DK148713B - Apparat til dyrkning af mikroorganismer paa et flydende substrat og fremgangsmaade til dets fremstilling - Google Patents

Description

i 148713 o

Den foreliggende opfindelse angår et apparat til dyrkning af mikroorganismer på et flydende substrat, bestående af en bærer forsynet med fordybninger, hvor der i hver enkelt fordybning findes en forudbestemt mængde af et biologisk aktivt 5 materiale, især et antibiotikum, i tørret form. Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til apparatets fremstilling ved hvilken man, til en bærer forsynet med fordybninger, til hver fordybning tilsætter en forudbestemt mængde af et biologisk aktivt materiale, især et antibiotikum, op-10 løst i et opløsningsmiddel, hvorefter det aktive materiale tørres ved fordampning af opløsningsmidlet.

Til identificering af mikroorganismer er det almindeligvis nødvendigt at bestemme virkningerne af forskellige biologisk aktive stoffer på mikroorganismernes vækst, og 15 dette er af særlig betydning i tilfælde af antibiotiske stoffer, hvor der til terapeutisk anvendelse kræves kendskab til den mængde, der er nødvendig for opnåelse af en væksthæmning.

Den klassiske metode til bestemmelse af denne mindste inhi-bitoriske koncentration (MIC) består i, at man fremstiller 20 en række reagensglas indeholdende flydende dyrkningsmedium med forskellige mængder antibiotikum i hvert glas, og efter podning med mikroorganismen og inkubering kan MIC da bestemmes ud fra det glas med den mindste antibiotikum-koncentration, hvori der ikke er sket nogen vækst.

25 Alternative metoder indbefatter fremstilling af en ten agarplader med en række antibiotikum-koncentrationer eller simple agarplader, ind i hvilke de antibiotiske stoffer får lov at diffundere fra papirskiver, der er imprægneret med de antibiotiske stoffer. Alle tre metoder kræver 30 til deres udførelse erfaring og betydelig umage, og da nogle antibiotika ikke er stabile i dyrkningsmediet, må medierne være frisk fremstillet før anvendelsen. Der er derfor blevet foreslået forskellige metoder til formindskelse af besværet ved udførelse af antibiotiske sensibilitetsprøver.

33 I USA patentskrift nr. 3.416.998 er der således be skrevet en fremgangsmåde, ved hvilken flere forsøgsforbin- 2 148713 o delser såsom kemoterapeutiske midler blandes med en 1,5%·s vandig opløsning af agar, hvorefter den opnåede blanding hældes ud på en plade til dannelse af et forholdvis tykt lag, som derefter tørres. De tørrede lag kan derefter op-5 deles i mindre stykker, som indeholder en konstant mængde materiale pr. enhedsareal af laget, og små skiver af dette materiale kan anbringes på bakteriekulturer, hvor det aktive middel så får lov at diffundere ind i kulturmediet, og indvirkningen af den anvendte forbindelse på bakterievæk-10 sten kan derefter bedømmes. Denne metode er imidlertid besværlig at udføre, og resultaterne er tilbøjelige til at variere betydeligt.

I alment tilgængelig hollandsk patentansøgning nr.

6917655 er beskrevet en fremgangsmåde til bedømmelse af 15 bakteriers vækst og fysiologi ved inkorporering af en kemisk forbindelse såsom en aminosyre eller en anden forbindelse, der fremmer bakteriers vækst, i en opløsning af et indifferent højmolekylært materiale og tilsætning af denne blanding i forskellige reagensglas til opnåelse af materi-2o alelåg. På et senere stadium tilsættes derpå et inoculum, og væksten bedømmes. Til denne metode anbefales der som stabilisatorer for den kemiske forbindelse en vandig opløsning af agar eller en 1%'s opløsning af polyacrylamid.

En ulempe ved denne sidste metode, er, at det af-25 satte lag af kemisk forbindelse inkorporeret i stabilisatoren er temmelig tykt og har utilstrækkelig mekanisk stabilitet. En anden ulempe er, at der anvendes temmelig stor mængde stabilisator, og i nogle tilfælde påvirker denne store mængde stabilisator sammensætningen af og egenskaber-30 ne for væsken i reagensglasset.

En metode, der omfatter anvendelse af papirskiver som bærer imprægneret med antibiotika, er beskrevet i alment tilgængelig hollandsk patentansøgning nr. 7205619 og indbefatter, at den antibiotikumimprægnerede papirskive anbringes på en 35 agarplade, hvorefter antibiotiket diffunderer fra papiret Over på agaren og giver en koncentrationsgradient. Stand-

O

3 148713 ardisering af denne metode frembyder imidlertid problemer, og de opnåede resultater varierer betydeligt efter hvem, der udfører dem.

I fransk patentskrift nr. 1.488.866 og alment til-5 gængelig hollandsk patentansøgning nr. 72.11.868 er beskrevet et apparat til bestemmelse af mikroorganismers følsomhed i nærværelse af forskellige antibiotika, men de kemiske forbindelser og den organisme, der skal prøves, er her til stede i lyofiliseret form, hvilket gør dem følsomme 10 over for mekaniske tab og fører til upålidelige resultater.

Der er derfor behov for en simpel,økonomisk og effektiv metode til stabilisering af meget små mængder af nøjagtigt præ-udtømte mængder af særlig biologisk aktive stoffer i både mekanisk og kemisk henseende.

15 Dansk patentskrift nr. 127009 angår en fremgangsmåde til fremstilling af blandede bakterielle sedimenter indeholdende gelatine, dextranderivater og salte tørret på ved-hængningsfrie overflader. Herved fås tørrede skiver eller småplader, som håndteres og opbevares på forskellige måder, 20 før de anvendes, idet de indgår som bestanddele, der skal tilsættes særskilt til mikrobiologiske kulturmedier til brug som kontrol på disses styrke og øvrige egenskaber.

Tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.220.506 og US patentskrift nr. 3.826.717 angår begge mikrotiterbakker in-25 deholdende brønde, hvori forskellige gelmedier er til stede med det formål at udføre mikrobiologiske kulturprøver.

Der er her tale om vandholdige, ganske vist faste, men ikke tørre medier.

Den formentlig nærmest beslægtede kendte teknik in-30 den for området er dog nok US patentskrift nr. 3.713.985 (og tilsvarende tyske offentliggørelsesskrift nr. 2.152.068), der omhandler en teknik baseret på brugen af lyophilisater.

Disse har imidlertid den ulempe, at de let går itu og brydes løs fra deres underlag. Hertil kommer, at de konserverede 35 materialemængder ikke er tilstrækkelige, eller man må i andre tilfælde benytte tykkere lag for at opnå en passende sta-

O

4 148713 bilitet end den tykkelse og dermed den analysefinhed, der navnlig er ønskelig.

I modsætning til de ovennævnte patentskrifter angår den foreliggende opfindelse tilvejebringelsen af et apparat 5 beregnet til dyrkning af mikroorganismer, i hvilket veldefinerede mængder af biologisk aktive materialer er doseret i form af en sammenhængende tør stabil film anbragt direkte i flydende form i samme apparat, hvori de mikrobiologiske kulturprøver senere skal gennemføres.

10 Det må i denne sammenhæng fremholdes, at det er sær deles overraskende, når det nu har vist sig, at selv tynde lag tilvejebragt ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er opnåelige. Herved fås et særdeles effektivt analyseudstyr, hvilket f.eks. fremgår af den nedenfor an-15 førte forsøgsrapport.

Det er således lykkedes at tilvejebringe og stabilisere ganske små mængder af biologisk aktive stoffer i mikrotiterbrønde, idet man i vid udstrækning undgår mange af de vanskeligheder, man tidligere har mødt ved fremstil-20 lingen af egnede systemer til bestemmelse af disse stoffers virkning på bakterievækst, og dette apparat opfylder de kendte forlangender for tilfredsstillende dyrkning af mikroorganismer, men er samtidig opbevaringsstabilt i tidsrum af størrelsesordenen flere år.

25 Apparatet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det biologisk aktive materiale er stabiliseret ved inkorporering i en sammenhængende, tør film med en tykkelse i intervallet fra 0,01 til 50 jm, hvilken film hænger ved overfladen i fordybningen.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at det aktive materiale opløst i opløsningsmidlet y-derligere tilsættes et stabiliserende filmdannende stof, og opløsningsmidlet fordampes ved en temperatur og et tryk, som tillader dannelse af en ensartet sammenhængende, til 35 fordybningen vedhængende, tør film af filmdanneren og det aktive materiale, og at koncentrationen af filmdanneren og det aktive materiale vælges således, at filmens tykkelse

O

5 148713 bliver mellem 0/01 og 50 ^im..

Ved stabilisering menes i det foreliggende tilfælde både en mekanisk stabilisering og en kemisk stabilisering, f.eks. mod hydrolyse, pH- og ionogene variationer i omgi-5 velserne, høj temperatur etc.

Den forbindelse, der skal stabiliseres, er et biologisk aktivt materiale, såsom antibiotika, der er følsomme over for varme, tilstedeværelse af fugtighed, ekstreme pH--betingelser etc.

10 Antibiotika er dog ikke de eneste materialer, der påvirker mikrobiologisk vækst, og inhibitionsprøver, er ikke de eneste mikrobiologiske kulturprøver. Det er således velkendt, at et antal ikke-antibiotika enten specifikt inhiberer eller fremmer mikroorganismers vækst, og at der 15 kan gøres brug af disse indbyrdes indvirkninger ikke alene ved inhibitionsprøver, men også til f.eks. artsidentifikationsprøver, som bygger på virkningerne af forskellige promotorer og inhibitorer. Den foreliggende opfindelse har naturligvis ikke noget som helst at gøre med den logiske sam-2q menhæng ved sådanne prøver, men vedrører udelukkende bekvem opbevaring, stabilisering, håndtering, dosering og fremlæggelse af et biologisk aktivt materiale, uanset hvad dets særlige mikrobiologiske egenskaber eller anvendelsesformål går ud på, hvilket i hvert enkelt givet tilfælde af-25 hænger helt og fuldt af det særskilte aktive materiale, som indgår i den pågældende fremgangsmåde til apparatets fremstilling.

Som stabilisator kan der anvendes mange forskellige materialer med filmdannende egenskaber såsom agar, cellu-3Q losederivater eller, og fortrinsvis, proteinstoffer som f.eks. gelatine, casein og bovalbumin. Til medicinske formål anvendes fortrinsvis gelatine, fordi a) den er en ampholyt med god puffer-kapacitet, b) den er ret letopløselig i forholdsvis kold opløsning, 35 hvilket er en stor fordel, når der deri skal inkorpo-

O

6 148713 reres termolabile forbindelser, c) den er et generelt accepteret mikrobiologisk medium, og d) den udgør et godt filmdannende materiale.

Det opløsningsmiddel, der skal anvendes, kan prin-5 cielt være et hvilket som helt opløsningsmiddel, men til medicinske formål foretrækkes der almindeligvis destilleret vand til fremstilling af vandige opløsningsmidler af stabilisatoren og den forbindelse, der skal stabiliseres. Fremstillingen af sådanne opløsninger og alle derpå følgen-10 de manipulationer udføres fortrinsvis under den temperatur, ved hvilken en hvilken som helst af komponenterne i blandingen kan blive påvirket.

Rumfanget og koncentrationen af portionerne af blandingen af stabilisator og forbindelse, der skal sta-15 biliseres, vælges således, at det på den faste overflade afsatte materiale efter tørring giver film med en tykkelse, der ikke overskrider 50 jm. Passende rumfang og koncentrationer kan let bestemmes i hvert enkelt tilfælde, således at de opfylder forlangenderne med hensyn 20 til filmens tykkelse, sammenhæng og vedhængen til den faste overflade.

Anvendelige opløsninger af stabilisatoren som f.eks. gelatine indeholder denne i en koncentration, der almindeligvis ligger mellem 0,001 og 0,5% (vægt/rumfang), for-25 trinsvis mellem 0,01 og 0,1% og især mellem 0,01 og 0,03%, der ved apparatets fremstilling anbringes på den faste bærers overflade i rumfang på 1-500 mikroliter, fortrinsvis 10-100 mikroliter af opløsningen indeholdende stabilisator og forbindelse, der skal stabiliseres.

30 Den opløsning, der afsættes, fremstilles almindelig vis ved sammenblandingen af passende rumfang af opløsninger af stabilisator og forbindelse, der skal stabiliseres, om nødvendigt under indstilling af pH-værdien på den ønskede værdi og eventuelt sterilisering.

35 Til opnåelse af den nødvendige mekaniske stabilitet, dvs. god vedhængen til den faste overflade efter tørring,

O

7 148713 skal filmene have en tykkelse på mellem 0,01 og 50 ^im, men fortrinsvis mellem 0,1 og 5 og ideelt mellem 0,3 og 1 jm, hvor der er tale om afioniseret gelatine som det filmdannende medium. Det er vigtigt, at de tørre-5 de film har en tykkelse indenfor det angivne område, da sammentrækning af tykkere film under tørring bevirker løsnen af kanterne og tab af mekanisk stabilitet.

I nogen grad afhænger filmenes vedhængen af formen af den faste overflade, hvorpå blandingen afsættes.

10 Der synes kun være ringe eller ingen forskel på de opnåede tynde films opførsel over for forskellige syntetiske plast-materialer såsom polyethylen, polystyren, poly-carbonat, polyvinylchlorid, polymethacrylat eller poly-tetrafluorethylen.

15 Tørringsprocessen kræver også nogen opmærksomhed.

Anvendelige tørrede film dannes ved, at opløsningsmidlet, der kan være et hvilket som helst opløsningsmiddel, men sædvanligvis er vand, fjernes ved lufttørring eller, og fortrinsvis, under formindsket tryk. Det er at foretrække, 20 at tørringen udføres under sådanne betingelser, at væsken ikke koger eller fryser, da kogning kan give anlending til mekanisk tab, og frysetørring ikke giver en sammenhængende film. Når der anvendes vand som opløsningsmiddel, holdes væsken fortrinsvis på mellem 5 og 30°C og vakuet på ca.

25 20 Torr.

En meget nyttig anvendelse for det ved den ovenfor angivne metode til stabilisering af forbindelser tilvejebragte apparat til dyrkning af mikroorganismer er til bestemmelse af den mindste inhibitoriske koncentration af 30 antibiotika mod patogene mikroorganismer. Et velegnet apparat ifølge opfindelsen til sådanne bestemmelser består af flere rækkevis anbragte fordybninger indeholdende en sammenhængende, tør film med en tykkelse på ikke over 50 og indeholdende et biologisk aktivt materiale, der skal stabilise- res. Ved inkorporering af dette materiale i en filmdannende stabilisator, der hæfter pålideligt til fordybningernes indvendige overflade, 35 148713 δ ο opnås stor analysenøjagtighed ved selv ganske små koncentrationer og meget lang tids opbevaringsstabilitet.

Det biologisk aktive materiale, der skal stabiliseres, er især et antibiotikum.

5 Stabilisatoren kan være et hvilket som helst film dannende stof, men ved anvendelse til medicinske formål er den fortrinsvis et proteinholdigt materiale såsom gelatine eller bovint serum-albumin.

Fordybningerne kan indeholde den samme forbindelse 10 eller forskellige forbindelser i samme koncentration eller i forudbestemte koncentrationer, der varierer fra fordybning til fordybning.

Filmene fremstilles på den ovenfor beskrevne måde, og hele apparatet kan være tillukket med en vedhæftende 15 folie og kan opbevares ved omgivelsestemperatur i flere måneder eller endog år, før det anvendes.

Apparatet kan være fremstillet af et hvilket som helst materiale, men et syntetisk materiale som f.eks. polystyren vil være særlig velegnet. Til illustration heraf 20 tjener tegningen, hvor fig. 1 viser et apparat ifølge opfindelsen set fra oven og med fordybhingerne anbragt i rækker og kolonner (1,2,3,4-12 hhv. A,B,C-H) som mikrotiterbrønde i en pladeformet bærer, 25 fig. 2 viser apparatet set fra neden og ifyldt sta biliseret biologisk aktivt materiale i bunden af hver brønd, og fig. 3 i perspektiv viser et lodret snit i fig. 1 efter linien 3-3.

30 I en foretrukken udførelsesform består apparatet af reaktangulære plader på ca. 12 x 8 x 1,5 cm, hver omfattende et arrangement af 8 rækker med 12 cirkulære fordybninger, der er 0,5 cm i diameter og 1 cm dybe og har halvkugleformet bund (se fig. 1 og 3). Fortyndinger af den ke-35 miske forbindelse, der skal prøves som biologisk aktivt materiale, i opløsning sammen med stabilisatoren anbringes i de 1487 13 o 9 første 10 fordybninger i rækken, medens der i de sidste to fordybninger anbringes alikvote mængder af den stabiliserede opløsning alene. Rumfanget, koncentrationen af stabilisatoren og den kemiske forbindelse og overfladearealet, hvorpå 5 opløsningen afsættes, vælges således, at der efter tørring dannes film af en tykkelse på 0,01-50 ^im, fortrinsvis 0,1-5 ^im og ideelt 0,3-1 ^im på bunden af fordybningerne.

Efter tilsætning af blandingen af stabilisator og den kemiske forbindelse, der skal prøves, og tørring ved 10 luft- eller vakuumtørring kan apparatet dækkes med en vedhæftende folie eller et vedhæftende laminat og forsegles til beskyttelse af det mod omgivelserne.

De følgende eksempler skal tjene til nærmere illustrering af opfindelsen.

15

Eksempel 1 I destilleret vand og ved stuetemperatur fremstilles opløsninger af de nedenfor nævnte antibiotika i de angivne koncentrationer.

20

Sulfamethoxazol 200 ^ig/ml

Trimethoprim 40

Benzylpenicillin 12 -

Ampicillin 80 25 Cephaloridin 80

Tetracyclin 80

Erythromycin 80

Gentamycin 80 30 Opløsningerne steriliseres i kulden ved at ledes gen nem et passende filter, og hver opløsning fortyndes med et lige så stort rumfang af en 0,05%'s (vægt/rumfang) opløsning af en gelatine af god kvalitet (Bloom-nr. 200) i destilleret vand af stuetemperatur, der i forvejen var indstillet på en pH-værdi på 7 og steriliseret i en autoklav i 15 minutter ved et tryk på 1 ato. Af hver af disse antibiotikum-op- o 148713 ίο løsninger fremstilles aseptisk en række på ni dobbeltfortyndinger ved succesive fortyndinger med lige så store rumfang åf en 0,025%'s (vægt/rumfang) opløsning af gelatine, der i forvejen er indstillet på en pH-værdi på 7 og 5 steriliseret ved autoklavering.

Disse opløsninger overføres derefter til de sterile reservoirer i et apparat som beskrevet i britisk patent nr. 1.520.745, der er i stand til at udtømme 96 dråber på hver 25 jil i fordybningerne i ert poly-10 styren-plade. De anvendte plader er rektangulære med en størrelse på ca. 12 x 8 x 1,5 cm og indeholder hver et arrangement af 8 rækker med 12 cirkulære fordybninger med en diameter på 0,5 cm og en dybde på 1 cm og med halvkugleformet bund. Fortyndingerne af hvert antibiotikum udtøm-15 mes i de første 10 fordybninger i en række, idet der i de to sidste fordybninger anbringes 25 jil alikvoter af en 0,025%'S (vægt/rumfang) gelatineopløsning alene.

De således præparerede plader vakuumtørres derefter ved ikke under 20 Torr og ved en temperatur ikke væsentligt 20 over omgivelsestemperatur. Tykkelsen af de opnåede film er ca. 0,4 ^om. Pladerne forsegles derefter med aluminiumfolielaminat i et varmeforseglingsorgan (fra Sharp-Intermatic eller Aylesham, England).

De færdige plader undersøges derefter med hensyn til 25 antibiotisk evne ved tilsætning af en alikvot mængde på 50 jil af en passende bakteriologisk dyrkningsvæske indeholdende ca. 106 mikroorganismer pr. ml. Til forsøgene anvendes forskellige dyrkningsvæsker, men den principielt anvendte er hjerte-infusionsvæske (fra Difco Laboratories of Detroit, 30 ' USA). I de fleste af forsøgene er der anvendt to mikroorganismer, nemlig Staph, aureus NCTC 6572 og E. coli NCTC 10418 Pladerne er derefter tillukket igen med en passende adhæsivfilm (fra Cellotape Products UK of Middlesex, England) og inkuberet ved 37°C natten over. Den mindste inhibitoriske 35 koncentration (MIC) for hvert af de anvendte antibiotika bestemmes derefter ved inspektion af pladerne og notering o 11 148713 af den laveste koncentration/ ved hvilken der ikke ses nogen vækst, idet vækst indiceres ved en knop af celler på bunden af fordybningerne. Til kontrol anbringes der i den næstsidste fordybning i hver række en alikvot mængde på 5 50^il af dyrkningsvæsken uden organismer, og denne vil hol de sig fri for vækst efter inkubering, medens den sidste fordybning i hver række, hvori der er anbragt et inoculum af organismerne, men intet antibiotikum, vil give en god vækst helt igennem. Ingen mangler ved fremgangsmåden er 10 konstateret gennem disse to kontrolrækker i nogen af de undersøgte plader.

Endvidere er der ikke blevet iagttaget noget tab af styrke hos de undersøgte antibiotika over et tidsrum på 3 måneder,hvadenten opbevaring skete ved -20, 2 eller 20°C.

15 Derimod vil penicillinerne især vise et hurtigt tab af antibiotisk styrke, når de tørres uden stabilisator og opbevares ved omgivelsestemperaturer.

Eksempel 2 20 Den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde gentages med den undtagelse, at der anvendes 25 ^il af en vandig opløsning af 0,075% (vægt/rumfang) gelatine. Tykkelsen af den opnåede film er ca. 1 ^om.

25 Eksempel 3

Den i eksempel 1 beskrevne metode gentages med den undtagelse, at der anvendes 25 pi af en vandig opløsning af 0,0075% (vægt/rumfang) gelatine. Tykkelsen af den opnåede film er ca. 0,1 um.

30 '

Eksempel 4

Den i eksempel 1 beskrevne metode gentages med den undtagelse, at der anvendes 25 jxl af en vandig opløsning af 0,025% (vægt/rumfang) bovint serum-albumin. Tykkelsen af

OC

den opnåede film er ca. 0,4 ^om.

De i eksemplerne 2-4 opnåede produkter udviser de samme fremragende egenskaber som det i eksempel 1 opnåede produkt.

148713

O

12

Eksempel 5

Der fremstilles film under anvendelse af den ovenfor beskrevne arbejdsmåde, og bestemmelsen af disses tykkelse samt iagttagelser med hensyn til deres hæfteevne på for-5 skellige typer formstofmateriale konstateres med de nedenfor anførte resultater.

Opløsninger af afioniseret gelatine af farmaceutisk kvalitet fremstilles ved opløsning af 1,4 g i 20 ml destilleret vand. Disse opløsninger fortyndes derpå yderligere med 10 destilleret vand til opnåelse af de nedenfor anførte koncentrationer .

Koncentration (vægtprocent/rumfang) 3,5 i,4 15 0,7 0,35 0,14 0,07 0,035 20 0,014 0,007

Derefter påføres hver koncentration af opløsningerne som dråber i en mængde på 25 yul i rækkefølge på overfladen 25 af prøveemner, som måler 12 x 4 cm, og som er fremstillet af følgende formstoffer:

Polycarbonat Polyethylen Polymethylmethacrylat 30 Polystyren

Polytetrafluorethylen Polyvinylchlorid

Formstofpladerne lægges i holderen på en termosta-35 tisk styret vakuumovn, som holdes på 45°C, og hvori holdes et tryk på 20 Torr, i 30 minutter.

o 13 148713

Vakuet nedsættes derefter til ca. 3 Torr, og tørringen fortsættes i yderligere 1,5 timer.

Formstofpladerne udtages derpå fra ovnen, og deres udseende inspiceres og fotograferes. Det viser sig herved, 5 at de seks laveste koncentrationer konsekvént giver i det yæ-sentlige helt flade film, som er bundet meget stærkt til formstofoverfladerne, hvorimod de ved de tre højeste koncentrationer fremstillede film er noget tykkere og udviser et rynket overfladeudseende og kan trækkes af formstofoverflader-10 ne. De tykke film viser sig endvidere ikke at være bundet særlig kraftigt til formstofoverfladerne og at kunne fjernes ved bortblæsning. På den anden side har ethvert forsøg på at fjerne tynde film, f.eks. ved afkrasning ved hjælp af en nål, kun vist sig at føre til ridsemærker, idet filmene 15 selv ved en sådan overrivning ikke lader sig fjerne flagevis fra formstofoverfladerne.

Filmenes tykkelser beregnes ud fra den kendte vægt af den påførte mængde gelatine, massefylden og det tilnærmede overfladeareal. Således indeholder 25/ul 0,035 vægtprocent/rum-20 fang 7,7/ig gelatine (idet gelatinens fugtighedsindhold regnes til 12 vægtprocent), hvor denne mængde dækker en cirkelformet 2 flade med en diameter på ca. 5 mm, dvs. et areal på ca. 19,6 mm .

3

Da massefylden er 1,35 g/cm , udgør den beregnede tykkelse herved 0,29/im.

25 De tynde films tykkelse måles under anvendelse af et Michelson Spektral-interferometer. Målingerne udføres i tre trin: a) Størrelsesordenen på rand- eller sømforskydningen bestemmes under anvendelse af hvidt lys (fra en wolframtrådlampe) 30 med ringe spektral båndbredde.

b) Randforskydningens heltal bestemmes visuelt under anvendelse af en kombineret kviksølvdamplampe og en lampe med rødt lys af 633 nm (fra en wolframlampe med en interferensfilter) , hvorved fås skarpt definerede mønstre af farvede 35 bånd, der uden vanskelighed lader sig skelne.

c) Den fraktionelle randforskydning bestemmes under anvendelse af monochromatisk rødt lys (633 nm fra en wolframlampe med interferensfilter) og påvises som forstørret billede af randene i en TV-monitor med lukket koblingskredsløb. Målingerne foretages på det på skærmen viste billede.

O

14 148713

Summen af målingerne b) og c) giver den samlede randforhaling "x", ud fra hvilken filmtykkelsen beregnes under anvendelse af følgende udtryk: 5 λ - xA 2 (>u-l) 10 hvori d betegner filmtykkelsen, x betegner randforhalingen, Λ betegner lysets bølgelængde, og /a betegner filmens brydningsindeks.

15 Det er ikke altid muligt at måle tykkelsen på filmene fremstillet med de tre højeste koncentrationer på denne måde, da disse film ikke er tilstrækkeligt flade.

I den følgende tabel er disse films tykkelser anført beregnet på den ovenfor angivne måde således som 20 bestemt ved hjælp af interferometri.

Opløsningens koncentration Filmtykkelse (/um) (vægtproc en t/r umf ang)_beregnet_målt_ 3,5 29 20,8 25 1 ^4 11,6 0,7 5,8 3,87 0,35 2,9 2,25 0,14 1,15 0,87 0,07 0,58 0,35 30 0,035 0,29 0,20 0,014 0,12 0,09 0,007 0,058 0,04 35