DE69938054T2

DE69938054T2 - Antikörpervarianten mit höheren bindungsaffinitäten im vergleich zu parentalen antikörpern

Info

Publication number: DE69938054T2
Application number: DE69938054T
Authority: DE
Inventors: Yvonne M. San Mateo CHEN; Henry B. El Granada LOWMAN; Yves Muller
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-11-18
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2019-11-17
Also published as: US20190202902A1; CA2347833A1; US20170096480A1; AU1728800A; DK1135498T3; ATE384792T1; EP1135498B1; US6632926B1; EP1135498A1; US8703133B2; US20090010925A1; US20150284458A1; US20040086502A1; JP2002530081A; US20070280931A1; ES2301254T3; US20100047236A1; PT1135498E; WO2000029584A1; DE69938054D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Herstellung von Anti-VEGF-Antikörpervarianten. Im Speziellen werden Anti-VEGF-Antikörpervarianten von Eltern-Antikörpern geoffenbart, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in eine hypervariable Region des Eltern-Antikörpers insertiert sind und die eine Bindungsaffinität für ein Zielantigen aufweisen, welche zumindest etwa zweimal stärker ist als die Bindungsaffinität des Eltern-Antikörpers für das Antigen.
Beschreibung verwandter Gebiete
Antikörper sind Proteine, die Bindungsspezifität für ein bestimmtes Antigen aufweisen. Native Antikörper sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine mit etwa 150.000 Dalton, die aus zwei identischen leichten (L-)Ketten und zwei identischen schweren (H-)Ketten bestehen. Jede leichte Kette ist über eine kovalente Disulfidbindung an eine schwere Kette gebunden, wobei die Anzahl an Disulfidbindungen zwischen den schweren Ketten je nach Immunglobulin-Isotyp variiert. Jede schwere und leichte Kette weist außerdem in regelmäßigen Abständen Disulfidbrücken innerhalb der Kette auf. Jede schwere Kette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_H) gefolgt von einer Reihe von konstanten Domänen auf. Jede leichte Kette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_L) und am anderen Ende eine konstante Domäne auf; die konstante Domäne der leichten Kette ist in einer Linie mit der ersten konstanten Domäne der schweren Kette ausgerichtet, und die variable Domäne der leichten Kette ist in einer Linie mit der variablen Domäne der schweren Kette ausgerichtet. Es wird davon ausgegangen, dass bestimmte Aminosäurereste eine Schnittstelle zwischen den variablen Domänen der leichten und schweren Kette bilden.
Die Bezeichnung „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass sich bestimmte Abschnitte der variablen Domänen zwischen Antikörpern stark in ihrer Sequenz unterscheiden und für die Bindungsspezifität jedes einzelnen Antikörpers für sein jeweiliges Antigen verantwortlich sind. Die Variabilität ist jedoch nicht gleichmäßig über die variablen Domänen von Antikörpern verteilt. Sowohl in den variablen Domänen der leichten Kette als auch in jenen der schweren Kette konzentriert sie sich in drei Segmenten, die als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) bezeichnet werden. Die höher konservierten Abschnitte der variablen Domänen werden als Gerüstregionen (FR) bezeichnet. Die variablen Domänen von nativen schweren und leichten Ketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die größtenteils eine β-Blatt-Konfiguration aufweisen, welche durch drei CDRs verbunden sind, die Schleifen bilden, welche die β-Faltblatt-Struktur verbinden und in manchen Fällen sogar einen Teil davon bilden. Die CDRs in den einzelnen Ketten werden durch die FR-Regionen sehr eng beieinander gehalten und tragen, mit den CDRs von der anderen Kette, zur Bildung der Antigenbindungsstelle von Antikörpern bei (siehe Kabat et al., Sequenzces of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (1991)).
Die konstanten Domänen sind nicht direkt an der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt, weisen aber verschiedene Effektorfunktionen auf. Je nach Aminosäuresequenz der konstanten Region ihrer schweren Ketten können Antikörper oder Immunglobuline unterschiedlichen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und einige davon können weiter in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, wie z. B. IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4; IgA1 und IgA2. Die konstanten Regionen der schweren Kette, die den verschiedenen Immunglobulinklassen entsprechen, werden als α, δ, ε, γ bzw. μ bezeichnet. Von den verschiedenen menschlichen Immunglobulinklassen ist lediglich von menschlichem IgG1, IgG2, IgG3 und IgM bekannt, dass sie komplementaktivierend sind.
In vivo wird eine Affinitätsreifung durch eine Antigenselektion von Antikörpervarianten mit höherer Affinität angetrieben, die hauptsächlich durch somatische Hypermutagenese erzeugt werden. Häufig findet auch eine „Repertoireverschiebung" statt, bei der sich die vorherrschenden Keimbahngene der sekundären oder tertiären Antwort von jenen der primären oder sekundären Antwort unterscheiden.
Mehrere Forschungsgruppen haben versucht, den Affinitätsreifungsprozess des Immunsystems nachzuahmen, indem sie Mutationen in vitro in Antikörpergene einbrachten und die Affinitätsselektion zur Isolation von Mutanten mit verbesserter Affinität nutzten. Solche Antikörpermutanten können auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen präsentiert sein, und Antikörper können durch ihre Affinität für ein Antigen oder durch ihre Dissoziationskinetik (off-rate) von einem Antigen selektiert werden. Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889–896 (1992). Eine CDR-Walking-Mutagenese wurde zur Affinitätsreifung von menschlichen Antikörpern eingesetzt, welche das menschliche Hüllglykoprotein gp120 des Humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) (Barbas III et al., PNAS (USA) 91, 3809–3813 (1994); und Yang et al., J. Mol. Biol. 254, 392–403 (1995)); und ein Anti-c-erbB-2-Einkettenantikörperfragment binden (Schier et al., J. Mol. Biol. 263, 551567 (1996)). Antikörperketten-Shuffling und die CDR-Mutagenese wurden zur Affinitätsreifung eines hochaffinen menschlichen Antikörpers eingesetzt, der gegen die dritte hypervariable Schleife von HIV gerichtet war (Thompson et al., J. Mol. Biol. 256, 77–88 (1996)). Balint und Larrick, Gene 137, 109–118 (1993), beschreiben ein Verfahren, das sie als „sparsame Mutagenese" bezeichnen, welches computergestützte oligodesoxyribonucleotidgerichtete Scanning-Mutagenese umfasst, wodurch alle drei CDRs eines Gens für eine variable Region gleichzeitig und genau auf verbesserte Varianten durchsucht werden. Wu et al. führten eine Affinitätsreifung eines ανβ3-spezifischen humanisierten Antikörpers unter Einsatz einer anfänglich eingeschränkten Mutagenesestrategie durch, bei der jede Position alter sechs CDRs mutiert wurde, gefolgt von der Expression und vom Screenen einer kombinatorischen Bibliothek, welche die Mutanten mit der höchsten Affinität umfasste (Wu et al., PNAS (USA) 95, 6037-6-42 (1998)). Phagenantikörper sind in Chiswell and McCafferty, TIBTECH 10, 80–84 (1992); und Ra der und Barbas III, Current Opinion in Biotech. 8, 503–508 (1997), beschrieben. Immer wenn in der oben genannten Literatur Antikörpermutanten mit verbesserter Affinität mit einem Eltern-Antikörper verglichen werden, weist die Antikörpermutante Aminosäuresubstitutionen in einer CDR auf.
Feeney et al (J. Immunol. 143, 4061–4068 (1989)) beschreiben Versuche, bei denen Mäuse mit Phosphorylcholin immunisiert wurden und die Sequenz und Bindungseigenschaften der in der primären und sekundären Antwort produzierten Antikörper untersucht wurden.
Wilson et al. (J. Exp. Med. 187(I), 59–70 (1998)) beschreiben die Wirkungen von zufallsbestimmten Insertions- und Deletionsvorgängen in einem somatisch mutierten Vh-Gen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Anders als die affinitätsgereiften Antikörper der oben genannten Literaturverweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Anti-Gefäßendothelwachstumsfaktor-(Anti-VEGF-)Antikörpervariante eines Eltern-Antikörpers bereit, wobei das Verfahren die Insertion von zwei bis zehn Aminosäureresten in eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) H3 einer variablen Schwerketten-Domäne des Eltern-Antikörpers umfasst, worin die Anti-VEGF-Antikörpervariante eine Bindungsaffinität für Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) aufweist, die zumindest zweimal stärker ist als die Bindungsaffinität des Eltern-Antikörpers, und worin zumindest einer der insertierten Reste Arginin oder Lysin ist oder die Insertion sich angrenzend an Rest Nr. 100 der variablen Schwerkettendomäne des Elternantikörpers befindet, wobei die Restenummerierung der variablen Domäne gemäß Kabat verwendet wurde.
Die Erfindung stellt weiters eine Ante-Gefäßendothelwachstumsfaktor-(Anti-VEGF-)Antikörpervariante eines Eltern-Antikörpers bereit, wobei die Anti-VEGF-Antikörper variante eine Aminosäureinsertion in der oder angrenzend an eine komplementaritätsbestimmende(n) Region (CDR) H3 einer variablen Schwerkettendomäne des Eltern-Antikörpers umfasst, worin die Anti-VEGF-Antikörpervariante eine Bindungsaffinität für Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) aufweist, die zumindest zweimal stärker ist als die Bindungsaffinität des Eltern-Antikörpers, und worin die CDR H3 der variablen Schwerkettendomäne der Anti-VEGF-Antikörpervariante eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Seq.-ID Nr. 85, Seq.-ID Nr. 53, Seq.-ID Nr. 86, Seq.-ID Nr. 78, Seq.-ID Nr. 54 und Seq.-ID Nr. 89 ausgewählt ist.
Diese CDR-H3-Sequenz kann beispielsweise in der variablen Schwerkettendomäne der Seq.-ID Nr. 98 oder 99 bereitgestellt sein; siehe 1B. Vorzugsweise umfasst die Antikörpervariante weiters eine variable Leichtkettendomäne und bindet ein VEGF-Antigen mit stärkerer Bindungsaffinität als Y0192 (siehe 1A und 1B; Seq.-ID Nr. 95 und 96).
Verschiedene Formen der Antikörpervariante werden hierin erwogen. Beispielsweise kann die Antikörpervariante ein Antikörper voller Länge (z. B. mit einer konstanten Region eines menschlichen Immunglobulins) oder ein Antikörperfragment (z. B. ein F(ab')2) sein. Weiters kann die Antikörpervariante mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein, auf einer Festphase immobilisiert sein und/oder mit einer heterologen Verbindung konjugiert sein (wie z. B. ein zytotoxisches Mittel).
Weiters stellt die Erfindung Folgendes bereit: eine isolierte Nucleinsäure, die für die beanspruchte Antikörpervariante kodiert; einen Vektor, der die Nucleinsäure umfasst, gegebenenfalls operabel an Kontrollsequenzen gebunden, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden; eine Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert ist; ein Verfahren zur Herstellung der Antikörpervariante, welches die Kultivierung dieser Wirtszelle, sodass die Nucleinsäure exprimiert wird, und gegebenenfalls Gewinnung der Antikörpervariante aus der Wirtszellkultur (z. B. aus dem Wirtszellkulturmedium) umfasst.
Die Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung bereit, welche die beanspruchten Antikörpervarianten und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner umfasst. Diese Zusammensetzung für therapeutische Anwendungen ist steril und kann gefriergetrocknet werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B zeigen eine Sequenzanordnung der variablen Region der leichten Kette (1A) und der variablen Region der schweren Kette (1B) verschiedener Varianten des humanisierten Anti-VEGF-Antikörper-F(ab)-12. Der Eltern-Fab-Phagenklon Y0192 enthält Leichtkettenmutationen, welche die Antigenbindungsaffinität nicht signifikant beeinflussen, und wurde schon beschrieben ( WO98/45331 ). Eine weitere Variante, Y0238-3, enthält Mutationen in der CDR H1, welche die Antigenbindung verbessern ( WO98/45331 ). Die Variante Y0239-19 enthält das Motiv „VNERK", das in Selektionen aus hierin beschriebenen CDR-H3-Insertionsbibliotheken identifiziert wurde. Die Variante Y0313-2 enthält die CDR-H1-Mutationen von Y0238-3 mit den CDR-H3-Mutationen von Y0239-19 kombiniert. Unterschiede zu F(ab)-12 sind durch grau unterlegte Kästchen hervorgehoben. Die Sequenzidentifikatoren in 1A und 1B sind die folgenden: variable Leichtkettendomäne von F(ab)-12 (Seq.-ID Nr. 94); variable Leichtkettendomäne von Y0192, Y0238-3, Y0239-19 und Y0313-2 (Seq.-ID Nr. 95); variable Schwerkettendomäne von F(ab)-12 und Y0192 (Seq.-ID Nr. 96); variable Schwerkettendomäne von Y0238-3 (Seq.-ID Nr. 97); variable Schwerkettendomäne von Y0239-19 (Seq.-ID Nr. 98); und variable Schwerkettendomäne von Y0313-2 (Seq.-ID Nr. 99).
2 zeigt die Hemmung von VEGF-Aktivität in einem zellbasierten Bioassay durch Fab, F(ab)-12 und die Fab-Variante Y0313-2.
3 zeigt einen Abschnitt des dreidimensionalen Modells von F(ab)-12 in einem Komplex mit VEGF, bestimmt durch Röntgenkristallographie (Muller et al., Structure 6(9): 1153–1167 (1998)). Die Hauptkettenspur der CDR-H3-Region des Antikörpers ist rechts als magentarote Schleife dargestellt. Eine Darstellung der Oberfläche eines Abschnitts von VEGF ist auf der linken Seite zu sehen, wobei mehrere proximale Reste rot (sauer) oder violett (sauer) hervorgehoben sind. Die Seitenkette von D41 von VEGF kann als mögliche Wechselwirkungsstelle mit einem hypothetischen Insertionspeptid angesehen werden, das in die CDR H3 platziert wird.
4 zeigt eine Überlagerung von Abschnitten des dreidimensionalen Modells von F(ab)-12 in einem Komplex mit VEGF (beide Moleküle grau dargestellt; Muller et al., w. o.) und eines Modells der Insertionsvariante Fab Y0313-2 (grün) in einem Komplex mit VEGF (gelb). Das letztere Modell basiert auf einer röntgenkristallographischen Bestimmung der hierin beschriebenen Variantenkomplexstruktur. Die Figur veranschaulicht, dass in diesem Komplex im Vergleich zum F(ab)-12-Komplex nur geringe strukturelle Veränderungen zu sehen sind, mit Ausnahme der nächsten Umgebung der Mutationen V104, N104a, E104b, R104c und K105.
5 zeigt einen Vergleich zwischen Abschnitten des dreidimensionalen Modells von F(ab)-12 in einem Komplex mit VEGF (rechts; Muller et al., w. o.) und einem Modell von Fab Y0313-2 in einem Komplex mit VEGF (links) wie hierin beschrieben. In jedem Fall ist VEGF gelb dargestellt, und das jeweilige Fab ist grün dargestellt. im Y0313-2-Komplex ist erkennbar, dass V104 und R104c neue Kontakte mit VEGF bilden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Definitionen
Die Bezeichnung „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und deckt im Speziellen monoklonale Antikörper (einschließlich monoklonaler Antikörper voller Länge), polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper) und Antikörperfragmente ab, solange diese die gewünschte biologische Aktivität aufweisen.
Die Bezeichnung „hypervariable Region", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf jene Regionen einer variablen Antikörperdomäne, deren Sequenz hypervariabel ist und/oder die strukturell definierte Schleifen bilden. Die hypervariable Region umfasst Aminosäurereste von einer „komplementaritätsbestimmenden Region" oder „CDR" (d. h. die Reste 24–34 („CDR L1"), 50–56 („CDR L2") und 89–97 („CDR L3") in der variablen Leichtkettendomäne sowie 31–35 („CDR H1"), 50–65 („CDR H2") und 95–102 („CDR H3") in der variablen Schwerkettendomäne; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (1991)) und/oder die Reste von einer „hypervariablen Schleife" (d. h. die Reste 26–32 („Schleife L1"), 50–52 („Schleife L2") und 91–96 („Schleife L3") in der variablen Leichtkettendomäne sowie 26–32 („Schleife H1"), 53–55 („Schleife H2") und 96–101 („Schleife H3") in der variablen Schwerkettendomäne; Chothia und Lesk; J. Mal. Biol, 196, 901–917 (1987)). In beiden Fällen sind die Reste der variablen Domäne gemäß Kabat et al., w. o., nummeriert. „Gerüst"- oder „FR"-Reste sind jene Reste variabler Domänen, die keine Reste hypervariabler Regionen wie hierin definiert sind.
Der Ausdruck „Restenummerierung der variablen Domäne wie in Kabat" bezieht sich auf das Nummerierungssystem, das für variable Schwerkettendomänen oder variable Leichtkettendomänen der Zusammenstellung von Antikörpern in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (1991), verwendet wurde. Bei Anwendung dieses Nummerierungssystems kann die tatsächliche lineare Aminosäuresequenz weniger oder zusätzliche Aminosäuren enthalten, die einer Verkürzung einer oder Insertion in eine FR oder CDR der variablen Domäne entspricht. Beispielsweise kann eine variable Schwerkettendomäne ein einzelnes Aminosäureinsert (Rest 52a gemäß Kabat) nach dem Rest 52 der CDR H2 und insertierte Reste (z. B. die Reste 82a, 82b und 82c usw. gemäß Kabat) nach dem Schwerketten-FR-Rest 82 enthalten. Die Kabat-Nummerierung von Resten kann für einen vorgegebenen Anti körper bestimmt werden, indem anhand von Regionen angeordnet wird, in denen eine Homologie zwischen der Sequenz des Antikörpers und einer gemäß Kabat nummerierten „Standard"-Sequenz vorhanden ist.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines Antikörpers voller Länge, vorzugsweise die antigenbindende oder variable Region davon. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper; einkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten.
Die Bezeichnung „monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen ist, d. h. dass die einzelnen, die Population bildenden Antikörper bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, die in geringem Ausmaß vorhanden sein können, identisch sind. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch, da sie gegen einen einzigen antigenen Ort gerichtet sind. Außerdem ist jeder monoklonale Antikörper, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise unterschiedliche Antikörper enthalten, die gegen unterschiedliche Determinanten (Epitope) gerichtet sind, gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet. Das Attribut „monoklonal" gibt den Charakter des Antikörpers dahingehend an, dass er von einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern stammt, und ist nicht so aufzufassen, dass die Produktion des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren erforderlich ist. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper durch das Hybridomverfahren, das von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), zum ersten Mal beschrieben wurde, oder durch DNA-Rekombinationsverfahren (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.816.467 ) hergestellt werden, Die „monoklonalen Antikörper" können auch unter Anwendung der beispielsweise in Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol, 222, 581–597 (1991), beschriebenen Verfahren aus Phagenantikörperbibliotheken isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen im Speziellen „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Abschnitt der schweren und/oder leichten Kette mit/zu entsprechenden Sequenzen in Antikörper identisch oder homolog ist, die von einer bestimmten Spezies stammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -subklasse gehören, während der Rest der Kette(n) mit/zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern identisch oder homolog ist, die von anderen Spezies stammen oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -subklasse gehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange diese die gewünschte biologische Aktivität aufweisen ( US-Patent Nr. 4.816.567 ; und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)).
„Humanisierte" Formen von nichtmenschlichen (z. B. Maus-)Antikörpern sind chimäre Antikörper, die eine Mindestsequenz enthalten, die von nichtmenschlichem Immunglobulin stammt. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipientenantikörper), in denen Reste von einer hypervariablen Region des Rezipienten durch Reste von einer hypervariablen Region einer nichtmenschlichen Spezies (Donorantikörper), wie z. B. einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens oder eines nichtmenschlichen Primaten, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen sind Reste der Fv-Gerüstregion (FR) des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nichtmenschliche Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die im Rezipientenantikörper oder im Donorantikörper nicht vorkommen. Diese Modifikationen werden zur weiteren Verbesserung der Antikörperwirkung durchgeführt. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle aus zumindest einer, typischerweise zwei, variablen Domänen, worin alle oder im Wesentlichen alle hypervariablen Schleifen jenen eines nichtmenschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst gegebenenfalls außerdem zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc), typischerweise von einem menschlichen Immunglobulin. Für weitere Details siehe Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct, Biol. 2, 593–596 (1992).
„Einkettige Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Domäne eines Antikörpers, wobei diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette enthalten sind. Im Allgemeinen umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen der V_H- und V_L-Domäne, wodurch das sFv in der Lage ist, die gewünschte Struktur für eine Antigenbindung zu bilden. Für eine Übersicht über sFv siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, S. 269–315, Rosenburg und Moore, Hrsg., Springer-Verlag, New York, USA (1994).
Die Bezeichnung „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei antigenbindenden Stellen, wobei die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) an eine variable Leichtkettendomäne (V_L) in der gleichen Polypeptidkette gebunden umfassen (V_H – V_L). Durch den Einsatz eines Linkers, der zu kurz ist, sodass eine Paarbildung zwischen den beiden Domänen auf der gleichen Kette möglich ist, werden die Domänen gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu einem Paar zu verbinden und zwei antigenbindende Stellen zu bilden. Diabodies sind beispielsweise in der EP 404.097 ; der WO 93/11161 ; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), näher beschrieben.
Die Bezeichnung „lineare Antikörper”, wie sie in der gesamten Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf die in Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 (1995), beschriebenen Antikörper. Kurz gesagt umfassen diese Antikörper ein Paar von Tandem-Fd-Segmenten (V_H-C_H1-V_H-C_H1), die ein Paar aus antigenbindenden Regionen bilden. Lineare Antikörper können bispezifisch oder monospezifisch sein.
Ein „Eltern-Antikörper" ist ein Antikörper, der eine Aminosäuresequenz umfasst, der im Vergleich zu einer Antikörpervariante, wie sie hierin geoffenbart ist, ein oder mehrere Aminosäurereste in oder angrenzend an einer oder mehreren hypervariablen Regionen davon fehlen. Somit weist der Eltern-Antikörper eine kürzere hypervariable Region auf als die entsprechende hypervariable Region der Antikörpervariante, wie sie hierin geoffenbart ist. Das Eltern-Polypeptid kann einen Nativsequenz-(d. h. natürlich vorkommend) Antikörper (einschließlich einer natürlich vorkommenden Allel variante) oder einen Antikörper mit schon vorher vorhandenen Aminosäuresequenzmodifikationen (wie z. B. anderen Insertionen, Deletionen und/oder Substitutionen) einer natürlich vorkommenden Sequenz umfassen. Vorzugsweise ist der Eltern-Antikörper ein humanisierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper.
Wie hierin verwendet bezieht sich „Antikörpervariante" auf einen Antikörper, der eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der Aminosäuresequenz eines Eltern-Antikörpers unterscheidet. Vorzugsweise umfasst die Antikörpervariante eine variable Schwerkettendomäne oder eine variable Leichtkettendomäne mit einer Aminosäuresequenz, die in der Natur nicht vorkommt. Solche Varianten weisen notwendigerweise weniger als 100% Sequenzidentität oder -ähnlichkeit mit dem Eltern-Antikörper auf. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Antikörpervariante eine Aminosäuresequenz auf, die etwa 75% bis weniger als 100% Aminosäuresequenzidentität oder -ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz von entweder der variablen Domäne der schweren oder leichten Kette des Eltern-Antikörpers aufweist, noch bevorzugter etwa 80% bis weniger als 100%, noch bevorzugter etwa 85% bis weniger als 100%, noch bevorzugter etwa 90% bis weniger als 100%, insbesondere etwa 95% bis weniger als 100%. Identität oder Ähnlichkeit in Bezug auf diese Sequenz ist hierin als Prozentsatz an Aminosäureresten in der Kandidatensequenz definiert, die mit den Eltern-Antikörperresten identisch sind (d. h. die gleichen Reste), nachdem die Sequenzen angeordnet und, falls erforderlich, Lücken eingeführt wurden, um die prozentuell höchste Sequenzidentität zu erzielen. Keine der N-terminalen, C-terminalen oder internen Extensionen, Deletionen oder Insertionen in der Antikörpersequenz außerhalb der variablen Domäne ist als Beeinträchtigung der Sequenzidentität oder -ähnlichkeit aufzufassen. Die Antikörpervariante ist im Allgemeinen eine solche, die eine längere hypervariable Region aufweist (um einen oder mehrere Aminosäurereste; z. B. um etwa einen bis etwa 30 Aminosäurereste und vorzugsweise um etwa 2 bis etwa zehn Aminosäurereste) als die entsprechende hypervariable Region eines Eltern-Antikörpers.
Eine „Aminosäureveränderung" bezieht sich auf eine Veränderung in der Aminosäuresequenz einer vorbestimmten Aminosäuresequenz. Beispiele für Veränderungen umfassen Insertionen, Substitutionen und Deletionen.
Eine „Aminosäureinsertion" bezieht sich auf die Einführung einer oder mehrerer Aminosäurereste in eine vorbestimmte Aminosäuresequenz.
Die Aminosäureinsertion umfasst gegebenenfalls eine „Peptidinsertion", wobei in diesem Fall ein Peptid, das zwei oder mehr durch (eine) Peptidbindung(en) verbundene Aminosäurereste umfasst, in die vorbestimmte Aminosäuresequenz eingeführt ist. Wenn die Aminosäureinsertion die Insertion eines Peptids umfasst, kann das insertierte Peptid durch zufallsbestimmte Mutagenese erzeugt werden, sodass es eine Aminosäuresequenz aufweist, die in der Natur nicht vorkommt.
Der insertierte Rest oder die insertierten Reste können „natürlich vorkommende Aminosäurereste" (d. h. ein genetischer Code kodiert dafür) und aus folgender Gruppe ausgewählt sein: Alanin (Ala); Arginin (Arg); Asparagin (Asn); Asparaginsäure (Asp); Cystein (Cys); Glutamin (Gln); Glutaminsäure (Glu); Glycin (Gly); Histidin (His); Isoleucin (Ile); Leucin (Leu); Lysin (Lys); Methionin (Met); Phenylalanin (Phe); Prolin (Pro); Serin (Ser); Threonin (Thr); Tryptophan (Trp); Tyrosin (Tyr); und Valin (Val).
Die Insertion einer oder mehrerer nicht natürlich vorkommender Aminosäurereste ist ebenfalls durch die Definition einer Aminosäureinsertion hierin abgedeckt. Ein „nicht natürlich vorkommender Aminosäurerest" bezieht sich auf einen Rest, der keiner der oben angeführten natürlich vorkommenden Aminosäurereste ist und in der Lage ist, kovalent an (einen) benachbarte(n) Aminosäurerest(e) in einer Polypeptidkette zu binden. Beispiele für nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste umfassen Norleucin, Ornithin, Norvalin, Homoserin und andere Aminosäurerestanaloga, wie sie beispielsweise in Ellman et al., Meth. Enzym. 202, 301–336 (1991), beschrieben sind. Um solche nicht natürlich vorkommenden Aminosäurereste herzustellen, können die Verfahren nach Noren et al., Science 244, 182 (1989), und Ellman et al., w. o., eingesetzt werden. Kurz gesagt umfassen diese Verfahren die chemische Akti vierung einer Suppressor-tRNA mit einem nicht natürlich vorkommenden Aminosäurerest, gefolgt von einer In-vitro-Transkription und -Translation der RNA.
Eine Aminosäureinsertion „in einer hypervariablen Region" bezieht sich auf die Einführung einer oder mehrerer Aminosäurereste innerhalb der Aminosäuresequenz einer hypervariablen Region.
Eine Aminosäureinsertion „angrenzend an einer hypervariablen Region" bezieht sich auf die Insertion einer oder mehrerer Aminosäurereste am N-terminalen und/oder C-terminalen Ende einer hypervariablen Region, sodass zumindest einer der insertierten Aminosäurereste eine Peptidbindung mit dem N-terminalen oder C-terminalen Aminosäurerest der betreffenden hypervariablen Region bildet.
Eine „Aminosäuresubstitution" bezieht sich auf den Ersatz eines vorhandenen Aminosäurerests in einer vorbestimmten Aminosäuresequenz durch einen anderen, unterschiedlichen Aminosäurerest.
Die Bezeichnung „mögliche Aminosäurewechselwirkungen" bezieht sich auf Kontakte oder bezüglich der Energie vorteilhafte Wechselwirkungen zwischen einem oder mehreren Aminosäureresten, die in einem Antigen vorhanden sind, und einem oder mehreren Aminosäureresten, die in einem Eltern-Antikörper nicht vorkommen, aber in diesen insertiert werden können, um die Aminosäurekontakte zwischen dem Antigen und einer Antikörpervariante zu erhöhen, welche diese(n) insertierten Aminosäurerest(e) umfasst. Vorzugsweise sind die Aminosäurewechselwirkungen von Interesse aus der aus Wasserstoffbrückenbindung, van-der-Waals-Wechselwirkungen und ionischen Wechselwirkungen bestehenden Gruppe ausgewählt.
Die Bezeichnung „Zielantigen" bezieht sich hierin auf ein vorbestimmtes Antigen, an das sowohl ein Eltern-Antikörper als auch eine Antikörpervariante, wie sie hierin definiert ist, bindet. Das Zielantigen kann ein Polypeptid, ein Kohlenhydrat, eine Nucleinsäure, ein Lipid, ein Hapten oder eine andere natürlich vorkommende oder synthetische Verbindung sein. Vorzugsweise ist das Zielantigen ein Polypeptid. Wäh rend die Antikörpervariante das Zielantigen mit besserer Bindungsaffinität bindet als der Eltern-Antikörper, weist der Eltern-Antikörper im Allgemeinen einen Bindungsaffinitäts-(K_d-)Wert für das Zielantigen von nicht mehr als etwa 1 × 10^–5 M, vorzugsweise nicht mehr als 1 × 10^–6 M, auf.
Ein „isolierter" Antikörper ist einer, der aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen wurde. Kontaminierende Komponenten aus seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische Anwendungen des Antikörpers stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nichtproteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) zu mehr als 95 Gew.-% des Antikörpers, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, und insbesondere zu mehr als 99 Gew.-%, gereinigt, (2) unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu einem Grad gereinigt, der ausreichend ist, um zumindest 15 Reste einer N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz zu erhalten, oder (3) durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt. Isolierte Antikörper umfassen den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird ein isolierter Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
„Behandlung" bezieht sich sowohl auf eine therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, die bereits die Erkrankung aufweisen, sowie jene, bei denen der Erkrankung vorgebeugt werden soll.
Eine „Erkrankung" ist jedes beliebige Leiden, das von einer Behandlung mit der Antikörpervariante profitieren würde. Dazu gehören chronische und akute Leiden oder Erkrankungen, einschließlich pathologischer Zustände, die das Säugetier für die betreffende Erkrankung anfällig machen.
„Säugetier” für Behandlungszwecke bezieht sich auf jedes beliebige Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztieren, nichtmenschlichen Primaten und Zoo-, Sport- oder Kleintieren, wie z. B. Hunden, Pferden, Katzen, Rindern usw.
Die Bezeichnung „zytotoxisches Mittel", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Substanz, welche die Funktion von Zellen inhibiert oder unterbindet und/oder die Zerstörung von Zellen verursacht. Die Bezeichnung ist so zu verstehen, dass sie radioaktive Isotope (z. B. I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ und Re¹⁸⁶), chemotherapeutische Mittel und Toxine, wie z. B. enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder von Pilzen, oder Fragmente davon umfassen.
Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung, die zur Behandlung von Krebs nützlich ist. Beispiele für chemotherapeutische Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Taxotere (Docetaxel) Busulfan, Cytokin, Taxol, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187 ), Melphalan und andere verwandte Stickstofflosts.
Die Bezeichnung „Prodrug", wie in dieser Anmeldung verwendet, bezieht sich auf einen Vorläufer oder ein Derivat einer pharmazeutisch aktiven Substanz, die für Tumorzellen weniger zytotoxisch ist als das Ausgangsarzneimittel und in der Lage ist, enzymatisch aktiviert oder in eine die aktivere Mutterform übergeführt zu werden. Siehe z. B. Wilman, „Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions 14, 375–382, 615th Meeting Belfast (1986), und Stella et al., „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (Hrsg.), 247–267, Humana Press (1985). Die Prodrugs dieser Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, phosphathältige Prodrugs, thiophosphathältige Prodrugs, sulfathältige Prodrugs, peptidhältige Prodrugs, D-aminosäuremodifizierte Prodrugs, glykosylierte Prodrugs, β-Lactam-hältige Prodrugs, gegebenenfalls substituierte phenoxyacetamidhältige Prodrugs oder gegebenenfalls substituierte phenylacetamidhältige Prodrugs, 5-Fluorcytosin- und andere 5-Fluoruridin-Prodrugs, die in das aktivere, zytotoxische freie Arzneimittel übergeführt werden können. Beispiele für zytotoxische Arzneimittel, die in eine Prodrug-Form derivatisiert werden können, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die oben beschriebenen chemotherapeutischen Mittel.
Das Wort „Markierung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist. Die Markierung selbst kann nachweisbar sein (z. B. Radioisotopenmarkierung oder Fluoreszenzmarkierung) oder, im Fall einer enzymatischen Markierung, eine chemische Veränderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die nachweisbar ist.
Unter „Festphase" wird eine nicht-wässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele für Festphasen, die hierin enthalten sind, umfassen jene, die teilweise oder vollständig aus Glas (z. B. Controlled Pore Glass), Polysacchariden (z. B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Siliconen bestehen. In bestimmten Ausführungsformen kann, je nach Zusammenhang, die Festphase den Well einer Testplatte umfassen; in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z. B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase einzelner Teilchen, wie beispielsweise jene, die im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben sind.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vehikel, zusammengesetzt aus verschiedenen Typen von Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensiden, die zur Zufuhr eines Arzneimittels (wie beispielsweise der hierin geoffenbarten Antikörpervarianten und gegebenenfalls eines chemotherapeutischen Mittels) zu einem Säugetier nützlich sind, Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer Doppelschichtkonformation angeordnet, ähnlich wie bei der Lipidanordnung biologischer Membranen.
Ein „isoliertes" Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül getrennt wurde, mit dem es gewöhnlich in der natürlichen Quelle der Antikörper-Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül liegt in anderer Form oder Umgebung vor als es in der Natur zu finden ist. Isolierte Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher von dem spezifischen Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen vorliegt. Dennoch umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül ein Nucleinsäuremolekül, das in Zellen enthalten ist, die üblicherweise den Antikörper exprimieren, wenn beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer chromosomalen Position liegt, die sich von jener der natürlichen Zellen unterscheidet.
Die Bezeichnung „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosomen-Bindungsstelle. Eukaryotische Zellen sind dafür bekannt, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer nutzen.
Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader ist beispielsweise operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so angeordnet ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die zu verbindenden DNA-Sequenzen zusammenhängend und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsschnittstellen. Sind solche Stellen nicht vorhanden, so werden die synthetischen Oligonucleotid-Adaptoren oder -Linker gemäß der herkömmlichen Praxis verwendet.
Wie hierin verwendet, werden die Bezeichnungen „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" synonym verwendet, und alle diese Bezeichnungen beziehen Nachkommenschaft mit ein. Somit umfassen die Termini „Transformanten" und „transformierte Zellen" die primär bearbeitete Zelle und die davon abgeleiteten Kulturen, ohne Berücksichtigung der Anzahl der Transfers. Es versteht sich auch, dass aufgrund von absichtlichen oder unabsichtlichen Mutationen nicht alle Nachkommen genau den gleichen DNA-Gehalt aufweisen. Mutierte Nachkommenschaft mit der gleichen Funktion oder biologischen Aktivität, auf welche in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurde, sind ebenfalls eingeschlossen. Sind bestimmte Bezeichnungen erwünscht, so ergibt sich das klar auf dem Kontext.
II. Durchführungsarten der Erfindung
Die Erfindung hierin betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Antikörpervariante. Der Eltern-Antikörper oder Ausgangsantikörper wird unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung zur Herstellung solcher Antikörper verfügbaren Verfahren hergestellt. Beispiele für Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind in den folgenden Abschnitten im Detail beschrieben.
Der Eltern-Antikörper ist gegen ein Zielantigen von Interesse gerichtet. Vorzugsweise ist das Zielantigen ein biologisch bedeutendes Polypeptid, und die Verabreichung des Antikörpers an ein Säugetier, das an einer Erkrankung oder Störung leidet, kann zu einem therapeutischen Nutzen in diesem Säugetier führen. Aber auch Antikörper, die gegen Nichtpolypeptid-Antigene (wie z. B. tumorassoziierte Glykolipidantigene; siehe US-Patent 5.091.178 ) gerichtet sind, kommen in Frage.
Handelt es sich bei dem Antigen um ein Polypeptid, kann dieses ein Transmembranmolekül (z. B. ein Rezeptor) oder ein Ligand, wie z. B. ein Wachstumsfaktor, sein. Beispiele für Antigene umfassen Moleküle, wie z. B. Renin; ein Wachstumshormon, einschließlich des menschlichen Wachstumshormons und des Rinderwachstumshormons; den Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor; Parathormon; das thyreoidstimu lierende Hormon; Lipoproteine, α-1-Antitrypsin; die Insulin-A-Kette; die Insulin-B-Kette; Proinsulin; das follikelstimulierende Hormon; Calcitonin; das luteinisierende Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren wie den Faktor VIIIC, den Faktor IX, den Gewebefaktor und den von-Willebrand-Faktor; Antigerinnungsfaktoren wie Protein C; den atrionatriuretischen Faktor; das Lungentensid; einen Plasminogenaktivator wie Urokinase oder den Humanurin- oder Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA); Bombesin; Thrombin; den hämatopoetischen Wachstumsfaktor; den Tumornekrosefaktor-α und -β, Enkephalinase; RANTES (regulationsaktiviert, normalerweise T-Zell-exprimiert und -sekretiert); das menschliche Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP-1-α); ein Serumalbumin wie humanes Serumalbumin; das Anti-Müller-Hormon; die Relaxin-A-Kette; die Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; das Maus-Gonadotropin-assoziierte Peptid; ein mikrobielles Protein wie β-Lactamase; DNase; IgE; ein zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Antigen (CTLA) wie CTLA-4; Inhibin; Activin; den Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Protein A oder D; Rheumafaktoren; einen neurotrophen Faktor wie den neurotrophen Knochenfaktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6) oder einen Nervenwachstumsfaktor; den aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF); einen Fibroblastenwachstumsfaktor wie aFGF und bFGF; den Epidermiswachstumsfaktor (EGF); einen transformierenden Wachstumsfaktor (TGF) wie TGF-α und TGF-β; den insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I und IGF-II); Des(1-3)-IGF-I (Gehirn-IGF-I), Bindungsproteine für insulinähnlichen Wachstumsfaktor; CD-Proteine wie CD3, CD4, CD8, CD19 und CD20; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein Knochen-Morphogenese-Protein (BMP); ein Interferon wie Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren (CSFs), z. B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (ILs), z. B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zell-Rezeptoren; Oberflächenmembranproteine; den Zerfall beschleunigenden Faktor; virale Antigene wie einen Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homing-Rezeptoren; Addressine; Regulatorproteine; Integrine wie CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ein ICAM, VLA-4 und VCAM; ein tumorassoziiertes Antigen wie den HER2-, HER3- oder HER4-Rezeptor; und Fragmente von beliebigen der oben genannten Polypeptide.
Bevorzugte molekulare Ziele für die in dieser Erfindung vorgesehenen Antikörper umfassen CD-Proteine, wie z. B. CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 und CD34; Mitglieder der ErbB-Rezeptorfamilie, wie z. B. den EGF-Rezeptor, HER2-, HER3- oder HER4-Rezeptor; Zelladhäsionsmoleküle, wie z. B. LFA-1, Mac-1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM und αν/β3-Integrin, einschließlich ihrer α- oder β-Untereinheiten (z. B. Anti-CD11a-, Anti-CD18- oder Anti-CD11b-Antikörper); Wachstumsfaktoren, wie z. B. VEGF; IgE; Blutgruppenantigene; den flk2/flt3-Rezeptor; den Obesitäts-(OB-)Rezeptor; den mpl-Rezeptor; CTLA-4; Protein C usw.
Das zur Erzeugung eines Antikörpers verwendete Antigen kann aus einer natürlichen Quelle dafür isoliert werden oder rekombinant produziert oder unter Anwendung anderer Syntheseverfahren hergestellt werden. Alternativ dazu können Zellen, die ein natives oder rekombinantes Antigen umfassen, als Immunogene zur Herstellung von Antikörpern eingesetzt werden.
Der Eltern-Antikörper kann schon vorher starke Bindungsaffinität für das Zielantigen aufweisen. Beispielsweise kann der Eltern-Antikörper das Antigen von Interesse mit einem Bindungsaffinitäts-(K_d-)Wert von nicht mehr als etwa 1 × 10^–7 M, vorzugsweise nicht mehr als etwa 1 × 10^–8 M, insbesondere nicht mehr als etwa 1 × 10^–9 M, binden.
Die „Bindungsaffinität" eines Antikörpers kann beispielsweise durch Gleichgewichtsverfahren (z. B. enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) oder Radioimmuntest (RIA)) oder Kinetik (z. B. BIACORE^TM-Analyse; siehe Beispiel 1 unten) bestimmt werden.
Außerdem kann der Antikörper anderen „biologischen Aktivitätstests" unterzogen werden, um z. B. seine „Wirksamkeit" oder pharmakologische Aktivität sowie mögliche Wirksamkeit als Therapeutikum zu beurteilen. Solche Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und hängen vom Zielantigen sowie der beabsichtigten Anwendung des Antikörpers ab. Beispiele umfassen den Keratinozyten-Monolayer- Adhäsionstest und den gemischten Lymphozytenreaktions-(MLR-)Test für CD11a (siehe WO98/23761 ); Tumorzellwachstumshemmtests (wie beispielsweise in der WO 89/06692 beschrieben); antikörpervermittelte zelluläre Toxizitäts-(ADCC-) und komplementvermittelte Zytotoxizitäts-(CDC-)Tests ( US-Patent 5.500.362 ); agonistische Aktivitäts- oder Hämatopoesetests (siehe WO 95/27062 ); den tritiierten Thymidininkorporationstest; und den Alamarblautest zur Messung der Stoffwechselaktivität von Zellen als Reaktion auf ein Molekül wie VEGF (siehe Beispiel 1 unten).
Die Aminosäuresequenz des Eltern-Antikörpers wird so verändert, dass eine Antikörpervariante erzeugt wird, die eine stärkere Bindungsaffinität für das Zielantigen aufweist als der Eltern-Antikörper. Die Antikörpervariante weist vorzugsweise eine Bindungsaffinität für das Zielantigen auf, die zumindest etwa doppelt so stark ist (z. B. etwa zweifach bis etwa 1000fach oder sogar bis zu etwa 10.000fach verbesserte Bindungsaffinität), vorzugsweise zumindest etwa fünfmal so stark, vorzugsweise etwa zehnmal oder 100-mal so stark, wie die Bindungsaffinität des Eltern-Antikörpers für das Antigen. Die gewünschte oder erforderliche Steigerung der Bindungsaffinität hängt gegebenenfalls von der anfänglichen Bindungsaffinität des Eltern-Antikörpers ab.
Wenn der eingesetzte Test ein biologischer Aktivitätstest ist, dann weist die Antikörpervariante vorzugsweise eine Wirksamkeit im biologischen Aktivitätstest der Wahl auf, die zumindest etwa doppelt so stark ist (z. B. etwa zweifach bis etwa 1000fach oder sogar bis zu etwa 10.000fach verbesserte Wirksamkeit), vorzugsweise zumindest etwa 20-mal so stark, vorzugsweise etwa 50-mal so stark, manchmal zumindest etwa 100-mal oder 200-mal so stark, wie die biologische Aktivität des Eltern-Antikörpers in diesem Test.
Um die Antikörpervariante herzustellen, wird eine Insertion von zwischen 2 und 10 Aminosäureresten in einer CDR H3 einer Schwerkettendomäne des Eltern-Antikörpers vorgenommen. Bei der Bestimmung der Anzahl an Resten, die insertiert werden sollen, können die verschiedenen Längen der betreffenden hypervariablen Region in bekannten Antikörpern berücksichtigt werden.
Wenn eine Insertion in der hypervariablen Region der CDR H3 vorgenommen wird, liegen die insertierten Aminosäurereste vorzugsweise zwischen den Resten Nr. 97 und 102 (z. B. angrenzend an den, vorzugsweise C-terminal nach dem, Rest Nr. 100) der variablen Schwerkettendomäne des Eltern-Antikörpers, wobei die Restenummerierung der variablen Domäne wie in Kabat verwendet wurde.
Bei der Bestimmung der Anzahl an Aminosäureresten, die insertiert werden sollen, kann die gewünschte Länge der veränderten hypervariablen Region berücksichtigt werden. Bei der ersten hypervariablen Region einer variablen Schwerkettendomäne ist die hypervariable Region beispielsweise vorzugsweise der Resteabschnitt von der „Schleife H1" gemäß Chothia et al., w. o., kombiniert mit dem Resteabschnitt, von dem angenommen wird, dass er „CDR H1" gemäß Kabat et al., w. o., darstellt. Somit kann die erste hypervariable Schleife der variablen Schwerkettendomäne eine Gesamtlänge von etwa acht Aminosäureresten bis etwa 20 Resten aufweisen, einschließlich des/der insertierten Aminosäurerests/-reste. In Bezug auf die zweite hypervariable Region einer variablen Schwerkettendomäne ist die hypervariable Region vorzugsweise „CDR H2" gemäß Kabat et al., w. o., z. B. mit einer Gesamtlänge von etwa 14 Aminosäureresten bis etwa 25 Resten, einschließlich des/der insertieren Aminosäurerestes/-reste. In Bezug auf die dritte hypervariable Region einer variablen Schwerkettendomäne, schließlich, ist die hypervariable Region vorzugsweise „CDR H3" gemäß Kabat et al., w. o., z. B. mit einer Gesamtlänge von etwa sechs Aminosäureresten bis etwa 30 Resten, einschließlich des/der insertierten Aminosäurerests/-reste.
Antikörpervarianten mit einem oder mehreren insertierten Aminosäureresten in einer hypervariablen Region davon können nach dem Zufallsprinzip hergestellt werden, besonders wenn die Ausgangsbindungsaffinität des Eltern-Antikörpers für das Zielantigen so aussieht, dass zufällig hergestellte Antikörpervarianten leicht gescreent werden können. Phagendisplay stellt beispielsweise ein geeignetes Verfahren zum Screenen solcher Zufallsvarianten dar.
Ein systematischeres Verfahren zur Herstellung von Antikörpervarianten kann auch eingesetzt werden. Dieses Verfahren umfasst die folgenden allgemeinen Schritte, die üblicherweise nacheinander durchgeführt werden:

(a) Identifizieren möglicher Aminosäurewechselwirkungen zwischen einer hypervariablen Region eines Eltern-Antikörpers und eines Zielantigens;
(b) Herstellen einer Variante des Eltern-Antikörpers durch Insertieren eines Aminosäurerests in die oder angrenzend an die hypervariable Region des Eltern-Antikörpers, wobei der eingeführte Aminosäurerest zu möglichen Aminosäurewechselwirkungen in (a) beiträgt;
(c) Selektieren einer wie in (b) hergestellten Antikörpervariante, die stärkere Bindungsaffinität für das Antigen aufweist als der Eltern-Antikörper.

Gemäß Schritt (a) dieses Verfahrens kann ein Molekülmodell des mit einem Antigen komplexierten Eltern-Antikörpers analysiert werden. Das Molekülmodell kann aus einer Röntgenkristall- oder Kernmagnetresonanz-(NMR-)Struktur dieses Komplexes erhalten werden. Siehe z. B. Amit et al., Science 233, 747–753 (1986); und Muller et al., Structure 6(9), 1153–1167 (1998). Alternativ dazu können Computerprogramme eingesetzt werden, um Molekülmodelle von Antikörper/Antigen-Komplexen zu erzeugen (siehe z. B. Levy et al., Biochemistry 28, 7168–7175 (1989); Bruccoleri et al., Nature 335, 564–568 (1998); und Chothia et al., Science 233, 755–758 (1986)), wobei keine Kristallstruktur verfügbar ist.
Im bevorzugten Verfahren wird das Molekülmodell des Antigen/Antikörper-Komplexes analysiert, und mögliche Bereiche zur Steigerung von energetisch vorteilhaften Wechselwirkungen zwischen dem Antigen und einer hypervariablen Region des Antikörpers werden identifiziert. Beispielsweise können mögliche polare Wechselwirkungen (z. B. Ionenpaare und/oder Wasserstoffbrückenbindung); nichtpolare Wechselwirkungen (wie z. B. van-der-Waals-Anziehungen und/oder hydrophobe Wechselwirkungen); und/oder kovalente Wechselwirkungen (z. B. Disulfidbindung(en)) zwischen einem oder mehreren Aminosäureresten des Antigens und einem oder mehreren Aminosäureresten, die in oder angrenzend an eine hypervariable Region des Antikörpers insertiert werden können, identifiziert werden. Vorzugsweise weist zu mindest einer der insertierten Reste eine positive Nettoladung oder eine negative Nettoladung auf. Beispielsweise kann zumindest einer der insertierten Reste ein positiv geladener Rest, vorzugsweise Arginin oder Lysin, sein.
Beispiele für Seitenketten, die typischerweise eine positive Ladung aufweisen, sind Lysin, Arginin und Histidin. Beispiele für Seitenketten, die typischerweise eine negative Ladung aufweisen, sind Asparaginsäure und Glutaminsäure. Diese Seitenketten können ionische Wechselwirkungen durchlaufen (positive Reste gepaart mit negativen Resten) sowie auch polare Wechselwirkungen mit Seitenketten mit polaren funktionellen Gruppen: Tryptophan, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Außerdem können polare oder ionische Wechselwirkungen durch dazwischen liegenden Lösungsmittel-(wie z. B. Wasser-) oder Gelöststoff- (z. B. Phosphat- oder Sulfat-)Moleküle vermittelt werden.
Beispiele für Reste, die an hydrophoben Wechselwirkungen, oder nichtpolaren van-der-Waals-Wechselwirkungen, beteiligt sein können, sind typischerweise Alanin, Vain, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin und Tyrosin; die nichtpolaren Seitenketten von anderen Resten, wie z. B. Lysin oder Arginin, können jedoch auch an solchen Wechselwirkungen mitwirken. Aromatische Seitenketten, wie z. B. Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, können aromatische (pi-)Stapelungswechselwirkungen bilden oder als Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren dienen.
Außerdem können die Hauptkettenatome eines beliebigen Rests (einschließlich Glycin) van-der-Waals- oder hydrophobe Wechselwirkungen durchlaufen; und die Atome Stickstoff und Carbonylsauerstoff der Hauptkette können polare (Wasserstoffbrückenbindungs-)Wechselwirkungen durchlaufen. in manchen Fällen kann eine kovalente Bindung (Disulfid) aus einem Cysteinrest des Antikörpers und einem Cysteinrest des Antigens gebildet werden.
Schließlich können posttranslationale Modifikationen (z. B. Glykosylierung oder Phosphorylierung) oder eine prosthetische Gruppe (z. B. Häm oder Zinkfinger) weite re funktionelle Gruppen (Carboxylat- oder Phosphatsauerstoffe; Zink- oder Eisenatome) für eine Wechselwirkung zwischen Antikörper und Antigen bereitstellen.
Somit können beispielsweise einer oder mehrere geladene Aminosäurereste in oder angrenzend an eine hypervariable Region des Eltern-Antikörpers an einer geeigneten dreidimensionalen Stelle insertiert werden, sodass der insertierte Rest oder die insertierten Reste in der Lage sind, ein oder mehrere Ionenpaare mit einem oder mehreren entgegengesetzt geladenen Resten im Antigen zu bilden. Auf ähnliche Weise können ein oder mehrere Paare für Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals-Wechselwirkungen usw. geschaffen werden, indem geeignete Aminosäurereste an einer geeigneten Stelle in oder angrenzend an eine hypervariable Region des Antikörpers insertiert werden.
Die Antikörpervariante kann weitere Veränderungen, wie z. B. Aminosäuredeletionen oder -substitutionen, in der hypervariablen Region des Antikörpers enthalten, in dem die Insertion vorgenommen wird. Dies ist im nachstehenden Beispiel gezeigt, bei dem die hypervariable Region sowohl durch Aminosäuresubstitutionen als auch durch Aminosäureinsertionen modifiziert wurde.
Im Allgemeinen muss jeder insertierte Aminosäurerest oder jedes insertierte Peptid an einer Restposition (x) aus der vorhandenen Antikörper-Polypeptidkette austreten, sich bis zu einem Punkt verlängern, der nahe genug an einer neuen Kontaktstelle ist, sodass ein Teil der Aminosäure-Seitenkette oder -Hauptkette des Peptids eine Wechselwirkung erzeugen kann, und an einer Position (y) wieder in die vorhandenen Antikörper-Polypeptidkette eintreten (worin y > x in der linearen Sequenz ist).
Es ist wünschenswert, dass der insertierte Aminosäurerest oder das insertierte Peptid die Struktur des Antikörpers umfassend und lokal gesehen nicht über die Nachbarschaft des neu insertierten Aminosäurerests oder Peptids hinaus signifikant stört. Insbesondere verzerrt der insertierte Aminosäurerest oder das insertierte Peptid vorzugsweise nicht die FR-Reste des Antikörpers oder Reste des Antikörpers oder Anti gens, die an vorhandenen Kontakten beteiligt sind. Dies kann in einem tatsächlichen oder modellierten Komplex evaluiert werden.
Wenn weder der Austritts- noch der Wiedereintrittsrest (x und y) signifikante intramolekulare und intermolekulare Kontakte (d. h. beide innerhalb des Antikörpers und zwischen Antikörper und Antigen) aufweisen, dann kann die Aminosäure- oder Peptidinsertion durch Addition eines Peptidsegments zwischen Rest x und y erzielt werden, wodurch die Reste x und y unverändert bleiben. Alternativ dazu können einer oder beide der Reste x und y deletiert und durch ein Peptidsegment aus > 2 Resten ersetzt werden.
Häufig können die Reste x und y und/oder dazwischen liegende Reste im Eltern-Antikörper an signifikanten intramolekularen und intermolekularen Kontakten beteiligt sein. In diesem Fall können diese Wechselwirkungen aufrechterhalten oder durch Reste ersetzt werden, die zu ähnlichen Wechselwirkungen beitragen, während es einem insertierten Rest oder Peptid ermöglicht wird, aus der Kette auszutreten und wieder in diese einzutreten. Dies kann erreicht werden, indem die beiden Reste x und y und/oder dazwischen liegende Reste im Eltern-Antikörper durch zufällige Reste ersetzt werden, die danach einem Affinitätsscreenen (oder Screenen auf andere biologische Aktivitäten) unterzogen werden, um Varianten mit verbesserter Affinität zu identifizieren.
Dieses systematische Verfahren ist beispielsweise in 3 veranschaulicht, wo die Reste D41 und E42 im VEGF-Antigen als mögliche Kandidaten für eine Wechselwirkung mit insertierten Resten in der CDR H3 der variablen Schwerkettendomäne des Eltern-Antikörpers identifiziert wurden.
Wie in 4 und 5 veranschaulicht ist, ist D41 des VEGF-Antigens somit in der Lage, ein Ionenpaar mit dem insertierten Rest R104c in der CDR H3 der Antikörpervariante Y0313-2 des nachstehenden Beispiels zu bilden. 5 zeigt weiters, wie der Rest V104 in der Antikörpervariante Y0313-2 in der Lage ist, eine hydrophobe Wechselwirkung mit den Resten 93 bis 95 des VEGF-Antigens zu verursachen. So mit ist erkennbar, dass mögliche Bereiche identifiziert werden, in denen Kontakte zwischen Antigen und Antikörper verbessert werden können, um so die Affinität der Antikörpervariante zu verbessern.
Im Allgemeinen nimmt man Veränderungen in hypervariablen Regionen proximal zum Antigen vor, wenn das Antigen und der Antikörper zusammen komplexiert sind. Die hypervariable Region des Eltern-Antikörpers, die wie hierin geoffenbart modifiziert sein kann, weist beispielsweise im Allgemeinen einen oder mehrere Aminosäurereste innerhalb von etwa 20 Å eines oder mehrerer Aminosäurereste des Antigens auf. Die hierin zu ändernde hypervariable Region kann eine sein, die im Elternantikörper keinen signifikanten Kontakt mit einem Antigen eingeht (z. B. kann eine nichtkontaktierende hypervariable Region so modifiziert werden, dass sie eine kontaktierende hypervariable Region wird). Vorzugsweise kontaktiert die zu modifizierende hypervariable Region jedoch das Antigen, und das Verfahren hierin dient zur Steigerung der Kontakte zwischen dem Antigen und der schon kontaktierenden hypervariablen Region.
In einer weiteren Ausführungsform können Reste hypervariabler Regionen, die mit einem Antigen wechselwirken, durch Alanin-Scanning-Mutagenese des Antigens und/oder Eltern-Antikörpers (Muller et al., Structure 6(9), 1153–1167 (1998)) oder durch andere Mittel identifiziert werden. Hypervariable Regionen, die als kontaktierendes Antigen identifiziert wurden, sind Kandidaten für (eine) Aminosäureinsertion(en), wie sie hierin geoffenbart ist.
Nucleinsäuremoleküle, die für Aminosäuresequenzvarianten kodieren, werden durch verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, oligonucleotidvermittelte (oder ortsgerichtete) Mutagenese; PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer vorher hergestellten Varianten- oder Nichtvariantenversion des Eltern-Antikörpers. Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Varianten ist ortsgerichtete Mutagenese (siehe z. B. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985)). Außerdem kann eine Nucleinsäuresequenz synthetisch hergestellt werden, sobald die gewünschte Aminosäuresequenz konzeptuell erhalten wurde. Die Antikörpervarianten kann auch durch Peptidsynthese, Peptidligation oder andere Verfahren hergestellt werden.
Nach der Herstellung der Antikörpervariante kann die Aktivität dieses Moleküls in Bezug auf den Eltern-Antikörper bestimmt werden. Wie oben angemerkt kann dies die Bestimmung der Bindungsaffinität und/oder anderer biologischer Aktivitäten des Antikörpers umfassen. in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Gruppe von Antikörpervarianten hergestellt und auf ihre Bindungsaffinität für das Antigen und/oder ihre Wirksamkeit in einem oder mehreren biologischen Aktivitätstests gescreent. Eine oder mehrere der aus einem anfänglichen Screen selektierten Antikörpervarianten werden gegebenenfalls einer oder mehreren weiteren biologischen Aktivitätstests unterzogen, um zu bestätigen, dass der/die Antikorpervariante(n) in mehr als einem Test verbesserte Aktivität aufweisen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung und zum Screenen von Insertionsmutanten umfasst das Präsentieren von Antikörpervarianten auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen und das Selektieren von Antikörpervarianten basierend auf ihrer Affinität für ein Antigen, durch ihre Dissoziationskinetik (off-rate) von einem Antigen oder ein anderes Screening auf Antikörperaffinität oder -wirksamkeit. Dies war das Verfahren, das im nachstehenden Beispiel zur Identifikation von Antikörpervarianten mit erhöhter biologischer Aktivität verwendet wurde.
Neben den oben genannten insertionen in die hypervariable Region des Eltern-Antikörpers können auch andere Veränderungen in den Aminosäuresequenzen einer oder mehrerer der hypervariablen Regionen vorgenommen werden. Beispielsweise können die oben genannten Aminosäureinsertionen mit Deletionen oder Substitutionen von anderen Resten einer hypervariablen Region kombiniert werden. Außerdem können eine oder mehrere Veränderungen (z. B. Substitutionen) von FR-Resten in den Eltern-Antikörper eingebracht werden, wo diese zu einer Verbesserung der Bindungsaffinität der Antikörpervariante für das Antigen führen. Beispiele für Reste einer Gerüstregion, die zu Modifikationen führen, umfassen solche, die ein Antigen direkt nichtkovalent binden (Amit et al., Science 233, 747–753 (1986)); mit der Konfor mation einer CDR Wechselwirken oder diese beeinflussen (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)); und/oder an der V_L-V_H-Schnittstelle beteiligt sind ( EP 239 400 B1 ). Solche Aminosäuresequenzveränderungen können im Eltern-Antikörper vorhanden sein, gleichzeitig mit der/den Aminosäureinsertion(en) hierin durchgeführt werden oder durchgeführt werden, nachdem eine Variante mit einer Aminosäureinsertion erzeugt wurde.
Die Antikörpervarianten können auch anderen Modifikationen unterzogen werden, was häufig von der beabsichtigten Anwendung des Antikörpers abhängt. Solche Modifikationen können weitere Veränderungen der Aminosäuresequenz, eine Fusion an (ein) heterologe(s) Polypeptid(e) und/oder eine kovalente Modifikation umfassen. Beispiele für Aminosäuresequenzveränderungen sind oben ausgeführt. Beispielsweise kann jeder Cysteinrest, der nicht an der Aufrechterhaltung der geeigneten Konformation der Antikörpervariante beteiligt ist, ebenfalls substituiert werden, im Allgemeinen mit Serin, um die Oxidationsbeständigkeit des Moleküls zu verbessern und aberrierende Vernetzungen zu verhindern. Umgekehrt können eine oder mehrere Cysteinbindungen zum Antikörper hinzugefügt werden, um seine Stabilität zu erhöhen (insbesondere wenn der Antikörper ein Antikörperfragment, wie z. B. ein Fv-Fragment, ist). Eine weitere Aminosäurevariantenart weist ein verändertes Glykosylierungsmuster auf. Dies kann erreicht werden, indem eine oder mehrere Kohlenhydratgruppierungen, die im Antikörper vorhanden sind, deletiert und/oder eine oder mehrere Glykosylierungsstellen, die nicht im Antikörper vorhanden sind, hinzugefügt werden. Die Glykosylierung von Antikörpern erfolgt typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Anbindung der Kohlenhydratgruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X eine Aminosäure außer Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Anbindung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparagin-Seitenkette. Somit schafft die Gegenwart einer beliebigen dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine mögliche Glykosylierungsstelle. O-gebundene Glykosylierung bezieht sich auf die Anbindung eines der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxyaminosäure, meist Serin oder Threonin, obwohl auch 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin verwendet werden können. Die Hinzufügung von Glykosylierungsstellen zum Antikörper wird am besten durch Veränderung der Aminosäuresequenz erreicht, sodass diese eine oder mehrere oder oben beschriebenen Tripeptidsequenzen (für N-gebundene Glykosylierungsstellen) enthält. Die Veränderung kann auch durch die Addition oder Substitution eines oder mehrerer Serin- oder Threoninreste bezüglich der Sequenz des ursprünglichen Antikörpers (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) erfolgen.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die der Eltern-Antikörper sein können und somit eine Modifikation gemäß den hierin ausgeführten Verfahren erfordern, folgen nun:
A. Antikörperherstellung
(i) Antigenherstellung
Lösliche Antigene oder Fragmente davon, gegebenenfalls an andere Moleküle konjugiert, können als Immunogene zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Für Transmembranmoleküle, wie z. B. Rezeptoren, können Fragmente davon (z. B. die extrazelluläre Domäne eines Rezeptors) als Immunogen eingesetzt werden. Alternativ dazu können Zellen, die das Transmembranmolekül exprimieren, als Immunogen eingesetzt werden. Solche Zellen können von einer natürlichen Quelle (z. B. Krebszelllinien) stammen oder Zellen sein, die durch Rekombinationsverfahren transformiert wurden, um das Transmembranmolekül zu exprimieren. Andere Antigene und Formen davon, die für die Herstellung von Antikörpern nützlich sind, werden für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein.
(ii) Polyklonale Antikörper
Polyklonale Antikörper werden vorzugsweise durch mehrfache subkutane (sk) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des relevanten Antigens und eines Adjuvans in Tie ren gebildet. Es kann nützlich sein, das relevante Antigen an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z. B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyreoglobulin oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, unter Anwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, z. B. Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, worin R und R¹ unterschiedliche Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen das Antigen, immunogene Konjugate oder Derivate immunisiert, indem z. B. 100 μg oder 5 μg des Proteins oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina Freundschem Adjuvans kombiniert werden und die Lösung an mehreren Stellen intradermal injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere durch subkutane Injektion an mehreren Stellen mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Peptid- oder Konjugatmenge in komplettem Freundschem Adjuvans geboostet. Sieben bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf einen Antikörpertiter getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer ein Plateau erreicht. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat des gleichen Antigens geboostet, aber an ein anderes Protein und/oder durch ein anderes Vernetzungsreagens konjugiert. Konjugate können auch in einer rekombinanten Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Außerdem werden am besten Aggregationsmittel wie Alaun verwendet, um die Immunantwort zu erhöhen.
(iii) Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper können unter Einsatz des Hybridomverfahrens, das zum ersten Mal von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder mithilfe von DNA-Rekombinationsverfahren ( US-Patent Nr. 4.816.567 ) hergestellt werden.
Beim Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z. B. ein Hamster oder ein Makakenaffe, wie oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten zu erzeugen, die Antikörper produzieren oder zu ihrer Produktion in der Lage sind, welche spezifisch an das für die Immunisierung verwendete Protein bin den. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Dann werden die Lymphozyten unter Einsatz eines geeigneten Fusionsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–103, Academic Press (1986)).
Die so hergestellten Hybridomzellen werden in einem geeigneten Kulturmedium ausgesät und gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten Eltern-Myelomzellen hemmen. Wenn den Eltern-Myelomzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, dann umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminoptherin und Thymidin (HAT-Medium), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
Bevorzugte Myelomzellen sind solche, die effizient fusionieren, eine stabile starke Antikörperproduktion durch die selektierten Antikörperproduktionszellen unterstützen und empfindlich gegenüber einem Medium, wie z. B. HAT-Medium, sind. Davon bevorzugte Myelomzelllinien sind Maus-Myelomlinien, wie z. B. die von MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren stammenden, die am Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, erhältlich sind, und SP-2- oder X63-Ag8-653-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden ebenfalls in Bezug auf die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Produktion Techniques and Applications, 51–63, Marcel Dekker, Inc., New York, USA (1987)).
Ein Kulturmedium, in dem Hybridomzellen wachsen, wird auf die Produktion von monoklonalen Antikörpern getestet, die gegen das Antigen gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch Hybridomzellen erzeugt werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z. B. Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt.
Nachdem jene Hybridomzellen identifiziert wurden, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und durch Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–103, Academic Press (1986)). Für diesen Zweck geeignete Kulturmedien umfassen beispielsweise das D-MEM- oder das RPMI-1640-Medium. Außerdem können die Hybridomzellen in einem Tier in vivo als Ascites-Tumoren gezüchtet werden.
Die durch die Subklone sekretierten monoklonalen Antikörper werden am besten durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z. B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, vom Kulturmedium, von der Ascitesflüssigkeit oder vom Serum getrennt.
DNA, die für die monoklonalen Antikörper kodiert, kann leicht unter Einsatz herkömmlicher Verfahren isoliert und sequenziert werden (z. B. unter Einsatz von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten der monoklonalen Antikörper kodieren). Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle für solche DNA. Nach der Isolation kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen, wie z. B. E. coli-Zellen, Affen-COS-Zellen, Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) oder Myelomzellen, transfiziert werden, welche sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die rekombinante Produktion von Antikörpern wird nachstehend genauer erläutert.
In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper oder Antikörperfragmente aus Antikörperphagenbibliotheken isoliert werden, die unter Einsatz der in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschriebenen Verfahren erzeugt werden. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschreiben die Isolation von Maus- bzw. Humanantikörpern unter Einsatz von Phagenbibliotheken. Nachfolgende Publikationen beschreiben die Produktion von hochaffinen (nM-Bereich) menschlichen Antikörpern durch Kettenaustausch (Marks et al., Bio/Technology 19, 779–783 (1992)) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Herstellung sehr großer Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21, 2265–2266 (1993)), Somit sind diese Verfahren gangbare Alternativen zu traditionellen Hybridomverfahren zur Isolation von monoklonalen Antikörpern.
Die DNA kann auch modifiziert werden, indem beispielsweise die kodierende Sequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen murinen Sequenz substituiert wird ( US-Patent Nr. 4.816,567 ; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)) oder indem die gesamte oder ein Teil der für ein Nichtimmunglobulinpolypeptid kodierenden Sequenz kovalent an die für das Immunglobulin kodierende Sequenz gebunden wird.
Typischerweise werden die konstanten Domänen eines Antikörpers durch solche Nichtimmunglobulinpolypeptide substituiert, oder die variablen Domänen einer antigenbindenden Stelle eines Antikörper werden dadurch substituiert, um einen chimären zweiwertigen Antikörper zu erzeugen, der eine antigenbindenden Stelle mit Spezifität für ein Antigen und eine weitere antigenbindende Stelle mit Spezifität für am anderes Antigen aufweist.
(iv) Humanisierte und menschliche Antikörper
Ein humanisierter Antikörper weist einen oder mehrere eingeführte Aminosäurereste auf, die von einer nichtmenschlichen Quelle stammen. Diese nichtmenschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet und stammen typischerweise von einer variablen „Import"-Domäne. Eine Humanisierung erfolgt im Wesentlichen durch das Verfahren gemäß Winter und seinen Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323, 327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)), indem die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen substituiert werden. Folglich sind solche „humanisierten" Antikörper chimäre An tikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz von einer nichtmenschlichen Spezies substituiert ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste von analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert sind.
Die Wahl der menschlichen variablen Domänen, sowohl leichte als auch schwere, die bei der Herstellung der humanisierten Antikörper eingesetzt werden, ist sehr wichtig, um die Antigenität zu reduzieren. Gemäß der so genannten „Methode der optimalen Anpassung" wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagetierantikörpers gegen die gesamte Bibliothek von bekannten Sequenzen von menschlichen variablen Domänen gescreent. Die menschliche Sequenz, die der des Nagetiers am nächsten ist, wird dann als menschliche FR für den humanisierten Antikörper genommen (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). In einem weiteren Verfahren wird eine bestimmte FR verwendet, die von der Consensus-Sequenz aller menschlichen Antikörper einer bestimmten Subgruppe von leichten oder schweren Kette stammt. Die gleiche FR kann für mehrere unterschiedliche humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
Weiters ist wichtig, dass Antikörper so humanisiert werden, dass die hohe Affinität für das Antigen und andere vorteilhafte biologische Eigenschaften erhalten bleiben. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper gemäß einem bevorzugten Verfahren durch einen Analyseprozess der Eltern-Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Verwendung von dreidimensionalen Modellen der Eltern- und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind allgemein verfügbar und Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Es gibt Computerprogramme, welche mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen von selektierten Kandidaten-Immunglobulinsequenzen veranschaulichen und darstellen. Eine Prüfung dieser Darstellungen erlaubt eine Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bezüglich der Funktion der Kandidaten- Immunglobulinsequenz, d. h. die Analyse von Resten, welche die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins beeinflussen, sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste aus den Rezipienten- und Importsequenzen selektiert und kombiniert werden, sodass die gewünschten Antikörpercharakteristika, wie z. B. erhöhte Affinität für das/die Zielantigen(e), erzielt werden. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und wesentlich an der Einwirkung auf die Antigenbindung beteiligt.
Alternativ dazu ist es nun möglich, nichtmenschliche transgene Tiere (z. B. Mäuse) zu erzeugen, die nach einer Immunisierung in der Lage sind, in Abwesenheit von endogener Immunglobulinproduktion ein volles Repertoire an menschlichen Antikörpern zu erzeugen. Beispielsweise wurde beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Bindungsregions-(-J_H-)Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen zu einer vollständigen Hemmung der endogenen Antikörperproduktion führt. Der Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulingenanordnung in solche keimbahnmutierte Mäuse resultiert bei Antigenprovokation in der Produktion von menschlichen Antikörpern. Siehe z. B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); Bruggerman et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993); und Duchosal et al., Nature 355, 258 (1992). Menschliche Antikörper können auch aus Phagendisplaybibliotheken stammen (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech. 14, 309 (1996)).
(v) Antikörperfragmente
Verschiedene Verfahren für die Produktion von Antikörperfragmenten wurden entwickelt. Herkömmlicherweise wurden diese Fragmente mittels proteolytischem Verdau von intakten Antikörpern abgeleitet (siehe z. B. Moritomo et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 107–117 (1992), und Brennan et al., Science 229, 81 (1985)). Diese Fragmente können nun jedoch direkt durch rekombinante Wirtszellen produziert werden. Die Antikörperfragmente können beispielsweise aus den oben beschriebenen Antikörperphagenbibliotheken isoliert werden. Alternativ dazu können Fab'-SH-Fragmente direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gebunden werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden (Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 (1992)). Gemäß einem weiteren Ansatz können F(ab')₂-Fragmente direkt aus einer rekombinanten Wirtszellkultur isoliert werden. Andere Verfahren für die Produktion von Antikörperfragmenten sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. In anderen Ausführungsformen ist der Antikörper der Wahl ein Einketten-Fv-Fragment (scFv). Siehe WO 93/16185 .
(vi) Multispezifische Antikörper
Multispezifische Antikörper weisen Bindespezifitäten für zumindest zwei unterschiedliche Antigene auf. Während solche Moleküle normalerweise nur an zwei Antigene binden (d. h. bispezifische Antikörper, BsAbs), umfasst diese Bezeichnung hierin auch Antikörper mit zusätzlichen Spezifitäten, wie z. B. trispezifische Antikörper. Beispiele für BsAbs umfassen solche, bei denen ein Arm gegen ein Tumorzellantigen gerichtet ist und der andere Arm gegen ein zytotoxisches Trigger-Molekül gerichtet ist, wie z. B. Anti-FcγRI/Anti-CD15, Ariti-p185^HER2/FcγRIII (CD16), Anti-CD3/Antimaligne-B-Zelle (1D10), Anti-CD3/Antip185^HER2, Anti-CD3/Anti-p97, Anti-CD3/Antinierenzellkarzinom, Anti-CD3/Anti-OVCAR-3, Anti-CD3/L-D1 (Antikolonkarzinom), Anti-CD3/Antimelanozytenstimulationshormonanalogon, Anti-EGF-Rezeptor/Anti-CD3, Anti-CD3/Anti-CAMA1, Anti-CD3/Anti-CD19, Anti-CD3/MoV18, Antinervenzelladhäsionsmolekül (NCAM)/Anti-CD3, Antifolatbindungsprotein (FBP)/Anti-CD3, Antipankarzinomassoziationsantigen (AMOC-31)/Anti-CD3; BsAbs mit einem Arm, der spezifisch an ein Tumorantigen bindet, und einem Arm, der an ein Toxin bindet, wie z. B. Antisaporin/Anti-Id-1, Anti-CD22/Antisaporin, Anti-CD7/Antisaporin, Anti-CD38/Antisaporin, Anti-CEA/Anti-Ricin-A-Kette, Anti-CEA/Anti-Vinca-Alkaloid; BsAbs zur Überführung von enzymaktivierten Prodrugs, wie z. B. Anti-CD30/Anti-alkalische-Phosphatase (katalysiert die Überführung von Mitomycinphosphat-Prodrugs in Mitomycinalkohol); BsAbs, die als Fibrinolytika eingesetzt werden können, wie z. B. Antifibrin/Antigewebeplasminogenaktivator (tPA), Antifibrin/Anti-Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator (uPA); BsAbs zum Targeting von Immunkomplexen auf Zelloberflächenrezeptoren, wie z. B. Anti-Lipoproteine-geringer-Dichte (LDL)/Anti-Fc-Rezeptor (z. B. FcγRI, FcγRII oder FcγRIII); BsAbs zum Einsatz bei der Therapie von Infektionskrankheiten, wie z. B. Anti-CD3/Anti-Herpes-simplex-Virus (HSV), Anti-T-Zellrezeptor:CD3-Komplex/Antiinfluenza, Anti-FcγR/Anti-HIV; BsAbs zur Tumordetektion in vitro oder in vivo, wie z. B. Anti-CEA/Anti-EOTUBE, Anti-CEA/Anti-DPTA, Antip185^HER2/Antihapten; BsAbs als Vakzinadjuvanzien; und BsAbs als diagnostische Werkzeuge, wie z. B. Anti-Kaninchen-IgG/Antiferritin, Antimeerrettichperoxidase (HRP)/Antihormon, Antisomatostatin/Anti-Substanz-P, Anti-HRP/Anti-FITC. Beispiele für trispezifische Antikörper umfassen Anti-CD3/Anti-CD4/Anti-CD37, Anti-CD3/Anti-CD5/Anti-CD37 und Anti-CD3/Anti-CD8/Anti-CD37. Bispezifische Antikörper können als Antikörper voller Länge oder als Antikörperfragmente (z. B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper) hergestellt werden.
Verfahren zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die traditionelle Produktion von bispezifischen Antikörpern voller Länge basiert auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Millstein et al., Nature 305, 537–539 (1983)), Aufgrund der zufälligen Zusammenstellung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise mittels Affinitätschromatographieschritten erfolgt, ist eher aufwendig, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829 und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Gemäß einem anderen Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) an Immunglobulin-Konstantdomänensequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne, die zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Vorzugsweise ist die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), welche die für Leichtkettenbindung erforderliche Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, die Immunglobulinleichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies sorgt für große Flexibilität beim Einstellen der gegenseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, in denen ungleiche Verhältnisse der drei Polypeptidketten, die zur Konstruktion verwendet werden, die optimalen Ausbeuten liefern. Es ist jedoch möglich, die Kodiersequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu höheren Ausbeuten führt oder wenn die Verhältnisse von keiner signifikanten Bedeutung sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes setzen sich die bispezifischen Antikörper aus einer Hybridimmunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybridimmunglobulin-Schwerketten-Leichtkettenpaar (das eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) im anderen Arm zusammen. Es wurde erkannt, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der erwünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für einen leichten Trennungsvorgang sorgt. Dieser Ansatz ist in der WO 94/04690 geoffenbart. Weitere Details zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind beispielsweise in Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986), zu finden.
Gemäß einem anderen Ansatz, der in der WO96/27011 beschrieben wird, kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen verändert werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der C_H3-Domäne einer konstanten Antikörperdomäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehrere kurze Aminosäureseitenketten aus der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch längere Seitenketten (z. B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensations-„Hohlräume” von identischer oder ähnlicher Größe wie die lange(n) Seitenkette(n) werden an der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen der langen Aminosäureseitenkette durch kürzere (z. B. Alanin oder Threonin) gebildet. Dies liefert einen Mechanismus zur Steigerung der Ausbeute des Heterodimers gegenüber unerwünschten Endprodukten wie Homodimeren.
Bispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder „Heterokonjugat"-Antikörper. Beispielsweise kann einer der Antikörper im Heterokonjugat an Avidin, der andere an Biotin gebunden sein. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten ( US-Patent Nr. 4.676.980 ), und wurden auch zur Behandlung von HIV-Infektion vorgeschlagen ( WO 91/00360 , WO 92/200373 und EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Verwendung jedes herkömmlichen Vernetzungsverfahrens hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind im US-Patent Nr. 4.676.980 zusammen mit zahlreichen Vernetzungsverfahren offenbart.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten werden auch in der Literatur beschrieben. Beispielsweise können bispezifische Antikörper unter Verwendung von chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexierungsmittels Natriumarsenit reduziert, um vicinale Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu unterbinden. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat-(TNB-)Derivaten umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird wieder zum Fab'-Thiol durch Reduktion mit Mercaptoethylamin umgesetzt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats vermischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die hergestellten bispezifischen Antikörper können als Mittel zur selektiven Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Jüngste Fortschritte erleichterten die direkte Gewinnung von Fab'-SH-Fragmenten aus E. coli, die chemisch gebunden werden können, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Herstel lung eines vollständig humanisierten bispezifischen Antikörper-F(ab')₂-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde getrennt aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Bindung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete bispezifische Antikörper war in der Lage, sich an Zellen, die den ErbB2-Rezeptor überexprimierten, und normale menschliche T-Zellen zu binden sowie die lytische Aktivität von menschlichen zytotoxischen Lymphozyten gegen menschliche Brusttumortargets auszulösen.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Isolierung bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur wurden ebenfalls bereits beschrieben. Beispielsweise wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucinzippern hergestellt. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992). Die Leucinzipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern mittels Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Produktion von Antikörper-Homodimeren verwendet werden. Die „Diabody"-Technologie, die von Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben wird, stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung von bispezifischen Antikörperfragmenten bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (V_H), gebunden an eine variable Leichtkettendomäne (V_L) über einen Linker, der zu kurz ist, um Paarbildung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Folglich werden die V_H- und V_L-Domänen eines Fragments gezwungen, mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments Paare zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Auch von einer anderen Vorgehensweise zur Herstellung von bispezifischen Antikörperfragmenten durch die Verwendung von einkettigen Fv-(sFv-)Dimeren wurde bereits berichtet. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Antikörper mit mehr als zwei Wertigkeiten werden auch erwogen. Beispielsweise können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
(vii) Effektorfunktionsbearbeitung
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren, um z. B. die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Behandlung von Krebs zu steigern. Beispielsweise können ein oder mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigertes komplementvermitteltes Zelltöten und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen, Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper so bearbeitet werden, dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten verfügen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
(viii) Immunkonjugate
Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die den hierin beschriebenen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z. B. ein enzymatisch aktives Toxin oder ein Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder auch von Pilzen oder Fragmente davon) oder an ein radioaktives Isotop (d. h. ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
Chemotherapeutische Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen die Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, die Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), die Ricin-A-Kette, die Abrin-A-Kette, die Modeccin-A-Kette, α-Sarcin, Aleuri tes-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), den Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, den Sapaonariaofficinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z. B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiver Ester (wie z. B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z. B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie z. B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z. B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. Kohlenstoff-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein Beispiel für Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026 .
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen „Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und der anschließenden Verabreichung eines „Liganden" (z. B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z. B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
(ix) Immunoliposomen
Die hierin offenbarten Antikörpervarianten können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben werden. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter von definierter Porengröße filtriert, um Liposomen mit dem erwünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
(x) Antikörper-dirigierte Enzym-Prodrug-Therapie (ADEPT)
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann auch in ADEPT durch Konjugieren des Antikörpers an ein Prodrug-aktivierendes Enzym, das cm Prodrug (z. B. ein chemotherapeutisches Peptidyl-Mittel, siehe die WO 81/01145 ) in einen aktives Antikrebs-Wirkstoff überführt, verwendet werden. Siehe beispielsweise die WO 88/07378 und das US-Patent Nr. 4.975.278 .
Die Enzymkomponente des Immunokonjugats, die für ADEPT nützlich ist, umfasst jedes beliebige Enzym, das in der Lage ist, auf ein Prodrug auf solche Weise zu wirken, dass es dieses in seine aktivere, zytotoxische Form überführt.
Enzyme, die im Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, alkalische Phosphatase, die zur Überführung von phosphathältigen Prodrugs in freie Wirkstoffe nützlich ist; Arylsulfatase, die zur Überführung von sulfathältigen Prodrugs in freie Wirkstoffe nützlich ist; Cytosindesaminase, die zur Überführung von nichttoxischem 5-Fluorcytosin in den Antikrebs-Wirkstoff 5-Fluoruracil nützlich ist; Proteasen, wie z. B. Serratia-Protease, Thermolysin, Subtilisin, Carboxypeptidasen und Cathepsine (wie z. B. Cathepsine B und L), die zur Überführung von peptidhältigen Prodrugs in freie Wirkstoffe nützlich sind; D-Alanylcarboxypeptidasen, die zur Überführung von Prodrugs nützlich sind, die D-Aminosäuresubstituenten enthalten; kohlenhydratspaltende Enzyme wie z. B. β-Galactosidase und Neuraminidase, die zur Überführung von glykosylierten Prodrugs in freie Wirkstoffe nützlich sind; β-Lactamase, die zur Überführung von Wirkstoffen, die mit β-Lactamen derivatisiert sind, in freie Wirkstoffe nützlich ist; und Penicillin-Amidasen, wie z. B. Penicillin-V-Amidase oder Penicillin-G-Amidase, die zur Überführung von Wirkstoffen, die an ihren Amin-Stickstoffen mit Phenoxyacetyl- bzw. Phenylacetylgruppen derivatisiert sind, in freie Wirkstoffe nützlich sind. Alternativ dazu können Antikörper mit enzymatischer Aktivität, die auch als „Abzyme" bekannt sind, verwendet werden, um die Prodrugs der Erfindung in freie aktive Wirkstoffen zu überführen (siehe z. B. Massey, Nature 328, 457–458 (1987)). Antikörper-Abzym-Konjugate können wie hierin für die Zufuhr des Abzyms zu einer Tumorzellpopulation hergestellt werden.
Die Enzyme dieser Erfindung können kovalent an die Antikörpermutante mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie beispielsweise mittels der Verwendung der heterobifunktionellen Vernetzer wie zuvor erläutert, gebunden werden. Alternativ dazu können Fusionsproteine, die zumindest die Antigen-Bindungsregion eines Antikörpers der Erfindung, gebunden an zumindest einen funktionell aktiven Abschnitt eines Enzyms der Erfindung, umfasst, unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, konstruiert werden (siehe z. B. Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984)).
(xi) Antikörper-Salvage-Rezeptorbindungsepitopfusionen
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann es wünschenswert sein, ein Antikörperfragment zu verwenden und keinen intakten Antikörper, um beispielsweise die Tumorpenetration zu verbessern. In diesem Fall kann es wünschenswert sein, das Antikörperfragment zu modifizieren, um seine Serumhalbwertszeit zu erhöhen. Dies kann beispielsweise erreicht werden, indem ein Salvage-Rezeptorbindungsepitop in das Antikörperfragment inkorporiert wird (z. B. durch Mutation der geeigneten Region im Antikörperfragment oder durch Inkorporation des Epitops in eine Peptidmarkierung, die dann an einem beliebigen Ende oder in der Mitte an das Antikörperfragment fusioniert wird, z. B. durch DNA- oder Peptidsynthese).
Das Salvage-Rezeptorbindungsepitop stellt vorzugsweise eine Region dar, in der ein oder mehrere Aminosäurereste von einer oder zwei Schleifen einer Fc-Domäne an eine analoge Position des Antikörperfragments transferiert sind. Noch bevorzugter sind drei oder mehr Reste von einer oder von zwei Schleifen der Fc-Domäne transferiert. Noch bevorzugter ist das Epitop aus der CH2-Domäne der Fc-Region (z. B. eines IgG) entnommen und in die CH1-, CH3- oder V_H-Region oder mehr als eine solche Region des Antikörpers transferiert. Alternativ dazu ist das Epitop aus der CH2-Domäne der Fc-Region entnommen und in die C_L-Region oder V_L-Region oder beide des Antikörperfragments transferiert. Siehe z. B. US-Patent 5.739.277 , das am 14. April 1998 ausgegeben wurde.
(xii) Kovalente Modifikationen
Kovalente Modifikationen des Antikörpers liegen im Schutzumfang dieser Erfindung. Sie können, sofern geeignet, durch chemische Synthese oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des Antikörpers erfolgen. Andere Arten von kovalenten Modifikationen des Antikörpers werden durch Umsetzung des gewünschten Aminosäurerests des Antikörpers mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten zu reagieren, in das Molekül eingeführt.
Die Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen, die am Antikörper vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch erfolgen. Eine chemische Deglykosylierung erfordert die Aussetzung des Antikörpers gegenüber der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Behandlung resultiert in der Spaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme des verbindenden Zuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während der Antikörper intakt bleibt. Die chemische Deglykosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Antikörpern kann durch den Einsatz zahlreicher verschiedener Endo- und Exoglykosidasen, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben, erreicht werden.
Ein anderer Typ von kovalenter Modifikation des Antikörpers umfasst das Binden des Antikörpers an eines von zahlreichen verschiedenen, nicht-proteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf eine Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben ist.
B. Vektoren, Wirtszellen und Rekombinationsverfahren
Die Erfindung stellt auch isolierte Nucleinsäure, die für eine Antikörpervariante wie hierin geoffenbart kodiert, Vektoren und Wirtszellen, welche die Nucleinsäure umfassen, sowie Rekombinationsverfahren zur Herstellung der Antikörpervariante bereit.
Für die rekombinante Herstellung der Antikörpervariante wird die dafür kodierende Nucleinsäure isoliert und für eine weitere Klonierung (Amplifikation der DNA) oder für eine Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert. DNA, die für die monoklonale Antikörpervariante kodiert, kann leicht unter Anwendung herkömmlicher Verfahren isoliert und sequenziert werden (z. B. durch den Einsatz von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an für die Schwer- und Leichtketten der Antikörpervariante kodierende Gene zu binden). Zahlreiche Vektoren stehen zur Verfügung. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eines oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
(I) Signalsequenzkomponente
Die Antikörpervariante dieser Erfindung kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das vorzugsweise eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids ist. Die vorzugsweise ausgewählte heterologe Signalsequenz ist eine, die durch die Wirtszelle erkannt und verarbeitet (z. B. durch eine Signalpeptidase gespaltet) wird. Bei prokaryotischen Wirtszellen, welche die native Antikörper-Signalsequenz nicht erkennen und verarbeiten, wird die Signalsequenz durch eine selektierte prokaryotische Signalsequenz substituiert, beispielsweise eine aus der Gruppe der alkalischen Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Entrotoxin-II-Leader. Zur Hefesekretion kann die native Signalsequenz durch z. B. den Hefe-Invertaseleader, α-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader), oder saure-Phosphatase-Leader, den C.-albicans-Glucoamylase-Leader oder das in der WO 90/13646 beschriebene Signal substituiert werden. Bei der Säugetier-Zellexpression stehen Säugetier-Signalsequenzen sowie virale Sekretionsleader, beispielsweise das Herpes-simplex-gD-Signal, zur Verfügung.
Die DNA für solch eine Vorläuferregion wird in Leseraster an DNA, die für die Antikörpervariante kodiert, ligiert.
(ii) Komponente des Replikationsursprungs
Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren selektierten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Kloniervektoren eine, die dem Vektor die Fähigkeit verleiht, sich unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und umfasst Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen bedarf es der Replikationsursprungskomponente bei Säugetier-Expressionsvektoren nicht (der SV40-Ursprung kann typischerweise nur verwendet werden, da er den frühen Promotor enthält).
(iii) Selektionsgenkomponente
Expressions- und Kloniervektoren können ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Protelne, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotroxat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel komplementieren oder (c) essenzielle Nährstoffe liefern, die aus komplexe Medien nicht erhältlich sind, z. B. das für D-Alaninracemase kodierende Gen für Bacilli.
Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet einen Wirkstoff, um Wachstum einer Wirtszelle anzuhalten. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert wurden, produzieren ein Protein, das Wirkstoffresistenz verleiht, und überleben somit das Selektionsschema. Beispiele für solche dominante Selektion verwenden die Wirkstoffe Neomycin, Mycophenolsäure und Hygromycin.
Ein anderes Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die Antikörper-Nucleinsäure aufzunehmen, wie z. B. DHFR, Thymidinkinase, Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosindesaminase, Ornithindecarboxylase usw.
Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert sind, werden beispielsweise zuerst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält. Eine geeignete Wirtszelle, wenn Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist die Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt.
Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wildtyp-Wirte, die endogene DHFR enthalten), die mit DNA-Sequenzen, die für einen Antikörper kodieren, Wildtyp-DHFR-Protein und anderen selektierbaren Markern wie z. B. Aminoglycosid-3'-phosphotransferase (APH) transformiert oder co-transformiert sind, durch Zeltwachstum in Medium, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker, wie z. B. ein aminoglykosidisches Antibiotikum, z. B. Kanamycin, Neomycin oder G418, enthält, selektiert werden. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199 .
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp-1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979)). Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1. Jones, Genetics 85, 12 (1977). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefe-Wirtszellgenom sorgt dann für eine wirksame Umgebung zur Detektion von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. in ähnlicher Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide, die Leu2-Gen in sich tragen, komplementiert.
Darüber hinaus können Vektoren, die vom ringförmigen 1,6-μm-Plasmid pKD1 abstammen, zur Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden. Alterna tiv dazu wurde über ein Expressionssystem zur großtechnischen Herstellung von rekombinantem Kälber-Chymosin für K. lactis berichtet. Van den Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Mehrfachkopien-Expressionsvektoren zur Sekretion von reifem rekombinantem menschlichem Serumalbumin durch industrielle Stämme von Kluyveromyces wurden auch bereits offenbart. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991).
(iv) Promotorkomponente
Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die Antikörper-Nucleinsäure gebunden ist. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen den phoA-Promotor, β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme, alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem und Hybridpromotoren, wie z. B. den tac-Promotor. Es sind jedoch auch andere bakterielle Promotoren geeignet. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S. D.-)Sequenz, die operabel an die für den Antikörper kodierende DNA gebunden ist.
Promotorsequenzen sind für Eukaryoten bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle, an der Transkription initiiert wird, liegt. Eine andere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromauf vom Transkriptionsstart zahlreicher Gene liegt, ist eine CNCAAT-Region, worin N für jedes beliebige Nucleotid stehen kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene liegt eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der Kodiersequenz darstellen kann. Alle diese Sequenzen werden auf geeignete Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, wie beispielsweise Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil von durch Wachstumsbedingungen gesteuerter Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden näher in der EP 73.657 beschrieben. Hefe-Enhancer werden auch vorteilhafterweise mit Hefepromotoren verwendet.
Antikörpertranskription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie z. B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus, Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und, am meisten bevorzugt, Affenvirus 40 (SV 40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z. B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, aus Hitzeschock-Promotoren erhalten werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden leicht aus einem SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält. Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Zytomegalie-Virus ist leicht als ein HindIII-E-Restriktionsfragment zu erhalten. Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinderpapillomavirus als Vektor ist im US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Alternativ dazu kann auch die lange terminale Wiederholung des Rous-Sarkomvirus als Promotor verwendet werden.
(v) Enhancerelement-Komponente
Die Transkription einer DNA, die für den Antikörper dieser Erfindung kodiert, durch höhere Eukaryoten wird häufig durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Zahlreiche Enhancersequenzen sind nun aus Säugetiergenen (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin) bekannt. Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), die frühen Promotorenhancer des Zytomegalie-Virus, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), bezüglich Enhancerelemente zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur Antikörper-Kodiersequenz gespleißt werden, liegt jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
(vi) Transkriptionsterminationskomponente
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekt, Pflanze, Tier, Mensch oder kernhaltigen Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'-, und gegebenenfalls 3'-, Regionen von eukaryotischen oder viralen DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente transkribiert werden, in dem untranslatierten Abschnitt der mRNA, die für den Antikörper kodiert. Eine nützliche Transkriptionsterminationskomponente ist die Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungsregion. Siehe WO94/11026 und den darin geoffenbarten Expressionsvektor.
(vii) Selektion und Transformation von Wirtszellen
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den Vektoren hierin sind die zuvor beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten für diesen Zweck umfassen Eubakterien, wie z. B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie Escherichia, z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli wie z. B. B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas wie z. B. P. aeruginosa und Streptomyces. Ein bevorzugter E.-coli-Klonierwirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obwohl andere Stämme wie beispielsweise E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325) geeignet sind. Diese Beispiele dienen zur Veranschaulichung und stellen keine Einschränkung dar.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z. B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonier- oder Expressionswirte für Antikörper-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae, oder gewöhnliche Bäckerhefe, wird unter niedereren eukaryotischen Wirts-Mikroorganismen am häufigsten verwendet. Es sind jedoch auch zahlreiche andere Gattungen, Spezies und Stämme allgemein erhältlich und hierin nützlich, wie z. B. Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces-Wirte, wie z. B. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltlii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa; Schwanniomyces wie z. B. Schwanniomyces occidentalis; und Fadenpilze wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium und Aspergillus-Wirte wie z. B. A. nidulans und A. niger.
Geeignete Wirtszellen für die Expression eines glykosylierten Antikörpers stammen von vielzelligen Organismen. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und -Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten wie z. B. Spodoptera frugiper da (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori wurden bereits identifiziert. Zahlreiche Virusstämme zur Transfektion sind öffentlich erhältlich, z. B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können als das Virus hierin gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, verwendet werden. Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte verwendet werden.
Das Interesse war jedoch stets für Wirbeltierzellen am größten, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist zu einem Routineverfahren geworden. Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszelllinien sind Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293- oder 293-Zellen, für Wachstum in Suspensionskultur subkloniert, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL 1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden mit den zuvor beschriebenen Expressions- und Kloniervektoren zur Antikörperherstellung transformiert und in herkömmlichem Nährmedium, modifiziert je nach Bedarf zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikationen der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, kultiviert.
(viii) Kultivieren der Wirtszellen
Die zur Herstellung der Antikörpervariante dieser Erfindung verwendeten Wirtszellen können in zahlreichen verschiedenen Medien kultiviert werden. Handelsübliche Medien wie z. B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Weiters können sämtliche Medien, die in Ham et al., Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem. 102, 255 (1980); in den US-Patenten Nr. 4.767.704 , 4.657.866 , 4.927.762 , 4.560.655 oder 5.122.469 ; WO 90/03430 , WO 87/00195 ; oder US-Patent Re. 30.985 beschrieben werden, als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jegliches dieser Medien kann, je nach Bedarf, mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z. B. Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z. B. HEPES), Nucleotiden (wie z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z. B. Wirkstoff GENTAMYCIN^TM), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Auch jegliche anderen erforderlichen Ergänzungen können bei geeigneten Konzentrationen eingebunden werden, die Fachleuten bekannt sein werden. Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH und dergleichen sind jene, die davor für die zur Expression selektierte Wirtszelle verwendet wurden, und werden durchschnittlichen Fachleuten ersichtlich sein.
(ix) Antikörperreinigung
Werden Rekombinationsverfahren eingesetzt, so kann die Antikörpervariante intrazellulär oder im periplasmatischen Raum hergestellt oder direkt in das Medium sekretiert werden. Wenn die Antikörpervariante intrazellulär hergestellt wird, werden im ersten Schritt Teilchenbruchstücke, entweder Wirtszellen oder lysierte Fragmente, entfernt, beispielsweise durch Zentrifugation oder Ultrafiltration. Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 (1992), beschreiben ein Verfahren zur Isolation von Antikörpern, die in den periplastmatischen Raum von E. coli sekretiert werden. Kurz ge sagt wird Zellpaste in Gegenwart von Natriumacetat (pH 3,5), EDTA und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) über einen Zeitraum von etwa 30 min aufgetaut. Zellbruchstücke können durch Zentrifugation entfernt werden. Wenn die Antikörpervariante in das Medium sekretiert wird, werden Überstände von solchen Expressionssystemen im Allgemeinen zuerst unter Einsatz eines handelsüblichen Proteinkonzentrationsfilters, z. B. einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, eingeengt. Ein Proteaseinhibitor, wie z. B. PMSF, kann in einen beliebigen der oben genannten Schritte eingeschlossen werden, um die Proteolyse zu hemmen, und Antibiotika können verwendet werden, um das Wachstum von zufälligen Kontaminanten zu verhindern.
Die aus den Zellen hergestellte Antikörperzusammensetzung kann beispielsweise unter Einsatz von Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse und Affinitätschromatographie gereinigt werden, wobei Affinitätschromatographie die bevorzugte Reinigungstechnik ist. Die Eignung von Protein A als Affinitätsligand hängt von der Spezies und dem Isotyp aller Immunglobulin-Fc-Domänen ab, die in der Antikörpervariante vorhanden sind. Protein A kann zur Reinigung von Antikörpern eingesetzt werden, die auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ-4-Schwerketten aufbauen (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)). Protein G wird für alle Maus-Isotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 (1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand gebunden ist, ist sehr häufig Agarose, wobei jedoch auch andere Matrizen erhältlich sind. Mechanisch stabile Matrizen, wie z. B. Controlled Pore Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol, ermöglichen raschere Durchflussgeschwindigkeiten und kürzere Verarbeitungszeiten als mit Agarose erreicht werden können. Wenn die Antikörpervariante eine C_H3-Domäne umfasst, ist das Bakerbond-ABX^TM-Harz (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) zur Reinigung geeignet. Andere Verfahren zur Proteinreinigung, wie z. B. Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie auf Silica, Chromatographie auf Heparin-SEPHAROSE^TM, Chromatographie auf einem Anionen- oder Kationenaustauschharz (wie z. B. einer Polyasparaginsäurensäule), Chro matofokussierung, SDS-PAGE und Ammoniumsulfatfällung, sind, abhängig von der zu gewinnenden Antikörpervariante, ebenfalls verfügbar,
C. Pharmazeutische Formulierungen
Therapeutische Formulierungen der Antikörpervariante werden zur Lagerung durch Vermischen der Antikörpervariante, der den erwünschten Reinheitsgrad aufweist, mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von gefriergetrockneten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen gegenüber Rezipienten nichttoxisch und umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid; Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene wie Methyl- oder Propylparaben; Catechin; Resorcinol; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Cresol); niedermolekulare Polypeptide (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zucker wie Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie Natrium; Metallkomplexe (z. B. Zn-Proteinkomplexe); und/oder nichtionische Tenside wie TWEEN^TM, PLURONIC^TM oder Polyethylenglykol (PEG).
Die Formulierung hierin kann auch mehr als einen Wirkstoff enthalten, sofern dies für die bestimmte zu behandelnde Indikation erforderlich ist, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Es kann beispielsweise wünschenswert sein, weiters ein Immunsuppressivum bereitzustellen.
Solche Moleküle sind am besten in Kombinationen und in Mengen vorhanden, die für den gewünschten Zweck wirksam sind.
Die Wirkstoffe können auch in Mikrokapseln eingeschlossen sein, die beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)mikrokapseln, in kolloidalen Wirkstoffzufuhrsystemen (z. B. Liposomen, Albuminmikroperlen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980), geoffenbart.
Die zur In-vivo-Verabreichung verwendeten Formulierungen müssen steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erreicht werden.
Es können auch Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrices aus festen hydrophoben Polymeren, welche die Antikörpervariante enthalten, worin die Matrices in Form von Formartikeln, z. B. Folien oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrices umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikroperlen, zusammengesetzt aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere, wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäureglykolsäure, die Freisetzung von Molekülen über 100 Tage lang ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine für kürzere Zeitabschnitte frei. Wenn eingekapselte Antikörper lange Zeit im Körper verbleiben, können sie aufgrund der Einwirkung von Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust an biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen in der Immunogenität führt. Zur Stabilisierung können je nach involviertem Mechanismus rationale Strategien entwickelt werden. Wenn beispielsweise entdeckt wird, dass der Aggregationsmechamisums die Bildung einer intermolekularen S-S-Bindung durch Thio-Disulfid-Austausch ist, kann eine Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Gefriertrocknen aus sauren Lösungen, Regelung des Feuchtigkeitsgehalts, Einsatz geeigneter Additive und Entwicklung spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen erfolgen.
D. Nichttherapeutische Anwendungen der Antikörpervariante
Die Antikörpervarianten der Erfindung können als Affinitätsreinigungsmittel verwendet werden. Bei diesem Verfahren werden die Antikörper mithilfe von auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren auf einer Festphase, wie z. B. einem Sephadex-Harz oder Filterpapier, immobilisiert. Die immobilisierte Antikörpervariante wird mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende Antigen enthält, und danach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen alle Materialien in der Probe mit Ausnahme des zu reinigenden Antigens, das an die immobilisierte Antikörpervariante gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem weiteren geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Glycinpuffer, pH 5,0, gewaschen, der das Antigen aus der Antikörpervariante freisetzt.
Die Antikörpervarianten können auch in diagnostischen Tests von Nutzen sein, z. B. zur Detektion der Expression eines Antigens von Interesse in bestimmten Zellen, Geweben oder in einem Serum.
Für diagnostische Anwendungen wird die Antikörpervariante typischerweise mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert. Zahlreiche Markierungen stehen zur Verfügung, die im Allgemeinen in die folgenden Kategorien eingeteilt werden können:

(a) Radioisotope, wie z. B. ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H und ¹³¹I. Die Antikörpervariante kann beispielsweise unter Einsatz der in Current Protocols in Immunology, Bd. 1 und 2, Coligen et al., Hrsg., Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991), beschriebenen Verfahren mit dem Radioisotop markiert werden, und die Radioaktivität kann mithilfe von Szintillationszählung gemessen werden.
(b) Fluoreszenzmarkierungen, wie z. B. Seltenerdchelate (Europiumchelate) oder Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Lissamin, Phycoerythrin und Texas-Rot stehen zur Verfügung. Die fluoreszierenden Markierungen können beispielsweise unter Einsatz von in Current Protocols in Immunology, w. o., beschriebenen Verfahren an die Antikörpervariante konjugiert werden. Die Fluoreszenz kann mithilfe eines Fluorimeters quantifiziert werden.
(c) Verschiedene Enzym-Substrat-Markierungen sind verfügbar, und das US-Patent Nr. 4.275.149 gibt einen Überblick über einige davon. Das Enzym katalysiert im Allgemeinen eine chemische Veränderung des chromogenen Substrats, die mithilfe verschiedener Verfahren gemessen werden kann. Beispielsweise kann das Enzym eine Farbänderung in einem Substrat katalysieren, die spektrophotometrisch gemessen werden kann. Alternativ dazu kann das Enzym die Fluoreszenz oder Chemilumineszenz des Substrats verändern. Verfahren zur Quantifizierung einer Änderung der Fluoreszenz sind oben beschrieben. Das chemilumineszierende Substrat wird durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt und kann dann Licht emittieren, das gemessen werden kann (beispielsweise mithilfe eines Chemiluminometers), oder Energie an einen Fluoreszenzakzeptor abgeben. Beispiele für enzymatische Markierungen umfassen Luciferasen (z. B. Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase; US-Patent Nr. 4.737.456 ), Luciferin, 2,3-Dihydrophthalazindione, Malatdehydrogenase, Uresse, Peroxidase, wie z. B. Meerrettichperoxidase (HRPO), alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharidoxidasen (z. B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase), heterozyklische Oxidasen (z. B. Uricase und Xanthinoxidase), Lactoperoxidase, Mikroperoxidase und dergleichen. Verfahren zur Konjugation von Enzymen an Antikörper sind in O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. 73, 147–166, J. Langone & H. Van Vunakis, Hrsg., Academic Press, New York (1981), beschrieben.

Beispiele für Enzym-Substrat-Kombinationen umfassen beispielsweise:

(i) Meerrettichperoxidase (HRPO) mit Wasserstoffperoxidase als Substrat, worin die Wasserstoffperoxidase einen Farbstoffvorläufer oxidiert (z. B. Orthophenylendiamin (OPD) oder 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinhydrochlorid (TMB));
(ii) alkalische Phosphatase (AP) mit para-Nitrophenylphosphat als chromogenes Substrat; und
(iii) β-D-Galactosidase (β-D-Gal) mit einem chromogenen Substrat (z. B. p-Nitrophenyl-β-D-galactosidase) oder fluorogenen Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosidase.

Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung stehen noch zahlreiche andere Enzym-Substrat-Kombinationen zur Verfügung. Für einen allgemeinen Überblick darüber siehe die US-Patent Nr. 4.275.149 und 3.318.980 .
Manchmal ist die Markierung indirekt mit der Antikörpervariante konjugiert. Fachleute werden verschiedene Verfahren kennen, um dies zu erreichen. Beispielsweise kann die Antikörpervariante mit Biotin konjugiert werden, und eine beliebige der oben genannten drei großen Kategorien von Markierungen kann mit Avidin konjugiert werden, oder umgekehrt. Biotin bindet selektiv an Avidin, und somit kann die Markierung auf diese indirekte Weise mit der Antikörpervariante konjugiert werden. Alternativ dazu wird, um eine indirekte Konjugation dieser Markierung mit der Antikörpervariante zu erreichen, die Antikörpervariante mit einem kleinen Hapten (z. B. Digoxin) konjugiert, und eine der verschiedenen oben genannten Markierungsarten wird mit einer Anti-Hapten-Antikörpervariante (z. B. einem Anti-Digoxin-Antikörper) konjugiert. So kann eine indirekte Konjugation der Markierung mit der Antikörpervariante erreicht werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung muss die Antikörpervariante nicht markiert werden, und ihre Gegenwart kann unter Einsatz eines markierten Antikörpers nachgewiesen werden, der an die Antikörpervariante bindet.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jedem beliebigen bekannten Testverfahren eingesetzt werden, z. B. in kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwich-Tests und Immunpräzipiationstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158, CRC Press Inc. (1987)).
Kompetitive Bindungstest stützen sich auf die Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Prüfprobenanalyt um die Bindung mit einer begrenzten Menge einer Antikörpervariante zu konkurrieren. Die Antigenmenge in der Prüfprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, der an die Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge des Standards, der gebunden wird, zu erleichtern, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach dem Kompetitionsvorgang unlöslich gemacht, sodass der Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden werden, leicht vom Standard und Analyt getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
Sandwichtests umfassen den Einsatz von zwei Antikörpern, von denen jeder zur Bindung eines anderen immunogenen Abschnitts, oder Epitops, des nachzuweisenden Proteins in der Lage ist. In einem Sandwichtest wird der Prüfprobenanalyt durch einen ersten Antikörper gebunden, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyt, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4.376.110 . Der zweite Antikörper kann selbst mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein (siehe Sandwichtests) oder kann unter Einsatz eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist, gemessen werden (indirekter Sandwichtest). Eine Sandwichtestart ist z. B. ein ELISA-Test, bei dem die nachweisbare Gruppierung ein Enzym ist.
Für immunhistochemische Zwecke kann die Tumorprobe frisch oder gefroren sein oder in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel, wie z. B. Formalin, fixiert sein.
Die Antikörper können auch für In-vivo-Diagnosetests verwendet werden. Im Allgemeinen ist die Antikörpervariante mit einem Radionuclid (wie z. B. ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ³²P oder ³⁵S) markiert, sodass der Tumor mithilfe von Immunszintigraphie lokalisiert werden kann.
E. Diagnosesets
Zur einfacheren Handhabung kann die Antikörpervariante der vorliegenden Erfindung in einem Set bereitgestellt werden, d. h. als verpackte Kombination von Reagenzien in vorbestimmten Mengen mit Anleitungen zur Durchführung des Diagnosetests. Wenn die Antikörpervariante mit einem Enzym markiert ist, umfasst das Set Substrate und Cofaktoren, die vom Enzym benötigt werden (z. B. einen Substratvorläufer, der ein nachweisbares Chromophor oder Fluorophor bereitstellt). Außerdem können noch andere Additive inkludiert sein, wie z. B. Stabilisatoren, Puffer (z. B. ein Blockierungspuffer oder Lysepuffer) und dergleichen. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien können stark variiert werden, um Lösungskonzentrationen der Reagenzien bereitzustellen, welche die Empfindlichkeit des Tests deutlich optimieren. Genauer gesagt können die Reagenzien als Trockenpulver, üblicherweise gefriergetrocknet, bereitgestellt werden, die Exzipienten enthalten, die beim Lösen eine Reagenslösung mit der geeigneten Konzentration ergeben.
F. In-vivo-Anwendungen für die Antikörpervariante
Für therapeutische Anwendungen werden die Antikörpervarianten der Erfindung einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsform, wie sie oben erläutert ist, verabreicht, einschließlich solcher, die Menschen intravenös als Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über einen bestimmten Zeitraum, auf intramuskulärem, intraperitonealem, intrazerebrospinalem, subkutanem, intraartikulärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem oder Inhalationsweg verabreicht werden können. Die Antikörper können auch auf intratumoralem, peritumoralem, intraläsionalem oder periläsionalem Weg verabreicht werden, um lokale sowie systemische therapeutische Wirkungen zu erzielen. Vom intraperitonealen Weg wird erwartet, dass er beispielsweise bei der Behandlung von Ovarialtumoren besonders gut geeignet ist. Außerdem kann die Antikörpervariante durch gepulste Infusion, insbesondere mit abnehmenden Dosen der Antikörpervariante, geeignet verabreicht werden. Vorzugsweise wird die Dosierung mittels Injektionen verabreicht, insbesondere mittels intravenöser oder subkutaner Injektionen, teilweise abhängig davon, ob die Verabreichung kurz oder chronisch erfolgt.
Bei der Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit hängt die geeignete Dosis der Antikörpervariante von der Art der zu behandelnden Krankheit, der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, davon, ob die Antikörpervariante zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von vorangegangenen Therapien, von der Krankengeschichte des Patienten und von der Reaktion auf die Antikörpervariante sowie vom Ermessen des behandelnden Arztes ab. Die Antikörpervariante wird dem Patienten am besten auf einmal oder in einer Reihe von Behandlungen geeignet verabreicht.
Das Beispiel hierin betrifft einen Anti-VEGF-Antikörper. Anti-VEGF-Antikörper sind bei der Behandlung von verschiedenen neoplastischen und nichtneoplastischen Erkrankungen und Leiden nützlich. Neoplasmen und verwandte Leiden, die auf eine Behandlung ansprechen, umfassen Mammakarzinome, Lungenkarzinome, Magenkarzinome, Ösophaguskarzinome, kolorektale Karzinome, Leberkarzinome, Ovarialkarzinome, Thekazelltumoren, Arrhenoblastome, Zervixkarzinome, Endometriumkarzinome, Endometriumhyperplasie, Endometriose, Fibrosarkome, Chorionkarzinome, Kopf-und-Hals-Krebs, Nasopharyngealkarzinome, Larynxkarzinome, Hepatoblastome, Kaposi-Sarkom, Melanome, Hautkarzinome, Hämangiome, kavernöse Hämangiome, Hämangioblastome, Pankreaskarzinome, Retinoblastome, Astrozytome, Glioblastome, Schwannome, Oligodendrogliome, Medulloblastome, Neuroblastome, Rhabdomyosarkome, Osteosarkome, Leiomyosarkome, Harnwegkarzinome, Schilddrüsenkarzinome, Wilms-Tumoren, Nierenzellkarzinome, Prostatakarzinome, abnorme Gefäßproliferation im Zusammenhang mit Phakomatosen, Ödeme (wie z. B. mit Hirntumoren assoziierte) und das Meigs-Syndrom.
Nichtneoplastische Leiden, die auf eine Behandlung ansprechen, umfassen rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Atherosklerose, Diabetes und andere proliferative Retinopathien, einschließlich der Retinopathia praematurorum, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläre Glaukome, altersbedingte Makuladegeneration, Schilddrüsenhyperplasie (einschließlich Basedow-Krankheit), Hornhaut- und andere Gewebetransplantationen, chronische Entzündungen, Lungenentzündungen, das nephrotische Syndrom, Präeklampsie, Aszites, Perikarderguss (wie z. B. im Zusammenhang mit Perikarditis) und Pleuraerguss.
Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für starken Sehverlust bei älteren Menschen. Die exsudative Form von AMD ist durch chorioidale Neovaskularisation und retinale Pigmentepithelzellenablösung gekennzeichnet. Da chorioidale Neovaskularisation mit einer dramatischen Verschlechterung der Prognose einhergeht, ist zu erwarten, dass die VEGF-Antikörper der vorliegenden Erfindung besonders nützlich bei der Reduktion des Schweregrades von AMD sein werden.
Je nach Art und Schwere der Erkrankung ist etwa 1 μg/kg bis 15 mg/kg (z. B. 0,1–20 mg/kg) einer Antikörpervariante eine geeignete Anfangsdosierung zur Verabreichung an einen Patienten, egal ob mittels einer oder mehrer separater Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion. Eine typische Tagesdosis kann, je nach den oben angeführten Faktoren, von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr betragen. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger wird die Behandlung, je nach Leiden, so lange fortgesetzt, bis eine gewünschte Suppression von Krankheitssymptomen auftritt. Andere Dosierungsschemata können jedoch ebenfalls nützlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mithilfe herkömmlicher Verfahren und Tests überwacht werden.
Die Antikörpervariantenzusammensetzung wird nach den Maßstäben guter medizinischer Praxis (GMP) formuliert, dosiert und verabreicht. Faktoren, die in diesem Zusammenhang berücksichtigt werden müssen, umfassen das jeweils zu behandelnde Leiden, das jeweils zu behandelnde Säugetier, den klinischen Zustand des jeweili gen Patienten, die Ursache des Leidens, die Zufuhrstelle des Wirkstoffs, die Verabreichungsmethode, den zeitlichen Ablauf der Verabreichung sowie andere, medizinischem Fachpersonal bekannte Faktoren. Die „therapeutisch wirksame Menge" der Antikörpervariante, die zu verabreichen ist, wird anhand solcher Überlegungen bestimmt und entspricht der Mindestmenge, die zur Vorbeugung, Linderung oder Behandlung einer Krankheit oder eines Leidens erforderlich ist. Die Antikörpervariante muss nicht, kann aber gegebenenfalls mit einem oder mehreren Mitteln formuliert sein, die derzeit zur Vorbeugung oder Behandlung des betreffenden Leidens eingesetzt werden. Die wirksame Menge solcher anderen Mittel hängt von der Menge der Antikörpervariante, die in der Formulierung vorhanden ist, von der Art des Leidens oder der Behandlung und von anderen oben angeführten Faktoren ab. Diese werden im Allgemeinen in den gleichen Dosierungen und über die gleichen Verabreichungswege eingesetzt wie oben erläutert oder in 1 bis 99% der bisher eingesetzten Dosierungen.
G. Herstellungsartikel
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Herstellungsartikel bereitgestellt, der für die Behandlung von den zuvor beschriebenen Erkrankungen nützlich ist. Der Herstellungsartikel umfasst einen Behälter und ein Etikett. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus zahlreichen verschiedenen Materialien wie beispielsweise Glas oder Kunststoff hergestellt sein. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Behandlung des Leidens nützlich ist, und kann über einen sterilen Eingang verfügen (beispielsweise kann der Behälter ein Beutel mit intravenöser Lösung oder eine Phiole mit einem Septum sein, das man mit einer Nadel zur subkutanen Injektion durchstechen kann). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist die Antikörpervariante. Das Etikett am oder als Beilage zum Behälter weist darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Behandlung der jeweiligen Erkrankung zu verwenden ist. Der Herstellungsartikel kann weiters einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlö sung, Ringer-Lösung und Dextroselösung, enthält. Weiters können andere Materialien enthalten sein, die aus kommerzieller Hinsicht und aus Sicht des Benutzers wünschenswert sind, einschließlich weiterer Puffer, Verdünner, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
Beispiel 1
In diesem Beispiel werden Antikörpervarianten, die randomisierte Peptidinserts innerhalb der Antikörper-CDRs enthalten, durch Phagendisplay hergestellt, wodurch die Affinität eines humanisierten Feb für VEGF wesentlich verbessert wird. Die Kristallographie weist darauf hin, dass diese Veränderungen zu einer vergrößerten Kontaktfläche mit einem Antigen führen.
VEGF: Fab-Röntgen-Co-Kristallstruktur: Eine Kristallstruktur des Komplexes zwischen dem VEGF-Antigen und einem Anti-VEGF-Eltern-Antikörper wurde wie in Muller et al., Structure 6(9), 1153–1167 (1998), beschrieben erstellt. Die Schlussfolgerung, dass die drei VH-CDRs die Hauptdeterminanten der Fab-Bindung an VEGF sind, wird durch die hochaufgelöste Kristallstruktur des VEGF-Fab(v36)-Komplexes unterstützt. Außerdem stimmen die wichtigsten energetischen Determinanten großteils mit den wichtigsten kontaktierenden Resten des Fab im Komplex überein.
Mehrere randomisierte Bibliotheken wurden erstellt, wobei eine Peptidinsertion in den Antigen-kontaktierenden CDRs platziert wurde, von denen aufgrund ihrer Kristallstruktur zu erwarten war, dass sie den potentiellen Kontakt zwischen dem Antikörper und dem Antigen steigern.
Erstellung von CDR-Zufallsschleifen-Insertionsbibliotheken: Basierend auf der Untersuchung der VEGF-Fab-Kristallstruktur wurde davon ausgegangen, dass zusätzliche Kontakte, die zusätzliche Bindungsenergie zwischen dem Fab und VEGF bereitstellen, durch die Addition von Peptidinserts in einer oder mehreren CDRs des Feb erzeugt werden können. Da die Art und relative Verteilung solcher zusätzlichen Wechselwirkungen schwer vorauszusagen wäre, wurden randomisierte Schleifen-Sequenzen (Xn) direkt in jede der vier CDRs insertiert, und zwar proximal zur vorhandenen VEGF-Bindungsstelle unter Verwendung von NNS-Codons und eines einer Rasterverschiebung unterzogenen Fab-Vektors als Matrize. Die Schleifenlänge wurde aufgrund der Abstände in der Kristallstruktur zwischen Ausgangs-/Eingangspunkt der Schleife auf der hypervariablen Region und möglichen Wechselwirkungsstellen auf der Oberfläche von VEGF bestimmt. Außerdem wurden in manchen dieser Matrizen ein oder mehrere Reste innerhalb der einzelnen Schleifen deletiert, wenn dies zur Unterbringung der neuen Peptidschleife als erforderlich erachtet wurde.
Drei solcher Schleifen wurden für VH1 erstellt, einschließlich der Insertion von 4, 5 oder 6 Resten zwischen Y27 und T28. In VH2 wurden zwei insertierte Peptide aus 3 oder 4 Resten zwischen Y54 und T55 platziert. Außerdem wurde in VH2 ein 6 Reste großes Zufallspeptid verwendet, um die Reste T55 und H56 zu ersetzen. In VH3 wurde ein 4 Reste oder 5 Reste umfassendes Peptid eingesetzt, um G104 zu ersetzen, und ein 5 Reste oder 6 Reste umfassendes Peptid wurde eingesetzt, um die Reste G104 und S105 zu ersetzen. In VL3, schließlich, wurde ein Zufallspeptid aus entweder 4 oder 6 Resten zwischen S92 und T93 insertiert.
Zweitgenerationsselektionen von Anti-VEGF-Bibliotheken: Matrizen für Zufallsmutagenese wurden ausgehend vom Fab-g3-Phagemid pY0192 ( WO98/45331 ) und Rasterverschiebungsoligonucleotiden (welche die Expression eines funktionellen Matrizen-Fab verhindern) konstruiert: YC-82, YC-85, YC-89, YC-92, YC-94 und YC-97 (Tabelle 1). Tabelle 1 Rasterverschiebungsoligos für CDR-Insert-Matrizen-Mutagenese
Die entsprechenden Randomisierungsoligonucleotide (die NNS an den für die Randomisierung bestimmten Stellen einsetzen) waren YC-83, YC-84 in VL3; YC-86, YC-87, YC-88 in VH1; YC-90, YC-91 und YC-93 in VH2; und YC-95, YC-96, YC-98, YC-99 in VH2. Siehe nachstehende Tabelle 2. Tabelle 2 Zufallsoligos für CDR-Insert-Bibliothekskonstruktionen
Die resultierenden Transformanten ergaben Bibliotheken mit Komplexitäten im Bereich von 6 × 10⁷ bis 5 × 10⁸, was vermuten lässt, dass die Bibliotheken umfassend waren und alle möglichen Varianten abdeckten.

Jede Bibliothek wurde separat für den ersten Durchgang sortiert; danach wurden Bibliotheken mit der gleichen Insertionsstelle kombiniert und gemeinsam sortiert. Folglich wurde Bibliothek YC-83 mit der Bibliothek YC-84 kombiniert; Bibliothek YC- 83 mit den Bibliotheken YC-87 und YC-88; Bibliothek YC-90 mit YC-91; Bibliothek YC-95 bis YC-96; und Bibliothek YC-98 mit YC-99. Diese Bibliotheken wurden im Wesentlichen wie in der WO98/45331 beschrieben sortiert, mit der Ausnahme, dass nach der Phagenbindung eine Inkubation mit einem Puffer PBS/TWEEN 20^® wie in Tabelle 3 beschrieben durchgeführt wurde. Tabelle 3 Bedingungen für sekundäre Selektionen von Fab-Varianten

Selektionsdurchgang (°C)	Inkubationszeit (h)	Inkubationslösung	Inkubationstemp.
1	0	0	Raumtemp.
2	1	ELISA-Puffer	Raumtemp.
3	2	1 μM VEGF/ELISA	Raumtemp.
4	18	1 μM VEGF/ELISA	Raumtemp.
5	37	1 μM VEGF/ELISA	Raumtemp.
6	17 h bei RT/30 h bei 37°C	gleich wie oben	Raumtemp./37°C
7	63	gleich wie oben	37°C
8	121	gleich wie oben	37°C

Der ELISA-Puffer enthielt 0,5% Rinderserumalbumin und 0,05% TWEEN 20^® in PBS. VEGF wurde in den Inkubationspuffer inkludiert, um die Wiederbindung eines Phagen an VEGF, das auf der Oberfläche der Platte aufgebracht war, zu minimieren.

Das Sortieren einiger dieser Bibliotheken ergab Anreicherung von VEGF-bindenden Phagen über 5 bis 8 Selektionsdurchgänge. Nach fünf bis acht Selektionsdurchgängen wurden 10 bis 20 Klone aus jeder Bibliothek aus Carbenicillin enthaltenden Platten isoliert, die E.-coli-(XL1-)Kolonien enthielten, die mit einem eluierten Phagenpool infiziert worden waren. Kolonien wurden isoliert und mit einem Helferphagen gezüchtet, um eine einzelsträngige DNA zur Sequenzierung zu erhalten. Klone wurden aus jenen Bibliotheken, die angereichert waren, für eine DNA-Sequenzierung ausgewählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Bibliotheken ohne Anreicherung wurden nicht sequenziert. Tabelle 4 Zusammenfassung der CDR-Insertionsbibliotheken

Oligos		CDR	Insertionsstelle	Anzahl an addierten Resten
Stopp-Oligo	Insert-Oligo	CDR	Insertionsstelle	Netto	Gesamt
YC-85	YC-86	H1	Y27^T28	4	4
YC-85	YC-87	H1	Y27^T28	5	5
YC-85	YC-88	H1	Y27^T28	6	6

YC-89	YC-90	H2	Y54^T55	3	3
YC-89	YC-91	H2	Y54^T55	4	4
YC-92	YC-93	H2	Y54^E57	4	6

YC-94	YC-95	H3	Y103^S105	3	4
YC-94	YC-96	H3	Y103^S105	4	5
YC-97	YC-98	H3	Y103^S106	3	5
YC-97	YC-99	H3	Y103^S106	4	6

YC-82	YC-83	L3	S92^T93	4	4
YC-82	YC-84	L3	S92^T93	6	6

Bezüglich VH1 wies nur die Bibliothek YC-86 eine Anreicherung auf. Eine Sequenzierung ergab, dass, obwohl ein 4 Reste umfassendes Insert in dieser Bibliothek erstellt worden war, keiner der sequenzierten Klone eine Netto-Insertion aufwies, sondern stattdessen Punktmutationen an T28 und F29. Dies lässt vermuten, dass dieser Antikörper relativ intolerant gegenüber Insertionen in dieser hypervariablen Region ist.
Ein ähnliches Ergebnis zeigte sich in den VH2-Bibliotheken, wo nur die Bibliothek YC-90 eine Anreicherung aufwies. Wieder waren die gefundenen Klone entweder vom Wildtyp (Y0192) oder ein Punktmutant Y54W. Dies lässt vermuten, dass dieser Antikörper auch relativ intolerant gegenüber Insertionen in der VH2-CDR ist.
Wiederum ein ähnliches Ergebnis ergab sich für die VL3-Bibliotheken. In diesem Fall wies nur die Bibliothek YC-83 eine Anreicherung auf, und die selektierten Klone wiesen Punktmutationen an T93 und/oder V94 auf und nicht die erstellte Insertion. Dies lässt vermuten, dass dieser Antikörper ebenfalls relativ intolerant gegenüber Insertionen in der VL3-CDR ist.
Im Gegensatz dazu wiesen zwei VH3-Bibliotheken eine Anreicherung auf: YC-95 und YC-98. Weiters zeigte eine Sequenzierung von ausgewählten Klonen, dass die Fab-Varianten tatsächlich Insertionssequenzen aufwiesen.
Aminosäuresequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus den verschiedenen Bibliotheken sind in den nachstehenden Tabellen 5–15 dargestellt. Nur die Sequenz der randomisierten Region ist so dargestellt, wie sie durch die DNA-Sequenzierung abgeleitet wurde. Stellen, an denen randomisierte insertierte Sequenzen gebildet wurden, sind fett dargestellt. Ein Stern bezeichnet ein verunreinigendes Phagemid aus einer anderen Bibliothek. chgang 7 (VEGF-eluierter Phage) Tabelle 5 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-86 Durchgang 7 (VEGF-eluierter Phage)
Tabelle 6 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-90 Durchgang 7 (VEGF-eluierter Phage)
Tabelle 7 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-83 Durchgang 7 (VEGF-eluierter Phage)
Tabelle 8 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-95 Durchgang 5 (VEGF-eluierter Phage)
Tabelle 9 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-95 Durchgang 5 (HCl-eluierter Phage)
Tabelle 10 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-95 Durchgang 7 (HCl-eluierter Phage)
Tabelle 11 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-95 Durchgang 8 (HCl-eluierter Phage)
Tabelle 12 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-98 Durchgang 5 (VEGF-eluierter Phage)
Tabelle 13 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-98 Durchgang 5 (VEGF-eluierter Phage)
Tabelle 14 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-98 Durchgang 7 (HCl-eluierter Phage)
Tabelle 15 Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Bibliothek YC-98 Durchgang 8 (HCl-eluierter Phage)
Um die relativen Antigenbindungsaffinitäten zu quantifizieren, wurde die DNA mehrerer Anti-VEGF-Varianten in den E.-coli-Stamm 34B8 transformiert, als Fab exprimiert und gereinigt, indem der periplasmatische Extrakt wie in der WO98/45331 beschrieben durch eine Protein-G-Säule (Pharmacia) geschickt wird.
CDR-Kombinationsvariante Y0313-2: Es wurde ein Versuch unternommen, die Antigenbindungsaffinität durch Kombination einer früher entdeckten CDR-VH2-Muation mit einer hierin beschriebenen Insertionsvariante zu kombinieren. Ein mutagenes Oligonucleotid, YC-107 (Tabelle 16), wurde verwendet, um Insertionsmuationen, die in der CDR VH3 zu finden sind, aus dem Klon Y0239-19 mit CH2-CDR-Mutationen T28D/N31H aus dem Klon Y0243-1 ( WO98/45331 ) der CDR VH2 zu kombinieren. Tabelle 16 Mutageneseoligo für die Addition eines CDR-Insertionspeptids
Die resultierende kombinierte CDR-Variante wurde als Y0313-2 bezeichnet. Eine Fab-Proteinprobe wurde wie oben beschrieben für eine BIACORE^TM-Analyse hergestellt.
BIACORE^TM-Analyse: Die VEGF-Bindungsaffinitäten von Fab-Fragmenten wurden aus Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten berechnet, die mithilfe eines Oberflächen-Plasmonresonanzsystems BIACORE^TM-2000 (BIACORE^TM, Inc., Piscataway, NJ, USA) gemessen worden waren. Ein Biosensorchip wurde aktiviert, um VEGF unter Anwendung von N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminoproyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) gemäß den Anweisungen des Herstellers (BIACORE^TM, Inc., Piscataway, NJ, USA) kovalent zu binden. VEGF(8-109) wurde in 20 mM Natriumacetat, pH 4,8, pufferausgetauscht und auf etwa 50 ug/ml verdünnt. Aliquoten von VEGF wurden mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 μl/min injiziert, um etwa 700–1400 Reaktionseinheiten (RU) gebundenes Protein zu erhalten. Eine Lösung von 1 M Ethanolamin wurde als Blockiermittel injiziert.

Für Messungen der Kinetik wurden zweifache Reihenverdünnungen von Fab bei 25°C bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 μl/min in PBS/TWEEN-Puffer (0,05% TWEEN 20^TM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) injiziert. Gleichgewichtsdissoziationskonstanten, Kds, aus SPR-Messungen wurden als koff/kon berechnet (Tabelle 17). Tabelle 17 Kinetik von Fab-VEGF-Bindung aus BIACORE^TM-Messungen

Variante	kon (10⁴/M/s)	koff (10^–4/s)	Kd (nM)	Kd(Wt)/ Kd(Mut)
Y0192	4,1	1,21	2,9	-1-
Y0241-4	4,4	1,41	3,2	0,9
Y0241-7	4,6	1,28	3,0	1,0
Y0241-6	4,7	1,29	2,7	1,1
Y0242-1	4,7	0,86	1,8	1,6
Y0239-19	3,6	0,10	0,30	9,7
Y0239-8	3,8	0,18	0,50	5,8
Y0240-1	2,5	0,13	0,50	5,8
Y0239-2	3,6	1,64	4,6	0,6
Y0239-12	5,7	0,34	0,6	4,8
Y0239-9	3,97	0,19	0,5	6,0
Y0261-6	4,4	0,25	0,6	5,0
Y0313-2	3,11	0,11	0,36	8,0

Die Ergebnisse von SPR-Messungen zeigten, dass die Affinität hauptsächlich durch eine niedrigere Dissoziationsgeschwindigkeit (im Gegensatz zu einer schnelleren Assoziation) gesteigert wird.
Für die Insertionsvariante Y0239-19 wurde eine etwa 10fache Verbesserung der Bindungsaffinität beobachtet (Tabelle 17). Die Addition der VH1-Mutationen verbesserte die Affinität jedoch nicht weiter, wie für die Variante Y0313-2 angegeben ist.
Zellbasierter Test für VEGF: Zwei Fab-Varianten des Anti-VEGF-Antikörpers wurden auf ihre Fähigkeit getestet, VEGF (rekombinant; Version 1–165) bei der Induktion des Wachstums von HuVECs (menschliche Nabelvenen-Endothelzellen) zu antagonisieren. Der Alamar-Blau-Test (H. Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202, 163–171 (1997)) wurde eingesetzt, um die Stoffwechselaktivität von Zeilen als Reaktion auf VEGF zu messen.
Zwei Fab-Varianten des Anti-VEGF-Antikörpers wurden auf ihre Fähigkeit getestet, VEGF-(rekombinant; Version 1–165) Aktivität bei der Induktion des Wachstums von HuVECS (menschliche Nabelvenen-Endothelzellen) zu antagonisieren, HuVEC- Zellen werden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte in komplettem Medium (Cell Systems, Kirkland, WA, USA) ausgesät (1500/Well), die mit einem Cell-Systems-Anbindungsfaktor beschichtet worden war. Die Zellen werden 24 h lang anbinden gelassen. Am 2. Tag werden VEGF und Fab in einem Testmedium (DMEM/F12 + Penicillin/Streptomycin, 0,1% Gelatine) verdünnt. Für die Antikörperversuche wird eine konstante Konzentration von 5 ng/ml VEGF zu allen Wells zugesetzt, gefolgt vom Zusatz unterschiedlicher Konzentrationen von Anti-VEGF-Fab (etwa 10 μg/ml und Verdünnungen). VEGF und Fab werden 2 Tage lang mit den HUVEC-Zellen inkubiert, wonach 25 μl Alamar-Blau zugesetzt werden. Nach einer Inkubationsdauer von 4 Stunden wird die Fluoreszenz auf einem Cytoflour-Fluoreszenzplattenlesegerät abgelesen. Das für diesen Test eingesetzte Medium stammt von Cell Systems.
Die Ergebnisse (2) zeigen, dass die Insertionsvariante Y0313-2-Fab gegenüber dem ursprünglichen humanisierten Antikörper, F(ab)-12, eine etwa 100fach verstärkte Wirkung aufweist.
Kristallisation und Röntgenstrukturbestimmung des Insert-Fab Y0313-2 im Komplex mit VEGF: Kristalle von VEGF in einem Komplex mit dem Fab-Fragment Y0313-2 wurden durch Dampfdiffusion unter Einsatz des Hängetropfenverfahrens bei Raumtemperatur gezüchtet. Ein Kristallisationspuffer mit 0,1 M Natriumchlorid, 20 mM Tris bei pH 7,5 und der VEGF:Fab-Komplex in einer Konzentration von 8 mg/ml wurden mit einer gleichen Menge Reservoirelösung (15% PEG 4000, 5% Isopropanol, 0,1 M MES, pH 6,0, 0,2 M Citrat, 0,2 M Ammoniumsulfat und 1 mM SPADNS (2-(p-Sulfophenylazo)-1,8-dihydroxy-3,6-naphthalindisulfonsäure) vermischt. Die resultierenden Kristalle gehören zur monoklinen Raumgruppe P2 mit den Zellparametern a = 107,6 Å, b = 65,8 Å, c = 123,8 Å und β = 93,4° und enthalten eine VEGF-Dimerbindung an zwei Fab-Fragmente in der asymmetrischen Einheit.
Vor einer Blitzkühlung mit flüssigem Stickstoff wurden die Kristalle in eine künstliche Stammlauge mit 20% Glycerin getaucht. Ein Satz Diffraktionsdaten von einem Einkristall wurde bei 100 K auf einem CCD-Detektor an der Advanced Light Source (Berkeley, CA, USA) gewonnen. Die Daten wurden mithilfe von MOSFLM (Leslie, A MOSFLM Users Guide, MRC-LMB, Cambridge (1994)) und Programmen der CCP4-Suite (Collaborative Computing Project Nr. 4, Acta Crystallog. sect. D, 50, 761–763 (1994)) verarbeitet. Der endgültige Datensatz war von guter Qualität (Rsym = 7,4%) und wies eine Vollständigkeit von 94,5% für alle Reflexionen zwischen 25 Å und 2,8 Å auf.
Die Anfangsphasen für den Komplex wurden durch molekularen Ersatz erhalten, wobei die konstanten Domänen und die variablen Domänen des Fab-Fragments F(ab)-12 als separates Suchmodell verwendet wurden. Ein Modell der Rezeporbindungsdomäne von VEGF konnte eindeutig in eine resultierende Differenzdichtekarte eingeordnet werden.
Eine Verfeinerung des Modells mit dem Programm X-PLOR (Brueger et al., Science 235, 458–460 (1987)) führte zu einem endgültigen R-Wert von 21,2% mit einem R-free-Wert von 26,6%, wobei alle Daten zwischen 2,8 Å und 25 Å verwendet wurden.
Neue Antikörper-Antigen-Kontakte im Insert-Fab-Komplex mit VEGF: Die Ergebnisse der Röntgenkristailographie zeigen, dass die Einführung des Inserts (Asn 104a, Glu 104b und Arg 104c (Anm.: die Nummerierung von Y0313-2-Resten erfolgt sequenziell, wobei insertierten Resten ein Buchstabe zugeordnet wird, und nicht nach Kabat et al., w. o.)) zusammen mit den beiden Substitutionen (G104V und S105K), die es einschließen, die Gesamtmenge der in der Schnittfläche zwischen VEGF und dem Antikörper verborgenen Oberfläche um etwa 20% erhöht (siehe 4), im Vergleich zur Struktur des F(ab)-12-Komplexes (Muller et al, Structure 6(9), 1153–1167 (1998)). Die Hauptbeitragenden zu dieser Vergrößerung der Kontaktfläche sind die Reste Val 104 und Arg 104c. Zusammen machen diese beiden Reste weitere 220 Å² verborgener Oberfläche am Fab-Fragment aus. Die Seitenkette von Val 104 wird eng an die Hauptkette der Reste 93 bis 95 von VEGF gepackt. Das neu eingeführte Arg 104c erzeugt eine geladene Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe von Asp 41 von VEGF und steht auch mit dem Phenylring von Tyr 39 in Kontakt (siehe 5). Kleinere Beiträge zur Grenzfläche werden auch von der Seitenkette von Lys 105 ge leistet, die sich in der Nachbarschaft der VEGF-Reste Glu 44 und Tyr 45 befindet. Die Seitenketten der Reste Asn 104a und Glu 104b zeigen von der Grenzfläche weg, und keine davon trägt signifikant zur Grenzfläche zwischen dem Fab-Fragment und VEGF bei.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Anti-Gefäßendothelwachstumsfaktor-(Anti-VEGF-)Antikörpervariante eines Eltern-Antikörpers, wobei das Verfahren die Insertion von zwei bis zehn Aminosäureresten in einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) H3 von einer variablen Schwerketten-Domäne des Elternantikörpers umfasst, worin die Anti-VEGF-Antikörpervariante eine Bindungsaffinität für Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) aufweist, die zumindest zweimal stärker ist als die Bindungsaffinität des Elternantikörpers, und worin zumindest einer der insertierten Reste Arginin oder Lysin ist, oder die Insertion sich angrenzend an Rest Nr. 100 der variablen Schwerkettendomäne des Elternantikörpers befindet, wobei die Restenummerierung der variablen Domäne wie in Kabat verwendet wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die insertierten Reste VNERK sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Antikörpervariante eine Bindungsaffinität für VEGF aufweist, die zumindest etwa fünfmal stärker ist als die Bindungsaffinität des Elternantikörpers für VEGF.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Elternantikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Elternantikörper ein menschlicher Antikörper ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin zumindest einer der insertierten Reste eine positive Nettoladung oder negative Nettoladung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Insertion aus drei insertierten Aminosäureresten besteht.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, weiters eine Aminosäuresubstitution in der hypervariablen Region umfassend.
Anti-Gefäßendothelwachstumsfaktor-(Anti-VEGF-)Antikörpervariante eines Elternantikörpers, wobei die Anti-VEGF-Antikörpervariante eine Aminosäureinsertion in oder angrenzend an eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) H3 einer variablen Schwerkettendomäne des Elternantikörpers umfasst, worin die Anti-VEGF-Antikörpervariante eine Bindungsaffinität für Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) aufweist, die zumindest zweimal stärker ist als die Bindungsaffinität des Elternantikörpers, und worin das CDR-H3 der variablen Schwerkettendomäne der Anti-VEGF-Antikörpervariante die Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Seq.-ID Nr. 85, Seq.-ID Nr. 53, Seq-ID Nr. 86, Seq.-ID Nr. 78, Seq.-ID Nr. 54 und Seq.-ID Nr. 89 ausgewählt ist.
Anti-VEGF-Antikörpervariante nach Anspruch 9, worin das CDR-H3 der variablen Schwerkettendomäne der Anti-VEGF-Antikörpervariante die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 85 umfasst.
Anti-VEGF-Antikörpervariante nach Anspruch 9, die eine variable Schwerkettendomäne umfasst, die die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 98 oder Seq.-ID Nr. 99 aufweist.
Anti-VEGF-Antikörpervariante nach Anspruch 11, welche die variable Schwer- und Leichtkettendomäne von Antikörper Y0239-190 mit den Aminosäuresequenzen von Seq-ID Nr. 98 bzw. 95 umfasst.
Anti-VEGF-Antikörpervariante nach Anspruch 11, welche die variablen Schwer- und Leichtkettendomänen von Antikörper Y0313-2 mit den Aminosäuresequenzen von Seq.-ID Nr. 99 bzw. 95 umfasst.
Anti-VEGF-Antikörpervariante nach einem der Ansprüche 9 bis 13 zur Verwendung in Therapie.
Zusammensetzung, die eine Anti-VEGF-Antikörpervariante nach einem der Ansprüche 9 bis 13 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für die Anti-VEGF-Antikörpervarianten nach einem der Ansprüche 9 bis 13 kodiert.
Vektor, der das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 16 umfasst.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 17 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Anti-VEGF-Antikörpervariante, welches die Kultivierung der Wirtszelle nach Anspruch 18 umfasst, sodass die Nucleinsäure exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 19, weiters die Gewinnung der Anti-VEGF-Antikörpervariante aus der Wirtszellkultur umfassend.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Antikörpervariante aus dem Wirtszellkulturmedium gewonnen wird.