DK146100B - Fremgangsmaade til fremstilling af 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-cephalosporinderivater - Google Patents

Description

/* / s'**? " ( ψ·$

(19) DANMARK MS

§02) FREMLÆGGELSESSKRIFT po 146100 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 5797/76 (51) Intel.3: C12 P 35/08 (22) Indleveringsdag: 22 dec 1976 C 07 D 501/57 (41) Aim. tilgængelig: 26 jun 1977 (44) Fremlagt: 27 jun 1983 (86) International ansøgning nr.: - (30) Prioritet: 25 dec 1975 JP155646/75 26jul 1976 JP 88770/76 (71) Ansøger: ‘YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO. LTD.; Tokyo, JP.

(72) Opfinder: Takashi *Osono; JP, Yoshlhlko Oka; JP, Shunichi ’Watanabe; JP, Takeshi ‘Salto; JP, Hiroshi ‘Gushima; JP, Kelsuke ‘Murakami; JP, Isao *Takahashi; JP, Hiroshi ‘Yamaguchi; JP, Toshlo ‘Sasaki; JP, Kiyoshi ‘Susaki; JP, Shuichl *Takamura; JP, Toshlaki ‘Mlyoshi; JP.

(74) Fuldmægtig: Patentbureauet Hofman-Bang & Boutard (54) Fremgangsmåde til fremstilling af 7-(4-carboxy-butyramido)-7-methoxy-cephalosporinderivater

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-cephalosporinderivater med den i krav l's indledning angivne almene formel Ab.

Som eksempler på den nitrogenholdige heterocykliske gruppe an-2 givet som R i den almene formel kan nævnes 5-carboxymethylthio- 1,3,4-thiadiazol-2-yl, l-methyl-lH-tetrazol-5-yl, 5-methyl-l,3,4-qj thiadiazol-2-yl og 1,3,4-thiadiazol-2-yl.

O

O Kationen for M er valgt blandt alkalimetaller, såsom natrium og (O kalium, jordalkalimetaller, såsom calcium, magnesium og barium, i— tungmetaller, såsom jern, kobber og zink, og baser, der danner ^ kvaternære salte eller aminosalte, f.eks. triethylamin, dieth- Ω 2 146100 anolamin, piperidin og morpholin.

o 2

Nar R har de ovennævnte betydninger, fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen følgende.forbindelser: 7-(4-carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-/\^-cephem-4-carboxyIsyre, 7-(4-carboxybutyramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-me thoxy-/\^-cephem-4-carboxy1syre, 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-^^-cephem-4-carboxylsyre, 7_(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-Δ3 -cephem-4-carboxylsyre, og saltene af disse forbindelser.

Nogle 7-methoxy-3-heterocyclothiomethyl-cephalosporiner er angivet at være fremstillet ved kemiske synteser i britisk patentskrift nr.

1 321 412 (1970), men der er ikke angivet nogen praktiske fysiske og kemiske egenskaber af disse forbindelser i det britiske patentskrift .

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede cephalospo-rinderivater, som har en methoxygruppe i 7-stillingen og en hetero-cyklisk thiomethylgruppe i 3-stillingen, viser særlig udmærket virkning ved behandling af alvorlige sygdomme forårsaget af infektion med sådanne bakterier som Pseudomonas- og Proteus-arter, overfor hvilke almindelige antibiotica er ineffektive, eller med bakterier, som er resistente overfor almindelige cephalosporiner, der ikke har nogen methoxy-gruppe i 7-stillingen.

Cephalosporiner med en heterocyklisk thiomethylgruppe i 3-stil-lingen fremstilles sædvanligvis ved først at fremstille de tilsvarende forbindelser, som har en acetoxymethylgruppe eller en carbamoyloxymethylgruppe i 3-stillingen, ved en gæringsmetode og derpå omsætte produkterne med en heterocyklisk thiolforbin-delse.

3 146100

Det har nu ifølge den foreliggende opfindelse vist sig, at visse hidtil ukendte 7-methoxycephalosporinderivater, som har en heterocyklisk thiomethylgruppe i 3-stillingen, kan opnås direkte ved et enkelt gæringstrin under anvendelse af en cephalosporin-antibioticum-producerende mikroorganisme af slægten Streptomyces.

De således opnåede forbindelser er sådanne med den almene formel HOOC ^ ?CH3 s CH(CH„).,CONH --S N -Aa H9N^ n 1 0^ ch2-s-r2

COOM

2 hvori R og M har den i krav l's indledning angivne betydning.

Forbindelserne med formlen Aa viser udmærkede antimikrobielle aktiviteter, men de viser amphotere egenskaber, da forbindelserne har en aminogruppe og to carboxygrupper i molekylet, og derfor er isoleringen og rensningen af de producerede forbindelser vanskelig. Når imidlertid gruppen HOOCv^^ ^ch(ch2)3co-

h2nX

i disse forbindelser omdannes til HOOC-(CH2)3CO-, udviser de dannede forbindelser med den i krav l's indledning angivne formel Ab kun den sure egenskab, hvilket letter isoleringen og rensningen af forbindelserne, ligesom forbindelserne bliver opløselige i organiske opløsningsmidler.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Et eksempel på en af de mikroorganismer tilhørende slægten Streptomyces, som er nyttige til fremstilling af de omhandlede 7-methoxycephalospo-rin-mellemprodukter i det første trin af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er en hidtil ukendt stamme, som betegnes Streptomyces oganonensis Y-G19Z, og som er isoleret fra jorden i Ogano-Town, Chichibugun, Saitama Prefecture, Japan. Denne stamme er blevet , 146100 4 deponeret i the Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, under accessionsnr. FERM-P 2725 og også i the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland 20852, USA under accessionsnr. ATCC 31167. Stammens mycologiske egenskaber er som følger: I. Morphologiske egenskaber af stammen S. oganonensis Y-G19Z: den vokser både på naturlige og syntetiske medier under dannelse af et velforgrenet substratmycelium, medens dannelsen af luftmycelium ikke er tilstrækkelig og dannelsen af sporer derfor ringe. Sporekæder er lige, tilhørerRr(rectus) eller RF (recti-flexibiles) type og bærer 10-50 sporer på hver kæde. Sporerne er elliptiske, sfæriske eller cylindriske af form og har en størrelse på 0,45-0,60 x 0,55-0,90 ^um. Sporeoverfladen er glat. Der blev hverken iagttaget flagellatsporer eller sporangium.

II. Kulturegenskaber af stammen S. oganonensis Y-G19Z:

Opløseligt

Medium Vækst Luftmycelium pigment

Czapek’s agar meget ringe sparsomt intet hvid' hvidt

Czapek’s glucose- god moderat intet agar flødegul gulliggråt· meget lidt· glucose-aspara- god ringe intet gin-agar hvid hvidt glycerol-aspara- god ringe . intet gin-agar hvid til hvidt til gullighvid gullighvidt uorganisk salt- god ringe intet stivelse-agar gulliggrå til gulliggråt blegt gulligbrun

5 1A 610 O

Opløseligt

Medium Vækst Luftmycelium pigment tyrosin-agar god ringe lidt bleggul gulliggråt blegt guliig- gråt

Jern og gærekstrakt god godt meget lidt -tyrosin-agar bleggul til brunlig hvidt lyst brunlig- gulligbrun til gulliggråt gråt nærings-agar god godt, pulver- lidt blegt gullig- agtigt blegt gulligbrunt brun orange til blegt brunt

Bennett’s agar god godt meget lidt blegt gulligbrun brunliggråt blegt orange til blegt lyserødt calciummalat-agar moderat intet intet flødefarvet kartoffelprop god godt brunliggråt til blegt gulligbrun gulliggråt til mørkt gulligblegt brunliggråt brunt blodagar god intet gulliggråt til olivengrå til mørkt rødligmørk olivengrå brunt

Loeffer’s god intet intet serummedium 6 146100 III. Fysiologiske egenskaber af stammen S. oganonensis Y-G19Z: tyrosinasedannelse negativ nitratreduktion positiv koagulering af skummetmælk positiv, svagt peptonisering af skummetmælk positiv, svagt hydrolyse af stivelse positiv smeltning af gelatine positiv cellulosenedbrydning negativ hæmolyse positiv solubilisering af calciummalat positiv

Udnyttelse af carbonforbindelser:

Carbonkilde Udnyttelse glucose + arabinose + saccharose xylose + inositol mannitol + fructose + rhamnose rhaffinose

Karakteristiske træk ved stammen Streptomyces oganonensis Y-G19Z kan sammenfattes som følger: 1. Den tilhører de ikke-chromogene Streptomyces-stammer.

2. Dens luftmycelium er lige uden verticilier (R eller RF type), 3. Sporerne er sfæriske eller elliptiske.

4. Sporeoverfladen er glat.

5. Den giver blegt gulliggrå til blegt gulligbrun vækst på forskellige medier.

6. Luftmyceliets farve er brunlig hvid, gullig hvid og gulliggrå.

7. Den producerer et antibiotisk stof kaldet Y-G19ZD3 tilhørende gruppen 7-methoxycephalosporiner.

7 146100

Ved eftersøgelse af kendte stammer med de ovennævnte egenskaber kan der som den nærmest beslægtede stamme nævnes Streptomyces globi-sporus, beskrevet i S.A. Waksman: the Actinomycetes 2, 218 (1961) og International Journal of Systematic Bacteriology, 18, (4) 324-325 (1968).

Ved sammenligning med den ovennævnte S. globisporus adskiller stamme Y-§19Z sig imidlertid fra denne på de punkter, som er anført i den følgende tabeli

Egenskab Y-G19Z S. globisporus sporestørrelse (pi) 0,45-0,60 x 0,55-0,90 1,2-1,4 x 1,8-2,0 eller 0,9-1,4 sfærisk opløseligt pigment intet gult til grønliggult på glycerol-aspara- gin-medium rhamnoseudnyttelse negativ positiv stivelsehydrolyse stærk svag koagulering af positiv negativ skummetmælk peptonisering af svag stærk skummetmælk produktion af positiv negativ cephalosporin- antibiotica

Som det klart fremgår af de forskelle, som er anført i denne ovenstående tabel, er stammen Y-G19Z, som kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, en hidtil ukendt stamme, og den har fået navnet "Streptomyces oganonensis".

8 146100

Som forklaret ovenfor er stammen Streptomyces oganonensis Y-G19Z en 7-methoxycephalosporin-antibioticum-producerende stamme, men der kendes andre stammer tilhørende slægten Streptomyces, som vides at producere 7-methoxycephalosporin-antibiotica. Disse er Streptomyces griseus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei,

Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces chartreusis og Streptomyces lactamdurans (se offentligt tilgængelig japansk patentansøgning nr. 3286/71 og belgisk patentskrift nr. 764 l60)/ Streptomyces lipmanii (se US patentskrift nr. 3 719 563),

Streptomyces clavuligerus (se japansk fremlæggelsesskrift nr.

43 594/74), Streptomyces wadayamensis (se offentligt tilgængelig japansk patentansøgning nr. 26488/74), Streptomyces jumonjinensis (se offentligt tilgængelig japansk patentansøgning nr. 42893/74), Streptomyces heteromorphus og Streptomyces panayensis (se offentligt tilgængelig japansk patentansøgning nr. 53594/75) og Streptomyces chartreusis SF-1623 (se de offentligt tilgængelige japanske patentansøgninger nr. 82291/75 og 121 488/75).

Også andre stammer, som tilhører slægten Streptomyces og kan producere 7-methoxycephalosporin-antibiotica, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Fremstillingen af mellemprodukterne med formlen Aa udføres ved dyrkning af en 7-methoxycephalosporin-antibioticum-produce-rende stamme i et almindeligt næringsmedium, hvortil der er sat en heterocyklisk thiol svarende til den heterocykliske thiogruppe, som skal indføres i 3-stillingen.

Som eksempler på de heterocykliske thioler, som kan tilsættes næringsmediet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan nævnes imidazolthiol, dihydroimidazolthiol, pyrazolthiol, triazolthiol, tetrazolthiol, methyltetrazolthiol, diazinthiol, •thiadiazolthiol, thiatriazolthiol, benzimidazolthiol, triazolo-.pyridinthiol og purinthiol.

9 146100

Disse heterocykliske thioler kan anvendes som saltene deraf, og disse salte kan være uorganiske salte, såsom alkalimetalsalte, jordalkalimetalsalte, ammoniumsalte osv., og salte med organiske baser, såsom triethylamin, triethanolamin, dicyclohexylamin, lysin, arginin, histidin, et basisk vandopløseligt antibioticum, f.eks. kanamycin, alkaloid, basisk protein, osv. Der kan om nødvendigt vælges salte med høj vandopløselighed, og hvis de heterocykliske thioler viser en stærk toxicitet overfor de antibioticumprodu*-cerende stammer, kan der vælges salte, som er tungtopløselige i vand.

Endvidere kan der som forbindelser, der kan omdannes til den førnævnte heterocykliske thiol under dyrkningen, nævnes forbindelser, som er forbundet til en organisk eller uorganisk SH-forbindelse med en s-s-binding. Sådanne S-S-forbindelser danner den førnævnte heterocykliske thiol i et dyrkningsmedium eller i myceliet ved kemisk omdannelse og/eller myceliets enzymatiske aktivitet, eller forbindelsen kan sommetider anvendes som den er som forstadium. Som eksempler på disse S-S -forbindelser kan nævnes følgende :

R2S-SCH3, R2S-SC2H5> R2S-SCH2CH20H, R2S-SCH2CH00H, R2S-SG (hvor G

^2 .

her og i det følgende betyder en glutathionrest), R^S-SCH^CH^NH^, o R S-SCoA (hvor CoA betyder en coenzym A rest), r2s-schconhch2cooh, ch3 H00C-CH-CHoCHoCHoC0NH-CH-CH S-SR2 I 2 2 2 1 2 CH_ NH2 X-NHCHCH^ 0 og 0 COOH CH3 H00C-CH-CH0CH0CH0CONH-CH-CHS-SR2 I 2 2 2 ,| ch NH0 .C—N-CHCH 0

/ I ^CH

u COOH

2 ιη 146100 ίο i hvilke formler R har den i krav l's indledning angivne betydning.

Også 2 molekyler af den samme heterocykliske thiol bundet sammen 2 2 af. S-S-bindingen, dvs. R S-SR , kan anvendes.

Endvidere kan, hvis den antibioticumproducerende stamme har evne 2 til at reducere svovlsyre, anvendes forbindelserne R SO^H, R2-S02K, R2-SOH eller salte deraf i stedet for r2SH.

Fremstillingen af mellemprodukterne ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres ved dyrkning af den 7-methoxycephalosporin-antibiotica-producerende stamme af slægten Streptomyces i et næringsmedium med tilsætning af den ovenfor beskrevne heterocykliske thiol eller et salt eller et derivat deraf. Dyrkningen udføres ved konventionelle metoder· til dyrkning af mikroorganismer, men sædvanligvis foretrækkes submers dyrkning i et 'flydende dyrkningsmedium.

Ethvert dyrkningsmedium, som indeholder næringsstoffer for den 7-methoxycephalosporin-antibioticumproducerende stamme af slægten Streptomyces, kan anvendes. Det kan være både syntetiske og halvsyntetiske dyrkningsmedier og naturlige dyrkningsmedier indeholdende de førnævnte næringsstoffer. Til sammensætning af dyrkningsmediet kan glucose, saccharose, mannitol, glycerol, dextrin, stivelse, vegetabilske olier osv. anvendes som carbonkilder, og kødekstrakt, pepton, glutenmel, majsfrømel, soyabønnemel, jord-nøddemel, fiskemel, majsstøbevand, tørgær, gærekstrakt, ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, urinstof og andre organiske og uorganiske nitrogenkilder som nitrogenkilder. Om nødvendigt kan der også sættes et metalsalt, såsom sulfaterne, nitraterne, carbonateme og phosphaterne af Na, K, Mg, Ca, Zn og Fe, til dyrkningsmediet. Endvidere kan der om nødvendigt sættes materialer til fremme af dannelsen af antibiotica eller skumdæmpende midler, såsom methionin, cystein, cystin, methyloleat, svinefedt, siliconeolie, overfladeaktive midler osv. til dyrkningsmediet.

Den førnævnte heterocykliske thiol eller saltet eller derivatet deraf tilsættes sædvanligvis i en koncentration på 0,1-5 mg/ml, fortrinsvis 0,5-2 mg/ml, beregnet som den heterocykliske thiol, og kan tilsættes dyrkningsmediet på én gang før dyrkningens begyndelse eller i flere opdelte portioner i de første stadier af dyrkningen.

11 146100

Det er almindeligvis fordelagtigt at udføre dyrkningen under aerobe forhold, og dyrkningstemperaturen er sædvanligvis fra omkring 18 til omkring 35°C, fortrinsvis omkring 30°C. Endvidere opnås ønskelige resultater, når dyrkningsmediet pH-værdi holdes ved fra omkring 5 til omkring 10, fortrinsvis 6-8. Dyrkningstiden afhænger af det anvendte dyrkningsmediums sammensætning og temperaturen, men er almindeligvis fra omkring 3 dage til omkring 10 dage, og således er det ønskede materiale selektivt dannet i mediet efter dyrkningens afslutning.

Mellemproduktet kan isoleres eller udvindes fra dyrkningsvæsken på konventionel måde til isolering af antibiotica fra dyrkningsvæsken eller myceliet. Det antibiotiske materiale indeholdes hovedsageligt i dyrkningsvæsken, og derfor fjernes myceliet derfra ved centrifugering eller filtrering, og det effektive materiale ekstraheres fra filtratet. Det ønskede materiale adskilles, udvindes og renses fra filtratet ved midler, der almindeligvis anvendes til fremstilling af antibiotica, såsom udnyttelse af forskellene i opløselighed i et egnet opløsningsmiddel, forskellene i adsorptiv affinitet til forskellige adsorbenser eller forskellene i opdeling mellem 2 væskefaser. Disse metoder kan anvendes hver for sig eller om nødvendigt som en passende kombination, eller de kan gentages flere gange.

Flere praktiske eksempler på de hidtil ukendte 7-methoxycephalosporin-forbindelser, som kan opnås som mellemprodukter ved fremgangsmåden i-følge opfindelsen, er anført nedenfor: 1. 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido )-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4- thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-/\ -cephem-4-carboxylsyre; 0CH3 s H00C-CH-CHoCHoCHoC0NH-—^ ^

I 2 2 2 I N—N

NH2 —N^^^JHg-SJLgA-S-CHgCOOH

COOH

12 UG10Q

Tilsætningsf orMndelse: 5-mercapto-l,3,4-thiadiazol-2-thioeddikesyre;

HS— ί iLs-CH2C00H

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse I

N—N

svarende til den almene formel Aa, hvori R^=Π ^S^SC^COOH og M=H, er som følger: (1) hvidt pulver; (2) begynder at smelte ved 156-160°C og bliver brunt og dekompo-neres fra omkring 170°C; (3) letopløselig i vand, tungtopløselig i methanol og næsten uopløselig i andre organiske opløsningsmidler; (4) amphotert materiale, som viser positiv nirihydrin-reaktion; (5) giver et ultraviolet absorptionspektrum som vist i fig. 1 på tegningen, målt i en 1/100 M phosphatpufferopløsning med en pH-værdi på 6,4 og viser absorptionsmaksimum ved 287 nm; (6) giver et infrarødt absorptionspektrum som vist i fig. 2, målt som kaliumbromidtablet, og viser absorptioner ved - 3413 cm"1, 2920 cm"cm, 1763 cm"1, 1620 cm"1, 1515 cm"1 og 1380 cm"1; (7) giver de følgende signaler i det magnetiske kerneresonansspek-trum, målt under anvendelse af TMS som ydre standard i tungt vand $ værdi (ppm): 2,35 (4H, multiplet), 2,96 (2H, multiplet), 4,00 (3H, singlet), 3,75-4,33 (2H, kvartet, J=18Hz), 4,25 (IH, multiplet), 4,44 (2H, singlet), 4,42-4,91 (2H, kvartet, J=l4Hz), 5,63 (IH, singlet); 13 146100 (8) produktet opnået i den hidtil reneste tilstand viser de følgende elementanalytiske værdier: C: 35,95%; H: 3,87%; N: 10,85%, S: 18,33%; (9) giver oc-aminoadipinsyre, når den hydrolyseres med 6N saltsyre; (10) forbindelsens massespektrum efter N-chloracetylering af forbindelsen og omdannelse af produktet til methylesteren giver det følgende fragment med m/e 392, dvs.

CHg-S-^^^Vs-CHgCOOCHj COOCH, 5 I betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart, at denne forbindelse er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, da den giver en absorption ved 1763 cm-1 (cyklisk lactam) i det infrarøde absorptionsspektrum og viser signalerne ved 4,00 ppm (3H, singlet, 7-0CH^), 5,63 ppm (IH, singlet, 6-CH), 3,73-4,33 (2H, kvartet, J=18 Hz, 2-0Η£) og 4,42-4,91 (2H, kvartet, J=l4 Hz), ^-sidekæde-CH^)* i det magnetiske kerneresonansspektrum, den giver α-aminoadipinsyre ved sur hydrolyse, og da den yderligere giver absorptionen ved 4,44 ppm (2H, singlet, CH^ i -S-CH^-COOH) i det magnetiske kerneresonansspektrum og giver fragmentet med m/e 392 i derivatets massespektrum, er forbindelsen blevet bestemt til at have den førnævnte struktur, hvori der er indført den heterocykliske thiol.

II. 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)- thiomethyl-7-methoxy-/\^-cephem-4-carboxylsyre: 0CH, 5

/S

H00C- CH- CH0CH0CH0C ONH--f N w_w I 2 2 2 J—\ nh9 . — Il Λ—ch9-s-^\ n

/ ΊΓ T

C00H 0H3 14 146100

Tilsætningsforbindelse: 5-mercapto~l-methyl-lH~tetrazol.

ΓΛ

V

Ah,

D

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse II

N—^ svarende til den almene formel Aa, hvori R^= og M=H er ch3 som følger: (1) hvidt pulver; (2) giver brun misfarvning og dekomponering ved 160-170°C; (3) letopløselig i vand, tungtopløselig i methanol og næsten uopløselig i andre organiske opløsningsmidler; (4) amphotert materiale som viser positiv ninhydrin-reaktion; (5) giver det i fig. 3 viste ultraviolette absorptionsspektrum, målt i en 1/100 M phosphatpufferopløsning med en pH-værdi på 6,4, og har absorptionsmaksimum ved 273 nm; (6) giver det i fig. 4 viste infrarøde absorptionsspektrum, målt som kaliumbromidtablet, og viser absorptioner ved 3413 cm“\ 2920 cm-1, 1765 cm-1, 1620 cm-1, 1515 cm"1 og 1390 cm-1; (7) det magnetiske kerneresonansspektrum, målt under anvendelse af TMS som ydre standard i tungt vand, viser de følgende signaler: g værdi (ppm): 2,36 (4H, multiplet), 2,96 (2H, multiplet), 3,98 (3H, singlet), 4,38 (IH, multiplet), 4,50 (3H, singlet), 5,59 (IH, singlet); 15 146100 (8) Det ovennævnte materiale, opnået i den hidtil reneste tilstand, viser de følgende elementanalytiske værdier: C: 37,48%, H: 4,25%, N: 16,74% og S: 10,90%; (9) Forbindelsen giver a-aminoadipinsyre, når den hydrolyseres med 6 N saltsyre, og giver 5-mercapto-l-methyl-lH-tetrazol, når den hydrolyseres i methanol med "Dowex®50 W" (H-type).

I betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart, at forbindelsen er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, da den giver signalerne ved 3,98 ppm (3H, singlet, 7-OCH^) og 5,59 ppm (IH, singlet, 6-CH) i det magnetiske kerneresonansspektrum, absorptionen ved 1765 cm“^ (cyklisk lactam) i det infrarøde absorptionsspektrum og giver α-aminoadipinsyre ved sur hydrolyse, og da den yderligere viser absorptionen ved 4,50 ppm (3H, singlet, tetrazol-N-methyl) i det magnetiske kerneresonansspektrum og også giver 5-mercapto-l-methyl-lH-tetrazol ved mild hydrolyse, er forbindelsen blevet bestemt til at have den før nævnte struktur, hvori der er indført den heterocykliske thiol.

Ill. 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl- A^-cephem~4-carboxylsyre.

ΟΟΗλ J S

H00C-CH-CH2CHjLCH1C0NH---ζ \ N_N

iL, ^Ln i-CH2S-lVs Ji— ch3 cooh

Tilsætningsforbindelse: 2-mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol:

N—N

• HS-4^ /—ch3

S

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse III

16 146100 svarende til den almene formel Aa, hvori = N-N og M=H,

Jl Ij er som følger: (1) lyst gulligt hvidt pulver; (2) viser intet distinkt smeltepunkt og giver "brun misfarvning og dekomponering ved omkring 170°C; (3) let opløselig i vand, tungt opløselig i methanol, men uopløselig i andre organiske opløsningsmidler; (4) amphotert materiale, som viser positiv ninhydrin reaktion; (5) giver det i fig. 5 viste ultraviolette adsorptionsspektrum, målt i en 1/100 M phosphatbuffer-opløsning med en pH værdi på 6,4, og har absorptionsmaksimum ved 272 nm? (6) giver det i fig. 6 viste infrarøde absorptionsspektrum, målt som kaliumbromid-tablet, og viser absorptioner ved 3420 cm-1, 2930 cm-1, 1765 cm-1, 1610 cm-1, 1515 cm-1 og 1385 cm”1.

(7) Det magnetiske kerneresonansspektrum, målt under anvendelse af IMS som ydre standard i tungt vand, giver de følgende signaler: værdi (ppm): 2,34 (4H, multiplet), 2,95 (2H, multiplet), 3,19 (3H, singlet), 3,72-4,31 (2H, kvartet, J = 18 Hz), 3,99 (3H, singlet), 4,26 (IH, multiplet), 4,40-4,95 (2H, kvartet, J = 14 Hz), 5,63 (IH, singlet); (8) forbindelsen fremstillet i den hidtil reneste tilstand viser de følgende elementanalytiske værdier: C: 37,82%, H: 4,01%, N: 12,90%, S: '14,97%; (9) giver α-aminoadipinsyre, når den hydrolyseres med 6 N saltsyre, og giver 2-mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol, når den 17 146100 hydrolyseres 1 methanol med "Dowex® 50 ¥” (H type).

I betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart, at forbindelsen er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, da den giver absorptionen ved 1765 cm-'1' (cyklisk lactam), i det infrarøde absorptionsspektrum, signalerne ved 3,99 ppm (3H, singlet, 7-OCH^), 5,63 ppm (IH, singlet, 6-CH), 3,72-4,31 ppm (2H, kvartet, J = 18 Hz, 2-CH2), 4,40-4,95 (2H, kvartet, J = 14 Hz, 3-sidekæde CH2) i det magnetiske kerneresonansspektrum og giver a-aminoadi-pinsyre ved sur hydrolyse, og da den endvidere viser absorptionen ved 3,19 ppm (3H, singlet, thiadiazol C-CH^) i det magnetiske kerneresonansspektrum og giver 2-mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol ved mild hydrolyse, er forbindelsen blevet bestemt til at have den ovennævnte struktur, hvori der er indført den hetero-cykliske thiol.

IV. 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl- Δ ^-cephem-4-carboxylsyre OCH,

HOOC-CH-CHpCHpCHnCONH--f Λ N-N

kh2 aLn^J—oh2s-A J1 2 </ I s

C00H

Tilsætningsforbindelse:

2-mercapto-l,3,4-thiadiazol N—N

hsAsJ

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse IV svarende til den almene formel Aa, hvori Rii= fj_N og M=H, er som følger: (1) lyst gulligt hvidt pulver; (2) viser intet distinkt smeltepunkt, men giver brun misfarvning og dekomponering ved omkring 175-180°C: 18 146100 (3) let opløselig i vand, tungt opløseligt i methanol, men uopløseligt i organiske opløsningsmidler; (4) amphotert materiale, som viser positiv ninhydrin reaktion; (5) giver det i fig. 7 viste ultraviolette absorptionsspektrum, målt i en 1/100 M phosphatbuffer-opløsning med en pH på 6,4, og har maksimal absorption ved 274 nm; (6) giver det i fig. 8 viste infrarøde absorptionsspektrum, målt som kaliumbromid-tablet, og viser absorptioner ved 3400 cm , 2925 cm-1, 1765 cm-1, 1610 οπΤ1, 1515 cm-1 og 1365 cm"''1'; (7) det magnetiske kerneresonansspektrum, målt under anvendelse af QMS som ydre standard i tungt vand, giver de følgende signaler: værdi (ppm): 2,30 (4H, multiplet), 2,93 (2H, multiplet), 3,69-4,29 (2H, kvartet, J = 18 Hz), 3,97 (3H, singlet), 4,26 (IH, multiplet), 4,45-4,99 (2H, kvartet, J = 14 Hz), 5,56 (IH, singlet), 9,85 (IH, singlet); (8) det ovennævnte materiale, opnået i den hidtil reneste tilstand, viser de følgende elementanalytiske værdier: C: 37,53% H: 4,36%, N: 12,77%, S: 16,42%; (9) giver oc- amino adip insyr e, når den hydrolyseres med 6 N saltsyre, og giver 2-mercapto-l,3,4-thiadiazol, når den hydrolyseres i methanol med "Dowex^50 W" (H type).

betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart, at forbindelsen er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, da den giver absorptionen ved 1765 cm’"'1' i det infrarøde absorptionsspektrum, giver signalerne ved 3,97 ppm (3H, singlet, 7-0CH^), 5,56 ppm (IH, singlet, 6-CH), 3,69-4,29 ppm (2H, kvartet, J = 18 Hz, 2-CH2), 4,45-4,99 (2H, kvartet, J = 14 Hz, 3-sidekæde-CH2) i det magnetiske kerneresonansspektrum og giver α-amino adip insyr e ved sur hydrolyse, og da den endvidere viser absorptionen ved 9,85 19 146100 ppm (IH, singlet, thiadiazol-CH) i det magnetiske kerneresonansspek-trum og giver 2-mercapto-l,3,4-thiadiazol ved mild hydrolyse, er forbindelsen blevet bestemt til at have den ovennævnte struktur, hvori der er indført den heterocykliske thiol.

Resultaterne af de forskellige chromatografiske og papirelektro-phoretiske analyser af de ovennævnte forbindelser I, II, III og IV, opnået som mellemprodukter ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er anført nedenfor.

Rf-værdierne for disse forbindelser ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel SF", handelsnavn) er anført i den følgende tabel.

1 2 3

Forbindelse I 0,39 0,37 0,32

Forbindelse II 0,39 0,34 0,31

Forbindelse III 0,43 0,43 0,40

Forbindelse IV 0,39 0,38 0,33

Cephalosporin C 0,37 0,36 0,31 7-methoxy-cephalspo- rin C 0,4l 0,36 0,32.

Cephamycin C 0,37 0,36 0,31 Y-G19Z-D3 0,26 0,26 0,22 Y-G19Z-D2 0,39 0,32 0,26

Udviklingssystem/(volumenforhold): 1. Isopropanol : n-butanol : eddikesyre : vand (21 : 3 : 7 : 9).

2. n-butanol : eddikesyre : vand (4:1:2).

3. n-butanol : eddikesyre : vand (6 : 1,5 : 2,5).

Kontrolprøven, cephamycin C, er 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)- -z 3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-Λ -cephem-4-carboxylsyre.

Kontrolprøverne Y-G19Z-D3 og Y-G19Z-D2, er de 7-methoxycephalos-porin-forbindelser, som tidligere er isoleret fra dyrkningsvæsken af Streptomyces oganonensis (se de offentligt tilgængelige japanske patentansøgninger nr. 109 753/74 og 146 593/75).

20 146100

Rf-værdierne, opnået ved papiradskillelseschromatografi under anvendelse af Wattman nr. 1 filterpapir og også et udviklingssystem bestående af n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 4 : 1 : 2), er som følger:

Rf-værdi

Forbindelse I 0,40

Forbindelse II 0,39

Cephalosporin C 0,36 7-methoxy-cephalosporin C 0,40

Cephamycin C 0,35 Y-G19Z-D3 0,24 Y-G19Z-D2 0,25

Derpå blev forbindelserne analyseret under anvendelse af et "Hitachi 635 High Speed Liquid Chromatography Apparatus", og resultaterne er som følger: * Søjle: 3 x 500 mm rustfast stålkolonne

Harpiks: "Hitachi 2610" (kationbytterharpiks, handelsnavn)

Udviklings system: 0,2 M citratpufferopløsning (pH 3,6) Strømningshastighed: 0,6 ml/min.

Kurvehastighed: 1,0 em/min.

Tilbageholdelsestid

Forbindelse I 5 min. 33 sek.

Forbindelse II 6 min. 00 sek.

Forbindelse III 9 min. 35 sek.

Cephalosporin C 5 min. 18 sek.

7-methoxy-cephalosporin C 5 min. 09 sek.

Cephamycin C 5 min. 18 sek.

Y-G19Z-D3 3 min. 42 sek.

Y-G19Z-D2 3 min. 42 sek.

Endvidere er resultaterne, opnået ved analyse under anvendelse af det ovennævnte apparat under de følgende betingelser anført i den følgende tabel.

21 146100 Søjle: "yu Bondapak C18 " (fremstillet af Waters Ltd.) på 4 x 300 mm.

Udviklingssystem: acetonitril : 0,1% eddikesyreopløsning (pH 3,3) (volumenforhold 1:9)

Strømningshastighed: 0,8 ml/min.

Kurvehastighed: 1,0 cm/min.

Tilbageholdelsestid Forbindelse I 3 min. 14 sek.

Forbindelse II 1 min. 52 sek.

Forbindelse III 2 min. 55 sek.

Forbindelse IV 1 min. 56 sek.

Resultaterne opnået ved højspændings-papirelektrophorese er som følger:

Filterpapir: Wattman Nr. 1.

Udviklingsmiddel: 10% eddikesyre (pH 2,2).

Spænding: 42 V/cm.

Løbetid: 1 time.

Vandringsafstand

Forbindelse I - 3,6 cm

Forbindelse II - 3,3 cm

Forbindelse III - 3,6 cm

Forbindelse IV - 3,9 cm

Cephalosporin C - 3,5 cm 7-methoxy-cephalospo- rin C - 3,4 cm

Cephamycin C - 3,5 cm Y-G19Z-D3 - 6,1 cm Y-G19Z-D2 - 6,1 cm

Cysteinsyre - 7,5 cm

Glutathion - 1,2 cm 22 146100

De i andet trin af fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte D-aminosyreoxidase-producerende stammer tilhørende slægten Trigonopsis kan udvælges blandt typekulturer opbevaret i kulturopbevaringsinstitutioner eller kan isoleres fra jord. Til forøgelse af evnen til at danne det ønskede materiale med formlen Ab ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der også med fordel anvendes mutantstammer dannet ud fra de førnævnte stammer ved sædvanlige midler. Som en mikroorganisme med den førnævnte D-aminosyreoxidase-producerende aktivitet kan f.eks. nævnes Trigonopsis variabilis. Denne stamme kan fås fra The Institute for Fermentation, Osaka, Japan under stammenummeret IFO 0755 (ATCC 10679) og stammenummeret IFO 0671.

Til fremstilling af det ønskede materiale med formlen Ab under anvendelse af mikroorganismen med en sådan D-aminosyreoxidase-producerende aktivitet foretrækkes det sædvanligvis først at dyrke mikroorganismen og derpå lade det således opnåede mycelium eller et enzymprodukt derfra indvirke på cephalosporin-forbin-delsen med den almene formel Aa under passende betingelser. Som dyrkningsmetode til dannelse af myceliet foretrækkes det sædvanligvis at anvende aerob dyrkning og endnu mere foretrækkes det at anvende væskedyrkning under omrøring og luftning. Der anvendes sædvanligvis konventionelle dyrkningsmedier ved denne fremgangsmåde.

Hertil kan anvendes syntetiske og halvsyntetiske dyrkningsmedier eller naturlige dyrkningsmedier, og til sammensætning af dyrkningsmedierne kan f.eks. anvendes glucose, saccharose, mannitol, glycerol, dextrin, stivelse og vegetabilsk olie som carbonkilder og kødextrakt, pepton, glutenmel, majsfrømel, sojabønnemel, jordnød-demel, fiskemel, majsstøbevand, tørgær, gærextrakt, ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, urinstof eller andre organiske og uorganiske nitrogenforbindelser som nitrogenkilder.

Om nødvendigt kan der også sættes et metalsalt, såsom sulfater, nitrater, chlorider, carbonater og phosphater af Na, K, Mg, Ca,

Zn, Fe osv. til dyrkningsmediet. Endvidere kan der om nødvendigt sættes methionin, cystein, cystin, methyloleat, svinefedt, silico-neolie, overfladeaktive midler osv. til dyrkningsmediet til frem- 23 146100 me af væksten eller som skumdæmpende middel. Ønskelige resultater opnås ved at holde dyrkningsmediets pH-værdi ved fra omkring 4-10, fortrinsvis 5-6.

Specielt hvis dyrkningsmediet indeholder D-(eller DL-) aminosyre, såsom D- (eller DL-)methionin, D- (eller DL-)alanin og D- (eller DL-)valin, opnås en udmærket D-aminosyre-oxidase-aktivitet. Dyrkningstemperaturen er sædvanligvis 18-37°C, fortrinsvis omkring 30°C. Dyrkningstiden varierer efter dyrkningsbetingelserne, især dyrkningsapparatet, dyrkningsmediets sammensætning og dyrkningstemperaturen, men det foretrækkes at afslutte dyrkningen, når den D-aminosyreoxiderende enzymaktivitet bliver maximum. Sædvanligvis er 2-10 dages dyrkning passende.

Det således opnåede mycelium eller et enzymprodukt derfra an- . vendes til den D-aminosyre-oxiderende reaktion af mellemproduktet med formlen Aa. I dette tilfælde betyder et enzymprodukt fra myceliet et mycelium, som er omdannet til en nyttig form til dannelse af det ønskede materiale med formlen Ab ved forøgelse af den D-aminosyre-oxiderende enzymaktivitet ved udførelse af en passende behandling derpå. F.eks. eksisterer den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udnyttede D-aminosyre-oxiderende enzymaktivitet sædvanligvis i myceliet, og derfor betyder det fra myceliet opnåede enzymprodukt den cellefrie ekstrakt, opnået ved anvendelse af fysiske og/eller kemiske midler på myceliet, opsamlet fra dyrkningsproduktet af den D-aminosyreoxidase-producerende stamme, vasket eller delvist eller fuldstændigt renset D-aminosyre-oxidase opnået ud fra den cellefrie extrakt ved anvendelse af en kendt enzymseparerings- og rensningsmetode, det aktiverede enzym opnået ved at kombinere den delvis eller helt rensede D-aminosyre-oxidase med en i vand uopløselig polymer eller en uorganisk bærer ved fysiske eller kemiske midler til dannelse af en fast D-aminosyre-oxidase-aktivator eller et fast mycelium udsat for en aktiveringsbehandling.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er fremstillingen og recirkuleringen af det førnævnte opløselige enzym begrænset i praktisk brug, men anvendelsen af de uopløselige enzymer, såsom det aktiverede mycelium, er fordelagtige til industrielle anvendelser, da de let kan genvindes og genanvendes.

24 146100 • Den ovenfor beskrevne aktiveringsbehandling af myceliet kan gennemføres ved at give myceliet en vis mild beskadigelse i en grad, som ikke fører til dets kollaps. Som eksempler på en sådan aktiveringsbehandling kan nævnes en metode, hvorved myceliet fryses ved temperaturer under -10°C ved en pH-værdi på omkring 3-4 og derpå optøs, en metode hvorved myceliet behandles i et bad med et eller flere organiske opløsningsmidler, såsom acetone, n-butanol, 2-phenylethanol, diethylether, cyclohexan, benzen og toluen, en metode hvorved myceliet behandles med 0,1-10% overfladeaktivt middel, f.eks. et kationisk overfladeaktivt middel, såsom cetyldimethylbenzylammoniumhalogenid, cetyltrimethylammonium-halogenid, cetylpyridiniumhalogenid osv., et anionisk overfladeaktivt middel, såsom dodecylsulfat, et alkalimetalalkylarylsulfo-nat, natriumdesoxycholat osv., og et ikke-^onisk overfladeaktivt middel, såsom sorbitanmonolaurat, "Triton^X-100'1 osv. i en vandig opløsning, en metode hvorved myceliet behandles med en fortyndet vandig opløsning af kaliumhydroxid eller natriumhydroxid, eller en metode hvorved myceliet suspenderes i en opløsning med højt osmotisk tryk, f.eks. 2 M rørsukkeropløsning, og derpå hurtigt fortyndes med vand. Disse aktiveringsbehandlinger påvirkes af forskellige elementer, såsom temperatur, behandlingstid, pH-værdi, koncentration af reagens osv., og derfor er det nødvendigt at udvælge aktiveringsbetingelserne.

Hvis endvidere virkningen af katalase, som sædvanligvis findes i et mycelium, ikke inhiberes, bliver den oxidative decarboxyle-ring til det ønskede materiale med formlen Ab ufuldstændig, således at der samtidigt dannes 7-(5-carboxy-5-oxovaleramido)-7-methoxycephalosporin-derivatet med den almene formel B

OCH-j 3 S

H00C-C0-(CHp) ^COHH--^ ^ (B> )-n-~^J~CK2Ss2

C00H

2 hvori R har den i krav l’s indledning angivne betydning.

25 146100

For selektivt at opnå det ønskede materiale med formlen Ab er det derfor ønskeligt at inhibere katalaseaktiviteten. Eksempler på passende katalaseinhibitorer er ascorbinsyre, 3-amino-1,2,4-triazol, alkalimetalazid osv., og natriumazid er særlig foretrukkent. Inhibitoren kan sættes til reaktionsblandingen under omdannelsen af mellemproduktet Aa til det ønskede materiale Ab, eller myceliet kan forbehandles med inhibitoren, før det anvendes til den førnævnte omdannelse. Den mængde natriumazid,’ som anvendes, er fra omkring 1 til omkring 100 mM. Endvidere kan k.atalasen i myceliet inaktiveres ved at underkaste myceliet en varmebehandling, før det bruges i det førnævnte omdannelsestrin. Hvis myceliet behandles ved 40-60°C, fortrinsvis omkring 50°C, i mindst tre timer, formindskes katalaseaktiviteten betydeligt, men D-aminosyre-oxidase-aktiviteten forbliver som den er. Varmebehandlingen kan simpelthen udføres på myceliet i en vandig opløsning eller en puffersuspension, men det er særligt effektivt at udsætte myceliet samtidigt for den førnævnte varmebehandling og aktiveringsbehandling. Ved f.eks. at udføre aktiveringsbehandlingen på myceliet ved 50°C i fire timer under anvendelse af toluen som opløsningsmiddel kan irihiberingen af katalaseaktiviteten og aktiveringen af myceliet opnås samtidigt.

Reaktionen af enzymsystemet i det før nævnte aktiverede mycelium med mellemproduktet Aa gennemføres sædvanligvis ved en pH-værdi på 6-8. Det er ønskeligt at reaktionen gennemføres ved 30-40°C. Reaktionstiden afhænger hovedsagligt af enzymets styrke, men er sædvanligvis 1-5 timer.

Da den førnævnte enzymreaktion gennemføres under aerobe betingelser, foretrækkes det at gennemføre reaktionen under luftning med luft eller oxygen.

Som nævnt ovenfor er det vanskeligt at ekstrahere mellemproduktet med formlen Aa fra gæringsvæsken på grund af den am-photere struktur, med efter andet trin af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udvindingen af det ønskede produkt med formlen Ab gennemføres under passende betingelser fra gæringsvæsken efter fjernelse af myceliet derfra, dvs. det dannede materiale Ab kan let udvindes ved opløsningsmiddelekstraktion eller adsorp ; 26 146100 tion på ionbytterharpiks. For eksempel gøres reaktionsproduktblandingen sur til pH-værdi under 2,5, og derpå extraheres det ønskede materiale fra reaktionsblandingen med et egnet organisk opløsningsmiddel, såsom ethylacetat og n-butanol. I dette tilfælde giver anvendelsen af en kombination af en ionbytterharpiks og en opløsningsmiddelextraktion bedre resultat. En egnet ion-bytterharpiks er en flydende amin-anionbytterharpiks. Eksempler på foretrukne opløsningsmidler er ethylacetat, butylacetat og n-butanol. Det ønskede produkt kan også udskilles ved hjælp af en fast ionbytterharpiks. I dette tilfælde kan et passende opløsningsmiddel let bestemmes ved forudgående forsøg.

Til opnåelse af det rene produkt kan anvendes konventionelle metoder til rensning af antibiotica.

Det-ønskede materiale med formlen Ab kan udvindes ikke kun i form af den frie syre, men også i form af et almindeligt alkalimetalsalt, jordalkalimetalsalt, organisk aminsalt osv. deraf.

Flere hidtil ukendte 7-methoxycephalosporin-derivater med formlen Ab, som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, belyses nedenfor sammen med deres egenskaber.

V. 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-2^^-cephem-4-carboxylsyre: OCHo j s KOOCr(CH2)3CONH--^ jj-j[

^—Nv^^-CHg-S /SvS/XSCH2COOH COOH

Udgangsforbindelse I: 7-(5-amino-5-carboxylvaleramido)-3-(5-carboxymethyl-thio-l,3,4- 27 146100 thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy- A^-cephem-4-carboxylsyre: ' OCH,

J C

HOOC-CH-(CH2)3-CONH--S 'N. N-N

NH2 J—jj J—sch2cooh

OI

COOH

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse V

2 N-N

svarende til formlen Ab, hvori R = ^l^^J^-SCHgCOOH og M=H' er som følger: (1) hvidt pulver; (2) smeltepunkt 75-78°C; (3) let opløselig i methanol og ethanol, opløselig i vand, ethyl- acetat, butylacetat og butanol, men næsten uopløselig i andre organiske opløsningsmidler; (4) Surt materiale, som viser negativ nihydrin reaktion; (5) Giver det i fig. 9 viste ultraviolette absorptionsspektrum, målt i en l/lOO M phosphat bufferopløsning med en pH-værdi på 6,5, og viser absorptionsmaximum ved 278 ran; (6) Giver det i fig. 10 viste infrarøde spektrum, målt som kalium-bromidtablet, og viser absorption ved 3250 cm-1, 2925 cm”1, 1770 cm”1, 1715 cm"1, 1520 cm"1 og 1380 cm”1; (7) Det magnetiske kerneresonansspektrum, målt under anvendelse af TMS som indre standard i tungt methanol, er vist i fig. 11, og viser følgende signaler: £ værdi (ppm): 1,93 (2H, multiplet), 2,41 (4H, multiplet), 3,51 (3H, singlet), 3,37-3,81 (2H, kvartet, J = 18 Hz), 4,11 (2H, singlet), 4,15-4,63 (2H, kvartet, J = 14 Hz), 5,05 (IH, singlet); 28 U6100 (8) Giver de følgende elementanalytiske værdier for C18H20N4°9S4* ^2°

C Η N

beregnet: 35,99% 4,03% 9,33% fundet: 35,77% 3,81% 9,42% (9) Massespektret for det ovennævnte materiale V, målt efter hydrolyse af materialet i 6 N saltsyre i 2,5 timer ved 100°C, ex-traktion af det hydrolyserede produkt med ethylether, tørring af produktet ved inddampning og efterfølgende silylering med BSA /“bis-(trimethylsilyl)acetamid7, giver fragmentet med m/e 276 (CH3)3Si-00C-CH2-CH2-CH2-C00-Si(CH^)3.

I betragtning af alle de ovenstående resultater er det klart, at den nævnte forbindelse er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, især på grund af absorptionen ved 1770 cm-·*· (cyklisk lactam) i det infrarøde absorptionsspektrum og signalerne ved 3,51 ppm (3H, singlet, 7-OCH^), 5,05 ppm (IH, singlet, 6-CH), 3,37-3,81 ppm (2H, kvartet, J = 18 Hz, 2-CH2), 4,15-4,6 ppm (2H, kvartet, J = 14 Hz, 3-sidekæde-CH2) og 4,11 ppm (2H, singlet, CH2 i -S-CH2-COOH) i det magnetiske kerneresonansspektrum, og da der endvidere er signaler ved 1,93 ppm (2H, multiplet, β-0Η2) og 2,41 ppm (4H, multiplet, α, β-0Η2), som viser eksistensen af 4-carboxy-butyramido, i det magnetiske kerneresonansspektrum,.og massespektret af derivatet af det ovennævnte materiale, som var hydrolyseret med saltsyre og silyleret, giver fragmentet med m/e 276., er forbindelsen V blevet bestemt til at have den ovennævnte struktur, dvs. at 5-amino-5-carboxyvaleramidogruppen i 7-stillingen af udgangsmaterialet er blevet oxidativt deamineret til 4-carboxy-butyr amido grupp en.

VI. 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A^-cephem-4-carboxylsyre: OCH-j 3 S.

hooc-(ch2) ,-C0NH—nr I ' II \\ 0/ T CH.

COOH 3 29 146100

Udgangsforbindelse II: 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1-methyl-lH-tetrazol- 5-yl) thiomethyl- ^-cephem-4-carboxylsyre.

OCH,

^ S

H00C-CH-(CH2)y-C0NH—:—p η j*-^

NHp J--N ^L-CH2-5>kH^H

\ COOK ch3

De fysiske og de kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse VI

p N—-li svarende til formlen Ab, hvori . jl H og M=H, '"Ν'” CH, er som følger: -> (1) hvidt pulver; (2) smeltepunkt 80-83°C; (3) letopløselig i methanol og ethanol, opløselig i vand, ethyl-acetat, butylacetat og butanol, men næsten uopløselig i andre organiske opløsningsmidler; natriumsaltet er letopløselig i vand; (4) surt materiale som giver negativ ninhydrin-reaktion; (5) giver det i fig. 12 viste ultraviolette absorptionsspektrum, målt i 1/100 M phosphatpufferopløsning med en pH-værdi på 6,5, og har absorptionsmaksimum ved 269 nm; (6) giver det i fig. 13 viste infrarøde absorptionsspektrum, målt som kaliumbromidtablet, og viser absorptioner ved 3420 cm~^, 2940 cm”^, 1765 cm“\ 1680 cm”^, 1610 cm”"*", 1525 cm~'1' og 1390 cm”1; (7) det magnetiske kerneresonansspektrum, målt under anvendelse af TMS som indre standard i tungt methanol,, eller vist i fig. 14 og viser følgende signaler: <5 værdi (ppm): 1,94 (2H, multiplet), 2,40 (4H, multiplet) 3,51 (3H, singlet), 3,40-3,83 (2H, kvartet, J=l4 Hz), 5,02 (IH, singlet); (8) giver de følgende elementanalytiske værdier for C16H20N6°7S2-2H2° 30 146100

C Η N

beregnet 37,79% 4,76% 16,53% fundet 37,78% 4,75% 16,41% (9) massespektret af det ovennævnte materiale VI, målt efter hydrolyse af materialet af materialet i 6N saltsyre i 2,5 timer ved 10QcC, ekstraktion af det hydrolyserede produkt med ethylether, tørring ved inddampning og efterfølgende silylering med BSA £bis-(trimethylsilyl)acetamid] giver fragmentet med m/e 276 (CH^)^Si-OOC-CHgCHgCEp-COOSi(CH^) ^.

I betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart, at den opnåede forbindelse er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, især på grund af forekomsten af absorption ved 1765 cm-1 (cyklisk lactam) i det infrarøde absorptionsspektrum og signalerne ved 3,51 ppm (3H, singlet, 7-OCH^), 5,02 ppm (IH, singlet, 6-CH), 3,99 ppm (3H, singlet, N-CH^ i tetrazol), 3,40-3,83 ppm (2H, kvartet, J=18 Hz, 2-CH2), 4,17-4,50 ppm (2H, kvartet, J=l4 Hz, 3-sidekæde CH2) i det magnetiske kerneresonansspektrum, og da der endvidere er signaler ved 1,94 ppm (2H, multiplet, β-0Η2) og 2,40 ppm (4H, multiplet, oc,/-CH^), som viser eksistensen af 4-carboxybutyramido, i det magnetiske kerneresonansspektrum, og yderligere massespektret af derivatet af det opnåede materiale, hydrolyseret med saltsyre og silyleret, giver fragmentet med m/e 276, er den opnåede forbindelse VI blevet bestemt at have den ovennævnte struktur, dvs. at 5-amino-5-carboxyvaleramidogruppen i 7-stillingen af udgangsmaterialet er oxidativt deamineret til 4-carboxybutyramidogruppen.

VII. 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-/\^-c ephem-4-carboxylsyre.

31 146100 och3 s hooc-(ch2)3-conh-'--S ^ _ 0/HY^ch2AsACB3

COOH

Udgangsforbindelse III: OCH, 3 hooc-ch-(ch2)3conh--r η jj-|j ®2 Lh 0Η23Λ Λ O I S OH, COOH 3

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse

N-N

VII svarende til formlen Ab, hvori R^= A./-ch3> °g M=H' s er som følger: (1) hvidt pulver; (2) smeltepunkt 95-99 C; (3) letopløselig i methanol og ethanol, opløselig i vand, ethyl-acetat, butylacetat og butanol, men næsten uopløselig i andre organiske opløsningsmidler; (4) surt materiale, som viser negativ ninhydrin-reaktion; (5) giver det i fig. 15 viste ultraviolette absorptionsspektrum, målt i en 1/100 M phosphatpufferopløsning med en pH-værdi på 6,5, og har absorptionsmaksimum ved 273 nm; (6) giver det i fig. 16 viste infrarøde absorptionsspektrum, målt som kaliumbromidtablet, og viser absorptioner ved 3260 cm-1, 2925 cm"1, 1773 cm"1, 1515 cm"1 og 1375 cm"1; (7) det magnetiske kerneresonansspektrum, målt under anvendelse af TMS som indre standard i tungt methanol, er vist i fig. 17 og giver de følgende signaler: ^værdi (ppm): 1,92 (2H, multiplet), 2,40 (4H, multiplet), 2,71 (3H, singlet), 3,38-3,80 (2H, kvartet, J=18 Hz), 32 146100 3,51 (3H, singlet), 4,17-4,64 (2H, kvartet, J=l4 Hz), 5,03 (1H, singlet); (8) viser de følgende elementanalytiske værdier for ci7H20N4°7S3

C Η N

beregnet 41,79% 4,13% 11,47% fundet 41,89% 4,27% 11,17% (9) massespektret for det opnåede materiale VII, målt efter hydrolyse af materialet i 6N saltsyre i 2,5 timer ved 100°C, ekstraktion af produktet med ethylether, tørring af ekstrakten ved inddampning og efterfølgende silylering med BSA [jbis- (trimethylsilyl) acetamid]] giver fragmentet med m/e 276 (CH^)3Si-00C-CH2CH2CH2-C0-0Si(CH3)^.

I betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart, at den opnåede forbindelse er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, især på grund af forekomsten af absorptionen ved 1773 cm” ^ (cyklisk lactam) i det infrarøde absorptionsspektrum og signalerne ved 3,51 ppm (3H, singlet, 7-OCH^), 5,03 ppm (IH, singlet, 6-CH), 2,71 ppm (3H, singlet, C-CH^ i thiadiazol), 3,38-3,80 ppm (2H, kvartet, J=18 Hz, 2-CH2) og 4,17-4,64 ppm (2H, kvartet, J=l4 Hz, 3-sidekæde CH2) i det magnetiske kerneresonansspektrum, og da endvidere der er signaler ved 1,92 ppm (2H, multiplet, β-0Η2) og 2,40 ppm (4H, multiplet, a, 2(-CH2), som viser eksistensen af 4-carboxybutyramido, i det magnetiske kerneresonansspektrum, og yderligere massespektret af derivatet, fremstillet ved hydrolyse af den opnåede forbindelse med saltsyre og silylering af produktet, giver fragmentet med m/e 276, er den opnåede forbindelse med formlen VII blevet bestemt at have den ovennævnte struktur, dvs. at 5-amino-5-carboxyvaleramido-gruppen i 7-stillingen af udgangsmaterialet er oxidativt deamineret til 4-carboxybutyramidogruppen.

VIII. 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl- /\?~c ephem-4-carboxy1syre 33 146100 OCH,

3 S

hooc-(ch2)3-conh--f N N_N

/yS^-V1

COOH

Udgangsforbindelse IV: 7-(5-aniino-5-carboxyvaleramido)-7- methoxy-3-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-/\3-cephem-4-carboxylsyre OCH-z 3 s hooc-ch-(ch2)3conh--< > „_„

COOH

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse VII svarende til formlen Ab, hvori R^= , og M=H,

er som følger: S

(1) hvidt pulver; (2) smeltepunkt 88-92°C; (3) letopløselig i methanol og ethanol, opløselig i vand, ethyl-acetat, butylacetat og butanol, men næsten uopløselig i andre organiske opløsningsmidler; (4) surt materiale, der viser negativ ninhydrin-reaktion; (5) giver det i fig. 18 viste ultraviolette absorptionsspektrum, målt i en 1/100 M phosphatpufferopløsning med en pH-værdi på 6,5, og har absorptionsmaksimum ved 274 nm; (6) giver det i fig. 19 viste infrarøde absorptionsspektrum målt som kaliumbromidtablet, og viser absorptioner ved 3250 cm-1, 2925 cm-1, 1770 cm-1, 1515 cm-1 og 1365 cm-1; (7) det magnetiske kerneresonansspektrum , målt under anvendelse af TMS som indre standard i tungt methanol, er vist i fig. 20 og giver de følgende signaler: 34 146100 ^værdi (ppm): 1,92 (2H, multiplet), 2,40 (4H, multiplet), 3,39-3,83 (2H, kvartet, J=18 Hz), 3,51 (3H, singlet), 4,24-4,73 (2H, kvartet, J=l4 Hz), 5,03 (IH, singlet) og 9,35 (IH, singlet); (8) viser de følgende elementanalytiske værdier for C16H18N4°7S3-1/2H2°

C Η N

beregnet 39,74# 3,96# 11,59# fundet 39,69# 3,87# 11,32# (9) massespektret for den opnåede forbindelse VIII, målt efter hydrolyse af forbindelsen i 6N saltsyre i 2,5 timer ved 100°C, ekstraktion af produktet med ethylether, tørring af ekstrakten ved inddampning, og efterfølgende -silylering med BAS [bis-(trimethylsilyl)acetamido3 giver fragmentet med m/e 276 (CH3)3Si-00C-CH2CH2CH2-C0-0Si(CH3)3. 1 betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart, at den opnåede forbindelse er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, især på grund af forekomsten af absorptionen ved 1770 cm”·*" (cyklisk lactam) i det infrarøde absorptionsspektrum og signalerne ved 3,51 ppm (3H, singlet, 7-0CH3), 5,03 ppm (IH, singlet, 6-CH), 9,35 ppm (IH, singlet, CH i thiadiazol), 3,39-3,83 ppm (2H, kvartet, J=18 Hz, 2-CH2) og 4,24-4,73 ppm (2H, kvartet, J=l4 Hz, 3-sidekæde-CH^) i det magnetiske kerneresonansspektrum, og da der endvidere er signaler ved 1,92 ppm (2H, multiplet, -CH2) og 2,40 ppm (4H, multiplet, a, ^-CH2), som viser eksistensen af 4-carboxybutyr-amido i det magnetiske kerneresonansspektrum og massespektret af derivatet, opnået ved hydrolyse af den opnåede forbindelse med saltsyre og silylering af produktet giver fragmentet med m/e 276, .er den opnåede forbindelse VIII blevet bestemt at have den ovennævnte struktur, dvs. at 5-amino-5-carboxyvaleramidogruppen i 7-stillingen af udgangsmaterialet er oxidativt deamineret til 4-carboxybutyramidogruppen.

35 146100

Resultaterne af en analyse af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser V-VIII ved tyndtlagschroma-tografi og høj-hastighed-væskechromatografi er anført i den følgende tabel sammen med resultaterne for de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede mellemprodukter I-IV.

Rf-værdierne ved tyndtlagschromatografi vinder anvendelse af mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") er som følger: 36 146100

TABEL I

Opløsningssystem Ninhydrinfarvning 1 2 mellemprodukt I 0,44 0,37 + forbindelse V 0,79 0,72 mellemprodukt II 0,44 0,34 + forbindelse VI 0,81 0,64 mellemprodukt III 0,42 0,44 + forbindelse VII 0,82 0,77 mellemprodukt IV ·’ 0,42 0,36 + forbindelse VIII 0,81 0,65 7-(5-amino-5-carboxy~ valeramido) -3-£(3-p- hydroxypheny1-2-methoxy- 0,66 0,67 + pr openoyl) oxymethyl]]-7-methoxy-/Vi-cephem-4-carboxylsyre 7-(4-carboxybutyramido)- 3-Q(3-p-hydroxyphenyl-2- 0,67 0,67 methoxypropenoyl) oxymethyl]]- 7-methoxy-/\^-cephem-4- carboxy1syre

Udviklingssystem: 1. isopropanol : n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 21 : 3 : 7 : 9) 2. n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 4:1:2) Påvisning : ninhydrin-reaktion eller ultraviolet absorption ("Manasulu Light", 2536 S) eller bioautografi (Proteus mirabilis).

37 146100

Alle forbindelserne var positive ved de sidste to prøvninger.

Resultaterne af høj-hastighed væskechromatografi er anført i den følgende tabel: TABEL 2

Tilbageholdelsestid mellemprodukt I 3 min. 14 sek.

forbindelse V 13 min. 24 sek.

mellemprodukt il 1 min. 53 sek.

forbindelse VI 4 min. 54 sek.

mellemprodukt III 2 min. 55 sek.

forbindelse VII 11 min. 18 sek.

mellemprodukt IV 1 min. 56 sek.

forbindelse VIII 5 min. 28 sek.

anvendt søjle : "yu Bondapak C^g" (paters Ltd.) opløsningssystem: acetonitril: 0,1% eddikesyre (pH 3,3) (volumenforhold 1:9)

Tilbageholdelsestiderne af de to kendte cephalosporin-forbindelser ved høj-hastigheds væskechromatografi er som følger:

Tilbageholdelsestid 7-(5-amino-5-carboxy-valeramido)-3- C(3 -p-hydroxy- phenyl-2-methoxypropenoyl)- 5 min. 18 sek.

gxymethyl^-7-methoxy-/\^-c ephem- 4-carboxylsyre 7-(4-carboxybutyramido)-3-[(3 -p-hydroxyphenyl-2- methoxypropenoyl)oxymethyl]]- 5 min. 55 sek.

7-methoxy- /\p-c ephem-4-carboxylsyre anvendt søjle : "yu Bondapak C18" (Waters Ltd.) opløsningssystem: acetonitril: 0,1% eddikesyre (pH 3,3) (volumenforhold 2:8) ; · 38 146100

In vivo virkningen af forbindelserne II, III, VI og VII er som anført nedenfor: I 5 sunde hanmus af ddYstammen blev intraperitonealt injiceret g 10 celler af E. coli NIHJ, og efter 2 timer blev hver prøveforbindelse indgivet subcutant, hvorefter overlevelsesprocenterne efter 5 dages forløb var som anført i den følgende tabel. Tilsva-rende forsøg blev udført ved injektion af 10 celler af Proteus mirabilis 1287. Hver kontrolgruppe bestod af 10 mus.

~..... r Jfi. coli MIHJ Proieu's mirabllls 126V

3 1 0,5 0 3 1 0,5 0 mellemprodukt II 100 100 100 0 40 20 0 0 forbindelse VI 100 100 00 60 20 0 0 mellemprodukt III 80 80 40 0 100 20 20 0 forbindelse VII 80 60 00 40 20 20 0 39 146100

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1 I. Fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxy-methylthio-1,3,4-thiadiazol-2-yl) t’hiomethyl-7-methoxy- Δ3 -cephem- 4-carboxylsyre___________ 1) Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1% glucose, 1,5% sojabønnemel, 0,5% gærekstrakt, 0,1% dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% magnesiumphosphat og 0,3% natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver og steriliseret ved 120°C i 20 min. Hvert medium blev podet med Streptomyces oganonensis stamme Y-G19Z og dyrket i 48 timer ved 30°C.

Et dyrkningsmedium med den ovennævnte sammensætning blev anbragt i 2000 ml Sakaguchi-kolber med 400 ml i hver, steriliseret ved 120°C i 20 min. og podet med ovenfor fremstillede podemateriale i en koncentration på 2-3% efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30°C til frembringelse af en podekultur.

Derefter blev 60 1 af et dyrkningsmedium indeholdende 7% stivelse, 2% glutenmel, 2% sojabønnemel, 0,8% glycerol, 0,1% ,,Casamino',-syre, 0,01% jern (Ill)-sulfat og 55 g natriumhydroxid fordelt i to 100 liters fermentorer sammen med 10 ml af et under handelsnavnet "Adecanol", forhandlet skumdæmpende middel, og efter sterilisering i 30 min. ved 120°C blev hvert medium podet med 800 ml af podekulturen og dyrket i 24 timer ved 30°C. I en vandig natriumhydroxidopløsning opløstes 2-carboxymethylthio-5-mercapto-l,3,4-thiadiazol, og den således dannede opløsning blev steriliseret ved højt tryk og sat til hver fermentor op til 0,05% af podematerialet, hvorpå der blev dyrket i yderligere 90 timer.

Efter at dyrkningen var fuldført blev dyrkningsvæsken indstillet til pH 2,0 og derpå blandet med "Radiolite,,. Blandingen blev filtreret ved hjælp af en filterpresse, og filtraterne blev kombineret til opnåelse af omkring 100 1 filtrat. Filtratet blev indstillet til pH 3,0 med en vandig natriumhydroxidopløsning, sendt .... 40 146100 igennem en 12 liters "Amberlite®'XAD-2"søjle, og søjlen blev vasket med 30 1 vand og derpå elueret med 30 1 50% vandig acetone.

Det opsamlede eluat blev koncentreret til 5,5 1, og efter fjernelse af dannede urenheder sattes vand til remanensen til frembringelse af 10 1 opløsning. Den således fremstillede opløsning blev indstillet til pH 3,5 med fortyndet saltsyre og derpå sendt igennem en 3 liters "ffimberlite® IRA-68"søjle. Efter vaskning af søjlen med 6 1 vand udførtes eluering ved hjælp af en vandig opløsning (pH 7,2) indeholdende 1 M natriumnitrat og 0,1 M natriumacetat til opnåelse af omkring 5 1 opløsning indeholdende antimicro-bielt aktivt materiale. Opløsningen blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 1 liters "Amberlite® XAD-2"søjle, og efter vaskning af søjlen med vand blev den elueret med 50% vandig acetone til opnåelse af omkring 400 ml vandig opløsning indeholdende antimicro-bielt aktivt materiale. Ved lyophilisering af opløsningen blev der opnået omkring 18 g råt pulver af den ønskede forbindelse I.

De 18 g råt pulver blev underkastet søjlechromatogråfi under anvendelse af omkring 800 ml "DEAE-Sephadex®A-25" (eddikesyre-type) fyldt med en lille mængde 0,5 M ammoniumbromid/eddikesyre-pufferopløsning og fraktioneret i effektive komponenter. De opnåede anti-mikrobielt aktive fraktioner blev opsamlet, sendt igennem en 500 ml "Amberlite® XAD-2"søjle, og efter vaskning med vand blev søjlen elueret med 25% vandig acetone, og eluatet blev inddampet til tørhed.

Derpå blev den opnåede produktremanens underkastet søjlechromatogråfi under anvendelse af mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel"), præpareret med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol og vand i volumenforholdet 7:3, og under anvendelse af den samme opløsningsmiddelblanding. 'Den opnåede antimikrobielt aktive fraktion blev anbragt sam en plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF", udviklet med en blanding af isopropanol: n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 21:3:7:9), og derpå blev der sprøjtet en 0,25% opløsning af ninhydrin i pyridin på pladen efterfulgt af opvarmning til frembringelse af farvning. De fraktioner, som udviste en Rf-værdi på 0,39, blev opsamlet. Fraktionen blev vacuuminddampet til tørhed ved 45-50°C og derpå underkastet søjlechromatogråfi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel"), 41 1A6100 præpareret med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol: n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 21:3:7ϊ9). Den således opnåede antimikrobielle fraktion blev underkastet tyndtlagschromatografi på "Avicel SF” med den ovennævnte opløsningsmiddelblanding, og ved at følge den samme procedure som ovenfor blev de fraktioner, som udviste en Rf-værdi på 0,39 opsamlet og vacuuminddampet til tørhed.

Produktremanensen blev yderligere renset ved en søjlechromatigrafi på mikrokrystallinsk cellulose under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 6:1,5i 2,5). Den rensede aktive fraktion blev inddampet til tørhed og derpå opløst i en lille mængde destilleret vand. Opløsningen blev udviklet på en søjle af "Sephadex® G-10” under anvendelse af destilleret vand. De fraktioner, som udviste antimikrobiel aktivitet, blev opsamlet og underkastet tyndtlagschromatografi som angivet ovenfor under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vaxld (volumenforhold 6:1,5:2,5). De fraktioner, som udviste Rf 0,32 blev opsamlet, koncentreret og derpå underkastet lyophilisering, hvorved der blev opnået omkring 80 mg hvid 7-(5-amino-5-carboxy-valeramido)-3-(5-carboxymethylthio-~l, 3,4-thia-diazol-2-vl )thiomethvl-7-methoxv~A^-cephem-4-carboxylsyre.

2) Ved den samme procedure som under (1) ovenfor,‘men under anvendelse af en opløsning af bis-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)di-stffid, fremstillet ved opløsning af disulfidet i vandholdigt methanol og sterilisering ved filtrering under anvendelse af Millipore-filter, i stedet for opløsningen 5-mercapto-l,3,4-thiadiazol-2-thioeddike-syre, fremstillet i vand under anvendelse af vandig natriumhydroxidopløsning og sterilisering ved højt tryk, blev der opnået 23 g råt pulver af den ønskede forbindelse I, og rensning af produktet som under (I) gav 45 mg 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3 > 4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-/\^-c ephem-4-c arboxy1syr e.

42 146100 II. Fremstilling af 7-(4-carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio- 3 . 1,3,4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl-7-methoxy-^ -cephem-4-carboxyl-syre .______ X 10 ml af en 0,1 M pyrophosphat-pufferopløsning med pH 8,1 indeholdende 0,026% natriumazid opløstes 50 mg 7-(5-amino-5-carboxyvaler-amido )-3-( 5-carboxymethylthio-l, 3,4-thiadiazol-2-yl) thiomethy 1- z 7-methoxy-/\ -cephem-4-carboxylsyre, og efter tilsætning af 0,5 ml af en aktiveret myceliesuspension, fremstillet på sådan måde som i eksempel 2-II-a, blev blandingen omrørt under luftning i et vandbad ved 33°C til gennemførelse af D-aminosyre-oxidationen. Fuldførelsen af oxidationen blev kontrolleret for hver 30 min. ved hjælp af Hitachi høj-hastighedsvæskechromatografi-apparatet som i eksempel 2-ΪΙ, idet tilbageholdelsestiden for udgangsmaterialet, (7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-/\^-cephem-4-carboxylsyre var 3 min. og 14 sek., og tilbageholdelsestiden for den ved indvirkning af D-aminosyre-oxidasen dannede 7-(4-carboxybutyramido)-3-(5-carboxy- methylthio-1,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-/\^-ceph.em- 4-carboxylsyre var 13 min. og 24 sek.

Efter fuldførelse af reaktionen blev myceliet fjernet ved centrifugering ved 4°C, overvæsken blev skilt fra og derpå indstillet til pH 1,5-2,0 med fortyndet saltsyre efterfulgt af ekstraktion 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat. De således udvundne ethylacetatekstrakter blev kombineret og gen-écstraheret med en phosphatpufferopløsning med pH 6,0. Phosphat-opløsningen blev indstillet til pH 1,5-2,0 med fortyndet saltsyre og ekstraheret igen 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev opsamlet, tørret over vandfrit natriumsulfat og vacuuminddampet til tørhed.

Remanensen blev udviklet med en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 4:1:2) på en søjle fyldt med mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") ved anvendelse af den samme opløsningsmiddelblanding som ovenfor. Hver fraktions antimikrobielle aktivitet blev undersøgt, og fraktionerne med antimikrobiel aktivitet overfor Proteus mirabilis blev udvalgt, sat som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF" og udviklet med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol: n-butanol: eddikesyre: 43 146100 vand (volumenforhold 21:5:7:9) og en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 4:1:2). Derpå opsamledes de fraktioner, som viste ultraviolet absorption for Manasulu-lys 2536 Å (fremstillet af Manasulu Kagaku Kogyo K.K.) og viste henholdsvis Rf 0,79 og Rf 0,72, og de blev koncentreret og lyo-philiseret, hvorved der blev opnået 30 mg ren 7-(4-carboxybutyramido)-3_(5-carboxymethylthio-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thi omethyl-7-methoxy-Δ3 -cephem-4-carboxylsyre. Dette materiale viser antimikrobiel aktivitet overfor Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum og Escherichia coli.

EKSEMPEL 2 I. Fremstilling af 7~(5-amino-5-carboxyvalerarnido)-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-Λ -cephem-4-carboxylsyre 1) Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1% glucose, 1,5% sojebønnemel, 0,5% gærekstrakt, 0,1% dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% magnesiumsulfat og 0,3% natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver og steriliseret i 20 min. ved 120°C, Derpå blev hvert medium podet med Streptomyces oganonensis stamme Y-G19Z efterfulgt af dyrkning i 48 timer ved 30°C. Et yderligere dyrkningsmedium med den ovennævnte sammensætning blev anbragt i 2 liters Sakaguchi-kolber med 400 ml i hver, og efter sterilisering i 20 min. ved 120°C blev hvert medium podet med op til 2-3% af den ovenfor fremstillede dyrkningsvæske og dyrket i yderligere 24 timer ved 30°C til opnåelse af et podemateriale.

Derefter blev 60 1 af et dyrkningsmedium indeholdende 7% stivelse, 2% glutenmel, 2% sojabønnemel, 0,8% glycerol, o,l% "Casamino"-syre, 0,01% jern(in)-sulfat og 55 g natriumhydroxid anbragt i 2 100 liters fermentorer, hver portion sammen med 10 ml af et under navnet "Adecanol" forhandlet skumdæmpende middel, og efter sterilisering i 30 min. ved 120°C, blev hvert medium podet med 800 ml af det ovenfor fremstillede podemateriale efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30°C. Derpå opløstes l-methyl-5-mercapto-lH-tetrazol i en vandig natriumhydroxidopløsning, og opløsningen blev steriliseret ved højt tryk og tilsat dyrkningsvæsken i en koncentration på 0,05%, hvorefter blandingen blev dyrket i yderligere 90 timer.

44 146100

Efter at dyrkningen variuldført, blev den således dannede dyrkningsvæske indstillet til pH 2,0 og derpå blandet med "Radiolite" under omrøring. Blandingen blev filtreret under anvendelse af en filterpresse, og de opnåede filtrater blev kombineret til opnåelse af omkring 100 1 filtrat.

Filtratet blev indstillet til pH 3,0 med en vandig natriumhydroxidopløsning, sendt igennem en 12 liters "Amberlite XAD-2"søjle, og efter vaskning af søjlen med 30 1 vand blev den elueret med 30 i 50% vandig acetone. Eluatet blev koncentreret til 5,5 1, og koncentratet indstillet til pH 3,5 med fortyndet saltsyre og sendt igennem en 3 liters "Amberlite ® IRA-68"(Cl-type) søjle.

Søjlen blev vasket med 6 1 vand og fraktioneret med en vandig opløsning (pH 7,2) indeholdende 1 M natriumnitrat og 0,1 M natriumacetat til opnåelse af omkring 5 1 af en opløsning indeholdende et antimikrobielt aktivt materiale. Opløsningen blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 1 liters "Amberlite ®XAD-2"søjle, vasket med vand og elueret med 50% vandig acetone til opnåelse af omkring 400 ml af en vandig opløsning indeholdende det antimikrobielt aktive materiale. Ved lyophilisering af opløsningen blev der opnået omkring 54 g råt pulver af den ønskede forbindelse II. Det rå pulver blev underkastet søjlechromatografi med omkring 800 ml "Sephadex A-25"eddikesyre-type fyldt med en lille mængde 0,5 M ammoniumbromid/eddikesyre-pufferopløsning til fraktionering af aktive komponenter. De antimikrobielt aktive fraktioner blev opsamlet, sendt igennem en 500 ml "Amberlite®'XAD-2" søjle, og søjlen blev vasket med vand og elueret med en vandig 25% acetoneopløsning. De antimikrobielt aktive fraktioner blev opsamlet og vacuuminddampet til tørhed.

Den dannede remanens blev underkastet søjlechromatografi under anvendelse af mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt med en blanding af isopropanol og vand (volumenforhold 7:3), under anvendelse af den samme opløsningsmiddelblanding. Den opnåede antimikrobielt aktive fraktion blev opsamlet,anbragt som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF", udviklet med en blanding af n^butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 6:1,5:2,5) og derpå sprøjtet med en opløsning af 0,25%> ninhydrin i pyridin, efterfulgt af opvarmning til frembringelse af farvning. De fraktioner, som udviste Rf 0,31 blev opsamlet. Fraktionerne blev 45 146100 koncentreret under formindsket tryk og tørret, og derefter blev den dannede remanens underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel ), præpareret med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol: n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 21:3:7:9). De opnåede antimikrobielt aktive fraktioner blev underkastet tyndtlagschromatografi på "Avicel SF" med en opløsningsmiddelblanding med samme sammensætning som ovenfor, og ved at følge den samme procedure som ovenfor blev de fraktioner, som udviste Rf 0,39, opsamlet og vacuuminddampet til tørhed.

Den således dannede remanens blev yderligere underkastet en søjlechromatografi på microkrystallinsk cellulose tinder anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 6:1,5:2,5) til rensning af den effektive komponent. Dén således rensede aktive fraktion blev vacuuminddampet til tørhed, opløst i en lille mængde destilleret vand og udviklet på en søjle af "Sephadex ® G 10" under anvendelse af destilleret vand. Fraktionerne med antimikrohiel aktivitet blev opsamlet og underkastet tyndtlagschromatografi under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 6:1,5:2,5) som angivet ovenfor. Derpå blev fraktionerne med Rf 0,31 opsamlet, koncentreret og derpå lyophiliseret, hvorved der blev opnået 60 mg hvid 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-/V^-c ephem-4-c arboxylsyre.

2) Ved den samme procedure som under (1) ovenfor, men under anvendelse af en opløsning af bis-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)disulfid, fremstillet ved opløsning af disulfidet i vand indeholdende methanol og sterilisering ved filtrering under anvendelse af Millipore-filter, i stedet for opløsningen af l-methyl-5-mercapto-lH-tetrazol fremstillet ved opløsning af tetrazolen i vand under anvendelse af en vandig natriumhydroxidopløsning og sterilisering ved højt tryk, blev der opnået omkring 26 g råt pulver af den ønskede forbindelse II, og rensning af produktet som under (I) gav 37'mg 7-(5-amino-5-carboxy valeramido)-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-Δ3 -c ephem-4-carboxylsyre.

46 146100 II. Fremstilling af 7-(4-carboxyhutyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-Δ 3-cephem-4-carboxylsyre_ a) Et dyrkningsmediimi med pH 6,0 bestående af 20 g glucose, 4 g kaliumdihydrogenphosphat, 1 g magnesiumsulfat, 2 g ammoniumsulfat, 0,5 g calciumchlorid, 0,1 g borsyre, 0,04 g ammoniummolybdat, 0,04 g mangansulfat, 0,04 g zincsulfat, 0,045 g kobbersulfat, 0,025 g jern(ll)-sulfat, 20 nyug biotin, 2 mg thiamin-hydrochlorid, 1 g DL-methionin og 1000 ml vand blev anbragt i 500 ml Erlenmeyer-kolber med 100 ml i hver, og efter sterilisering på konventionel måde blev hvert medium podet med Trigonopsis variabilis stamme IF0 0755 efterfulgt af rystet dyrkning i 72 timer ved 30°C.

Efter at dyrkningen var fuldført blev omkring 1000 ml af dyrkningsvæsken opsamlet og centrifugeret ved 2000 omdr-min. i 30 min. ved 4°C. Det opsamlede mycelium blev suspenderet i 500 ml af en 0,1 M pyrophosphat-puf fer opløsning med pH 8,1, og til mycelie suspensionen sattes 5 ml "Triton X-100", og blandingen blev omrystet i 20-40 min. ved 37°C til aktivering af myceliet. Den rystede blanding blev centrifugeret ved 2000 omdr./min. i 30 min. ved 4°C, og det opsamlede aktiverede mycelium blev vasket 2 gange med en pyrophosphat-pufferopløsning med pH 7-8 og igen suspenderet i 100-200 ml af en 0,1 M pyrophosphat-pufferopløsning med pH 8,1.

b) I 10 ml af en 0,1 M pyrophosphat-pufferopløsning med pH 8,1 indeholdende 0,026% natriumazid opløstes 54,5 mg 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-{\ ^-cephem-4-carboxylsyre og efter tilsætning af 0,5 ml af suspensionen af det aktiverede mycelium blev blandingen omrørt under luftning i et vandbad ved 33°C. Reaktionssystemet blev undersøgt for.

hver 30 min. ved hjælp af et Hitachi højhastigtiedsvæskechromatografisk ' apparat (under anvendelse af "yu Bondapak C-^g" fremstillet af Waters Ltd., og et opløsningsmiddelsystem af acetonitril: 0,1% eddikesyre (volumenforhold 1:9)) til bestemmelse af reaktionens forløb. Herved viser tilbageholdelsestiden af udgangsmaterialet, 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-/VLcephem-4-carboxylsyre sig at være 1 min. og 53 sek., medens tilbageholdelsestiden af det ved D-aminosyreoxidationen dannede produkt, 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-ΙΗ-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-/\?-cephem-4-carboxylsyre er 4 min. og 54 sek.

47 146100

Efter fuldførelse af reaktionen blev myceliet fjernet ved centrifugering, og overvæsken blev skilt fra, indstillet til pH 1,5-2,0 med fortyndet saltsyre og derpå ekstraheret 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen éthylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev kombineret og genekstraheret med phosphatpufferopløsning med pH 6,0. Phosphatpufferopløsningen blev derpå indstillet til pH

1,5-2,0 med fortyndet saltsyre og yderligere ekstraheret 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev kombineret, tørret over vandfrit natriumsulfat og inddampet til tørhed. Produktet blev udviklet under anvendelse af en søjle fyldt med mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") og en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 4:1:2) og fraktioneret. Hver fraktions antimikro-bielle aktivitet overfor Proteus mirabilis blev undersøgt, og fraktionerne med antimikrobiel aktivitet blev udvalgt, sat som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF" og udviklet med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol: n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 21:3:7:9) og en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 4:1:2). Derpå opsamledes de fraktioner, som viste ultraviolet absorption for et Manasulu-lys 2536 Å (fremstillet af Manasulu Kagaku Kogyo K.K. ) og viste henholdsvis Rf 0,81 og Rf 0,64, og de blev koncentreret og lyophiliseret, hvorved der blev opnået 35 mg ren 7-(4-carboxy-butyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-/\^-cephem-4-carboxylsyre. Dette materiale viste antimikrobiel aktivitet overfor Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum og Escherichia coli.

EKSEMPEL 3 I. Fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5- Λ methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-Δ -cephem-4-carboxylsyre 1) Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1% glucose, 1,5% sojabønnemel, 0,5% gærekstrakt, 0,1% dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% magnesiumsulfat og 0,3% natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver og steriliseret i 20 min. ved 120°C. Hvert medium blev derpå podet med Streptomyces ogano-nensis stamme Y-G19Z og dyrket i 48 timer ved 30°C. Yderligere dyrkningsmedium med den ovenfor beskrevne sammensætning blev anbragt i 2 liters Sakaguchi-kolber med 400 ml i hver og sterili 48 166100 seret i 20 min. ved 120°C. Hvert medium blev podet med den ovenfor fremstillede dyrkningsvæske i en koncentration på 2-3% og derpå dyrket i 24 timer ved 30°C til dannelse af en podekultur.

For sig blev 60 1 af et dyrkningsmedium indeholdende 7% stivelse, 2% glutenmel, 2% sojabønnemel, 0,8% glycerol, 0,1% "Casamino"-syre, 0,01 % jern(IIISulfat og 55 g natriumhydroxid anbragt i 2 100 liters fermentorer sammen med i hver portion 10 ml af et under havnet "Adecanol" forhandlet skumdæmpende middel, steriliseret i 30 min. ved 120°C og podet med 800 ml podekultur efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30°C. Derpå blev 2-mercapto-5-methyl- 1,3,4-thiadiazol opløst i vandig natriumhydroxidopløsning, steriliseret ved højt tryk og tilsat dyrkningsvæsken i en koncentration på 0,05%, efterfulgt af yderligere dyrkning i 90 timer.

Efter at dyrkningen var fuldført, blev dyrkningsvæsken indstillet til pH 2,0 og blandet med "Radiolite" under omrøring. Blandingen blev filtreret under anvendelse af en filterpresse, og filtraterne blev kombineret til opnåelse af omkring 1 1 filtrat.

Filtratet blev indstillet til pH 3,0 ved tilsætning af vandig . natriumhydroxidopløsning, sendt igennem en 12 liters "Amberlite ®XAD-2"søjle, og søjlen blev vasket med 30 1 og elueret med 30 1 vandig 50% acetoneopløsning. Eluatet blev koncentreret til 5»5 1, og koncentratet blev indstillet til pH 3,5 med fortyndet saltsyre og sendt igennem en 3 liters "Amberlite® IRA-68"søjle. Søjlen blev vasket med 6 1 vand og elueret med en vandig opløsning (pH 7>2) indeholdende 1 M natriumnitrat og 0,1 M natriumacetat til opnåelse af en opløsning indeholdende omkring 5 1 antimikro-bielt aktivt materiale. Opløsningen blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 1 liters "Amberlite®XAD-2"søjle, og efter vaskning af søjlen med vand blev den elueret med en vandig 50% acetoneopløsning til opnåelse af omkring 400 ml af en vandig opløsning indeholdende det antimikrobielt aktive materiale. Produktet blev lyophiliseret.

Under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 4:1:2) blev remanensen underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt med den samme opløsningsmiddelblanding som ovenfor. De opnåede 49 146100 antimikrobielt aktive fraktioner bliver kombineret og anbragt som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF", udviklet med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol: n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 21:3:7:9) og derpå påsprøjtet en 0,25% opløsning af ninhydrin i chloridin til frembringelse af farvning ved opvarmning. Således blev de fraktioner, der udviste Rf 0,43 opsamlet, vacuuminddampet til tørhed ved 45-50°C og derpå underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel"), præpareret med en opløsningsmiddelblanding af acetonitril: vand (volumenforhold 7:3). Den opnåede antimikrobielt aktive fraktion blev underkastet tyndtlagschromatografi på "Avicel SF" som ved den ovenstående procedure, og derpå blev de fraktioner, der udviste Rf o,43, opsamlet og inddampet til tørhed, hvorved der blev opnået 0,78 g råt pulver.

Pulveret blev opløst i en lille mængde destilleret vand og udviklet på en søjle af "Sephadex®G 10" under anvendelse af destilleret vand. De antimikrobielt aktive fraktioner blev kombineret og underkastet tyndtlagschromatografi under anvendelse af eii opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 4:1:2) som angivet ovenfor, og fraktionerne med Rf 0,43 blev opsamlet, koncentreret og lyophiliseret, hvorved der blev opnået 82 mg hvid 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-

O

1,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-^ -cephem-4-carboxylsyre.

2) Ved den samme procedure som under (1) ovenfor, men under anvendelse af en opløsning af bis-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)disulfid, fremstillet ved opløsning af disulfidet i vandholdigt methanol og sterilisering ved filtrering under anvendelse af Millipore-filter, i stedet for opløsningen af 2-mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol, fremstillet i vand under anvendelse af en vandig natriumhydroxidopløsning og sterilisering ved højt tryk, blev der opnået omkring 19 g råt pulver af den ønskede forbindelse III, og rensning af produktet somunder (1) gav 5C mg 7-(5-amino-5-carboxyvalerzmido)-

O

7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl- ^ -cephem- 4-carboxylsyre.

50 14-6100 II. Fremstilling af 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-inethyl- 1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl- Αί -cephem-4-carboxylsyre_ I 10 ml af en 0,1 M pyrophosphat-pufferopløsning med pH 8,1 indeholdende 0,026% natriumazid opløstes 50 mg 7-(5-amino-5-carboxyvaler-amido) -7-methoxy-3- (5-methyl-l, 3 , 4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl-/\^-cephem-4-carboxylsyre, og til denne opløsning sattes 0,5 ml af den aktiverede myceliesuspension af Trigonopsis variabilis IF0 0755, opnået på samme måde som i eksempel 2-II-a. Blandingen blev omrørt under luftning i et vandbad ved 33°C til gennemførelse af D-aminosyre-oxidationen, og reaktionens fuldførelse blev bestemt ved hjælp af den samme høj-hastighedsvæskechromatografi. som i eksempel 2-II. Tilbageholdelsestiden af udgangsmaterialet, 7-(5-amino-5-carboxy- valeramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-2 Δ -cephem-4-carboxylsyre, var 2 min. og 55 sek., og tilbageholdelsestiden af den ved D-aminosyreoxidationen dannede 7-(4-carboxy-butyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-Δ3 -cephem-4-carboxylsyre var 11 min. og 18 sek.

Efter at reaktionen var fuldført blev myceliet fjernet ved 4°C, og overvæsken skilt fra, indstillet til pH 1,5-2,0 med fortyndet saltsyre og ekstraheret 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev kombineret og ekstraheret ved en phosphatpufferopløsning med pH 6. Phosphatopløs-ningen blev indstillet til pH 1,5-2,0 og ekstraheret igen 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev opsamlet, tørret over vandfrit natriumsulfat og vacuuminddampet til tørhed. Under anvendelse af en søjle, fyldt med mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") ved hjælp af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 4:1:2) blev remanensen udviklet under anvendelse af den samme opløsningsmiddelblanding som ovenfor. De fraktioner, der udviste antimikrobielle aktivitet overfor Proteus mirabilis, blev udvalgt, sat som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF" og udviklet med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol: n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 21:3:7:9) og en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumen-forhold 4:1:2). Derpå opsamledes de fraktioner, som udviste ultraviolet absorption for Manasulu-lys 2536 Å (fremstillet af Manasulu Kagaku Kogyo K.K.) og som også viste henholdsvis Rf 0,82 51 148100 og Rf 0,77, og de blev koncentreret og lyophiliseret, hvorved der blev opnået 32 mg ren 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-1,3>4-thiadia2ol-2-yl)thiomethyl-/\^-cephem-4-carboxylsyre« Dette materiale viste antimikrobiel aktivitet overfor Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum og Escherichia coli.

EKSEMPEL 4 I. Fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvalerainido)-7-methoxy-3-(1,3,4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl-A3-cephem-4-carboxylsyre

Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1$ glucose, 1,5$ sojabønnemel, 0,5$ gærekstrakt, 0,1$ dikaliumhydrogenphosphat, 0,05$ magnesiumsulfat og 0,3$ natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver, steriliseret i 20 min. ved 120°C og podet med Streptomyces oganonensis stamme Y-G19Z efter fulgt af dyrkning i 48 timer ved 30°C. Yderligere dyrkningsmedium med den ovennævnte sammensætning blev anbragt i 2 1 liters Sakaguchi-kolber med 400 ml i hver, steriliseret i 20 min. ved 120°C og derpå podet med 2-3$ af den ovenfor fremstillede dyrkningsvæske efterfulgt af yderligere dyrkning i 24 timer ved 30°C til dannelse af en podekultur.

Separat blev 60 1 af et dyrkningsmedium indeholdende 7$ stivelse, 2$ glutenmel, 2$ sojabønnemel, 0,8$ glycerol, 0,1$ ,,Casamino"-syre, 0,01$ jern(III)-sulfat og 55 mg natriumhydroxid anbragt i 2 100 liters fermentorer sammen med i hver portion 10 ml af-et under navnet "Adecanol" forhandlet skumdæmpende middel, steriliseret i 30 min ved 120°C og podet med 800 ml af podekulturen efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30°C. Derefter sattes en opløsning af 2-mercapto-l,3,4-thiadiazol, fremstillet ved opløsning af thiadia-zolen i vand under anvendelse af en vandig natriumhydroxidopløsning og sterilisering ved højt tryk, til dyrkningsvæsken, således at koncentrationen af thiadiazolen blev 0,05$, og derefter blev systemet dyrket i yderligere 90 timer.

Efter at dyrkningen var fuldført blev dyrkningsvæsken indstillet til pH 2,0 og blandet med "Radiolite" under omrøring. Blandingen blev filtreret under anvendelse af en filterpresse, og filtraterne blev kombineret til omkring 100 1 filtrat.

52 146100

Filtratet blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 12 liters "Åmberlite®XAD-2"søjle, og søjlen blev vasket med 30 1 vand og elueret med 30 1 vandig 50% acetoneopløsning. Eluatet blev koncentreret til 5)5 1, og koncentratet blev indstillet til pH 3,5» sendt igennem en 3 liters "Åmberlite 'S'IRA-68" (Cl-type) søjle. Søjlen blev vasket med 6 1 vand og elueret med en vandig opløsning (pH 7,2) indeholdende 1 M natriumnitrat og 0,1 M natriumacetat til opnåelse af omkring 5 1 opløsning indeholdende et anti-microbielt aktivt materiale. Opløsningen blev indstillet til pH

3,0, sendt igennem en 1 liters "Åmberlite® XAD-2"søjle, vasket med vand og elueret med en vandig 50% acetoneopløsning til opnåelse af omkring 400 ml af en vandig opløsning indeholdende det antimikrobielt aktive materiale. Opløsningen blev lyophiliseret.

Under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 4:1:2) blev den dannede remanens underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt med den samme opløsningsmiddelblanding som ovenfor. De antimikrobielt aktive fraktioner blev kombineret og anbragt som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel", udviklet under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af isopropanol: n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 21:3:7:9) og derefter sprøjtet med en 0,25% opløsning af ninhydrin i pyridin til frembringelse af farvning under opvarmning. Fraktionerne, som udviste Rf 0,39, blev opsamlet og vacuuminddampet til tørhed ved 45-50°C. Produktremanensen blev underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt med en opløsningsmiddelblanding af acetonitril: vand (volumenforhold 7:3). De antimikrobielt aktive fraktioner blev også underkastet tyndtlagschromatografi på "Avicel SF" som ved den ovenstående procedure, og derpå blev fraktionerne med Rf 0,39 opsamlet og vacuuminddampet til tørhed, hvorved der blev opnået 0,92 g råt pulver.

Det rå pulver blev opløst i en lille mængde destilleret vand og underkastet søjlechromatografi under anvendelse af "Åmberlite ^CG-SO" (H-type) søjle med destilleret vand, og de antimikrobielt aktive fraktioner blev opsamlet, koncentreret og lyophiliseret. Remanensen blev opløst i en lille mængde destilleret vand og udviklet på en søjle af "Sephadex® G 10" under anvendelse af destilleret vand. Den antimikrobielle aktivitet af hver fraktion blev 53 146100 undersøgt, og de effektive fraktioner blev underkastet tyndtlags-chromatografi under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 4:1:2) som beskrevet ovenfor. Fraktionerne med Rf 0,38 blev opsamlet, koncentreret og lyophiliseret, hvorved der blev opnået 75 mg hvid 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-Δ5 -cephem-4-carboxylsyre.

II. Fremstilling af 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-Å3-cephem-4-carboxylsyre_ I 10 ml af en 0,1 M pyrophosphat-pufferopløsning med pH 8,1 indeholdende 0,026$ natriumazid opløstes 50 mg 7-(5-amino-5-carboxy-valeramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl-Λ 3-ce-phem-4-carboxylsyre, og efter tilsætning af 0,5 ml af en aktiveret myceliumsuspension, fremstillet som i eksempel 2-ii-a, blev blandingen omrørt under luftning i et vandbad ved 35°C til gennemførelse af D-aminosyreoxidationen. Reaktionens fuldførelse blev bestemt ved den samme høj-hastighedsvæskechromatografi som i eksempel 2-n-b.Tilbageholdelsestiden for udgangsmaterialet, 7-(5~amino-5-carboxyvaler-amido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-4 ^-cephem-4-carboxylsyre, var 1 minut og 56 sekunder, og tilbageholdelsestiden af den ved D-aminosyreoxidationen fremstillede 7-(4-carboxybutyramido )-7-methoxy~3-(1,3,4-thiadiazol-2yl)-thiomethyl-4 ^-cephem-4-carboxylsyre var 5 minutter og 28 sekunder.

Efter fuldførelse af reaktionen blev myceliet fjernet ved 4°C, og overvæsken udvundet, indstillet til pH 1,5-2,0 med fortyndet saltsyre og ekstraheret 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev kombineret og gen-ekstraheret med en phosphatpufferopløsning med pH 6,0. Phosphat-opløsningen blev igen ekstraheret 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat, og ethylacetatekstrakterne blev opsamlet, tørret over vandfrit natriumsulfat og inddampet til tørhed i vakuum.

Det opnåede produkt blev udviklet med en opløsningsmiddelblanding af n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 4 : 1 : 2) på en søjle af mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt under anvendelse af den samme opløsningsmiddelblanding som ovenfor, til 54 146100 udvælgelse af de fraktioner, som udviste antimikrobiel aktivitet overfor Proteus mirabilis. De således udvalgte fraktioner blev sat som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF” og udviklet under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af isopropanol : n-butanol: eddikesyre : vand (volumenforhold 21 : 3 : 7 : 2) og en opløsningsmiddelblanding af n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 4:1:2) til opsamling af de fraktioner, som viste ultraviolet absorption for Manasulu-lys 2536 Å (fremstillet af Manasulu Kagaku Kogyo K. K.) og som udviste henholdsvis Rf 0,81 og Rf 0,65. Fraktionerne blev koncentreret og lyophiliseret, hvorved der blev opnået 40 mg ren 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(1,3,4-thiadia-zol-2-yl)thiomethyl- cephem-4-carboxylsyre. Dette materiale viste antimikrobiel aktivitet overfor Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum og Escherichia coli.

EKSEMPEL 5 I. Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1% glucose, 1,5% sojabønnemel, 0,5% gærekstrakt, 0,1%> dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% magnesiumsulfat og 0,3% natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver og steriliseret i 20 min. ved 120°C. Hvert medium blev podet ved Streptomyces oganonensis stamme Y-G19Z efterfulgt af dyrkning i 48 timer ved 30°C. Yderligere dyrkningsmedium med den ovennævnte sammensætning blev anbragt i 2 1 liters Sakaguchi-kolber med 400 ml i hver, steriliseret i 20 min. ved 120°C og podet med 2-3% af den ovenfor fremstillede dyrkningsvæske efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30°C til opnåelse af en podekultur.

Separat blev 60 1 af et dyrkningsmedium indeholdende 7% stivelse, 2% glutenmel, 2% sojabønnemel, 0,8% glycerol, 0,1% "Casamino"-syre 0,01% jern(III)-sulfat og 55 g natriumhydroxid anbragt i 2 100 liters fermentorer sammen med i hver portion 10 ml "Adecanol”, steriliseret i 30 min. ved 120°C og podet med 800 ml af den ovenfor fremstillede podekultur efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30°C. Derpå blev en opløsning af 5-mercapto-l-methyl-lH-tetrazol i vandig natriumhydrox idopløsning, steriliseret ved højt tryk, sat til dyrkningsvæsken, såle des at koncentrationen af tetrazolen blev 0,05%. Dyrkningen fortsattes i yderligere 90 timer.

146100 55

Efter dyrkningens fuldførelse blev dyrkningsvæsken indstillet til pH 2,0 og blandet med "Radiolite" under omrøring. Blandingen blev. filtreret ved hjælp af en filterpresse, og filtraterne kombineret til opnåelse af 100 1 filtrat indeholdende 100 yug/ml 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-Δ3 -cephem-4-carboxylsyre.

II.Filtratet blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 12 liter "Amberlite ® XAD-2" kolonne, og kolonnen blev vasket med 30 liter vand og elueret med 30 liter vandig 50% acetoneopløsning. Eluatet blev koncentreret til 5,5 liter, og koncentratet blev indstillet til pH 7,5 med vandig natriumhydroxidopløsning.

Efter fjernelse af det dannede uopløselige materiale sattes 320 ml af den aktiverede myceliesuspension af Trigonopsis variabilis stamme IFO 0755, fremstillet som i eksempel 2-Il-a til opløsningen. Blandingen blev omrørt under luftning i 4 timer, indstillet til pH 1,5-2,0 med fortyndet saltsyre og ekstraheret 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethyl-acetat. Ethylacetatekstrakterne blev opsamlet, og 20 liter af den således opnåede ethylacetatekstrakt blev genekstraheret med 2 liter af en phosphatbufferopløsning med pH 6,0. Phosphat-opløsningen blev derefter indstillet til pH 1,5-2,0 med fortyndet saltsyre og igen ekstraheret 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev kombineret, og 8 liter af den således opnåede ekstrakt blev inddampet i vakuum til tørhed, hvorved der blev opnået ca. 15 g råt materiale. Materialet blev underkastet søjlechromatografi under anvendelse af cellulosepulver på samme måde som i eksempel 2-II-b, hvorved der blev opnået 5,1 g hvid 7-(4-carboxybutyramido)- 7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl- A^-cephem-4-carboxylsyre.

EKSEMPEL 6

Et dyrkningsmedium bestående af 50 g glucose, 10 g pepton, 1 g kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g magnesiumsulfat, 10 g maltekstrakt, 1 g DL-methionin og 1000 ml vand med pH 6,0 blev podet med Trigonopsis variabilis stamme IFO 0755 efterfulgt af dyrkning som i eksempel 2-II-a. Der blev opsamlet 1000 ml dyrkningsvsske, som blev centrifugeret ved 2000 omdr ../min. ved 4°C, og det udskilte mycelium

56 1Λ 610 O

blev opsamlet. Myceliet blev suspenderet i 200 ml af en 0,1 M pyrophosphat-bufferopløsning med pH 8,1, og myceliumsuspensionen blev anbragt i 500 ml Erlenmeyer-kolber med 50 ml i hver. Efter tilsætning af 5 ml toluen gennemførtes aktiveringen i 1 time ved 37°C. Derefter blev det aktiverede mycelium opsamlet ved centrifugering i 30 minutter ved 2000 omdr./min. og derpå i centrifugen vasket med 200 ml af en 0,1 M pyrophosphat-pufferopløsning med pH 8,1. Det aktiverede mycelium blev igen suspenderet i 200 ml 0,1 M pyrophosphat-bufferopløsning med pH 8,1, og suspensionen blev omrørt i et vandbad ved 50°C til inaktivering af katalase-aktiviteten. Derpå sattes 5 ml af suspensionen af det aktiverede mycelium til en opløsning af 100 mg 7-{5-amino-5-carboxyvaleramido)- 7-methoxy-3-(1-methyl-1H-tetrazo1-5-y1)thiomethy1- Δ -cephem-4-carboxylsyre, fremstillet som i eksempel 5-1, i 20 ml af en 0,1 M pyrophosphat-pufferopløsning med pH 8,1, og efter omrøring af blandingen under luftning i 5 timer ved 33°C blev den behandlet som i eksempel 2-II-b til opnåelse af 7-(4-carboxy-butyramido)- 7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl) thiomethy 1-Λ -cephem-4-carboxylsyre.

EKSEMPEL 7

Et mycelium af Trigonopsis variabilis, opnået på samme måde som i eksempel 2-II-a, blev frosset ved en temperatur under -20°C i mere end en time og fik derpå lov at stå ved stuetemperatur til optøning, hvorefter det blev suspenderet i 200 ml af en 0,1 M pyrophosphatpufferopløsning med pH 8,1. Derpå sattes 5 ml af suspensionen til en opløsning af 100 mg 7-(5-amino-5-carboxylvaler-

O

amido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-Δ “cephem- 4-carboxylsyre, fremstillet som i eksempel 5-1, i 20 ml af en 0,1 M pyrophosphat-pufferopløsning med pH 8,1 indeholdende 0,026% natriumazid, og efter omrøring af blandingen under luftning i 5 timer ved 33°C, blev den behandlet på samme måde som i eksempel 2-II-b til opnåelse af 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(1- 2 methyl-IH-tetra zol-5-y1)thiomethyl-A -cephem-4-carboxylsyre.

57 146100 EKSEMPEL 8 i. Fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-A^-cephem-4-carboxylsyre.

Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1% glucose, 1,5% sojabønnemel, 0,5% gærekstrakt, 0,1% dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% magnesiumsulfat og 0,3% natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Saka-guchi-kolber med 100 ml i hver, og hvert medium blev steriliseret i 20 minutter ved 120°C. Det sterile dyrkningsmedium blev podet med Streptomyces oganonensis Y-G19Z efterfulgt af dyrkning i 48 timer ved 30°C. Yderligere dyrkningsmedium med den ovennævnte sammensætning blev anbragt i 2 1 liters Sakaguchi-kolber med 400 ml 1 hver, og efter sterilisering af mediet i 20 minutter ved 120°C blev det podet med den ovenfor fremstillede dyrkningsvæske i en mængde på 2-3% efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30°C til opnåelse af en podekultur.

Separat blev 60 liter af et dyrkningsmedium indeholdende 7% stivelse, 2% glutenmel, 2% sojabønnemel, 0,8% glycerol, 0,1% "Casamino"-syre, 0,01% jern (IH)-sul fat og 55 g natriumhydroxid anbragt i 2 100 liters fermentorer sammen med i hver portion 10 ml af et under navnet "Adecanol" forhandlet skumdæmpende middel. Hvert dyrkningsmedium blev steriliseret i 30 minutter ved 120°C og derefter podet med 800 ml af den ovenfor fremstillede podekultur.

Til hver frementor sattes en opløsning af l-methyl-5-mercapto-lH-tetrazol i vandig natriumhydroxidopløsning, steriliseret ved højt tryk, således at indholdet af tetrazolen blev 0,05%, og derpå blev dyrkningsvæsken dyrket i yderligere 90 timer.

Efter fuldførelse af dyrkningen blev dyrkningsvæsken indstillet til pH 2,0 og blandet med "Radiolite" under omrøring. Blandingen blev filtreret ved hjælp af en filterpresse, og filtraterne blev kombineret til opnåelse af omkring 100 liter filtrat.

Filtratet blev indstillet til pH 3,0 ved tilsætning af en vandig natriumhydroxidopløsning, sendt igennem en 12 liters "Amberlite '^XAD-2M søjle, og søjlen blev vasket med 30 liter vand og elueret med 30 liter vandig 50% acetoneopløsning. Eluatet blev koncentreret 58 146100 til 5,5 liter, og koncentratet indstillet til pH 3,5 med fortyndet saltsyre, sendt igennem en 3 liters "Amberlite®IRA-68" (Cl-type) søjle, og søjlen blev vasket med 6 liter vand og elueret med en vandig opløsning (pH 7,2) indeholdende 1 N natriumnitrat og 0,1 M natriumacetat til opnåelse af omkring 5 liter opløsning indeholdende et antimikrobielt aktivt materiale. Opløsningen blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 1 liters "Amberlite ^ XAD-2" søjle, og søjlen blev vasket med vand og elueret med en vandig 50% acetoneopløsning til opnåelse af omkring 400 ml af en vandig opløsning indeholdende det antimikrobielt aktive materiale, som blev lyophiliseret, hvorved der blev opnået 54 g råt pulver. Det rå pulver blev underkastet søjlechromatografi på omkring 800 ml "DEAE Sephadex® A-25" eddikesyre fyldt med en lille mængde 0,5 M ammoniumbromid-eddikesyre-pufferopløsning til fraktionering af effektive fraktioner. De således opsamlede antimikrobielt aktive fraktioner blev sendt igennem en søjle af 500 ml "Amberlite ^ XAD-2", og søjlen blev vasket med vand og elueret med en vandig 25% acetoneopløsning. Eluatet blev derpå inddampet til tørhed i vakuum.

Det tørrede produkt blev underkastet søjlechromatografi med en opløs-ningsmiddélblanding af isopropanol : vand (volumenforhold 7 : 3) på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt med den samme opløsningsmiddelblanding som nævnt ovenfor. Derpå blev de fraktioner, som viste antimikrobiel aktivitet, sat som plet på en tyndt-lagsplade af "Avicel SF" og udviklet med en opløsningsmiddelblanding af n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 6 : 1,5 : 2,5), hvorpå den blev sprøjtet med en 0,25% opløsning af ninhydrin i pyridin til frembringelse af farvning under opvarmning. Fraktionerne, som viste Rf 0,31, blev opsamlet, inddampet til tørhed i vakuum ved 45-50°C og underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel"), fremstillet med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol : n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 21 : 3 ϊ 7 : 9). De antimikrobielt aktive fraktioner blev derpå udvalgt og underkastet tyndtlagschromatografi på "Avicel SF", og ved den samme proceudre som ovenfor blev fraktionerne, som udviste Rf 0,39, opsamlet og inddampet til tørhed i vakuum.

Det tørrede produkt blev yderligere underkastet chromatografi på 59 146100 mikrokrystallinsk cellulose under anvendelse af en opløsningsmiddel-blanding af n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 6 : 1,5 : 2,5) til rensning af de effektive komponenter. De rensede aktive fraktioner blev inddampet til tørhed, opløst i en lille mængde destilleret vand og udviklet på en søjle af "Sephadex®G 10" under anvendelse af destilleret vand. Hver fraktions antimikrobiel-le aktivitet blev undersøgt, og de effektive fraktioner blev udvalgt, underkastet tyndtlagschromatografi som angivet ovenfor under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 6 : 1,5 : 2,5), og fraktionerne, der udviste Rf 0,31, blev opsamlet, koncentreret og lyophiliseret, hvorved der blev opnået 60 mg hvid 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)- 3- (l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-7-methoxy- A^-cephem-4-carboxylsyre.

il.Fremstilling af 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl- A^-cephem-4-carboxylsyre.

I 10 ml af en 0,1 M pyrophosphat-pufferopløsning med pH 8,1 indeholdende 0,02% natriumazid opløstes i 54,5 mg 7-(5-amino-5-carboxy-valeramido)-7-methoxy-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-Δ ^-cephem-4-carboxylsyre, fremstillet i trin a), og efter tilsætning af 0,5 ml af en aktiveret myceliumsuspension, fremstillet på samme måde som i eksempel 2-II-a, blev blandingen omrørt under luftning i et vandbad i 33°C. Reaktionens fuldførelse blev kontrolleret for hver 30 minutter ved hjælp af et Hitachi høj-hastighedsvæske-chromatografi-apparat (under anvendelse af "yu Bondapak C^g" fremstillet af Waters Ltd. og et opløsningssystem af acetonitril : 0,1% eddikesyreopløsning (volumenforhold 1 : 9)), idet tilbageholdelsestiden for udgangsmaterialet, 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)- 7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl- A^-cephem-4-carboxylsyre var 1 minut og 53 sekunder, og tilbageholdelsestiden for den ved D-aminosyre-oxidationen dannede 7-(4-carboxybutyrami- -z do)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl- Λ -cephem- 4- carboxylsyre var 4 minutter og 54 sekunder. Efter fuldførelse af reaktionen blev myceliet fjernet ved centrifugering ved 4°C. Overvæsken blev udvundet, indstillet pH 1,5-2,0 med fortyndet saltsyre og ekstraheret 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev kombineret og gen- 60 U8100 ekstraheret med en phosphat-pufferopløsning med pH 6,0. Phosphat-pufferopløsningen blev derpå indstillet til pH 1,5-2,0 med fortyndet saltsyre og igen ekstraheret 4 gange, hver gang med et lige så stort volumen ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev kombineret, tørret over vandfrit natriumsulfat og inddampet til tørhed i vakuum. Det tørrede produkt blev udviklet med en opløsningsmiddelblanding af n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 4 : 1 : 2) på en søjle af mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel"), fremstillet med den samme opløsningsmiddelblanding som ovenfor. Hver fraktions antimikrobielle aktivitet overfor Proteus mirabilis blev undersøgt, og fraktionerne med antimikrobiel aktivitet blev udvalgt, sat som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF" og udviklet med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol : n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 21 : 3 : 7 : 9) og en opløsningsmiddelblanding af n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 4:1:2) til opsamling af de fraktioner, som viste ultraviolet absorption for Manasulu-lys 2536 Å (fremstillet af Manasulu Kagaku Kogyo K. K.) og som viste henholdsvis Rf 0,81 og Rf 0,64. Fraktionerne blev kombineret og derpå koncentreret og lyophiliseret, hvorved der blev opnået 35 mg ren 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A^-cephem-4-carboxylsyre. Dette materiale viste antimikrobiel aktivitet overfor Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum og Escherichia coli.

Methylesteren af den ovenfor fremstillede syre, fremstillet ved proceduren i det efterfølgende referenceeksempel A, stemte fuldstændig overens i struktur med den tilsvarende forbindelse fremstillet ved synteseprocessen i det nedenstående referenceeksempel B.

Referenceeksempel A

I 10 ml chloroform suspenderedes 100 mg 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl- Δ^-cephem-4-carboxylsyre, og efter tilsætning af 4 ml af en 1% opløsning af diazomethan i ether blev blandingen omrørt i 30 minutter ved stuetemperatur. Den opnåede reaktionsblanding blev vasket med fortyndet eddikesyre og vand, tørret over vandfrit magnesiumsulfat og koncentreret under formindsket tryk. Den opnåede remanens blev 61 166100 underkastet søjlechromatografi på en silicagel søjle og elueret med en opløsningsmiddelblanding af benzen : ethylacetat (volumen-forhold 1 : 3). Fraktionerne indeholdende den ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under formindsket tryk, hvorved der blev opnået 80 mg methyl-7-methoxy-7-(4-methoxycarbonylbutyramido)- 3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl- A^-cephem-4-carboxylat.

Infrarødt absorptionsspektrum: cm-1: 1780 (lactam )

ΙΓι S./C

1725 (ester, carbonyl).

Magnetisk kerneresonansspektrum (CDCl^):

Si 2,03 (2H, -CO-CHg-OTg-CHg-CO-), 2,39 (4H, -CO-Cl^-C^-CHp-CO-), 3,51 (3H, 7-position, -OCH^), 3,64 (3H, CH^-0-C0-(CH2)3- ), 3j87 3H, n—^ 3,92 3H, -^N + N^J- C00CH3 4,23, 4,53 (2Hf ^.s_ ) 5,04 (IH, 6-position, -H).

Referenceeksempel B

a) I en blanding af 30 ml ethylacetat og 50 ml methanol opløstes 1,0 g diphenylmethyl-7p-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzylidenami-no )-7oc-methoxy-3“ (l-methyl-lH-tetrazol-5-yl) thiomethyl- Δ^-cephem- 4-carboxylat og 1,8 g af et Gilard-reagens, og blandingen blev omrørt i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter fuldførelse af reaktionen blev reaktionsblandingen koncentreret under formindsket tryk, og den dannede remanens blev opløst i 50 ml ethylacetat og vasket 3 gange, hver gang med 20 ml vand. Det organiske lag blev skilt fra, tørret over vandfrit magnesiumsulfat, og opløsningsmidlet afdestil- 62 146100 leret under formindsket tryk, hvorved der blev opnået 0,6 g råt dxphenylme ^7ΐ-7β-^ϊηο-7α^β thoxy-3- (1-methyl-lH-tetrazol-5-yl) thi ome thyl- Λ^-cephem-4-carboxylat. Produktet blev opløst i 10 ml chloroform, og efter afkøling af opløsningen til en temperatur mellem -20 og -30°C tilsattes dråbevis 0,6 g methyl-4-chlorformyl-butyrat under omrøring. Blandingen blev derpå yderligere omrørt i en time ved samme temperatur. Reaktionsblandingen blev blandet med 20 ml chloroform, og blandingen blev vasket med 10 ml 1 N saltsyre og derpå med 10 ml vand. Det organiske lag blev skilt fra og tørret over vandfrit magnesiumsulfat. Opløsningsmidlet blev afdestilleret under formindsket tryk og remanensen blev underkastet silicagel-søjlechromatografi. Søjlen blev elueret med en opløsningsmiddelblanding af benzen : ethylacetat (volumenforhold 3 : l) og derpå med en opløsningsmiddelblanding af benzen : ethylacetat (volumenforhold 1:3), hvorved der blev opnået 500 mg rent 7oc-methoxy-7P-(4-methoxycarbonyl-butyramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thio-methyl- A^-cephem-4-carboxylat med de følgende egenskaber:

Magnetisk kerneresonansspektrum (CDCl^): 2,00 (211, -CO-CKg-OTg-CHg-CO-) , 2,36 (4H, -C0-CHg-0H2-CH^-C0-), 3,50 (3H, 7-position, -0CH,), 3,63 (3H, CH3-0-C0-(CH2)3-), 3,7& (3H, h ), i 63 146100 4,19, 4,44 (2H, c„s_ ),

T N<VS

5,04 (1H, 6-position, H),

C H

6,91 (1H, -CH< 6 5 ),

C6H5 C H

7,32 (10H, -CH\ 6-§ ), b) I 4 ml af en opløsningsmiddelblanding af trifluoreddikesyre : anisol (volumenforhold 4 : l) opløstes 400 mg diphenylmethyl-7a-methoxy-7P-(4-methoxycarbonylbutyrmaido)-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl- ^-cephem-4-carboxylat ved en temperatur mellem -10 og -20°C, og blandingen blev omrørt i 30 minutter ved samme temperatur. Efter fuldførelse af reaktionen blev opløsningsmidlet afdestilleret linder formindsket tryk, og derpå sattes ether til remanensen, hvorved der udfældedes rå 7a-methoxy-7P-(4-methoxycar-bonyl-butyramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl- /¥*-cephem-4-carboxylsyre, som blev udvundet ved filtrering og suspenderet i 10 ml chloroform. Suspensionen blev blandet med 0,4 ml af en 1% opløsning af diazomethan i ether ved 10-20°C, og blandingen blev omrørt i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev vasket med en fortyndet eddikesyreopløsning og derpå med vand og tørret over vandfrit magnesiumsulfat. Derefter blev opløsningsmidlet afdestilleret under formindsket tryk, og den dannede remanens blev underkastet silicagel-søjlechromatografi. Søjlen blev elueret med en opløsningsmiddelblanding af benzen : ethylacetat (volumenforhold 1 : 3)» og fraktionerne indeholdende den ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under formindsket tryk, hvorved der blev opnået 150 mg methyl-7cc-methoxy-7P-(4-methoxy-carbonylbutyramido)-3- (l-methyl-lH-tetrazol-5-yl) thiomethyl- /\p-cephem-4-carboxylat med de følgende egenskaber:

Infrarødt absorptionsspektrum: V1®1, cm”’: 1780 (lactam «Λ" ) - max ° 1725 (ester, carbonyl).

146100 64

Magnetisk kerneresonansspektrum (CDCl^): S i 2,03 (2H, -CO-CHg-æg-CHg-CO-), 2,39 (4H, -CO-CHg-CHg-CH^-CO-), 3^51 (3H, 7-position -OCIU), 3,64 (3H, CH^OCO(CK2)3-), 3,87 /3H, + ''f' Ji

An.N

3.82 mH, , T

1 ch3 cooch3 4f23, 4,53 (2H, ^-CHg-S- ), 5,04 (IH, 6-position H).

Claims (4)

1. 65 146100
2. 1. Fremgangsmåde til fremstilling af 7-(4-carboxybutyramido)-7-methoxycephalosporin-derivater med den almene formel OCH,
3. 3 S H00C-(CH2)5C0NH--^ N
4. 0 J-Y^ch2-s-r2 COOM p hvori R betyder en heterocyclisk gruppe, som indeholder 2-4 nitrogenatomer og yderligere kan indeholde et svovlatom, og som kan være substitueret med en lavere-alkylgruppe eller en carboxy-lavere-alkylthiogruppe og M betyder hydrogen eller en saltdannende kation udvalgt blandt alkalimetaller, jordalka-limetaller, tungmetaller og baser, der danner kvaternære salte eller aminosalte, kendetegnet ved, at en 7-methoxy-cephalosporinantibioticum-producerende mikroorganisme tilhørende slægten Streptomyces dyrkes i et næringsmedium med tilsætning af en heterocyclisk thiol med formlen R2SH p hvori R har den ovennævnte betydning, eller et salt deraf eller en forbindelse, som kan omdannes til den nævnte hetero-cykliske thiol under dyrkningen, til dannelse af et 7-methoxycephalosporin-derivat med formlen 00¾ HOOC.. 3 g ^ch(ch2)3conh ..--S N h2n L1JL . Aa ^ IJHg- S-R2 COOM 2 hvori R og M har den ovennævnte betydning, hvorefter denne forbindelse udsættes for aerob indvirkning af myceliet af en