DE69722450T2

DE69722450T2 - Halbsynthetische sulfatierte sulfoaminoheparosane mit hoher antimetastatischer wirkung und reduziertem hämorrhagischem risiko

Info

Publication number: DE69722450T2
Application number: DE69722450T
Authority: DE
Inventors: Annamaria Naggi; Giangiacomo Torri
Original assignee: Istituto Scient Di Chemica E B; ISTITUTO SCIENTIFICO DI CHEMICA E BIOCHEMICA "G RONZONI"
Current assignee: Istituto Scient Di Chemica E B; ISTITUTO SCIENTIFICO DI CHEMICA E BIOCHEMICA "G RONZONI"
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-08-28
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2017-08-29
Also published as: PL331798A1; EP0956027B1; AU715868B2; ITMI961840A1; DE69722450D1; IT1284143B1; JP2000517328A; CA2264929A1; NZ334566A; ATE241367T1; WO1998009636A1; EP0956027A1; AU4456197A; KR20000068468A; CA2264929C; RU2176915C2

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der sulfatierten Sulfoaminoheparosane zur Herstellung antimetastatischer Wirkstoffe.
Die Metastase ist ein Vorgang, der darin besteht, dass Krebszellen sich vom Ort des Primärkarzinoms lösen, sich über den Blutkreislauf ausbreiten, sich an den Gefäßwänden anlagern, in extravaskuläre Bereiche wandern und dort wuchern. Die genannten Erscheinungen, insbesondere die Anlagerung an Gefäßwände, werden anscheinend durch das endogene Polysaccharid Heparansulfat (HS) gesteuert. Einige Antikoagulanzien, darunter Heparin (HEP), das strukturelle Analogien mit Heparansulfat aufweist, sind als potenzielle antimetastatische Wirkstoffe getestet worden. (I. Vlodavsky et al.: „Modulation of neovascularization and metastasis by species of heparin", in: "Heparin and Related Polysaccharides" (D. A. Lane et al., Hrsg.), Plenum Press, New York 1992, 317–327). Unter den genannten Wirkstoffen ist Heparin als Antimetastatikum besonders aktiv, doch seine hohe antikoagulierende Aktivität geht mit der Gefahr von Blutungen einher, weshalb die Suche nach heparinartigen Substanzen mit geringerer antikoagulierender Aktivität von besonderem Interesse ist. (D. J. Tyrrell et al.: „Therapeutic uses of heparin beyond its traditional rote as an anticoagulant", TIPS 16, 198–204, 1995). So sind Glycoaminoglycan-Derivate, die ein Molekulargewicht von 10.000 bis 12.500 besitzen und über keine antikoagulierende Aktivität verfügen, bereits als Inhibitoren der Eindringungsfähigkeit von Tumoren oder der Metastasierung eingesetzt worden (W/O-A-8801280). Diese Derivate werden durch chemische Modifikation von Heparin hergestellt, und zwar durch partielle N-Desulfatierung und N-Acetylierung oder durch partielle N,O-Desulfatierung und nachfolgende N-Resulfatierung.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung basiert auf der Tatsache, dass einige halbsynthetische Heparansulfate aus der Klasse der sulfatierten Sulfoaminoheparosane (SAHS) (B. Casu et al.: „Heparin-like compounds prepared by chemical modification of capsular polysaccharide from E. coli K5", Carbohdr. Res. 263, 271–284 (1994)) überraschenderweise „in vivo" eine antimetastatische Aktivität aufweisen, die mit derjenigen von Heparin vergleichbar ist, obwohl ihre antikoagulierende Aktivität „in vivo" um eine Größenordung niedriger ist als die von Heparin.
Genauer gesagt hat sich herausgestellt, dass nur die SAHS, die aus dem von Escherichia coli K5 produzierten Polysaccharid durch Entacetylierung und nachfolgende Sulfatierung mit dem Schwefeltrioxid/Trimethylamin-Addukt bei einer Temperatur von 0°C, einer Reaktionszeit von 0,25 bis 2 Stunden und einem Verhältnis Reaktant/Polysaccharid (SO₃-Äquivalente/verfügbare OH-Gruppen-Äquivalente) von 5 (mit der Bezeichnung SAHS-B) erhalten werden und ein Molekulargewicht von 5.000 bis 40.000 besitzen, eine antimetastatische Aktivität aufweisen, die mit derjenigen eines typischen Heparins vergleichbar ist, während die antimetastatische Aktivität von SAHS, die unter anderen experimentellen Bedingungen erzeugt wurden, deutlich unter derjenigen von Heparin oder SAHS-B liegt.
Es wird weiter auch gefunden, dass Fraktionen von SAHS-B mit einem Molekulargewicht unter 5.000 immer noch eine signifikante antimetastatische Aktivität besitzen (die auch höher ist als diejenige der entsprechenden Heparine mit niedrigem Molekulargewicht).
Daher haben die halbsynthetischen sulfatierten Heparosane SAHS-B die Eigenschaften von antimetastatischen Medikamenten mit einem verringerten Blutungsrisiko.
Für diesen Zweck werden die SAHS-B in geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert unter Verwendung konventioneller Methoden und Bindemittel. Solche Zusammensetzungen können zur Vorbeugung gegen Metastasen oder zu deren Behandlung in Dosierungen verabreicht werden, die offensichtlich von mehreren Faktoren abhängen, jedoch im Allgemeinen von 1 bis 1.000 mg SAHS-B einmal oder mehrmals täglich reichen.
Die SAHS wurden, wie früher beschrieben (B. Casu et al., 1994, loc. cit.; PCT/EP94/01660), aus dem Polysaccharid K5 erhalten, welches ein Bestandteil der Zellmembran von Escherichia coli des Stamms K5 ist. Insbesondere wurde das Polysaccharid K5 selektiv N-entacetyliert und N-sulfatiert und daraufhin O-sulfatiert, wie es zusammenfassend in dem folgenden Schema gezeigt wird.
Das Ergebnis sind SAHS der verschiedenen Typen SAHS-B, SAHS-C, SAHS-A.
Schema
Der erste Schritt besteht in der N-Entacetylierung durch Hydrazinolyse des Polysaccharids K5 (K5-PS). Das erhaltene Produkt (Heparosan, AH) wird mit dem Schwefeltrioxid/Trimethylamin-Addukt (TMA/SO₃) N-sulfatiert, wodurch Sulphaminoheparosan (SAH) entsteht. Die Zahlen neben den Pfeilen geben, in dieser Reihenfolge, die Reaktionstemperaturen (°C), die Verhältnisse Reaktant/Polysaccharid (SO₃-Äquivalente/verfügbare OH-Gruppen-Äquivalente) und die Reaktionszeiten (Stunden) an.
Die antimetastatische Aktivität von SAHS, Heparin und anderen als Referenzsubstanzen dienenden sulfatierten Polysacchariden wurde getestet unter Verwendung der Methode, bei der die Besiedelung der Lunge mit B16 Melanomzellen beobachtet wird.
(N. Casella et al., Thromb. Haem. 73, 964 (1995)). Solch eine Methode, die sich insbesondere eignet, um die Wirkung von Medikamenten mit inhibitorischer Aktivität auf die Krebsausbreitung über das Blut zu testen, besteht darin, die Anzahl der Krebskolonien auszuwerten, die sich in der Lunge nach der intravenösen Injektion an Mäusen von Melanomzellen aus Mäusen bilden. Es wurden B16 Melanomzellen verwendet. Die Zellen wurden in einem CO₂-Inkubator (5%) unter feuchten Bedingungen und bei einer Temperatur von 37 °C in DME-Medium kultiviert, das 10% fötales Rinderserum enthielt. Die Zellen wurden zweimal pro Woche geteilt und mit 0,25% Trypsin/0,05% EDTA behandelt. Die zu testenden Polysaccharide wurden in einer physiologischen Lösung oder in einem Phosphat-Puffer (PBS) mit geeigneter Verdünnung gelöst und sofort eingesetzt. B16 Melanomzellen, die in PBS verdünnt wurden (10⁵ Zellen/0,1 ml/Maus), wurden in eine Seitenvene des Schwanzes von C57B16-Mäusen mit einem durchschnittlichen Gewicht von 20 g injiziert, wobei das Endvolumen 0,2 ml/Maus betrug. Die Mäuse wurden 12–16 Tage nach der Injektion der Krebszellen getötet; die Lungen wurden entnommen und in einer Buoin-Lösung fixiert, um die an der Oberfläche befindlichen metastatischen Knötchen zu zählen, die sich als schwarze Masse von einem gelben Grund abheben. Danach wurde das Verhältnis zwischen der Anzahl an Lungenknötchen bei den behandelten Mäusen und den Kontrolltieren abgeschätzt. Jedes Experiment wurde an wenigstens fünf Mäusen, häufiger jedoch an 8–10 Mäusen durchgeführt. Die in mehreren Experimenten festgestellten prozentualen Werte der Metastaseninhibition werden in den einzelnen Beispielen und in Tabelle 1 angegeben.
BEISPIEL 1
Herstellung und antimetastatische Aktivität von SAHS der Typen A, B und C.
Die Standardverfahren zur Herstellung einiger sulfatierter Sulfoaminoheparosane mit unterschiedlicher antimetastatischer Aktivität werden nachfolgend beschrieben. Die Produkte wurden hinsichtlich des mittleren Molekulargewichts (durch Gelfiltration), des Sulfatierungsgrads (ausgedrückt durch das molare Verhältnis Sulfat-/Carboxylgruppen, bestimmt mittels Konduktometrie) und der Verteilung der Sulfatgruppen (bestimmt mittels ¹H- und ¹³C-NMR-Spektrometrie) charakterisiert, wie es in Casu et al., 1994 (loc. cit.) beschrieben ist.
Die weiter unten beschriebenen Verfahren ergeben SAHS mit einem N-Sulfatierungsgrad von ungefähr 100% und einem 6-O-Sulfatierungsgrad von wenigsten 25%.
Das als Ausgangssubstanz dienende Polysaccharid K5 lässt sich in geeigneter Weise zubereiten, wie es in der italienischen Patentanmeldung MI91A000659 beschrieben ist.
Die Mengenangaben in Klammern sind Richtwerte.
1a) N-Entacetylierung
Das Polysaccharid K5 (100 mg) und Hydrazinsulfat (138 mg) werden in wasserfreiem Hydrazin (1,38 mg) gelöst und in einem geschlossenen Rohr unter Stickstoffatmosphäre 5 Stunden lang auf einer Temperatur von 96 °C gehalten. Die Lösung wird in einem Rotavapor getrocknet, das Reaktionsprodukt wird in destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert dann mit 37% HCl auf 4 eingestellt. Der pH-Wert wird mit 2 N NaOH auf 9 eingestellt, darauf wird das vierfache Volumen an mit Natriumacetat gesättigtem Ethanol zugesetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abgefiltert, in destilliertem Wasser gelöst und die Lösung 3 Tage lang gegen destilliertes Wasser dialysiert (3 × 2 l pro Tag; Cutoff bei 14.000 D) und schließlich gefriergetrocknet.
1b) N-Sulfatierung
Das gemäß 1a) erhaltene Polysaccharid (100 mg) wird in destilliertem Wasser gelöst, der pH-Wert der Lösung wird durch Zusatz von Natriumhydrogencarbonat auf 9 eingestellt und die Temperatur auf 55°C erhöht. Bei dieser Temperatur werden unter ständigem Rühren der Mischung 100 mg Schwefeltrioxid/Trimethylamin-Addukt (TMA/SO₃) zugesetzt. Nach 4 Stunden wird das Addukt in gleichen Mengen zugesetzt, und man lässt die Reaktion insgesamt 24 Stunden lang ablaufen. Die Gewinnung des N-sulfatierten Polysaccharids erfolgt wie vorstehend beschrieben.
1c) O-Sulfatierung
Das gemäß 1b) erhaltene Polysaccharid (100 mg) wird in destilliertem Wasser (20 ml) gelöst und die Lösung dann bei Raumtemperatur durch eine mit Amberlite IR-120 H⁺ gefüllte Säule geleitet. Die Säule wird mit weiteren 20 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Eluate werden gesammelt und mit 10% Tributylamin in Ethanol (Gewicht/Volumen) (3 ml) auf einen pH-Wert von 5,5 gebracht. Das überschüssige Tributylamin wird mit Diethylether (40 ml) entfernt, dann wird die Lösung gefriergetrocknet.
Das auf diese Weise erhaltene Produkt (188,2 mg) wird in wasserfreiem Dimethylformamid (33 ml) gelöst, das in 15 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöste Pyridin/Schwefeltrioxid-Addukt (Py/SO₃, Stoffmengen s. u.) wird zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird über unten angegebene Zeiten auf ebenfalls unten angegebenen Temperaturen gehalten. Um verschiedene Typen von SAHS zu erhalten, wurden unterschiedliche Reaktionstemperaturen, Mengen an Schwefeladdukt und Reaktionszeiten gewählt. Insbesondere wurde SAHS des Typs A bei 0°C unter Verwendung von 460 mg Pyridin/SO₃ in einer Reaktionszeit von 1 Stunde erhalten. Das Produkt (G1524-3; mittleres Molekulargewicht 11.700; Molverhältnis Sulfat-/Carboxylgruppen 1,8) wies eine antimetastatische Aktivität auf, die eine Metastaseninhibition von 17,5% entspricht, bei einer Dosis von 0,5 mg/Maus; im selben Test zeigte das Referenzheparin eine Inhibition von 97,5%, und für Heparansulfat aus der Bauchspeicheldrüse eines Schweins ergab sich 54,8%.
SAHS des Typs B wurde bei 0°C unter Verwendung von 765 mg des Schwefeladdukts in einer Reaktionszeit von 0,25–2 Stunden (vorzugsweise 1 Stunde) erhalten, wobei das Produkt wieder der in 1b) beschriebenen N-Sulfatierung unterzogen wurde. Ein typisches Endprodukt (G1669; mittleres Molekulargewicht 25.700; Molverhältnis Sulfat-/Carboxylgruppen 2,2) wies eine antimetastatische Aktivität (0,5 mg/Maus) auf, die einer Metastaseninhibition von 92,7% entspricht.
SAHS des Typs C wurde bei 25°C unter Verwendung von 7.650 mg des Schwefeladdukts in einer Reaktionszeit von 1 Stunde erhalten. Das Produkt (G1524/3; mittleres Molekulargewicht 10.800; Molverhältnis Sulfat/Carboxylgruppen 2,8) wies eine antimetastatische Aktivität (0,5 mg/Maus) auf, die einer Metastaseninhibition von 8,8% entspricht.
BEISPIEL 2
Antimetastatische Aktivität von SAHS des Typs B.
Die Tests der antimetastatischen Aktivität wurden für das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte SAHS-B (Produkt G1669) für drei Dosierungen (0,5; 0,2 und 0,1 mg/Maus) wiederholt. Die Entsprechenden Werte für die Metastaseninhibition betrugen 78,5%, 62,5% und 20,5%; für dieselben Dosierungen wies das Referenzheparin Inhibitionswerte von 95,5%, 91,3% und 80,3% auf.
BEISPIEL 3
Antimetastatische Aktivität von SAHS des Typs B.
Der Test der antimetastatischen Aktivität wurden für das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte SAHS-B (Produkt G1669) für die Dosierung 0,5 mg/Maus wiederholt, wobei sich eine Metastaseninhibition von 98,5% ergab. (Bei derselben Dosierung ergab das Referenzheparin eine Inhibition von 98,5% und ein „supersulfatiertes" Heparin mit niedrigem Molekulargewicht eine Inhibition von 91,0%.
BEISPIEL 4
Herstellung und antimetastatische Aktivität von Fraktionen von SAHS des Typs B mit unterschiedlichem Molekulargewicht.
Eine Probe von SHAS des Typs B (Präparat G1668, im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten) wurde mittels Sephadex Gelchromatographie fraktioniert, und es wurden drei Fraktionen isoliert, die durch vergleichbare Verhältnisse Sulfat-/Carboxylgruppen (2,2–2,3) und unterschiedliche Molekulargewichte gekennzeichnet waren: G1668a (mittleres Molekulargewicht 38.200), G1668c1 (22.700) und G1668b1 (3.200). Für die drei Fraktionen (0,5 mg/Maus) ergaben sich vergleichbare Werte der metastatischen Aktivität (Inhibition 97–98%), die auch mit derjenigen eines anderen, nicht fraktionierten wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten SAHS-B-Präparats (G1783) vergleichbar waren. In derselben Versuchsreihe wies das Referenzheparin eine Inhibition von 95–97% auf.
BEISPIEL 5
Antimetastatische Aktivität von SAHS-B mit niedrigem Molekulargewicht.
Vergleich mit anderen natürlichen und supersulfatierten Glycoaminoglycanen. Die Fraktion G1668b1, die ein niedriges Molekulargewicht besitzt (hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben), wies eine antimetastatische Aktivität auf, die einer Metastaseninhibition von 83,6% entspricht. Im selben Test wies das Referenzheparin eine Inhibition von 92,8% auf, ein „supersulfatiertes" Heparansulfat (ssLMWHS) eine Inhibition von 46,4% und 4,6-disufatiertes Dermatansulfat (DS4, 6S) eine Inhibition von 65,32%.
BEISPIEL 6
Antimetastatische Aktivität von SAHS-B.
Ein SAHS-B-Präparat (Produkt G1668, im Wesentlichen erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben) wies eine antimetastatische Aktivität (0,5 mg/Maus) auf, die einer Metastaseninhibition von 98,5% entspricht. (Im selben Test ergab das Referenzheparin eine Inhibition von 98,5%).
BEISPIEL 7
Antimetastatische Aktivität einer niedrigen Dosis einer SAHS-B-Fraktion niedrigen Molekulargewichts.
Die in Beispiel 4 beschriebene Fraktion G1668c1 mit niedrigem Molekulargewicht wies bei der Dosis von 0,1 mg/Maus eine antimetastatische Aktivität auf, die einer Metastaseninhibition von 41,0% entspricht. (Bei derselben Dosierung ergab das nicht fraktionierte Referenzheparin eine Inhibition von 91,1%).
BEISPIEL 8
Antimetastatische Aktivität einer sehr niedrigen Dosis einer SAHS-B-Fraktion niedrigen Molekulargewichts.
Die in Beispiel 4 beschriebene Fraktion G1668c1 mit niedrigem Molekulargewicht wies bei der Dosis von 0,02 mg/Maus eine antimetastatische Aktivität auf, die einer Metastaseninhibition von 24,0% entspricht. (Bei derselben Dosierung ergab das Referenzheparin eine Metastaseninhibition von 30%)
BEISPIEL 9
Antikoagulierende Aktivität von SAHS-B.
Die antikoagulierende Aktivität des Produkts G1668 wurde als Prolongation des aPTT-Werts an der Maus bestimmt (intravenöse Injektion von 0,5 mg/Maus; Versuche an einer Gruppe von 4 Mäusen) und ergab 1, 2 und 4 Stunden nach der Injektion die Werte > 300 bzw. 44,4 bzw. 39,9. Die entsprechenden Werte für das Referenzheparin betrugen > 300, > 300 und 37,6. (Normaler Wert bei den Kontrolltieren: 28,5).
TABELLE 1 ANTIMETASTATISCHE AKTIVITÄT VON SULFATIERTEN SULFAMINOHEPAROSANEN (SAHS)

Claims

Verwendung von sulfatierten Sulfoaminoheparosanen mit einem Molekulargewicht zwischen 5.000 und 40.000, die erhalten werden aus dem von Escherichia coli K5 produzierten Polysaccharid durch Entacetylierung und nachfolgende Sulfatierung mit dem Schwefeltrioxid/Trimethylamin-Addukt bei einer Temperatur von 0°C, einer Reaktionszeit von 0,25 bis 2 Stunden und einem Verhältnis Reaktant/Polysaccharid (SO₃-Äquivalente/verfügbare OH-Gruppen-Äquivalente) von 5, zur Herstellung antimetastatischer Medikamente.
Verwendung der sulfatierten Sulfoaminoheparosane mit einem Molekulargewicht unter 5.000, die erhalten werden aus dem von Escherichia coli K5 produzierten Polysaccharid durch Entacetylierung und nachfolgende Sulfatierung mit dem Schwefeltrioxid/Trimethylamin-Addukt bei einer Temperatur von 0°C, einer Reaktionszeit von 0,25 bis 2 Stunden und einem Verhältnis Reaktant/Polysaccharid (SO₃-Äquivalente/verfügbare OH-Gruppen-Äquivalente) von 5 sowie durch die nachfolgende Fraktionierung durch Gelchromatographie an Sephadex, zur Herstellung antimetastatischer Medikamente.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 1 und 2, wobei die sulfatierten Sulfoaminoheparosane einen Sulfatierungsgrad besitzen, der gleich dem von Heparin 1 ist (Molverhältnis Sulfat/Carboxyl ungefähr gleich 2,2).