flere af trinnene: Udblødning, vådformaling og separation. Anvendelse af et SPS-ase-præparat med i det væsentlige ingen amylolytisk aktivitet vil tilvejebringe følgende fordele, hvorved majs anvendes som et eksempel: 1. Stivelsesfrigørelsen vil lettes under en kortere udblødningsperiode, 2. Vandforbruget kan reduceres, 3. Frigørelsen af majskim vil lettes uden frigørelse af majskimolie, 4. Proteinet kan opnås i en højere renhed, 5. Udvindingen af majsstøbevand vil lettes.
A 2. Ekstraktion af lipider fra plantemateriale.
Da lipiderne i plantematerialer er indesluttet i cellerne og sædvanligvis bundet til proteiner, kan lipider ekstraheres i vandig fase ved behandling med et SPS-ase-præparat, der i det væsentlige er fri for lipaser. Majskimolie isoleres således normalt ved hexan-ekstraktion af de tørrede majskim. Imidlertid er tørreoperationen overflødig, hvis de våde majskim behandles med et SPS-ase-præparat af den ovenfor angivne art. Ligeledes kan ekstraktionen af olivenolie i vandig fase forbedres, hvis det enzym, der anvendes til den enzymatiske behandling, er et SPS-ase-præparat af den ovenfor angivne art, se f.eks.
Food, Pharmaceutical and Bioengineering nr. 172, bind 74, side 93 - 94. Desuden kan vandig ekstraktion af f.eks. sojaolie, rapsfrøolie og solsikkeolie forbedres på lignende måde.
A 3. Ekstraktion af æteriske olier fra plantematerialer.
Hvis vegetabilske materialer, der indeholder æteriske olier, ekstraheres med en vandig opløsning af et SPS-ase-præpa- - 67 -
rat, der i det væsentlige er fri for enzymatisk akt©f$ef52222B
der er i stand til at nedbryde eller på anden måde ændre de æteriske olier, vil de æteriske olier kunne udvindes meget billigt og i høje udbytter.
A 4. Ekstraktion af naturlige farvestoffer fra plantema teriale.
Hvis vegetabilske materialer, der indeholder farvestoffer, f.eks. rødbeder, der indeholder det røde farvestof betanin eller farvestoffet i tranebær, behandles med et SPS-ase-præparat, der i det væsentlige er frit for enzymaktiviteter, der er i stand til at nedbryde eller på anden måde at ændre farvestofferne, vil farvestofferne udvindes meget billigt og i høje udbytter.
A 5. Ekstraktion af gummi fra guayulbusk.
Et andet eksempel på et substrat til et SPS-ase-præparat, der i det væsentlige er frit for enzymatisk aktivitet, der er i stand til at nedbryde nativ gummi, er cellevægsmaterialet i rødder og grene af guayulbusk.
Ba 1. Fremstilling af en mælkeerstatning til husdyr, fortrinsvis kalvemælkeerstatning.
Ved total forflydning i vandigt medium af sojabønner, solsikkefrø, bomuldsfrø, fababønner eller markærter kan man fremstille en kalvemælkserstatning, der er opløselig i koldt vand ved pH ca. 4,5. Ved anvendelse af de stivelsesholdige råmaterialer som fababønner eller markærter skal en stivelsesforflydning ved hjælp af en alfa-amylase gennemføres før, efter eller samtidigt med en behandling med en SPS-ase, som slutteligt solubiliserer de ikke-stivelsesagtige polysac-charider, der er tilstede som det strukturelle materiale i cellevæggene. Et detaljeret eksempel, som gør brug af fababønner, er vist i det følgende, og hvad angår sojabønner skal der - 68 -
DK 152222 B
henvises til tabel I. Forbehandlinen af disse sojabønner kan fortrinsvis være en jet-kogning, som forbedrer solubiliseringen af remanensen.
Eksempel Ba 1.1 15 kg fababønnemel (Farine de Feves fra GRANDES MINOTERIES A FEVES DE FRANCE, Paris) blev suspenderet i 35 liter vand.
75 g TermamyJ. 60 L og 18 g CaCl^ blev tilsat. Suspensionen blev under omrøring opvarmet til 95° C under anvendelse af en beholder med dampkappe. Suspensionen blev derpå behandlet ved denne temperatur i 60 minutter. Herefter blev pH indstillet til 4,5, og produktet blev afkølet til 50° C. 300 g af SPS-ase-præparatet KRF 68 blev solubiliseret i 1 liter vand og tilsat. Reaktionen blev udført i 440 minutter. Når der inkorporeres 10 g Fungamyl 800 L, vil stivelsesfraktionen hovedsageligt konverteres til disaccharid (maltose). Herefter blev reaktionsblandingen pasteuriseret ved 90° C i 2 minutter. En aliquot af produktet blev derpå frysetørret og anvendt til stabilitetsprøver. Prøven blev derpå solubiliseret svarende til 10% tørstof, og opløsningen af produktet kunne holdes stabil uden sedimentation i dagevis.
Smeltet fedt eller olie kan let emulgeres i produktet, hvorved man kan opnå en sluttelig sammensætning, der i høj grad ligner sammensætningen af komælk. En emulsion indeholdende 3,5% olie (sojabønneolie) kunne også holdes stabil uden sedimentation i dagevis.
Eksempel Ba 1.2
Sojamel (Sojamel 13) blev jet-kogt ved 150° C i 25 sekunder som beskrevet i eksempel 8. Det jet-kogte sojamel blev sprøjtetørret og anvendt til yderligere studier beskrevet i det følgende.
A: 50 g af det jet-kogte sojamel blev blandet med 450 g vand, og pH blev indstillet på 4,5 med 4,1 ml 6N HC1. Blandingen blev derpå opvarmet til 45° C i et vandbad, og 0,250 g af SPS-ase-præparatet KRF-68 blev tilsat til den opvarmede blanding,
~69~ DK 152222 B
der derpå blev omsat i 5 timer under omrøring. Derefter blev blandingen varmebehandlet ved 80° C i 2 minutter for inaktivere enzymet. En 100 ml prøve blev centrifugeret ved omgivelsernes temperatur i 15 minutter ved 3000 x g (g = gravitet). Supernatanten blev ionbyttet og analyseret for kulhydratsammensætning ved HPLC. Supernatanten blev også analyseret for Kjeldahl-N og tørstof, og man beregnede nitrogensolubilitetindeks (NSI) og tørstofsolubilitetsindeks (DSI); der henvises til resultaterne i tabel Ba I. 100 ml af reaktionsblandingen, som var afkølet til 20° C,blev hældt i et 100 ml måleglas og holdt ved 4° C i 2 dage. Dispersionens stabilitet (%) blev målt ved at aflæse voluminet af de fremkomne dispersioner (tabel Ba II) efter 1 og 2 dages forløb. Til 200 ml af reaktionsblandingen (ved 20° C) tilsattes 8 g sojabønneolie. Man fremstillede en emulsion ved blanding i 2 minutter i en Waring-blander. Emulsionsstbili-teten (%) blev målt som angivet efter 1 og 2 dages forløb.
B: Man gennemførte en reaktion som beskrevet i det fore gående, men i dette tilfælde anvendte man 1,00 g af SPS-ase-præparatet. Man udførte de samme typer af analyser og stabili-tetsmålinger som beskrevet i sektion A. Resultater er vist i tabellerne Ba I og Ba II.
Det fremgår af de kemiske analyser af supernatanterne, at de værdier for NSI (%) og DSI (%), som er opnået ved B-forsøget, er højere end for A-forsøget. Imidlertid viser de stabilitetsprøver, der er gennemført på reaktionsblandingerne, en bedre værdi for A-prøverne. Dette skyldes sandsynligvis den større peptid-kædelængde af proteinerne i reaktionsblandingen med den lave enzymdosis.
Af kulhydratsammensætningen målt ved HPLC fremgår det, at der hovedsageligt fremkommer mono- og disaccharider. Oligosaccharider, om hvilke det er kendt, at de er ansvarlige for diarrhoea og flatulens, når de gives til kalve i for store mængder, foreligger således kun i små mængder.
i
-7°- DK 152222 B
Tabel Ba I. Kemiske egenskaber af supernatanten.
Forsøg Enzymdosis NSI, % * DSI, % ** HPLC resultater i relation (ved pH = (ved pH = (sammensætning til sub- 4,5) 4,5) af neutrale suk- strat kerarter) % w/w A E/S = 0,5% 39,9 62,4 DP., + DP : 79,7% DPi : 7,4% DP? : 12,2% DP?, : 8,1% _____4+_'_ DP, + DP9 : 84,4% B E/S =2,0% 57,0 67,1 DP^ : 6,1% DP? : 3,7% DP^+ : 5,7% * NSI = Nitrogensolubilitetsindeks ** DSI = Tørstofsolubilitetsindeks
Tabel Ba II. Stabilitetsprøver med reaktionsblandingerne.
Forsøg Enzymdos i s _Stabilitetsprøver__ i relation ;_Uden olie__Med olie_ til sub- Dispersion Dispersion Emulsion Emulsion strat, 1. dag 2. dag 1. dag 2. dag __% w/w_____ A E/S = 0,5% 80% 63% 100% 87% B E/S = 2,0% 66% 35% 85% 71%
DK 152222B
Ba 2. Fremstilling af råmaterialer indeholdende forsukret stivelse.
I forbindelse med forsukringen af kassava og søde kartofler og andre stivelsesholdige plantematerialer er en tilsætning af et SFS-ase-præparat i stand til at løse viskositetsproblemer. Ved at anvende et SPS-ase-præpa-rat er det muligt at fremstille stivelsessuspensioner med et tørstofindhold på 25 - 30%, og efter forsukring kan mæsken gæres, hvorved man kan fremstille billig ethanol.
Eksempel Ba 2.1
Man fremstillede en mæsk med et tørstofindhold på 24% på basis af friske og revne søde kartofler (japanske).
Det viste sig, at stivelsesindholdet af søde kartofler var ca. 70% af disses tørstof. Man gennemførte en forforflydning ved hjælp af bakterieamylasen Termamyl 60 L i en dosis på 0,5 kg/ton stivelse under opvarmning af mæsken til 90° C. Mæsker; blev derpå holdt ved 90° C i 30 minutter. Viskositeten \ ± af reaktionsblandingen blev derpå målt ved hjælp af en HAAKE spindel ved 90° C.
Herefter blev reaktionsblandingen afkølet til 55° C, og pH blev indstillet på 5,0 med 2N ^SO^. Man initierede derpå en forsukring ved tilsætning af gluco-amylasen SAN 150 (varemærke fra NOVO INDUSTRI A/S) i en dosis af 1,75 liter/ton stivelse. Forsukringsblandingen blev derpå delt i 3 dele, A, B og C, som blev enzymbehandlet i 15 minutter, som vist i det følgende, før viskositetsmåling: A: Denne del er blindprøven. Viskositeten blev målt, jfr. tabel Ba III.
® B: Cellulasen fra Tricboderma viride, Celluclast 200 N, blev tilsat i en dosis af 1 kg/ton t.ørstof • < af· de· søde kartofler. Viskositeten blev målt, jfr. tabel Ba III.
C: SPS-ase-præparatet. KRF-68 blev tilsat i en dosis af 0,25 kg/ton tørstof af de søde kartofler.
- 72 -
DK 152222B
Viskositeten blev målt, jfr. tabel Ba III.
Tabel Ba III.
Viskositeter
Reaktionsblanding Viskositet Viskositet
ved 90° C ved 55° C
For-forflydigede η = >, = 2i90 co søde kartofler Li //u cp (/2 ^±yu cp A - )^2 = 2190 cp B - = 1970 cp C - = 950 cp
Det ses således, at viskositeten af reaktionsblandingen på effektiv måde kan reduceres med SPS-ase i lav dosis i sammenligning med Celluclast og SAN 150.
Ba 3. Total forflydning af pærer og andre frugter.
' 73 " DK 152222B
Hvis hele pærer, som er knust ad mekanisk vej, i et følgende trin behandles med et SPS-ase-præparat, finder der en total forflydning sted, og der frembringes en klar pæresaft efter fjernelse af mindre mængder tørstof. En lignende metode kan anvendes i forbindelse med andre frugter af lignende art, f.eks. æbler.
Eksempel Ba 3.1
Friske æbler blev formalet groft ved hjælp af en Buehar Central mølle. Æblemæsken blev derpå pasteuriseret ved 90° C i 5 minutter i en tank med varmekappe og derpå afkølet til omgivelsernes temperatur. De for-mæskede æbler blev derpå formalet på en Fryma-mølle med kurundsten-udstyr, indtil mæsken var blød at føle på. Mæsken blev derpå re-pasteuriseret ved 80° C i 10 minutter og a'fkølet til 50° C.
Man gennemførte nu enzymreaktioner ved 50° C i 30 minutter med Contraves Rheomat 15, hvorved omrøring og viskositetsmåling (i forbindelse med en procentisk aflæsning på Rheometret ved hastigheden 13) blev gennemført samtidigt.
' Efter afslutningen af enzymreaktionerne trak man 100 g prøver ud, og disse centrifugeredes i et måleglas med 3000 x g i 15 minutter. Herved måles procentdelen af saft og procentdelen af udfældning. Man målte også pH og procentdelen af refraktometer-tørstof som °Brix. Tabel Ba IV viser en sammenligning mellem effekten af SPS-ase, kombinationen af Celluclast og SPS-ase, og kombinationen af Celluclast og Pectinex. Man anvendte SPS-ase-præparatet KRF-68.
-74- DK 152222 B
Tabel Ba IV. Resultater af forsøg med total forflydning af æblemæsk ved 50° C i 30 minutter.
SPS-ase, Celluclast Pectinex Slutte- Centrifugering__Saft g/hl 200 1, 3x, g/hl lig % saft % ud- Τη I oRriv mæsk g/hl mæsk mæsk visko- ~ ^ sitet, £æld- % mng 0 0 0 100 59 41 3,8 9,7 25 0 0 19 81 19 3,5 10,5 50 0 0 15 79 21 3,5 10,7 cn cn n 4'8 83 17 3’5 10'8 D υ 3,8 83 17 3,1 12,5 0 50 200 9,5 83 17 3,2 12,9 0 50 2000 4,0 82 18 3,1 13,2
Ba 4. Fremstilling af saft ved behandling af frugter og grøntsager.
Det har vist sig, at SPS-ase-præparater er velegnede til fremstilling af saft ved behandling af adskillige frugter, bær og grøntsager, f.eks. gulerødder, ærter, tomater, æbler, pærer, solbær, bønner og kål. Herved opnås et forbedret saftudbytte samt en bedre ekstraktion af farve- og aromakomponenter, i sammenligning med kommercielt rekvirerbare pectinase- og cellulase-præparater.
Eksempel Ba 4.1
Der henvises til eksempel Ba 3.1, hvor SPS-ase-præpa-ratet er blevet sammenlignet med de kommercielt rekvirerbare, konventionelle cellulase- og pectin'aseprodukter Celluclast 200 L og Pectinex 3x. Det fremgår af tabellen, at saftudbyttet kan blive lidt forbedret med så lidt som 50 g SPS-ase/hl i sammen-ligning med 2000 g Pectinex /hl, begge i kombination med 50 g Celluclast /hl. Også viskositeten var lidt lavere. Man ser således, at RPS—a«a av r*a _ nannp mava a-Ftaktivt anrt Pantinav.
-75- DK 152222B
Ba 5. Behandling i forbindelse med ekstraktion eller presning af sukkerrør eller sukkerroe.
Det har vist sig, at det er muligt at forbedre udbyttet i forbindelse med simple ekstraktionsprocesser, hvis SPS-ase-præparatet anvendes til behandling af sukkerrør eller sukkerroer før og/eller under ekstraktionen eller presningen deraf. Desuden kan remanensen (bagassen) behandles med SPS-ase-præparatet, hvorved den udsættes for en delvis konvertering til forgærbare sukkerarter, hvilke kan anvendes som råmateriale til ethanolgæring.
Eksempel Ba 5.1 10 kg sukkerroeremanens (pulp) fremkommet i forbindelse med kontinuerlig modstrømsekstraktion i en DDS-diffusør i Nakskov sukkerfabrik blev formalet to gange i en Fryma-mølle (type MZ-110). Man tilsatte procesvand under mølle-operationen.
Portioner på 300 g af pulpen blev nu enzymbehandlet ved 45° C i 18 timer ved hjælp af de enzymdoser, der er vist i tabel Ba V. Det tørre enzymprodukt (KRF-68) blev tilsat til pulpen, som blev holdt under omrøring med en stav i den første time. Derefter blev pulpen forflydiget i et sådant omfang, at man med godt resultat kunne foretage magnetomrøring i den resterende tid. Ved slutningen af reaktionen blev pH målt (der blev ikke foretaget nogen pH-korrektioner ved begyndelsen af reaktionen) og reaktionsblandingen blev centrifugeret, indtil der fremkom en klar supernatant. Man foretog tørstofbestemmelser på reaktionsblandingerne og på supernatanterne. På basis af disse resultater beregnedes procentdelene af solubiliseret tørstof. Man foretog korrektioner for det opløselige tørstof i enzymproduktet i alle beregninger.
Supernatanterne nr. 2, 3 og 4 blev ionbyttet og analyseret ved HPLC for kulhydratsammensætning.
-76- DK 152222 B
Tabel Ba V. Resultater opnået ved enzymatisk forflydning af roe-pulp.
Forsøg Enzym- _Sluttelige målinger___ nummer dosis ' ~Ζ~~~7~Γ· 77 -. I 7 7 ^ for_ Reaktionsblanding_ Supernatanter hold pH (slut- % tør- % tør- % solubilise- til teligt) stof stof ret tørstof tørstof, _E/s %______ 1 0 5,5 4,18 0,0 0,0 2 0,35 3,6 3,85 2,58 66,9 3 0,56 3,5 3,81 2,56 66,2 4 1,02 3,5 3,86 2,73 70,4 5 1,58 3,3 3,17 2,34 73,4 6 3,10 3,4 3,23 2,49 76,4 7 7,52 3,4 2,66 2,18 80,5
Reaktionsbetingelser : M = 300 g S = 4,18% tørstof E/S som vist ovenfor pH ikke indstillet T = 45° C t = 18 timer 77' DK 152222 Β
Tabel Ba VI. HPLC data.
_Forsøg nummer_
Sukkertype 2__3__4_
Neutral)_·__% af neutrale sukkerarter Højmolekylær 3 (DP4+) . οχ,? ΔΟ,ό
Disaccharider 4,6 4,8 -
Glucose 20,4 23,7 27,8
Galactose 5,0 5,9 7,3
Fructose/ arabinose 26'4 32,2 33'2
Galacturon- .
syre I . ------— ... I ---- . . ...
Alle de sukkerarter, som dannes i henhold til den ovenfor viste tabel Ba VI, kunne forgæres til alkohol eller anvendes til andre formål.
Ba 6. Fremstilling af sojamælk.
Man kan let fremstille sojamælk ved total forflydning af formalede sojabønner og påfølgende homogenisering af den resulterende blanding. Sojamælk fremstilles ofte ved udblødning af sojabønner i kogende vand, formaling af de'udblødte bønner og vandekstraktion efterfulgt af en separation af uopløselig remanens, f.eks. proteiner og polysaccharider. For at forbedre udbyttet af sojamælken kan disse uopløselige remanenser for-flydiges ved reaktion med SPS-asen.
-78- DK 152222B
Eksempel Ba 6.1
Sojamælksprocessen illustreres ved følgende serie af enzymreaktioner, hvorved beregninger af proteinsolubilitets-indekset (PSI, %) og tørstofsolubilitetsindekset (DSI, %) illustrerer de udbytter, der opnås efter separation ved pH =7 (se tabel Ba VII). Enzymreaktionerne blev gennemført under følgende betingelser:
Substrat: Fuldfedt sojamel (Dansk Sojakagefabrik A/S)
Masse af reaktionsblanding: 220 g
Masse af substrat: 20 g
Temperatur: 50° C
pH: 4,5 (6 N HC1)
Reaktionstid: Serie A: 1 time
Serie B: 0,5 - 6 timer
Enzym: SPS-ase (KRF-68)
Enzymdosis: Serie A: E/S-forhold (w/w): 0 - 8,0%
Serie B: E/S-forhold (w/w): 1,0%
Efter reaktionen blev pH indstillet på 7 ved hjælp af 4 N NaOH, og der udførtes en separation ved centrifugering ved 3000 x g i 15 minutter.
-7,-- DK 152222B
in φ υ -Η <Α° h Ο 'ί ΙΛ σ\ Ο Η ^ Η h ιη > V - ν .. - *· ν ^ ν C η ro ο Η σο ro ιη η pi h ri ω -Η ίο 10 Γ~ Γ'' I" 00 00 θ'- Γ" 00 00
in D
• -Μ ιη (1)-------—___
φ +J
Ο ·Η 0 Ή Ρ -Η
Cl, χ) ύρ cd Η in id in ο r-· cm ο ro μ). g ------ < ^ ν * χ γ-ηη σ\ η ιη ν <j od ^ οο in ^ cm Η ο ιη μγ νο ό ι— 00 00 CD ΙΟ Γ- 00 Ο fij to (¾ e------- f0 -η m 0 0 in -p ω Q) p CM 00 CO 00 Cl 00 <-l Ο rH O Cl
,¾ © h Μ ·ί H W O St* CD Cl CM CD
Φ -p '----- - H in ID ID Γ' 00 CD CO CO Γ~
+3 dP
CO
& -p___ >, C--
N CO G
G -P -H
ω co q)
C -P
p Ο Γ' iH 00 00 CD ID (Λ H) ΟΙ O ffl G φ p to m n h to in <Η co (1) Q. Qj v-*.-.-- ».».*.*.*.
Q G i—I cm cm cm ro ro cm cm cm ro ro CO *0 I—I ..“ .. ....... .“—......
-H
+j m 0
C -P
0 W
-H G1 P O ^ 00 CD CD t~~ 00 00 CO 00 00 +j c © r~ r-~ r- oo o ro to to tO -Η -p *· v k *. v - - - - - rH 'd 00 00 CO 00 Cl Cl 00 00 00 00 00
φ G dP
p is ri Χί " in c
P G -H
ω 0 ω
G> -H -P
C di O in oo ri oo cm co >T η η n
-r-t j4P VD'Dh't^CifH CD ID ID ID <D
G G Q_i — — — — — — — — — — — tn © ro ro ro ro ro ktf ro ro ro ro ro
fl) 05 dP
P ---- Φ
X5 I
O) O
O Ό
G £ dP
tO >, - in o o o o o o o o o r-t n in tn ^ v - ^ » v - - - -
(0 G-Hvv.OOiH CM'M,00 ι-t iH r-l r-t rH
X2 w in w 0) tn ' ..... .
G I P
G in ω s c ε
O -H •Η -P
. 4-3 oooooo in o o o o Η X · - - » V k k -k "k - -k >·
H Cd G i—t i—i i—I r—1 i—I i—ί O I—i CM M* CD
> φ -H
tn -p G ---
CQ
H 0)
Φ *H
XJ P < CQ
G Φ E-c _i0__ '8°· DK 152222 Β
Ba 7. Behandling med henblik på forøgelse af den udvindelige mængde af opløseligt kaffemateriale.
Det har vist sig, at behandling af kaffebønner på forskellige stadier under fremstillingen af "instant-kaffe" resulterer i et forøget udbytte af opløseligt kaffemateriale. Således kan f.eks. forbrugt, formalet kaffe eller grønne bønner enzymbehandles med favorable resultater.
Bb 1. Forhindring af og/eller nedbrydning af æble- eller pæreuklarhed.
Efter fremstilling af æblesaft eller pæresaft og andre frugtsafter, som skal være klare, og som tidligere har været behandlet med konventionelle pectinase- og cellulase-præparater for at forhindre dannelsen af turbiditet, kan der forekomme en æbleuklarhed eller en lignende uklarhed i andre frugter. Det har vist sig, at SPS-ase-præparaterne er velegnede til nedbrydning af sådanne uklarheder, hvilke hovedsageligt består af araban bundet til proteiner.
Eksempel Bb 1
Det viste sig, at pæresaftkoncentrat fremstillet ved enzymatisk forflydning af affald fra en pære-konservesfabrik under anvendelse af Celluclast® og Pectinex® blev uklar ved henstand. Uklarheden blev isoleret og hydrolyseret med 0,01 N I^SO^ i 24 timer og analyseret ved hjælp af HPLC.
Kromatogrammet viste, at der forelå arabinose og små mængder oligosaccharider.
Ved inkubering af 0,5% w/v af dette kulhydrat i 1 mM acetatstødpude ved pH 4,5 i 3 timer ved 40° C med SPS- ase (KRF-68 + KRF-92 1:1) med en enzymkoncentration af 0,05% w/v — 81 —
DK 152222B
viste det sig, at 84% af det oprindelige uklarhedskulhydrat (tørstof) blev konverteret til arabinose.
Også fortyndet pærekoncentrat (20° Brix) blev behandlet i 2 timer ved 40° C med en enzymdosis af den ovenfor angivne SPS-ase på 0,15% w/v eller med et kommercielt produkt kal-det Clarex® i en dosis på 1% w/v. Det viste sig, at SPS-asen var i stand til at reducere det relative HPLC "peak"-areal af en araban-lignende uklarhed med 86%, hvorimod den tilsvarende reduktion med Clarex (anvendt i en meget højere dosering end SPS-ase-præparatet) kun var 78%.
Bb 2. Anvendelse som klaringsmiddel for hvidvin.
Det har vist sig, at hvidvin, som udviser en i høj grad uønsket turbiditet, på effektiv måde kan klares ved hjælp af SPS-ase. Det har vist sig, at uklarhedsmaterialet hovedsageligt består af arabinogalactaner, der er bundet til hydroxyprolin-remanenser i et strukturelt cellevægsprotein.
Bb 3. Fremstilling af ISSPH eller andre vegetabilske protein- hydrolysater.
Før separationen af ISSPH (isoelektrisk opløseligt sojaproteinhydrolysat) eller andre vegetabilske proteinhydroly-sater fra slammet, som beskrevet i US patent nr. 4 100 024 eller i Process Biochemistry, bind 14, nr. 7 (1979), side 6 - 8 og 10 - 11, kan reaktionsblandingen behandles med et SPS-ase-præparat. Herved opnås en lettere separation.
Bb 4. Mæskeenzym i bryggeriindustrien.
Ved ølfremstillingen påvirker kulhydrater i råmaterialerne, f.eks. beta-glucanerne i malt og bygurtens viskositet og filtrerbarhed. Tilsætning af SPS-ase under mæskningen
- 82 - DK 152222B
vil reducere urtens viskositet og forbedre filtrerbarheden og ekstraktudbyttet. Yderligere vil tilsætning af SPS-ase under mæskningen forøge urtens forgærbarhed og urtens nitrogenindhold.
Eksempel Bb 4.1 I laboratoriet mæskedes 50 g formalede, grove partikler bestående af 50% malt og 50% byg sammen med 275 g vand (15% tørstof) i henhold til følgende mæskediagram: 52° C (60 minutter)/63° C (60 minutter)/76° C (30 minutter).
For at påvise SPS-asens virkning udførte man 4 prøver, jfr. den nedenfor viste tabel, hvorved enzymerne blev tilsat under indmæskningen (pH af mæsken var 5,5 - 6,0).
t
Enzym Intet Cereflo SPS-ase (KRF 68)
0 200 BGU 1630 FBG 1630 FBG
beta-gluca- .
nase/g _
Dosis af *Tgro?er 0 1,5 g 0,05 g partikler
Total dosis
0 300 BGU 80 FBG 300 FBG
tivitetsen-heder per kg grove partikler
Filtrerings- urt^fter 120 ml 135 ml 160 ml 170 ml 10 minutter
Viskositet
ai ιι^4· 1 Π O
Balling 1,52 cP 1,36 cP 1,36 cP 1/30 cP
(25° C)_____
-83- DK 152222B
BGU er beta-glucanase enheder bestemt i henhold til analytisk metode AF -70/4-GB, som kan rekvireres fra NOVO Industri A/S.
FBG er fungale beta-glucanaseenheder bestemt i henhold til analysemetode AF 70.1/2-GB, som kan rekvireres fra NOVO Industri A/S.
Den eneste forskel mellem BGU og FBG er det pH, ved hvilket enzymbestemmelsen gennemføres: pH 7,5 for BGU og pH
5,0 for FBG.
Cereflo er et bakterielt beta-glucanase-præparat, som er beskrevet i informationsbladet B 214b-GB 1500 af juli 1981, hvilket kan rekvireres fra NOVO Industri A/S.
Eksempel Bb 4.2 I laboratoriet mæskedes 50 g af formalede grove partikler bestående af 40% malt og 60% byg sammen med 150 g vand (25% tørstof) i henhold til følgende mæskediagram: 45° C (60 minutter)/63° C (90 minutter)/75° C (15 minutter).
For at påvise effekten af SPS-asen gennemførte man 3 prøver, jfr. den nedenfor angivne tabel, hvorved enzymerne blev tilsat under indmæskningen (pH af mæsken var 5,5 - 6,0).
-84- DK 152222B
SPS-ase (KRF 68) + Ceremix til-
Enzym Intet Ceremix sat som i flen foregående prøve
Aktivitet af - 200 BGU 1630 FBG
betaglucanase/g
Dosis af enzym per kg grove - 1/65 g _ 0,033 g partikler _
Total dosis af
enjymaktivitets- „ 330 BG„ 50 FBQ
enheder per kg grove partikler
Filtrer ingshas*- tjfedVrtan 48 ml 98 ml 111 ml efter 30 minutters forløb oeSif?kt' 18,6 i9,° 19,5 °Balling__'___'__'_
Viskositet af
urt 10° Bal- 1,72 cP 1,37 cP 1,27 cP
ling (25° C)
Definitionen af BGU og FBG er som angivet i eksempel Bb 4.1. I den sidste søjle i den ovenfor angivne tabel er kun %*· den aktivitet og den dosis, der hidrører fra SPS-ase, angivet.
Ceremix er et bakterielt beta-glucanase-præparat, der er beskrevet i informationsbladet B 216 b-GB 1000 Feb. 1982, hvilket kan rekvireres fra NOVO Industri A/S.
Bb 5. Enzymatisk additiv til anvendelse under ølgæring og/eller -lagring.
SPS-ase kan tilsættes under urtens gæring eller under lagringen af øllet for at reducere indholdet af beta-glucaner og derved forbedre øllets filtreringsevne og øllets stabilitet hvad angår uklarhed. SPS-ase vil også udøve en virkning på proteiner, der er ansvarlige for kuldeuklarhed.
-85- DK 152222B
Bb 6. Frigørelsesmiddel for mandelhud.
Under det trin, der omfatter den mekaniske fjernelse af mandelhud efter blancheringen af mandler vil en vis procentdel af mandelhuden ikke blive frigjort. Det har vist sig, at enzymbehandling af mandlerne resulterer i en reduktion af den ovenfor angivne procentdel.
Be 1. Nedbrydning af forskellige affaldsmaterialer.
I forbindelse med visse fremstillingsprocesser dannes der store mængder kulhydratholdige affaldsmaterialer. F.eks. er dette tilfældet i forbindelse med produktfon af sojaisolat ved vandekstraktion og sur bundfældning, sojamælk og tofu (en speciel art af japansk ost). Man kan også i denne forbindelse anføre affaldspulp fra f.eks. æbler, pærer eller citrusfrugter. Det har vist sig, at et SPS-ase-præparat er i stand til at forflydige dette kulhydratholdige affaldsmateriale fuldstændigt og at frembringe forgærbare sukkerarter, der kan anvendes som udgangsmateriale til ethanolgæring.
Eksempel Bc 1.1
Ved traditionel fremstilling af sojamælk eller tofu bliver sojabønner ofte udblødt i kogende vand og formalet og ekstraheret med varmt vand, hvorefter man gennemfører en separation. Remanensen fra denne separation er det materiale, der anvendes til dette forsøg. Den flydende fase er sojamælken, som kan behandles yderligere til fremstilling af tofu.
10 kg hele sojabønner rekvireret fra Aarhus Oliefabrik A/S blev formalet samtidigt med 70 liter kogende vand i en Fryma-mølle af type MZ 110. Den formalede opslemning blev derpå holdt ved
- 86 - DK 152222 B
en temperatur over 85° C i 15 minutter for at inaktivere de naturlige bønneenzymer, som udvikler den kendte, uønskede sojabønnearoma.
5 liter af denne sojabønneopslemning blev derpå centrifugeret i laboratoriet i 15 minutter ved 3000 x g (g = gravitet). Det viste sig ved analyse, at remanensen indeholdt 20,45% og 20,06% tørstof (dobbeltbestemmelser, beregnet gennemsnit 20,26%). Man tilsatte langsomt 6 N HC1, som indarbejdedes i remanensen med en spatel, indtil et pH-meter viste 4,50, når elektroden blev indført direkte i massen.
Enzymreaktioner på 2 x 200 g af massen med de to doseringer af SPS-asen (KRF-68) E/S = 0,5% hvad angår tørstof og E/S = 3,0% hvad angår tørstof blev gennemført i et 500 ml bæger ved 50° C. Det tørre enzym blev tilsat til massen. I de første 1-2 timer blev omrøringen gennemført med en spatel, og herefter blev massen forflydiget i et sådant omfang, at omrøring med en magnet kunne gennemføres med et godt resultat. Den totale reaktionstid var 21 timer. Under reaktionen blev osmolaliteten målt med et osmometer (Advanced Digimatic 3DII fra Advanced Instruments Inc.). Resultaterne i tabel Be I viser reaktionens forløb. Ved slutningen af forsøget blev blandingerne centrifugeret ved 3000 x g i 15 minutter. Der viste sig et olielag på toppen af supernatanterne, og man bestemte voluminet deraf. Et løst slamlag forekom som et bundlag. Supernatanten inklusive olien blev fjernet med en pipette. Olien blev kombineret med den klare vandfase ved homogenisering, og en prøve blev udtaget med henblik på bestemmelse af tørstof.
De resultater, der er vist i tabel Be I viser tydeligt, at dette affaldsprodukt kan forflydiges ved en enzymatisk reaktion, og at man kan fremstille rå olie, som anført i sektion A4. Efter udvinding af olien kan den solubiliserede remanens anvendes på forskellig måde, f.eks. til gæring til værdifulde forbindelser eller til koncentrering og tørring og påfølgende anvendelse som foder eller næringsmiddel, eller efter yderligere rensning til produktion af værdifulde produkter.
-87- DK 152222B
Tabel Be I. Resultater opnået under forflydning af sojamælk og tofu-slam.
Reaktionsbetingelser
og -resultater Forsøg A Forsøg B
Masse af remanens 200 g 200 g
Masse af SPS-ase Λ , (KRF-68) °'20 9 ^20 9
Temperatur 50° C 50° C
pH 4,50 4,50
Reaktionstid 21 timer . . 21 timer
Resultater målt på t, Osmo- Æosmo- t, osmo- 4oamo- osmometer under min. lali- lali- min. lali- lali- reaktionens frem- tet, tet tet tet adskriden mOsm mOsm mOsm mOsm -------ΙΟ 287 0 0 ' 282 0 Å osmolalitet er 10 313 26 10 368 86
værdien korrigeret - - - 25 497 215 I
for osmolaliteten 40 391 104 45 601 319 af blandingen ved 95 501 214 95 718 436 t = 0 250 634 347 250 875 593 > 1260 907 620 1260 1145 863
Reaktionsblanding: no Tørstof 20'3% 20'7t5
Supernatant: Tørstof 10,ϋΐ 1S,4< ^Pern^ant: 8-10% 8-10%
Oliemdhold - [
Blegnet % af 88,6% 93,5* i solubiliseret ; tørstof j
Bc 2. Forsukring og samtidig forgæring.
Kulhydratholdige plantematerialer, f.eks. rodknolde som jordskokker , kartofler, søde kartofler, cassawa eller pulp fra sådanne rodknolde, d.v.s. det materiale, der bliver tilbage efter fjernelse af de ekstraherede bestanddele, kan
DK 152222 B
- 88 - forsukres ved behandling med et SPS-ase-præparat, og samtidigt kan de dannede forgsrbare saccharider fermenteres til ethanol.
Eksempel ~Bc 2.1J
Fremstillingen af ethanol ved forgæring af de nedbrudte inulinholdige jordskokker blev undersøgt i laboratorieskala ved samtidig forsukring med SPS-ase og inulinase og ved fire forskellige forbehandlinger af jordskokker.
SPS-ase: Man anvendte SPS-ase præparatet KRF-68.
Inulinase: Inulinasen blev produceret ved forgæring af Aspergillus ficuum (CBS 55 565). Inulinaseaktiviteten bestemmes som beskrevet i Research Disclosure nr. 21 234 (December 1981) side 456 - 458.
Laboratorieforgaring: Portioner på 150 g af den forbehandlede mask (beskrevet senere) blev forgæret efter tilsætning af 4,5 g bagerigær og 1 ml af en 4% opløsning af Pluronic som skumdæmpningsmiddel. Forgæringsbeholderne er forsynet med C02“f®låer indeholdende 98% svovlsyre, og fermentationen følges ved måling af vægttabet hidrørende fra frigjort CO2 · Indholdet af beholderne holdes under omrøring under fermentationen, der gennemføres ved 30° C. Man anvendte tre beholdere til hver af de undersøgte parametre.
I tabel Be II konverteres vægttabet hidrørende fra frigørelse af CC^ til ethanol under antagelse af, at 1 mol frigjort C02 er ækvivalent med 1 mol Ο,Η^ΟΗ, d.v.s. 1 1 g CO 2^£6 g C2H5OH.
44
Forbehandling af jordskokkerne:
Behandling A: 14,1 kg jordskokker (22,8% tørstof) blev Henze- kogt ved 140° C og 4 - 5 atm. i 20 minutter.
-89- DK 152222B
Vægten efter kogning var 19,0 kg ( <^16,9% tørstof). Man gennemførte gæringerne direkte på mæsken.
Behandling B: Vaskede og skiveskårne jordskokker blev blandet med vand (1:1) og blandet i .en Waring-blander. Mæsken blev derpå varmebehandlet i 1 time ved 85° C og pH = 4,5.
Behandling C: Som B, men pH blev ikke indstillet.
Behandling D: Som B, men ingen varmebehandling og ingen pH-indstilling.
Resultater: I tabel Be II viser resultaterne virkningen på ethanoludbyttet af tilsætningen af SPS-ase til den forbehandlede mæsk. Man opnåede en betydelig forbedring af ethanoludbyttet på alle forbehandlede mæske, når der var tilsat SPS-ase.
- 90 - DK 152222 B
Tabel Be II. Fermentationsresultater i forbindelse med samtidig fermentation og enzymatisk forsukring af jordskokker.
For- Inulina- SPS- Tab af C02 (g) efter 42 - 44 % fremstil- be- seenhe- ase timers forgæring let ethanol hand- der til- E/S i forhold ling sat til % til tørstof 1 g tør- __stof_____ A 1,5 0 7,65 - 0,05 31,5 1>5 0,27 8,07 - 0,08 33,2 1.5 0 4,85 - 0,03 29,7 1.5 0,40 5,41 - 0,03 33,1 1.5 0 5,70 - 0,05 34,8 1.5 0,10 5,97 ^ 0,01 36,5 C 1,5 0,20 6,13 - 0,06 37,5 1.5 0,30 6,13 - 0,00 37,5 1.5 0,40 6,18 - 0,05 37,8 1.5 0 5,77 - 0,02 35,3 1.5 0,10 5,89 - 0,00 36,0 D 1,5 0,20 6,04 - 0,11 36,9 1.5 0,30 6.01 - 0,01 36,7 1.5 0,40 6.02 - 0,03 36,8 0 0,40 5,48 - 0,02 33,5
Bc 3. Nedbrydning af cellulose.
Det har vist sig, at celluloseholdige materialer som strå, f.eks. hvedestrå, savsmuld, papir og lignocellulose, kan hydrolyseres i større udstrækning med et SPS-ase-præparat end med konventionelle cellulaser. Dette illustreres ved det følgende eksempel, hvori man behandler et krystallinsk cellulose-materiale (AVICEL) ved hjælp af en konventionel cellulase, Celluclast 200, fremstillet på basis af Trichoderma reesei, og SPS-ase-præpara-tet KRF 68.
'91' DK 152222 B
Eksempel Be 3.1
Man suspenderede Avicel i vand (20% tørstof); pH blev indstillet på 5 og temperaturen blev holdt på 50° C. Efter 24 timers reaktionstid blev opslemningen filtreret, og indholdet af reducerende sukker (mg glueose/g AVICEL) blev målt. Under anvendelse af enzymdoseringer på 5% og 20% i forhold til celluloseindholdet fandt man følgende værdier:
Tabel Be III
Enzym E/S % mg glueose/g AVICEL
Celluclast 5 80 SPS-ase 5 200
Celluclast 20 100 SPS-ase 20 340
Bc 4. Anvendelse som bagehjælpemiddel.
Det har vist sig, at SPS-ase-præparater er særdeles velegnede som bagehjælpemidler. Når man således tilsætter et SPS-ase-præparat til det tørre mel før fremstillingen af dejen, er det muligt at opnå brød af overlegen kvalitet hvad angår volumen, krumme og smag. Det er således muligt at opnå et brød af høj kvalitet ned et hvedemel af ringe kvalitet, hvis man som additiv anvender et SPS-ase-præparat.
Bc 5. Forbedring af alkoholudbytte og udbytte af biomasse ved fermentering af sulfitlud fra papirproduktion.
Det har også vist sig, at udbyttet af ethanol kan forbedres, hvis papirsulfitlud behandles med et SPS-ase-præparat, før den anvendes som kulhydratkilde til gæring af ethanol. Papirsulfitlud kan også anvendes til fremstilling af biomasse, f.eks.
-β2- DK 152222B
udbyttet af biomasse forbedres, når sulfitluden i et foregående trin er blevet behandlet med et SPS-ase-præparat. Nedbrydning hidrørende fra tilstedeværelsen af SPS-ase-præparatet og gæringen kan også foretages samtidigt.
Bc 6. Afvanding af biologiske slamprodukter.
Under traditionel vandekstraktion af mange biologiske materialer fra vegetabilske råmaterialer dannes der store voluminer af uopløselig remanens, der indeholder store andele af kvældede polysaccharider. Dette er f.eks. tilfældet, når sojamælk, tofu eller sojaisolat fremstilles ved vandekstraktion af sojabønner, affedtet sojamel eller hvide flager. Det strukturelle kvældede polysaccharidmateriale kan derpå i lille udstrækning behandles med SPS-ase, hvorved netværksstrukturen af materialet åbnes, og blot små mængder kulhydrater solubiliseres. Derved afvandes materialet, og som følge deraf fremkommer der et højere tørstofindhold i slammet i forhold til et produkt, som er fremkommet uden den enzymatiske behandling. Enzymprocessen udviser således den fordel, at den kræver et betydeligt lavere energiforbrug til fjernelse af vand ved tørring, og den muliggør også fremstillingen af et billigere tørt dyrefoder eller fyldstof til næringsmiddelanvendelser.
Bc 7. Ensileringshjælpemiddel.
Det er kendt at tilsætte enzymatiske ensilerings-hjælpemidler til ensilage for at forøge hastigheden af ensilerings-processen og nedbrydeligheden af ensilagen. Det har vist sig, at SPS-ase-præparater er bedre til dette formål end kendte enzymatiske ensileringshjælpemidler.
- 93 -
DK 152222B
r En oversigt over de figurer, hvortil der allerede har været henvist, fremgår af det nedenstående skema for at tilvejebringe et bedre overblik.
Fig. nr. Hører til Beskriver 1 Beskrivelses- Påvisning af bindingseffekten indledningen mellem SPS og sojaprotein 2 Beskrivelses- Strømningsdiagram, som beskri-
indledningen ver fremstillingen af SPS
3 Sektion 2 Kalibreringskurve for HPLC- gelfiltreringskromatografi 4 Sektion 2 HPLC-gelfiltreringskromatogram
af SPS
5 Sektion 2 HPLC-gelfiltreringskromatogram af SPS nedbrudt af SPS-ase 6 Sektion 2 og 3 HPLC-gelfiltreringskromatogram af supernatant fra SPS inkuberet med sojaprotein 7 Sektion 2 HPLC-gelfiltreringskromatogram af supernatant fra nedbrudt SPS inkuberet med sojaprotein 8 Sektion 3 HPLC-gelfiltreringskromatogram af APS nedbrudt med Pectolyase 9 Sektion 3 HPLC-gelfiltreringskromatogram af APS nedbrudt med SPS-ase 10 Sektion 3 HPLC-gelfiltreringskromatogram af SPS behandlet med Pectolyase 11 Sektion 7 Immunelektroforetiske toppe, herunder en SPS-ase-top identificeret ved overlejringsteknik 12 Sektion 8 Ionbytningskromatogram af en SPS-ase 13 Sektion 9 pH-aktivitets-afhængighed af en SPS-ase 14 Sektion 9 Temperatur-aktivitets-afhængig hed af en SPS-ase 15 Sektion 9 Temperaturstabilitet af en SPS- ase 16 Sektion 10 pH-stabilitet af protease i et SPS-ase-præparat

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en carbohydrase kaldet SPS-ase, som under passende betingelser er i stand til at nedbryde soja-SPS til nedbrydningsprodukter, der binder sig til protein i et vandigt medium i mindre omfang end soja-SPS før nedbrydningen ville have bundet sig til det samme protein under tilsvarende betingelser, kendetegnet ved, at man dyrker en SPS-ase producerende mikroorganisme hørende til slægten Aspergillus, hvilken organisme er i stand til at vokse i et medium indeholdende SPS som hovedcarbonkilde i et næringsmedium, der indeholder carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte, og at man om nødvendigt isolerer den dannede SPS-ase.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den SPS-ase dannende mikroorganisme er stammen Aspergillus aculeatus CBS 101.43 eller Aspergillus japonicus IFO 4408.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at dyrkningen gennemføres som submers dyrkning ved et pH mellem 3 og 7, fortrinsvis mellem 4 og 6, ved en temperatur mellem 20 og 40°C, fortrinsvis mellem 25 og 35eC·
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 - 3, kendetegnet ved, at næringsmediet indeholder sojamel.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at sojamelet, er behandlet med et proteolytisk enzym før anvendelsen som komponent af substratet, fortrinsvis det proteolytiske enzym, der er fremstillet ad mikrobiel vej ved hjælp af Bacillus licheniformis.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 - 5, kendetegnet ved, at en steril opløsning af pectin tilsættes aseptisk til gæringsvæsken under dyrkningen.
DK564282A 1981-12-22 1982-12-21 Fremgangsmaade til fremstilling af en carbohydrase til nedbrydning af et hoejmolekylaert kulhydrat DK152222C (da)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK564282A DK152222C (da) 1981-12-22 1982-12-21 Fremgangsmaade til fremstilling af en carbohydrase til nedbrydning af et hoejmolekylaert kulhydrat

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK569081 1981-12-22
DK569081 1981-12-22
DK202582 1982-05-06
DK202582 1982-05-06
DK564282A DK152222C (da) 1981-12-22 1982-12-21 Fremgangsmaade til fremstilling af en carbohydrase til nedbrydning af et hoejmolekylaert kulhydrat
DK564282 1982-12-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK564282A DK564282A (da) 1983-06-23
DK152222B true DK152222B (da) 1988-02-08
DK152222C DK152222C (da) 1988-06-20

Family

ID=26066299

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK564282A DK152222C (da) 1981-12-22 1982-12-21 Fremgangsmaade til fremstilling af en carbohydrase til nedbrydning af et hoejmolekylaert kulhydrat

Country Status (19)

Country Link
AT (2) AT387789B (da)
AU (1) AU556762B2 (da)
CA (1) CA1198700A (da)
CH (1) CH662820A5 (da)
DD (2) DD208821A5 (da)
DE (1) DE3247276A1 (da)
DK (1) DK152222C (da)
ES (2) ES8502157A1 (da)
FR (1) FR2518570B1 (da)
GB (1) GB2115820A (da)
HR (1) HRP930089B1 (da)
IT (1) IT1153863B (da)
MX (1) MX7419E (da)
MY (1) MY8600644A (da)
NL (1) NL8204924A (da)
NZ (1) NZ202876A (da)
SE (1) SE461659B (da)
SI (1) SI8212812A8 (da)
YU (1) YU43107B (da)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK167983D0 (da) * 1983-04-18 1983-04-18 Novo Industri As Fremgangsmade til enzymatisk behandling af presserester hidroerende fra frugter eller groentsager
FR2588886B1 (fr) * 1985-10-18 1988-06-24 Comite Eco Agric Prod Chanvre Procede de traitement biochimique de plantes fibreuses liberiennes ou cellulosiques et assimilees
DK481385D0 (da) * 1985-10-21 1985-10-21 Novo Industri As Fremgangsmaade til diskontinuerlig enzymatisk roedning af hoer eller andre roedningsegnede planter
DK153042C (da) * 1985-11-04 1989-01-02 Novo Industri As Kaeledyrsfoder
GB8825181D0 (en) * 1988-10-27 1988-11-30 Atomic Energy Authority Uk Recovery of substances
DK158989D0 (da) * 1989-03-31 1989-03-31 Novo Industri As Fremgangsmaade til enzymatisk afhaaring af huder eller skind
EP0498137A1 (en) * 1991-02-06 1992-08-12 Novo Nordisk A/S Novel expression systems
EP0574495B1 (en) * 1991-03-08 1995-06-14 Novo Nordisk A/S Method for cleaning of heat exchangers
JPH06506831A (ja) * 1991-05-02 1994-08-04 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ラムノガラクツロナーゼ、対応するｄｎａ配列、ラムノガラクツロナーゼ含有酵素調製物および該酵素調製物の用途
US6001627A (en) * 1991-05-02 1999-12-14 Novo Nordisk A/S Rhamnogalacturonase, corresponding DNA sequence, rhamnogalacturonase containing enzyme preparation and use of the enzyme preparation
EP1067180A1 (en) * 1991-05-02 2001-01-10 Novo Nordisk A/S Aspergillus japonicus and Irpex lacteus rhamnogalacturonase and its use
DK41992D0 (da) * 1992-03-27 1992-03-27 Novo Nordisk As
ES2046135B1 (es) * 1992-07-03 1994-09-01 Univ Santiago Compostela Tratamiento enzimatico de semillas oleaginosas para mejorar la extraccion de aceite y simultaneamente aumentar la calidad nutricional de la harina.
ATE324386T1 (de) * 2000-06-23 2006-05-15 Novozymes As Verfahren zum quellen
WO2004087889A1 (en) * 2003-04-04 2004-10-14 Novozymes A/S Mash viscosity reduction
US20080075824A1 (en) * 2006-09-25 2008-03-27 Wild Flavors, Inc. Treatment of Plant Juices, Extracts and Pigments
DE102007019401A1 (de) * 2007-04-23 2008-11-27 Bühler AG Verfahren zur Verarbeitung von Leguminosen-Rohmaterial

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3632346A (en) * 1968-04-30 1972-01-04 Rohm & Haas Process for rendering innocuous flatulence-producing saccharides
BE792665A (fr) * 1971-12-14 1973-03-30 Ury & Cie Ets Concentre purifie de soja
FR2302336A1 (fr) * 1975-02-26 1976-09-24 Baxter Laboratories Inc Procede pour la fabrication d'un melange d'enzymes
US4119733A (en) * 1977-05-13 1978-10-10 Massachusetts Institute Of Technology Method of making soybean beverages
US4200694A (en) * 1977-10-08 1980-04-29 Kikkoman Shoyu Co., Ltd. Novel pectin esterase, process for its production, and process for producing demethoxylated pectin by the use of said pectin esterase
JPS54163848A (en) * 1978-06-14 1979-12-26 Toyo Seikan Kaisha Ltd Juice making method
DK109880A (da) * 1980-03-14 1980-03-14 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et renset vegetabilsk proteinprodukt

Also Published As

Publication number Publication date
DK564282A (da) 1983-06-23
AU556762B2 (en) 1986-11-20
ATA333086A (de) 1994-04-15
FR2518570B1 (fr) 1987-02-13
SE461659B (sv) 1990-03-12
GB2115820B (da) 1985-07-03
NL8204924A (nl) 1983-07-18
SE8207215L (sv) 1983-06-23
MX7419E (es) 1988-10-18
IT8224870A1 (it) 1984-06-21
CA1198700A (en) 1985-12-31
DE3247276A1 (de) 1983-07-07
YU43107B (en) 1989-02-28
HRP930089B1 (en) 1996-12-31
AT387789B (de) 1989-03-10
YU281282A (en) 1984-12-31
ES518411A0 (es) 1984-12-16
ES529680A0 (es) 1985-12-01
DD213240A5 (de) 1984-09-05
ES8602932A1 (es) 1985-12-01
SE8207215D0 (sv) 1982-12-16
ES8502157A1 (es) 1984-12-16
CH662820A5 (de) 1987-10-30
NZ202876A (en) 1986-06-11
SI8212812A8 (en) 1995-10-31
GB2115820A (en) 1983-09-14
MY8600644A (en) 1986-12-31
FR2518570A1 (fr) 1983-06-24
DD208821A5 (de) 1984-04-11
AT398436B (de) 1994-12-27
DK152222C (da) 1988-06-20
IT1153863B (it) 1987-01-21
AU9172082A (en) 1983-06-30
IT8224870A0 (it) 1982-12-21
ATA462282A (de) 1988-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2233599C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ВОДОРАСТВОРИМЫЙ β-ГЛЮКАН, (ВАРИАНТЫ) И ИЗГОТАВЛИВАЕМЫЕ ИЗ НЕЕ ПРОДУКТЫ
DK152222B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af en carbohydrase til nedbrydning af et hoejmolekylaert kulhydrat
AU2002339797B2 (en) Process for the fractionation of oilseed press cakes and meals
EP0671883B1 (en) Method for stabilizing rice bran and rice bran products
US4478939A (en) SPS, SPS-ase and method for producing SPS-ase
JP2011521629A (ja) トウモロコシグルテン加水分解物の製造方法及びこれにより製造されたトウモロコシグルテン加水分解物
CN110192592A (zh) 一种速溶大豆蛋白粉及其制备方法
CN105707270A (zh) 核桃肽乳的加工工艺
KR100578495B1 (ko) 청국장을 이용한 발효 두유의 제조방법
JP2001327263A (ja) キノコ類の成分の抽出方法
CN114317657A (zh) 一种鱼骨肽及其制备方法和应用
US20030022274A1 (en) Partially hydrolysed protein nutrient supplement
US20050100645A1 (en) Process for producing vegetable foods from coconuts
CN109287840A (zh) 一种破碎鸭蛋蛋黄和蛋清分离回收工艺
CN114250209B (zh) 一种岩藻聚糖酶及其在海参复合酶解中的应用
JPH057998B2 (da)
CN113317387A (zh) 一种优化黑豆蛋白提取工艺的方法
DK150495B (da) Middel til nedbrydning af vegetabilsk remanens, isaer sojaremanens
JP2004000271A (ja) キノコ類の成分の抽出方法
BE895430A (fr) Enzyme destinee a la decomposition d&#39;un hydrate de carbone a poids moleculaire eleve, hydrate de carbone ainsi obtenu, procede de selection d&#39;un mucroorganisme produisant ladite enzyme et procede de production d&#39;une telle enzyme
NL8204925A (nl) Verbeteringen in en met betrekking tot een middel voor het ontleden van plantaardige remanentie, in het bijzonder sojaremanentie, een werkwijze ter bereiding van een gezuiverd plantaardig proteineprodukt alsmede het gezuiverde plantaardige proteineprodukt.
RU2210249C1 (ru) Способ получения белкового концентрата из моллюсков
BE895431A (fr) Agent de decomposition de la remanence vegetale, procede de preparation d&#39;une proteine vegetale purifiee et proteine vegetale purifiee obtenue

Legal Events

Date Code Title Description
AHS Application shelved for other reasons than non-payment
PBP Patent lapsed