DE3689493T2

DE3689493T2 - Verfahren zur Herstellung von reinem natürlichen Heparansulfat und Dermatansulfat und ihre pharmazeutische Verwendung.

Info

Publication number: DE3689493T2
Application number: DE86102963T
Authority: DE
Inventors: Ambrosi Luigi De; Bono Rinaldo Del; Gianni Ferrari; Piergiuseppe Pagella
Original assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA
Current assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA
Priority date: 1985-03-13
Filing date: 1986-03-06
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2006-03-07
Also published as: DK113886D0; NO860940L; DE3689493D1; ZA861855B; PT82198A; NZ215435A; FI82700C; ES8705894A1; YU46303B; GR860677B; NO166187B; FI861020A; FI861020A0; AU582221B2; PT82198B; FI82700B; JPH0238601B2; YU37586A; EP0199033A2; KR860007278A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von reinem natürlichem Heparansulfat und Dermatansulfat und ihre pharmazeutische Verwendung.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Heparansulfat und Dermatansulfat aus Mischungen von Proteoglycanen aus tierischem Gewebe der Aorta, des Myocards und von besonders mit Gefäßen durchzogenen Organen, basierend auf der Eliminierung der Proteinkomponente der Proteoglycane durch milde Behandlung, welche es gestattet, die Struktur der beiden Mucopolysaccharide vollständig zu erhalten.
Dieses Verfahren bietet zweifelsfrei Vorteile anderen bekannten Prozessen gegenüber, da es gestattet, Heparansulfat und Dermatansulfat in reiner Form zu erhalten, d. h. nicht verunreinigt mit anderen Mucopolysaccharid- Familien, und es ferner jeden chemischen oder enzymatischen Abbau der Produkte selbst vermeidet und einfach in einen industriellen Produktionsprozeß umgesetzt werden kann.
Die Mucopolysaccharide, die in den verschiedenen Körperzentren weit verbreitet sind, bestehen aus heterogenen Makromolekülkomplexen und weisen Strukturen und pharmakologische Profile auf, welche sich je nach der zu erfüllenden Aufgabe wesentlich unterscheiden.
Veränderungen in der Struktur und folglich im pharmakologischen Profil werden häufig durch die chemische und enzymatischen Behandlung induziert, welche für die industrielle Reinigung nach bekannten Verfahren notwendig ist.
Heparansulfat und Dematansulfat werden im allgemeinen aus einer Mucopolysaccarid-Mischung erhalten, welche ein Nebenprodukt der Heparindarstellung ist.
Die lange Abfolge von chemischen und enzymatischen Behandlungen, Fällungen und Fraktionierungen, welche zur Gewinnung des Heparins und zur Abtrennung der Verunreinigungen erforderlich sind, führen immer zu einem Abbau der Heparan- und Dermatanstrukturen mit anschließender Veränderung des pharmakologischen Profils, und zwar in Abhängigkeit von den verwendeten Fraktionierungs- und Reinigungsmethoden.
Die unterschiedlichen Eigenschaften des Heparins in Abhängigkeit von den Ausgangsmaterialien und den für die Herstellung verwendeten Verfahren werden aus dem Merck- Index, 10. Auflage, Seiten 672 und 673 und aus Römpps Chemie Lexikon, 1976, Seiten 893 und 1450 deutlich.
Das rohe Heparin ist normalerweise gefärbt und kann durch eine oxidative Behandlung gereinigt werden, wie beispielsweise in U.S.-P 3,179,566 beschrieben.
Arbeitet man nach den Verfahren des Standes der Technik, wie beispielsweise nach dem in der U.S.-P 3,862,003 beschriebenen Verfahren, dann werden die Reaktionen zur Freisetzung der Mucopolysaccharide mit proteolytischen Enzymen bei 55ºC durchgeführt. Die Protein-Koagulation wird durch Erhitzen auf 100ºC oder mehr erreicht, wie beispielsweise in dem in der DE-OS-25 08 082 beschriebenen Verfahren und nachfolgender Komplexierung, welche mit quartären Ammonium-Salzen durchgeführt wird, wie beispielsweise in der EP-A-0 097 625 berichtet.
Weniger drastische Verfahren werden in "Biochemica und Biophysica Acta", Band 338, 1974, Seiten 108-119; oder in "The Journal of Biological Chemistry", Band 254, No. 4, 25. Februar 1979, Seiten 1312-1318, beschrieben.
Aufgrund der Tatsache, daß die in der Aorta, im Myocard und insbesondere in gefäßdurchzogenen Organen vorkommenden Mucopolysaccharide der koagulativen Hämostase ausgesetzt sind, ist das erfindungsgemäße Verfahren, welches für deren Extraktion aus genannten Geweben unter Erhalt der natürlichen Struktur geeignet ist, von besonderer Wichtigkeit.
Das erfindungsgemäße Verfahren schließt Reaktionen unter Verwendung von proteolytischen Enzymen zur Freisetzung der Mucopolysaccharide bei 55ºC aus und umgeht ferner das Erhitzen auf 100ºC zur Koagulation der Proteine und vermeidet darüber hinaus deren Komplexierung unter Verwendung von quartären Ammonium-Salzen.
Somit werden tatsächlich solche Schritte vermieden, welche die Materialien derart behandeln, daß ihre empfindliche Struktur denaturiert wird.
Das Verfahren zur Herstellung von natürlichem Heparansulfat und Dermatansulfat, welche nicht mit anderen Mucopolysaccharid-Familien verunreinigt sind, aus Mischungen von Proteoglycanen aus tierischen Organgeweben der Aorta, dem Myocard und gefäßdurchzogenen Organen umfaßt die folgenden Schritte:
- Extraktion der Proteoglycane aus dem Gewebe in fein mikronisierter Form durch Behandlung mit einer Lösung von demineralisiertem Wasser, welches zwischen 0,5 Gew.-% und 2 Gew.-% Natriumacetat, zwischen 0,5 Gew.-% und 1 Gew.-% EDTA-Na-Salz und zwischen 20 Gew.-% und 35 Gew.-% einer Verbindung aus der Gruppe von Harnstoff, Guanidin, Thioharnstoff und Kaliumthiocyanat/Harnstoff enthält in einem Gewichtsverhältnis der Lösung zum Gewebe, welches zwischen 2 und 4 beträgt, unter Rühren bei Raumtemperatur während einer Zeit zwischen 15 und 50 Stunden;
- Filtration und Klärung der Lösung und Elimination der für die vorstehende Behandlung verwendeten Substanzen durch wiederholte Verdünnung mit demineralisiertem Wasser und Konzentration mittels Ultrafiltration, wobei die Wiederholung so lange erfolgt, bis eine Lösung erhalten wird, welche einen Gehalt an besagter Komponente aufweist, welcher geringer als 5 Gew.-% ist;
- Spaltung der Bindung zwischen den Mucopolysacchariden und Proteinen durch Behandlung der Lösung des vorangehenden Schrittes mit einer Natriumchloridlösung mit einer Konzentration zwischen 8,7 Gew.-% und 14,5 Gew.-% in einer solchen Menge, daß schließlich eine NaCl-Konzentration zwischen 1,5 und 2,5 M erhalten wird bei Raumtemperatur während einer Zeit zwischen 5 und 15 Stunden;
- Ausfällung der Proteine durch Behandlung mit Trichloressigsäure einer Konzentration zwischen 3 Gew.-% und 6 Gew.-% und Filtration;
-Eliminierung der Nukleinsäure-Spuren durch Behandlung mit Aktiverden in einer Menge zwischen 2 Gew.-% und 5 Gew.-% bezogen auf die Lösung bei einem pH-Wert zwischen 3 und 4 unter Rühren bei Umgebungstemperatur für 2 Stunden;
- Ausfällung der Mucopolysaccaride durch Behandlung mit Alkoholen oder Ketonen, wie beispielsweise Methanol, Ethanol oder Aceton in einem volumetrischen Verhältnis zwischen 0,8 : 1 und 1,2 : 1 in Bezug auf die Lösung bei einem pH-Wert zwischen 5 und 6;
- Fraktionierung von Heparansulfat und Dermatansulfat durch Auflösen des Rohproduktes, welches in demineralisiertem Wasser mit einem Gehalt von 1 Gew.-% bis 3 Gew.-% vorliegt, Behandlung mit kationischen Harzen, Neutralisation mit Calciumhydroxyd und Durchführung einer fraktionellen Fällung durch Zugabe von Aceton, zuerst bis zu einer Konzentration von 30 Vol-% und Abtrennung des ausgefällten Dermatansulfats durch Filtration und dann durch weitere Zugabe von Aceton bis zu einer Konzentration von 50 Vol-% und Abtrennung des ausgefällten Heparansulfats;
- Reinigung des Heparansulfats und Dermatansulfats durch getrenntes Wiederauflösen der beiden Rohprodukte in einer 2 M Natriumchlorid-Lösung zu einer Konzentration dieser Lösung zwischen 3 Gew.-% und 7 Gew.-%, Filtration und anschließender Wiederausfällung der reinen Produkte durch Zusatz von Methanol in einem volumetrischen Verhältnis zwischen 0,8 : 2 und 1,2 : 2 in Bezug zur Lösung.
Diese und weitere Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens und der durch dieses erhaltenen Produkte werden durch die nachfolgend gegebene ausführliche Beschreibung deutlicher, welche bevorzugte Methoden zur Durchführung des Verfahrene sowie pharmakologische Untersuchungen betrifft.
Das Verfahren besteht aus zwei Arbeitszyklen: In einem ersten Zyklus, welcher mit dem Ausgangsmaterial beginnt, wird ein Rohprodukt hergestellt, welches aus einer Mischung von Mucopolysacchariden besteht; im zweiten Zyklus wird diese Mischung fraktioniert und die einzelnen Mucopolysaccharide werden gereinigt.
Das in dem Verfahren verwendete Ausgangsmaterial besteht aus Geweben von Schweinen, welches Aorten, Myocard und besonders vaskularisierte Organe enthält, die fein mikronisiert sind.
Getrennt davon wird eine Lösung von 0,5 Gew.-% bis 2 Gew.-% Natriumacetat, von 0,5 Gew.-% bis 1 Gew.-% des EDTA-Na- Salzes und von 20 Gew.-% bis 35 Gew.-% Harnstoff in demineralisiertem Wasser hergestellt, in welcher das mikronisierte Produkt suspendiert wird, und zwar in einem Gewichtsverhältnis der Lösung zu dem mikronisierten Produkt von 2 bis 4.
Die erhaltene Suspension wird bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 15 bis 50 Stunden gerührt, um die Extraktion der Proteoglycane zu bewirken.
Alternativ können Guanidin, Thioharnstoff und Kaliumthiocyanat anstelle von Harnstoff verwendet werden.
Die obige Suspension wird durch einen Drehfilter filtriert, wobei eine opaleszierende Flüssigkeit erhalten wird, welche einer Ultrafiltration durch tubulare Membranen unterworfen wird, um den Harnstoff teilweise zu entfernen.
Die Lösung wird wiederholt mit demineralisiertem Wasser gewaschen und ultrafiltriert, bis der Harnstoffgehalt kleiner als 5 Gew.-% ist. Danach wird die Flüssigkeit mit einer Natriumchlorid-Lösung mit einer Konzentration zwischen 8,7 Gew.-% und 14,5 Gew.-% behandelt und zwar in einer solchen Menge, daß eine Endkonzentration an NaCl zwischen 1,5 und 2,5 M erhalten wird. Diese Behandlung, deren Zweck die Spaltung der Bindung zwischen den Mucopolysacchariden und den Proteinen ist, wird unter Rühren bei Raumtemperatur während einer Zeit zwischen 5 und 15 Stunden durchgeführt.
Die Proteine werden durch Zusatz von Trichloressigsäure mit einer Konzentration zwischen 3 Gew.-% und 6 Gew.-% ausgefällt und dann durch Filtration mit einer Filterpresse abgetrennt.
Die Nukleinsäure-Spuren werden dann durch Behandlung mit Aktiverden in einer Menge zwischen 2 Gew.-% und 5 Gew.-% in Bezug auf die Lösung entfernt, und zwar bei einem pH-Wert zwischen 3 und 4 unter Rühren und bei Umgebungstemperatur während 2 Stunden.
Die Feststoffe werden durch Filtration mit einer Filterpresse abgetrennt, der pH-Wert durch Zugabe einer NaOH- Lösung zwischen 5 und 6 eingestellt und dann die Mucopolysaccharide durch Zusatz von Alkoholen oder Ketonen wie beispielsweise Methanol, Ethanol oder Aceton in einem volumetrischen Verhältnis zwischen 0,8 : 1 und 1,2:1 in Bezug auf die Lösung ausgefällt.
Nach der Filtration besteht das erhaltene Rohprodukt aus Mucopolysacchariden, welche bezogen auf das trockene Produkt folgende durchschnittliche Zusammensetzung aufweisen:
Chondroitinsulfat-A 15 Gew.-%
Dermatansulfat 20 Gew.-%
Heparansulfat 65 Gew.-%
Die Fraktionierung des Rohprodukts und die Reinigung der einzelnen Mucopolysaccaride wird durch die folgenden Arbeitsschritte erreicht.
Das Rohprodukt wird in einer solchen Menge demineralisierten Wassers gelöst, daß eine Lösung zwischen 1 Gew.-% und 3 Gew.-% erhalten wird und die so erhaltene Lösung wird mit kationischen Harzen behandelt und dann durch Zusatz von Calciumhydroxid neutralisiert. Zur fraktionierten Fällung der einzelnen Mucopolysaccaride wird Aceton in folgender Weise hinzugefügt: Bei einer Aceton- Konzentration von 30 Vol-% fällt das Dermatansulfat aus und wird durch Filtration abgetrennt; bei weiterer Erhöhung der Aceton-Konzentration in der Lösung auf 50 Vol-% fällt Heparansulfat aus.
Die beiden Niederschläge werden getrennt voneinander in einer 2 M Natriumchlorid-Lösung in einer solchen Menge gelöst, daß eine Konzentration zwischen 3 Gew.-% und 7 Gew.-% in dieser Lösung vorliegt.
Die erhaltenen Lösungen werden durch Filtration geklärt und die jeweiligen Mucopoysaccaride durch Methanol in einem volumetrischen Verhältnis von 0,8 : 2 in Bezug auf die Lösung ausgefällt.
Die erhaltenen Produkte werden abschließend gefriergetrocknet.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Produkte weisen die folgenden Eigenschaften auf:

Heparansulfat

- Molekulargewicht: Innerhalb eines Bereiches von 5000-30 000 Dalton (bestimmt durch Gelfiltration gegen einen Mucopolysaccharid-Standard);
- Grad der Sulfatation: Mittelwert: 1,2 SO&sub4;²-/Hexosamin (bestimmt durch Gravimetrie);
- Grad der Iduronation: 30-40% (berechnet durch das Carbazol/Orcinol-Verhältnis);
- Elektrophorese: Einzelbande mit Rf 1,90-1,96 cm. Methode nach Cappelletti et al. Analyt. Biochem (1979) 99, 311 - Laufzeiten: 1. Lauf = 3 min, 2. Lauf = 15 min, 3. Lauf = 20 min.

Dermatan Sulfat

- Molekulargewicht: Innerhalb eines Bereiches von 20 000 bis 45 000 Dalton (bestimmt durch Gelfiltration gegen einen Mucopolysaccharid-Standard);
- Grad der Sulfatation: 1,1-1,2 SO&sub4;²-/Hexosamin (gravimetrisch bestimmt;)
- Grad der Iduronation: 45-65% (berechnet durch das Carbazol/Orcinol-Verhältnis);
- Elektrophorese: Einzelbande mit Rf 2,15-2,2 cm. Methode nach Cappelletti et al. Analyt. Biochem (1979), 99, 311. Laufzeiten: 1. Lauf = 3 min, 2. Lauf = 15 min, 3. Lauf = 20 min.
Diese Produkte wurden entweder oral oder parenteral solchen Personen verabreicht, welche von thrombogenen Erscheinungen befallen waren und zeigten die folgenden wichtigen pharmakodynamischen Wirkungen:

Heparansulfat

- Fehlen antikoagulierender Wirkungen (Hepato-Quick; PTTA);
- geringe Wirkung auf den Faktor Xa
- induziert die Aktivierung auf Antithrombin-III;
- bewirkt signifikante fibrinolytische Effekte (Lysis von Euglobulin unter normalen Bedingungen und nach venöser Stasis).

Dermatansulfat

- geringe antikoagulierende Wirkung (Hepato-Quick; PTTA);
- inhibierende Wirkung auf Faktor Xa;
- induziert ein Absinken der Antithrombin-III-Plasmaspiegel;
- signifikante fibrinolytische Wirkung;
- besitzt die Fähigkeit der Aktivierung und Potenzierung der fibrinolytischen Effekte des Heparansulfats.

Pharmakologische Untersuchungen

Das pharmako-logische Profil des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Heparansulfats und Dermatansulfats und die pharmakologische Wechselwirkung zwischen diesen beiden Substanzen wurde in vivo an freiwilligen Patienten beiderlei Geschlechts mit in einem Alter zwischen 45 und 70 Jahren ermittelt, welche an thrombogenen Erkrankungen venöser Natur (Thrombophlebitis, Varicophlebitis etc.) und arterieller Natur (Microangiopathie) litten.
Die Produkte wurden sowohl oral als auch parenteral in einer Einzeldosis in unterschiedlichen Dosierungsmengen verabreicht, und die Wechselwirkungen mit den koagulativen und fibrinolytischen Prozessen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt.
Nachdem festgestellt wurde, daß die Produkte nach der parenteralen und oralen Administration das qualitativ gleiche dosisabhängige pharmakologische Profil aufwiesen, werden nachfolgend die Daten aufgeführt, welche nach Verabreichung der höchsten getesteten intramuskularen Dosis erhalten wurden und welche die beste Charakterisierung der Wirkungen der einzelnen Komponenten oder ihres Assoziates auf die koagulativen und fibrinolytischen Prozesse erlaubt.
Die Untersuchungen wurden unter Verwendung der einzelnen Produkte, nämlich Heparansulfat und Dermatansulfat und unter Verwendung eines Assoziats aus gleichen Gewichtsanteilen von Heparansulfat und Dermatansulfat durchgeführt.
Das Assoziat aus gleichen Gewichtsmengen von Heparansulfat und Dermatansulfat wurde deshalb ausgewählt, da vorhergehende Tests gezeigt haben, daß dieses die positiven Wechselwirkungen der beiden Substanzen miteinander am besten hervorbringen (komplementäre Wirkungen auf die Koagulation und die Aktivierung des fibrinolytischen Effekts von Heparansulfat durch Dermatansulfat).
Die näheren Angaben zur Verabreichung und die daraus erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt: Tabelle 1 Vergleich der Wirkungen von Heparansulfat (HS), Dermatansulfat (DS) und deren Assoziat (HS + DS 1 : 1 Gewichtsverhältnis) auf die Hepato-Quick-Zeit (E-QT), auf die partielle Thromboplastin-Aktivierungszeit (PTTA) und auf die Thrombinzeit (TT). Produkt Art der Verabreichung Dosis mg max. Variation (*) in Bezug auf den Basis-Wert
Werte in Klammern geben die Zeit in Stunden wieder, nach der die maximale Wirkung nach Verabreichung eintritt. (*), (+) Erhöhung (-) Verringerung Tabelle 2 Vergleich der Wirkungen von Heparansulfat (HS), Dermatansulfat (DS) und deren Assoziat (HS + DS, 1:1 Gewichtsverhältnis) auf den Faktor Xa und auf Antithrombin-III (AT III). Produkt Art der Verabreichung Dosis mg max. Variation (*) in Bezug auf den Basis-Wert
Werte in Klammern geben die Zeit in Stunden wieder, nach der die maximale Wirkung nach Verabreichung eintritt. (*), (+) Erhöhung (-) Verringerung Tabelle 3 Vergleich der Wirkungen von Heparansulfat (HS), Dermatansulfat (DS) und deren Assoziat (HS+DS, 1 : 1 Gewichtsverhältnis) auf den Plasmagehalt an Fibrinogen (FB), α&sub2;-Antiplasmin (α&sub2;-AP) und Plasminogen (PA) Produkt Art der Verabreichung Dosis mg max. Variation (*) in Bezug auf den Basis-Wert
Werte in Klammern geben die Zeit in Stunden wieder, nach der die maximale Wirkung nach Verabreichung eintritt. (*), (+) Erhöhung (-) Verringerung Tabelle 4 Vergleich der Wirkungen von Heparansulfat (HS), Dermatansulfat (DS) und deren Assoziat (HS+DS, 1 : 1 Gewichtsverhältnis) auf die Euglobulin-Lyse-Zeit (ELT) und auf die Euglobulin-Lyse-Zeit nach der venösen Stasis (ELTSTAS) Produkt Art der Verabreichung Dosis mg max. Variation (*) in Bezug auf den Basis-Wert
Werte in Klammern geben die Zeit in Stunden wieder, nach der die maximale Wirkung nach Verabreichung eintritt. (*), (+) Erhöhung (-) Verringerung
Die vorstehenden Daten zeigen, daß reines Heparansulfat und Dermatansulfat, welches nach den erfindungsgemäßen Verfahren unter Vermeidung von drastischen Bedingungen und somit die natürliche Struktur der beiden Polysaccharide erhaltend, die folgenden pharmakologischen Eigenschaften aufweisen:
a) weder Heparansulfat noch Dermatansulfat sind in der Lage, die Hepato-Quick-Zeit, die partielle Thromboplastin-Aktivierungszeit oder die Thrombin-Zeit signifikant zu verändern. Das Assoziat der beiden Verbindungen verhält sich in gleicher Weise (Tabelle 1);
b) Dermatansulfat übt eine signifikante Faktor-Xa-Inhibition aus; Heparansulfat zeigt keinen signifikanten Effekt; das Assoziat weist einen Inhibierungswert auf, der dem des reinen Dermatansulfats entspricht (Tabelle 2);
c) Die Dermatansulfatverabreichung reduziert den Plasma- Antitrombin III-Gehalt wesentlich; Heparansulfat erhöht diesen allerdings nur schwach; das Assoziat zeigt keine Wirkung (Tabelle 2);
d) Heparansulfat hat eine signifikante fibrinolytische Wirkung, diese ist jedoch gering im Falle von Dermatansulfat; das Assoziat zeigt eine starke Potenzierung der Wirkung und einen zeitlichen Verlauf, welcher die induzierte Aktivierung durch Dermatansulfat deutlich in Bezug auf den fibrinolytischen Effekt von Heparansulfat allein zeigt (Tabellen 3 und 4).
Es läßt sich daher feststellen, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenes Heparansulfat wesentliche fibrinolytische und Antithrombin-III-Wirkungseigenschaften zeigt, ohne mit den pharmakologischen Wirkungen von Dermatansulfat zu interferieren.
Letzteres wirkt hauptsächlich auf die Inhibierung des Faktors Xa (möglicherweise durch die Heparin-Cofaktor II- Aktivierung) ohne in signifikanter Weise die Koagulationszeit zu beeinflussen, während überraschenderweise die fibrinolytischen Wirkungen des Heparansulfats aktiviert werden.
Erste wiederholende Behandlungstests, sowohl oral mit Dosen zwischen 75 und 600 mg/Tag und intramuskulär mit Dosen zwischen 50 und 400 mg/Tag bestätigen die obigen Ergebnisse und zeigen insbesondere nicht nur das Fehlen von signifikanten Nebenwirkungen, sondern darüber hinaus das Vorhandensein der folgenden Wirkungen:
- im Falle der Dermatansulfatanwendung allein signifikante Ergebnisse in der Vorbeugung venöser Thrombosen;
- im Falle von Heparansulfat allein signifikante Ergebnisse in der Behandlung von venösen und arteriellen thrombogenen Formen;
- im Falle des Heparansulfat/Dermatansulfat-Assoziats, signifikante Ergebnisse in der Verhinderung und Behandlung von venösen und arteriellen thrombogenen Formen und von arteriosklerotischen Manifestationen.

Beispiel 1

1000 kg Aorta, Myocardgewebe und beachtlich vaskularisierte Organe von Säugetieren werden fein mikronisiert und 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperaturen mit einer aus 2000 Litern demineralisiertem Wasser, 20 kg Natriumacetat, 10 kg EDTA-Natrium-Salz und 700 kg Harnstoff hergestellten Lösung behandelt.
Die Mischung wird durch einen Drehfilter filtriert, die klare Lösung durch tubulare Membranen ultrafiltriert und auf 200 Liter konzentriert.
Die Lösung wird dann mit 200 Liter demineralisiertem Wasser verdünnt, ultrafiltriert und auf 200 Liter konzentriert. Die Verdünnung mit demineralisiertem Wasser, Ultrafiltration und Konzentration wird weitere zwei Male wiederholt bis eine Lösung mit einem Harnstoffgehalt von weniger als 5 Gew.-% erhalten wird. Natriumchlorid wird in einer solchen Menge hinzugefügt, daß eine Konzentration von 2 M erhalten wird, und die Mischung wird unter Rühren 8 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten. 40 Liter einer 20 Gew.-%igen Trichloressigsäure-Lösung werden hinzugefügt und die ausfallenden Proteine mittels einer Filterpresse abfiltriert.
6 kg Aktiverde werden hinzugefügt, der pH-Wert auf 4 eingestellt und die Mischung unter Rühren 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gehalten und dann mittels einer Filterpresse filtriert.
Der pH-Wert der Lösung wird durch Zusatz von KOH auf 5,5 eingestellt und das gleiche Volumen von Methanol hinzugefügt, um 0,5 kg Mucopolysaccharid-Mischung auszufällen, welche folgende durchschnittliche Zusammensetzung hat:
Chondrointinsulfat A 13,5 Gew.-%
Dermatansulfat 22,0 Gew.-%
Heparansulfat 64,6 Gew.-%
Die Mischung wird in einer solchen Menge demineralisiertem Wasser gelöst, daß eine Lösung mit einer Konzentration vom 2 Gew.-% erhalten wird, welche mit kationischen Harzen behandelt und mit Calciumhydroxyd neutralisiert wird, worauf Aceton bis zu einer Konzentration von 30 Vol-% hinzugefügt wird.
Der so erhaltene Dermatansulfat-Niederschlag wird durch Dekantieren und Filtrieren gewonnen.
Weiteres Aceton wird der Flüssigkeit bis zu einer Konzentration von 50 Vol-% hinzugefügt, um Heparansulfat auszufällen, welches durch Dekantieren und Filtrieren gewonnen wird.
Die beiden Produkte werden getrennt in der folgenden Weise weiterbehandelt: Sie werden in einer solchen Menge einer 2 M Natriumchlorid-Lösung gelöst, daß jeweils eine 5 Gew.-%ige Lösung der beiden Produkte erhalten wird, die Lösungen werden filtriert, und die beiden Produkte durch Behandlung mit Methanol in einem Volumenverhältnis von 1 : 2 in Bezug auf die Lösung ausgefällt.
Die beiden Produkte werden abschließend gefriergetrocknet, und man erhält 240 g Heparansulfat und 150 g Dermatansulfat in gefriergetrockneter Form.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von natürlichem Heparansulfat und Dermatansulfat, welche nicht mit anderen Mucopolysaccharid-Familien verunreinigt sind, aus Mischungen von Proteoglycanen aus tierischen Organgeweben der Aorta, dem Myocard und von Gefäßen durchzogenen Organen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Extraktion der Proteoglycane aus dem Gewebe in fein mikronisierter Form durch Behandlung mit einer Lösung von demineralisiertem Wasser, welches zwischen 0,5 Gew.-% und 2 Gew.-% Natriumacetat, zwischen 0,5 Gew.-% und 1 Gew.-% EDTA-Na-Salz und zwischen 20 Gew.-% und 35 Gew.-% einer Verbindung aus der Gruppe von Harnstoff, Guanidin, Thioharnstoff und Kaliumthiocyanat/Harnstoff enthält in einem Gewichtsverhältnis der Lösung zum Gewebe, welches zwischen 2 und 4 beträgt, unter Rühren bei Raumtemperatur während einer Zeit zwischen 15 und 50 Stunden;

- Filtration und Klärung der Lösung und Elimination der für die vorstehende Behandlung verwendeten Substanzen durch wiederholte Verdünnung mit demineralisiertem Wasser und Konzentration mittels Ultrafiltration, wobei die Wiederholung so lange erfolgt, bis eine Lösung erhalten wird, welche einen Gehalt an besagter Komponente aufweist, der geringer als 5 Gew.-% ist;

- Spaltung der Bindung zwischen den Mucopolysacchariden und Proteinen durch Behandlung der Lösung des vorangehenden Schrittes mit einer Natriumchloridlösung mit einer Konzentration zwischen 8,7 Gew.-% und 14,5 Gew.-% in einer solchen Menge, daß schließlich eine NaCl-Konzentration zwischen 1,5 und 2,5 M erhalten wird bei Raumtemperatur während einer Zeit zwischen 5 und 15 Stunden;

- Ausfällung der Proteine durch Behandlung mit Trichloressigsäure einer Konzentration zwischen 3 Gew.-% und 6 Gew.-% und Filtration;

- Eliminierung der Nukleinsäure-Spuren durch Behandlung mit Aktiverden in einer Menge zwischen 2 Gew.-% und 5 Gew.-% bezogen auf die Lösung bei einem pH-Wert zwischen 3 und 4 unter Rühren bei Umgebungstemperatur für 2 Stunden;

- Ausfällung der Mucopolysaccaride durch Behandlung mit Alkoholen oder Ketonen, wie beispielsweise Methanol, Ethanol oder Aceton in einem volumetrischen Verhältnis zwischen 0,8 : 1 und 1,2 : 1 in Bezug auf die Lösung bei einem pH-Wert zwischen 5 und 6;

- Fraktionierung von Heparansulfat und Dermatansulfat durch Auflösen des Rohproduktes, welches in demineralisiertem Wasser mit einem Gehalt von 1 Gew.-% bis 3 Gew.-% vorliegt, Behandlung mit kationischen Harzen, Neutralisation mit Calciumhydroxyd und Durchführung einer fraktionellen Fällung durch Zugabe von Aceton, zuerst bis zu einer Konzentration von 30 Vol-% und Abtrennung des ausgefällten Dermatansulfats durch Filtration und dann durch weitere Zugabe von Aceton bis zu einer Konzentration von 50 Vol-% und Abtrennung des ausgefällten Heparansulfats;

- Reinigung des Heparansulfats und Dermatansulfats durch getrenntes Wiederauflösen der beiden Rohprodukte in einer 2 M Natriumchlorid-Lösung zu einer Konzentration dieser Lösung zwischen 3 Gew.-% und 7 Gew.-%, Filtration und anschließender Wiederausfällung der reinen Produkte durch Zusatz von Methanol in einem volumetrischen Verhältnis zwischen 0,8 : 2 und 1,2 : 2 in Bezug zur Lösung.

2. Assoziat aus gleichen Gewichtsteilen Heparansulfat und Dermatansulfat erhalten nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen für die Prophylaxe und Behandlung von thrombogenen, venösen, arteriellen und artherogenen Episoden.