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Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus insulinhaltigen Organen im
Wecte der Extraktion Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Insulin
aus insulinhaltigen Organen im Wege der Extraktion.
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Es ist bekannt, daß zwecks Gewinnung von Insulin gemahlene Bauchspeicheldrüsen
verwendet werden, die einer meistens wiederholten Extraktion unterzogen werden.
Als Extraktionsflüssigkeit wurde ursprünglich Wasser verwendet, mit dem die Extraktion
in einem sauren und auch im einem alkalischen Medium vorgenommen «erden kann. Später
zog man als Extraktionsflüssigkeit eine alkoholische Lösung vor, bei der die Extraktion
sowohl in einem neutralen, als auch in einem sauren und auch in einem alkalischen
Medium erfolgen kann. Neuerdings wird die Extraktion im allgemeinen mit saurem Alkohol
durchgeführt, um die zerstörende Wirkung proteolytischer Enzyme auf Insulin auf
ein Minimum zu reduzieren. (Vergleiche hierzu: A. Grevenstuck und E. Laqueur, Insulin,
1925, S. 2o8; ebenso Ch. B o m s ko v, Methodik der Hormonforschung, 1937, Bd. Z.
S. 66o).
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Nach Ausführungen von C. M. J ep h c o t t, Trans. Roy. Soc. Canada
V, Biol. Sci. 25, 183 (193Z), und ebenso D. Hill und F. Howit, Insulin, 1936,
S.32
und Ch. Bomskov, Methodik der Hormonforschung, 1937, Bd. 1, S. 671, ergeben
in Anwesenheit von Salzsäure durchgeführte Extraktionen dann die besten Ausbeuten,
wenn die Alkoholkonzentration der Extraktionsmischung etwa- 6o bis 8o V olumprozent
beträgt. Es ist daher nicht überraschend, wenn die bekannten Extraktionsverfahren,
bei denen saurer Alkohol benutzt wird, sämtlich gerichtet sind-auf-die Erreichung
eines Alkoholgehaltes in der Extraktionsmischung
von etwa 6o bis
8o Volumprozent. (Vergleiche hierzu beispielsweise C. H, B e s t undD. A. S c o
t t, J. Biol. Chem. 57, 709, [19231; Lilly & Co., J. Am. Med. Ass. I, 1851 [x923];
EI. Peneau, J. Pharm. Chim.3o, i45 [z924], bei denen ein prozentualer Gehalt von
etwa 6o °/o angegeben ist; vergleiche weiter M. k Blätherwick c. s., J. Biol. Chem.
792,57 [I927], der eineu Alkbholgehalt von 63 bis 65 °/o angibt, und auch
die britische Patentschrift 566 354 Es wurde bei systematischer und gründlicher
Überprüfung und Untersuchung der Extraktion in saurem alkoholischem Medium die überraschende
Feststellung gemacht, daß eine wiederholte Extraktion in einem etwa 45 bis 55 volumprozentigen
alkoholischen Medium in Gegenwart von nur wenigen Gewichtsprozenten eines oder mehrerer
Salze, mit einwertigen Anionen mit Ausnahme von Schwermetallsalzen, eine wesentlich
höhere Insulinausbeute ergibt *als die' bekannte Extraktion mit 6o- bis 8o°/oigem
Alkohol.
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Mit der erfindungsgemäßen Extraktion wird eine Erhöhung der Ausbeute
um annähernd 2o °/o erreicht. Die Konzentration des Alkohols hängt ab von der Gesamtmenge
der in der Extraktionsmischung anwesenden Flüssigkeit,, wobei das in den Organen
anwesende Wasser zu berücksichtigen ist.
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Bei der erfindungemäßen Extraktion handelt es sich um eine spezifische,
auf die Gewinnung von Insulin zugeschnittene Methode. Die erhaltenen Extrakte besitzen
nämlich viel weniger gelöste störende Ballastsubstanzen in Form von reduzierend
wirkenden, die Aktivität des Insulins zu einem beträchtlichen Teil zerstörenden
Material und von fettigen und proteinartigen zerstörenden Substanzen als die Extrakte
mit höherem Alkoholgehalt. Da in den nach der Erfindung hergestellten Extrakten
der Alkoholgehalt niedriger ist, verursacht die notwendige Austreibung des Alkohols
aus dem Extrakt in .der anschließenden Reinigungsbehandlung beträchtlich geringere
Mühe als die Austreibung aus den nach den bekannten Verfahren hergestellten Extrakten,
die mehr Alkohol enthalten.
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Um zu verhindern,- daß auf Grund des wechselnden Flüssigkeitsgehaltes
beispielsweise der verschiedenen Arten von Bauchspeicheldrüsen die Extraktion außerhalb
der angegebenen Grenzen stattfindet, ist es zu empfehlen, den Wassergehalt des .
jeweils verwendeten Pankreasmaterials vor der Behandlung zu bestimmen.
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Bei der erfindungsgemäßen Verwendung von Salzen mit einwertigen Anionen
sind die Salze von Schwermetallen auszunehmen, da diese bei einem pu-Bereich von
4 bis 5,5, wie er für die anschließende Reinigung der Extrakte Anwendung findet,
als Hydroxyde ausfallen und somit geeignet sind; nicht nur die Filtration zu stören,
sondern auch die Adsorption des Insulins an den Niederschlag zu fördern und sogar
zur -Mitausfällung des Insulins zu führen.
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Die Verbesserung der Ausbeute wird erreicht nicht nur durch die Anwendung
eines Alkoholgehaltes von. 45 bis 55 Volumprozent im-Gegensatz zu der in einschlägigen
Fachkreisen verbreitetenAuffassung, wie sie oben dargelegt wurde, sondern auch infolge
der Verwendung der vorher -angegebenen Metallsalze in der Extraktionsmischung, wobei
diese Salze zusätzlich noch von wesentlicher Bedeutung sind für die der Extraktion
folgenden weiteren Behandlung. An sich müßte erwartet werden, daß die Zugabe dieser
Salze zur Extraktionsmischung auf die Ausbeute aus der Extraktion einen schädigenden
Einfluß besitzt. Denn durch eine gründliche Nachprüfung seitens des Erfinders wurde
festgestellt, daß gewisse Elektrolyten, die keine Schwermetalle enthalten, nämlich
solche mit mehrwertigen Anionen, wie Sulfate und Phosphate, oft eine sehr starke
Adsorption des Insulins an alle in den sauren, alkoholhaltigen Pankreasextrakten
dispergierten Materialien bedingen. Diese Erscheinung kann mit einem bekannten Adsorptionsvorgang
in Zusammenhang stehen, der durch A. Tiselius, Archiv f. Kemi, Mineralog, och. Geol.,
26 B (i),i (i948) und auch in Chem. Abstr. 43, 1624 (i949) beschrieben ist. Dieser
Effekt wird beispielsweise auch beobachtet bei bekannten Extraktionsmethoden in
alkoholischem Medium, wo zum Ansäuren Schwefelsäure (vgl. Methode von Blatherwick
an oben zitierter Stelle) oder Phosphorsäure (vgl. H. Langecker und W. Wiechowski,
Klin. Wochenschr. IV, 1339 (1925) und schweizerische Patentschrift 264296,
S. 3 Zeile 2o) benutzt wird. Bei diesen Methoden wurden kleinere Extraktionsausbeuten
gefunden als beispielsweise bei einer Salzsäureextraktion. Bei der Zugabe von Elektrolyten
mit einwertigen Anionen müßte an sich ein ähnlicher vielleicht kleinerer Effekt
erwartet werden. Im Gegensatz hierzu zeigt aber die Anwesenheit dieser Elektrolyten
eine Erhöhung der Ausbeute bei der Extraktion. -Diese Vergrößerung der Ausbeute
ist also verbunden mit einer vermehrten Ausfällung feiner, dispergierter und reduzierend
wirkender Substanzen, die nach erfolgter Extraktion zusammen mit den gröberen Organresten,
beispielsweise durch einfaches Zentrifugieren zu einem bedeutenden Teil entfernt
werden. Für dieses Zentrifugieren sind keine besonderen Zentrifugen mit hohem Wirkungsgrad
erforderlich; es können die üblichen laboratoriums- und betriebsmäßigen Zentrifugen
benutzt werden.
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Das Salz wird vorzugsweise in einer Menge von nur wenigen Gewichtsprozenten
zugegeben. Beispiele dieser Salze sind Na C1, das beispielsweise in einer Menge
von 0,25 Gewichtsprozent verwendet wird, KCl(0,4Gewichtsprozent),KBr(o,6
Gewichtsprozent), NH,Cl (0,3 Gewichtsprozent), CaCh (o,25 Gewichtsprozent),Tetramethylammoniumchlorid
(o,6 Gewichtsprozent) und Natriumsalz der Paratoluolschwefelsäure (0,5 Gewichtsprozent).
Zu empfehlen ist die Verwendung von N H4 Cl.
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Die erfindungsgemäße Extraktion kann besonders wirksam und leicht
durchgeführt werden, wenn die Menge der den Organen zugegebenen Extraktionsflüssigkeit
wenigstens das doppelte Organgewicht ausmacht.
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Weiterhin ist es besonders vorteilhaft, wenn die Extraktion und die
nachfolgende Abscheidung .der Organreste bei Temperaturen zwischen 5 und i5° C durchgeführt
wird, da bei diesen Temperaturen die Einverleibung von Ballaststoffen so gering
wie möglich ist, ohne daß dabei eine Verminderung derExtraktionsausbeute auftritt.
Die
auf diese Weise erhaltenen Extrakte, die verhältnismäßig wenig fein dispergiertes,
die nachfolgende Reinigung störendes Material enthalten, werden vereinigt und auf
einen pH-Wert etwa zwischen 4 und 5,5 eingestellt. Hierbei «-erden die reduzierend
wirkenden Substanzen zusammen mit anderem schädlichen Material vollständig und leicht
ausgefällt und können schnell und auf einfache Weise durch Filtern entfernt werden.
Auf diese Weise ist die Möglichkeit der Adsorption des Insulins an das ausgefällte
Material wie auch die Möglichkeit der Hydrierung des Insulins außerordentlich gering,
so daß der Verlust an Insulin ein Minimum darstellt. Aus dem nur wenig Insulin enthaltenden
Niederschlag kann letzteres mühelos durch Waschen entfernt werden.
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Eine dieser Reinigung bei einem pH-Wert von 4 bis 5,5 vorausgehende
Destillation im Vakuum zwecks Entfernung eines wesentlichen Teiles des Alkohols
(vgl. britische Patentschrift 566 351), die stets zu Insulinverlusten führt, ist
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wegen der günstigen Alkoholkonzentration der
Extraktionsflüssigkeit vollkommen überflüssig.
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Danach wird die Flüssigkeit auf einen pH-Wert etwa zwischen 7 und
8,5 eingestellt, um weitere störende Ballastsubstanzen auszufällen. Wenn auch bei
diesem pH-Wert die Umstände für eine Reduktion des Insulins an sich günstig sind,
so tritt doch kein nennenswerter Insulinverlust auf, da alle reduzierend wirkenden
Substanzen bereits entfernt sind. Der erhalteneNiederschlag wird im Wege der Filtration
entfernt.
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Darauf wird das Filtrat angesäuert und der Alkohol im Vakuum abdestilliert.
Die zurückbleibende insulinhaltige Flüssigkeit wird filtriert. Das klare Filtrat
wird dann ausgesalzen, der Salzkuchen, der alle aktiven Substanzen enthält, wird
in gesäuertem Wasser gelöst, worauf gegebenenfalls das Aussalzen wiederholt werden
kann. Die Lösung des Salzkuchens endlich wird auf den iso-elektrischen Punkt des
Insulins, d. h. auf einen pH-Wert von 5 bis 5,5 eingestellt, wobei die aktive Substanz
aus der Lösung ausgefällt wird.
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Es wurde gefunden, daß nach voraufgehender Reinigungsbehandlung gemäß
der Erfindung, im Gegensatz zu den üblichen Behandlungsmethoden, nicht die gesamte
:Menge der aktiven Substanz ausgefällt werden kann, sondern daß ein beträchtlicher
Teil in der Mutterlauge des normalen iso-elektrischen Niederschlages gelöst bleibt.
Diese aktive Substanz kann durch Einstellen des pH-Wertes auf 6 bis 8 ausgefällt
werden. Die so erhaltene Substanz kann gegebenenfalls durch Lösung in gesäuertem
Wasser gereinigt werden, gefolgt von einer erneuten Fällung bei einem pH-Wert zwischen
6 und B. Dieses Produkt, dessen Aktivität etwa 5 bis io I. E. pro Milligramm beträgt,
wird in einer Menge erhalten, die auch von der Qualität der verwendeten Bauchspeicheldrüsen
abhängt.
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Auf Grund der Eigenschaft dieses sogenannten natürlichen Insulins,
daß es nämlich in dem pH-Bereich, in dem es sich im menschlichen Gewebe und Blut
darstellt, unlöslich ist, ergibt sich eine zeitlich längere Aktivität, die leicht
festgestellt werden kann. Auf diese Weise kann ein vollkommen natürliches- Insulin
mit verlängerter Aktivität dargestellt werden, ohne alle die sonst für diesen Zweck
notwendigen Arten von Substanzen verwenden zu müssen.
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Das natürliche Insulin ist bereits in der amerikanischen Patentschrift
2 449 076 beschrieben. Mit diesem bekannten Verfahren, das übrigens hinsichtlich
der Extraktion und der weiteren Reinigung von dem vorliegenden Verfahren abweicht,
wird natürliches Insulin außer normalem Insulin erhalten.
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Die gesamte, bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene
Ausbeute an natürlichem und normalem Insulin liegt annähernd ioo °(o höher als diejenige,
die sich bei Verwendung der bekannten Verfahren ergibt, beispielsweise nach R. G.
Romans, D. A. Scott und A. i42. Fischer, Ind. Eng. Chem, 32, 908 (194o).
Als normales Insulin wird das bei dem iso-elektrischen Punkt gefällte Produkt bezeichnet,
während natürliches Insulin das aus der dabei hinterbleibenden Mutterlauge nach
Einstellung des pH-Wertes auf 6 bis 8 ausgefallene Produkt ist.
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In den folgenden Ausführungsbeispielen wird die Erfindung ausführlich
beschrieben. Beispiel i 5o kggefrorene Rinderbauchspeicheldrüsen mit einem Wassergehalt
von 70"1, wurden gemahlen und unter Rühren in 1401 einer 61 volumprozentigen alkoholischen
Lösung gegeben, in der 0,35 kg Natriumchlorid gelöst war, und der so viel,
nämlich i,1 1 konzentrierte Salzsäure beigegeben war, daß die Pankreasdispersion
einen pH-Wert von 3 aufwies. Die Extraktion wurde während 2 Stunden durchgeführt,
die Temperatur der Extraktionsmischung wurde auf io° C gehalten. Die Mischung wurde
dann mittels einer Trommelzentrifuge bei io° C in Extrakt und Organreste getrennt.
Die Organreste wurden ein zweites Mal extrahiert mit 1301 einer 49 volumprozentigen
alkoholischen Lösung mit einem Gehalt von 0,32 kg Na Cl. Der pH-Wert, die
Temperatur und die Dauer dieser zweiten Extraktion waren die gleichen wie bei der
ersten. Die Mischung wurde wiederum in einer Trommelzentrifuge zentrifugiert, worauf
der Extrakt mit demjenigen der ersten Behandlung vereinigt wurde. Die beiden vereinigten
Extrakte wurden daraufhin auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt, worauf der erhaltene
Niederschlag mittels einer Filterpresse entfernt wurde. Das im Niederschlag noch
anwesende Insulin wurde durch Behandeln mit einer 49 volumprozentigen alkoholischen
Lösung ausgewaschen, Die so erhaltene klare Flüssigkeit wurde danach auf einen pH-Wert
von 7,6 eingestellt und wiederum mittels einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat
wurde auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und dann im Vakuum bis zur Entfernung des
Alkohols destilliert. Die alkoholfreie Flüssigkeit wurde durch Filtration von dem
dispergierten Material befreit. In dem Filtrat wurde Kochsalz in einer Menge von
28 Gewichtsprozent in Lösung gebracht, wobei ein Salzkuchen erhalten wurde, der
nach seiner Abscheidung in 5 1 o,oi n-Salzsäure gelöst wurde. Das Aussahen wurde
bei dieser Lösung mit 16 Gewichtsprozent Natriumchlorid wiederholt. Der zweite Salzkuchen
wurde in 21 o,oi n-Salzsäure gelöst und der normale iso-elektrische Niederschlag
durch Einstellung auf den pH-Wert zwischen 5 und 5,4 ausgefällt und in
kristallinisches
Insulin umgewandelt. Aus der Mutterlauge des iso-elektrischen Niederschlages wurde
wiederum durch Einstellung auf einen pu-Wert zwischen 6,8 und 7 ein Niederschlag
aktiver Substanz erhalten. Nachdem dieses Produkt wieder gelöst und gefällt war,
zeigte es als natürliches Insulin in trockenem Zustande eine Aktivität von 8 I.
E. pro Milligramm; bezogen auf = kg Bauchspeicheldrüsen wurden bei der geschilderten
Arbeitsweise ßoo I. E. natürlichen Insulins mit protrahierter Wirkung neben 280o
I. E. normalen Insulins erhalten.
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Beispiel 2 -"kg gefrorene Rinderbauchspeicheldrüsen mit einem
Wassergehalt von 75 °/o wurden gemahlen und unter Rühren in 1300 1 65 volumprozentigen
Alkohols eingebracht, in der sich 4 kg Ammoniumchlorid und 1o 1 konzentrierte Salzsäure
befanden, um eine Extraktion bei einem pH=Wert von annähernd 3 zu gewährleisten.
Die Extraktionstemperatur wurde auf z2° C gehalten. Nach 2 Stunden wurde die Mischung
mittels einer Trommelzentrifuge bei z2° C zentrifugiert, worauf eine zweite Extraktion
der Organreste durchgeführt wurde. Zu diesem Zwecke wurden z2oo 1 einer 5zvolumprozentigen
alkoholischen Lösung benutzt, in der 3,5 kg Ammoniumchlorid gelöst waren. Die Dauer,
der Säuregrad und die Temperatur dieser zweiten Extraktion waren die gleichen wie
bei der ersten. Nach erfolgter Zentrifugierung wurden die beiden Extrakte vereinigt:
Die so erhaltene Flüssigkeit wurde auf einen _pu-Wert von 5,2 eingestellt, worauf
der entstandene Niederschlag mittels einer Filterpresse entfernt wurde= Hieraus
wurde durch Waschen mit einer 5zvolumprozentigen alkoholischen Lösung hinterbliebenes
Insulin gewonnen.
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Das klare Filtrat wurde darauf auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt
und der gebildete Niederschlag mit einer Filterpresse abfiltriert. Das Filtrat wurde
auf einen pH-Wert von 3 angesäuert, worauf der Alkohol im Vakuum abdestilhert wurde.
Die weitere Behandlung entsprach genau der des Beispiels z.
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Aus der Mutterlauge des normalen iso-elektrischen Niederschlages kann
das natürliche Insulin durch Einstellen des pH-Wertes auf 7,4 bis 7,6 gefällt werden.
Das daraus gewonnene trockene Produkt besitzt eine Aktivität von 6 I. E. pro Milligramm.
Die Ausbeute, bezogen auf z kgBauchspeicheldrüsen, beträgt 20o I. E,; das normale
kristallinische Produkt wird in einer Ausbeute von 3500 I. E. pro Kilogramm
Bauchspeicheldrüsen erhalten.
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Beispiel 3 5o kg gefrorene Bauchspeicheldrüsen neugeborener Kälber
mit einem Wassergehalt von 77 "/o wurden -gemahlen und danach in 1251 68 volumprozentigen
Alkohols mit 0,35 kg Calciumchlorid und ausreichender Salzsäure, nämlich
etwa z l konzentrierter Salzsäure, zur Erreichung eines pH-Wertes von ungefähr 3-
eingebracht. Die Extraktion wurde 2 Stunden lang bei 8° C durchgeführt. Dann wurde
die Mischung ebenfalls bei 8° C mittels einer Trommelzentrifuge zentrifugiert. ,Die
Organreste wurden nochmals mit zzo l 53volumprozentigen Alkohols, indem o;3 kg Calciumchlorid
gelöst waren, extrahiert. Temperatur, pH-Wert und Extraktionsdauer entsprechen den
Werten der ersten Extraktion. Nach Zentrifugierung bei 8° C wurden die Organreste
wiederum in gleicher Weise wie bei der zweiten Extraktion extrahiert und die erhaltene
Mischung zentrifugiert.
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Die vereinigten Extrakte wurden auf einen pH-Wert von 5 eingestellt,
worauf der Niederschlag in gleicher Weise wie in den Beispielen z und 2 gefiltert
und mit 53 volumprozentigem Alkohol gewaschen wurde. Das klare Filtrat wurde auf
pH 7,8 eingestellt und der gebildete Niederschlag nochmals abfiltriert. Das Filtrat
wurde auf pH 3 angesäuert und im Vakuum bis zur vollkommenen Entfernung des Alkohols
destilliert, worauf die zurückbleibende insulinhaltige Flüssigkeit durch Filtration
von dispergiertem Material befreit wurde.
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Der Salzkuchen, der durch Lösung von 28 Gewichtsprozent N atriumchlorid
in dem klaren Filtrat erhalten wurde, wurde in z51 o,oz n-Salzsäure gelöst. Diese
Lösung wurde nochmals ausgesalzen mit z6 Gewichtsprozent Natriumchlorid. Der gebildete
Salzkuchen wurde in 6 1 o,oz n-Salzsäure gelöst, worauf .der pH-Wert auf 5,2 bis
5,4 eingestellt wurde. Der erhaltene normale iso-elektrische Insulinniederschlag
wurde in kristallinisches Insulin umgewandelt. Die Mutterlauge des iso-elektrischen
Niederschlages wurde auf pH 7,6 bis 7,8 eingestellt, worauf das natürliche Insulin
ausfiel. Nach der Reinigung ergab sich eine Ausbeute an natürlichem Insulin mit
1o I. E. pro Milligramm. Bezogen auf Bauchspeicheldrüsen wurde das normale kristallinische
Produkt erhalten in einer Ausbeute von 10,400 I. E. pro Kilogramm, während die Ausbeute
an gereinigtem natürlichem Insulin 1,20o I. E. pro Kilogramm Pankreas betrug.