DE2759342C3 - Vorrichtung zur mechanischen und chemischen Stabilisierung von biologisch aktiven Verbindungen mit einem filmbildenden Stabilisator und zur Durchführung von biologischen Testen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Es ist üblicherweise bei der Identifizierung von Mikroorganismen notwendig, die Effekte einer Vielzahl von biologisch aktiven Substanzen auf ihr Wachstum zu überprüfen. Dies ist von besonderer Bedeutung im Fall von antibiotischen Substanzen, bei denen die Kenntnis der zur Hemmung des Wachstums notwendigen Menge für die therapeutische Anwendung benötigt wird. Die klassische Bestimmung dieser minimalen Hemmungskonzentration (MHK) erfolgt in einer Reihe von Rohren, die ein flüssiges Kulturmedium enthalten, wobei eine unterschiedliche Menge des Antibiotikums in jedem Rohr enthalten ist. Nach der Beimpf ung mit dem Mikroorganismus und der Inkubation kann der MHK-Wert aufgrund des Rohres mit der niedrigeren antibiotischen Konzentration, in dem kein Wachstum stattgefunden hat, besiimmt werden.

Alternativ können Agarplatten, die eine Reihe von antibiotischen Konzentrationen aufweisen, oder einfache Agarplatten, in die die Antibiotika aus Papierscheiben, die mit den Antibiotika imprägniert sind, diffundiert werden, zur Anwendung gelangen. Die Anwendung dieser Vorrichtungen erfordert wesentliche Fachkenntnis st und beträchtliche Arbeit; da einige Antibiotika nicht stabil im Kulturmedium sind, müssen die Merlien frisch vor dem Gebrauch hergestellt werden.

In der US-PS 3416998 ist beispielsweise beschrieben, daß auf einer Platte eine relativ dicke Schicht aus einer wäßrigen Agarlösung, welche die Testsubstanz, ι. B. chemotherapeutische Mittel, enthält, nach Trocknen erhalten wird. Teile der getrockneten Schicht können auf Bakterienkulturen aufgebracht

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5(1 werden, wonach der Einfluß der Testsubstanz auf das Wachstum der Bakterien bewertet wird. Diese Arbeitsweise ist jedoch umständlich, und die Ergebnisse zeigen eine Neigung zu beträchtlichen Abweichungen. Gemäß der NL-OS 6917655 werden aus einer Lösung eines inerten hochmolekularen Materials, dem Verbindungen zugefügt sind, welche das Wachstum von Bakterien fördern, Materialschichten in verschiedenen Rohren hergestellt, denen in einer weiteren Stuie ein Impfstoff zugegeben wird, worauf das Wachstum der Bakterien bewertet wird.

Ein Nachteil der bekannten Anordnung besteht darin, daß die abgeschiedene Schicht aus dem inerten, hochmolekularen Material und der einverleibten chemischen Verbindung, welche das Wachstum der Bakterien fördert, ziemlich dick is» und eine unzureichende mechanische Stabilität besitzt. Außerdem ist es nachteilig, daß eine vergleichsweise große Menge des hochmolekularen Materials erforderlich ist.

Aus der NL-OS 7205619 ist es bekannt, eine mit einem Antibiotikum imprägnierte Papierscheibe auf eine Agarplatte aufzulegen. Das Antibiotikum diffundiert von der Papierscheibe auf den Agar, und es bildet sich ein Konzentrationsgradient aus. Die Durchführung dieser Arbeitsweise ist schwierig und führt zu stark schwankenden Ergebnissen.

In der FR-PS 1488 866 sind Vorrichtungen zur Bestimmung der Empfindlichkeit von Mikroorganismen in Gegenwart unterschiedlicher Antibiotika beschrieben. Die zu untersuchenden chemischen Verbindungen und Organismen liegen in lyophilisierter Form vor, was diese für mechanische Verluste empfindlich macht und zu unzuverlässigen Ergebnissen führt.

Aus der DE-AS 1227855 ist ein Verfahren zur-Herstellung von Enzymkörpern für die Durchi ührung enzymatischer Reaktionen beschrieben, bei eiern die Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen trokken emulgiert oder gelöst in ein gelöstes Einbettungsmaterial eingearbeitet werden, das z. B. aus Polyamid besteht. Soweit nach dem bekannten Verfahren Membranen oder Lamellen als Enzymkörper hergestellt werden, haben diese eine wesentliche Dicke. In der DE-OS 21 52 068 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung für den Empfindlichkeitstest von Antibiotika beschrieben, worin Einzelbehälter einer Reihe von Behältern jeweils eine getrocknete Form des Antibiotikums enthalten, welches durch Trocknung einer Antibiotikumdispersion in einem Lösungsmittel erhalten wurde. Nach dem beschriebenen Verfahren werden, wenn das Antibiotikum aus einem Penicillin besteht, nichtwäßrige Dispersionsmedien bevorzugt, um die Losungsmittelentfernung zu vereinfachen. Falls das Medium wäßrig ist, kann jedes Trocknungsverfahren verwendet werden, jedoch wird insbesondere die l.yophilisierung empfohlen. Hei der Verwendung der Versuchsvorriehtung muli das getrocknete Antibiotikum in einem Nährmedium, das der Kultur des zur Untersuchung anstehenden Mikroorganismus dient, erneut dispergiert werden. Die in dieser Weise stabilisierten, insbesondere lyophilisierun Präparate sind schwierig einsetzbar und führen zu ungenauen Versuchsergebnissen.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung ei ner Vorrichtungzur mechanischen und chemischen Stabilisierung von biologisch aktiven Verbindungen und zur Durchführung von biologischen Testen, wobei auch sehr kleine Mengen biologisch aktiver Substanzen in einer sowohl mechanisch als auch chemisch stabilen

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Form bequem untersucht und überprüft werden können.

Erfindungsgegenstand ist die im Anspruch 1 genannte Vorrichtung. Die Ansprüche 2 bis 4 nennen vorteilhafte Ausgestaltungen des Erfindungsgegenstandes.

Der Träger kann plattenförmig ausgebildet und aus synthetischem Material, wie Polystyrol, gefertigt sein.

Bei Anwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung können in einfacher Weise biologisch aktive Verbindungen oder Testsubstanzen in den Vertiefungen in stabilisiertem Zustand in Form eines zusammenhängenden, trockenen Films erhalten werden.

Die bei der Vorrichtung gemäß der Erfindung erzielte vorzügliche Haftung der Filme in den Vertiefungen des Trägers ist gewährleistet, wenn die Stärke der Filme in den angegebenen Bereichen von 0,01 bis SO um fällt Innerhalb dieses Bereiches sind die zwischen dem FUm und dem Träger auftretenden »van der Waalsc-Kräfte größer als die Kräfte, die während der Trocknung des Films auftreten (Schrumpfkräfte) oder sind diesen wenigstens gleich.

Es kann dabei ein Gemisch, das mindestens eine zu stabilisierende Komponente, einen filmbildenden Stabilisator und ein Lösungsmittel enthält, hergestellt, ein ger'nger Anteil des Gemisches auf der Aufnahmeoberfläche in jeder Vertiefung verteilt und das Lösungsmittel abgedampft werden, so daß ein zusammenhängender getrockneter, an der Aufnahmeoberfläche anhaftender Film mit einer Stärke im genannten Bereich ausgebildet wird.

Unter »Stabilisierung« wird sowohl eine mechanische Stabilisierung als auch eine chemische Stabilisierung, beispielsweise gegen Hydrolyse, pH- und Ionenumgebungs-Änderungen oder hohe Temperaturen verstanden.

Die zu stabilisierenden Verbindungen sind biologisch aktive Verbindungen, wie Antibiotika, die gegenüber Wärme, vorhandener Feuchtigkeit oder extremen pH-Bedingungen empfindlich sind.

Als Stabilisator kann ein weiter Bereich von Materialien mit filmbildenden Eigenschaften wie Agar, Cellulosederivate oder zweckmäßig Materialien wie Gelatine, Kasein, Rinderserumalbumin od. dgl. verwendet werden. Für medizinische Zwecke wird in ungünstiger Weise Gelatine eingesetzt.

Das zu verwendende Lösungsmittel kann prinzipiell aus beliebigen Lösungsmitteln bestehen. Für medizinische Zwecke wird im allgemeinen destilliertes Wasser zur Herstellung wäßriger Lösungen des Stabilisators und der zu stabilisierenden Verbindung eingesetzt. Die Bereitung derartiger Lösungen und sämtliche nachfolgenden Stufen werden zweckmäßig unterhalb derjenigen Temperatur durchgeführt, bei der eine der Komponenten des Gemisches angegriffen wird.

Volumen und Konzentration der Teile des Gemisches aus Stabilisator und zu stabilisierender Verbindung werden so gewählt, daß das auf der Aufnahmeoberfläche abgeschiedene Material nach der Trocknung Filme mit Stärken von 0,01 bis 50 um ergibt. Geeignete Volumen und Konzentrationen lassen sich leicht in jedem speziellen Fall bestimmen, damit die Erfordernisse hinsichtlich der Stärke des Filmes, des Zusammenhanges und des Anhaftens an der Aufnahmeoberfläche erfüllt werden.

Brauchbare Lösungen des Stabilisators, beispielsweise Gelatine, enthalten den Stabilisator in einer Konzentration, die üblicherweise im Bereich zwischen 0,001 bis 0,5% Gewicht/Volumen, zweckmäßig zwischen 0,01 und 0,1% Gewicht/Volumer, und insbesondere zwischen 0,01 und 0,03% Gewicht/Volumen liegt.

Im nachstehenden wird ein Ausführungsbeispiel

der Vorrichtung gemäß der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. In der Zeichnung zeigt Fig. 1 eine Draufsicht auf eine Vorrichtung gemäß

ίο der Erfindung, und

Fig. 2 einen Teilquerschnitt durch die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung.

Die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung weist einen plattenartigen Träger 1 auf, der eine Schar einzelner Reihen von Vertiefungen 2 besitzt. Die Vertiefungen sind gleichmäßig über den Träger 1 verteilt und bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel in senkrecht verlaufenden Spalten 1 bis 12 und horizontalen Reihen A bis H angeordnet. Die Vertiefungen 2 des gezeigten Ausführungsbeispiels haben in der Draufsicht eine kreisförmige Gestalt.

Fig. 2 zeigt einen Teilquerschnitt durch die Vorrichtung gemäß der Erfindung, aus welchem die Vertiefungen 2 anschaulich hervorgehen. Die Vertiefungen besitzen einen halbkugelförmigen Bodenteil 3. Wie aus Fig. 2 hervorgeht, sind die halbkugelförmigen Bodenteile mit einem Film 4 und einem Stabilisator aus einer biologisch aktiven Verbindung (Testsubstanz) überzogen. Die Filme 4 haben eine Stärke von 0,01 bis 50 μιη, vorzugsweise 0,01 bis 5 um und im Idealfall von 0,3 bis 1 μιη. Die Vertiefungen 2 besitzen zweckmäßig gleiche Abmessungen.

Wenn die vorstehend beschriebene Vorrichtung verwendet wird, werden Volumen von 1 bis 500 Mi-

.15 kroliter, zweckmäßig 10 bis 100 Mikroliter Lösung des Gemisches aus Stabilisator und Testsubstanz, auf die feste Oberfläche aufgegeben.

Die aufzugebende Lösung wird üblicherweise durch Vermischung entsprechender Volumen der Lösungen des Stabilisators und der zu stabilisierenden Verbindung, erforderlichenfalls unter Einstellung des pH-Wertes auf den gewünschten Wert, und, falls erforderlich, Stcrilisicrung hergestellt.

Um die notwendige mechanische Stabilität, d. h. ein

4s gutes Anhaften an der festen Oberfläche nach der Trocknung, zu erzielen, müssen die Filme eine Stärke von 0,01 bis 50 μιη, vorzugsweise von 0,01 bis 5 μιη und im Idealfall von 0,3 bis 1 μτη besitzen. Es ist wichtig, daß die getrockneten Filme von einer Stärke insu nerhalb des angegebenen Bereiches sind, da die Kontraktion dickerer Filme während der Trocknung eine Ablösung an den Kanten und einen Verlust der mechanischen Stabilität verursacht.

In gewissem Ausmaß hängt die Haftung der Filme von der Geometrie der festen Oberfläche des Trägers ab, auf den das Gemisch verteilt wird.

Es scheint nur wenig oder kein Unterschied im Verhalten der erhaltenen dünnen Filme hinsichtlich unterschiedlicher synthetischer Kunststoffmaterialien,

ω wie Polyäthylen, Polystyrol, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polymethacrylat oder Polytetrafluorethylen zu bestehen.

Brauchbare getrocknete Filme werden durch Entfernur.3 des Lösungsmittels, das aus beliebigen Lö-

(Λ sungsmittelnbestehen kann, jedoch üblicherweise aus Wasser besteht, durch Lufttrocknung oder in günstiger Weise unter verringertem Druck gebildet. Zweckmäßigwird die Trocknung unter solchen Bedingungen

ausgeführt, daß die Flüssigkeit nicht siedet oder gefriert, da das Sieden Anlaß zu mechanischen Verlusten geben kann und die Gefriertrocknung keinen zusammenhängenden Film ergibt. Im Fall von Wasser als Lösungsmittel werden die Flüssigkeit zweckmäßig zwischen 5 und 30° C und das Vakuum bei etwa 20 Torr gehalten.

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist insbesondere zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von Antibiotika gegen pathogene Mikroorganismen geeignet.

Die Vertiefungen 2 in dem Träger 1 der Vorrichtunggemäß der Erfindung können gleiche oder unterschiedliche Substanzen in der gleichen Konzentration oder in von Vertiefung zu Vertiefung varrierenden vorbestimmten Konzentrationen enthalten.

Die Filme 4 können nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise hergestellt werden. Die Vorrichtung kann mit einer Haftfolie verschlossen werden und kann bei Umgebungstemperaturen während einiger Monate gelagert werden, bis es für den Gebrauch benötigt wird.

Eine günstige Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung besteht aus rechteckigen Platten 1 von etwa 12 X 8 X 1,5 cm, die jeweils eine Schar von 8 Reihen von 12 Vertiefungen 2 mit kreisförmigem Querschnitt mit 0,5 cm Durchmesser und 1 cm Tiefe mit halbkugelförmigen Bodenteilen (vgl. Fig. 1) enthalten. Die Verdünnungen der zu untersuchenden chemischen Verbindungen werden in die Lösung mit dem Stabilisator in die ersten 10 Vertiefungen der Reihe verteilt, während die letzten 2 Vertiefungen lediglich aliquote Teile der Stabilisierlösung erhalten. Das Volumen, die Konzentration des Stabilisators und der chemischen Verbindung und der Oberflächenbereich, worauf die Lösung verteilt wird, werden so gewählt, daß nach der Trocknung Filme mit einer Stärke von 0,01 bis 50 μητι, vorzugsweise 0,01 bis 5 Mikron, und im Idealfaii von 0,3 bis 1 μπι, beispielsweise auf dem Boden der Vertiefungen gebildet werden.

Nach der Zugabe des Gemisches aus Stabilisator und der zu untersuchenden chemischen Verbindung und Trocknen mittels Luft- oder Vakuumtrocknung kann die Vorrichtung mit einer Haftfolie oder einem Schichtgebilde abgedeckt und dicht verschlossen werden, um sie gegenüber der Umgebung zu schützen.

Nachfolgend wird die Anwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung zur Stabilisierung biologisch aktiver Verbindungen beschrieben.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Lösungen der aufgeführten Antibiotika wurden in den angegebenen Konzentrationen in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur hergestellt:
Sulfa methoxazol 200 μg/ml

Trimethoprim 40 μg/ml

Benzylpenicillin 12μ^ΐη1

Ampicillin 80 ug/ml

Cephaloridin 80 μ§/ΐη1

Tetracyclin 80 μg/ml

Erythromycin 80 μg/ml

Gentamicin 80 μ^πιΐ

Die Lösungen wurden in der Kälte sterilisiert, indem sie durch ein geeignetes Filter geführt wurden und wurden jeweils mit einem gleichen Volumen einer Lösung mit 0,05% Gewicht/Volumen Gelatine von guter Qualität (Bloom-Zahl 200) in destilliertem Wasser von Raumtemperatur verdünnt, welche vorhergehend auf pH 7 eingestellt und in einem Autoklaven während 15 Minuten bei 1 atü Druck sterilisiert worden war. Aus jeder dieser Antibiotikalösungen ■ wurde aseptisch eine weitere Reihe von 9 Doppelver- ^ dünnungen durch aufeinanderfolgende Verdünnungen mit gleichem Volumen einer 0,025 %igen Gewicht/Volumen Gelatinelösung, die vorhergehend auf

κι pH 7 eingestellt worden war und im Autoklaven sterilisiert worden war, hergestellt. ■!

Diese Lösungen wurden dann in die sterilen Behälter einer Vorrichtung übertragen, die zur Verteilung i^! _; von 96 Tropfen, jeweils von 25 Mikroliter Volumen, ;:>

is in die Vertiefungen 2 einer Polystyrolplatte 1 einge- | richtet war. Die verwendeten Platten waren von | rechteckiger Form mit etwa 12 X 8 X 1,5 cm; sie ent- '; hielten jeweils eine Schar von 8 Reihen aus 12 kreis- ' förmigen Vertiefungen 2 von 0,5 cm Durchmesser und 1 cm Tiefe mit halbkugelförmigen Böden. Die Verdünnungen jedes Antibiotikums wurden in die ersten 10 Vertiefungen einer Reihe verteilt, wobei die letzten beider Vertiefungen 25 Mikroliter aliquoter Teile lediglich der Gelatinelösung mit 0,025% Gewicht/Volumen erhielten.

Die auf diese Weise hergestellten Platten 1 wurden vakuumgetrocknet, wobei sichergestellt wurde, daß das Vakuum nicht unterhalb 20 Torr abfiel oder die Temperatur wesentlich oberhalb Raumtemperatur

jo anstieg. Die Stärke der erhaltenen Filme 4 betrug; etwa 0,4 Mikron. Die Platten 1 wurden mit einem'-Schichtgebilde aus Aluminiumfolie in einer Wärmeversiegelungsvorrichtung versiegelt.

Die auf diese Weise hergestellten Platten wurden,

is auf die antibiotischen Wirksamkeiten durch Zusatz von aliquoten Teilen von 50 Mikroliter einer geeigneten bakteriologischen Kulturbrühe, die etwa 10* Mikroorganismen je ml enthielt, untersucht. Verschiedene Kulturbrühen wurden angewandt, jedoch war

4(i die hauptsächlich angewandte die »Herzinfusionsbrühe«.

Zwei Mikroorganismen "wurden bei den meisten Testen verwendet, nämlich Staph. aureus NCTC 6571 und E. coli NCTC 10418. Die Platten 1 wurden dann erneut mit einem geeigneten Klebfilm verschlossen und bei 37° C über Nacht inkubiert. Die minimale Hemmkonzentration (MHC) jedes Antibiotikums wurde dann durch Untersuchung der Platten 1 und Feststellung der niedrigsten Konzentration, bei der

si, kein Wachstum ersichtlich war, bestimmt. Das Wachstum zeigte sich durch einen Zellenknopf am Boden der Vertiefungen 2. Zu Kcntra!!zwecke-n erhielt die vorletzte Vertiefung 2 jeder Reihe einen aliquoten Teil von 50 Mikrolitern der Kulturbrühe ohne

s_S Organismen und soll nach der Bebrütung frei von; Wachstum bleiben; hingegen soll die letzte Vertief fung 2 jeder Reihe, die ein Inokulum der Organismen: erhalten hat, jedoch keine antibiotische Substanz, ein durchwegs gutes Wachstum zeigen. Es zeigten sich;

_w, ke. ί Verfahrensfehler bei diesen beiden Kontrollrei|'

her. bei sämtlichen untersuchten Platten 1. Ji

Es zeigte sich kein Verlust der Potenz der unter|

suchten Antibiotika im Verlauf von 3 Monaten, ganz:

gleich ob sie bei -20° C, 2° C oder 20° C gelagerf

wurden, während insbesondere die Penicilline eineii rapiden Verlust üer Potenz zeigen, wenn sie ohne Stej| bilisator getrocknet und bei Umgebungstemperaturen' gelagert werden. ' \

*»^' r-t —

Beispiel 2

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß 25 Mikroliter einer wäßrigen Lösung mit 0,075% Gewicht/Volumen an GeIa- s tine verwendet wurden. Die Stärke des erhaltenen Films 4 betrug etwa 1 μπι.

Beispiel 3

Die Arbeitsweise nach Beispiel 1 wurde wiederholt ι ο mit der Ausnahme, daß 25 Mikroliter einer wäßrigen Lösung mit 0,0075% Gewicht/Volumen Gelatine verwendet wurden. Die Stärke des erhaltenen Films 4 betrug etwa 1 μπι.

is Beispiel4

Die Arbeitsweise nach Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß 25 Mikroliter einer wäßrigen Lösung mit 0,025% Gewicht/Volumen Rinderserum-Albumin verwendet wurden. Die Stärke des erhaltenen Films 4 betrug etwa 0,4 um.

Die nach den Beispielen 2-4 erhaltene Vorrichtung zeigte die gleichen hervorragenden Eigenschaften wie die Vorrichtung nach Beispiel 1.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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Claims (4)

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur mechanischen und chemischen Stabilisierung von biologisch aktiven Verbindungen und zur Durchführung biologischer, von diesen Verbindungen abhängiger Teste, die in Reihen von Vertiefungen in einem Träger jeweils einen Teil mindestens einer zu stabilisierenden aktiven Verbindung in einer getrockneten, für die Kultur der Mikroorganis- m men verträglichen Form aufweist, dadurch ge kenn ζ e i c h η e t, daß die Vorrichtung in den Vertiefungen (2) in dem Träger (!) jeweils einen zusammenhängenden trockenen Film mit einer Stärke von 0,01 bis 50 μιη aufweist, der auf der inneren Oberflä- ι s ehe der Vertiefungen (2) anhaftend ist, und der mindestens eine biologisch aktive, durch Einverleibung

in einen an sich bekannten fümbildenden Stabilisator mechanisch und chemisch stabilisierte Verbindung enthält. ^M

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke des Films von 0.01 bis 5 μιη beträgt

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke des Films von 03 bis 1 μπι beträgt

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich mit einer anhaftenden Folie abgedeckt ist.