DE8213161U1 - Trockene chromatographische saeule fuer ein vereinfachtes separationsverfahren fuer immunologische bestimmungen - Google Patents
Trockene chromatographische saeule fuer ein vereinfachtes separationsverfahren fuer immunologische bestimmungenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine chromatographische Säule für ein vereinfachtes Trennverfahren für eine
immunologische Bestimmung wie eine radio-, fluoreszenz- und/oder enzym-immunologische Bestimmung, bei der ein
Antigen-Antikörper-Komplex vom freien, nicht gebundenen Antigen getrennt werden muß.
Der quantitative UachwRis kleinster biologisch bereit-S
wirksamer Substanzmengen in Körperflüssigkeiten, Lebensmitteln,
in Luft und Wasser ist von großer Bedeutung für die Medizin, Pharmakologie, Toxikologie und Ökologie.
Für Forschungszwecke und für Routineuntersuchungen wurden bereits zahlreiche Analysemethoden entwickelt, wie z.B.
die Fluorometrie, die Chromatographie, die Massenfrngmentographie
und die Neutronenaktivierungsanalyse.
Eine besondere Gruppe von BastimmungsverfaJiren sind immunologische
Bestimmungsverfahren, die die extrem hohe Spezifität immunologischer Reaktionen ausnutzen. Es
handelt sich bei derartigen Verfahren im Prinzip um eine Konkurrenzreaktion von markiertem Antigen (Ag') und
nicht markiertem Antigen (Ag) um die Bindung an einen spezifischen Antikörper (Ak) unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes.
Aus dem Anteil an gebundenem markiertem Antigen läßt sich die zu bestimmende Menge des
nicht markierten Antigens ermitteln. Die Markierung des Antigens erfolgte bisher mit fluoreszierenden Substanzen,
Enzymen und im Falle des als Radio-Snnuno-Assay (RIA) bekannten
Verfahrens mit Isotopen. Theoretisch sind auch andere ϊ-larkierungen denkbar, sofern eine geeignete Meßmethode
gefunden werden kann.
Neben der fluoreszenz- und enzym-immunologischen Bestimmungsmethode
hat sich seit 1959 vor allem das radio—
„ immunologische Untersuchungsverfahren (Radio-Immuno-
ί Assay - RIA) von Yalow durchgesetzt. Es verbindet die
außerordentliche Spezifität der immunologischen Reaktion und die hohe Nachweisempfindlichkeit radioaktiv markierter
Substanzen mit einer relativ einfachen Durchführbarkeit und ermöglicht erstmals eine Quantifizierung
im Pico- und Femtogrammbereich. ;
Auf Grund der besonderen Bedeutung des Radio-Immuno-Assays ■
wird die vorliegende Erfindung nachfolgend stets anhand ihrer Verwendung bei diesem Verfahren beschrieben, obwohl
sich für den Fachmann sofort erkennen IaBt7 daß die
vorliegende Erfindung für alle immunologischen Bestimmungsverfahren angewendet werden kann, bei denen es um eine !
Trennung eines Antikörper-Antigen-Komplexes von freien \
Antigenen geht.
Dieser Trennschritt ist im allgemeinen technisch und zeitlich aufwendig und meist mit nicht unerheblichen
Fehlern behaftet. Die verschiedenen angewandten Separationsverfahren
stellen daher die größten unterschiede zwischen den bekannten RIA-Systemen dar.
Zu den bekannten universell anwendbaren Trenntechniken für immunologische Bestimmungen gehören das Solid-Phase-System,
die Doppelantikörpermethode und die Polyäthylenglykol (PEG-) Fällung. Bei der Solid-Phase-Methode wird ein an
einen festen Träger kovalent oder durch Adsorption gebundener Antikörper eingesetzt. Dient das Inkubationsröhrchen
selbstals feste Phase (coated tube), so ist
zu bedenken, daß bisweilen die Fixierung des Antikörpers
unregelmäßig ist und der Antikörper sich während der Inkubations-
und Waschschritte teilweise ablösen kann. Die Doppelantikörper-Trenntechnik nutzt die Vergrößerung und
damit die bessere Sedimentierung des Antigen-Antikör: er-Komplexes
aus. Hierbei reagiert ein zweiter Antikörper, der seinerseits gegen den Antigen-Antikörper-Komplex gerichtet
ist, unter Bildung eines sehr viel größeren hochmolekularen Komplexes. Bei dieser Methode ist die unspezifische
Bindung deutlich geringer als bei der PEG-Fällungsmethcde,nachteilig
ist jedoch die im Vergleich zur PEG-Fällung sehr geringe Präzipitation (Fällung/ des Doppelantikörperkomplexes.
Durch Zugabe kleiner Mengen dieses PEG-Fällungsmittels läßt sich die Doppelantikörpermethode
bisweilen verbessern.
Mit Ausnahme des Coated-Tube-Assays ist bei allen herkömmlichen
Methoden eine Zentrifugation erforderlich, was wegen der Anschaffungskosten für die Zentrifuge und des
Zeitaufwandes als nachteilig anzusehen ist.
Zusätzlich fallen bei allen bisherigen radio-immunologischen
Separationsverfahren radioaktive Flüssigkeiten an, die dekantiert bzw. aspiriert werden müssen, was neben
dem Zeitaufwand vor allem eine Kontaminationsgefahr mit sich bringt.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine neue
Trennvorrichtung für ein präzises Verfahren zur vollständigen Trennung des Antigen-Antikörper-Kbnplexes von der freien, ungebirsdenen
Antigen-Phase zu entwickeln, welche die Zentrifugation und das
Dekantieren bzw. Aspirieren erübrigt und gleichzeitig die Bindung der flüssigen Radioaktivität ohne Kontaminationsgefahr
an einen festen Träger ermöglicht, und die Kosten günstig und gleichzeitig umweltfreundlich sind-
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Diese Aufgabe wird durch eine trockene chroinatographische
Säule gelöst, wie sie in den Ansprüchen beschrieben xst
und sich für den Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung ergibt.
überraschenderweise war festgestellt worden, daß eine sichere und einfache Trennung vco. Antikörper—fintigen-Kcsplex und freien Anti—
gpsnen sowie im galle von ττ*ή-ϊo-Tntrarvvirrp«yfryn Bestintoungsver—
fahren auch noch eine vollständige Bindung der gesamten
Radioaktivität der Reageazlösung möglich wird, wenn man
nach erfolgter Inkubation in das flüssige Reaktionsgeniisch
eine geeignete troc!<ene, senkrecht stehende chroma
tographische Säule einführt ι in die das radioaktive
Reaktionsgeiaisch durch Kapillarkräfte vollständig eingesaugt
wird, wobei gleichzeitig die freie und die gebundene Phase weitestgehend voreinander getrennt werden.
Die Radioaktivität der unterschiedlichen Phasen kann anschließend beispielsweise im Gaimaacounter exakt gemessen
werden.
Die nähere Erläuterung der Erfindung und ihrer Vorteile
erfolgt nachfolgend im Rahmen der Figurenbeschreibung und eines konkreten Ausführungsbeispiels.
Es zeigen:
Fig. 1 in schematischer Schnittansicht eine bevorzugte
Ausführungsform der erfindungsgemäßen
trockenen Chromatographisehen Säule;
Fig. 2 eine schematische Schnittansicht einer anderen Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen trockenen
chrOmatographischen Säule;
Fig. 3 in Ansichten al bis fj die zus" isssunel
Bestimmung einer Substanz unter Verwendung der erxindungsgemäßen Säule erforderlichen wichtigsten
Ärbeitsschritte;
Fig. 4 eine typische Standardkurve, die durch Messung von Standardkonzentrationen erhalten
wurde und zur Bestimmung einer unbekannten Äntigenkonzentration herangezogen wird.
Erf indungsgeriäß erfolgt die Trennung der Äntigen-Anti- j
körper-Xomplexe von den freien, nicht an Antikörper ge- :
bundenen Antigenen bei der immunologischen Bestimmung ;
von Antigenen nach dem Radio-Immuno—Assay mit . . j
man einer besonderen trcckeneruchromatograpliischen Säule I
, wie sie in einer bevorzugten Ausführungsform iii Fig. 1 dargestellt ist. Eine erfindungsgemäße trockene,
chromatographische Säule besteht aus einem trockenen, feinverteilten, relativ inerten Material (1), das im
Verhältnis zu seiner Korngröße eine große Oberfläche aufweist, wodurch eine Adsorption und gleichzeitig eine
selektive Trennung von Antigen-Antikörper-Komplex und
freien Antigenen ermöglicht wird. Obwohl es denkbar ist, die Säule direkt als säulenförmigen Preßling aus einem
geeigneten Granulat herzustellen, ist es sowohl aus praktischen Gründen als auch zur Erzielung einer besseren
Trennwirkung bevorzugt, das Säulenmaterial mit mindestens einer oben und unten offenen, wasserfesten und
wasserdichten umhüllung zu versehen, in der das trockene
feinverteilte inerte Material (1) derart enthalten ist, daß es beim bestimmungsgemäßen Gebrauch der Säule unter
Eintauchen derselben in senkrechter Lage in ein inkubiertes Reaktionsgemisch nicht aus der Säule herausfallen
kann. Diese Sicherung des Säulenmaterials ist in gewisser
Abhängigkeit vom jeweils verwendeten Säulenmaterial in
verschiedener Weise möglich. In Fig. 1 ist eine trockene chromatographische Säule dargestellt, bei der als Säulenmaterial
(1) ein homogen verfilztes, kreppförmiges oder gewelltes Filterpapier mit hohem Reinheitsgrad verwendet
wird, das zu einer dichten runden Säule zusanEengerollt ist
und durch eine erste Umhüllung (2) in Form einer
wasserfesten und wasserdichten Polymerfolie in Säulenfors
fest zussEsengehalten wird. Es ergibt sich bei dieser
Ausführungsform von selbst, daß das als Säulenmaterial verwendete Kreppapier (1) bei einer senkrechten Anordnung
der Säule nicht aus der ümhüllungsfolie (2) herausrutschen
kann. Als Folie für die Umhüllung (2) kommt an sich jede inerte wasserfeste und wasserdichte Polymerfolie
ir· Frage. Als besonders vorteilhaft hat sich jedoch eine Umhüllung (2) aus einer Celluloseesterfolie/
insbesondere einer Ce?tuloseacetatfolie erwiesen. An
sich kann die durch das Säulenmaterial Kreppapier ί1) und die ümhüllungsfolie (2) gebildete Säule direkt in
dieser Form zum Aufsaugen des Reaktionsgemische= unter
Auftrennung in seine Komponenten verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt/ die von einer Folie (2) umhüllte
Säule in einer weiteren festen Umhüllung mit rundem Querschnitt(3) anzuordnen, die an beiden Seiten offen
ist, wobei das obere Ende jedoch bevorzugt durch eine Kappe (4) so abgedeckt ist, daß eir. nicht dichtenderVerschloß
erhalten wird, so daß am oberen Ende ein Druckausgleich zur Umgebung erfolgen kann. Die Anordnung des mit einer ersten
Umhüllung (2) versehenen Säulenmaterials (1) in einer zweiten, steifen rohrförmigen Umhüllung (3) mit einer
nicht luftdicht schließenden Kappe (4) hat den Vorteil, daß die mechanische Festigkeit der erhaltenen trockenen
Säule und damit deren Handhabbarkeit verbessert wird, und daß im Inneren des äußeren Umhüllungsrohres (3} mit
der nicht luftdicht schließenden Kappe (4) eine stabile
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Γ. J ■·
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Umgebung für das eigentliche Säulenmaterial (1) erhalten
wird, was bekanntlich die arbeit von chromatographischen
Trennsäulen und ihre Trennwirkung in der Regel verbessert- Die Abmessungen der inneren Säule aus dem trockenen '
inerten Material (1) mit der ersten Umhüllung (2) in Folienform sind dabei bevorzugt so auf die Abmessungen
der äußeren rohrförmigen Umhüllung (3) abgestimmt, daß das Material (1) mit seiner umhüllung (2? die Innenwand
der rohrförmigen äußeren umhüllung {3} leicht berührt, j
so daß die innere Säule nicht aus der äußeren Umhüllung j
(3) herausfällt/ selbst wenn man diese mit ihrem offenen j Ende nach unten anordnet. Durch leichtes Klopfen auf das f
Ende der steiferen äußeren Umhüllung (3) ist es aber ohne weiteres möglich, die innere Säule der äußeren Umhüllung
(3) zu entnehmen.
Die Abmessungen der gesamten in Fig. 1 dargestellten
Säulenanordnung sind dabei bevorzugt so, daß die ganze Anordnung in ein üblichesProbenröhrchen senkrecht hineingestellt
werden kann, ohne zu kippen oder in Schräglage zu kommen. Typische, für übliche Verwendungen bevorzugte
Maße für die Säulenanordnung betragen 50 bis 100 mm in Längsrichtung und 4 bis 6 mm im Durchmesser. Es können
jedoch auch für besondere Zwecke Säulenanordnungen mit anderen Abmessungen verwendet werden. Sollte es beispielsweise
erforderlich sein, ein relativ weites Probenröhrchen zu verwenden und gleichzeitig eine langgestreckte,
relativ dünne Säule, so kann die entsprechend^:· äußere steife - bevorzugt
Kunststoff-, z.B. PVC Umhüllung (3) mit Abstandhaltern versehen sein, die für die senkrechte Anordnung der Säule
im Probenröhrchen sorgen, oder es können besondere Halteteile vorgesehen sein, beispielsweise durchbohrte Stopfen,
zu einem Ring zusammenbiegbare gewellte Kunststoffteile, mit einer öffnung, die gebördelt sein kann, versehene
Deckel oder ähnliche/ auf verwandten Gebieten verwendete einfache
Elemente zur Aufrechterhaltur.g der senkrechten Anordnung
der Säulenanordnung gemäß Fig. 1 in einem Proberöhrchen.
Die Kappe (4) , die die äußere steife rohrförmige Umhüllung {2) nicht dicht abschließen darf, kann, wie in Fig. 1
dargestellt, ausgeführt sein, wobei zwischen dem eingeschobenen Teil der Kappe und der Innenwand der rohrförmigen
umhüllung (3) ein Spiel vorgesehen ist. Es sind aber beliebige andere nicht dicht schließende Ausführungsformen für die Kappe (4) möglich, beispielsweise Kappen
mit Einschubteilen, die Längsrippen oder Längskanäle aufweisen, außen auf die Umhüllung (3) aufschiebbare
Kappen mit Längsrippen oder Kanälen oder Kappen beliebiger Form mit kleinen öffnungen, bevorzugt in den seitlichen
Flächen der Kappen. Es ist dann möglich, relativ festsitzende Kappen zu verwenden, an denen die gesamte Säulenanordnung
gehalten und gehoben werden kann. Bevorzugt ist auch die Kappe (4) aus einem relativ steifen Kunststoff hergestellt.
In der eben unter Bezugnahme auf Fig. 1 geschilderten Ausführungsform war das Säulenmaterial (!) ein homogen
verfilztes, kreppförmiges Filterpapier hoher Reinheit, das dicht in Säulenform gerollt war. Für den Zweck der
vorliegenden Erfindung ist es besonders bevorzugt/ ein derartiges Material (1) zu verwenden, das aus reinen
Linters, d.h. kurzen Fasern von der Oberfläche von Baumwollsamen mit einem Polymerisationsgrad von 2000-3000
besteht und frei von löslichen Stoffen wie Leimen und von Lignin ist. Es kann jedoch auch ein anderes ligninfreies
Celluloseesterial wie beispielsweise Regeneratcellulose
mit einem Polymerisationsgrad von 800 bis 3000 verwendet werden. Die Verwendbarkeit verschiedener
möglicher trockener, inerter, feinverteilter Materialien als Säulenmaterialien für die vorliegende Erfindung
hängt in erster Linie von der Gleichmäßigkeit der Textur und von einer einheitlichen Saugfähigkeit des gesamten
Säulenmafcerials über die Höhe der Säule ab. Es
ist dabei von Vorteil, wenn das Material Poren in der Größenordnung von 1 bis 14 μπι aufweist.
Zu; Sicherung des eigentlichen Säulenmaterials (1),
das gegebenenfalls eine erste Umhüllung (2) aufweist, in der äußeren steifen Kunststoffumhüllung (3) sind an
sich auch andere konstruktive Ausfuhrungsformen möglich.
Außer der schon oben beschriebenen Sicherung durch Einpassen ist es z.B. auch möglich, zwischen dem eigentlichen Säulenmaterial
(1) mit der ersten Umhüllung (2) und der äußeren Umhüllung (3) einen gewissen Abstand vorzusehen, wobei in einem derartigen Fall
die innere Säule (1,2) gegen ein Herausfallen aus der äußeren Umhüllung (3) z.B. durch eine Schicht eines porösen Materials,
ein geeignetes Gitter, nach innen weisende Vorsprünge oder auch einen
Querstag oder dergleichen am unteren Ende der Umhüllung (3) gesichert sein kann.
Außer dem in Zusammenhang mit Fig. 1 beschriebenen Säulenmaterial
(1) in Form eines gerollten Filterpapiers, können auch eine Vielzahl von verschiedenen pulverförmigen Säulenmaterialien
verwendet werden. Voraussetzung für die Verwendung derartiger Pulvermaterialien ist dabei ebenfalls,
daß sie eine im Verhältnis zur Korngröße große Oberfläche aufweisen, inert sind und feinverteilt vorliegen. Die
Materialien können polare Substanzen wie Kieselgel und Aluminiumoxid sein, wobei sich trockenes Kieselgel und
Aluminiumoxid mit einer Porengröße von 0,01 bis 0,4 mm,
vorzugsweise 0,06 mm, als gut geeignet erwiesen, oder es können unpolare Substanzen wie hochreines Cellulosepulver
oder Holzkohle sein.
Pulverförmige Materialien müssen zur Erzielung guter,
reproduzierbarer Trennergebnisse sehr homogen gepackt sein. Fig. 2 zeigt eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen
trockenen chromatographischen Säule, die ein Säuleniiiaterial in Form eines Pulvers enthält. Das pulverförmige
Säulenmaterial C6) kann bei einer geeigneten Ausführungsform
unter kontinuierlicher Vibration in ein 50-100 mm langes PVC—Röhrchen (7) mit einem Durchmesser
von 4 bis 6 mm eingefüllt werden, wobei die kontinuierliche
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Vibration während des Einfüllens für eine gleichmäßige
Packung sorgt. Das bei der Ausführungsform gemäß Fig. 2 gezeigte Röhrchen (7), das die Umhüllung des Säulenmaterials
(6) bildet, kann dabei ein Röhrchen sein, wie es bei der Ausführungsform gemäß Fig. 1 als äußere Umhüllung
(3) verwendet wurde. Im Falle der Ausführungsform von Fig. 2 ist es erforderlich, durch besondere Maßnahmen
dafür zu sorgen, daß das pulverförmige Säulenmaterial (6) nicht aus dem Röhrchen (7) herausfallen
kann, wenn es beim Transport oder während des Gebrauchs senkrecht gestellt wird. Es hat sich in diesem Zusammenhang
als vorteilhaft erwiesen, die Enden eines Röhrchens (7) mit einem porösen, saugfähigenMaterial($) zu ΛΓβ^.οΙι1ϊθβεη,
beispielsweise mit einem Zellstoffstopfen o.dgl.
Zur weiteren Vereinfachung des eigentlichen radio-immunologischen
Bestimmungsverfahrens kann es ferner vorteilhaft, sein, auf das Säulenmaterial des Endabschnitts der Säule,
der in das Reaktionsgemisch taucht, eines der in konstanter Konzentration verwendeten Reagenzien aufzutragen.
Beispielsweise kann es vorteilhaft sein, die erforderliche Menge an Antikörper oder an markiertem Antigen (Tracer)
in den unteren Säulenabschnitt einzuimprägnieren und zu lyophilisieren. Es ist in einem solchen Falle nur noch
die Pipettierung der restlichen Substanzen, d.h. der Standards bzw. der Seren und Antikörper bzw. Tracer
erforderlich. Ein besonderer Vorteil wird erhalten, wenn man den radioaktiven Tracer an das poröse Material lyophilisiert,
da dann der freie Umgang mit radioaktivem Material und damit die Kontaminationsgefahr völlig vermieden
wird. Da es in der Praxis schwierig ist, eine kontinuierliche Säule abschnittweise definiert zu
imprägnieren bzw. auf der Säule auf homogene Weise Substanzen zu lyophilisieren/ ist es aus praktischen Gründen
bevorzugt, die Säule schichtweise aufzubauen, wobei die lyophilisierte Schicht und die Schicht aus neutralem
-♦•14·-
Säulenmaterial getrennt erzeugt werden und erst anschliessend
zu einer homogenen Säule vereinigt werden können.
Fig. 3 zeigt in schematischer Darstellung die an sich bekannten
Schritte eines Radio-Immuno-Assay, bei dem jedoch
eine erfindungsgemäße trockene chromatographische
Säule verwendet, wird, wie sie eben unter Bezugnahme auf
die FiJ. 1 und 2 beschrieben wurde. Das Verfahren läuft
generell - unabhängig davon, ob es sich um die Bestimmung der Eichkurve unter Verwendung einer Standardlösung
oder um die eigentliche Messung handelt - so ab, daß man in an sich bekannter üblicher Weise ein flüssiges
radioaktives Reaktionsgemisch aus Antikörper, markiertem und unmarkiertem Antigen sowie gegebenenfalls Hilfssubstanzen
erzeugt, dieses Gemisch die erforderliche Zeit inkubiert, und daß man dann die erfindungsgemäße trockene, chromatographische
Säule in das erhaltene Reaktionsgemisch eintaucht. Infolge der Wirkung von Kapillarkräften wird das Reaktionsgemisch
dann in die chromatographische Säule aufgesaugt. Da diese Säule so bemessen ist, daß sie das gesamte
Reaktionsgemisch aufnehmen kann, bleibt nach dem Eintauchen der chromatographischen Säule ein trockenes
Probenröhrchen zurück, um dieses gänzlich von zurückgebliebenen
Substanzen zu reinigen, und um ferner die während der Adsorption erfolgende Trennung in Antigen-Antikörper-Komplex
und freie Antigene zu verbessern, wird nach dem Aufsaugen der ursprünglichen Reaktionslösung
noch etwas destilliertes Wasser, beispielsweise in einer Menge von 1,0 ml, zugegeben, das ebenfalls von der
Säule aufgesaugt wird. Die Säule enthält nunmehr in schichtweiser Auftrennung die gesamte Reaktionsmischung,
und die Radioaktivität der verschiedenen Zonen der Säule kann exakt gemessen werden. Bei der bevorzugten
Ausführungsforin des erfindungsgemäßen Verfahrens taucht
die chroinatographische Säule mit ihrem unteren Ende | %
in die Reaktionsmischung, es ist jedoch ohne weiteres J
auch möglich, diese auf das obere Ende der Säule aufzu- |
geben. J i
überraschenderweise hat es sich herausgestellt, daß bei *,
Verwendung der erf indungsgeinäßen chromatographisehen
Säule in vielen Fällen eine solche Auftrennung des
Reaktionsgemischs erfolgt, daß der hochmolekulare Antigen- |
P Antikörper-Komplex nach oben in den oberen Säulenab- _ s§
schnitt wandert, während im Gegensatz zu den üblichen Erfahrungen und Erwartungen die niedermolekularen Bestandteile
(Ag, Ag'/ Ak) im unteren Säulenabschnitt zurückbleiben. Die Ursachen für diese ungewöhnliche Art
der 3indung an die Adsorbentien innerhalb der chromatographischen Säule sind nicht genau bekannt. Wahrscheinlich
überwiegen bei den bevorzugt verwendeten unpolaren Aasorbentien, insbesondere bei dem gerollten Filterpapier,
van der Waals' und hydrophobe Wechselwirkungen, die das Wanderungsverhalten erklären können, während bei den
polaren Adsorbentien ionische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken entscheidend sind.
Die iianunologische Bestininung läßt sich unter Verwendung der
erfindungsgeraäßen trockenen chromatographischen Säule
ist in der Praxis besonders einfach durchzuführen, wenn alle erforderlichen Reagenzien zusammen mit der Säule
in Form eines Testsatzes oder Kits bezogen werden, da bei derartigen Kits die Möglichkeit besteht, die Konzentrationen
und das Verhalten von Antikörpern, Standardantigenzubereitungen und markierten Antigenen genau aufeinander
abzustimmen, so daß optimale Ergebnisse erhalten werden- Die Kits werden spezifisch für die zu bestimmenden
Substanzen zusammengestellt und enthalten in
der Regel in definierten Konzentrationen Antikörper,
markierte Antigene, eine Seihe von Standard-Antigenzubereitungen,
gegebenenfalls Hilfssubstanzen wie Puffer
oder Substanzen zum Freisetzen der eigentlichen zu messenden Substanz sowie mindestens ein, in der Regel jedoch
mehrere, üblicherweise 100 erfindungsgemäße chromafcographische
Säulen. Derartige Kits können beispielsweise für die Bestimmung von Thyreotropin (TSH), Trijodthyronin
(T3), Tetrajodthyronin (T4), Progesteron/ Östriol, Lutropin, Follitropin, Cortisol, Digoxin u.a.
ausgelegt sein.
Nachfolgend wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Säule anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels noch näher erläutert
.
Bestimmung von Thyreotropin (TSH) durch Radio-Immuno-Assays:
Zur Bestimmung des Thyreoidea stimulierenden
Hormons (TSH) Thyreotropin werden die folgenden, alle in einem erfindungsgemäßen Kit enthaltenen Reagenzien
verwendet:
1. Antiserum: Das hochspezifische Antiserum gegen TSH
wurde durch Immunonisierung von Kaninchen mit hochgereinigten humanem Thyreotropin gewonnen. Die Kreuzreaktion
mit anderen Hypophysenhormonen ist unbedeutend. Ein Kit enthält 22 ml Antiserum.
125
2. Mit J markiertes TSH (Tracer), 11 ml. Das markierte
TSH liegt in einer gebrauchsfertigen Lösung in Puffer vor.
3. TSH-Standards, lyophilisiert, 1,0 ml/Flasche. Hoch-
gereinigtes humanes TSH, lyophilisiert in TSH—freiem
i
HisaansenM, kalibriert mit der WHO First International
Reference Preparation of Thyreoid Stimulating Hormon, Sin Kit enthält 8 Standards mit folgenden Konzentrationen
(μ.ϋ/ΐη1) : 0,1,2,5,10,25,50,75.
4. Trockene chromatographische Trennsäulen, die als Säulenmaterigl
ein gekrepptes Filterpapier von hohem Reinheitsgrad enthalten, das eine homogene Verfilzung aufweist
und aus reinen Linters besteht und frei von löslichen Stoffen ist. Das Säulenmaterial ist in einer
oben und unten offenen Umhüllung aus Cellulese-Acetatfolie
angeordnet, und die erhaltene patronenartige Säule ist >n eindurch eine lose sitzende Kappe ctbgedecktes
rundes Knststoffröhrchen eingeschoben.
5. Puffer, 25 ml, gebrauchsfertige Lösung.
Zur Bestimmung einer unbekannten Menge von TSH werden zu Serumsproben von 20 bis 600 μΐ, vorzugsweise 100 ul, 0,1 ml TSH-
Antikörper zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 2
Stunden bei 37°C oder über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend werden 0,1 ml Tracer (markiertes
TSH-Antigen) hinzugefügt, und es wird noch einmal 2 Stunden bis zur Einstellung des Reaktionsgleichgewichts
inkubiert. Nach Erreichen des Reaktionsgleich- | gewichts erfolgt die Trennung der gebundenen Phase,
d.h. des Antigen-Antikörper-Komplexes von der freien Phase, d.h. den nichtgebundenen Antigenen und Antikörpern
dadurch, daß die trockene Chromatographisehe
Säule senkrecht in das flüssige radioaktive Reaktions-
gemisch eingetaucht wird- Die im Probenröhrchen enthaltene
Flüssigkeit wird vollständig von der Säule aufgesaugt, um die Trennung während der Adsorbtion
zu verbessern, werden nach dem vollständigen Aufsaugen noch einmal 1,0 ml destilliertes Wasser zugesetzt.
Das Wasser wird ebenfalls von der Säule aufgesaugt.
Es zeigte sich, da£ im unteren Abschnitt der chromaccgraphischen
Säule die freie Phase gebunden ist/
während sich die gebundene Phase räumlich davon getrennt im oberen Säulenbereich befindet. Die Radioaktivität
der verschiedenen Phasen konnte im Gansmacounter exakt gemessen werden.
Die Auswertung der Meßergebnisse erfolgte unter Verwendung
einer Eichkurve aus 6 Standards. Zur Erstellung d&r Standard-Eichkurve wurde die gemessenen Prozent-Bindung
gegen die entsprechende Standardkonzentration nach der Spline-Approximation-Standartkurve aufgetragen.
Eine typische Standaid kurve (Mittelwert + 2fache
Standardabweichung) ist in Abbildung 4 dargestellt.
In abbildung 4 ze.1gt das schraffierte Rechteck den
Bereich der maximalen Empfindlichkeit des Bestimmungs-
verfahrens, die nach dem Nullwert unterschieden werden
kann (Bo-3S). Der Mittelwert zur Bestimmung der Nachweisempfindlichkeit
liegt bei 0,1 nU/ml TSH, d.h. TSH Konzentrationen unterO,2 μϋ/ml TSH können ebenfalls mit guter
Reproduzierbarkeit gemessen werden. Die Bestimmung der Intercept-Werte gibt an, ob das Verhältnis der einzelnen
Testkomponenten (Ak, Ag, Ag1) und die Diskriminierungsfähigkeit des Testsystems in einem idealen Bereich liegen.
Die gefundenenTSH-Werte für den 90 %- und den 50 %-Intercentpunkt
liegen mit 0,5 bis 1,5 μϋ/ml TSH bzw. 15 bis 25 Hü/ml TSH im optimalen Bereich. Die Wiederfindung zugesetzter
TSH-Mengen verläuft über den gesamten Meßbereich annähernd linear. Die relative Wiederfindung schwankt
Als ein wichtiger erwünschter Nebeneffekt der radioimmunologischen
Bestimmungen mit der erfindungsgemäßen Säule ist anzusehen, daß die gesamte Radioaktivität der
Probe zusammen mit dem Reaktionsgemisch in die Säule aufgesaugt wurde. Nach der Auszählung der Probe liegt
somit die Radioaktivität in einer bequem handhabbaren
Form vor und die Gefahr einer Kontaminierung mit Resten des flüssigen Reaktionsgemischs ist gegenüber den üblichen
Verfahren stark gesenkt, auch wenn der
15 körper stationär an eine Trägersubstanz innerhalb
P des Proberöhrchen gebunden ist, wird die gesamte flüssige
Radioaktivität in der Säule absorbiert und dabei werden gleichzeitig die freien Antigene im unteren Säulenabschnitt
gebunden. In diesem Fall verbleibt der Antigen-Antikörper-Komplex innerhalb des flüssigkeitsfreien
Probenröhrchens an die Trägersubstanz gebunden und kann nach Herausnahme der Säule geinessen werden. Es ist darauf
hinzuweisen, daß die erfindungsgemäßen trockenen chromatographischen
Säulen so preiswert hergestellt werden können,
daß sie auch zum Aufsaugen von ähnlichen radioaktiven Gemischen verwendet werden können, die nicht ausgezählt
werden sollen, sondern die nur unschädlich gemacht werden sollen.
Obwohl in der obenstehenden Beschreibung die Erfindung unter einen Radio-Immuno-Assay beschrieben wurde, ist es für den
Fachmann aufgrund der für ihn gut übersehbaren Wirkung einer Trennung
mit einer erfindungsgemäßen chromatographischen Säule selbstverständlich, daß diese Säule eine Trennung aller anderen bei immonulogischen
Bestimmungsverfahren erhaltenen Gemische ermöglicht, daß sie also genauso für fluoraszenz- und enzymimmunologische
Untersuchungsverfahren geeignet ist.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das
. Separationsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen
trockenen Säule äußerst präzise und im Vergleich zu den bisher bekannten Trennverfahren
für radio-immunologische Bestimmungen einfacher, wirtschaftlicher und umweltfreundlicher ist, und daß
es aufgrund seiner Anwendbarkeit für andere immunologische Untersuchungen auch sehr vielseitig ist.
-Jl-
Trockene chromatographische· Säule für ein vereinfachtes
Separatiönsverfahren für immunologische Bestimmungen
Zu saramenfassung
Bei dem Separationsverfahren für die Trennung von Antigen-Antikörper-Komplexen
von freien Antigenen bei immunologischen Bestimmungen erfolgt äis Trennung technisch einfach
dadurch, daß das flüssige Reaktionsgemisch mit einer trockenen, senkrecht angeordneten chromatographischen
Säule zusammengebracht wird, welche das flüssige Reaktionsgemisch bevorzugt mit ihrem xinteren Ende vollständig einsaugt und dabei gleichzeitig die gebundene
und freie Phase im oberen bzw. unteren Säulenabschnitt räumlich voneinander trennt.
Claims (1)
- ^Ü ifi '& ΞΕΗΤΕΙ«OFZ. WOLFGANG IPATENTANWALTVON 1927 -1975 J □R. PAUL DEUFEL. DIPL.-CHSM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL, DIFL.-PHYS-G 3200 An/OpDr. Armin Gilak
Siochusstraße 137
5300 Bonn-Duisdorf,Trockene Chromatograph!sehe Säule für ein vereinfachtes Separationsverfahren für immunologische BestimmungenSchutzansprücheTrockene chromatographische Säule zum Separieren der Antigen-Antikörper-Komplexe von den freien, nicht an Antikörper gebundenen Antigenen und/oder zur vollständigen Bindung aller radioaktiven Substanzen bei der immunologischen Bestimmung von Antigenen bzw. ßaptenen nach radio-, fluoreszenz- oder enzym-immunologischen Bestimmungsmethoden, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem trockenen, feinverteilten inerten Material (1) mit einer im Verhältnis zur Korngröße großen Oberfläche besteht, das von mindestens eirter oben und unten offenen wasserfesten und wasserdichten Umhüllung (2,3) umgeben ist und das gegen ein Herausfallen aus der zum Reaktionsgemisch offenen Umhüllung (2,3) bei der senkrechten Anordnung der Säule in einem Reaktionsgemisch gesichert ist.• MUN1CHEN SS, S1EBERTSTR. 4 ' POB**6rf7jd.·. Ki35EL,-,ft!UESpf\\f ■ ΛΕΙ« (089) 474005 · TELECOPIER XEROX 400 - TELEX 5-242852- Säule nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das trockene Material (1) ein homogen verfilztest krepoförmiges und zu einer dichten Säule gerolltes Filterpapier mit hohem Reinheitsgrad oder ein reines, gleichmäßig gepacktes Cellulose-Pulver ist.3. Säule nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Material (1) aus reinen Linters, d.h. kurzen Fasern von der Oberfläche der Baumwollsamen mit einem Polymerisationsgrad von 2000 bis 3000, oder aus Regeneratcellulose mit einem P'^lyiuerisationsgrad von 800 bis 3000 besteht und frei von löslichen Stoffen ist.4. Säule nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß das trockene Material (1) eine gleichmäßige Textur mit Poren in der Größenordnung von 1 bis 14 Jim und eine über die Höhe der Säule einheitliche Saugfähigkeit aufweist.5 . Säule nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie ein inertes trockenes polares Material(6) wie Kieselgel oder Aluminiumoxid mit einer Porengröße von 0,01 bis 0,4 mm, vorzugsweise 0,06 mm, enthalt.6- Säule nach einem der Ansprüche 2 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, daß das Filterpapier (1) von einer oben und unten offenen Umhüllung (2) aus einer wasserfesten und wasserdichten Polymerfolie fest in Säulenfcrm zusammengehalten ist,7. Säule nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerfolie eine wasserfeste und wasserdichte Celluloseacetatfolie ist.'8. Säule nach Anspruch 6 oder1 7 , dadurch gekennzeichnet/ daß das mit einer Polymerfolie U) umhüllte Filterpapier (1) in ein steifes,- beidseitig offenes rundes Kunststoff röhrchen (3) eingeschoben ist, das an seinem oberenEnde durch eine nicht dicht schließende Kappe (4) abgedeckt ist/ so eingeschoben ist, daß die Umhüllung (2) die Innenwände des Röhrchens (3) berührt.9. Säule nach Anspruch δ, dadurch gekennzeichnet, daß das Kunststoffröhrchen (3) einen solchen Durchmesser aufweist, daß es in ein übliches Probenröhrchen eingeführt werden kann und von diesem in senkrechter Anordnung ; gehalten wird. j10- Säule nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, daß das Kunststoffröhrchen (3) Abstands- und/oder Führungselemente aufweist, die seine senkrechte Anordnung in einem Probenröhrchen gewährleisten.11. Säule nach einem der Ansprüche 1 bis 1O-7 dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Länge von 50 bis 100 mm und einen Durchmesser von 4 bis 6 mm aufweist.12. Säule nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Material (1) eine homogene oder aus einer Abfolge von Schichten bestehende Mischung von polaren oder unpolaren Materialien ist.13. Säule nach einem der Ansprüche "1 bis 12 , dadurch gekennzeichnet, daß einer der Endabschnitte des Materials(1) mit der für die jeweilige Bestimmung erforderlichen Menge von Antikörpern oder Antigenen, die mit Isotopen, Enzymeni fluoreszierenden oder anderen Substanzen markiert sein können, imprägniert und lyophilisiert ist.14 - Säule nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der mit lyophilisierten Substanzen beladene Endabschnitt und der nichtbeladene Abschnitt des Säulenniaterials (1) zwei verschiedene kurze Säulen sind, die nachträglich zu einer Gesamtsäule vereinigt wurden.
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DE19828213161 DE8213161U1 (de) | 1982-05-06 | 1982-05-06 | Trockene chromatographische saeule fuer ein vereinfachtes separationsverfahren fuer immunologische bestimmungen |
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