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Verfahren zur Herstellung von Insulinkristallen ungefähr einheitlicher Grösse
Es sind injizierbare Insulinpräparate bekannt, deren protrahierte Wirkung ausschliesslich oder hauptsächlich auf der Anwesenheit von Insulinkristallen in wässeriger Suspension beruht. Auch ist es bekannt, dass es für eine gleichmässige und zuverlässige klinische Wirkung solcher Präparate wichtig ist, dass die suspendierten Insulinkristalle ungefähr einheitlicher Grösse sind.
Zweck der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Insulinkristallen ungefähr einheitlicher Grösse während des Kri- stal1isationsvorganges, so dass besondere Mass- nahmen zur Hervorbringung einheitlicher Grösse der Kristalle nach der Kristallisation überflüssig werden.
Bei der Kristallisation von Insulin verfährt man bekanntlich derart (s. beispielsweise die amerikanischen Patentschriften Nr. 2, 143. 590, 2, 174. 862 und 2, 626. 228), dass ein insulinhaltiges wässeriges Medium, das auch eine genügende Menge an einem die Kristallisation begünstigenden Metall, vorzugsweise Zink, enthält, auf einen pH-Wert zwischen 5 und 7 eingestellt wird. Zum Festlegen des pH-Wertes wird gewöhnlich Zusetzung einer Puffersubstanz verwendet, und zum Fördern der Kristallbildung hat man vorgeschlagen, einige Kristalle dem Kristallisationsmedium zuzusetzen, s. die amerikanische Patentschrift Nr. 2, 174. 862.
Das Ergebnis der bekannten Kristallisationsverfahren sind indessen Kristalle sehr verschiedener Grösse, indem keine Massnahme getroffen wurde, um einheitliche Grösse der Kristalle zu erreichen. Solche Massnahmen würden auch keinen Zweck haben, denn die hergestellten Insulinkristalle als solche wurden nicht als Bestandteil klinischer Insulinpräparate verwendet.
Es wurde nunmehr erfindungsgemäss gefun- den, dass man bei der Kristallisation zu Kristallen ungefähr einheitlicher Grösse kommen kann, wenn Impfkristalle ungefähr einheitlicher Grösse in einer der Gleichung
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entsprechenden Menge verwendet werden, wo-
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in stallausbc : ute Zu erhalten, sollen höhere Halogenionenkonzentrationen als etwa 1 Mol pro Liter nicht verwendet werden.
Von therapeutischen und pharmazeutischen Gesichtspunkten aus ist es zweckmässig, die Impfkristalle und das zu kristallisierende Insulin in einer solchen Menge zu verwenden, dass Insulinkristalle von hauptsächlich einheitlicher Grösse im Gebiete von 15 bis 40 ! J. gebildet werden. Durch Unterdrückung spontaner Kristallisation ist es beispielsweise möglich, 90 Gew.-% der anfallenden Insulinkristalle in einer Grösse von 28-36 ! J. zu gewinnen.
Für das Verfahren gemäss der Erfindung kann das insulinhaltige wässerige Kristallisationsmedium in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Es ist zumeist üblich, eine saure, wässerige Insulinlösung mit dem erforderlichen Gehalt an einem oder mehreren der kristallisationsfördernden Metalle (Zn, Co, Ni, Cd, Cu, Mn und Fe, von welchen zumeist Zn verwendet wird), sowie gegebenenfalls an Puffersubstanzen herzustellen und die Lösung auf den für die Kristallisation erforderlichen pH-Wert einzustellen. Das Insulin kann aber auch aus einem wässerigen Medium ohne den erforderlichen Metallgehalt amorph gefällt und dann durch darauffolgenden Zusatz der erforderlichen Metallmenge, z. B. als wässerige Metallsalzlösung, in Kristallform übergeführt werden.
Schliesslich ist es auch möglich, sich dem für die Kristallisation erforderlichen pH-Wert von der basischen Seite aus zu nähern, indem basische Insulinlösungen verwendet werden.
Die Impfkristalle können in Form einer wässerigen Suspension zugesetzt werden, z. B. jener wässerigen Suspension, in welcher sie hergestellt wurden. Sie können aber auch in trockener Form zugegeben werden, z. B. in Form eines durch Gefriertrocknen gewonnenen Produktes.
Wenn das Insulin im amorphen Zustand ohne den erforderlichen Metallgehalt im Suspensionsmedium vorhanden ist, so können die Impfkristalle zugleich mit dem fehlenden Metall zu gesetzt werden, wobei die wässerige Suspension der Impfkristalle selbst einen genügenden Metallgehalt besitzen kann.
Wie erwähnt, tritt die Kristallisation bei einem pH-Wert zwischen 5 und 7 ein. Innerhalb dieses Bereiches wird zweckmässig bei einem pH-Wert von 5, 3 bis 6, 5, je nach der Zusammensetzung des Kristallisationsmediums, gearbeitet.
Die Impfkristalle können z. B. nach dem in der österr. Patentschrift Nr. 198426 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Verfahrens gemäss der Erfindung.
Beispiel 1 : 500 mg aus Schweinepankreas gewonnenes, kristallines Insulin werden in 50 cms Wasser gelöst, das 6 cmS 0, 1 n HC1 enthält.
Dieser Lösung werden 15 cm3 Aceton, 10 cm3 einer Pufferlösung, die 10% Zitronensäure und 0, 4% Zn (als Zinkchlorid) enthält, und soviel
NaOH zugesetzt, dass die gepufferte Lösung einen pH-Wert von etwa 6, 3 besitzt. Dann wird mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 cm3 aufgefüllt. Der pH-Wert wird auf etwa 6, 2 ein- gestellt. Vor Anfang der Kristallisation werden
2 cm3 einer Impfkristallsuspension folgender
Zusammensetzung zugesetzt : 0, 03lao Insulinkri- stalle einer Grösse von etwa 3 it, 2, 5 mg Zink (als Zinkchlorid) je 100 cm3, 2, 5 mg Zitronen- säure je 100 cm3, 0, 08% Methyl-p-oxybenzoat und soviel NaOH, dass sich ein pH-Wert von
7, 2 bis 7, 4 ergibt. Nach vorsichtigem, mehrstün- digem Rühren ist die Kristallisation beendet.
Die Hauptgewichtsmenge des Insulins ist in
Form von 20-25 L grossen Kristallen auskristal- lisiert.
Beispiel 2 : 1, 6g aus Rinderpankreas gewon- nenes, kristallisiertes Insulin werden in 50 cm3
Wasser gelöst, das 10 mg Zn (als Zinkchlorid) und 2 cm3 1 n HC1 enthält. Dazu werden 50 cm3 einer Pufferlösung gegeben, die 1, 36g . CH3COONa. 3H2O, 7 g NaCI und 1 cm3 In Natronlauge enthält. Unmittelbar darauf werden 3, 5 cm3 einer Impfkristallsuspension zugesetzt, welche die in Beispiel 1 angegebene Zusammensetzung besitzt. Der pH-Wert wird auf 5, 4 bis
5, 6 eingestellt. Nach einem 15-20 Stunden langem Rühren ist die Kristallisation beendet.
Die Hauptgewichtsmenge des Insulins ist in etwa 30 cl grossen Kristallen auskristallisiert.
Beispiel 3 : 1, 12g aus Rinderpankreas gewonnenes, kristallisiertes Insulin werden in 50 cm3 Wasser gelöst, das 10 mg Zn (als Zinkchlorid) und 2 cm3 1 n HCI enthält. Dieser Lösung werden 50 cm3 einer wässerigen Lösung zugesetzt, die 1, 36g CHgCOONa. 3H2O, 11, 9g KBr und 1 cm3 1 n Natronlauge enthält. Unmittelbar darauf werden 2, 5 cm3 Impfkristallsuspension zugesetzt, welche die in Beispiel 1 angegebene Zusammensetzung besitzt. Der pH-Wert wird auf 5, 4 bis 5, 6 eingestellt. Nach 15-20 Stunden langem Rühren ist die Kristallisation beendet.
Die Hauptgewichtsmenge des Insulins ist in Form von etwa 30 L grossen Kristallen auskristallisiert.
Beispiel 4 : 1, 6 g kristalllisiertes Insulin werden in 500 cm3 Wasser gelöst, das 100 mg Zn (als Zinkchlorid) und 20 cm3 1 n HC1 enthält. Dieser Lösung werden 500 cm3 einer Pufferlösung zugesetzt, welche 13, 6g CH3COONa. 3H O, 70 g NaCI und 10 cm3 1 n Natronlauge enthält. Dann werden 1, 8 cm3 einer Impfkristallsuspension zugegeben, welche die in Beispiel 1 angeführte Zusammensetzung besitzt. Der pH-Wert wird auf 5, 4 bis 5, 6 eingestellt. Nach 15-20 Stunden langem Rühren ist die Kristallisation beendet. Die Hauptgewichtsmenge des Insulins ist in Form von etwa 40 11 grossen Kristallen auskristallisiert.
Beispiel 5 : 3. 2 g kristallisiertes Insulin werden in 50 cm3 einer wässerigen Lösung aufge-
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löst, die 20 mg Zn (als Zinkchlorid) und 3 cm3
1 n HCI enthält. Dieser Lösung werden 50 cm3 einer wässerigen Lösung zugesetzt, welche 1, 36 g CH3COONa. 3H2O, 7 g NaCI und 2 cm3 1 n Natronlauge enthält. Dann werden 5 cm3 einer Impfkristallsuspension zugegeben, die gegen- über der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung sämtliche Bestandteile in der lOfachen Konzentration enthält. Nach etwa 20 Stunden ist die Kristallisation beendet. Die Hauptgewichtmenge des Insulins ist in Form von etwa
15 ft grossen Kristallen auskristallisiert.
Beispiel 6 : Die Kristallisation wird nach der in Beispiel 2 angegebenen Vorschrift durchgeführt, jedoch wird an Stelle von 3, 5 cm3 Impfkristallsuspension die äquivalente Menge Insulin in Form eines durch Gefriertrocknung gewonnenen Pulvers zugesetzt. Auf diese Weise wird die gleiche Kristallgrösse wie nach Beispiel 2 erhalten.
Das Verfahren gemäss der Erfindung kann auch zur Herstellung von therapeutisch ver- wendbare Insulinkristallsuspensionen, welche eine protrahierte Wirkung aufweisen, benutzt werden. In solchem Falle kann die Kristallisation unter sterilen Bedingungen in einem injizierbaren Kristallisationsmedium in Gegenwart einer Puffersubstanz durchgeführt werden, welche das die Kristallisation begünstigende Metall bei neutraler Reaktion nicht bindet. Hiedurch wird die separate Herstellung von sterilen Insulinkristallen einheitlicher Grösse und das nachfolgende Suspendieren dieser Kristalle in einem separat hergestellten sterilen, injizierbaren Suspensionsmedium überflüssig.
Das folgende Beispiel erläutert diese Ausführungsform des Verfahrens.
Beispiel 7 : 1, 6 g kristallisiertes Insulin werden in 50 cm3 Wasser gelöst, das 10 mg Zn (als Zinkchlorid) und 2 cm3 1 n HCI enthält. Die Lösung wird steril filtriert. Das Filter wird mit 25 cm3 Wasser gewaschen. Zu den 75 cm3 des Filtrates werden 25 cm3 einer unter aseptischen Bedingungen hergestellten Pufferlösung gegeben, die 1, 36 g CH3COONa. 3H2O, 7 g NaCI und 1 cm3 1 n Natronlauge enthält. Dann werden 3, 5 cm3 einer unter aseptischen Bedingungen hergestellten Impfkristallsuspension zugesetzt, welche die in Beispiel 1 angeführte Zusammensetzung besitzt. Der pH-Wert wird auf 5, 5 eingstellt. Nach einem 15-20 Stunden andauerndem Rühren ist die Kristallisation beendet. Die Hauptgewichtsmenge des Insulins ist in Form von etwa 30 [t grossen Kristallen auskristallisiert.
Die Kristallsuspension wird in ein gebrauchsfertiges, injizierbares Präparat übergeführt, indem sie mit 900 cm3 einer unter aseptischen Bedingungen hergestellten Lösung verdünnt wird, die 70 mg Zn (als Zinkchlorid), zoo Methylp-oxybenzoat und 2, 7 cm3 1 n Natriumlauge enthält. Der pH-Wert soll bei etwa 7, 3 liegen ; die Suspension wird mit 0, 1 n NaOH oder HCI auf diesen Wert eingestellt.
Das schliessliche Präparat enthält 40 internationale Einheiten Insulin je cm3.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Insulinkristallen ungefähr einheitlicher Grösse durch Kristallisation des Insulins aus einem wässerigen Medium bei einem zwischen 5 und 7 liegenden pH-Wert, in Gegenwart von einem die Kristallisation begünstigenden Metall, durch gekennzeichnet, dass Impfkristalle ungefähr einheitlicher Grösse in einer der Gleichung
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entsprechenden Menge verwendet werden, wobei P die Menge der Impfkristalle in g, I die Menge des kristallisierbaren Insulins in der
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Impfkristalle in it und di die Grösse in t, in welcher die Hauptmenge des Insulins auskristallisieren soll, bedeuten.
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