DE970763C - Process for the preparation of a dextran sulfate suitable for therapeutic purposes - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung eines für therapeutische Zwecke geeigneten Dextransulfates Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß die Aktivität natürlicher gerinnungshemmender Stoffe, wie z. B. des Heparins, bei der therapeutischen Verwendung auf der Gegenwart einer teilweise veresterten Schwefelsäuregruppe beruht und daß die sauren Schwefelsäureester von Kohlenhydraten, wie z. B. Dextran, Cellulose, Chondroitin und Mucoitin, eine ähnliche Aktivität zeigen. Obwohl diese Verbindungen die Gerinnung von Blut oder Blutplasma wirkungsvoll verhindern, sind sie doch mehr oder weniger giftig und daher nicht zur klinischen Verwendung geeignet. Neuere Forschungsarbeiten haben jedoch gezeigt, daß auch ein ungiftiges Dextransulfat hergestellt werden kann. Process for the preparation of a suitable for therapeutic purposes Dextran sulfates It has been known for some time that the activity of natural anticoagulant Substances such as B. heparin, in the therapeutic use on the present a partially esterified sulfuric acid group and that the acidic sulfuric acid ester of carbohydrates such as B. dextran, cellulose, chondroitin and mucoitin, one show similar activity. Although these compounds cause clotting of blood or Effectively prevent blood plasma as they are more or less toxic and therefore not suitable for clinical use. More recent research, however, has has shown that a non-toxic dextran sulfate can also be produced.

Das dabei verwendete Verfahren umfaßt die selektive Entfernung der größeren Moleküle des Dextrans, die in dem nach der Hydrolyse von Dextran hohen Molekulargewichtes erhaltenen Gemisch vorhanden sind, sowie die anschließende Veresterung der verbleibenden Moleküle von geringerem Molekulargewicht mit einem Sulfatierungsmittel zwecks Bildung eines Schwefel- säureesters. Die Eigenviskosität des Dextrans hängt von der Größe der Moleküle ab und ist daher ein zweckmäßiger Maßstab für diese. Die Viskosität wird darum auch im allgemeinen dazu benutzt, die Molekülgröße des Dextrans zu bestimmen. Die in der Beschreibung angegebenen Zahlen für die Viskosität wurden durch Messung bei 37° C in o,g0/,iger Kochsalzlösung unter Verwendung eines B. B. S.-(British-Standard-Specifikation-)Viskosimeters Nr. I erhalten. Bei den bisher verwendeten Verfahren beläuft sich die Eigenviskosität des Dextrans nach Entfernung der größeren Moleküle auf weniger als 0,12.The method used involves the selective removal of the larger molecules of dextran that are high in that after hydrolysis of dextran Molecular weight obtained mixture are present, as well as the subsequent esterification the remaining lower molecular weight molecules with a sulfating agent for the purpose of forming a sulfur acid esters. The inherent viscosity of dextran depends on the size of the molecules and is therefore an expedient one Benchmark for this. The viscosity is therefore also generally used to reduce the To determine the molecular size of the dextran. The numbers given in the description for the viscosity were measured at 37 ° C in o.g0 /, iger saline solution under Using a B.B.S. (British Standard Specification) Viscometer No. I obtained. In the processes used so far, the inherent viscosity of the dextran is after removal of the larger molecules to less than 0.12.

Es wurde nun gefunden, daß Dextransulfat selbst dann, wenn es eine Eigenviskosität von weniger als 0,I2 hat, dadurch verbessert werden kann, daß man es einer fraktionierten Fällung aus seiner Lösung unterwirft, um die großen Dextransulfatmoleküle, die durch die Veresterung großer DextranmoIeküle entstanden sind oder möglicherweise durch die Verbindung zweier Dextranmoleküle durch eine Sulfatbrücke gebildet wurden, zu entfernen, und hierbei die Fraktion mit einer Eigenviskosität von etwa 0,035 oder darunter isoliert. Aus dieser Fraktion sind die großen Moleküle so weit entfernt, daß in der klinischen Praxis größere Dosen als bisher auf längere Zeit mit größerer Sicherheit gegeben werden können. It has now been found that even if there is a Has inherent viscosity of less than 0.12, can be improved by subjects it to fractional precipitation from its solution in order to remove the large molecules of dextran sulfate, that may or may have arisen from the esterification of large dextran molecules formed by connecting two dextran molecules through a sulfate bridge, to remove, and here the fraction with an inherent viscosity of about 0.035 or isolated below. From this fraction the large molecules are so far removed that in clinical practice larger doses than before over a longer period of time with larger doses Security can be given.

Es ist selbstverständlich, daß die durch die fraktionierte Fällung erhaltenen Fraktionen nicht völlig homogen in bezug auf die Größe der Moleküle sind, denn es ist unmöglich, alle vorhandenen Moleküle irgendeiner bestimmter Größe völlig auszufällen. Je verdünnter indessen die anfängliche Lösung und je geringer die prozentuale Größe der erzeugten Fraktion ist, desto besser ist auch die Homogenität. It goes without saying that the fractionated precipitation the fractions obtained are not completely homogeneous with regard to the size of the molecules, for it is impossible to completely determine all existing molecules of any particular size to fail. However, the more dilute the initial solution and the lower the percentage The size of the fraction produced, the better the homogeneity.

Es ist zu beachten, daß das Dextransulfat stets in der Form eines Salzes, im allgemeinen des Natriumsalzes, verwendet wird, und wo hier auf das Sulfat Bezug genommen wird, handelt es sich um solch ein Salz. It should be noted that the dextran sulfate is always in the form of a Salt, generally the sodium salt, is used, and where here we refer to the sulfate Reference is made to such a salt.

Bei der Durchführung der Erfindung ist es nicht notwendig, die großen Dextranmoleküle vor der Veresterung zu entfernen, denn wenn diese in das Sulfat umgewandelt werden, werden sie später bei der erfindungsgemäß angewandten fraktionierten Ausfällung entfernt. Indessen ist es doch am besten, sie schon vorher zu entfernen, um eine Vergeudung von Dextran und der Reagenzien, welche zu seiner Umwandlung in das Sulfat verwendet werden, zu vermeiden. Die Sulfatierung wird gewöhnlich durch die Einwirkung von Chlorsulfonsäure auf Dextran in Gegenwart von Pyridin ausgeführt. Di blutgerinnungshemmende Wirkung von Dextransulfat hängt von dem Schwefelgehalt der. Verbindung ab. Für eine Verabfolgung in vivo muß der Schwefelgehalt höher als 9°/0 sein. Die Sulfatierung muß daher so weit durchgeführt werden, daß die Fraktion einen für die therapeutische Verwendung genügend hohen Schwefelgehalt hat. In practicing the invention it is not necessary to use the large Remove dextran molecules before esterification, because when this is in the sulfate are converted, they are later used in the fractionated according to the invention Precipitation removed. However, it is best to remove them beforehand, to avoid wasting dextran and the reagents which convert it to to avoid the sulfate used. The sulfation is usually done by the action of chlorosulfonic acid on dextran carried out in the presence of pyridine. The anticoagulant effects of dextran sulfate depend on the sulfur content the. Connection off. For in vivo administration, the sulfur content must be greater than Be 9 ° / 0. The sulfation must therefore be carried out so far that the fraction has a sufficiently high sulfur content for therapeutic use.

Die selektive Entfernung der großen Sulfatmoleküle kann am zweckmäßigsten durch fraktionierte Ausfällung aus einer wäßrigen Dextransulfatlösung mit Hilfe eines wassermischbaren oder teilweise wassermischbaren organischen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches, in dem das Dextransulfat nicht löslich ist, durchgeführt werden. Die fraktionierte Ausfällung erfolgt nach an sich bekannten Methoden. The selective removal of the large sulfate molecules may be most convenient by fractional precipitation from an aqueous dextran sulfate solution with the aid a water-miscible or partially water-miscible organic solvent or a solvent mixture in which the dextran sulfate is not soluble will. The fractional precipitation takes place according to methods known per se.

Wenn das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch allmählich zu einer neutralisierten oder schwach alkalischen, wäßrigen I,ösung von Dextransulfat hinzugesetzt wird, entsteht ein Niederschlag, der durch Filtrieren oder, wenn er harzig ist, durch Absitzenlassen entfernt werden kann. Das zuerst ausgefällte Sulfat besitzt eine höhere Viskosität als das später ausgefällte Sulfat, woraus sich ergibt, daß die größeren Moleküle zuerst ausgefällt werden. Mit zunehmender Konzentration des Lösungsmittels ist eine zunehmende Ausfällung der großen Dextransulfatmoleküle zu beobachten. Durch Hinzufügen einer geeigneten Menge an Lösungsmittel kann man also Moleküle jeder gewünschten Größe ausfällen und beseitigen. Bei weiterem Hinzufügen von Lösungsmitteln zu der nach Entfernung des Niederschlages verbleibenden Lösung wird weiteres Dextransulfat ausgefällt, welches als ungiftige, gerinnungshemmende Substanz verwendet werden kann.When the solvent or solvent mixture gradually becomes a neutralized or weakly alkaline, aqueous I, solution of dextran sulfate is added a precipitate is formed which, by filtration or, if it is resinous, can be removed by allowing it to sit down. The sulfate precipitated first has a higher viscosity than the later precipitated sulfate, from which it follows that the larger molecules are precipitated first. With increasing concentration of the Solvent is increasing precipitation of the large dextran sulfate molecules too watch. So by adding an appropriate amount of solvent you can Precipitate and eliminate molecules of any desired size. With further addition of solvents to the solution remaining after removal of the precipitate further dextran sulfate is precipitated, which is classified as a non-toxic, anticoagulant Substance can be used.

Wahlweise kann bei der Fraktionierung die mit der Temperatur abnehmende Löslichkeit des Sulfates ausgenutzt werden. Bei diesem Verfahren wird das Fällmittel der Lösung so lange hinzugesetzt, bis eine leichte Trübung auftritt. Das Gemisch wird erwärmt, um die Trübung wieder aufzulösen, und dann gekühlt, worauf sich ein Niederschlag bildet. Die Fraktionierung kann beliebig oft wiederholt werden. Optionally, the fractionation can reduce with the temperature Solubility of the sulfate can be exploited. In this process the precipitant is used added to the solution until a slight cloudiness appears. The mixture is heated to dissolve the cloudiness and then cooled, whereupon a Precipitation forms. The fractionation can be repeated as often as required.

Im allgemeinen ist Dextransulfat mit einer Eigenviskosität von weniger als 0,035 praktisch ungiftig. Generally, dextran sulfate has an inherent viscosity of less practically non-toxic as 0.035.

Andererseits hat Dextransulfat mit einer Eigenviskosität unter 0,OI praktisch keine gerinnungshemmende Wirkung, weshalb Fraktionen mit einer Eigenviskosität unter dieser Zahl vorzugsweise ebenfalls entfernt werden. Es werden daher bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zwei Ausfällvorgänge durchgeführt, nämlich einer, um die großen Moleküle zu entfernen und in der Lösung nur ein Dextransulfat mit einer Eigenviskosität von weniger als 0,035 zu belassen, und ein weiterer Ausfällvorgang, um das gewünschte Dextransulfat mit einer Eigenviskosität von mehr als 0,OI auszufällen.On the other hand, dextran sulfate has an inherent viscosity below 0. OI practically no anticoagulant effect, which is why fractions with an inherent viscosity below this number are preferably also removed. There will therefore be a preferred embodiment of the method carried out two precipitation processes, namely one to remove the large molecules and only one dextran sulfate in the solution to be left with an inherent viscosity of less than 0.035, and another precipitation process, in order to precipitate the desired dextran sulfate with an inherent viscosity of more than 0. OI.

Nachstehend folgen einige Beispiele für das erfindungsgemäße Verfahren der fraktionierten Ausfällung und die Ergebnisse einiger mit den erhaltenen Fraktionen vorgenommenen Versuche. Some examples of the method according to the invention follow below of fractionated precipitation and the results of some with the fractions obtained attempts made.

Beispiel I Zuerst wurde eine Io°/Oige Lösung rohen Dextrans in bekannter Weise durch saure Hydrolyse abgebaut, um die Größe der Moleküle herabzusetzen. Die Lösung mit einem pE-Wert von I,02 wurde bei 98° C erhitzt, bis eine relative Viskosität von I,62 erreicht war. EXAMPLE I First, a solution of crude dextran was prepared in a known manner Way degraded by acid hydrolysis to reduce the size of the molecules. the Solution with a pE value of 1.02 was heated at 98 ° C until a relative viscosity by I, 62 was reached.

Unter relativer Viskosität ist das Verhältnis der Viskosität dieser Io°/Oigen Lösung zu derjenigen von destilliertem Wasser bei 37° C zu verstehen. Nach dem Neutralisieren mit Kalk wurde die Lösung filtriert, und 260/, des Dextrans wurden durch Hinzufügen von Aceton ausgefällt. Weitere Ion!, Dextran erhielt man durch erneutes Hinzufügen von Aceton, und dieses Dextran war durch eine relative Viskosität von I,55 gekennzeichnet. Es wurde mittels Aceton entwässert und bei einer Temperatur von 500 C im Vakuum getrocknet, um als Ausgangsmaterial für die Erzeugung von Dextransulfat zu dienen.Relative viscosity is the ratio of viscosity to these Io ° / Oigen solution to understand that of distilled water at 37 ° C. After neutralizing with lime, the solution was filtered, and 260 /, of the dextran were precipitated by adding acetone. More ion !, dextran, was obtained by adding acetone again, and this dextran was by a relative viscosity marked by I, 55. It was dehydrated using acetone and dried at a temperature of 500 C in vacuo to be used as the starting material to serve for the production of dextran sulfate.

Zur Herstellung des Sulfats wurden 541 wasserfreien Pyridin in ein Reaktionsgefäß eingebracht und 7,04 ccm Chlorsulfonsäure unter Kühlen hinzugesetzt, wobei die Temperatur unter 20° C gehalten wurde. Dann wurde die Temperatur auf 60° C erhöht, und es wurden 4,8 g Dextran hinzugefügt. Die Temperatur wurde nun 4 Stunden auf 65 bis 70" C gehalten, worauf die Sulfatierung beendet war. Die viskose Flüssigkeit wurde in 180 1 Wasser von 200 C gegossen, und das Pyridinsalz des Dextransulfats wurde zusammen mit einer geringen Menge von Pyridinhydrochlorid und Pyridinsuliat durch Zusatz von 2 Volumina Aceton ausgefällt. Das Gemisch trennte sich in Schichten, wobei das Pyridinsalz des Dextransulfats die untere Schicht bildete. Diese Salzschicht wurde abgezogen und in 150 1 destillierten Wassers gelöst. For the preparation of the sulfate 541 anhydrous pyridine were in a Put in the reaction vessel and add 7.04 ccm of chlorosulfonic acid while cooling, keeping the temperature below 20 ° C. Then the temperature was raised to 60 ° C increased and 4.8 grams of dextran was added. The temperature was now 4 hours Maintained at 65 to 70 "C, whereupon the sulfation was finished. The viscous liquid was poured into 180 l of water at 200 C, and the pyridine salt of dextran sulfate was taken along with a small amount of pyridine hydrochloride and pyridine sulate precipitated by adding 2 volumes of acetone. The mixture separated into layers the pyridine salt of dextran sulfate forming the lower layer. This layer of salt was drawn off and dissolved in 150 l of distilled water.

Hierauf wurde Natriumhydroxyd hinzugefügt, bis ein pH-Wert von 8,o erreicht war. Sodium hydroxide was then added until a pH of 8.0 was reached was achieved.

Das entstandene Natriumsalz des Dextransulfates wurde darauf gereinigt. Es handelte sich um ein harziges Produkt, welches in 8o 1 Wasser gelöst und von dem größeren Teil anorganischer Verunreinigungen sowie von Pyridin befreit wurde, indem man die Lösung nacheinander durch Kationenaustausch-und Anionenaustauschharze leitete. Die Lösung wurde dann mit Natriumhydroxyd auf einen pE-Wert von 7,4 neutralisiert und auf 136,5 1 verdünnt. The resulting sodium salt of dextran sulfate was then purified. It was a resinous product which was dissolved in 8o 1 of water and removed from it the greater part of inorganic impurities and pyridine has been freed, by changing the solution successively through cation exchange and anion exchange resins directed. The solution was then neutralized to a pE value of 7.4 with sodium hydroxide and diluted to 136.5 liters.

Die gereinigte Lösung des Natriumsalzes von Dextransulfat verursachte, obwohl sie für die Verwendung als gerinnungshemmendes Mittel von geeigneter Potenz war, bei Meerschweinchen im Falle intravenöser Injektion heftige Reaktionen und führte auch zu einer leichten Ablagerung metachromatisch färbbarer Stoffe in Rattenlebern. Diese Sulfatlösung wurde sodann gemäß der Erfindung einer fraktionierten Ausfällung mit Aceton unterzogen. Zuerst wurde die Lösung mit 55 ] Aceton bei 20° C behandelt. The purified solution of the sodium salt of dextran sulfate caused although they are of suitable potency for use as an anticoagulant was violent reactions in guinea pigs in the case of intravenous injection and also led to a slight deposition of metachromatically stainable substances in rat livers. This sulfate solution was then subjected to fractional precipitation according to the invention subjected to acetone. First the solution was treated with 55] acetone at 20 ° C.

Es schied sich eine geringe Menge flockigen Materials aus, das durch Absitzenlassen entfernt wurde. Dann wurde noch mehr Aceton zugesetzt, und die ausgefällten Dextransulfatfraktionen wurden abgezogen, sobald die darüberschwimmende Flüssigkeit klar erschien. Es wurden fünf weitere Fraktionen auf diese Weise entfernt und ihre Viskosität gemessen.A small amount of fluffy material settled through Weaning has been removed. Then more acetone was added and the precipitated ones Dextran sulfate fractions were withdrawn as soon as the liquid above it appeared clear. Five more factions were removed in this way, and theirs Viscosity measured.

Lösungen dieser Fraktionen wurden Meerschweinchen intravenös eingespritzt. Die ersten beiden Fraktionen waren giftig; die nächsten drei Fraktionen waren hingegen ungiftig und besaßen eine gerinnungshemmende Wirkung von I2 Internationalen Einheiten je Milligramm, waren also zur Herstellung von Inj ektionspräparaten geeignet. Solutions of these fractions were injected intravenously into guinea pigs. The first two factions were poisonous; the next three factions were, however non-toxic and had an anticoagulant effect of I2 international units per milligram, so they were suitable for the production of injection preparations.

Nach Abtrennen der fünften Fraktion war die obenauf schwimmende Flüssigkeit und damit die sechste Fraktion durch Natriumsu]fat stark verunreinigt. After separating the fifth fraction, the liquid on top was floating and thus the sixth fraction is heavily contaminated by sodium sulfate.

Darüber hinaus hatten diese sechste Fraktion und das verbleibende Material eine gerinnungshemmende Wirkung von weniger als 10 Internationalen Einheiten je Milligramm und waren daher zur Verwendung als gerinnungshemmende Mittel nicht geeignet.In addition, this sixth faction and the remaining had Material an anticoagulant effect of less than 10 international units per milligram and therefore were not for use as anticoagulants suitable.

Einzelheiten der Versuchsergebnisse zeigt die Tabelle I. Details of the test results are shown in Table I.

Tabelle I Volumen Ausge- Giftig- des fälltes keit bei hinzu- Dextran Viskosität Meer 1. Em gesetzten sulfat schwein- I. E./mg Acetons chen Liter o/o 55 6,7 0,0362 + 3 6,7 0,0350 + - 5 7,9 0,0336 o 12 7 8,6 0,03Ig o I2 94 43,I o,o289 O 12 IOO (mit Natriumsulfat verunreinigt) Von dem ursprünglichen Dextransulfat wurden also 59,6 O/o in für therapeutische Zwecke geeigneter Form wiedergewonnen.Table I. Volume Exhausted Toxic this is due to the fact add- dextran viscosity sea 1. Em set sulphate pork- IU / mg Acetone Liter o / o 55 6.7 0.0362 + 3 6.7 0.0350 + - 5 7.9 0.0336 o 12 7 8.6 0.03 Ig o I2 94 43, I o, o289 O 12 IOO (contaminated with sodium sulfate) Thus 59.6% of the original dextran sulfate was recovered in a form suitable for therapeutic purposes.

Beispiel 2 Dieses Beispiel beschreibt die fraktionierte Ausfällung von Dextransulfat unter Ausnutzung der verringerten Löslichkeit des Materials bei sinkender Temperatur. Um zu veranschaulichen, daß ein für die Verabfolgung an Menschen geeignetes Dextransulfat aus einem nicht dafür geeigneten Dextransulfat hergestellt werden kann, wurde auch in diesem Beispiel eine Partie Dextransulfat, welches keine guten biologischen Eigenschaften besaß, verwendet. Bei einer Temperatur von 30° C wurde Äthylalkohol zu 77 ccm einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von I5,4 g des Natriumsalzes eines Schwefelsäureesters von fraktioniertem Dextran mit einer Eigenviskosität von 0,04 hinzugesetzt, bis eine Trübung eintrat; hierzu waren Io8 ccm Äthylalkohol erforderlich. Das Gemisch wurde erwärmt, bis es homogen wurde, was bei 33° C eintrat, und dann langsam wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt. Es wurde ein Sirup ausgeschieden; dieser wurde von der obenauf sdwimmenden Flüssigkeit abgetrennt und mit Äthylalkohol verrieben. Das so erhaltene Pulver bildete die erste Fraktion. Example 2 This example describes fractional precipitation of dextran sulfate, taking advantage of the reduced solubility of the material falling temperature. To illustrate that a for human administration suitable dextran sulfate made from an unsuitable dextran sulfate In this example, too, a batch of dextran sulfate, which does not contain any possessed good biological properties. At a temperature of 30 ° C became ethyl alcohol to 77 cc of an aqueous solution with a content of 15.4 g of the sodium salt of a sulfuric acid ester of fractionated dextran with a Inherent viscosity of 0.04 added until turbidity occurred; for this were Io8 cc of ethyl alcohol required. The mixture was heated until it became homogeneous, which occurred at 33 ° C, and then slowly cooled back to room temperature. It a syrup was excreted; this was caused by the liquid floating on top separated and triturated with ethyl alcohol. The powder thus obtained constituted the first Fraction.

Die obenauf schwimmende Flüssigkeit wurde wiederum auf eine Temperatur von 300 C gebracht und Äthylalkohol hinzugesetzt, bis eine Trübung eintrat. The liquid floating on top was again brought to a temperature brought from 300 C and added ethyl alcohol until a cloudiness occurred.

Dann wurde das Gemisch erwärmt, bis es homogen wurde, und wieder langsam abgekühlt. Der ausgefällte Sirup wurde abgetrennt und mit Äthylalkohol verrieben. Er bildete die zweite Fraktion, ebenfalls in Form eines Pulvers. Auf diese Weise erhielt man fünf weitere Fraktionen.The mixture was then heated until it became homogeneous and again slowly cooled down. The precipitated syrup was separated and triturated with ethyl alcohol. He formed the second fraction, also in the form of a powder. In this way five more fractions were obtained.

Durch Vermischen gleicher Volumina einer 1 0/0igen Lösung der einzelnen Fraktionen mit einer 1 0/0igen Lösung menschlichen Fibrinogens wurden die verschiedenen Fraktionen daraufhin untersucht, ob sie irgendwie menschliches Fibrinogen ausfällten. Gemische, welche eine größere Opaleszenz zeigten als ein Gemisch gleicher Volumina o,g °/Oigen Natriumchlorids und I°/Oigen menschlichen Fibrinogens, sind in der Tabelle II durch ein oder mehrere Pluszeichen gekennzeichnet, je nach dem Grade der Opaleszenz. By mixing equal volumes of a 1 0/0 solution of the individual Fractions with a 10/0 solution of human fibrinogen were the different Fractions examined to see if they somehow precipitated human fibrinogen. Mixtures which showed greater opalescence than a mixture of equal volumes 0.1% sodium chloride and 100% human fibrinogen are in the table II by one or more plus signs marked, depending on the Degree of opalescence.

Gemische, welche eine geringere Opaleszenz aufweisen, sind mit O bezeichnet.Mixtures which have a lower opalescence are denoted by O.

Lösungen der Fraktionen wurden außerdem Versuchstieren in einer Dosierung von 50 mg je Kilogramm Körpergewicht injiziert. Dort, wo die Injektion nach 24 Stunden in den Zellen der Leber, der Milz oder des Knochenmarks eine Ablagerung erzeugte, die mit Toluidinblau metachromatisch anfärbbar war, ist das Ergebnis durch ein Pluszeichen gekennzeichnet. Ein »O« bedeutet keinen färbbaren Niederschlag. Die verschiedenen Fraktionen wurden auch daraufhin untersucht, ob sie bei Meerschweinchen irgendwelche unerwünschten Reaktionen hervorriefen. Das Fehlen einer solchen Reaktion wird durch ein »O«, eine posi tive Reaktion durch ein Pluszeichen angedeutet. Solutions of the fractions also became test animals in one dose of 50 mg per kilogram of body weight is injected. There where the injection after 24 hours produced a deposit in the cells of the liver, spleen, or bone marrow which could be stained metachromatically with toluidine blue, the result is indicated by a plus sign marked. An "O" means no colorable precipitate. The different Fractions were also examined for any in guinea pigs caused undesirable reactions. The lack of such a response is indicated by an “O”, a positive reaction indicated by a plus sign.

Ebenso wurden die Fraktionen auf ihre gerinnungshemmende Wirkung untersucht, wobei die Ergebnisse in Internationalen Einheiten je Milligramm angegeben sind.The fractions were also examined for their anticoagulant effect, with results given in international units per milligram.

Tabelle II Ausge- fällter Eigen- Schwefel- Ausge- Färbbare Meer- Gerinnungs- Anteil viskosität gehalt fäiltes Ablagerung Reaktion % % Fibrinogen Ablagerung Reaktion Wirkung Ursprüngliches Salz - 0,044 I7,9 + + + I6,5 Fraktion I......... 1 14,69 0,070 19,4 +++ + + 20,7 Fraktion 2 ......... II,44 o,o58 I9,3 ++ + + 20,2 Fraktion 3 ......... 10,25 0,054 20,6 ++ + + 20,7 Fraktion 4 ......... II,23 0,044 19,4 ++ + 0 I7,7 Fraktion 5 ......... 15,44 0,035 I9,6 0 0 O 14,2 Fraktion 6 ......... 9,83 o,o26 I9,3 0 0 0 II,9 Fraktion 7 ......... 3,95 - I4,9 0 0 0 4,6 Die Prozentzahlen in dieser Tabelle beziehen sich auf Trockenbasis nach Bestimmung des Feuchtigkeitsgehaltes durch Trocknen auf konstantes Gewicht im Vakuum bei 60° C. Man sieht, daß die Fraktionen 5 und 6 die gewünschten biologischen Eigenschaften besitzen und daher für den therapeutischen Gebrauch geeignet sind.Table II Selected precipitated own- sulfur- Colorable sea- coagulation- Fraction viscosity content precipitate deposit reaction %% Fibrinogen deposition reaction effect Original salt - 0.044 I7.9 + + + I6.5 Fraction I ......... 1 14.69 0.070 19.4 +++ + + 20.7 Fraction 2 ......... II, 44 o, o58 I9.3 ++ + + 20.2 Fraction 3 ......... 10.25 0.054 20.6 ++ + + 20.7 Fraction 4 ......... II, 23 0.044 19.4 ++ + 0 I7.7 Fraction 5 ......... 15.44 0.035 I9.6 0 0 O 14.2 Fraction 6 ......... 9.83 o, o26 I9.3 0 0 0 II, 9 Fraction 7 ......... 3.95 - I4.9 0 0 0 4.6 The percentages in this table relate to a dry basis after determining the moisture content by drying to constant weight in vacuo at 60 ° C. It can be seen that fractions 5 and 6 have the desired biological properties and are therefore suitable for therapeutic use.

Wie oben bereits ausgeführt wurde, kann Dextransulfat in einer ungiftigen Form hergestellt werden. As stated above, dextran sulfate can be used in a non-toxic Shape to be made.

Man muß dabei nur darauf achten, daß keine großen Moleküle vorhanden sind. Die Sulfatierungsreaktion erfordert aber kostspielige Chemikalien und ist nicht leicht auszuführen. Demzufolge ist es klar, daß man, um die Kosten der Reaktion herabzusetzen, den Weg einschlagen muß, eine Dextranfraktion geeigneter Größe zu wählen und diese Fraktion zu sulfatieren.You just have to make sure that there are no large molecules are. However, the sulfation reaction requires and is expensive chemicals not easy to do. Accordingly, it is clear that one in order to reduce the cost of the reaction reduce, must take the path to a dextran fraction of suitable size choose and sulfate this fraction.

Die Herstellung der geeigneten Dextranfraktion kann in bekannter Weise durch Fraktionierung bewerL-stelligt werden.The suitable dextran fraction can be prepared in a known manner be assessed by fractionation.

Experimente haben indessen gezeigt, daß dieses Verfahren zur Herstellung von Dextransulfat nicht zufriedenstellend ist, da die Sulfatierung von Dextran zu der Bindung zweier Dextranmoleküle aneinander durch eine Sulfatbrücke unter Bildung eines großen und daher giftigen Moleküls führen kann. Weiterhin nehmen die größten der in einer sonst geeigneten Dextranfraktion vorhandenen Dextranmoleküle beim Sulfatieren noch ein wenig in ihrem Molekulargewicht zu, was wiederum Anlaß zur Giftigkeit geben kann. Experiments have shown, however, that this method of manufacture of dextran sulfate is unsatisfactory as the sulfation of dextran increases the bond between two dextran molecules through a sulfate bridge with formation of a large and therefore toxic molecule. Continue to take the largest of the dextran molecules present in an otherwise suitable dextran fraction during sulfation a little more in their molecular weight, which in turn give rise to toxicity can.

Die Erfindung weicht von dem bekannten Verfahren ab, indem ein rohes Dextranmaterial von unbestimmter Molekulargröße sulfatiert und das erhaltene Dextransulfat alsdann einer fraktionierten Ausfällung unter Gewinnung einer Fraktion mit einer Eigenviskosität von etwa 0,035 oder darunter unterworfen wird. Obwohl das bedeutet, daß sowohl Dextran als auch Sulfatierungschemikalien in gewissem Umfange vergeudet werden, wird dadurch doch die Erzeugung einer ungiftigen Dextransulfatfraktion gesichert. Natürlich kann man das Dextran auch einer Vorfraktionierung unterziehen, wie dies im Beispiel 1 erläutert wird. The invention differs from the known method by adding a raw Dextran material of indefinite molecular size sulfated and the resulting dextran sulfate then a fractionated precipitation to obtain a fraction with a Is subjected to inherent viscosity of about 0.035 or below. Though that means that both dextran and sulfating chemicals are wasted to some extent this ensures the production of a non-toxic dextran sulfate fraction. Of course, the dextran can also be pre-fractionated like this is explained in Example 1.

PATENTANspn0cHE: I. Verfahren zur Herstellung eines für therapeutische Zwecke geeigneten Dextransulfates, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus Molekülen verschiedener Größe bestehendes Dextransulfat einer fraktionierten Ausfällung aus seiner Lösung unter Isolierung einer Fraktion mit einer Eigenviskosität von etwa 0,035 oder darunter unterworfen wird. PATENT ANNOUNCEMENTS: I. Process for the manufacture of a therapeutic Dextran sulfates suitable for purposes, characterized in that one of molecules Dextran sulfate of various sizes from a fractionated precipitation its solution with isolation of a fraction with an inherent viscosity of about 0.035 or below.

Claims (1)

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das Dextransulfat aus wäßriger Lösung durch stufenweise Zugabe von Äthvlalkohol oder Aceton ausgefällt wird. 2. The method according to claim I, characterized in that the dextran sulfate precipitated from aqueous solution by the gradual addition of ethyl alcohol or acetone will. 3. Verfahren nach Anspruch I oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß voll einem Dextransulfat ausgegangen wird, das aus Dextran mit einer Eigenviskosität von nicht mehr als 0,I2 hergestellt worden ist. 3. The method according to claim I or 2, characterized in that fully a dextran sulfate is assumed, which is made of dextran with an inherent viscosity of not more than 0.12 has been established. In Betracht gezogene Druckschriften: ActaPhysiologicaScandinavica, Bd. 9, Heft I (I945); Helvetica Chimica Acta, Bd. 26, S. I309, I3I0 (I943) ; Dissertation Swift, I946, S. 93. Publications considered: ActaPhysiologicaScandinavica, Vol. 9, Book I (1945); Helvetica Chimica Acta, Vol. 26, pp. I309, I3I0 (I943); dissertation Swift, 1946, p. 93.