BR112020010085A2

BR112020010085A2 - métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliar uma lesão cerebral traumática em um indivíduo humano usando uma combinação de gfap e uch-l1

Info

Publication number: BR112020010085A2
Application number: BR112020010085-4A
Authority: BR
Inventors: Beth McQuiston; Saul Datwyler; Raj Chandran; Jaime Marino
Original assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 2017-12-09
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-10-13
Also published as: WO2019112860A1; EP3721234A1; CN110892266A; US20190219598A1; US20210389334A1; CA3067055A1; JP2021505844A; JP2024016137A; US11016105B2; AU2018378084A1; JP7379165B2

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos de auxílio no diagnóstico e avaliação de um indivíduo que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. Por exemplo, a presente descrição fornece métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliação de um indivíduo para determinar se o indivíduo sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT) detectando ou medindo uma combinação dos níveis de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) e de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) em amostras coletadas em vários pontos no tempo no prazo de 48 horas após o indivíduo ter sofrido ou poder ter sofrido uma lesão na cabeça.

Description

“MÉTODOS PARA AUXILIAR NO DIAGNÓSTICO E AVALIAR UMA LESÃO

CEREBRAL TRAUMÁTICA EM UM INDIVÍDUO HUMANO USANDO UMA COMBINAÇÃO DE GFAP E UCH-L1”

INFORMAÇÃO DE PEDIDO RELACIONADO

[001]Este pedido reivindica prioridade para o Pedido US. No. 62/596.814, depositado em 9 de dezembro de 2017, Pedido US. No. 62/610.805 depositado em 27 de dezembro de 2017, Pedido US. No. 62/663.811, depositado em 27 de abril de 2018 e o pedido US No. 62/667.227, depositado em 4 de maio de 2018, cujo conteúdo de cada um deles é aqui incorporado por referência.

CAMPO DA TÉCNICA

[002]A presente descrição refere-se a métodos de auxílio no diagnóstico e avaliação de um indivíduo que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. Por exemplo, a presente descrição fornece métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliação de um indivíduo para determinar se o indivíduo sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT) detectando ou medindo uma combinação dos níveis de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) e proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) em amostras coletadas em vários pontos no tempo no prazo de 48 horas após o indivíduo ter sofrido ou poder ter sofrido uma lesão na cabeça.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003]Mais de 5 milhões de lesões cerebrais traumáticas leves (LCTs) ocorrem a cada ano apenas nos Estados Unidos. Atualmente, não há medidas simples, objetivas e precisas disponíveis para auxiliar na avaliação do paciente. De fato, grande parte da avaliação e diagnóstico de LCT é baseada em dados subjetivos. Infelizmente, as medidas objetivas, tal como a TC da cabeça e o Escore de Coma de Glasgow (GCS), não são muito abrangentes ou sensíveis na avaliação de LCT leve. Além disso, a TC da cabeça não é reveladora na maioria das vezes para LCT leve, é dispendiosa e expõe o paciente à radiação desnecessária. Além disso, uma TC de cabeça negativa não significa que o paciente não tenha sofrido uma concussão; pelo contrário, apenas significa que certas intervenções, tal como cirurgia, não são garantidas. Pacientes que sofreram uma lesão traumática, tal como uma lesão ortopédica, também podem ter uma LCT. Clínicos e pacientes precisam de informações objetivas e confiáveis para avaliar com precisão essa condição e promover triagem e recuperação apropriadas.

Até o momento, dados limitados estavam disponíveis para o uso de UCH-L1 e GFAP no ambiente de tratamento agudo para auxiliar na avaliação e no gerenciamento do paciente.

[004]A LCT leve ou concussão são difíceis de detectar objetivamente e apresentam um desafio diário em unidades de atendimento de emergência em todo o mundo. A concussão frequentemente não causa patologia grave, tal como hemorragia, nem anormalidades nas tomografias computadorizadas convencionais do cérebro, mas disfunção neuronal de início rápido que se resolve de maneira espontânea por alguns dias a algumas semanas. Aproximadamente 15% dos pacientes com LCT leve sofrem de disfunção cognitiva persistente. Existe uma necessidade não atendida de pacientes ortopédicos e vítimas leves de LCT serem avaliados quanto ao seu estado de LCT em cena, em prontos-socorros e clínicas, no hospital, na área de esportes e em atividades militares (por exemplo, combate).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005]Em um aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar no diagnóstico ou determinar se um indivíduo que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT) moderada, grave ou moderada a grave. O método compreende as etapas de: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH- L1) na amostra; e

(a) determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 105 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 110 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 105 pg / mL a cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 110 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo com maior probabilidade de sofrer uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 890 pg / mL, e o nível de UCH- L1 na amostra é maior do que um nível de referência de cerca de 2000 pg / mL.

[006]Em uma modalidade do método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido um escore na Escala de Coma de Glasgow (GCS) antes ou depois da realização do ensaio. Em outra modalidade, suspeita-se que um indivíduo que tenha recebido tal escore GCS tenha uma LCT moderada com base no escore GCS determinado. Em outra modalidade, suspeita-se que um indivíduo que recebe tal escore GCS tenha uma LCT grave. Em outra modalidade, suspeita-se que um indivíduo que tenha recebido tal escore GCS tenha LCT moderada a grave com base no escore GCS determinado. Em ainda outra modalidade, no método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 correlacionam-se ou correspondem a um escore na Escala de Coma de Glasgow de 3-8 (uma LCT grave).

Ainda em outros aspectos, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um escore na escala de coma de Glasgow de 9- 12 (uma LCT moderada). Em outros aspectos, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 correlacionam-se ou correspondem a um escore na Escala de Coma de Glasgow de 3-12 (uma LCT moderada a grave).

[007]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão.

Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou a suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 44 horas a 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[008]Em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio tendo uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 79% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 33%.

[009]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[010]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 2% maior e uma especificidade pelo menos 3% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[011]Ainda em outra modalidade do método descrito acima: a. a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97% e uma especificidade igual ou superior a 51%; ou b. a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97,5% e uma especificidade igual ou superior a 36%; ou c. a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de referência de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL; e o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 79%; ou d. a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 66%.

[012]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a medição do nível de GFAP compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou fragmento de GFAP para formar pelo menos um complexo de anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado pelo anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP, de modo que um complexo de anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP é formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[013]Em ainda outra modalidade, a medição de UCH-L1 no método identificado acima compreende:

(a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo m UCH-L1 ou fragmento de UCH-L1 para formar pelo menos um complexo de anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado por pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - um antígeno de UCH-L1 - pelo menos anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 – pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1.

[014]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[015]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos). Qualquer tal tratamento conhecido na técnica e descrito aqui mais adiante pode ser usado. Além disso, em um aspecto adicional, qualquer indivíduo sendo tratado para LCT também pode,

opcionalmente, ser monitorado durante e após qualquer curso de tratamento.

Alternativamente, os ditos métodos podem ainda compreender monitorar um indivíduo avaliado como tendo uma LCT moderada, grave ou moderada a grave (tal como aqueles que, até o momento, podem não estar recebendo nenhum tratamento).

[016]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano, e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Tal amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ser exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia, ou combinações dos mesmos.

[017]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano, sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, da classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo humano a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP,

e do momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[018]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico e a amostra é sangue integral. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única e a amostra é sangue integral. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é soro. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento, o indivíduo é um humano, e a amostra é soro.

Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico e a amostra é soro. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única e a amostra é soro. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é plasma. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento, o indivíduo é um humano e a amostra é plasma. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico e a amostra é plasma. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única e a amostra é plasma.

[019]Em ainda outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar uma tomografia computadorizada (TC) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. O método compreende as etapas de: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína ácida fibrilar da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não precisa de uma tomografia computadorizada quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 50 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 90 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 50 pg / mL a cerca de 975 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 90 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 975 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[020]Em uma modalidade do método descrito acima, o indivíduo recebeu uma TC antes ou depois da realização do ensaio, e em que se suspeita que o indivíduo tenha uma LCT com base no resultado da TC. Em outra modalidade, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um resultado de TC negativo.

[021]Mais especificamente, nos métodos descritos acima para determinar ou avaliar se deve ser realizada uma TC na cabeça, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma TC que foi ou já foi realizada (ou seja, antes do ensaio que está sendo realizado). Por exemplo, dependendo da condição médica de um indivíduo (tal como, se o paciente estiver inconsciente), uma TC pode ser realizada logo após o paciente chegar a uma sala de emergência, centro de trauma, ou outro local de modo a avaliar se o indivíduo tem uma LCT. Essa TC pode ser realizada antes da realização do ensaio para confirmar e determinar se o indivíduo tem ou não uma LCT leve ou moderada a grave. Após a realização do ensaio, uma ou mais TCs subsequentes podem ser realizadas com base nos resultados do ensaio, como parte do gerenciamento pelo médico (ou por outro profissional de medicina) da LCT (tal como, por exemplo, para determinar se intervenção cirúrgica e / ou farmacológica pode ser necessária).

[022]Em certos aspectos dos métodos acima, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma TC. Por exemplo, um indivíduo pode ser suspeito de ter uma LCT leve com base em uma TC.

Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT moderada com base em uma TC. Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT grave com base em uma TC. Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT moderada a grave com base em uma TC. Além disso, pode- se suspeitar que um indivíduo não tenha uma LCT com base em uma TC.

[023]Em certos aspectos dos métodos acima, o nível de referência utilizado é correlacionado ou corresponde a uma tomografia computadorizada da cabeça positiva. Por exemplo, o nível de referência pode correlacionar-se ou corresponder (como através de um aumento ou diminuição do nível de referência) a indivíduos com tomografia computadorizada da cabeça positiva. Alternativamente, o nível de referência pode se correlacionar ou corresponder (como através de um aumento ou diminuição no nível de referência) a indivíduos com tomografia computadorizada da cabeça negativa. Ainda mais alternativamente, o nível de referência pode se correlacionar ou corresponder (como por meio de um aumento ou diminuição no nível de referência) a indivíduos com hemorragia cerebral ou hemorragia cerebral que está melhorando ou piorando. Em outros aspectos do método acima, o nível de referência está correlacionado ou corresponde a indivíduos de controle que não sofreram LCT.

[024]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão.

Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[025]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio tendo uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 54% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 32%.

[026]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[027]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 2% maior e uma especificidade pelo menos 4% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[028]Em ainda outra modalidade do método descrito acima: a. a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 62%; b. a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 300 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 91,5% e uma especificidade igual ou superior a 52%; ou c. a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 190 pg / mL e o nível de referência de UCH- L1 é de cerca de 90 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 99% e uma especificidade igual ou superior a 36%.

[029]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a medição do nível de GFAP compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo de GFAP ou fragmento de GFAP para formar pelo menos um complexo de anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP é formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[030]Em ainda outra modalidade, a medição de UCH-L1 no método identificado acima compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado por pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 – antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 – antígeno de UCH-L - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

[031]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT leve. Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[032]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT (por exemplo, como uma LCT leve a moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos)).

Qualquer tal tratamento conhecido na técnica e descrito aqui mais adiante pode ser usado. Além disso, em um aspecto adicional, qualquer indivíduo sendo tratado para LCT também pode, opcionalmente, ser monitorado durante e após qualquer curso de tratamento. Alternativamente, os ditos métodos podem ainda compreender monitorar um indivíduo avaliado como tendo uma LCT moderada, grave ou moderada a grave (tal como aqueles que, até o momento, podem não estar recebendo nenhum tratamento).

[033]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano, e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[034]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, na classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e o momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[035]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ponto de atendimento, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico e a amostra é sangue integral. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única e a amostra é sangue integral.

Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é soro. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento, o indivíduo é um humano e a amostra é soro. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico e a amostra é soro. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única e a amostra é soro. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é plasma. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento, o indivíduo é um humano e a amostra é plasma. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico e a amostra é plasma. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única e a amostra é plasma.

[036]Em ainda outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar na determinação ou determinar se um indivíduo humano que sofreu uma lesão na cabeça sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT). O método compreende as etapas de: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após uma lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 70 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo provavelmente não teve uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 40 pg / mL, e o o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 70 pg / mL a cerca de 150 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo provavelmente não teve uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 40 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 150 pg / mL.

[037]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão.

Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão.

Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão.

[038]Em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio tendo uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 90% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 35%.

[039]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a amostra pode ser obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão.

[040]Ainda em outra modalidade, o ensaio no método descrito acima tem uma sensibilidade pelo menos 3% maior e uma especificidade pelo menos 17% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[041]Em ainda outra modalidade do método descrito acima: a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 92% e uma especificidade igual ou superior a 99%; ou a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 99%; ou a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 40 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 100 pg / mL; e em que o método tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 94%; ou a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 82%; ou a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 65%.

[042]No método descrito acima, os níveis de GFAP e UCH-L1 podem ser medidos ou detectados usando um imunoensaio ou ensaio químico clínico.

Alternativamente, no método descrito acima, os níveis de GFAP e UCH-L1 podem ser medidos ou detectados usando um ensaio de detecção de molécula única.

[043]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a medição do nível de GFAP compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com:

(1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos anticorpo de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP é formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[044]Em ainda outra modalidade, a medição de UCH-L1 no método identificado acima compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado por pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e

(c) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

[045]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT leve. Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[046]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT (por exemplo, como uma LCT leve a moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos)).

[047]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano, e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[048]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, da classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e o momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[049]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

[050]Em ainda outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar um procedimento de ressonância magnética de cabeça (RM) em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. O método compreende as etapas de: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é inferior a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é inferior a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo com maior probabilidade não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo com maior probabilidade não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 1000 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é superior a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[051]No método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido uma RM após a realização do ensaio, e em que o indivíduo é suspeito de ter uma LCT com base no resultado da RM. Em ainda outra modalidade, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 correlacionam-se com um resultado de RM negativo.

[052]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou a suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[053]Nos métodos descritos acima para determinar ou avaliar se é necessário realizar uma ressonância magnética, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma RM ou TC que foi ou já tenha sido realizada (ou seja, antes da realização do exame). Por exemplo, dependendo da condição médica de um indivíduo (tal como, se o paciente estiver inconsciente), uma RM ou TC pode ser realizada logo após o paciente chegar a uma sala de emergência, centro de trauma ou outro local para avaliar se o indivíduo tem uma LCT. Tal RM ou TC pode ser realizada antes da realização do ensaio para confirmar e determinar se o indivíduo tem ou não uma LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave. Após a realização do ensaio, uma ou mais RMs (ou TCs) subsequentes podem ser realizadas com base nos resultados do ensaio como parte do gerenciamento da LCT pelo médico (ou por outro profissional de medicina) (tal como, por exemplo, para determinar se pode ser necessária intervenção cirúrgica e / ou farmacológica).

[054]Em certos aspectos dos métodos acima, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma RM. Por exemplo, um indivíduo pode ser suspeito de ter uma LCT leve com base em uma RM.

Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT moderada com base em uma RM. Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT grave com base em uma RM. Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha LCT moderada a grave com base em uma RM. Adicionalmente, um indivíduo pode ser suspeito de não ter uma LCT com base em uma RM.

[055]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio tendo uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 98% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 85%.

[056]Em uma modalidade adicional do método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido um resultado negativo de TC antes da realização do ensaio.

[057]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT leve. Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[058]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT (por exemplo, tal como uma LCT leve a moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos)). Qualquer tal tratamento conhecido na técnica e descrito aqui mais adiante pode ser usado. Além disso, em um aspecto adicional, qualquer indivíduo sendo tratado para LCT também pode, opcionalmente, ser monitorado durante e após qualquer curso de tratamento. Alternativamente, os ditos métodos podem ainda compreender monitorar um indivíduo avaliado como tendo uma LCT moderada, grave ou moderada a grave (tal como aqueles que, até o momento, podem não estar recebendo nenhum tratamento).

[059]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[060]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, da classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e do momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[061]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

[062]Em ainda outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar um procedimento de ressonância magnética de cabeça (RM) em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. O método compreende as etapas de: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) ou um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 ( UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 0 pg / mL a cerca de 68 pg / mL, ou o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 0 pg / mL a cerca de 99 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo com maior probabilidade do que não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 68 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é superior a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 99 pg / mL.

[063]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou a suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[064]No método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido uma RM após a realização do ensaio e em que o indivíduo é suspeito de ter uma LCT com base no resultado da RM. Em ainda outra modalidade, o nível de referência de GFAP ou o nível de referência de UCH-L1 correlacionam-se com um resultado de RM negativo.

[065]Nos métodos descritos acima para determinar ou avaliar se é necessário realizar uma ressonância magnética, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma RM ou TC que foi ou já foi realizada (ou seja, antes do ensaio que está sendo realizado). Por exemplo, dependendo da condição médica de um indivíduo (tal como, se o paciente estiver inconsciente), uma

RM ou TC pode ser realizada logo após o paciente chegar a uma sala de emergência, centro de trauma ou outro local para avaliar se o indivíduo tem uma LCT. Uma RM ou TC pode ser realizada antes da realização do ensaio para confirmar e determinar se o indivíduo tem ou não uma LCT leve ou moderada a grave. Após a realização do ensaio, uma ou mais RMs (ou TCs) subsequentes podem ser realizadas com base nos resultados do ensaio, como parte do gerenciamento da LCT pelo médico (ou por outro profissional de medicina) (tal como, por exemplo, para determinar se pode ser necessária intervenção cirúrgica e / ou farmacológica).

[066]Em certos aspectos dos métodos acima, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma RM. Por exemplo, um indivíduo pode ser suspeito de ter uma LCT leve com base em uma RM.

Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT moderada com base em uma RM. Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT grave com base em uma RM. Alternativamente, pode-se suspeitar de um indivíduo com LCT moderada a grave com base em uma RM. Ainda mais, um indivíduo pode ser suspeito de não ter uma LCT com base em uma RM.

[067]Em certos aspectos dos métodos acima, o nível de referência utilizado correlaciona-se ou corresponde a uma tomografia computadorizada da cabeça positiva. Por exemplo, o nível de referência pode correlacionar-se ou corresponder (tal como através de um aumento ou diminuição do nível de referência) a indivíduos com tomografia computadorizada da cabeça positiva. Alternativamente, o nível de referência pode se correlacionar ou corresponder (como através de um aumento ou diminuição no nível de referência) a indivíduos com tomografia computadorizada da cabeça negativa. Ainda mais alternativamente, o nível de referência pode se correlacionar ou corresponder (tal como por meio de um aumento ou diminuição no nível de referência) a indivíduos com hemorragia cerebral ou hemorragia cerebral que está melhorando ou piorando. Em outros aspectos do método acima, o nível de referência está correlacionado ou corresponde a indivíduos de controle que não sofreram LCT.

[068]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP é determinado por um ensaio tendo uma sensibilidade de cerca de 90% a cerca de 95% e uma especificidade de cerca de 31% a cerca de 46%. Ainda em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de UCH-L1 é determinado por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 81% a cerca de 84% e uma especificidade de cerca de 31% a cerca de 46%.

[069]Em uma modalidade adicional do método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido um resultado de TC negativo antes da realização do ensaio.

[070]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT leve. Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[071]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT (por exemplo, como uma LCT leve a moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos)).

[072]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[073]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, da classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e do momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[074]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

[075]Em ainda outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar na previsão ou prever o resultado de um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. O método compreende as etapas de: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) prever para o indivíduo um resultado favorável quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 80 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 130 pg / mL; ou (b) prever para o indivíduo um resultado provavelmente mais desfavorável quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 80 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 130 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) prever para o indivíduo um resultado provavelmente mais desfavorável quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 2000 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[076]Em outra modalidade do método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido um escore na Escala de Resultados de Glasgow Estendida (GOSE) após a execução do método e em que o indivíduo é suspeito de ter um resultado ruim com base no escore GOSE. Em ainda outra modalidade, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com indivíduos com um resultado ruim com base em um escore GOSE de 1.

[077]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou a suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[078]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 97% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 95%.

[079]No método descrito acima, os níveis de GFAP e UCH-L1 são medidos ou detectados usando um imunoensaio ou ensaio químico clínico. Alternativamente,

no método descrito acima, os níveis de GFAP e UCH-L1 são medidos ou detectados usando um ensaio de detecção de molécula única.

[080]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a medição do nível de GFAP compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP é formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[081]Em ainda outra modalidade, a medição de UCH-L1 no método identificado acima compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado por pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

[082]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT leve. Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[083]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT (por exemplo, tal como uma LCT moderada, grave ou moderada a grave com tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos)).

[084]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[085]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano, sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, da classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e do momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[086]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

[087]Em ainda outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar no diagnóstico ou determinar se um indivíduo que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT) moderada, grave ou moderada a grave. O método compreende as etapas de: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 105 pg / mL a cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 110 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

[088]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou a suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[089]Em uma modalidade do método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido um escore na Escala de Coma de Glasgow (GCS) antes ou depois da realização do ensaio. Em outra modalidade, suspeita-se que um indivíduo que tenha recebido tal escore GCS tenha uma LCT moderada com base no escore GCS determinado. Em outra modalidade, suspeita-se que um indivíduo que recebe tal escore GCS tenha uma LCT grave. Em outra modalidade, suspeita-se que um indivíduo que tenha recebido tal escore GCS tenha LCT moderada a grave com base no escore GCS determinado. Em ainda outra modalidade, no método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 correlacionam-se ou correspondem a um escore na Escala de Coma de Glasgow de 3-8 (uma LCT grave).

[090]Em outra modalidade do método descrito acima: (a) o nível de referência de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; (b) o nível de referência de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (c) o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (d) o nível de referência de GFAP é de cerca de 265 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (e) o nível de referência de GFAP é de cerca de 370 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (f) o nível de referência de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; (g) o nível de referência de GFAP é de cerca de 695 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1570 pg / mL; ou (h) o nível de referência de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL.

[091]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (b) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 265 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (c) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL; (d) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; (e) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 370 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (f) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 370 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (g) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1590 pg / mL; (h) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 695 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1570 pg / mL; ou (i) cerca de

12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL.

[092]Em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 79% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 33%.

[093]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[094]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 2% maior e uma especificidade pelo menos 3% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[095]Em ainda outra modalidade do método descrito acima: e. a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97% e uma especificidade igual ou superior a 51%; ou f. a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de 12 horas a 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97,5% e uma especificidade igual ou superior a 36%; ou g. a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, e o nível de referência do GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL; e o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 79%; ou h. a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 12 horas a 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 66%.

[096]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a medição do nível de GFAP compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[097]Em ainda outra modalidade, a medição de UCH-L1 no método identificado acima compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com:

(1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado por pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

[098]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[099]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos). Qualquer tal tratamento conhecido na técnica e descrito aqui mais adiante pode ser usado. Além disso, em um aspecto adicional, qualquer indivíduo sendo tratado para LCT também pode, opcionalmente, ser monitorado durante e após qualquer curso de tratamento.

[0100]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[0101]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, da classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e do momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[0102]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

[0103]Em ainda outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar uma tomografia computadorizada (TC) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. O método compreende as etapas de: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e determinar que o indivíduo não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 50 pg / mL a cerca de 975 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 90 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

[0104]Em uma modalidade do método descrito acima, o indivíduo recebeu uma TC antes ou depois da realização do ensaio, e em que se suspeita que o indivíduo tenha uma LCT com base no resultado da TC. Em outra modalidade, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um resultado de TC negativo.

[0105]Mais especificamente, nos métodos descritos acima para determinar ou avaliar se é necessário realizar uma TC da cabeça, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma TC que foi ou já foi realizada (ou seja, antes do ensaio que está sendo realizado). Por exemplo, dependendo da condição médica de um indivíduo (tal como, se o paciente estiver inconsciente), uma TC pode ser realizada logo após o paciente chegar a uma sala de emergência, centro de trauma ou outro local para avaliar se o indivíduo tem uma LCT. Essa TC pode ser realizada antes da realização do ensaio para confirmar e determinar se o indivíduo tem ou não uma LCT leve ou moderada a grave. Após a realização do ensaio, uma ou mais TCs subsequentes podem ser realizadas com base nos resultados do ensaio, como parte do gerenciamento da LCT pelo médico (ou por outro profissional de medicina) (como, por exemplo, para determinar se pode ser necessária intervenção cirúrgica e / ou farmacológica).

[0106]Em certos aspectos dos métodos acima, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma TC. Por exemplo, um indivíduo pode ser suspeito de ter uma LCT leve com base em uma TC.

Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT moderada com base em uma TC. Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT grave com base em uma tomografia computadorizada. Alternativamente, pode- se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT moderada a grave com base em uma TC. Além disso, pode-se suspeitar que um indivíduo não tenha uma LCT com base em uma TC.

[0107]Em certos aspectos dos métodos acima, o nível de referência utilizado correlaciona-se ou corresponde a uma tomografia computadorizada da cabeça positiva. Por exemplo, o nível de referência pode correlacionar-se ou corresponder (tal como através de um aumento ou diminuição do nível de referência) a indivíduos com tomografia computadorizada da cabeça positiva. Alternativamente, o nível de referência pode se correlacionar ou corresponder (tal como através de um aumento ou diminuição no nível de referência) a indivíduos com tomografia computadorizada da cabeça negativa. Ainda mais alternativamente, o nível de referência pode se correlacionar ou corresponder (tal como por meio de um aumento ou diminuição no nível de referência) a indivíduos com hemorragia cerebral ou hemorragia cerebral que está melhorando ou piorando. Em outros aspectos do método acima, o nível de referência correlaciona-se ou corresponde a indivíduos de controle que não sofreram LCT.

[0108]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou a suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0109]Em ainda outra modalidade do método acima, (a) nível de referência de GFAP é de cerca de 50 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (b) o nível de referência de GFAP é de cerca de 95 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (c) o nível de referência de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg /

mL; (d) o nível de referência de GFAP é de cerca de 115 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (e) o nível de referência de GFAP é de cerca de 140 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (f) o nível de referência de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 190 pg / mL; (g) o nível de referência de GFAP é de cerca de 190 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; (h) o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 300 pg / mL; (i) o nível de referência de GFAP é de cerca de 285 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 190 pg / mL; (j) o nível de referência de GFAP é de cerca de 500 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1450 pg / mL; (k) o nível de referência de GFAP é de cerca de 555 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 810 pg / mL; (l) o nível de referência de GFAP é de cerca de 800 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 900 pg / mL; (m) o nível de referência de GFAP é de cerca de 840 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (n) o nível de referência de GFAP é de cerca de 880 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 810 pg / mL; ou (o) o nível de referência de GFAP é de cerca de 975 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL.

[0110]Em ainda outra modalidade do método acima, a amostra obtida a partir do indivíduo (a) cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 50 pg / mL e o nível de UCH-L1 é cerca de 2000 pg / mL; (b) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (c) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 140 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (d) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 500 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1450 pg / mL; (e) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL; (f) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; (g) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 370 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (h) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; (i) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 695 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1570 pg / mL; ou (j) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL.

[0111]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio tendo uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 54% e uma especificidade igual ou superior de cerca de 32%.

[0112]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0113]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 2% maior e uma especificidade pelo menos 4% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[0114]Ainda em outra modalidade do método descrito acima: d. a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 62%; e. a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 300 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 91,5% e uma especificidade igual ou superior a 52%; ou f. a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de 12 horas a 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 190 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 99% e uma especificidade igual ou superior a 36%.

[0115]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a medição do nível de GFAP compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[0116]Em ainda outra modalidade, a medição de UCH-L1 no método identificado acima compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado por pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

[0117]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT leve. Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[0118]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT (por exemplo, como uma LCT leve a moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos)).

[0119]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[0120]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, na classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e do momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[0121]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

[0122]Em ainda outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar na determinação ou determinar se um indivíduo humano que sofreu uma lesão na cabeça sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT). O método compreende as etapas de: realizar um ensaio dentro de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão em uma amostra obtida a partir do indivíduo para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e determinar que o indivíduo provavelmente teve uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 40 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 70 pg / mL a cerca de 150 pg / mL.

[0123]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão.

Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão.

[0124]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, (a) o nível de referência de GFAP é de cerca de 10 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; (b) o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 70 pg / mL; (c) o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; (d) o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL; (e) o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; (f) o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 70 pg / mL; ou (g) o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL.

[0125]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão e o nível de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de UCH-L1 é cerca de 70 pg / mL; (b) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão e o nível de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 70 pg / mL; (c) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão e o nível de GFAP é de cerca de 40 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 100 pg / mL; (d) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão e o nível de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; (e) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão e o nível de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL; (f) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão e o nível de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (g) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão e o nível de GFAP é de cerca de 10 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; (h) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão e o nível de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; ou (i) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão e o nível de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL.

[0126]Em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio tendo uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 90% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 35%.

[0127]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a amostra pode ser obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão.

[0128]Ainda em outra modalidade, o ensaio no método descrito acima tem uma sensibilidade pelo menos 3% maior e uma especificidade pelo menos 17% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[0129]Ainda em outra modalidade do método descrito acima:

a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 92% e uma especificidade igual ou superior a 99%; ou a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 99%; ou a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 40 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 100 pg / mL; e em que o método tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 94%; ou a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 82%; ou a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 65%.

[0130]No método descrito acima, os níveis de GFAP e UCH-L1 podem ser medidos ou detectados usando um imunoensaio ou ensaio químico clínico.

[0131]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a medição do nível de GFAP compreende: (d) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP seja formado; e (e) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de CFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[0132]Em ainda outra modalidade, a medição de UCH-L1 no método identificado acima compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado por pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (f) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

[0133]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT leve. Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[0134]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT (por exemplo, tal como uma LCT leve a moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos)). Qualquer tal tratamento conhecido na técnica e descrito aqui mais adiante pode ser usado. Além disso, em um aspecto adicional, qualquer indivíduo sendo tratado para LCT também pode, opcionalmente, ser monitorado durante e após qualquer curso de tratamento. Alternativamente, os ditos métodos podem ainda compreender monitorar um indivíduo avaliado como tendo uma LCT moderada, grave ou moderada a grave (tal como aqueles que, até o momento, podem não estar recebendo nenhum tratamento).

[0135]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[0136]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, da classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e do momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[0137]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

[0138]Em ainda outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método para auxiliar na determinação ou determinar se deve executar um procedimento de ressonância magnética (RM) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. O método compreende as etapas de: realizar um ensaio dentro de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão em uma amostra obtida a partir do indivíduo para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e

(a) determinar que o indivíduo não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[0139]No método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido uma RM após a realização do ensaio e em que o indivíduo é suspeito de ter uma LCT com base no resultado da RM. Em ainda outra modalidade, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 correlacionam-se com um resultado de RM negativo.

[0140]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou a suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0141]Nos métodos descritos acima para determinar ou avaliar se é necessário realizar uma RM, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma RM ou TC que foi ou já foi realizada (ou seja, antes do ensaio que está sendo realizado). Por exemplo, dependendo da condição médica de um indivíduo (tal como, se o paciente estiver inconsciente), uma RM ou TC pode ser realizada logo após o paciente chegar a uma sala de emergência, centro de trauma ou outro local de modo a avaliar se o indivíduo tem uma LCT. Uma RM ou TC pode ser realizada antes da realização do ensaio para confirmar e determinar se o indivíduo tem ou não uma LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave. Após a realização do ensaio, uma ou mais RMs (ou TCs) subsequentes podem ser realizadas com base nos resultados do ensaio, como parte do gerenciamento da LCT pelo médico (ou por outro profissional de medicina) (tal como, por exemplo, para determinar se pode ser necessária intervenção cirúrgica e / ou farmacológica).

[0142]Em certos aspectos dos métodos acima, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base em uma RM. Por exemplo, um indivíduo pode ser suspeito de ter uma LCT leve com base em uma RM.

Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT moderada com base em uma RM. Alternativamente, pode-se suspeitar que um indivíduo tenha uma LCT grave com base em uma RM. Alternativamente, pode-se suspeitar de um indivíduo com LCT moderada a grave com base em uma RM. Adicionalmente, um indivíduo pode ser suspeito de não ter uma LCT com base em uma RM.

[0143]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 98% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 85%.

[0144]Em uma modalidade adicional do método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido um resultado de TC negativo antes da realização do ensaio.

[0145]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT leve. Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[0146]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT (por exemplo, como uma LCT leve a moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos)).

[0147]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[0148]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, da classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e do momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[0149]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

[0150]Em ainda outro aspecto, a presente descrição se refere a um método para auxiliar na previsão ou prever o resultado de um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. O método compreende as etapas de: realizar um ensaio dentro de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão em uma amostra obtida a partir do indivíduo para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e prever para o indivíduo um resultado provavelmente mais desfavorável quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 80 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL, e o nível de UCH- L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 130 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

[0151]Em outra modalidade do método descrito acima, o indivíduo pode ter recebido um escore na Escala de Resultados de Glasgow Estendida (GOSE) após a execução do método e em que o indivíduo é suspeito de ter um resultado ruim com base no escore GOSE. Em ainda outra modalidade, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com indivíduos com um resultado ruim com base em um escore GOSE de 1.

[0152]No método descrito acima, em uma modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo em cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após uma lesão ou suspeita de lesão. Ainda em uma modalidade adicional, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou a suspeita de lesão. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outra modalidade, o ensaio é realizado em uma amostra obtida a partir de um indivíduo dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0153]Ainda em outra modalidade do método descrito acima, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 97% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 95%.

[0154]No método descrito acima, os níveis de GFAP e UCH-L1 são medidos ou detectados usando um imunoensaio ou ensaio químico clínico. Alternativamente, no método descrito acima, os níveis de GFAP e UCH-L1 são medidos ou detectados usando um ensaio de detecção de molécula única.

[0155]Em ainda outra modalidade do método descrito acima, a medição do nível de GFAP compreende: (c) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP seja formado; e (d) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[0156]Em ainda outra modalidade, a medição de UCH-L1 no método identificado acima compreende: (c) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado por pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (d) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

[0157]Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT leve. Em um aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT grave. Em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como tendo uma LCT moderada a grave. Ainda em outro aspecto, usando os métodos descritos acima, o indivíduo é avaliado como não tendo uma LCT.

[0158]Os métodos descritos acima podem ainda compreender tratar um indivíduo humano avaliado como tendo uma LCT (por exemplo, tal como LCT leve a moderada, grave ou moderada a grave com um tratamento para LCT (por exemplo, um tratamento cirúrgico, um tratamento terapêutico ou combinações dos mesmos)).

[0159]Nos métodos descritos acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Essa amostra pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, a amostra pode ser obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, a amostra pode ser obtida após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de produtos químicos ou toxinas são fogo, mofo, amianto, pesticida, inseticida, solvente orgânico, tinta, cola, gás, metal orgânico, droga de abuso ou uma ou mais combinações dos mesmos. Além disso, a amostra pode ser obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[0160]Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser realizado em qualquer indivíduo humano, sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo humano, dos valores laboratoriais do indivíduo humano, da classificação do indivíduo humano como sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave, da exposição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, GFAP e ou UCH-L1 e GFAP, e do momento de qualquer evento em que o indivíduo humano possa ter sofrido lesão na cabeça.

[0161]Nos métodos descritos acima, o ensaio é um imunoensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaio de ponto de atendimento. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio químico clínico. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única. Em ainda outras modalidades, o ensaio é um imunoensaio, o indivíduo é um humano e a amostra é sangue integral.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0162]As Figuras 1A-1B incluem gráficos representativos representando os níveis médios de GFAP (Figura 1A) e UCH-L1 (Figura 1B) em vários pontos no tempo no prazo de 48 horas após a lesão para grupos de LCT moderada / grave, LCT leve e LCT leve e moderada / grave.

[0163]As Figuras 2A-2B incluem gráficos representativos representando os níveis médios de GFAP (Figura 2A) e UCH-L1 (Figura 2B) em vários pontos no tempo no prazo de 48 horas após a lesão para grupos de LCT leve, Controle saudável e Controle Orto.

[0164]As Figuras 3A-3D incluem gráficos representativos dos níveis médios de GFAP por ponto no tempo em indivíduos atribuídos com escores GCS (13-15 = LCT leve; 9-12 = LCT moderada; menor ou igual a 8 = LCT grave) (Figuras 3A e 3B), e com base nos resultados de imagiologia (resultado de TC na Figura 3C; resultado de RM na Figura 3D).

[0165]As Figuras 4A-4D incluem gráficos representativos dos níveis médios de GFAP por ponto no tempo em indivíduos atribuídos com escores GCS (13-15 = LCT leve; 9-12 = LCT moderada; menor ou igual a 8 = LCT grave) (Figuras 4A e 4B), e com base nos resultados de imagiologia (resultado de TC na Figura 4C; resultado de RM na Figura 4D).

[0166]As Figuras 5A-5B incluem gráficos representativos de caixas dos níveis de GFAP (Figura 5A) e UCH-L1 (Figura 5B) em indivíduos agrupados de acordo com os escores de GOSE.

[0167]A Figura 6 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no resultado da tomografia computadorizada (TC positiva) e indivíduos saudáveis (TC negativa).

[0168]A Figura 7 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos atribuídos com um escore GCS; os indivíduos que receberam escore GCS ≤ 12 foram positivos (LCT moderada ou grave) e os indivíduos que receberam escore GCS > 12 foram negativos (LCT leve ou controles saudáveis).

[0169]A Figura 8 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no resultado de RM (RM positiva) e indivíduos de controle saudáveis (RM negativa).

[0170]A Figura 9 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no escore GOSE (1 = LCT / morte) e em indivíduos saudáveis (8 = saudáveis / recuperados).

[0171]A Figura 10 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no resultado da RM (RM positiva) e em indivíduos com controle orto (RM negativa).

[0172]A Figura 11 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no escore GOSE (1 = LCT / morte) e em indivíduos saudáveis orto (8 = saudáveis / recuperados).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0173]A presente descrição refere-se a métodos de auxílio no diagnóstico e avaliação ou no diagnóstico e avaliação de um indivíduo que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. Em particular, a presente descrição fornece métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliação ou diagnosticar e avaliar um indivíduo para determinar se o indivíduo sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT) detectando ou medindo uma combinação dos níveis de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) e proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) em amostras coletadas em vários pontos no tempo no prazo de 48 horas após o indivíduo ter sofrido ou poder ter sofrido uma lesão na cabeça. As modalidades do método também incluem auxiliar na determinação de se um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça se beneficiaria e, portanto, receberia um procedimento de imagiologia, tal como ressonância magnética (RM) ou tomografia computadorizada (TC) da cabeça, com base na avaliação de uma combinação dos níveis de GFAP e UCH-L1. Os métodos podem envolver detectar os níveis de GFAP e UCH-L1 em uma ou mais amostras coletadas a partir do indivíduo humano em um momento dentro de cerca de 48 horas, por exemplo, 0 a cerca de 12 horas, da lesão na cabeça ou suspeita de lesão na cabeça. A detecção de níveis de GFAP e UCH-L1 superiores aos níveis de referência nas primeiras 48 horas após a lesão ou suspeita de lesão na cabeça fornece uma ajuda na determinação de se um indivíduo humano deve receber um procedimento de imagiologia (ou seja, “inclusão” em um procedimento de imagiologia). Por exemplo, indivíduos humanos com níveis de GFAP e UCH-L1 superiores a um nível de referência também podem ser identificados como susceptíveis de realizar uma TC da cabeça positiva ou uma RM positiva (por exemplo, uma lesão intracraniana presente, indicando uma potencial LCT) e, assim, se beneficiam de uma TC ou RM da cabeça. Alternativamente, certos níveis de GFAP e UCH-L1 podem ser usados para “descartar” a necessidade de mais intervenção médica. Por exemplo, indivíduos humanos com níveis de GFAP e UCH-L1 inferiores a um nível de referência podem ser identificados como susceptíveis de realizar uma TC da cabeça negativa ou uma RM negativa (ou seja, ausência de lesão intracraniana e, portanto, uma TC ou RM de cabeça não seriam necessárias ou realizadas).

[0174]A presente descrição se refere a métodos que envolvem detectar os níveis de GFAP e UCH-L1 em uma ou mais amostras coletadas a partir do indivíduo humano em diferentes pontos no tempo no prazo de 48 horas após a lesão na cabeça ou suspeita de lesão na cabeça. A detecção de um aumento ou níveis elevados de uma combinação de GFAP e UCH-L1 também pode auxiliar no diagnóstico de um determinado tipo de LCT. Por exemplo, níveis de GFAP e UCH-L1 maiores que os níveis de referência específicos podem indicar que um indivíduo tem uma LCT moderada, grave ou moderada a grave e, concomitantemente, níveis de GFAP e

UCH-L1 inferiores ao nível de referência podem indicar que o indivíduo tem uma LCT leve. Em alguns casos, os níveis de GFAP e UCH-L1 em combinação também podem auxiliar a determinar se um indivíduo que sofreu uma lesão ortopédica também sofreu uma LCT leve e, portanto, requer intervenção médica adicional para diagnosticar a presença ou ausência de uma LCT leve.

[0175]Os títulos das seções, conforme usados nesta seção e em toda a descrição deste documento, são meramente para fins organizacionais e não se destinam a ser limitantes.

1. Definições

[0176]A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo as definições, prevalecerá. Os métodos e materiais preferenciais são descritos abaixo, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente descrição. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. Os materiais, métodos e exemplos aqui descritos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes.

[0177]Os termos “compreende(m)”, “inclui(em)”, “tendo”, “tem”, “pode”, “contêm(ém)” e suas variantes, conforme aqui utilizados, devem ser frases, termos ou palavras de transição abertos que não excluam a possibilidade de atos ou estruturas adicionais. As formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a” incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. A presente descrição também considera outras modalidades “compreendendo”, “consistindo de” e “consistindo essencialmente de”, as modalidades ou elementos aqui apresentados, explicitamente apresentados ou não.

[0178]Para a citação de intervalos numéricos aqui citados, cada número interveniente entre eles com o mesmo grau de precisão é explicitamente considerado.

Por exemplo, para o intervalo de 6 a 9, os números 7 e 8 são considerados além de 6 e 9, e para o intervalo 6,0 a 7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 e 7,0 são explicitamente considerados.

[0179]“Anticorpo de maturação de afinidade” é usado aqui para se referir a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs, que resultam em uma melhora na afinidade (ou seja, KD, kd ou ka) do anticorpo com um antígeno alvo em comparação com um anticorpo de origem, que não tem a(s) alteração(ões). Os anticorpos de maturação de afinidade exemplificativos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares com o antígeno alvo. Uma variedade de procedimentos para a produção de anticorpos de maturação de afinidade é conhecida na técnica, incluindo a triagem de uma biblioteca combinada de anticorpos que foi preparada usando bio- exibição. Por exemplo, Marks e outros, BioTechnology, 10: 779 a 783 (1992) descreve a maturação de afinidade por embaralhamento dos domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de CDR e / ou estrutura é descrita por Barbas e outros, Proc.

Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809 a 3813 (1994); Schier e outros, Gene, 169: 147 a 155 (1995); Yelton e outros, J. Immunol., 155: 1994 a 2004 (1995); Jackson e outros, J.

Immunol., 154 (7): 3310 a 3319 (1995); e Hawkins e outros, J. Mol. Biol., 226: 889 a 896 (1992). A mutação seletiva em posições de mutagênese seletiva e em posições de contato ou hipermutação com um resíduo de aminoácido que aumenta a atividade é descrita na Patente US No. 6.914.128 B1.

[0180]“Anticorpo” e “anticorpos”, conforme usado aqui, refere-se a anticorpos monoclonais, anticorpos monoespecíficos (por exemplo, que podem ser monoclonais ou também podem ser produzidos por outros meios que não os produzam a partir de uma célula germinativa comum), anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados (total ou parcialmente humanizados), anticorpos de animais, tal como, entre outros, um pássaro (por exemplo, um pato ou um ganso), um tubarão,

uma baleia e um mamífero, incluindo um não primata (por exemplo, uma vaca, um porco, um camelo, uma lhama, um cavalo, uma cabra, um coelho, uma ovelha, um hamster, um porquinho da Índia, um gato, um cachorro, um rato, um camundongo, etc.) ou um primata não humano (por exemplo, um macaco, um chimpanzé, etc.), anticorpos recombinantes, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia única (“scFv”), anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único, fragmentos Fab, F(ab’) fragmentos, fragmentos F(ab’)2, Fvs ligados por dissulfeto (“sdFv”) e anticorpos anti- idiotípicos (“anti-Id”), anticorpos de domínio duplo, anticorpos de domínio variável duplo (DVD) ou de domínio variável triplo (TVD) (imunoglobulinas de domínio variável duplo e métodos para produzi-los são descritos por Wu, C., e outros, Nature Biotechnology, 25 (11): 1290 a 1297 (2007) e Pedido International PCT WO 2001/058956, cujo conteúdo de cada um deles é aqui incorporado por referência) ou anticorpos de domínio (dAbs) (por exemplo, como descrito por Holt e outros (2014) Trends in Biotechnology 21: 484 a 490), e incluindo anticorpos de domínio único sdAbs que ocorrem naturalmente, por exemplo, como em peixes cartilaginosos e camelídeos, ou que são sintéticos, por exemplo, nanocorpos, VHH ou outra estrutura de domínio), e fragmentos de ligação ao epítopo funcionalmente ativos de qualquer um dos anteriores. Em particular, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina, ou seja, moléculas que contêm um sítio de ligação ao analito. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse. Por uma questão de simplicidade, um anticorpo contra um analito é frequentemente chamado aqui de um “anticorpo anti-analito” ou apenas um “anticorpo de analito” (por exemplo, um anticorpo anti-GFAP, um anticorpo de GFAP, um anticorpo anti-UCH-L1 ou um anticorpo de UCH-L1).

[0181]“Fragmento de anticorpo”, conforme aqui utilizado, refere-se a uma porção de um anticorpo intacto compreendendo o sítio de ligação ao antígeno ou a região variável. A porção não inclui os domínios constantes de cadeia pesada (isto é, CH2, CH3 ou CH4, dependendo do isotipo do anticorpo) da região Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, entre outros, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos Fab’-SH, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diabetes, moléculas de cadeia única Fv (scFv), polipeptídeos de cadeia única contendo apenas um domínio variável da cadeia leve, polipeptídeos de cadeia única contendo as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, polipeptídeos de cadeia única contendo apenas uma região variável de cadeia pesada e polipeptídeos de cadeia única contendo as três CDRs da região variável de cadeia pesada.

[0182]A “área sob curva” ou “AUC” refere-se à área sob uma curva ROC. A AUC sob uma curva ROC é uma medida de precisão. Uma AUC de 1 representa um teste perfeito, enquanto uma AUC de 0,5 representa um ensaio insignificante. Uma AUC preferencial pode ser de pelo menos cerca de 0,700, pelo menos cerca de 0,750, pelo menos cerca de 0,800, pelo menos cerca de 0,850, pelo menos cerca de 0,900, pelo menos cerca de 0,910, pelo menos cerca de 0,920, pelo menos cerca de 0,930, pelo menos cerca de 0,940, pelo menos cerca de 0,950, pelo menos cerca de 0,960, pelo menos cerca de 0,970, pelo menos cerca de 0,980, pelo menos cerca de 0,990 ou pelo menos cerca de 0,995.

[0183]“Microesfera” e “partícula” são aqui utilizadas de forma intercambiável e referem-se a um suporte sólido substancialmente esférico. Um exemplo de uma microesfera ou partícula é uma micropartícula. As micropartículas que podem ser usadas neste documento podem ser de qualquer tipo conhecido na técnica. Por exemplo, a microesfera ou partícula pode ser uma microesfera magnética ou partícula magnética. As microesferas / partículas magnéticas podem ser ferromagnéticas, ferrimagnéticas, paramagnéticas, superparamagnéticas ou ferrofluídicas. Os materiais ferromagnéticos exemplificativos incluem Fe, Co, Ni, Gd, Dy, CrO 2, MnAs,

MnBi, EuO e NiO / Fe. Exemplos de materiais ferrimagnéticos incluem NiFe2O4, CoFe2O4, Fe3O4 (ou FeO.Fe2O3). As microesferas podem ter uma porção de núcleo sólido que é magnética e é cercada por uma ou mais camadas não magnéticas.

Alternativamente, a porção magnética pode ser uma camada em torno de um núcleo não magnético. As micropartículas podem ser de qualquer tamanho que funcionem nos métodos aqui descritos, por exemplo, de cerca de 0,75 a cerca de 5 nm, ou de cerca de 1 a cerca de 5 nm, ou de cerca de 1 a cerca de 3 nm.

[0184]“Proteína de ligação” é usada aqui para se referir a uma proteína monomérica ou multimérica que se liga e forma um complexo com um parceiro de ligação, tal como, por exemplo, um polipeptídeo, um antígeno, um composto químico ou outra molécula, ou um substrato de qualquer tipo. Uma proteína de ligação se liga especificamente a um parceiro de ligação. As proteínas de ligação incluem anticorpos, bem como seus fragmentos de ligação ao antígeno e outras várias formas e derivativos dos quais são conhecidos na técnica e aqui descritos abaixo, e outras moléculas compreendendo um ou mais domínios de ligação ao antígeno que se ligam a uma molécula de antígeno ou a um sítio particular (epítopo) na molécula de antígeno. Por conseguinte, uma proteína de ligação inclui, mas não está limitado a, um anticorpo, uma imunoglobulina tetramérica, uma molécula de IgG, uma molécula de IgG1, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado em CDR, um anticorpo humanizado, um anticorpo de maturação de afinidade, e fragmentos de quaisquer anticorpos que mantêm a capacidade de se ligar a um antígeno.

[0185]“Anticorpo biespecífico” é aqui utilizado para se referir a um anticorpo de comprimento total que é gerado pela tecnologia de quadroma (ver Milstein e outros, Nature, 305 (5934): 537 a 540 (1983)), por conjugação química de dois anticorpos monoclonais diferentes (ver Staerz e outros, Nature, 314 (6012): 628 a 631 (1985)), ou por “knob-into-holes” ou abordagens semelhantes, que introduzem mutações na região Fc (ver Holliger e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (14): 6444 a 6448 (1993)), resultando em múltiplas espécies diferentes de imunoglobulinas, das quais apenas uma é o anticorpo biespecífico funcional. Um anticorpo biespecífico se liga a um antígeno (ou epítopo) em um de seus dois braços de ligação (um par de HC / LC) e se liga a um antígeno (ou epítopo) diferente em seu segundo braço (um par diferente de HC / LC). Por esta definição, um anticorpo biespecífico tem dois braços distintos de ligação ao antígeno (tanto na especificidade quanto na sequência de CDR) e é monovalente para cada antígeno ao qual ele se liga.

[0186]“CDR” é usado aqui para se referir à “região determinante de complementaridade” dentro de uma sequência variável de anticorpo. Existem três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve. A partir do N terminal de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são denotadas como “CDR1”, “CDR2” e “CDR3”, para cada uma das regiões variáveis. O termo “conjunto de CDR”, conforme usado aqui, refere-se a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma única região variável que se liga ao antígeno. Um sítio de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada uma das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve. Um polipeptídeo compreendendo uma única CDR (por exemplo, uma CDR1, CDR2 ou CDR3) pode ser chamado de uma “unidade de reconhecimento molecular”. As análises cristalográficas dos complexos de antígeno - anticorpo demonstraram que os resíduos de aminoácidos das CDRs formam contato extenso com o antígeno ligado, em que o contato mais extenso do antígeno é com a CDR3 de cadeia pesada. Assim, as unidades de reconhecimento molecular podem ser as principais responsáveis pela especificidade de um sítio de ligação ao antígeno. Em geral, os resíduos de CDR estão direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.

[0187]Os pontos de cortes exatos dessas CDRs foram definidos diferentemente de acordo com diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat

(Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) e (1991)) não fornece apenas um sistema de numeração de resíduos inequívoco aplicável a qualquer região variável de uma região de um anticorpo, mas também fornece pontos de corte precisos de resíduos definindo as três CDRs. Essas CDRs podem ser chamadas de “CDRs de Kabat”. Chothia e parceiros (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 a 917 (1987); e Chothia e outros, Nature, 342: 877 a 883 (1989)) descobriram que certas subporções dentro das CDRs de Kabat adotam conformações de esqueleto peptídico quase idênticas, apesar de terem grande diversidade no nível da sequência de aminoácidos. Essas subporções foram designadas como “L1”, “L2” e “L3” ou “H1”, “H2” e “H3”, onde o “L” e o “H” designam as regiões de cadeia leve e de cadeia pesada, respectivamente. Essas regiões podem ser chamadas de “CDRs de Chothia”, que têm pontos de corte que se sobrepõem aos das CDRs de Kabat. Outros pontos de corte que definem as CDRs que se sobrepõem às CDRs de Kabat foram descritos por Padlan, FASEB J., 9: 133 a 139 (1995), e MacCallum, J. Mol. Biol., 262 (5): 732 a 745 (1996). Ainda outras definições de pontos de corte de CDR podem não seguir rigorosamente um dos sistemas aqui mencionados, mas, no entanto, se sobrepõem às CDRs de Kabat, embora possam ser encurtadas ou prolongadas face a previsões ou descobertas experimentais de que determinados resíduos ou grupos de resíduos ou mesmo CDRs inteiras não afeta significativamente a ligação ao antígeno. Os métodos aqui utilizados podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer um desses sistemas, embora certas modalidades usem CDRs definidas por Kabat ou Chothia.

[0188]“Componente”, “componentes” ou “pelo menos um componente” refere- se geralmente a um anticorpo de captura, uma detecção ou conjugado de um calibrador, um controle, um painel de sensibilidade, um recipiente, um tampão, um diluente, um sal, uma enzima, um cofator para uma enzima, um reagente de detecção, um reagente / solução de pré-tratamento, um substrato (por exemplo, como uma solução), uma solução de parada e similares que podem ser incluídos em um kit para ensaio de uma amostra de teste, tal como uma amostra de urina, sangue integral, soro ou plasma do paciente, de acordo com os métodos aqui descritos e outros métodos conhecidos na técnica. Alguns componentes podem estar em solução ou liofilizados para reconstituição para uso em um ensaio.

[0189]“Controles”, conforme usado neste documento, geralmente se refere a um reagente cujo objetivo é avaliar o desempenho de um sistema de medição para garantir que ele continue produzindo resultados dentro dos pontos de corte permitidos (por exemplo, pontos de corte que variam de medidas apropriadas para um ensaio de uso de pesquisa em uma extremidade a pontos de corte analíticos estabelecidos pelas especificações de qualidade para um ensaio comercial na outra extremidade). Para conseguir isso, um controle deve ser indicativo dos resultados do paciente e, opcionalmente, deve avaliar o impacto do erro na medição (por exemplo, erro devido à estabilidade do reagente, variabilidade do calibrador, variabilidade do instrumento, e similares). Como usado aqui, um “indivíduo de controle” refere-se a um indivíduo ou indivíduos que não sofreram uma lesão cerebral traumática (LCT). Um “controle orto”, conforme usado aqui, refere-se a (por exemplo, é baseado em) amostras ou informações de um indivíduo ou indivíduos que sofreram uma lesão ortopédica, mas não sofreram uma LCT aparente. Conforme usado neste documento, um “indivíduo de controle orto” refere-se a um indivíduo ou indivíduos que sofreram uma lesão ortopédica, mas não sofreram uma LCT aparente. Em alguns casos, “indivíduos de controle orto” são pacientes ortopédicos adultos que têm um escore abreviado de lesões ≤ 4 (sem risco de vida) por sua extremidade e / ou lesão na pelve e / ou fratura de costela. Um “controle saudável”, como aqui utilizado, refere-se a (por exemplo, com base em) amostras ou informações de um indivíduo ou indivíduos considerados saudáveis e que não sofreram LCT ou lesão ortopédica aparente. Conforme usado neste documento, um “indivíduo de controle saudável” refere-se a um indivíduo ou indivíduos considerados saudáveis e que não sofreram LCT ou lesão ortopédica aparente.

[0190]“Correlacionado a”, conforme aqui utilizado, refere-se a comparado a.

[0191]“TC”, conforme aqui utilizado, refere-se a uma tomografia computadorizada (TC). Uma TC combina uma série de imagens de raios-X tiradas de diferentes ângulos e usa o processamento de computador para criar imagens transversais, ou fatias, dos ossos, vasos sanguíneos e tecidos moles dentro do corpo.

A TC pode usar TC de raios X, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia axial computadorizada (CAT) ou tomografia auxiliada por computador. A TC pode ser uma TC convencional ou uma TC helicoidal / espiral. Em uma TC convencional, a varredura é feita fatia a fatia e após cada fatia, a varredura para e move-se para a próxima fatia, por exemplo, do topo do abdômen até a pelve. A TC convencional exige que os pacientes prendam a respiração para evitar artefatos de movimento. A TC helicoidal / espiral é uma varredura contínua feita em espiral e é um processo muito mais rápido em que as imagens digitalizadas são contíguas.

[0192]“Derivativo” de um anticorpo, conforme aqui utilizado, pode se referir a um anticorpo que tem uma ou mais modificações em sua sequência de aminoácidos quando comparado com um anticorpo genuíno ou e origem e exibe uma estrutura de domínio modificada. O derivativo ainda pode ser capaz de adotar a configuração típica de domínio encontrada em anticorpos nativos, bem como uma sequência de aminoácidos, capaz de se ligar a alvos (antígenos) com especificidade. Exemplos típicos de derivativos de anticorpos são anticorpos acoplados a outros polipeptídeos, domínios de anticorpos rearranjados, ou fragmentos de anticorpos. O derivativo também pode compreender pelo menos um composto adicional, por exemplo, um domínio de proteína, sendo o dito domínio de proteína ligado por ligações covalentes ou não covalentes. A ligação pode ser baseada na fusão genética de acordo com os métodos conhecidos na técnica. O domínio adicional presente na proteína de fusão compreendendo o anticorpo pode preferencialmente ser ligado por um ligante flexível, vantajosamente um ligante peptídico, em que o dito ligante peptídico compreende aminoácidos plurais, hidrofílicos, ligados a peptídeos com um comprimento suficiente para percorrer a distância entre a extremidade C terminal do domínio proteico adicional e extremidade N terminal do anticorpo ou vice-versa. O anticorpo pode estar ligado a uma molécula efetora com uma conformação adequada para atividade biológica ou ligação seletiva a um suporte sólido, uma substância biologicamente ativa (por exemplo, uma citocina ou hormônio do crescimento), um agente químico, um peptídeo, uma proteína ou um fármaco, por exemplo.

[0193]“Determinado por um ensaio” é usado aqui para se referir à determinação de um nível de referência por qualquer ensaio apropriado. A determinação de um nível de referência pode, em algumas modalidades, ser alcançada por um ensaio do mesmo tipo que o ensaio a ser aplicado à amostra do indivíduo (por exemplo, por um imunoensaio, ensaio químico clínico, um ensaio de detecção de molécula única, imunoprecipitação de proteínas, imunoeletroforese, análise química, SDS-PAGE e análise de Western blot, ou imunocoloração de proteínas, análise por eletroforese, ensaio de proteínas, ensaio de ligação competitiva, ensaio funcional de proteínas, ou métodos de cromatografia ou espectrometria, tal como métodos de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC / MS)). A determinação de um nível de referência pode, em algumas modalidades, ser alcançada por um ensaio do mesmo tipo e sob as mesmas condições de ensaio que o ensaio a ser aplicado à amostra do indivíduo. Como observado neste documento, esta descrição fornece níveis de referência exemplificativos (por exemplo, calculados comparando os níveis de referência em diferentes pontos no tempo). Está dentro do conhecimento comum de um versado na técnica adaptar esta descrição para outros ensaios de modo a obter níveis de referência específicos para os outros ensaios com base nesta descrição fornecida. Por exemplo, um conjunto de amostras de treinamento compreendendo amostras obtidas a partir de indivíduos humanos que sofreram uma lesão na cabeça (e, mais particularmente, amostras obtidas a partir de indivíduos humanos que sofreram uma (i) LCT leve; e / ou (ii) LCT moderada, grave ou moderada a grave, e amostras obtidas a partir de indivíduos humanos que sabidamente não sofreram lesões na cabeça podem ser usadas para obter níveis de referência específicos do ensaio. Será entendido que um nível de referência “determinado por um ensaio” e tendo um nível citado de “sensibilidade” e / ou “especificidade” é usado aqui para se referir a um nível de referência que foi determinado para fornecer um método da sensibilidade e / ou especificidade citado quando o dito nível de referência é adotado nos métodos da descrição. Está dentro do conhecimento comum do versado na técnica determinar a sensibilidade e a especificidade associadas a um determinado nível de referência nos métodos da descrição, por exemplo, por análise estatística repetida dos dados do ensaio usando uma pluralidade de diferentes níveis de referência possíveis.

[0194]Praticamente, ao discriminar um indivíduo como tendo uma lesão cerebral traumática ou não tendo uma lesão cerebral traumática ou um indivíduo como tendo uma lesão cerebral leve versus moderada, grave, ou moderada a grave, o versado na técnica balanceará o efeito de aumentar um ponto de corte na sensibilidade e a especificidade. Aumentar ou diminuir um ponto de corte terá um impacto bem definido e previsível na sensibilidade e especificidade, além de outras medidas estatísticas padrão. É sabido que aumentar um ponto de corte melhorará a especificidade, mas provavelmente piorará a sensibilidade (proporção de pessoas com doença que testam positivo). Por outro lado, a redução de um ponto de corte melhorará a sensibilidade, mas piorará a especificidade (proporção de pessoas sem doença que testam negativo). As ramificações para detectar lesão cerebral traumática ou determinar uma lesão cerebral traumática leve versus moderada, grave ou moderada a grave serão prontamente evidentes para os versados na técnica. Ao discriminar se um indivíduo tem ou não uma lesão cerebral traumática ou uma lesão cerebral traumática leve versus moderada, grave ou moderada a grave, quanto maior o ponto de corte, a especificidade melhora à medida que mais negativos verdadeiros (ou seja, indivíduos que não apresentam uma lesão cerebral traumática, não têm uma lesão cerebral traumática leve, não têm uma lesão cerebral traumática moderada, não têm uma lesão cerebral traumática grave ou não têm uma lesão cerebral traumática moderada a grave) são distinguidos daqueles tendo lesão cerebral traumática, uma lesão cerebral traumática leve, uma lesão cerebral traumática moderada, uma lesão cerebral traumática grave ou uma lesão cerebral traumática moderada a grave. Mas, ao mesmo tempo, aumentar o ponto de corte diminui o número de casos identificados como positivos em geral, bem como o número de verdadeiros positivos, portanto, a sensibilidade deve diminuir. Por outro lado, quanto menor o ponto de corte, a sensibilidade melhora à medida que mais positivos verdadeiros (ou seja, indivíduos tendo uma lesão cerebral traumática, tendo uma lesão cerebral traumática leve, tendo uma lesão cerebral traumática moderada, tendo uma lesão cerebral traumática grave, tendo uma lesão cerebral traumática grave ou tendo uma lesão traumática moderada a grave) são distinguidos daqueles que não apresentam lesão cerebral traumática, lesão cerebral traumática leve, lesão cerebral traumática moderada, lesão cerebral traumática grave ou lesão cerebral traumática moderada a grave. Mas, ao mesmo tempo, diminuir o ponto de corte aumenta o número de casos identificados como positivos em geral, bem como o número de falsos positivos, portanto, a especificidade deve diminuir.

[0195]Geralmente, um alto valor de sensibilidade ajuda um versado na técnica a descartar doenças ou condições (tal como uma lesão cerebral traumática, lesão cerebral traumática leve, lesão cerebral traumática moderada, lesão cerebral traumática grave ou lesão cerebral traumática moderada a grave), e um alto valor de especificidade ajuda a pessoa a dominar a doença ou condição. Se um versado na técnica deseja descartar ou incluir uma doença depende das consequências para o paciente em cada tipo de erro. Consequentemente, não se pode conhecer ou prever o equilíbrio preciso empregado para obter um ponto de corte de teste sem a descrição completa das informações subjacentes sobre como o valor foi selecionado. O equilíbrio da sensibilidade com a especificidade e outros fatores diferirá caso a caso.

É por isso que às vezes é preferencial fornecer valores alternativos de ponto de corte (por exemplo, referência) para que um médico ou profissional possa escolher.

[0196]“Drogas de abuso” é usada aqui para se referir a uma ou mais substâncias viciantes (tal como uma droga) tomadas por razões não médicas (tal como, por exemplo, efeitos recreativos e / ou que alteram a consciência). Excesso, uso ou dependência de tais drogas de abuso é frequentemente chamado de “abuso de substâncias”. Exemplos de drogas de abuso incluem álcool, barbitúricos, benzodiazepínicos, cannabis, cocaína, alucinógenos (tal como cetamina, mescalina (peiote), PCP, psilocibina, DMT e / ou LSD), metacalona, opioides, anfetaminas (incluindo metanfetaminas), esteroides anabolizantes, inalantes (ou seja, substâncias que contêm substâncias voláteis que contêm propriedades psicoativas, tal como, por exemplo, nitritos, tintas em aspersão, fluidos de limpeza, marcadores, colas, etc.) e combinações dos mesmos.

[0197]“Anticorpo duplo-específico” é usado aqui para se referir a um anticorpo de comprimento total que pode ligar dois antígenos diferentes (ou epítopos) em cada um de seus dois braços de ligação (um par de HC / LC) (ver a publicação PCT WO 02/02773). Por conseguinte, uma proteína de ligação dupla-específica tem dois braços de ligação ao antígeno idênticos, com especificidade idêntica e sequências de CDR idênticas, e é bivalente para cada antígeno ao qual se liga.

[0198]“Domínio variável duplo” é aqui utilizado para se referir a dois ou mais sítios de ligação ao antígeno em uma proteína de ligação, que pode ser divalente (dois sítios de ligação ao antígeno), tetravalente (quatro sítios de ligação ao antígeno) ou proteínas de ligação multivalentes. Os DVDs podem ser monoespecíficos, ou seja, capazes de se ligar a um antígeno (ou um epítopo específico) ou multiespecíficos, ou seja, capazes de se ligar a dois ou mais antígenos (ou seja, dois ou mais epítopos da mesma molécula de antígeno alvo ou dois ou mais epítopos de antígenos alvo diferentes). Uma proteína de ligação DVD preferencial compreende dois polipeptídeos de DVD de cadeia pesada e dois polipeptídeos de DVD de cadeia leve e é chamada de “DVD imunoglobulina” ou “DVD-Ig”. Essa proteína de ligação a DVD-Ig é, portanto, tetramérica e restante de uma molécula de IgG, mas fornece mais sítios de ligação ao antígeno do que uma molécula de IgG. Assim, cada metade de uma molécula de DVD- Ig tetramérica lembra uma metade de uma molécula de IgG e compreende um polipeptídeo de DVD de cadeia pesada e um polipeptídeo de DVD de cadeia leve, mas diferentemente de um par de cadeias pesadas e leves de uma molécula de IgG que fornece um domínio de ligação ao antígeno único, um par de cadeias pesadas e leves de um DVD-Ig fornece dois ou mais sítios de ligação ao antígeno.

[0199]Cada sítio de ligação ao antígeno de uma proteína de ligação ao DVD- Ig pode ser derivativo de um anticorpo monoclonal doador (“de origem”) e, portanto, compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) com um total de seis CDRs envolvidas na ligação ao antígeno por sítio de ligação ao antígeno. Por conseguinte, uma proteína de ligação a DVD-Ig que liga dois epítopos diferentes (isto é, dois epítopos diferentes de duas moléculas de antígeno diferentes ou dois epítopos diferentes da mesma molécula de antígeno) compreende um sítio de ligação ao antígeno derivado de um primeiro anticorpo monoclonal de origem e um sítio de ligação ao antígeno de um segundo anticorpo monoclonal de origem.

[0200]Uma descrição do modelo, expressão e caracterização das moléculas de ligação a DVD-Ig é fornecida na Publicação PCT No. WO 2007/024715, Patente US No. 7.612.181 e Wu e outros, Nature Biotech., 25: 1290 a 1297 (2007). Um exemplo preferencial de tais moléculas de DVD-Ig compreende uma cadeia pesada que compreende a fórmula estrutural VD1- (X1) n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é o primeiro domínio variável de cadeia pesada, VD2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada, C é um domínio constante de cadeia pesada, X1 é um ligante com a condição de que não seja CH1, X2 é uma região Fc, e n é 0 ou 1, mas preferencialmente 1; e uma cadeia leve que compreende a fórmula estrutural VD1- (X1)n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve, VD2 é um segundo domínio variável de cadeia leve, C é um domínio constante de cadeia leve, X1 é um ligante com a condição de que não seja CH1, e X2 não compreende uma região Fc; e n é 0 ou 1, mas preferencialmente 1. Esse DVD-Ig pode compreender duas dessas cadeias pesadas e duas dessas cadeias leves, em que cada cadeia compreende domínios variáveis ligados em tandem, sem uma região constante interveniente entre regiões variáveis, em que uma cadeia pesada e uma cadeia leve associada para formar sítios de ligação ao antígeno funcional em tandem, e um par de cadeias pesadas e leves pode associar-se a outro par de cadeias pesadas e leves para formar uma proteína de ligação tetramérica com quatro sítios de ligação ao antígeno funcionais. Em outro exemplo, uma molécula de DVD-Ig pode compreender cadeias pesadas e leves, onde cada uma compreende três domínios variáveis (VD1, VD2, VD3) ligados em tandem sem uma região constante interveniente entre domínios variáveis, em que um par de cadeias pesadas e leves pode se associar para formar três sítios de ligação ao antígeno, e em que um par de cadeias pesadas e leves pode se associar a outro par de cadeias pesadas e leves para formar uma proteína de ligação tetramérica com seis sítios de ligação ao antígeno.

[0201]Em uma modalidade preferencial, uma proteína de ligação a DVD-Ig não apenas liga as mesmas moléculas alvo ligadas por seus anticorpos monoclonais de origem, mas também tem uma ou mais propriedades desejáveis de um ou mais de seus anticorpos monoclonais de origem. De preferência, tal propriedade adicional é um parâmetro de anticorpo de um ou mais dos anticorpos monoclonais de origem. Os parâmetros de anticorpo que podem ser contribuídos para uma proteína de ligação a DVD-Ig a partir de um ou mais de seus anticorpos monoclonais de origem incluem, mas não estão limitados a, especificidade de antígeno, afinidade ao antígeno, potência, função biológica, reconhecimento de epítopo, estabilidade de proteínas, solubilidade de proteínas, eficiência de produção, imunogenicidade, farmacocinética, biodisponibilidade, reatividade cruzada de tecidos, e ligação ortóloga a antígenos.

[0202]Uma proteína de ligação a DVD-Ig se liga a pelo menos um epítopo de GFAP e / ou UCH-L1. Exemplos não limitantes de uma proteína de ligação a DVD-Ig incluem uma proteína de ligação a DVD-Ig que se liga a um ou mais epítopos de GFAP e / ou UCH-L1, uma proteína de ligação a DVD-Ig que se liga a um epítopo de GFAP e / ou UCH-L1 humano e um epítopo de GFAP e / ou UCH-L1 de outra espécie (por exemplo, camundongo) e uma proteína de ligação a DVD-Ig que liga um epítopo de GFAP e / ou UCH-L1 humano e um epítopo de outra molécula alvo.

[0203]“Faixa dinâmica”, conforme aqui utilizado, refere-se à faixa na qual uma leitura de ensaio é proporcional à quantidade de molécula alvo ou analito na amostra que está sendo analisada.

[0204]“Epítopo” ou “epítopos” ou “epítopos de interesse” refere-se a um ou mais sítios em qualquer molécula que sejam reconhecidos e possam se ligar a um ou mais sítios complementares em seu parceiro de ligação específica. A molécula e o parceiro de ligação específica fazem parte de um par de ligação específica. Por exemplo, um epítopo pode estar em um polipeptídeo, uma proteína, um hapteno, um antígeno de carboidrato (tal como, mas não limitado a, glicolipídios, glicoproteínas ou lipopolissacarídeos) ou um polissacarídeo. O seu parceiro de ligação específica pode ser, mas não está limitado a, um anticorpo.

[0205]“Fragmento de ligação ao antígeno” ou “fragmento Fab”, conforme aqui utilizado, refere-se a um fragmento de um anticorpo que se liga a antígenos e que contém um sítio de ligação ao antígeno, uma cadeia leve completa, e parte de uma cadeia pesada. Fab é um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CH1. Fab é composto de um domínio constante e um variável de cada uma das cadeias pesada e leve. O domínio variável contém o parátopo (o sítio de ligação ao antígeno), compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade, na extremidade amino terminal do monômero. Cada braço de Y, portanto, liga um epítopo ao antígeno. Os fragmentos Fab podem ser gerados como foi descrito na técnica, por exemplo, usando a enzima papaína, que pode ser usada para clivar um monômero de imunoglobulina em dois fragmentos Fab e um fragmento Fc, ou pode ser produzido por meios recombinantes.

[0206]“Fragmento F(ab’)2”, conforme usado aqui, refere-se a anticorpos gerados pela digestão com pepsina de anticorpos IgG inteiros para remover a maior parte da região Fc, deixando intacta parte da região de dobradiça. Os fragmentos F(ab’)2 têm duas porções F(ab) de ligação ao antígeno ligadas entre si por ligações dissulfeto e, portanto, são divalentes com um peso molecular de cerca de 110 kDa.

Os fragmentos de anticorpos divalentes (fragmentos F(ab’)2) são menores do que as moléculas de IgG inteiras e permitem uma melhor penetração no tecido, facilitando assim um melhor reconhecimento de antígenos na imuno-histoquímica. A utilização de fragmentos F(ab’)2 também evita a ligação inespecífica ao receptor Fc nas células vivas ou à proteína A / G. Os fragmentos F(ab’)2 podem se ligar e precipitar antígenos.

[0207]“Estrutura” (FR) ou “Sequência de estrutura”, conforme aqui utilizado, pode significar as sequências restantes de uma região variável menos as CDRs.

Como a definição exata de uma sequência de CDR pode ser determinada por diferentes sistemas (por exemplo, ver acima), o significado de uma sequência de estrutura está sujeito a diferentes interpretações correspondentes. As seis CDRs

(CDR-L1, -L2 e -L3 de cadeia leve e CDR-H1, -H2 e -H3 de cadeia pesada) também dividem as regiões estruturais de cadeia leve e de cadeia pesada em quatro sub- regiões (FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, na qual a CDR1 está posicionada entre FR1 e FR2, CDR2 entre FR2 e FR3, e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as sub-regiões particulares como FR1, FR2, FR3 ou FR4, uma região estrutural, como dito por outros, representa as FRs combinadas dentro da região variável de uma única cadeia de imunoglobulina que ocorre naturalmente. Como aqui utilizado, uma FR representa uma das quatro sub-regiões, e FRs representa duas ou mais das quatro sub-regiões que constituem uma região estrutural.

[0208]As sequências FR humanas de cadeia pesada e cadeia leve que são conhecidas na técnica podem ser usadas como sequências de estrutura “aceitadoras” de cadeia pesada e cadeia leve (ou simplesmente, sequências “aceitadoras”) para humanizar um anticorpo não humano usando técnicas conhecidas. Em uma modalidade, as sequências aceitadoras de cadeia pesada e cadeia leve humanas são selecionadas a partir das sequências de estrutura listadas em bancos de dados publicamente disponíveis, tal como V-base (hypertext transfer protocol: //vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/) ou no sistema internacional de informações ImMunoGeneTics® (IMGT®) (hypertext transfer protocol: //imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/ LocusGenes /).

[0209]“Sítio de ligação ao antígeno funcional”, conforme usado aqui, pode significar um sítio em uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) que é capaz de se ligar a um antígeno alvo. A afinidade de ligação ao antígeno do sítio de ligação ao antígeno pode não ser tão forte quanto a proteína de ligação de origem, por exemplo, anticorpo de origem, do qual o sítio de ligação ao antígeno é derivado, mas a capacidade de se ligar ao antígeno deve ser mensurável usando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos para avaliar a proteína, por exemplo, anticorpo, se ligando a um antígeno. Além disso, a afinidade de ligação ao antígeno de cada um dos sítios de ligação ao antígeno de uma proteína multivalente, por exemplo, anticorpo multivalente, neste documento não precisa ser quantitativamente a mesma.

[0210]“GFAP” é usado aqui para descrever a proteína fibrilar ácida da glia.

GFAP é uma proteína que é codificada pelo gene GFAP em humanos, e que pode ser produzida (por exemplo, por meios recombinantes, em outras espécies).

[0211]“Estado de GFAP” pode significar o nível ou a quantidade de GFAP em um determinado momento (tal como com uma única medida de GFAP), o nível ou a quantidade de GFAP associado ao monitoramento (tal como com um ensaio de repetição em um indivíduo para identificar um aumento ou diminuição na quantidade de GFAP), o nível ou quantidade de GFAP associado ao tratamento de lesão cerebral traumática (seja uma lesão cerebral primária e / ou uma lesão cerebral secundária) ou combinações das mesmas.

[0212]“Escala de coma de Glasgow” ou “GCS”, conforme usado aqui, refere- se a uma escala de 15 pontos para estimar e categorizar os resultados de lesão cerebral com base na capacidade social geral ou na dependência de outras pessoas.

O teste mede a resposta motora, a resposta verbal e a resposta de abertura ocular com os seguintes valores: I. Resposta Motora (6 - Obedece totalmente aos comandos; 5 - Localiza-se a estímulos nocivos; 4 - Retira-se de estímulos nocivos; 3 - Flexão anormal, ou seja, postura decorticada; 2 - Resposta extensora, ou seja, postura descerebrada; e 1 - Nenhuma resposta); II Resposta verbal (5 - Alerta e Orientado; 4 - Fala confusa, porém coerente; 3 - Palavras inapropriadas e frases confusas compostas por palavras; 2 - Sons incompreensíveis; e 1 - Sem sons); e III. Abertura ocular (4 - Abertura espontânea dos olhos; 3 - Olhos abertos à fala; 2 - Olhos abertos à dor; e 1 - Nenhuma abertura ocular). O escore final é determinado adicionando-se os valores de I + II + III. O escore final pode ser categorizado em quatro níveis possíveis de sobrevivência, com um número menor indicando lesão mais grave e pior prognóstico: Leve (13-15); Deficiência moderada (9-12) (perda de consciência superior a 30 minutos; deficiências físicas ou cognitivas que podem resolver: e se beneficiar da reabilitação); Deficiência Grave (3-8) (Coma: estado inconsciente.

Nenhuma resposta significativa, nenhuma atividade voluntária); e Estado vegetativo (menos de 3) (ciclos de vigília do sono; excitação, mas sem interação com o ambiente; sem resposta localizada à dor). A lesão cerebral moderada é definida como uma lesão cerebral que resulta em perda de consciência de 20 minutos a 6 horas e uma Escala de coma de Glasgow de 9 a 12. A lesão cerebral grave é definida como uma lesão cerebral que resulta em perda de consciência superior a 6 horas e uma escala de coma de Glasgow de 3 a 8.

[0213]“Escala de Resultados de Glasgow”, conforme usado aqui, refere-se a uma escala global para resultados funcionais que classifica o estado do paciente em uma de cinco categorias: Morto, Estado Vegetativo, Incapacidade Grave, Incapacidade Moderada ou Boa Recuperação.

[0214]“Escala de Resultados de Glasgow Estendida” ou “GOSE”, conforme usado aqui de forma intercambiável, fornece categorização mais detalhada em oito categorias, subdividindo as categorias de incapacidade grave, incapacidade moderada e boa recuperação em uma categoria inferior e superior, como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1

1 Morte D Condição de inconsciência com apenas 2 Estado Vegetativo VX respostas reflexivas, mas com períodos de abertura espontânea dos olhos. 3 Incapacidade grave inferior SD - Paciente dependente de suporte diário para incapacidade mental ou física, geralmente uma combinação de ambos. Se o paciente puder ficar Incapacidade grave 4 SD + sozinho por mais de 8 horas em casa, é o nível superior superior de SD; caso contrário, é nível inferior de SD. Incapacidade moderada Os pacientes têm alguma incapacidade, tal como 5 MD - inferior afasia, hemiparesia ou epilepsia e / ou déficits de memória ou personalidade, mas são capazes de cuidar de si mesmos. Eles são independentes em Incapacidade moderada casa, mas dependem de alguém externamente. 6 MD + superior Se eles são capazes de retornar ao trabalho, mesmo com arranjo especial, é o nível superior de MD; caso contrário, é o nível inferior de MD. Retomada da vida normal com capacidade para 7 Boa recuperação inferior GR - trabalhar, mesmo que o estado pré-lesão não tenha sido alcançado. Alguns pacientes têm déficits neurológicos ou psicológicos menores. Se esses déficits não estiverem incapacitando, 8 Boa recuperação superior GR + será o nível superior de GR, se estiverem incapacitando, será o nível inferior de GR.

[0215]“Anticorpo humanizado” é usado aqui para descrever um anticorpo que compreende sequências de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de uma espécie não humana (por exemplo, um camundongo), mas na qual pelo menos uma porção da sequência VH e / ou VL foi alterada para ser mais “semelhante à humana”, isto é, mais semelhante às sequências variáveis da linhagem germinativa humana.

Um “anticorpo humanizado” é um anticorpo ou uma variante, derivativo, análogo ou fragmento do mesmo, que se liga imunoespecificamente a um antígeno de interesse e que compreende uma região estrutural (FR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e uma região determinante de complementaridade (CDR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. Como usado aqui, o termo “substancialmente”, no contexto de uma CDR, refere-se a uma CDR tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de uma CDR de anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis (Fab, Fab’, F(ab’)2, FabC, Fv) nos quais todas ou praticamente todas as regiões CDR correspondem às de uma região de imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém a cadeia leve, bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões CH1, dobradiça, CH2, CH3 e CH4 de cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e / ou cadeia pesada humanizada.

[0216]Um anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo, sem limitação, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Um anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais de uma classe ou isotipo, e domínios constantes particulares podem ser selecionados para otimizar as funções efetoras desejadas usando técnicas bem conhecidas.

[0217]As regiões estruturais e CDRs de um anticorpo humanizado não precisam corresponder exatamente às sequências de origem, por exemplo, a CDR do anticorpo doador ou a estrutura consenso pode ser mutagenizada por substituição, inserção e / ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido de modo que a CDR ou resíduo da estrutura naquele sítio não corresponda ao anticorpo doador ou à estrutura consenso. Em uma modalidade preferencial, essas mutações, no entanto, não serão extensivas. Normalmente, pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 95% dos resíduos de anticorpos humanizados corresponderão aos das sequências FR e CDR de origem. Como usado aqui, o termo “estrutura consenso” refere-se à região estrutural na sequência de imunoglobulina consenso. Como usado aqui, o termo “sequência de imunoglobulina consenso” refere-se à sequência formada a partir dos aminoácidos (ou nucleotídeos) que ocorrem com mais frequência em uma família de sequências de imunoglobulinas relacionadas (ver, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)). Uma “sequência de imunoglobulina consenso” pode assim compreender uma “região(ões) estrutural consenso” e / ou “CDR(s) consenso”. Em uma família de imunoglobulinas, cada posição na sequência consenso é ocupada pelo aminoácido que ocorre com mais frequência nessa posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem com a mesma frequência, ambos podem ser incluídos na sequência consenso.

[0218]“Idêntico” ou “identidade”, conforme usado aqui no contexto de duas ou mais sequências polipeptídicas ou polinucleotídicas, pode significar que as sequências têm uma porcentagem especificada de resíduos que são os mesmos em uma região especificada. A porcentagem pode ser calculada alinhando de maneira ideal as duas sequências, comparando as duas na região especificada, determinando o número de posições nas quais o resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na região especificada, e multiplicando o resultado por 100 para gerar a porcentagem de identidade de sequência. Nos casos em que as duas sequências têm comprimentos diferentes ou o alinhamento produz uma ou mais extremidades escalonadas e a região de comparação especificada inclui apenas uma única sequência, os resíduos da sequência única são incluídos no denominador, mas não no numerador do cálculo.

[0219]“Procedimento de imagiologia”, conforme usado aqui, refere-se a um teste médico que permite que o interior de um corpo seja visto para diagnosticar, tratar e monitorar condições de saúde. Um procedimento de imagiologia pode ser um procedimento não invasivo que permite o diagnóstico de doenças e lesões sem ser intrusivo. Exemplos de procedimentos de imagiologia incluem RM, TC, raios-X, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT), e imagiologia por tensor de difusão (DTI).

[0220]“Lesão na cabeça”, conforme usado aqui, refere-se a qualquer trauma no couro cabeludo, crânio ou cérebro. Tais lesões podem incluir apenas uma pequena protuberância no crânio ou podem ser uma lesão cerebral grave. Tais lesões incluem lesões primárias no cérebro e / ou lesões secundárias no cérebro. As lesões cerebrais primárias ocorrem durante o insulto inicial e resultam do deslocamento das estruturas físicas do cérebro. Mais especificamente, uma lesão cerebral primária é o dano físico ao parênquima (tecido, vasos) que ocorre durante o evento traumático, resultando em cisalhamento e compressão do tecido cerebral circundante. As lesões cerebrais secundárias ocorrem após a lesão primária e podem envolver uma série de processos celulares. Mais especificamente, uma lesão cerebral secundária refere-se às alterações que evoluem ao longo de um período de tempo (de horas a dias) após a lesão cerebral primária. Ela inclui uma cascata inteira de alterações celulares, químicas, de tecidos ou de vasos sanguíneos no cérebro que contribuem para a destruição adicional do tecido cerebral.

[0221]Uma lesão na cabeça pode ser fechada ou aberta (penetrante). Uma lesão na cabeça fechada refere-se a um trauma no couro cabeludo, crânio ou cérebro,

onde não há penetração do crânio por um objeto golpeante.

Uma lesão na cabeça aberta refere-se a um trauma no couro cabeludo, crânio ou cérebro onde há penetração do crânio por um objeto golpeante.

Uma lesão na cabeça pode ser causada por agitação física de uma pessoa, por um impacto contundente de uma força mecânica ou outra força externa que resulte em um traumatismo craniano fechado ou aberto (por exemplo, acidente de veículo, tal como automóvel, avião, trem etc.), golpe na cabeça tal como com um taco de beisebol ou com uma arma de fogo, um acidente vascular cerebral (por exemplo, derrame), uma ou mais quedas (por exemplo, como em esportes ou outras atividades), explosões (coletivamente, “lesões por explosão”)

e por outros tipos de trauma por força contundente.

Alternativamente, uma lesão na cabeça pode ser causada pela ingestão e / ou exposição a um produto químico, toxina ou uma combinação de um produto químico e toxina.

Exemplos de tais produtos químicos e / ou toxinas incluem fogo, fungos, amianto, pesticidas e inseticidas,

solventes orgânicos, tintas, colas, gases (tal como monóxido de carbono, sulfeto de hidrogênio e cianeto), metais orgânicos (tal como metil mercúrio, chumbo tetraetílico e estanho orgânico) e / ou uma ou mais drogas de abuso.

Alternativamente, uma lesão na cabeça pode ser causada como um resultado de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, um ou mais vírus,

meningite, hidrocefalia, hipóxia ou qualquer combinação dos mesmos.

Em alguns casos, não é possível ter certeza de que qualquer tal evento ou lesão ocorreu.

Por exemplo, pode não haver histórico de um paciente ou indivíduo, o indivíduo pode não conseguir falar, o indivíduo pode não estar ciente ou ter informações completas sobre a quais eventos eles foram expostos etc.

Essas circunstâncias são descritas aqui como o indivíduo “pode ter sofrido uma lesão na cabeça”. Em certas modalidades deste documento, a lesão na cabeça fechada não inclui e exclui especificamente um acidente vascular cerebral, tal como um derrame.

[0222]“Lesão intracraniana”, conforme aqui utilizado, refere-se a uma área de lesão dentro do cérebro. Uma lesão intracraniana pode ser uma anormalidade observada em um procedimento de imagiologia ou em um ensaio de imagiologia cerebral, tal como RM ou TC. Na RM ou TC, as lesões cerebrais podem aparecer como pontos escuros ou claros que não parecem tecido cerebral normal.

[0223]“Polinucleotídeo isolado”, conforme usado aqui, pode significar um polinucleotídeo (por exemplo, de origem genômica, cDNA, ou de origem sintética, ou uma combinação dos mesmos) que, em virtude de sua origem, o polinucleotídeo isolado não está associado a todo ou a uma porção de um polinucleotídeo com o qual o “polinucleotídeo isolado” é encontrado na natureza; está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza; ou não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[0224]“Marcador” e “marcador detectável”, conforme aqui utilizados, se referem a uma porção ligada a um anticorpo ou um analito para tornar a reação detectável entre o anticorpo e o analito, e o anticorpo ou analito assim marcado é chamado de “detectavelmente marcado”. Um marcador pode produzir um sinal detectável por meios visuais ou instrumentais. Vários marcadores incluem substâncias produtoras de sinal, tal como cromagens, compostos fluorescentes, compostos quimioluminescentes, compostos radioativos e similares. Exemplos representativos de marcadores incluem porções que produzem luz, por exemplo, compostos de acridínio, e porções que produzem fluorescência, por exemplo, fluoresceína. Outros marcadores são descritos aqui. A este respeito, a porção, por si só, pode não ser detectável, mas pode se tornar detectável após a reação com outra porção. O uso do termo “detectavelmente marcado” visa abranger tal marcação.

[0225]Qualquer marcador detectável adequado, como é conhecido na técnica, pode ser usado. Por exemplo, o marcador detectável pode ser um marcador radioativo

(tal como 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho e 153Sm), um marcador enzimático (tal como peroxidase de rábano silvestre, peroxidase alcalina, glicose 6-fosfato desidrogenase e similares), um marcador quimioluminescente (tal como ésteres de acridínio, tioésteres ou sulfonamidas; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridínio e similares), um marcador fluorescente (tal como fluoresceína (por exemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluoresceína, 3’6- carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6- tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, e similares)), rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, pontos quantum (por exemplo, seleneto de cádmio com cap de sulfeto de zinco), um marcador termométrico, ou um marcador de reação em cadeia da imuno-polimerase. Uma introdução aos marcadores, procedimentos de marcação e detecção de marcadores é encontrada em Polak e Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2ª ed., Springer Verlag, NY (1997), e em Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), que é um manual e um catálogo combinados publicados por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Um marcador fluorescente pode ser utilizado em FPIA (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.593.896, 5.573.904, 5.496.925, 5.359.093 e 5.352.803, que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade). Um composto de acridinio pode ser usado como um marcador detectável em um ensaio quimioluminescente homogêneo (ver, por exemplo, Adamczyk e outros, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324 a 1328 (2006); Adamczyk e outros, Bioorg. Med Chem. Lett. 4: 2313 a 2317 (2004); Adamczyk e outros, Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917 a 3921 (2004); e Adamczyk e outros, Org. Lett. 5: 3779 a 3782 (2003)).

[0226]Em um aspecto, o composto de acridínio é uma acridínio 9- carboxamida. Os métodos para a preparação de acridínio 9-carboxamidas são descritos por Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107 a 114 (1991); Adamczyk e outros, J. Org. Chem. 63: 5636 a 5639 (1998); Adamczyk e outros, Tetrahedron 55:

10899 a 10914 (1999); Adamczyk e outros, Org. Lett. 1: 779 a 781 (1999); Adamczyk e outros, Bioconjugate Chem. 11: 714 a 724 (2000); Mattingly e outros, In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, pág. 77 a 105 (2002); Adamczyk e outros, Org. Lett. 5: 3779 a 3782 (2003); e Patentes U.S. Nos. 5.468.646, 5.543.524 e 5.783.699 (cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade para seus ensinamentos a respeito).

[0227]Outro exemplo de um composto de acridínio é um acridínio-9- carboxilato aril éster. Um exemplo de acridínio-9-carboxilato aril éster de fórmula II é o fluorossulfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil) acridínio (disponível a partir de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Os métodos para a preparação de acridínio 9- carboxilato aril éster são descritos por McCapra e outros, Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi e outros, Luminescence 15: 245 a 249 (2000); Razavi e outros, Luminescence 15: 239 a 244 (2000); e Patente U.S. No. 5.241.070 (cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade para seus ensinamentos a respeito). Tais acridínio 9-carboxilato aril ésteres são indicadores quimioluminescentes eficientes para o peróxido de hidrogênio produzido na oxidação de um analito por pelo menos uma oxidase em termos da intensidade do sinal e / ou da rapidez do sinal. O curso da emissão quimioluminescente para o acridínio 9- carboxilato aril éster é concluído rapidamente, isto é, em menos de 1 segundo, enquanto a emissão quimioluminescente de acridínio 9-carboxamida se estende por mais de 2 segundos. O acridínio-9-carboxilato aril éster, no entanto, perde suas propriedades quimioluminescentes na presença de proteína. Portanto, seu uso requer a ausência de proteína durante a geração e detecção do sinal. Os métodos para separar ou remover proteínas na amostra são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem, entre outros, ultrafiltração, extração, precipitação, diálise, cromatografia e / ou digestão (ver, por exemplo, Wells, High Throughput Bioanalytical

Sample Preparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)). A quantidade de proteína removida ou separada da amostra de teste pode ser de cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95%. Mais detalhes sobre o acridínio 9-carboxilato aril éster e seu uso são apresentados no Pedido de Patente US. No. 11/697.835, depositado em 9 de abril de

2007. Os acridínio 9-carboxilato aril ésteres podem ser dissolvidos em qualquer solvente adequado, tal como N,N-dimetilformamida anidra desgaseificada (DMF) ou colato de sódio aquoso.

[0228]“Sequência de ligação” ou “sequência peptídica de ligação” refere-se a uma sequência polipeptídica natural ou artificial que está conectada a uma ou mais sequências polipeptídica de interesse (por exemplo, fragmentos de comprimento total, etc.). O termo “conectado” refere-se à junção da sequência de ligação à sequência polipeptídica de interesse. Tais sequências polipeptídicas são preferencialmente unidas por uma ou mais ligações peptídicas. As sequências de ligação podem ter um comprimento de cerca de 4 a cerca de 50 aminoácidos. De preferência, o comprimento da sequência de ligação é de cerca de 6 a cerca de 30 aminoácidos. As sequências de ligação naturais podem ser modificadas por substituições, adições ou deleções de aminoácidos para criar sequências de ligação artificiais. As sequências de ligação podem ser usadas para muitos propósitos, inclusive em Fabs recombinantes.

Sequências de ligação exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a: (i) etiquetas de histidina (His), tal como uma etiqueta 6X His, que tem uma sequência de aminoácidos de HHHHHH (SEQ ID NO: 3), são úteis como sequências de ligação para facilitar o isolamento e a purificação de polipeptídeos e anticorpos de interesse; (ii) sítios de clivagem de enteroquinase, como etiquetas His, são usados no isolamento e na purificação de proteínas e anticorpos de interesse. Frequentemente, os sítios de clivagem de enteroquinase são utilizados juntamente com as etiquetas His no isolamento e na purificação de proteínas e anticorpos de interesse. Vários sítios de clivagem de enteroquinase são conhecidos na técnica. Exemplos de sítios de clivagem de enteroquinase incluem, entre outros, a sequência de aminoácidos de DDDDK (SEQ ID NO: 4) e seus derivativos (por exemplo, ADDDDK (SEQ ID NO: 5), etc.); (iii) Sequências diversas podem ser usadas para ligar ou conectar as regiões variáveis de cadeia leve e / ou pesada de fragmentos de região variável de cadeia única. Exemplos de outras sequências de ligação podem ser encontrados em Bird e outros, Science 242: 423 a 426 (1988); Huston e outros, PNAS USA 85: 5879 a 5883 (1988); e McCafferty e outros, Nature 348: 552 a 554 (1990). As sequências de ligação também podem ser modificadas para funções adicionais, tal como fixação de fármacos ou fixação em suportes sólidos. No contexto da presente descrição, o anticorpo monoclonal, por exemplo, pode conter uma sequência de ligação, tal como uma etiqueta His, um sítio de clivagem de enteroquínase, ou ambos.

[0229]“Anticorpo monoclonal”, como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único antígeno. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anticorpos “quiméricos” nos quais uma porção da cadeia pesada e / ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivativos de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivativos de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam o biológico desejado.

[0230]“Imagiologia de ressonância magnética” ou “RM”, conforme usado aqui de forma intercambiável, refere-se a uma técnica de imagiologia médica usada em radiologia para formar imagens da anatomia e dos processos fisiológicos do corpo em saúde e doença (por exemplo, aqui mencionados de forma intercambiável como “uma RM”, “um procedimento de RM” ou “uma varredura de RM”). A RM é uma forma de imagiologia médica que mede a resposta dos núcleos atômicos dos tecidos do corpo às ondas de rádio de alta frequência quando colocadas em um forte campo magnético, e que produz imagens dos órgãos internos. Os digitalizadores de RM, baseados na ciência da ressonância magnética nuclear (RMN), usam fortes campos magnéticos, ondas de rádio e gradientes de campo para gerar imagens do interior do corpo.

[0231]“Proteína de ligação multivalente” é usada aqui para se referir a uma proteína de ligação compreendendo dois ou mais sítios de ligação ao antígeno (também aqui chamados de “domínios de ligação ao antígeno”). Uma proteína de ligação multivalente é preferencialmente manipulada para ter três ou mais sítios de ligação ao antígeno e geralmente não é um anticorpo que ocorre naturalmente. O termo “proteína de ligação multiespecífica” refere-se a uma proteína de ligação que pode ligar dois ou mais alvos relacionados ou não relacionados, incluindo uma proteína de ligação capaz de ligar dois ou mais epítopos diferentes da mesma molécula alvo.

[0232]“Valor preditivo negativo” ou “NPV”, conforme usado aqui de forma intercambiável, refere-se à probabilidade de um indivíduo ter um resultado negativo (ou seja, o resultado proposto está ausente), uma vez que eles têm um resultado de teste negativo (ou seja, o indivíduo que testou negativo para o resultado proposto não tem o resultado proposto).

[0233]“Dispositivo de ponto de atendimento” refere-se a um dispositivo usado para fornecer teste de diagnóstico médico no ponto de atendimento ou próximo a ele (ou seja, fora de um laboratório), no momento e local do atendimento ao paciente (tal como em um hospital, consultório médico, centro de atendimento médico urgente ou outro, casa do paciente, lar de idosos e / ou centro de cuidados prolongados e / ou hospício). Exemplos de dispositivos de ponto de atendimento incluem os produzidos por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) (por exemplo, i-STAT e i-STAT Alinity, Universal Biosensors (Rowville, Austrália) (ver US 2006/0134713), Axis-Shield PoC AS (Oslo, Noruega) e Clinical Lab Products (Los Angeles, USA).

[0234]“Valor preditivo positivo” ou “PPV”, conforme usado aqui de forma intercambiável, refere-se à probabilidade de um indivíduo ter um resultado positivo (ou seja, o resultado proposto está presente), uma vez que eles têm um resultado de teste positivo (ou seja, o indivíduo que testou positivo para o resultado proposto tem o resultado proposto).

[0235]“Reagentes de controle de qualidade”, no contexto de imunoensaios e kits aqui descritos, incluem, mas não estão limitados a, calibradores, controles e painéis de sensibilidade. Um “calibrador” ou “padrão” normalmente é usado (por exemplo, um ou mais, tal como uma pluralidade) de modo a estabelecer curvas de calibração (padrão) para interpolação da concentração de um analito, tal como um anticorpo ou um analito. Alternativamente, um único calibrador, que está próximo de um nível de referência ou nível de controle (por exemplo, níveis “baixo”, “médio” ou “alto”), pode ser usado. Vários calibradores (ou seja, mais de um calibrador ou uma quantidade variável de calibradores) podem ser usados em conjunto para compreender um “painel de sensibilidade”.

[0236]Uma curva “característica de operação do receptor” ou curva “ROC” refere-se a um gráfico que ilustra o desempenho de um sistema classificador binário, pois seu ponto de corte de discriminação varia. Por exemplo, uma curva ROC pode ser um gráfico da taxa de verdadeiro positivo contra a taxa de falso positivo para os diferentes pontos de corte possíveis de um teste de diagnóstico. Ele é criado plotando a fração de verdadeiros positivos dos positivos (TPR = taxa de verdadeiro positivo) versus a fração de falsos positivos dos negativos (FPR = taxa de falso positivo), em várias configurações de limite. O TPR também é conhecido como sensibilidade, e o FPR é um menos a especificidade ou a taxa de verdadeiro negativo. A curva ROC demonstra a compensação entre a sensibilidade e a especificidade (qualquer aumento na sensibilidade será acompanhado por uma diminuição na especificidade); quanto mais próxima a curva segue a borda esquerda e depois a borda superior do espaço ROC, mais preciso é o teste; quanto mais próxima a curva estiver da diagonal de 45 graus do espaço ROC, menos preciso é o teste; a inclinação da linha tangente no ponto de corte fornece a razão de probabilidade (LR) para esse valor do teste; e a área sob a curva é uma medida da precisão do teste.

[0237]“Anticorpo recombinante” e “anticorpos recombinantes” referem-se a anticorpos preparados por uma ou mais etapas, incluindo clonagem de sequências de ácido nucleico codificando todos ou parte de um ou mais anticorpos monoclonais em um vetor de expressão apropriado por técnicas recombinantes e subsequentemente expressando a anticorpo em uma célula hospedeira apropriada. Os termos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos monoclonais produzidos de forma recombinante, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados (total ou parcialmente humanizados), estruturas multiespecíficas ou multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticorpos, anticorpos bifuncionais, heteroconjugados Abs, DVD-Ig®s e outros anticorpos, conforme descrito em (i) neste documento. (As imunoglobulinas de domínio duplo variável e métodos para produzi-las são descritos por Wu, C., e outros, Nature Biotechnology, 25: 1290 a 1297 (2007)). O termo “anticorpo bifuncional”, como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo que compreende um primeiro braço tendo uma especificidade para um sítio antigênico e um segundo braço tendo uma especificidade para um sítio antigênico diferente, isto é, os anticorpos bifuncionais têm uma especificidade dupla.

[0238]“Nível de referência”, conforme usado neste documento, refere-se a um valor (ou nível) de corte de ensaio usado para avaliar a eficácia de diagnóstico, prognóstico ou terapêutica e que foi vinculado ou associado aqui a vários parâmetros clínicos (por exemplo, presença de doença, estágio da doença, gravidade da doença, progressão, não progressão ou melhora da doença, etc.). Como aqui utilizado, o termo “ponto de corte” refere-se a um limite (por exemplo, um número) acima do qual existe um resultado clínico certo ou específico e abaixo do qual existe um resultado clínico certo ou específico diferente.

[0239]Esta descrição fornece níveis de referência exemplificativos. No entanto, é sabido que os níveis de referência podem variar dependendo da natureza do imunoensaio (por exemplo, anticorpos empregados, condições de reação, pureza da amostra, etc.) e que os ensaios podem ser comparados e padronizados. Além disso, está dentro do conhecimento comum de um versado na técnica adaptar a descrição aqui para outros imunoensaios para obter níveis de referência específicos para imunoensaio para aqueles outros imunoensaios com base na descrição fornecida por esta descrição. Enquanto o valor preciso do nível de referência pode variar entre os ensaios, as conclusões aqui descritas devem ser geralmente aplicáveis e capazes de serem extrapoladas para outros ensaios.

[0240]“Avaliação de risco”, “classificação de risco”, “identificação de risco” ou “estratificação de risco” de indivíduos (por exemplo, pacientes), conforme usado neste documento, refere-se à avaliação de fatores, incluindo biomarcadores, para prever o risco de ocorrência de futuro eventos, incluindo início ou progressão da doença, de modo que as decisões de tratamento com relação ao indivíduo possam ser tomadas de maneira mais informada.

[0241]“Amostra”, “amostra de teste”, “espécime”, “amostra de um indivíduo” e “amostra de paciente”, conforme usado neste documento, podem ser usadas de forma intercambiável e pode ser uma amostra de sangue, tal como sangue integral, tecido, urina, soro, plasma, líquido amniótico, líquido cefalorraquidiano, células ou tecido placentário, células endoteliais, leucócitos ou monócitos. A amostra pode ser usada diretamente como obtida a partir de um paciente ou pode ser pré-tratada, tal como por filtração, destilação, extração, concentração, centrifugação, inativação de componentes interferentes, adição de reagentes e similares, para modificar o caráter da amostra de alguma maneira, como discutido aqui ou de outra forma, como é conhecido na técnica.

[0242]Uma variedade de tipos de células, tecidos ou fluidos corporais pode ser utilizada para obter uma amostra. Esses tipos de células, tecidos e fluidos podem incluir seções de tecidos, tal como amostras de biópsia e autópsia, seções congeladas tomadas para fins histológicos, sangue (tal como sangue integral), plasma, soro, glóbulos vermelhos, plaquetas, líquido intersticial, fluido da espinha cerebral, etc. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de soro. Em ainda outras modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Os tipos e tecidos de células também podem incluir fluido linfático, líquido cefalorraquidiano, um fluido coletado por um tipo de tecido ou célula pode ser fornecido removendo uma amostra de células de um animal humano e não humano, mas também pode ser realizado usando-se células previamente isoladas (por exemplo, isoladas por outra pessoa, em outro momento e / ou para outra finalidade). Também podem ser utilizados tecidos de arquivo, tal como aqueles com histórico de tratamento ou resultado. O isolamento e / ou a purificação de proteínas ou nucleotídeos pode não ser necessário.

[0243]“Sensibilidade” de um ensaio, conforme usado aqui, refere-se à proporção de indivíduos para os quais o resultado é positivo e que são corretamente identificados como positivos (por exemplo, identificar corretamente os indivíduos com uma doença ou condição médica para a qual estão sendo testados). Por exemplo,

isso pode incluir identificar corretamente indivíduos com LCT daqueles que não têm LCT, identificar corretamente indivíduos com LCT moderada, grave ou moderada a grave daqueles com LCT leve, identificar corretamente indivíduos com LCT leve daqueles com LCT moderada, grave ou moderada a grave, identificar corretamente os indivíduos como tendo uma LCT moderada, grave ou moderada a grave daqueles sem LCT ou identificando corretamente indivíduos como tendo uma LCT leve daqueles sem LCT, identificar corretamente os indivíduos com probabilidade de se beneficiar de uma TC da cabeça ou RM daqueles que provavelmente não se beneficiam de uma TC da cabeça ou RM, etc.).

[0244]“Especificidade” de um ensaio, conforme aqui utilizado, refere-se à proporção de indivíduos para os quais o resultado é negativo e que são corretamente identificados como negativos (por exemplo, identificar corretamente aqueles que não têm uma doença ou condição médica para a qual estão sendo testados). Por exemplo, isso pode incluir identificar corretamente indivíduos com uma LCT daqueles que não têm uma LCT, identificar corretamente indivíduos sem LCT moderada, grave ou moderada a grave daqueles com uma LCT leve, identificar corretamente indivíduos como não tendo uma LCT leve daqueles com LCT moderada, grave ou moderada a grave, ou identificar corretamente indivíduos como não tendo nenhuma LCT, ou identificar corretamente indivíduos como tendo uma LCT leve daqueles sem LCT etc.).

[0245]“Série de composições de calibração” refere-se a uma pluralidade de composições compreendendo uma concentração conhecida dos analitos, tal como GFAP e UCH-L1, em que cada uma das composições difere das outras composições na série pela concentração dos analitos, tal como GFAP e UCH-L1.

[0246]Como usado aqui, o termo “detecção de molécula única” refere-se à detecção e / ou medição de uma molécula única de um analito em uma amostra de teste em níveis muito baixos de concentração (tal como níveis de pg / mL ou femtograma / mL). Vários diferentes analisadores ou dispositivos de molécula única são conhecidos na técnica e incluem dispositivos de nanoporos e nanopoços.

Exemplos de dispositivos de nanoporos são descritos na Publicação de Patente Internacional No. WO 2016/161402, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Exemplos de dispositivo de nanopoços são descritos na Publicação de Patente Internacional No. WO 2016/161400, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0247] “Fase sólida” ou “suporte sólido”, conforme usados aqui de forma intercambiável, refere-se a qualquer material que possa ser usado para anexar e / ou atrair e imobilizar (1) um ou mais agentes de captura ou parceiros de ligação específica de captura, ou (2) um ou mais agentes de detecção ou parceiros de ligação específica de detecção. A fase sólida pode ser escolhida por sua capacidade intrínseca de atrair e imobilizar um agente de captura. Alternativamente, a fase sólida pode ter fixado a ela um agente de ligação que tem a capacidade de atrair e imobilizar (1) o agente de captura ou o parceiro de ligação específica de captura, ou (2) o agente de detecção ou o parceiro de ligação específica de detecção. Por exemplo, o agente de ligação pode incluir uma substância que é carregada opostamente em relação ao agente de captura (por exemplo, parceiro de ligação específica de captura) ou próprio agente de detecção (por exemplo, parceiro de ligação específica de detecção) ou a uma substância carregada conjugada com (1) o agente de captura ou parceiro de ligação específica de captura ou (2) agente de detecção ou parceiro de ligação específica de detecção. Em geral, o agente de ligação pode ser qualquer parceiro de ligação (preferencialmente específica) que é imobilizado (acoplado) à fase sólida e que tem a capacidade de imobilizar (1) o agente de captura ou o parceiro de ligação específica de captura ou (2) o agente de detecção ou parceiro de ligação específica de detecção através de uma reação de ligação. O agente de ligação permite a ligação indireta do agente de captura a um material de fase sólida antes da realização do ensaio ou durante a realização do ensaio. Por exemplo, a fase sólida pode ser plástica,

plástica derivatizada, metal magnético ou não magnético, vidro ou silício, incluindo, por exemplo, um tubo de ensaio, poço de microtitulação, folha, microesfera, micropartícula, chip e outras configurações conhecidas por aqueles versados na técnica.

[0248]“Ligação específica” ou “especificamente ligando”, conforme usado neste documento, pode se referir à interação de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo com uma segunda espécie química, em que a interação depende da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo) nas espécies químicas; por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura de proteína específica e não às proteínas em geral. Se um anticorpo for específico para o epítopo “A”, a presença de uma molécula contendo o epítopo A (ou A não marcado e livre), em uma reação contendo “A” marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo.

[0249]“Parceiro de ligação específica” é um membro de um par de ligação específica. Um par de ligação específica compreende duas moléculas diferentes, que se ligam especificamente através de meios químicos ou físicos. Portanto, além dos pares de ligação específica a antígenos e anticorpos de imunoensaios comuns, outros pares de ligação específica podem incluir biotina e avidina (ou estreptavidina), carboidratos e lectinas, sequências nucleotídicas complementares, moléculas efetoras e receptoras, cofatores e enzimas, enzimas e inibidores de enzimas, e similares. Além disso, pares de ligação específica podem incluir membros que são análogos dos membros de ligação específica originais, por exemplo, um analito- análogo. Os membros de ligação específica imunorreativos incluem antígenos, fragmentos de antígeno, e anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais, bem como complexos e fragmentos dos mesmos, isolados ou produzidos de forma recombinante.

[0250]“Estatisticamente significativo”, conforme usado aqui, refere-se à probabilidade de que uma relação entre duas ou mais variáveis seja causada por algo diferente do acaso. O teste de hipótese estatística é usado para determinar se o resultado de um conjunto de dados é estatisticamente significativo. No teste de hipótese estatística, um resultado estatístico significativo é obtido sempre que o valor p observado de uma estatística de teste for menor do que o nível de significância definido no estudo. O valor p é a probabilidade de obter resultados pelo menos tão extremos quanto os observados, uma vez que a hipótese nula é verdadeira. Exemplos de análise de hipótese estatística incluem o teste de postos sinalizados de Wilcoxon, teste t, qui-quadrado ou teste exato de Fisher. “Significativo”, conforme usado neste documento, refere-se a uma alteração que não foi estatisticamente significativa (por exemplo, pode não ter sido submetida ao teste de hipótese estatística).

[0251]“Indivíduo” e “paciente”, conforme aqui utilizados de forma intercambiável, referem-se a qualquer vertebrado, incluindo, entre outros, um mamífero (por exemplo, vaca, porco, camelo, lhama, cavalo, cabra, coelho, ovelha, hamsters, porquinho da Índia, gato, cachorro, rato e camundongo, um primata não humano (por exemplo, um macaco, tal como um macaco cinomolgo ou rhesus, chimpanzé, etc.) e um humano). Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser humano ou não humano). Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. O indivíduo ou paciente pode estar passando por outras formas de tratamento. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano que pode estar passando por outras formas de tratamento. O indivíduo ou paciente pode estar passando por outras formas de tratamento. Em algumas modalidades, quando o indivíduo é um humano, o indivíduo não inclui nenhum ser humano que sofreu um acidente vascular cerebral (por exemplo, um derrame). Em algumas modalidades, suspeita-se que o indivíduo tenha sofrido uma lesão na cabeça. Em algumas modalidades, sabe-se que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça. Em algumas modalidades, suspeita-se que o indivíduo esteja sofrendo de LCT leve, moderada, grave ou moderada a grave. Em algumas modalidades, suspeita-se que o indivíduo esteja sofrendo de LCT leve. Em algumas modalidades, suspeita-se que o indivíduo esteja sofrendo de LCT moderada.

Em algumas modalidades, suspeita-se que o indivíduo esteja sofrendo de LCT leve.

Em algumas modalidades, suspeita-se que o indivíduo esteja sofrendo de LCT moderada. Em algumas modalidades, suspeita-se que o indivíduo esteja sofrendo de LCT grave.

[0252]“Tratar”, “tratando” ou “tratamento” são usados de forma intercambiável neste documento para descrever a reversão, o alívio ou a inibição do progresso de uma doença e / ou lesão, ou um ou mais sintomas dessa doença, para os quais esse termo se aplica. Dependendo da condição do indivíduo, o termo também se refere à prevenção de uma doença e inclui a prevenção do aparecimento de uma doença ou a prevenção dos sintomas associados a uma doença. Um tratamento pode ser realizado de maneira aguda ou crônica. O termo também se refere à redução da gravidade de uma doença ou sintomas associados a essa doença antes da aflição com a doença. Tal prevenção ou redução da gravidade de uma doença antes da aflição refere-se à administração de uma composição farmacêutica a um indivíduo que não está, no momento da administração, afligido com a doença. “Prevenir” também se refere à prevenção da recorrência de uma doença ou de um ou mais sintomas associados a essa doença. “Tratamento” e “terapeuticamente” referem-se ao ato de tratar, como “tratar” é definido acima.

[0253]“Lesão cerebral traumática” ou “LCT”, conforme usado aqui de forma intercambiável, refere-se a uma lesão complexa com um amplo espectro de sintomas e incapacidades. A LCT costuma ser um evento agudo semelhante a outras lesões. A LCT pode ser classificada como “leve”, “moderada” ou “grave”. As causas da LCT são diversas e incluem, por exemplo, tremores físicos por uma pessoa, um acidente de carro, lesões de armas de fogo, acidentes vasculares cerebrais (por exemplo, derrames), quedas, explosões e outros tipos de traumatismo por força contundente.

Outras causas de LCT incluem a ingestão e / ou exposição a um ou mais produtos químicos ou toxinas (tal como fogo, fungos, amianto, pesticidas e inseticidas, solventes orgânicos, tintas, colas, gases (tal como monóxido de carbono, sulfeto de hidrogênio e cianeto), metais orgânicos (tal como metil mercúrio, chumbo tetraetílico e estanho orgânico), uma ou mais drogas de abuso ou combinações dos mesmos.

Alternativamente, a LCT pode ocorrer em indivíduos que sofrem de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um ou mais vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos. Adultos jovens e idosos são as faixas etárias de maior risco para LCT. Em certas modalidades deste documento, lesão cerebral traumática ou LCT não inclui e exclui especificamente acidentes vasculares cerebrais, tal como derrames.

[0254]“LCT leve”, conforme usado aqui, refere-se a uma lesão cerebral em que a perda de consciência é breve e geralmente em alguns segundos ou minutos e / ou a confusão e desorientação é menor do que 1 hora. A LCT leve também é chamada de concussão, traumatismo craniano leve, LCT menor, lesão cerebral menor, e lesão na cabeça menor. Embora RM e TC possam ser normais, o indivíduo com LCT leve pode ter problemas cognitivos, tal como dor de cabeça, dificuldade para pensar, problemas de memória, déficits de atenção, alterações de humor, e frustração.

[0255]A LCT leve é a LCT mais prevalente e geralmente é esquecida no momento da lesão inicial. Normalmente, um indivíduo tem um número de escala de coma de Glasgow entre 13 e 15 (tal como 13 a 15 ou 14 a 15). Quinze por cento (15%) das pessoas com LCT leve apresentam sintomas que duram 3 meses ou mais. LCT leve é definida como o resultado do movimento vigoroso da cabeça ou do impacto, causando uma breve alteração no estado mental (confusão, desorientação ou perda de memória) ou perda de consciência por menos de 30 minutos. Os sintomas comuns de LCT leve incluem fadiga, dores de cabeça, distúrbios visuais, perda de memória, pouca atenção / concentração, distúrbios do sono, tontura / perda de equilíbrio,

distúrbios de irritabilidade – distúrbios emocionais, sentimentos de depressão e convulsões. Outros sintomas associados à LCT leve incluem náusea, perda de olfato, sensibilidade à luz e sons, alterações de humor, perda ou confusão e / ou lentidão no pensamento.

[0256]“LCT moderada”, conforme usado aqui, refere-se a uma lesão cerebral em que a perda de consciência e / ou confusão e desorientação ocorre entre 1 e 24 horas e o indivíduo tem um número na escala de coma de Glasgow entre 9 e 13 (tal como 9 a 12 ou 9 a 13). O indivíduo com LCT moderada apresenta resultados anormais de imagiologia do cérebro. “LCT grave”, conforme usado aqui, refere-se a uma lesão cerebral em que a perda de consciência é superior a 24 horas e a perda de memória após a lesão ou lesão penetrante no crânio é superior a 24 horas e o indivíduo tem um número na escala de coma de Glasgow entre 3 e 8. Os déficits variam de comprometimento das funções cognitivas de nível superior a estados em coma. Os sobreviventes podem ter função limitada dos braços ou pernas, fala ou linguagem anormal, perda da capacidade de pensar ou problemas emocionais. Os indivíduos com lesões graves podem ser deixados em estados que não respondem a longo prazo. Para muitas pessoas com LCT grave, a reabilitação a longo prazo é frequentemente necessária para maximizar a função e a independência.

[0257]LCT “moderada a grave”, conforme usado aqui, refere-se a um espectro de lesão cerebral que inclui moderada a grave e, portanto, abrange LCT moderado sozinho, LCT grave sozinho e LCT moderado a grave combinados. Os indivíduos que sofrem de uma LCT moderada a grave podem ter um número na escala de coma de Glasgow entre 3 e 13 (tal como 3 a 12 ou 3 a 13). Por exemplo, em algumas situações clínicas, um indivíduo pode inicialmente ser diagnosticado como tendo uma LCT moderada, mas que, ao longo do tempo (minutos, horas ou dias), progride para ter uma LCT grave (tal como, por exemplo, em situações quando houver um hemorragia cerebral). Tais indivíduos seriam exemplos de pacientes que poderiam ser classificados como “moderados a graves”. Sintomas comuns de LCT moderada a grave incluem déficits cognitivos, incluindo dificuldades com atenção, concentração, distração, memória, velocidade de processamento, confusão, perseverança, impulsividade, processamento de linguagem e / ou “funções executivas”, sem entender a palavra falada (afasia receptiva), dificuldade em falar e ser compreendido (afasia expressiva), fala arrastada, falar muito rápido ou muito devagar, problemas na leitura, problemas na escrita, dificuldades na interpretação do toque, temperatura, movimento, posição dos membros e discriminação fina, integração ou padronização de impressões sensoriais em dados psicologicamente significativos, perda parcial ou total da visão, fraqueza dos músculos dos olhos e visão dupla (diplopia), visão turva, problemas de julgamento de distância, movimentos involuntários dos olhos (nistagmo), intolerância à luz (fotofobia), audição, tal como diminuição ou perda de audição, zumbido nos ouvidos (sibilo), aumento da sensibilidade a sons, perda ou diminuição de sensação de olfato (anosmia), perda ou diminuição do paladar, convulsões associadas à epilepsia que podem ser de vários tipos e podem envolver perturbações na consciência, percepção sensorial ou movimentos motores, controle do intestino e bexiga, distúrbios do sono, perda de resistência, alterações de apetite, regulação da temperatura corporal, dificuldades de menstruar, comportamentos dependentes, capacidade emocional, falta de motivação, irritabilidade, agressão, depressão, desinibição, ou negação / falta de consciência.

[0258]“Hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1” ou “UCH-L1”, conforme aqui utilizado de forma intercambiável, refere-se a uma enzima desubiquitinante codificada pelo gene UCH-L1 em humanos. UCH-L1, também conhecida como esterase carboxil-terminal de ubiquitina L1 e Ubiquitina tiolesterase, é um membro de uma família de genes cujos produtos hidrolisam pequenos aductos C-terminais de ubiquitina para gerar o monômero de ubiquitina.

[0259]“Estado de UCH-L1” pode significar o nível ou a quantidade de UCH-L1 em um determinado momento (tal como com uma única medida de UCH-L1), o nível ou a quantidade de UCH-L1 associada ao monitoramento (tal como em um teste de repetição em um indivíduo para identificar um aumento ou diminuição da quantidade de UCH-L1), o nível ou a quantidade de UCH-L1 associado ao tratamento de lesão cerebral traumática (seja uma lesão cerebral primária e / ou uma lesão cerebral secundária) ou combinações dos mesmos.

[0260]“Variante” é usada aqui para descrever um peptídeo ou polipeptídeo que difere na sequência de aminoácidos pela inserção, deleção ou substituição conservativa de aminoácidos, mas retém pelo menos uma atividade biológica.

Exemplos representativos de “atividade biológica” incluem a capacidade de se ligar a um anticorpo específico ou promover uma resposta imune. A variante também é usada aqui para descrever uma proteína com uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácidos que retém pelo menos uma atividade biológica. Uma substituição conservativa de um aminoácido, isto é, substituindo um aminoácido por um aminoácido diferente de propriedades similares (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição de regiões carregadas) é reconhecida na técnica como tipicamente envolvendo uma alteração menor. Estas alterações menores podem ser identificadas, em parte, considerando o índice hidropático de aminoácidos, como entendido na técnica. Kyte e outros, J. Mol. Biol. 157: 105 a 132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado na consideração de sua hidrofobicidade e carga. É sabido que aminoácidos de índices hidropáticos similares podem ser substituídos e ainda retêm a função de proteína. Em um aspecto, os aminoácidos com índices hidropáticos de ± 2 são substituídos. A hidrofilicidade dos aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas retendo a função biológica. Uma consideração da hidrofilicidade dos aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidrofilicidade média local desse peptídeo, uma medida útil que foi relatada como correlacionando bem com a antigenicidade e imunogenicidade. A Patente U.S. No. 4.554.101, incorporada aqui integralmente por referência. A substituição de aminoácidos com valores de hidrofilicidade similares pode resultar em peptídeos retendo a atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, como é entendido na técnica. As substituições podem ser realizadas com aminoácidos com valores de hidrofilicidade dentro de ± 2 um do outro. Tanto o índice de hidrofobicidade quanto o valor de hidrofilicidade dos aminoácidos é influenciado pela cadeia lateral particular desse aminoácido. Consistente com essa observação, entende-se que as substituições de aminoácidos compatíveis com a função biológica dependem da similaridade relativa dos aminoácidos, e particularmente das cadeias laterais desses aminoácidos, conforme revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades. “Variante” também pode ser usada para se referir a um fragmento antigenicamente reativo de um anticorpo anti-analito (tal como GFAP e / ou UCH-L1) que difere do fragmento correspondente do anticorpo anti-analito (como GFAP e / ou UCH- L1) na sequência de aminoácidos, mas ainda é reativo antigenicamente e pode competir com o fragmento correspondente de anticorpo anti- analito (tal como GFAP e / ou UCH-L1) pela ligação com o analito (tal como GFAP e / ou UCH-L1). “Variante” também pode ser usada para descrever um polipeptídeo ou um fragmento do mesmo que tenha sido processado diferencialmente, tal como por proteólise, fosforilação ou outra modificação pós-traducional, mas que ainda retém sua reatividade ao antígeno.

[0261]“Vetor” é usado aqui para descrever uma molécula de ácido nucleico que pode transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça circular de DNA de fita dupla no qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores podem replicar-se autonomamente em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são chamados aqui de “vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente “vetores de expressão”). Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos.

“Plasmídeo” e “vetor” podem ser usados de forma intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, outras formas de vetores de expressão, tal como vetores virais (por exemplo, retrovírus com defeito de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem a funções equivalentes, podem ser usadas. A este respeito, versões de RNA de vetores (incluindo vetores virais de RNA) também podem ser úteis no contexto da presente descrição.

[0262]A menos que de outra forma definido neste documento, os termos científicos e técnicos usados em conjunto com a presente descrição terão os significados que são comumente entendidos pelos versados na técnica. Por exemplo, quaisquer nomenclaturas usadas em conjunto com e técnicas de cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química e hibridação de proteínas e ácidos nucleicos aqui descritas são aquelas que são bem conhecidas e comumente usadas na técnica. O significado e o escopo dos termos devem estar claros; no caso, no entanto, de qualquer ambiguidade latente, as definições aqui fornecidas têm precedência sobre qualquer dicionário ou definição extrínseca. Além disso, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular.

2. Métodos de auxílio no diagnóstico de indivíduos que sofreram ou são suspeitos de terem sofrido uma lesão na cabeça usando uma combinação dos níveis de referência de GFAP e UCH-L1

[0263]A presente descrição se refere, entre outros métodos, a um método de auxílio no diagnóstico e avaliação de um indivíduo que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. Em particular, a presente descrição fornece métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliação de um indivíduo para determinar se o indivíduo sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT), tal como, por exemplo, lesão cerebral traumática moderada a grave, detectando ou medindo uma combinação dos níveis de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) e proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) em amostras coletadas em vários pontos no tempo no prazo de 48 horas após o indivíduo ter sofrido ou poder ter sofrido uma lesão na cabeça. Conforme descrito neste documento, o diagnóstico e a avaliação de um indivíduo com suspeita de LCT inclui uma determinação de se deve realizar um procedimento de imagiologia, juntamente com outras avaliações médicas (por exemplo, avaliações clínicas) com base nos níveis de GFAP e UCH-L1 no indivíduo, em comparação com vários níveis de referência. Esse diagnóstico e avaliação baseados em uma combinação dos níveis de GFAP e UCH-L1 podem auxiliar a determinar se é mais provável que o indivíduo tenha uma RM positiva e / ou TC da cabeça positiva (ou seja, a presença de uma lesão intracraniana).

[0264]Em algumas modalidades, o método pode auxiliar a determinar se um indivíduo que sofreu uma lesão na cabeça sofreu uma lesão cerebral traumática com base nos níveis de GFAP e UCH-L1 em comparação com os níveis de referência. De acordo com essas modalidades, o método pode compreender as etapas de realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após uma lesão na cabeça para medir ou detectar uma combinação de um nível de GFAP e um nível de UCH- L1 na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de

GFAP de cerca de 15 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 70 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo provavelmente sofreu uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 40 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 70 pg / mL a cerca de 150 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo provavelmente teve uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 40 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é superior a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 150 pg / mL.

[0265]Em algumas modalidades, o método pode incluir obter uma amostra no prazo de 48 horas após uma suspeita de lesão ao indivíduo e colocar em contato a amostra com um anticorpo para UCH-L1 e / ou GFAP para permitir a formação de um complexo do anticorpo e de UCH-L1 e / ou GFAP. O método também inclui detectar o complexo de anticorpo-GFAP / UCH-L1 resultante. De acordo com esses métodos, os níveis de GFAP e UCH-L1 podem ser medidos ou detectados e, em seguida, correlacionados com um ou mais parâmetros clínicos (por exemplo, escore GCS e / ou TC), antes ou depois da realização do método, de modo a estabelecer níveis de referência de GFAP e UCH-L1 que possam ser usados para determinar se o indivíduo tem uma LCT.

[0266]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 podem ser usados como parte de um ensaio com pelo menos cerca de 35% de especificidade e pelo menos cerca de 90% de sensibilidade, como descrito mais adiante. Além disso, em outras modalidades, o método quando usado como um ensaio tem uma sensibilidade pelo menos 3% maior e uma especificidade pelo menos 17% maior em comparação com um método ou ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente. Em outras modalidades, o método quando usado como um ensaio tem uma sensibilidade pelo menos 5% maior e uma especificidade pelo menos 20% maior em comparação com um método ou ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente. Em outras modalidades, o método quando usado como um ensaio tem uma sensibilidade pelo menos 8% maior e uma especificidade pelo menos 25% maior em comparação com um método ou ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[0267]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade entre pelo menos cerca de 70% a cerca de 100% e uma especificidade entre pelo menos cerca de 30% a cerca de 100%. Em algumas modalidades, a sensibilidade está entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 75% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 85% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 90% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 95% e cerca de 100% ou entre pelo menos cerca de 95% e pelo menos cerca de 99%. Em algumas modalidades, a sensibilidade é de pelo menos cerca de 70,0%, pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%,

pelo menos cerca de 85,0%, pelo menos cerca de 87,5%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 95,0%, em pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%, pelo menos cerca de 99,2%, pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de 99,4%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%, pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 100,0%.

[0268]Em algumas modalidades, a especificidade está entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 50%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 50%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de

60% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de

100%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

70% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de

80%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 80%

e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 90% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 90% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

90% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 95% e cerca de 99% ou entre pelo menos cerca de 95% e cerca de 100. Em algumas modalidades, a especificidade é de pelo menos cerca de 30,0%, pelo menos cerca de 31,0%, pelo menos cerca de

32,0%, em pelo menos cerca de 33,0%, pelo menos cerca de 34,0%, pelo menos cerca de 35,0%, pelo menos cerca de 36,0%, pelo menos cerca de 37,0%, pelo menos cerca de 38,0%, pelo menos cerca de 39,0%, pelo menos cerca de 40,0%, pelo menos cerca de 45,0%, pelo menos cerca de 50,0%, pelo menos cerca de 55,0%, pelo menos cerca de 60,0%, pelo menos cerca de 65,0%, pelo menos cerca de 70,0%, pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 85,0%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 91,0%, pelo menos cerca de 92,0%, pelo menos cerca de 93,0%, pelo menos cerca de 94,0%, pelo menos cerca de 95,0%, pelo menos cerca de 96,0%, pelo menos cerca de 97,0%, em pelo menos cerca de 98,0%, pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%,

pelo menos cerca de 99,2%, pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de 99,4%,

pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%,

pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de

100,0%. Por exemplo, em algumas modalidades, a sensibilidade é pelo menos cerca de 99% e a especificidade é pelo menos cerca de 75%, a sensibilidade é pelo menos cerca de 99% e a especificidade é pelo menos cerca de 99% ou a sensibilidade é pelo menos cerca de 100% e a especificidade é de pelo menos cerca de 100%. Em algumas modalidades, os níveis de referência GFAP e UCH-L1 podem ser usados como parte de um ensaio tendo pelo menos cerca de 35% de especificidade e pelo menos cerca de 90% de sensibilidade.

[0269]Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 48 horas após lesão ou suspeita de lesão na cabeça, tal como dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 24 horas e dentro de cerca de 0 a cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas, e dentro de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Em outras modalidades, a amostra pode ser coletada a partir do indivíduo humano em cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas da lesão ou suspeita de lesão na cabeça. Em algumas modalidades, o início da presença da combinação de GFAP e UCH-L1 aparece dentro de cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas após a lesão na cabeça. Em um aspecto, a amostra é coletada a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão. Em outro aspecto, a amostra é coletada a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 a cerca de 8 horas após a lesão. Em ainda outro aspecto, a amostra é coletada a partir do indivíduo dentro de 8 a 12 horas após a lesão. Em ainda outro aspecto, a amostra é coletada a partir do indivíduo dentro de 12 a 16 horas após a lesão.

[0270]Em algumas modalidades, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão (ou pós lesão) e o nível de referência de GFAP é de cerca de 40 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 100 pg / mL e o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 94%.

[0271]Em algumas modalidades, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão (ou pós lesão) e o nível de referência do GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL e o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 82%.

[0272]Em algumas modalidades, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão (ou pós lesão) e o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL e o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 65%.

[0273]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 15 pg / mL e cerca de 40 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 70 pg / mL e cerca de 150 pg / mL.

Em outras modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 20 pg / mL e cerca de 40 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 80 pg / mL e cerca de 150 pg / mL. Em outras modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 25 pg / mL e cerca de 40 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 90 pg / mL e cerca de 150 pg / mL. Em outras modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 30 pg / mL e cerca de 40 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 100 pg / mL e cerca de 150 pg / mL. Em outras modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 15 pg / mL e cerca de 30 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 70 pg / mL e cerca de 140 pg / mL. Em outras modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre pelo menos cerca de 15 pg / mL e cerca de 25 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 70 pg / mL e cerca de 130 pg / mL. Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP é de cerca de 40 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 100 pg / mL. Em outras modalidades, o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL. Ainda em outras modalidades, o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL.

[0274]Em algumas modalidades, o indivíduo recebeu um procedimento de imagiologia, tal como RM ou TC ou, em alguns casos, ambos, antes ou depois da realização do ensaio. Em algumas modalidades, suspeita-se que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base no procedimento de imagiologia. Em algumas modalidades, os níveis de referência de UCH-L1 e GFAP estão correlacionados com uma RM positiva e / ou TC da cabeça positiva (isto é, a presença de uma lesão intracraniana). Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 podem ser usados para indicar se um indivíduo precisa de um procedimento de RM, independente da realização de uma TC, e independente de uma TC que seja negativa (ou seja, indica que não sofreu uma LCT).

[0275]Geralmente, um nível de referência de um biomarcador, tal como UCH- L1 ou GFAP, e uma combinação dos mesmos, pode ser empregue como uma referência para avaliar os resultados obtidos após a análise de uma amostra de teste para GFAP e UCH-L1. Ao fazer essa comparação, por exemplo, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 podem ser obtidos correndo um ensaio específico um número suficiente de vezes e sob condições apropriadas, de modo que uma ligação ou associação da presença, quantidade ou concentração de analito com um determinado estágio ou desfecho da LCT ou com indícios específicos possa ser feita.

Normalmente, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 são obtidos através da realização de ensaios em amostras de indivíduos de referência (ou populações de indivíduos). O GFAP e o UCH-L1 medidos podem incluir seus fragmentos, produtos de degradação e / ou produtos de clivagem enzimática.

[0276]Em outras modalidades, o método pode auxiliar a diagnosticar o tipo de LCT (tal como, por exemplo, uma LCT moderada a grave) que um indivíduo pode ter sofrido com base nos níveis de GFAP e UCH-L1 em comparação com os níveis de referência. De acordo com essas modalidades, o método pode compreender as etapas de realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após uma suspeita de lesão na cabeça para medir ou detectar uma combinação de um nível de GFAP e um nível de UCH-L1 na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 105 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 110 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 105 pg / mL a cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 110 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo mais provavelmente não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 890 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de cerca de 2000 pg / mL.

[0277]Em algumas modalidades, o método pode incluir obter uma amostra dentro de 48 horas após uma suspeita de lesão no indivíduo e colocar a amostra em contato com um anticorpo para UCH-L1 e / ou GFAP para permitir a formação de um complexo do anticorpo e de UCH-L1 e / ou GFAP. O método também inclui detectar o complexo anticorpo - GFAP / UCH-L1 resultante. De acordo com esses métodos, os níveis de GFAP e UCH-L1 podem ser medidos ou detectados e, em seguida, correlacionados com um ou mais parâmetros clínicos (por exemplo, escore GCS e / ou TC), antes ou depois da realização do método, a fim de estabelecer níveis de referência de GFAP e UCH-L1 que possam ser usados para diagnosticar e avaliar um indivíduo que tenha sofrido ou possa ter sofrido uma LCT. Por exemplo, em algumas modalidades, o indivíduo pode ter recebido um escore na Escala de Coma de Glasgow (GCS) antes ou depois da execução do método. Se o escore GCS for menor ou igual a 12, é provável que se suspeite que o indivíduo tenha uma LCT moderada a grave.

[0278]Os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 podem ser usados como parte de um ensaio com pelo menos cerca de 30% de especificidade e pelo menos cerca de 90% de sensibilidade, como descrito mais adiante.

[0279]Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 48 horas após lesão ou suspeita de lesão na cabeça, tal como dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 24 horas e dentro de cerca de 0 a cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas, e dentro de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Em outras modalidades, a amostra pode ser coletada a partir do indivíduo humano em cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas após a lesão ou suspeita de lesão na cabeça.

Em algumas modalidades, o início da presença da combinação de GFAP e UCH-L1 aparece dentro de cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas após a lesão na cabeça. Em um aspecto, a amostra é coletada a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em ainda outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0280]Em algumas modalidades, o indivíduo recebeu um procedimento de imagiologia, tal como RM ou TC, antes ou depois da realização do ensaio. Em algumas modalidades, suspeita-se que o indivíduo tenha uma lesão cerebral traumática com base no procedimento de imagiologia. Em algumas modalidades, os níveis de referência de UCH-L1 e GFAP estão correlacionados com uma RM positiva e / ou TC da cabeça positiva (isto é, a presença de uma lesão intracraniana). Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 podem ser usados para indicar se um indivíduo precisa de um procedimento de RM, independente da realização de uma TC, e independente de uma TC que seja negativa (ou seja, indica que não sofreu uma LCT).

[0281]Geralmente, um nível de referência de um biomarcador, tal como UCH- L1 ou GFAP, e uma combinação dos mesmos, pode ser empregue como uma referência para avaliar os resultados obtidos ao analisar uma amostra de teste para GFAP e UCH-L1. Ao fazer essa comparação, por exemplo, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 podem ser obtidos correndo um ensaio específico um número suficiente de vezes e sob condições apropriadas, de modo que uma ligação ou associação da presença, quantidade ou concentração do analito com um determinado estágio ou desfecho de LCT ou com indícios específicos pode ser feita. Normalmente, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 são obtidos através da realização de ensaios em amostras de indivíduos de referência (ou populações de indivíduos). O GFAP e o UCH-L1 medidos podem incluir seus fragmentos, produtos de degradação e / ou produtos de clivagem enzimática.

[0282]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade entre pelo menos cerca de 70% a cerca de 100% e uma especificidade entre pelo menos cerca de 30% a cerca de 100%. Em algumas modalidades, a sensibilidade está entre pelo menos cerca de

70% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos 85%, entre pelo menos cerca de 75% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 80% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 85% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 90% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 95% a cerca de 100% ou entre pelo menos cerca de 95% e pelo menos cerca de 99%. Em algumas modalidades, a sensibilidade é de pelo menos cerca de 70,0%, pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 85,0%, pelo menos cerca de 87,5%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 95,0%, em pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%, pelo menos cerca de 99,2%, pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de 99,4%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%, pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 100,0%.

[0283]Em algumas modalidades, a especificidade está entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de

30% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de

60%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 50%, entre pelo menos cerca de 40%

e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de

40% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 50%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de

100%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

50% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de

80%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 50%

e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 60% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de

100%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 90% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 90% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 90% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 95% e cerca de 99% ou entre pelo menos cerca de 95% e cerca de 100. Em algumas modalidades, a especificidade é de pelo menos cerca de 30,0%, pelo menos cerca de 31,0%, pelo menos cerca de 32,0%, em pelo menos cerca de 33,0%, pelo menos cerca de 34,0%, pelo menos cerca de 35,0%, pelo menos cerca de 36,0%, pelo menos cerca de 37,0%, pelo menos cerca de 38,0%, pelo menos cerca de 39,0%, pelo menos cerca de 40,0%, pelo menos cerca de 45,0%, pelo menos cerca de 50,0%, pelo menos cerca de 55,0%, pelo menos cerca de 60,0%, pelo menos cerca de 65,0%, pelo menos cerca de 70,0%, pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 85,0%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 91,0%, pelo menos cerca de 92,0%, pelo menos cerca de 93,0%, pelo menos cerca de 94,0%, pelo menos cerca de 95,0%, pelo menos cerca de 96,0%, pelo menos cerca de 97,0%, em pelo menos cerca de 98,0%, pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%, pelo menos cerca de 99,2%, pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de 99,4%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%, pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 100,0%. Por exemplo, em algumas modalidades, a sensibilidade é pelo menos cerca de 99% e a especificidade é pelo menos cerca de 75%, a sensibilidade é pelo menos cerca de 99% e a especificidade é pelo menos cerca de 99% ou a sensibilidade é pelo menos cerca de 100% e a especificidade é de pelo menos cerca de 100%. A título de outro exemplo, em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 79% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 33%.

Além disso, em outras modalidades, o método quando usado como um ensaio tem uma sensibilidade pelo menos 3% maior e uma especificidade pelo menos 17% maior em comparação com um método ou ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente. Em outras modalidades, o método quando usado como um ensaio tem uma sensibilidade pelo menos 5% maior e uma especificidade pelo menos 20% maior em comparação com um método ou ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente. Em outras modalidades, o método quando usado como um ensaio tem uma sensibilidade pelo menos 8% maior e uma especificidade pelo menos 25% maior em comparação com um método ou ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[0284]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 50 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 100 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL.

Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP ou níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 10 pg / mL e cerca de 500 pg / mL, entre pelo menos cerca de 10 pg / mL e cerca de 400 pg / mL, entre pelo menos cerca de 10 pg / mL e cerca de 300 pg / mL, entre pelo menos cerca de 10 pg / mL e cerca de 200 pg / mL, entre pelo menos cerca de 10 pg / mL e cerca de 100 pg / mL, entre pelo menos cerca de 10 pg / mL e cerca de 50 pg / mL, entre pelo menos cerca de 10 pg / mL e cerca de 40 pg / mL, entre pelo menos cerca de 10 pg / mL e cerca de 30 pg / mL, entre pelo menos cerca de 20 pg / mL e cerca de 500 pg / mL, entre pelo menos cerca de 20 pg / mL e cerca de 400 pg / mL, entre pelo menos cerca de 20 pg / mL e cerca de 300 pg / mL, entre pelo menos cerca de 20 pg / mL e cerca de 200 pg / mL, entre pelo menos cerca de 20 pg / mL e cerca de 100 pg / mL, entre pelo menos cerca de 20 pg / mL e cerca de 50 pg / mL, entre pelo menos cerca de 20 pg / mL e cerca de 40 pg / mL, entre pelo menos cerca de 20 pg / mL e cerca de 30 pg / mL, entre pelo menos cerca de 30 pg / mL e cerca de 500 pg / mL, entre pelo menos cerca de 30 pg / mL a t 400 pg / mL, entre pelo menos cerca de 30 pg / mL e cerca de 300 pg / mL, entre pelo menos cerca de 30 pg / mL e cerca de 200 pg / mL, entre pelo menos cerca de 30 pg / mL e cerca de 100 pg / mL, entre pelo menos cerca de 30 pg

/ mL e cerca de 50 pg / mL, entre pelo menos cerca de 30 pg / mL e cerca de 40 pg /

mL, entre pelo menos cerca de 40 pg / mL e cerca de 500 pg / mL, entre pelo menos cerca de 40 pg / mL e cerca de 400 pg / mL, entre pelo menos cerca de 40 pg / mL e cerca de 300 pg / mL, entre pelo menos cerca de 40 pg / mL e cerca de 200 pg / mL,

entre pelo menos cerca de 40 pg / mL e cerca de 100 pg / mL, entre pelo menos cerca de 40 pg / mL e cerca de 50 pg / mL, entre pelo menos cerca de 50 pg / mL e cerca de 500 pg / mL, entre pelo menos cerca de 50 pg / mL e cerca de 400 pg / mL, entre pelo menos cerca de 50 pg / mL e cerca de 300 pg / mL, entre pelo menos cerca de

50 pg / mL e cerca de 200 pg / mL, entre pelo menos cerca de 50 pg / mL e cerca de

100 pg / mL, entre pelo menos cerca de 75 pg / mL e cerca de 500 pg / mL, entre pelo menos cerca de 75 pg / mL e cerca de 400 pg / mL, entre pelo menos cerca de 75 pg

/ mL e cerca de 300 pg / mL, seja entre pelo menos cerca de 75 pg / mL e cerca de

200 pg / mL, entre pelo menos cerca de 75 pg / mL e cerca de 100 pg / mL, entre pelo menos cerca de 100 pg / mL e cerca de 500 pg / mL, entre pelo menos cerca de 100 pg / mL e cerca de 400 pg / mL, entre pelo menos cerca de 100 pg / mL e cerca de

300 pg / mL, entre pelo menos cerca de 100 pg / mL e cerca de 200 pg / mL, entre pelo menos cerca de 150 pg / mL e cerca de 500 pg / mL, entre pelo menos cerca de

150 pg / mL e cerca de 400 pg / mL, entre pelo menos cerca de 150 pg / mL e cerca de 300 pg / mL, entre pelo menos cerca de 150 pg / mL e cerca de 200 pg / mL, entre pelo menos cerca de 200 pg / mL e cerca de 500 pg / mL, entre pelo menos cerca de

200 pg / mL e cerca de 400 pg / mL ou entre pelo menos cerca de 200 pg / mL e cerca de 300 pg / mL.

Por exemplo, o nível de referência para UCH-L1 pode estar entre pelo menos cerca de 80 pg / mL e cerca de 150 pg / mL e o nível de referência para GFAP pode estar entre pelo menos cerca de 20 pg / mL e cerca de 200 pg / mL.

A título de outro exemplo, em outras modalidades, o nível de referência para GFAP é de cerca de 105 pg / mL a cerca de 890 pg / mL e o nível de referência para UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

Em algumas modalidades, o nível de referência para GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de referência para UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL. Em algumas modalidades, o nível de referência para GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência para UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL. Em outras modalidades, o nível de referência para GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência para UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL.

[0285]Em algumas modalidades, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de referência de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL e o método tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 79%. Em outra modalidade, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de referência do GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL e o método tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 66%.

[0286]Em algumas modalidades, o método inclui ainda tratar o indivíduo humano com um tratamento para lesão cerebral traumática e / ou monitorar o indivíduo humano, como descrito abaixo.

[0287]A natureza do ensaio empregue nos métodos aqui descritos não é crítica e o ensaio pode ser qualquer ensaio conhecido na técnica, tal como, por exemplo, imunoensaios, imunoprecipitação de proteínas, imunoeletroforese, análise química, SDS-PAGE e análise Western blot, ou imunocoloração de proteínas, análise por eletroforese, um ensaio de proteínas, um ensaio de ligação competitiva, um ensaio funcional de proteínas, ou métodos de cromatografia ou espectrometria, tal como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia líquida - espectrometria de massas (LC / MS). Além disso, o ensaio pode ser empregue em um formato químico clínico, como seria conhecido por um versado na técnica. Tais ensaios são descritos em mais detalhes aqui nas Seções 5-9. Sabe-se na técnica que os valores (por exemplo, níveis de referência, pontos de corte, limites, especificidades, sensibilidades, concentrações de calibradores e / ou controles etc.) usados em um ensaio que emprega um tipo de amostra específico (por exemplo, um imunoensaio que utiliza soro ou um dispositivo de ponto de atendimento que emprega sangue integral) pode ser extrapolado para outros formatos de ensaio usando técnicas conhecidas, tal como padronização de ensaio. Por exemplo, uma maneira pela qual a padronização do ensaio pode ser realizada é aplicando um fator ao calibrador empregue no ensaio para fazer com que a concentração da amostra seja lida mais alta ou mais baixa para obter uma inclinação que se alinha com o método comparador.

Outros métodos de padronização dos resultados obtidos em um ensaio para outro são bem conhecidos e foram descritos na literatura (ver, por exemplo, David Wild, Immunoassay Handbook, 4ª edição, capítulo 3.5, páginas 315 a 322, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência).

3. Métodos de auxílio na determinação de se deve realizar imagiologia em um indivíduo humano que sofreu lesão na cabeça

[0288]A presente descrição se refere, entre outros métodos, a um método para auxiliar na determinação de se deve realizar um procedimento de imagiologia, tal como RM ou TC, em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. Conforme usado aqui, “determinação de se deve realizar um procedimento de imagiologia, tal como RM ou TC, em um indivíduo humano” refere-se ao fato de que o método mencionado acima pode ser usado com outras informações (por exemplo, dados de avaliação clínica) para determinar que é mais provável que o indivíduo não tenha uma RM positiva ou TC da cabeça positiva (ou seja, a presença de uma lesão intracraniana).

[0289]Em algumas modalidades, o método pode auxiliar a determinar se um indivíduo que sofreu uma LCT precisa de uma tomografia computadorizada (TC) com base nos níveis de GFAP, UCH-L1 ou GFAP e UCH-L1 em comparação com níveis de referência. De acordo com essas modalidades, o método pode compreender as etapas de realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de GFAP e um nível de UCH- L1 na amostra e (a) determinar que o indivíduo não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra for menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 50 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra for menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 90 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 50 pg / mL a cerca de 975 pg / mL, e o nível de UCH- L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 90 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 975 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[0290]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 50 pg / mL e cerca de 975 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 90 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL.

Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 100 pg / mL e cerca de 975 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 100 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 200 pg / mL e cerca de 975 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 200 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 300 pg / mL e cerca de 975 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 300 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 400 pg / mL e cerca de 975 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 400 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 500 pg / mL e cerca de 975 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 500 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 110 pg / mL e cerca de 975 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 90 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL.

Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 240 pg / mL e cerca de 975 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 300 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 190 pg / mL e cerca de 975 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 90 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP é de pelo menos 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de pelo menos 2000 pg / mL. Em outras modalidades, o nível de referência de GFAP é de pelo menos 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de pelo menos 300 pg / mL. Em outras modalidades, o nível de referência de GFAP é de pelo menos 190 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de pelo menos 90 pg / mL.

[0291]Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 48 horas após lesão ou suspeita de lesão na cabeça, tal como dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 24 horas e dentro de cerca de 0 a cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas, e dentro de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Em outras modalidades, a amostra pode ser coletada a partir do indivíduo humano em cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas de lesão ou suspeita de lesão na cabeça. Em algumas modalidades, o início da presença da combinação de GFAP e UCH-L1 aparece dentro de cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas após a lesão na cabeça. Em um aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em ainda outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0292]Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um método com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 54% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 32%, conforme discutido aqui mais adiante.

[0293]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 100% e uma especificidade entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 100%. Em algumas modalidades, a sensibilidade está entre pelo menos cerca de 50% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 50% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 50% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 50% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 50% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 55% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 55% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 55% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 55% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 55% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 60% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 60% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 60% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 60% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 60% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 70% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 70% para pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 80% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 85% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 90% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 95% a cerca de 100%, ou entre pelo menos cerca de 95% e pelo menos cerca de 99%. Em algumas modalidades, a sensibilidade é de pelo menos 50%, pelo menos 51%, pelo menos 52%, pelo menos 53%, pelo menos 54%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70,0%, pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 85,0%, pelo menos cerca de 87,5%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 95,0%, pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%, pelo menos cerca de 99,2%, pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de 99,4%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%, pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 100,0%. Em algumas modalidades, a sensibilidade do ensaio é igual ou superior a 54%.

[0294]Em algumas modalidades, a especificidade está entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 50%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 50%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de

100%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

100%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 95%, entre pelo menos de 80% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 80% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 90% e cerca de

100%, entre pelo menos cerca de 90% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

90% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 95% e cerca de 99% ou entre pelo menos cerca de 95% e cerca de 100%. Em algumas modalidades, a especificidade é de pelo menos cerca de 30,0%, pelo menos cerca de 31,0%, pelo menos cerca de

32,0%, em pelo menos cerca de 33,0%, pelo menos cerca de 34,0%, pelo menos cerca de 35,0%, pelo menos cerca de 36,0%, pelo menos cerca de 37,0%, pelo menos cerca de 38,0%, pelo menos cerca de 39,0%, pelo menos cerca de 40,0%, pelo menos cerca de 45,0%, pelo menos cerca de 50,0%, pelo menos cerca de 55,0%, pelo menos cerca de 60,0%, pelo menos cerca de 65,0%, pelo menos cerca de 70,0%, pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 85,0%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 91,0%, pelo menos cerca de 92,0%, pelo menos cerca de 93,0%, pelo menos cerca de 94,0%, pelo menos cerca de 95,0%, pelo menos cerca de 96,0%, pelo menos cerca de 97,0%, pelo menos cerca de 98,0%, pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%, pelo menos cerca de 99,2%, pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de 99,4%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%, pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 100,0%. Por exemplo, em algumas modalidades, a sensibilidade é pelo menos cerca de 99% e a especificidade é pelo menos cerca de 75%, a sensibilidade é pelo menos cerca de 99% e a especificidade é pelo menos cerca de 99% ou a sensibilidade é pelo menos cerca de 100% e a especificidade é de pelo menos cerca de 100%.

[0295]Em outras modalidades, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de referência de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL e o método tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 62%. Ainda em outras modalidades, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 300 pg / mL e o método tem uma sensibilidade igual ou superior a 91,5% e uma especificidade igual ou superior a 52%.

Em ainda outras modalidades, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de 12 horas a 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de referência de GFAP é de cerca de 190 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL e o método tem uma sensibilidade igual ou superior a 99% e uma especificidade igual ou superior a 36%.

[0296]Em outras modalidades, o método pode auxiliar a determinar se um indivíduo que sofreu uma LCT precisa de um procedimento de RM com base nos níveis de GFAP e UCH-L1 em comparação com os níveis de referência. De acordo com essas modalidades, o método pode compreender as etapas de realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de GFAP e um nível de UCH- L1 na amostra e (a) determinar que o indivíduo não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra for menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo mais provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo mais provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 1000 pg / mL e o nível de UCH- L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[0297]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 10 pg / mL e cerca de 1000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 40 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL.

Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 15 pg / mL e cerca de 1000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 50 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 25 pg / mL e cerca de 1000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 75 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 50 pg / mL e cerca de 1000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 100 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 75 pg / mL e cerca de 1000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 150 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 100 pg / mL e cerca de 1000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 200 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL.

[0298]Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 48 horas após lesão ou suspeita de lesão na cabeça, tal como cerca de 0 a cerca de 4 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 24 horas e dentro de cerca de 0 a cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas, e dentro de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Em outras modalidades, a amostra pode ser coletada a partir do indivíduo humano em cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas após a lesão na cabeça ou suspeita de lesão. Em algumas modalidades, o início da presença da combinação de GFAP e UCH-L1 aparece dentro de cerca de

0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas após a lesão na cabeça. Em um aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em ainda outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0299]Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um método tendo uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 98% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 85%, conforme discutido em mais detalhes abaixo.

[0300]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 são determinados por um ensaio tendo uma sensibilidade entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 100% e uma especificidade entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 100%. Em algumas modalidades, a sensibilidade está entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 70% a pelo menos 85%, entre pelo menos cerca de 75% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 80% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 85% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 90% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 95% a cerca de 100% ou entre pelo menos cerca de 95% e pelo menos cerca de 99%. Em algumas modalidades, a sensibilidade é de pelo menos cerca de 70,0%, pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 85,0%, pelo menos cerca de 87,5%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 95,0%, em pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%, pelo menos cerca de 99,2%, pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de 99,4%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%, pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 100,0%.

[0301]Em algumas modalidades, a especificidade está entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 50%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de

100%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

100%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

32,0%, pelo menos cerca de 33,0%, pelo menos cerca de 34,0%, pelo menos cerca de 35,0%, pelo menos cerca de 36,0%, pelo menos cerca de 37,0%, pelo menos cerca de 38,0%, pelo menos cerca de 39,0%, pelo menos cerca de 40,0%, pelo menos cerca de 45,0%, pelo menos cerca de 50,0%, pelo menos cerca de 55,0%, pelo menos cerca de 60,0%, pelo menos cerca de 65,0%, pelo menos cerca de 70,0%, pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 85,0%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 91,0%, pelo menos cerca de 92,0%, pelo menos cerca de 93,0%, pelo menos cerca de 94,0%, pelo menos cerca de 95,0%, pelo menos cerca de 95,0%, pelo menos cerca de 96,0%, pelo menos cerca de 97,0%, pelo menos cerca de 98,0%, pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%, pelo menos cerca de 99,2%, pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de 99,4%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%, pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 100,0%. Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um método que tem uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 98% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 85%.

[0302]Em algumas modalidades, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após a lesão e o nível de referência de GFAP é de cerca de 35 pg / mL, o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 94% e uma especificidade igual ou superior a 30%. Em ainda outras modalidades, a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas após a lesão e o nível de referência de GFAP é de cerca de 143 pg / mL, o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 88% e uma especificidade igual ou superior a 50%. A amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de 24 horas a 48 horas após a lesão e o nível de referência do GFAP é de cerca de 602 pg / mL, o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 57% e uma especificidade igual ou superior a 95%.

[0303]Em algumas modalidades, o método é realizado em um indivíduo que recebeu uma TC antes ou depois da realização do ensaio e, em alguns casos, a TC indica que uma LCT não ocorreu (ou seja, uma TC normal). Nesses casos, se os níveis de GFAP e UCH-L1 de um indivíduo indicarem, por exemplo, que um procedimento de RM é necessário, o método pode incluir determinar que um procedimento de RM deve ser realizado para diagnosticar e avaliar o indivíduo, e / ou determinar que tipo de LCT foi sofrida pelo indivíduo, independentemente do resultado da TC. Em algumas modalidades, o indivíduo não recebeu uma TC antes ou depois de realizar o ensaio. Nesses casos, se os níveis de GFAP e UCH-L1 do indivíduo indicarem, por exemplo, que um procedimento de RM é necessário, o método pode incluir determinar que um procedimento de RM deve ser realizado para diagnosticar e avaliar o indivíduo e / ou determinar que tipo de LCT foi sofrida pelo indivíduo, independente da ausência de TC negativa. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP e UCH- L1 são correlacionados com uma RM positiva ou TC da cabeça positiva (isto é, a presença de uma lesão intracraniana).

[0304]Em outras modalidades, o método pode auxiliar a determinar se um indivíduo que sofreu uma LCT precisa de um procedimento de RM com base nos níveis de GFAP ou UCH-L1 em comparação com os níveis de referência. De acordo com essas modalidades, o método pode compreender as etapas de realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de GFAP ou um nível de UCH- L1 na amostra, e (a) determinar que o indivíduo não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 0 pg / mL a cerca de 68 pg / mL ou o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 0 pg / mL a cerca de 99 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo mais provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 68 pg / mL ou o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 99 pg / mL.

[0305]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 1 pg / mL e cerca de 68 pg / mL ou os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 1 pg / mL e cerca de 99 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 5 pg / mL e cerca de 68 pg / mL, ou os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 5 pg / mL e cerca de 99 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 5 pg / mL e cerca de 65 pg / mL, ou os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 5 pg / mL e cerca de 95 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 5 pg / mL e cerca de 60 pg / mL, ou os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 5 pg / mL e cerca de 90 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 5 pg / mL e cerca de 55 pg / mL, ou os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 5 pg / mL e cerca de 85 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 5 pg / mL e cerca de 50 pg / mL, ou os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 5 pg / mL e cerca de 80 pg / mL.

[0306]Em algumas modalidades, uma amostra é retirada do indivíduo humano dentro de cerca de 48 horas após lesão na cabeça ou suspeita de lesão, tal como cerca de 0 a cerca de 4 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 24 horas e dentro de cerca de 0 a cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas, e dentro de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Em outras modalidades, a amostra pode ser coletada a partir do indivíduo humano cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas após a lesão na cabeça ou suspeita de lesão. Em algumas modalidades, o início da presença da combinação de GFAP e UCH-L1 aparece dentro de cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas após a lesão na cabeça. Em um aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em ainda outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0307]Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP é determinado por um método com uma sensibilidade de cerca de 90% a cerca de 95% e uma especificidade de cerca de 31% a cerca de 46%, como mostrado em mais detalhes na tabela abaixo.

Sensibilidade

31% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 32% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 33% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 34% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 35% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 36% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 37% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 38% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 39% 90% 91% 92% 93% 94% 95% Especificidade 40% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 41% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 42% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 43% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 44% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 45% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 46% 90% 91% 92% 93% 94% 95%

[0308]Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP é determinado por um método com uma sensibilidade de cerca de 81% a cerca de 84% e uma especificidade de cerca de 31% a cerca de 34%, como mostrado em mais detalhes na tabela abaixo: Sensibilidade 31% 81% 82% 83% 84% 32% 81% 82% 83% 84% Especificidade 33% 81% 82% 83% 84% 34% 81% 82% 83% 84%

[0309]Em algumas modalidades, o método é realizado em um indivíduo que recebeu uma TC antes ou depois da realização do ensaio e, em alguns casos, a TC indica que uma LCT não ocorreu (ou seja, uma TC normal). Nesses casos, se os níveis de GFAP ou UCH-L1 de um indivíduo indicarem, por exemplo, que um procedimento de RM é necessário, o método pode incluir determinar que um procedimento de RM deve ser realizado para diagnosticar e avaliar o indivíduo, e / ou determinar que tipo de LCT foi sofrida pelo indivíduo, independentemente do resultado da TC. Em algumas modalidades, o indivíduo não recebeu uma TC antes ou depois de realizar o ensaio. Nesses casos, se os níveis de GFAP ou UCH-L1 do indivíduo indicam, por exemplo, que um procedimento de RM é necessário, o método pode incluir determinar que um procedimento de RM deve ser realizado para diagnosticar e avaliar o indivíduo, e / ou determinar que tipo de LCT foi sofrida pelo indivíduo, independente da ausência de TC negativa. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP ou UCH-L1 são correlacionados com uma RM positiva ou TC da cabeça positiva (isto é, a presença de uma lesão intracraniana).

4. Métodos para auxiliar na previsão do resultado de um indivíduo humano que sofreu uma lesão na cabeça

[0310]A presente descrição se refere, entre outros métodos, a um método para prever o resultado de um indivíduo que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça. Como descrito aqui, prever o resultado de um indivíduo que sofreu uma lesão na cabeça inclui prever um resultado favorável ou desfavorável de um indivíduo que sofreu uma LCT com base nos níveis de GFAP e UCH-L1 em comparação com os níveis de referência. De acordo com essas modalidades, o método pode compreender as etapas de realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após a lesão na cabeça real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de GFAP e um nível de UCH-L1 na amostra.

[0311]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 70 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 100 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL.

Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 100 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 150 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 200 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 200 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 300 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 300 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL. Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP podem estar entre cerca de 80 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL, e os níveis de referência de UCH-L1 podem estar entre pelo menos cerca de 130 pg / mL e cerca de 2000 pg / mL.

[0312]Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um método com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 97% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 95%, conforme discutido em mais detalhes abaixo.

[0313]Em algumas modalidades, um indivíduo recebeu um escore na Escala de Resultados de Glasgow Estendida (GOSE) após a execução do método e é previsto que tenha um resultado favorável ou desfavorável (por exemplo, ruim) com base no escore GOSE. Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 se correlacionarão com indivíduos com um resultado ruim com base em um escore GOSE de 1.

[0314]Em algumas modalidades, o método é realizado em um indivíduo que não recebeu um diagnóstico médico para LCT (por exemplo, como onde o indivíduo sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, mas a LCT não foi diagnosticada).

Nesses casos, se os níveis de GFAP e UCH-L1 de um indivíduo estiverem acima dos níveis de referência prevendo, por exemplo, um resultado desfavorável, o método poderá incluir determinar que é necessária mais intervenção médica, tal como a realização de uma TC e / ou procedimento de RM para diagnosticar e avaliar o indivíduo, e / ou determinar que tipo de LCT o indivíduo pode ter sofrido. Em algumas modalidades, um indivíduo pode ter recebido um diagnóstico de que sofreu uma LCT.

Nesses casos, o método pode incluir determinar se os níveis de GFAP e UCH-L1 do indivíduo estão acima dos níveis de referência, confirmando o diagnóstico e prevendo um resultado desfavorável. No entanto, em algumas modalidades, os níveis de GFAP e UCH-L1 de um indivíduo podem estar abaixo dos níveis de referência de GFAP e UCH-L1 e, portanto, podem contradizer o diagnóstico de LCT ao prever um resultado favorável. Nesses casos, o método pode incluir reavaliar se o indivíduo sofreu uma LCT, tal como com um procedimento de RM ou TC da cabeça (isto é, para detectar a presença de uma lesão intracraniana).

[0315]Em algumas modalidades, os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 100% e uma especificidade entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 100%. Em algumas modalidades, a sensibilidade está entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 70% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 70% a pelo menos 85%, entre pelo menos cerca de 75% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 75% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 80% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 80% e pelo menos cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 85% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de

85% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 85% e pelo menos cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 90% a cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 90% e pelo menos cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 95% a cerca de 100% ou entre pelo menos cerca de 95% e pelo menos cerca de 99%. Em algumas modalidades, a sensibilidade é de pelo menos cerca de 70,0%, pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 85,0%, pelo menos cerca de 87,5%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 95,0%, em pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%, pelo menos cerca de 99,2%, pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de 99,4%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%, pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 100,0%.

[0316]Em algumas modalidades, a especificidade está entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 30% e cerca de 50%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 95%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 90%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 85%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 80%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 75%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 70%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 60%, entre pelo menos cerca de 40% e cerca de 50%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 100%, entre pelo menos cerca de 50% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

100%, entre pelo menos cerca de 70% e cerca de 99%, entre pelo menos cerca de

32,0%, pelo menos cerca de 33,0%, pelo menos cerca de 34,0%, pelo menos cerca de 35,0%, pelo menos cerca de 36,0%, pelo menos pelo menos cerca de 37,0%, pelo menos cerca de 38,0%, pelo menos cerca de 39,0%, pelo menos cerca de 40,0%,

pelo menos cerca de 45,0%, pelo menos cerca de 50,0%, pelo menos cerca de 55,0%,

pelo menos cerca de 60,0%, pelo menos cerca de 65,0%, pelo menos cerca de 70,0%,

pelo menos cerca de 75,0%, pelo menos cerca de 80,0%, pelo menos cerca de 85,0%,

pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 90,0%, pelo menos cerca de 91,0%,

pelo menos cerca de 92,0%, pelo menos cerca de 93,0%, pelo menos cerca de 94,0%,

pelo menos cerca de 95,0%, pelo menos cerca de 96,0%, pelo menos cerca de 97,0%,

pelo menos cerca de 98,0%, pelo menos cerca de 99,0%, pelo menos cerca de 99,1%,

pelo menos cerca de 99,2%, em pelo menos cerca de 99,3%, pelo menos cerca de

99,4%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,6%, pelo menos cerca de 99,7%, pelo menos cerca de 99,8%, pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 100,0%. Em algumas modalidades, o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um método que tem uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 97% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de

95%. Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 48 horas após a lesão na cabeça ou suspeita de lesão, tal como dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 8 horas,

dentro de cerca de 0 a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 16 horas,

dentro de cerca de 0 a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 0 a cerca de 24 horas e dentro de cerca de 0 a cerca de 48 horas.

Em algumas modalidades, uma amostra é coletada a partir do indivíduo humano dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas,

dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas, e dentro de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas.

Em outras modalidades, a amostra pode ser coletada a partir do indivíduo humano em cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos,

cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de

6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas,

cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de

19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas de lesão na cabeça ou suspeita de lesão.

Em algumas modalidades, o início da presença da combinação de GFAP e UCH-L1 aparece dentro de cerca de 0 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas ou cerca de 24 horas após a lesão na cabeça. Em um aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Em ainda outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão. Ainda em outro aspecto, a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

5. Tratamento e monitoramento de indivíduos que sofreram uma lesão na cabeça

[0317]O indivíduo identificado ou avaliado nos métodos descritos acima como tendo lesão cerebral traumática, tal como lesão cerebral traumática leve ou lesão cerebral traumática moderada a grave, pode ser tratado ou monitorado. Em algumas modalidades, o método inclui ainda tratar o indivíduo humano avaliado como tendo lesão cerebral traumática com um tratamento para lesão cerebral traumática, tal como quaisquer tratamentos conhecidos na técnica. Por exemplo, o tratamento para lesões cerebrais traumáticas pode assumir várias formas, dependendo da gravidade da lesão na cabeça. Por exemplo, para indivíduos que sofrem de LCT leve, o tratamento pode incluir um ou mais de repousar, abster-se de eventos que agravam os sintomas (tal como esportes), evitar luz ou usar óculos de sol quando exposto à luz, gerenciamento sintomático tal como medicamentos para alívio da dor de cabeça ou enxaqueca,

medicação antináusea, etc. O tratamento para pacientes que sofrem de LCT grave pode incluir a administração de um ou mais medicamentos apropriados (tal como, por exemplo, diuréticos, anticonvulsivos, medicamentos para sedar e colocar um indivíduo em coma induzido por fármacos, ou outros medicamentos farmacêuticos ou biofarmacêuticos (conhecidos ou desenvolvidos no futuro para o tratamento de LCT), um ou mais procedimentos cirúrgicos (tal como, por exemplo, remoção de um hematoma, reparação de fratura de crânio, craniectomia descompressiva, etc.) e uma ou mais terapias (tal como, por exemplo, uma ou mais de reabilitação, terapia cognitivo-comportamental, controle da raiva, psicologia de aconselhamento, etc.). Em algumas modalidades, o método inclui ainda monitorar o indivíduo humano avaliado como tendo lesão cerebral traumática (por exemplo, lesão cerebral traumática leve ou moderada a grave). Em algumas modalidades, um indivíduo identificado como tendo lesão cerebral traumática, tal como lesão cerebral traumática leve ou lesão cerebral traumática grave, pode ser monitorado com TC ou RM.

6. Métodos para medir o nível de UCH-L1

[0318]Nos métodos descritos acima, os níveis de UCH-L1 podem ser medidos por qualquer meio, tal como métodos dependentes de anticorpos, tal como imunoensaios, imunoprecipitação de proteínas, imunoeletroforese, análise química, SDS-PAGE e análise de Western blot, imunocoloração de proteínas, análise por eletroforese, um ensaio proteico, um ensaio competitivo de ligação, um ensaio funcional de proteínas ou métodos de cromatografia ou espectrometria, tal como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia líquida - espectrometria de massas (LC / MS). Além disso, o ensaio pode ser empregue no formato químico clínico ou no ensaio de detecção de molécula única, como seria conhecido por um versado na técnica.

[0319]Em algumas modalidades, a medição do nível de UCH-L1 inclui colocar a amostra em contato com um primeiro membro de ligação específica e um segundo membro de ligação específica. Em algumas modalidades, o primeiro membro de ligação específica é um anticorpo de captura e o segundo membro de ligação específica é um anticorpo de detecção. Em algumas modalidades, medir o nível de UCH-L1 inclui colocar a amostra em contato, simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura (por exemplo, anticorpo de captura de UCH-L1), que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar pelo menos um complexo de anticorpo de captura - antígeno de UCH-L1 (por exemplo, complexo de anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1), e (2) pelo menos um anticorpo de detecção (por exemplo, anticorpo de detecção de UCH-L1), que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado ao anticorpo de captura, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção (por exemplo, complexo de antígeno UCH-L1 - anticorpo de detecção de UCH-L1), de modo que pelo menos um complexo de anticorpo de captura de UCH-L1 – antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção (por exemplo, complexo de anticorpo de captura de UCH-L1 – antígeno de UCH-L1 - anticorpo de detecção de UCH-L1) seja formado, e medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável no complexo de anticorpo de captura - antígeno de UCH-L1 – anticorpo de detecção.

[0320]Em algumas modalidades, o método compreende ainda um terceiro membro de ligação específica, tal como um segundo anticorpo de detecção que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado ao anticorpo de captura e ao primeiro anticorpo de detecção.

[0321]Em algumas modalidades, o primeiro membro de ligação específica é imobilizado em um suporte sólido. Em algumas modalidades, o segundo membro de ligação específica é imobilizado em um suporte sólido. Em algumas modalidades, o primeiro membro de ligação específica é um anticorpo de UCH-L1 como descrito abaixo.

[0322]Em algumas modalidades, a amostra é diluída ou não diluída. A amostra pode ser de cerca de 1 a cerca de 25 microlitros, cerca de 1 a cerca de 24 microlitros, cerca de 1 a cerca de 23 microlitros, cerca de 1 a cerca de 22 microlitros, cerca de 1 a cerca de 21 microlitros, cerca de 1 a cerca de 21 microlitros, cerca de 1 a cerca de 20 microlitros, cerca de 1 a cerca de 18 microlitros, cerca de 1 a cerca de 17 microlitros, cerca de 1 a cerca de 16 microlitros, cerca de 15 microlitros ou de cerca de 1 microlitro, cerca de 2 microlitros, cerca de 3 microlitros, cerca de 4 microlitros, cerca de 5 microlitros, cerca de 6 microlitros, cerca de 7 microlitros, cerca de 8 microlitros, cerca de 9 microlitros, cerca de 10 microlitros, cerca de 11 microlitros, cerca de 12 microlitros, cerca de 13 microlitros, cerca de 14 microlitros, cerca de 15 microlitros, cerca de 16 microlitros, cerca de 17 microlitros, cerca de 18 microlitros, cerca de 19 microlitros, cerca de 20 microlitros, cerca de 21 microlitros, cerca de 22 microlitros, cerca de 23 microlitros, cerca de 24 microlitros ou cerca de 25 microlitros.

Em algumas modalidades, a amostra é de cerca de 1 a cerca de 150 microlitros ou menos ou de cerca de 1 a cerca de 25 microlitros ou menos.

[0323]Alguns instrumentos (tal como, por exemplo, o instrumento Abbott Laboratories ARCHITECT® e outros instrumentos de laboratório), que não um dispositivo de ponto de atendimento, podem ser capazes de medir os níveis de UCH- L1 em uma amostra maior ou maior do que 25.000 pg / mL.

[0324]Outros métodos de detecção incluem o uso de, ou podem ser adaptados para uso em, um dispositivo de nanoporos ou dispositivo de nanopoços, por exemplo, para detecção de molécula única. Exemplos de dispositivos nanoporos são descritos na Publicação de Patente Internacional No. WO 2016/161402, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Exemplos de dispositivo de nanopoços são descritos na Publicação de Patente Internacional No. WO 2016/161400, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Outros dispositivos e métodos apropriados para a detecção de molécula única também podem ser empregues.

7. Anticorpos de UCH-L1

[0325]Os métodos aqui descritos podem usar um anticorpo isolado que se liga especificamente à hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (“UCH-L1”) (ou seus fragmentos), chamado aqui de “anticorpo de UCH-L1”. Os anticorpos de UCH-L1 podem ser usados para avaliar o estado de UCH-L1 como uma medida de lesão cerebral traumática, detectar a presença de UCH-L1 em uma amostra, quantificar a quantidade de UCH-L1 presente em uma amostra, ou detectar a presença e quantificar a quantidade de UCH-L1 em uma amostra.

a. Hidrolase Carboxi-Terminal L1 de Ubiquitina (UCH-L1)

[0326]A hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (“UCH-L1”), também conhecida como “hidrolase C-terminal de ubiquitina”, é uma enzima desubiquitinante.

UCH-L1 é um membro de uma família de genes cujos produtos hidrolisam pequenos adutcos C-terminais de ubiquitina para gerar o monômero de ubiquitina. A expressão de UCH-L1 é altamente específica para neurônios e células do sistema neuroendócrino difuso e seus tumores. Ela está abundantemente presente em todos os neurônios (responde por 1 a 2% da proteína total do cérebro), expressa especificamente em neurônios e testículos / ovário. A tríade catalítica de UCH-L1 contém uma cisteína na posição 90, um aspartato na posição 176, e uma histidina na posição 161 que são responsáveis por sua atividade de hidrolase.

UCH-L1 humano pode ter a seguinte sequência de aminoácidos:

MQLKPMEINPEMLNKVLSRLGVAGQWRFVDVLGLEEESLGSVPAPACALLL LFPLTAQHENFRKKQIEELKGQEVSPKVYFMKQTIGNSCGTIGLIHAVANNQDKLGF EDGSVLKQFLSETEKMSPEDRAKCFEKNEAIQAAHDAVAQEGQCRVDDKVNFHFIL

FNNVDGHLYELDGRMPFPVNHGASSEDTLLKDAAKVCREFTEREQGEVRFSAVAL CKAA (SEQ ID NO: 1).

[0327]O UCH-L1 humano pode ser um fragmento ou variante da SEQ ID NO:

1. O fragmento de UCH-L1 pode estar entre 5 e 225 aminoácidos, entre 10 e 225 aminoácidos, entre 50 e 225 aminoácidos, entre 60 e 225 aminoácidos, entre 65 e 225 aminoácidos, entre 100 e 225 aminoácidos, entre 150 e 225 aminoácidos, entre 100 e 175 aminoácidos ou entre 175 e 225 aminoácidos de comprimento. O fragmento pode compreender um número contíguo de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

b. Anticorpo de Reconhecimento de UCH-L1

[0328]O anticorpo é um anticorpo que se liga a UCH-L1, um fragmento do mesmo, um epítopo de UCH-L1 ou uma variante do mesmo. O anticorpo pode ser um fragmento do anticorpo anti-UCH-L1 ou uma variante ou um derivativo do mesmo. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo de maturação de afinidade, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano, ou um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fab, ou uma mistura dos mesmos. Os fragmentos ou derivativos de anticorpo podem compreender fragmentos F(ab’)2, Fv ou scFv. Os derivativos de anticorpos podem ser produzidos por peptidomiméticos. Além disso, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única.

[0329]Os anticorpos anti-UCH-L1 podem ser um anticorpo quimérico anti- UCH-L1 ou anti-UCH-L1 humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado e o anticorpo quimérico são monovalentes. Em uma modalidade, tanto o anticorpo humanizado quanto o anticorpo quimérico compreendem uma única região Fab ligada a uma região Fc.

[0330]Os anticorpos humanos podem ser derivativos da tecnologia de exibição de fagos ou de camundongos transgênicos que expressam genes de imunoglobulina humana. O anticorpo humano pode ser gerado como um resultado de uma resposta imune humana in vivo e isolado. Ver, por exemplo, Funaro e outros, BMC Biotechnology, 2008 (8): 85. Portanto, o anticorpo pode ser um produto do repertório humano e não animal. Por ser de origem humana, os riscos de reatividade contra auto-antígenos podem ser minimizados. Alternativamente, as bibliotecas de exibição de leveduras e tecnologias de exibição padrão podem ser usadas para selecionar e isolar anticorpos anti-UCH-L1 humanos. Por exemplo, bibliotecas de fragmentos variáveis de cadeia única humana (scFv) virgens podem ser usadas para selecionar anticorpos anti-UCH-L1 humanos. Animais transgênicos podem ser usados para expressar anticorpos humanos.

[0331]Os anticorpos humanizados podem ser moléculas de anticorpo a partir de anticorpo de espécie não humana que se liga ao antígeno desejado tendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana.

[0332]O anticorpo é distinguível dos anticorpos conhecidos pelo fato de que tem funções biológicas diferentes daquelas conhecidas na técnica.

(1) Epítopo

[0333]O anticorpo pode se ligar imunoespecificamente a UCH-L1 (SEQ ID NO: 1), um fragmento do mesmo ou uma variante do mesmo. O anticorpo pode reconhecer e se ligar imunoespecificamente a pelo menos três aminoácidos, pelo menos quatro aminoácidos, pelo menos cinco aminoácidos, pelo menos seis aminoácidos, pelo menos sete aminoácidos, pelo menos oito aminoácidos, pelo menos nove aminoácidos ou pelo menos dez aminoácidos dentro de uma região de epítopo. O anticorpo pode reconhecer e se ligar imunoespecificamente a um epítopo que tem pelo menos três aminoácidos contíguos, pelo menos quatro aminoácidos contíguos, pelo menos cinco aminoácidos contíguos, pelo menos seis aminoácidos contíguos, pelo menos sete aminoácidos contíguos, pelo menos oito aminoácidos contíguos, pelo menos nove aminoácidos contíguos ou pelo menos dez aminoácidos contíguos de uma região de epítopo.

c. Anticorpos Anti-UCH-L1 Exemplificativos

[0334]Os anticorpos anti-UCH-L1 podem ser gerados usando as técnicas descritas aqui, bem como usando técnicas de rotina conhecidas. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-UCH-L1 pode ser um anticorpo UCH-L1 não conjugado, tal como anticorpos UCH-L1 disponíveis a partir de United States Biological (Número de Catálogo: 031320), Cell Signaling Technology (Número de Catálogo: 3524), Sigma- Aldrich (Número de catálogo: HPA005993), Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Números de catálogo: sc-58593 ou sc-58594), R&D Systems (Número de catálogo: MAB6007), Novus Biologicals (Número de catálogo: NB600-1160), Biorbyt (Número de catálogo: orb33715), Enzo Life Sciences, Inc. (Número de catálogo: ADI-905-520-1), Bio-Rad (Número de catálogo: VMA00004), BioVision (Número de catálogo: 6130-50), Abcam (Números de catálogo: ab75275 ou ab104938), Invitrogen Antibodies (Números de Catálogo: 480012), ThermoFisher Scientific (Números de Catálogo: MA1-46079, MA5- 17235, MA1-90008 ou MA1-83428), EMD Millipore (Número de Catálogo: MABN48) ou Sino Biological Inc (Número de catálogo: 50690-R011). O anticorpo anti-UCH-L1 pode ser conjugado com um fluoróforo, tal como anticorpos UCH-L1 conjugados disponíveis a partir de BioVision (Número de Catálogo: 6960-25) ou de Aviva Systems Biology (Números de catálogo: OAAF01904-FITC). Outros anticorpos de UCH-L1 que podem ser usados nos métodos aqui descritos incluem aqueles descritos em WO 2018/081649, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

d. Preparação / Produção de Anticorpo

[0335]Os anticorpos podem ser preparados por qualquer uma de uma variedade de técnicas, incluindo aquelas bem conhecidas dos versados na técnica.

Em geral, os anticorpos podem ser produzidos por técnicas de cultura de células, incluindo a geração de anticorpos monoclonais por técnicas convencionais, ou por transfecção de genes de anticorpos, cadeias pesadas e / ou cadeias leves em hospedeiros celulares bacterianos ou de mamíferos adequados, para permitir a produção de anticorpos, onde os anticorpos podem ser recombinantes. As várias formas do termo “transfecção” destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano, e similares. Embora seja possível expressar os anticorpos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas é preferencial, e mais preferencial em células hospedeiras de mamíferos, porque essas células eucarióticas (e em particular as células de mamíferos) são mais prováveis do que as células procarióticas de montar e secretar um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo.

[0336]As células hospedeiras de mamíferos exemplificativas para expressar os anticorpos recombinantes incluem células de ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas por Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 77: 4216 a 4220 (1980)), usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito por Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601 a 621 (1982), células de mieloma NS0, células COS, e células SP2. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando métodos padrão de purificação de proteínas.

[0337]As células hospedeiras também podem ser usadas para produzir fragmentos de anticorpos funcionais, tal como fragmentos Fab ou moléculas de scFv.

Será entendido que variações no procedimento acima podem ser realizadas. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificando fragmentos funcionais ou de cadeia leve e / ou de cadeia pesada de um anticorpo. A tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para remover parte ou todo o DNA que codifica uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não são necessárias para a ligação aos antígenos de interesse. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são abrangidas pelos anticorpos. Além disso, podem ser produzidos anticorpos bifuncionais nos quais uma cadeia pesada e uma leve são um anticorpo (ou seja, liga a UCH-L1 humano) e a outra cadeia pesada e leve são específicas para um antígeno que não o UCH-L1 humano, reticulando um anticorpo a um segundo anticorpo por métodos de reticulação química padrão.

[0338]Em um sistema preferencial para expressão recombinante de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, um vetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada do anticorpo quanto a cadeia leve do anticorpo é introduzido nas células dhfr-CHO por transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes das cadeias pesada e leve do anticorpo estão operacionalmente ligados aos elementos reguladores do promotor CMV / promotor AdMLP para conduzir altos níveis de transcrição dos genes.

O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando seleção / amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. As técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras, e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura. Ainda mais, o método de sintetizar um anticorpo recombinante pode ser através da cultura de uma célula hospedeira em um meio de cultura adequado até que um anticorpo recombinante seja sintetizado. O método pode ainda compreender isolar o anticorpo recombinante a partir do meio de cultura.

[0339]Os métodos de preparação de anticorpos monoclonais envolvem a preparação de linhagens de células imortais capazes de produzir anticorpos com a especificidade desejada. Tais linhagens de células podem ser produzidas a partir de células do baço obtidas a partir de um animal imunizado. O animal pode ser imunizado com UCH-L1 ou um fragmento e / ou variante do mesmo. O peptídeo utilizado para imunizar o animal pode compreender aminoácidos que codificam Fc humano, por exemplo, a região cristalizável do fragmento ou a região da cauda do anticorpo humano. As células do baço podem então ser imortalizadas por, por exemplo, fusão com um parceiro de fusão de células de mieloma. Uma variedade de técnicas de fusão pode ser empregue. Por exemplo, as células do baço e as células de mieloma podem ser combinadas com um detergente não iônico por alguns minutos e depois plaqueadas em baixa densidade em um meio seletivo que suporta o crescimento de células híbridas, mas não as células de mieloma. Uma dessas técnicas usa a seleção de hipoxantina, aminopterina, timidina (HAT). Outra técnica inclui eletrofusão. Após um tempo suficiente, geralmente cerca de 1 a 2 semanas, são observadas colônias de híbridos. Colônias únicas são selecionadas e seus sobrenadantes de cultura são testados quanto à atividade de ligação contra o polipeptídeo. Hibridomas com alta reatividade e especificidade podem ser utilizados.

[0340]Os anticorpos monoclonais podem ser isolados a partir dos sobrenadantes das colônias de hibridoma em crescimento. Além disso, várias técnicas podem ser empregues para aumentar o rendimento, tal como injeção da linhagem de células de hibridoma na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado adequado, tal como um camundongo. Os anticorpos monoclonais podem então ser colhidos a partir do líquido de ascite ou do sangue. Os contaminantes podem ser removidos dos anticorpos por técnicas convencionais, tal como cromatografia, filtração em gel, precipitação e extração. A cromatografia de afinidade é um exemplo de um método que pode ser usado em um processo para purificar os anticorpos.

[0341]A enzima proteolítica papaína cliva preferencialmente as moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F(ab)) compreendem um heterodímero covalente que inclui um sítio de ligação ao antígeno intacto. A enzima pepsina é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários fragmentos, incluindo o fragmento F(ab’)2, que compreende ambos os sítios de ligação ao antígeno.

[0342]O fragmento Fv pode ser produzido por clivagem proteolítica preferencial de um IgM e, em raras ocasiões, moléculas de imunoglobulina IgG ou IgA. O fragmento Fv pode ser derivado usando técnicas recombinantes. O fragmento Fv inclui um heterodímero VH :: VL não covalente incluindo um sítio de ligação ao antígeno que retém grande parte das capacidades de reconhecimento e ligação ao antígeno da molécula de anticorpo nativa.

[0343]O anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivativo pode compreender um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (“CDR”) de cadeia pesada e cadeia leve, respectivamente interpostas entre uma estrutura (“FR”) de cadeia pesada e de cadeia leve que fornece suporte às CDRs e definem a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDRs pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou de cadeia leve.

[0344]Outros métodos adequados de produção ou isolamento de anticorpos com a especificidade necessária podem ser utilizados, incluindo, mas não limitados a, métodos que selecionam anticorpo recombinante a partir de uma biblioteca de peptídeos ou proteínas (por exemplo, mas não limitado a, uma biblioteca de exibição de bacteriófago, ribossomo, oligonucleotídeo, RNA, cDNA, levedura ou similares); por exemplo, conforme disponível a partir de vários fornecedores comerciais tal como

Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido), MorphoSys (Martinsreid / Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Escócia, Reino Unido) BioInvent (Lund, Suécia), usando métodos conhecidos na técnica. Ver Patentes U.S. Nos.

4.704.692, 5.723.323, 5.763.192, 5.814.476, 5.817.483, 5.824.514, 5.976.862.

Métodos alternativos dependem da imunização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos SCID, Nguyen e outros (1997) Microbiol. Immunol. 41: 901 a 907; Sandhu e outros (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95 a 118; Eren e outros (1998) Immunol. 93: 154 a 161) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, como é conhecido na técnica e / ou como aqui descrito. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a, exibição de ribossomos (Hanes e outros (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937 a 4942; Hanes e outros (1998) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 95: 14130 a 14135); tecnologias de produção de anticorpos de célula única (por exemplo, método de anticorpo linfocitário selecionado (“SLAM”) (Patente US No.

5.627.052, Wen e outros (1987) J. Immunol. 17: 887 a 892; Babcook e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 7843 a 7848); microgotículas em gel e citometria de fluxo (Powell e outros (1990) Biotechnol. 8: 333 a 337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass); Gray e outros (1995) J. Imm. Meth. 182: 155 a 163; Kenny e outros (1995) Bio / Technol. 13: 787 a 790); seleção de células B (Steenbakkers e outros (1994) Molec.

Biol. Reports 19: 125 a 134 (1994)).

[0345]Um anticorpo de maturação de afinidade pode ser produzido por qualquer um de vários procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, ver Marks e outros, BioTechnology, 10: 779 a 783 (1992) que descreve a maturação de afinidade por embaralhamento de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de CDR e / ou de estrutura é descrita por Barbas e outros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809 a 3813 (1994); Schier e outros, Gene, 169: 147 a 155 (1995); Yelton e outros, J.

Immunol., 155: 1994 a 2004 (1995); Jackson e outros, J. Immunol., 154 (7): 3310 a 3319 (1995); Hawkins e outros, J. Mol. Biol., 226: 889 a 896 (1992). A mutação seletiva em posições de mutagênese seletiva e em posições de contato ou hipermutação com um resíduo de aminoácido que aumenta a atividade é descrita na Patente US No.

6.914.128 B1.

[0346]As variantes de anticorpo também podem ser preparadas utilizando a entrega de um polinucleotídeo que codifica um anticorpo para um hospedeiro adequado, tal como para fornecer animais transgênicos ou mamíferos, tal como cabras, vacas, cavalos, ovelhas e similares, que produzem esses anticorpos em seu leite. Estes métodos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. Nos. 5,827,690, 5.849.992, 4.873.316, 5.849.992, 5.994.616,

5.565.362, e 5.304.489.

[0347]As variantes de anticorpos também podem ser preparadas entregando um polinucleotídeo para fornecer plantas transgênicas e células vegetais cultivadas (por exemplo, mas não se limitadas a tabaco, milho e lentilha) que produzem esses anticorpos, porções ou variantes especificadas nas partes da planta ou em células cultivadas a partir delas. Por exemplo, Cramer e outros (1999) Curr. Top. Microbiol.

Immunol. 240: 95 a 118 e referências aqui citadas, descrevem a produção de folhas de tabaco transgênicas expressando grandes quantidades de proteínas recombinantes, por exemplo, usando um promotor induzível. O milho transgênico tem sido utilizado para expressar proteínas de mamíferos em níveis de produção comercial, com atividades biológicas equivalentes às produzidas em outros sistemas recombinantes ou purificadas a partir de fontes naturais. Ver, por exemplo, Hood e outros, Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464: 127 a 147 e referências citadas. As variantes de anticorpos também foram produzidas em grandes quantidades a partir de sementes de plantas transgênicas, incluindo fragmentos de anticorpos, tal como anticorpos de cadeia única (scFv’s), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. Ver, por exemplo, Conrad e outros (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101 a 109 e referência citada. Assim, os anticorpos também podem ser produzidos usando plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos.

[0348]Os derivativos de anticorpos podem ser produzidos, por exemplo, adicionando sequências exógenas para modificar a imunogenicidade ou reduzir, aprimorar ou modificar a ligação, afinidade, taxa de associação, taxa de dissociação, avidez, especificidade, meia-vida ou qualquer outra característica adequada.

Geralmente, parte ou todas as sequências de CDR não humanas ou humanas são mantidas enquanto as sequências não humanas das regiões variável e constante são substituídas por aminoácidos humanos ou outros.

[0349]Pequenos fragmentos de anticorpo podem ser diacorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, em que os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH VL). Ver, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger e outros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 a 6448. Ao usar um ligante muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Ver também a Patente U.S. No.

6.632.926 de Chen e outros que é aqui incorporada por referência em sua totalidade e descreve variantes de anticorpos que têm um ou mais aminoácidos inseridos em uma região hipervariável do anticorpo de origem e uma afinidade de ligação a um antígeno alvo que é pelo menos cerca de duas vezes mais forte que a afinidade de ligação do anticorpo de origem para o antígeno.

[0350]O anticorpo pode ser um anticorpo linear. O procedimento para produzir um anticorpo linear é conhecido na técnica e descrito por Zapata e outros, (1995) Protein Eng. 8 (10): 1057 a 1062. Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[0351]Os anticorpos podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por métodos conhecidos, incluindo, entre outros, purificação de proteína A, precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração ácida, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. A cromatografia líquida de alto desempenho (“HPLC”) também pode ser usada para purificação.

[0352]Pode ser útil marcar de forma detectável o anticorpo. Os métodos para conjugar anticorpos a esses agentes são conhecidos na técnica. Apenas para fins ilustrativos, os anticorpos podem ser marcados com uma porção detectável, tal como um átomo radioativo, um cromóforo, um fluoróforo ou similares. Tais anticorpos marcados podem ser utilizados para técnicas de diagnóstico, in vivo ou em uma amostra de teste isolada. Eles podem ser ligados a uma citocina, a um ligando, a outro anticorpo. Agentes adequados para acoplamento a anticorpos para obter um efeito antitumoral incluem citocinas, tal como interleucina 2 (IL-2) e fator de necrose tumoral (TNF); fotossensibilizadores, para uso em terapia fotodinâmica, incluindo tetrassulfonato de ftalocianina de alumínio (III), hematoporfirina e ftalocianina; radionuclídeos, tal como iodo-131 (131I), ítrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto- 213 (213Bi), tecnécio-99m (99mTc), rênio-186 (186Re) e rênio-188 (188Re); antibióticos, tal como doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina e carboplatina; toxinas bacterianas, vegetais e outras, tal como toxina da difteria, pseudomonas exotoxina A, enterotoxina estafilocócica A, toxina abrina-A, ricina A (ricina desglicosilada A e ricina nativa A), toxina TGF-alfa, citotoxina da cobra chinesa (naja naja atra) e gelonina (uma toxina vegetal); proteínas inativadoras de ribossomos de plantas, bactérias e fungos, tal como restrinocina (uma proteína inativadora de ribossomos produzida por Aspergillus restringus), saporina (uma proteína que inativa o ribossomo de Saponaria officinalis) e RNase; inibidores de tirosina quinase; ly207702 (um nucleosídeo de purina difluorado); lipossomas contendo agentes anti-císticos (por exemplo, oligonucleotídeos antissenso, plasmídeos que codificam toxinas, metotrexato, etc.); e outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, tal como F(ab).

[0353]A produção de anticorpos através do uso da tecnologia de hibridoma, o método de anticorpo linfocitário selecionado (SLAM), animais transgênicos e bibliotecas de anticorpos recombinantes é descrita em mais detalhes abaixo.

(1) Anticorpos monoclonais anti-UCH-L1 usando a tecnologia de hibridoma

[0354]Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas, incluindo o uso de hibridoma, tecnologias recombinante e de exibição de fagos ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma, incluindo os conhecidos na técnica, e descritos, por exemplo, por Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Manual, segunda edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, e outros, In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981). Também é observado que o termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado aqui, não está limitado aos anticorpos produzidos pela tecnologia de hibridoma. O termo “anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou fago, e não o método pelo qual é produzido.

[0355]Métodos de geração de anticorpos monoclonais, bem como anticorpos produzidos pelo método, podem compreender cultivar uma célula de hibridoma secretando um anticorpo em que, preferencialmente, o hibridoma é gerado pela fusão de esplenócitos isolados de um animal, por exemplo, um rato ou camundongo, imunizados com UCH-L1 com células de mieloma e depois triando os hibridomas resultantes da fusão de clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de se ligar a um polipeptídeo. Resumidamente, os ratos podem ser imunizados com um antígeno de UCH-L1. Em uma modalidade preferencial, o antígeno de UCH-L1 é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Tais adjuvantes incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídeos de muramil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Esses adjuvantes podem proteger o polipeptídeo da rápida dispersão sequestrando-o em um depósito local, ou podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imunológico. De preferência, se um polipeptídeo estiver sendo administrado, o esquema de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipeptídeo, espalhadas por várias semanas; no entanto, uma única administração do polipeptídeo também pode ser usada.

[0356]Após a imunização de um animal com um antígeno de UCH-L1, anticorpos e / ou células produtoras de anticorpos podem ser obtidos a partir do animal. Um soro contendo anticorpo anti-UCH-L1 é obtido sangrando ou sacrificando o animal. O soro pode ser utilizado como é obtido a partir do animal, uma fração de imunoglobulina pode ser obtida a partir do soro, ou os anticorpos anti-UCH-L1 podem ser purificados a partir do soro. O soro ou imunoglobulinas obtidas desta maneira são policlonais, tendo assim um conjunto heterogêneo de propriedades.

[0357]Uma vez que uma resposta imune é detectada, por exemplo, anticorpos específicos para o antígeno de UCH-L1 são detectados no soro de rato, o baço do rato é colhido e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos por técnicas bem conhecidas a quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo, células da linhagem de células SP20 disponíveis a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va., US). Os hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitada. Os clones de hibridoma são então analisados por métodos conhecidos na técnica para células que secretam anticorpos capazes de se ligar a UCH-L1. O líquido de ascite, que geralmente contém altos níveis de anticorpos, pode ser gerado imunizando ratos com clones de hibridoma positivos.

[0358]Em outra modalidade, hibridomas imortalizados produtores de anticorpos podem ser preparados a partir do animal imunizado. Após a imunização, o animal é sacrificado e as células B esplênicas são fundidas com células de mieloma imortalizadas, como é bem conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, acima. Em uma modalidade preferencial, as células do mieloma não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linhagem celular não secretora). Após a fusão e a seleção de antibiótico, os hibridomas são triados usando UCH-L1, ou uma porção dele, ou uma célula que expressa UCH-L1. Em uma modalidade preferencial, a triagem inicial é realizada utilizando um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA), preferencialmente um ELISA. Um exemplo de triagem ELISA é fornecido na publicação PCT No. WO 00/37504.

[0359]Os hibridomas produtores de anticorpos anti-UCH-L1 são selecionados, clonados e triados ainda quanto a características desejáveis, incluindo crescimento robusto de hibridomas, alta produção de anticorpos, e características desejáveis de anticorpos. Os hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo em animais singênicos, em animais que não têm um sistema imunológico, por exemplo, camundongos pelados, ou em cultura de células in vitro. Os métodos de seleção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos dos versados na técnica.

[0360]Em uma modalidade preferencial, os hibridomas são hibridomas de rato. Em outra modalidade, os hibridomas são produzidos em espécies não humanas e não ratos tal como camundongos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos. Ainda em outra modalidade preferencial, os hibridomas são hibridomas humanos, nos quais um mieloma não secretório humano é fundido com uma célula humana que expressa um anticorpo anti-UCH-L1.

[0361]Os fragmentos de anticorpos que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab’)2 podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tal como papaína (para produzir dois fragmentos Fab idênticos) ou pepsina (para produzir um fragmento F(ab’)2). O fragmento F(ab’)2 de uma molécula de IgG retém os dois sítios de ligação ao antígeno da molécula de IgG maior (“de origem”), incluindo ambas as cadeias leves (contendo as regiões de cadeia leve variável e de cadeia leve constante), os domínios CH1 das cadeias pesadas, e uma região de dobradiça formadora de dissulfeto da molécula de IgG de origem. Por conseguinte, um fragmento F(ab’)2 ainda é capaz de reticular moléculas de antígeno como a molécula de IgG de origem.

(2) Anticorpos monoclonais anti-UCH-L1 usando SLAM

[0362]Em outro aspecto, os anticorpos recombinantes são gerados a partir de linfócitos únicos isolados, utilizando um procedimento chamado na técnica de método de anticorpo por linfócito selecionado (SLAM), como descrito na Patente U.S. No.

5.627.052; Publicação PCT No. WO 92/02551; e Babcook e outros, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 93: 7843 a 7848 (1996). Neste método, células únicas que secretam anticorpos de interesse, por exemplo, linfócitos derivados de qualquer um dos animais imunizados, são triadas usando um ensaio de placa hemolítica específica de antígeno, em que o antígeno de UCH-L1, uma subunidade de UCH-L1 ou um fragmento do mesmo é acoplada a glóbulos vermelhos de ovelha usando um ligante, tal como biotina, e usada para identificar células únicas que secretam anticorpos com especificidade para UCH-L1. Após a identificação das células de interesse secretoras de anticorpos, os cDNAs das regiões variáveis de cadeia pesada e leve são resgatados a partir das células por transcriptase reversa-PCR (RT-PCR) e essas regiões variáveis podem então ser expressas, no contexto de regiões constantes de imunoglobulina apropriadas (por exemplo, regiões constantes humanas), em células hospedeiras de mamíferos, tal como células COS ou CHO. As células hospedeiras transfectadas com as sequências de imunoglobulina amplificada, derivadas de linfócitos selecionados in vivo, podem então ser submetidas a análise e seleção adicionais in vitro, por exemplo, aderindo as células transfectadas para isolar células que expressam anticorpos para UCH-L1. As sequências de imunoglobulina amplificada podem ainda ser manipuladas in vitro, tal como pelo método de maturação de afinidade in vitro. Ver, por exemplo, a publicação PCT No. WO 97/29131 e a Publicação PCT No. WO 00/56772.

(3) Anticorpos monoclonais anti-UCH-L1 usando animais transgênicos

[0363]Em outra modalidade, os anticorpos são produzidos pela imunização de um animal não humano compreendendo parte ou todo o locus de imunoglobulina humana com um antígeno de UCH-L1. Em uma modalidade, o animal não humano é um camundongo transgênico XENOMOUSE®, uma cepa de camundongo manipulada que compreende grandes fragmentos dos lóci de imunoglobulina humana e é deficiente na produção de anticorpos de camundongos. Ver, por exemplo, Green e outros, Nature Genetics, 7: 13 a 21 (1994) e Patentes U.S. Nos. 5.916.771, 5.939.598,

5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598, e 6.130.364. Ver também as Publicações PCT Nos. WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560, e WO 00/37504. O camundongo transgênico XENOMOUSE® produz um repertório humano semelhante a um adulto de anticorpos totalmente humanos, e gera anticorpos monoclonais humanos específicos de antígenos. O camundongo transgênico XENOMOUSE® contém cerca de 80% do repertório de anticorpos humanos através da introdução de fragmentos YAC de configuração de linhagem germinativa de tamanho de megabase dos lóci de cadeia pesada humana x lóci de cadeia leve. Ver Mendez e outros, Nature Genetics, 15: 146 a 156 (1997), Green e Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483 a 495 (1998), cujas descrições são aqui incorporadas por referência.

(4) Anticorpos monoclonais anti-UCH-L1 usando bibliotecas de anticorpos recombinantes

[0364]Os métodos in vitro também podem ser utilizados para produzir os anticorpos, em que uma biblioteca de anticorpos é triada para identificar um anticorpo tendo a especificidade de ligação a UCH-L1 desejada. Os métodos para essa triagem de bibliotecas de anticorpos recombinantes são bem conhecidos na técnica e incluem métodos descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.223.409 (Ladner e outros); Publicação PCT No. WO 92/18619 (Kang e outros); Publicação PCT No. WO 91/17271 (Dower e outros); Publicação PCT No. WO 92/20791 (Winter e outros); Publicação PCT No. WO 92/15679 (Markland e outros); Publicação PCT No. WO 93/01288 (Breitling e outros); Publicação PCT No. WO 92/01047 (McCafferty e outros); Publicação PCT No. WO 92/09690 (Garrard e outros); Fuchs e outros, Bio / Technology, 9: 1369 a 1372 (1991); Hay e outros, Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81 a 85 (1992); Huse e outros, Science, 246: 1275 a 1281 (1989); McCafferty e outros, Nature, 348: 552 a 554 (1990); Griffiths e outros, EMBO J., 12: 725 a 734 (1993); Hawkins e outros, J. Mol. Biol., 226: 889 a 896 (1992); Clackson e outros, Nature, 352: 624 a 628 (1991); Gram e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576 a 3580 (1992); Garrard e outros, Bio / Technology, 9: 1373 a 1377 (1991); Hoogenboom e outros, Nucl. Acids Res., 19: 4133 a 4137 (1991); Barbas e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978 a 7982 (1991); Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2003/0186374; e Publicação PCT No. WO 97/29131, cujo conteúdo de cada um deles é incorporado aqui por referência.

[0365]A biblioteca de anticorpos recombinantes pode ser de um indivíduo imunizado com UCH-L1 ou uma porção de UCH-L1. Alternativamente, a biblioteca de anticorpos recombinantes pode ser de um indivíduo virgem, isto é, um que não foi imunizado com UCH-L1, tal como uma biblioteca de anticorpos humanos de um indivíduo humano que não foi imunizado com UCH-L1 humano. Os anticorpos são selecionados triando-se a biblioteca de anticorpos recombinantes com o peptídeo compreendendo UCH-L1 humano para, assim, selecionar aqueles anticorpos que reconhecem UCH-L1. Os métodos para realizar tal triagem e seleção são bem conhecidos na técnica, tal como descrito nas referências no parágrafo anterior. Para selecionar anticorpos com afinidades de ligação específicas para UCH-L1, tal como aqueles que se dissociam de UCH-L1 humano com uma determinada constante de taxa de Koff, o método conhecido na técnica de ressonância plasmônica de superfície pode ser usado para selecionar anticorpos com a constante de taxa de K off desejada.

Para selecionar anticorpos com uma atividade neutralizante específica para hUCH- L1, como aqueles com uma IC50 específica, podem ser utilizados métodos padrão conhecidos na técnica para avaliar a inibição da atividade de UCH-L1.

[0366]Em um aspecto, a descrição refere-se a um anticorpo isolado, ou a uma porção de ligação ao antígeno, que se liga a UCH-L1 humano. De preferência, o anticorpo é um anticorpo neutralizante. Em várias modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante ou um anticorpo monoclonal.

[0367]Por exemplo, os anticorpos também podem ser gerados usando vários métodos de exibição de fagos conhecidos na técnica. Nos métodos de exibição de fagos, os domínios funcionais de anticorpos são exibidos na superfície das partículas de fagos que transportam as sequências polinucleotídicas que os codificam. Esse fago pode ser utilizado para exibir domínios de ligação ao antígeno expressos a partir de um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, humanos ou murinos). O fago que expressa um domínio de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, usando o antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado em uma superfície ou microesfera sólida. Os fagos usados nesses métodos são tipicamente fagos filamentosos, incluindo domínios de ligação fd e M13 expressos a partir de fago com domínios de anticorpo Fab, Fv, ou Fv estabilizado com dissulfeto fundidos de forma recombinante ao gene do fago III ou à proteína do gene VIII. Exemplos de métodos de exibição de fagos que podem ser utilizados para produzir os anticorpos incluem aqueles descritos por Brinkmann e outros, J. Immunol. Methods, 182: 41 a 50 (1995); Ames e outros, J. Immunol. Methods, 184: 177 a 186 (1995); Kettleborough e outros, Eur. J. Immunol. 24: 952 a 958 (1994); Persic e outros, Gene, 187: 9 a 18 (1997); Burton e outros, Advances in Immunology, 57: 191 a 280 (1994); Publicação PCT No. WO 92/01047; Publicações PCT Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, e Patentes U.S. Nos. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753,

5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743, e

5.969.108.

[0368]Como descrito nas referências acima, após a seleção do fago, as regiões de codificação do anticorpo a partir do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos, células vegetais, leveduras e bactérias, por exemplo, conforme descrito em detalhes abaixo. Por exemplo, as técnicas para produzir de forma recombinante os fragmentos Fab, Fab’ e F(ab’)2 também podem ser empregues usando métodos conhecidos na técnica, tal como os descritos na publicação PCT No. WO 92/22324; Mullinax e outros, BioTechniques, 12 (6): 864 a 869 (1992); Sawai e outros J. Reprod. Immunol. 34: 26 a 34 (1995); e Better e outros, Science, 240: 1041 a 1043 (1988). Exemplos de técnicas que podem ser utilizadas para produzir Fvs e anticorpos de cadeia única incluem os descritos nas Patentes U.S. Nos. 4.946.778 e 5.258.498; Huston e outros, Methods in Enzymology, 203: 46 a 88 (1991); Shu e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995 a 7999 (1993); e Skerra e outros, Science, 240: 1038 a 1041 (1988).

[0369]Alternativa à triagem de bibliotecas de anticorpos recombinantes por exibição de fagos, outras metodologias conhecidas na técnica para triagem de grandes bibliotecas combinatórias podem ser aplicadas à identificação de anticorpos.

Um tipo de sistema de expressão alternativo é aquele em que a biblioteca de anticorpos recombinantes é expressa como fusões de RNA-proteína, como descrito na Publicação PCT No. WO 98/31700 (Szostak e Roberts), e por Roberts e Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297 a 12302 (1997). Nesse sistema, uma fusão covalente é criada entre um mRNA e o peptídeo ou proteína que ele codifica por tradução in vitro de mRNAs sintéticos que transportam puromicina, um antibiótico aceitador de peptidil, na extremidade 3’. Assim, um mRNA específico pode ser enriquecido a partir de uma mistura complexa de mRNAs (por exemplo, uma biblioteca combinatória) com base nas propriedades do peptídeo ou proteína codificado, por exemplo, anticorpo ou sua porção, tal como a ligação do anticorpo ou sua porção, ao antígeno de dupla especificidade. As sequências de ácido nucleico que codificam anticorpos, ou porções dos mesmos, recuperadas a partir da triagem de tais bibliotecas podem ser expressas por meios recombinantes, como descrito acima (por exemplo, em células hospedeiras de mamíferos) e, além disso, podem ser submetidos à maturação de afinidade adicional por qualquer rodada adicional de triagem de fusões de mRNA-peptídeo em que mutações foram introduzidas na(s) sequência(s) originalmente selecionada(s) ou por outros métodos para maturação de afinidade in vitro de anticorpos recombinantes, como descrito acima. Um exemplo preferencial dessa metodologia é a tecnologia de exibição PROfusion.

[0370]Em outra abordagem, os anticorpos também podem ser gerados usando métodos de exibição de leveduras conhecidos na técnica. Nos métodos de exibição de leveduras, métodos genéticos são usados para amarrar domínios de anticorpos à parede celular de leveduras e exibi-los na superfície da levedura. Em particular, essa levedura pode ser utilizada para exibir domínios de ligação ao antígeno expressos a partir de um repertório ou de uma biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, humanos ou murinos). Exemplos de métodos de exibição de leveduras que podem ser utilizados para produzir os anticorpos incluem aqueles descritos na Patente U.S. No. 6.699.658 (Wittrup e outros) aqui incorporada por referência.

e. Produção de anticorpos de UCH-L1 recombinantes

[0371]Os anticorpos podem ser produzidos por qualquer uma de várias técnicas conhecidas. Por exemplo, expressão a partir de células hospedeiras, em que os vetores de expressão que codificam as cadeias pesada e leve são transfectados para uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo “transfecção” visam abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e similares. Embora seja possível expressar os anticorpos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas é preferencial, e mais preferencial em células hospedeiras de mamíferos, porque essas células eucarióticas (e em particular as células de mamíferos) são mais prováveis do que as células procarióticas de montar e secretar um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo.

[0372]As células hospedeiras de mamíferos exemplificativas para expressar os anticorpos recombinantes incluem células de ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas por Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 77: 4216 a 4220 (1980), usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito por Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601 a 621 (1982), células de mieloma NS0, células COS e células SP2. Quando os vetores de expressão recombinantes codificando os genes de anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando métodos padrão de purificação de proteínas.

[0373]As células hospedeiras também podem ser usadas para produzir fragmentos de anticorpos funcionais, tal como fragmentos Fab ou moléculas de scFv.

Será entendido que variações no procedimento acima podem ser realizadas. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificando fragmentos funcionais de cadeia leve e / ou de cadeia pesada de um anticorpo. A tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para remover parte ou todo o DNA que codifica uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não são necessárias para a ligação aos antígenos de interesse. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são englobadas pelos anticorpos. Além disso, podem ser produzidos anticorpos bifuncionais nos quais uma cadeia pesada e uma leve são um anticorpo (ou seja, se liga a UCH-L1 humano) e a outra cadeia pesada e leve são específicas para um antígeno que não o UCH-L1 humano, reticulando um anticorpo a um segundo anticorpo por métodos de reticulação química padrão.

[0374]Em um sistema preferencial para a expressão recombinante de um anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, um vetor de expressão recombinante que codifica a cadeia pesada do anticorpo e a cadeia leve do anticorpo é introduzido nas células dhfr-CHO por transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes das cadeias pesada e leve do anticorpo estão operacionalmente ligados aos elementos reguladores do promotor CMV / promotor AdMLP para conduzir altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando seleção / amplificação de metotrexato.

As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura. Adicionalmente, a descrição fornece um método de sintetizar um anticorpo recombinante cultivando uma célula hospedeira em um meio de cultura adequado até que um anticorpo recombinante seja sintetizado. O método pode ainda compreender isolar o anticorpo recombinante a partir do meio de cultura.

(1) Anticorpo Humanizado

[0375]O anticorpo humanizado pode ser um anticorpo ou uma variante, derivativo, análogo ou porção do mesmo que se liga imunoespecificamente a um antígeno de interesse e que compreende uma região estrutural (FR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e uma região determinante complementaridade (CDR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. O anticorpo humanizado pode ser de um anticorpo de espécie não humana que se liga ao antígeno desejado com uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana.

[0376]Como usado aqui, o termo “substancialmente” no contexto de uma CDR refere-se a uma CDR com uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácido de uma CDR de anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis (Fab, Fab’, F(ab’)2, FabC, Fv) nos quais todas ou praticamente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. De acordo com um aspecto, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém tanto a cadeia leve quanto pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões CH1, dobradiça, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizada.

Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e / ou de uma cadeia pesada.

[0377]O anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo, sem limitação, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. O anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais de uma classe ou isotipo, e domínios constantes particulares podem ser selecionados para otimizar as funções efetoras desejadas usando técnicas bem conhecidas.

[0378]As regiões de CDR e estruturais de um anticorpo humanizado não precisam corresponder exatamente às sequências de origem, por exemplo, a CDR do anticorpo doador ou a estrutura consenso pode ser mutagenizada por substituição, inserção e / ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido, de modo que que a CDR ou resíduo de estrutura naquele sítio não corresponda ao anticorpo doador ou à estrutura consenso. Em uma modalidade, essas mutações, no entanto, não serão extensivas. Normalmente, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% dos resíduos de anticorpos humanizados corresponderão aos das sequências FR e CDR de origem. Como usado aqui, o termo “estrutura consenso” refere-se à região estrutural na sequência de imunoglobulina consenso. Como usado aqui, o termo “sequência de imunoglobulina consenso” refere-se à sequência formada a partir dos aminoácidos (ou nucleotídeos) que ocorrem com mais frequência em uma família de sequências de imunoglobulinas relacionadas (ver, por exemplo, Winnaker,

From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha) 1987)). Em uma família de imunoglobulinas, cada posição na sequência consenso é ocupada pelo aminoácido que ocorre com mais frequência nessa posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem com a mesma frequência, ambos podem ser incluídos na sequência consenso.

[0379]O anticorpo humanizado pode ser designado para minimizar a resposta imunológica indesejada contra anticorpos anti-humanos de roedores, o que limita a duração e a eficácia das aplicações terapêuticas dessas porções em receptores humanos. O anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos não humanos são frequentemente chamados de resíduos de “importação”, que geralmente são obtidos a partir de um domínio variável. A humanização pode ser realizada substituindo-se as sequências da região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, esses anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Por exemplo, ver Patente U.S. No. 4.816.567, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. O anticorpo humanizado pode ser um anticorpo humano no qual alguns resíduos da região hipervariável, e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos nos anticorpos de roedores. A humanização ou engenharia de anticorpos da presente descrição pode ser realizada usando qualquer método conhecido, tal como, sem limitação, os descritos nas Patentes U.S. Nos. 5.723.323, 5.976.862, 5.824.514, 5.817.483,

5.814.476, 5.763.192, 5.723.323, 5.766.886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370,

5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.539, e 4.816.567.

[0380]O anticorpo humanizado pode reter alta afinidade para UCH-L1 e outras propriedades biológicas favoráveis. O anticorpo humanizado pode ser preparado por um processo de análise das sequências de origem e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências de origem e humanizadas.

Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comumente disponíveis.

Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências candidatas de imunoglobulina selecionadas.

A inspeção dessas exibições permite a análise da provável função dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, na análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno.

Deste modo, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptora e de importação, de modo que as características desejadas do anticorpo, tal como afinidade aumentada para UCH-L1, sejam alcançadas.

Em geral, os resíduos da região hipervariável podem estar diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.

Como uma alternativa à humanização, os anticorpos humanos (também aqui chamados de “anticorpos totalmente humanos”) podem ser gerados.

Por exemplo, é possível isolar anticorpos humanos a partir de bibliotecas através de tecnologias relacionadas com PROfusion e / ou levedura.

Também é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos capazes de, após a imunização, produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulina). Por exemplo, a deleção homozigótica da região de junção da cadeia pesada do anticorpo (o gene JH) em camundongos mutantes quiméricos e da linhagem germinativa resulta em completa inibição da produção de anticorpos endógenos.

A transferência da matriz de genes da imunoglobulina de linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante provocação do antígeno.

Os anticorpos humanizados ou totalmente humanos podem ser preparados de acordo com os métodos descritos nas patentes US 5.770.429,

5.833.985, 5.837.243, 5.922.845, 6.017.517, 6.096.311, 6.111.166, 6.270.765,

6.303.755, 6.365.116, 6.410.690, 6.682.928, e 6.984.720, são aqui incorporados por referência.

8. Métodos para medir o nível de GFAP

[0381]Nos métodos descritos acima, os níveis de GFAP podem ser medidos por qualquer meio, tal como métodos dependentes de anticorpos, tal como imunoensaios, imunoprecipitação de proteínas, imunoeletroforese, análise química, SDS-PAGE e Western blot, ou imunocoloração de proteínas, análise por eletroforese, um ensaio de proteína, um ensaio de ligação competitiva, um ensaio funcional de proteínas, ou métodos de cromatografia ou espectrometria, tal como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia líquida - espectrometria de massas (LC / MS). Além disso, o ensaio pode ser empregue no formato químico clínico ou no ensaio de detecção de molécula única, como seria conhecido por um versado na técnica.

[0382]Em algumas modalidades, a medição do nível de GFAP inclui colocar a amostra em contato com um primeiro membro de ligação específica e um segundo membro de ligação específica. Em algumas modalidades, o primeiro membro de ligação específica é um anticorpo de captura e o segundo membro de ligação específica é um anticorpo de detecção. Em algumas modalidades, medir o nível de GFAP inclui colocar a amostra em contato, simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura (por exemplo, anticorpo de captura de GFAP), que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura - antígeno de GFAP (por exemplo, complexo de anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP) e (2) pelo menos um anticorpo de detecção (por exemplo, anticorpo de detecção de GFAP), que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção (por exemplo, complexo de antígeno de GFAP - anticorpo de detecção de GFAP), de modo que pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GAP - pelo menos um anticorpo de detecção (por exemplo, complexo de anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - anticorpo de detecção de GFAP) seja formado, e medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura – antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção.

[0383]Em algumas modalidades, o primeiro membro de ligação específica é imobilizado em um suporte sólido. Em algumas modalidades, o segundo membro de ligação específica é imobilizado em um suporte sólido. Em algumas modalidades, o primeiro membro de ligação específica é um anticorpo GFAP como descrito abaixo.

[0384]Em algumas modalidades, a amostra é diluída ou não diluída. A amostra pode ser de cerca de 1 a cerca de 25 microlitros, cerca de 1 a cerca de 24 microlitros, cerca de 1 a cerca de 23 microlitros, cerca de 1 a cerca de 22 microlitros, cerca de 1 a cerca de 21 microlitros, cerca de 1 a cerca de 21 microlitros, cerca de 1 a cerca de 20 microlitros, cerca de 1 a cerca de 18 microlitros, cerca de 1 a cerca de 17 microlitros, cerca de 1 a cerca de 16 microlitros, cerca de 15 microlitros ou cerca de 1 microlitro, cerca de 2 microlitros, cerca de 3 microlitros, cerca de 4 microlitros, cerca de 5 microlitros, cerca de 6 microlitros, cerca de 7 microlitros, cerca de 8 microlitros, cerca de 9 microlitros, cerca de 10 microlitros, cerca de 11 microlitros, cerca de 12 microlitros, cerca de 13 microlitros, cerca de 14 microlitros, cerca de 15 microlitros, cerca de 16 microlitros, cerca de 17 microlitros, cerca de 18 microlitros, cerca de 19 microlitros, cerca de 20 microlitros, cerca de 21 microlitros, cerca de 22 microlitros, cerca de 23 microlitros, cerca de 24 microlitros ou cerca de 25 microlitros.

[0385]Alguns instrumentos (tal como, por exemplo, o instrumento Abbott Laboratories ARCHITECT® e outros instrumentos de laboratório), que não um dispositivo de ponto de atendimento, podem ser capazes de medir níveis de GFAP em uma amostra maior do que 50.000 pg / mL.

[0386]Outros métodos de detecção incluem o uso de, ou podem ser adaptados para uso em, um dispositivo de nanoporos ou dispositivo de nanopoços, por exemplo, para detecção de molécula única. Exemplos de dispositivos de nanoporos são descritos na Publicação de Patente Internacional No. WO 2016/161402, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Exemplos de dispositivo de nanopoços são descritos na Publicação de Patente Internacional No.

WO 2016/161400, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Outros dispositivos e métodos apropriados para a detecção de molécula única também podem ser empregues.

9. Anticorpos de GFAP

[0387]Os métodos aqui descritos podem usar um anticorpo isolado que se liga especificamente à proteína fibrilar ácida da glia (“GFAP”) (ou seus fragmentos) chamado de “anticorpo de GFAP”. Os anticorpos de GFAP podem ser usados para avaliar o estado de GFAP como uma medida de lesão cerebral traumática, detectar a presença de GFAP em uma amostra, quantificar a quantidade de GFAP presente em uma amostra, ou detectar a presença e quantificar a quantidade de GFAP em uma amostra.

a. Proteína fibrilar ácida da glia (GFAP)

[0388]A proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) é uma proteína filamentosa intracitoplasmática de 50 kDa que constitui uma porção do citoesqueleto nos astrócitos, e provou ser o marcador mais específico para células de origem astrocítica.

A proteína GFAP é codificada pelo gene GFAP em humanos. GFAP é o principal filamento intermediário de astrócitos maduros. No domínio da haste central da molécula, o GFAP compartilha considerável homologia estrutural com os outros filamentos intermediários. O GFAP está envolvido na motilidade e forma dos astrócitos, fornecendo estabilidade estrutural aos processos astrocíticos. A proteína fibrilar ácida da glia e seus produtos de degradação (GFAP-BDP) são proteínas específicas do cérebro liberadas no sangue como parte da resposta fisiopatológica após lesão cerebral traumática (LCT). Após lesão no SNC humano causada por trauma, distúrbios genéticos ou produtos químicos, os astrócitos se proliferam e mostram extensa hipertrofia do corpo e processos celulares, e o GFAP é marcadamente induzido. Em contraste, com o aumento da malignidade dos astrócitos, há uma perda progressiva da produção de GFAP. O GFAP também pode ser detectado nas células de Schwann, células da glia entérica, neoplasias da glândula salivar, carcinomas renais metastatizados, cartilagem epiglótica, hipófitos, oligodendrócitos imaturos, meningiomas papilares, e células mioepiteliais da mama.

[0389]O GFAP humano pode ter a seguinte sequência de aminoácidos:

MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRV DFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRA KEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLR LEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQV HVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLR QAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARL

EEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIR ETSLDTKSVSEGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVM (SEQ ID NO: 2).

[0390]O GFAP humano pode ser um fragmento ou variante da SEQ ID NO: 2.

O fragmento de GFAP pode estar entre 5 e 400 aminoácidos, entre 10 e 400 aminoácidos, entre 50 e 400 aminoácidos, entre 60 e 400 aminoácidos, entre 65 e 400 aminoácidos, entre 100 e 400 aminoácidos, entre 150 e 400 aminoácidos, entre 100 e 300 aminoácidos ou entre 200 e 300 aminoácidos de comprimento. O fragmento pode compreender um número contíguo de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. O fragmento de GFAP humano ou variante de SEQ ID NO: 2 pode ser um produto de quebra de GFAP (BDP). O GFAP BDP pode ser de 38 kDa, 42 kDa (mais fraco 41 kDa), 47 kDa (mais fraco 45 kDa); 25 kDa (mais fraco 23 kDa); 19 kDa ou 20 kDa.

[0391]Concluiu-se que o uso de pelo menos dois anticorpos que se ligam a epítopos não sobrepostos dentro dos produtos de decomposição de GFAP (BDP), tal como o BDP de 38 kDa definido pelos aminoácidos 60-383 da sequência da proteína GFAP (SEQ ID NO: 2), pode auxiliar a manter a faixa dinâmica e a sensibilidade final baixa dos imunoensaios. Em um aspecto, pelo menos dois anticorpos se ligam a epítopos não sobrepostos próximos ao N terminal do BDP de 38 kDa. Em outro aspecto, pelo menos dois anticorpos se ligam a epítopos não sobrepostos entre os aminoácidos 60-383 da SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, pelo menos um primeiro anticorpo (tal como um anticorpo de captura) se liga a um epítopo próximo ao N terminal do BDP de 38 kDa e pelo menos um segundo anticorpo (tal como um anticorpo de detecção) se liga a um epítopo próximo ao meio do BDP de 38 kDa que não se sobrepõe ao primeiro anticorpo. Em outro aspecto, pelo menos um primeiro anticorpo (tal como um anticorpo de captura) se liga a um epítopo entre os aminoácidos 60-383 da SEQ ID NO: 2 e pelo menos um segundo anticorpo se liga a um epítopo entre os aminoácidos 60-383 da SEQ ID NO: 2 que não se sobrepõe ao primeiro anticorpo. O epítopo ligado ao primeiro anticorpo pode ter 10 aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos ou 15 aminoácidos de comprimento. O epítopo ligado ao segundo anticorpo pode ter 10 aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos ou 15 aminoácidos de comprimento. Um versado na técnica pode determinar facilmente os anticorpos que se ligam a epítopos não sobrepostos dentro do BDP de 38 kDa definido pelos aminoácidos 60-383 da SEQ ID NO: 2 utilizando técnicas de rotina conhecidas.

[0392]Da mesma forma, é possível que outros anticorpos possam ser selecionados, o que da mesma forma pode auxiliar a manter a faixa dinâmica e a sensibilidade final baixa dos imunoensaios. Por exemplo, pode ser útil selecionar pelo menos um primeiro anticorpo (tal como um anticorpo de captura) que se liga a um epítopo próximo ao N terminal do BDP de 38 kDa e pelo menos um segundo anticorpo (tal como um anticorpo de detecção) que se liga a um epítopo próximo ao meio do BDP de 38 kDa, por exemplo, próximo ao meio do BDP de 38 kDa e que não se sobrepõe ao primeiro anticorpo. Outras variações são possíveis e podem ser prontamente testadas por um versado na técnica, tal como confirmando os anticorpos que se ligam a diferentes epítopos, examinando a ligação a peptídeos curtos e, em seguida, triando pares de anticorpos usando baixa concentração do calibrador. Além disso, a seleção de anticorpos de afinidade diferente para GFAP também pode auxiliar na manutenção ou aumento da faixa dinâmica do ensaio. Os anticorpos de GFAP foram descritos na literatura e estão disponíveis comercialmente.

b. Anticorpo de Reconhecimento de GFAP

[0393]O anticorpo é um anticorpo que se liga ao GFAP, um fragmento do mesmo, um epítopo de GFAP ou uma variante do mesmo. O anticorpo pode ser um fragmento do anticorpo anti-GFAP ou uma variante ou um derivativo do mesmo. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo de maturação de afinidade, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano ou um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fab, ou uma mistura dos mesmos. Fragmentos ou derivativos de anticorpo podem compreender fragmentos F(ab’)2, Fv ou scFv. Os derivativos de anticorpos podem ser produzidos por peptidomiméticos. Além disso, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única.

[0394]Os anticorpos anti-GFAP podem ser um anticorpo quimérico anti-GFAP ou anti-GFAP humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado e o anticorpo quimérico são monovalentes. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado e o anticorpo quimérico compreendem uma única região Fab ligada a uma região Fc.

[0395]Os anticorpos humanos podem ser derivados da tecnologia de exibição de fagos ou de camundongos transgênicos que expressam genes de imunoglobulina humana. O anticorpo humano pode ser gerado como um resultado de uma resposta imune humana in vivo e isolada. Ver, por exemplo, Funaro e outros, BMC Biotechnology, 2008 (8): 85. Portanto, o anticorpo pode ser um produto do repertório humano e não animal. Por ser de origem humana, os riscos de reatividade contra auto- antígenos podem ser minimizados. Alternativamente, podem ser utilizadas bibliotecas de exibição de leveduras e tecnologias de exibição padrão para selecionar e isolar anticorpos anti-GFAP humanos. Por exemplo, bibliotecas de fragmentos variáveis de cadeia única humana (scFv) virgens podem ser usadas para selecionar anticorpos anti-GFAP humanos. Animais transgênicos podem ser usados para expressar anticorpos humanos.

[0396]Os anticorpos humanizados podem ser moléculas de anticorpo a partir de anticorpo de espécie não humana que se liga ao antígeno desejado com uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana.

[0397]O anticorpo é distinguível dos anticorpos conhecidos pelo fato de que tem funções biológicas diferentes das conhecidas na técnica.

(1) Epítopo

[0398]O anticorpo pode se ligar imunoespecificamente ao GFAP (SEQ ID NO: 2), um fragmento do mesmo ou uma variante do mesmo. O anticorpo pode reconhecer e ligar imunoespecificamente a pelo menos três aminoácidos, pelo menos quatro aminoácidos, pelo menos cinco aminoácidos, pelo menos seis aminoácidos, pelo menos sete aminoácidos, pelo menos oito aminoácidos, pelo menos nove aminoácidos ou pelo menos dez aminoácidos dentro de uma região de epítopo. O anticorpo pode reconhecer e se ligar imunoespecificamente a um epítopo que tem pelo menos três aminoácidos contíguos, pelo menos quatro aminoácidos contíguos, pelo menos cinco aminoácidos contíguos, pelo menos seis aminoácidos contíguos, pelo menos sete aminoácidos contíguos, pelo menos oito aminoácidos contíguos, pelo menos nove aminoácidos contíguos ou pelo menos dez aminoácidos contíguos de uma região de epítopo.

c. Anticorpos Anti-GFAP Exemplificativos

[0399]Os anticorpos anti-GFAP podem ser gerados usando as técnicas descritas aqui, bem como usando técnicas de rotina conhecidas. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GFAP pode ser um anticorpo GFAP não conjugado, tal como anticorpos GFAP disponíveis a partir de Dako (Número de Catálogo: M0761), ThermoFisher Scientific (Números de Catálogo: MA5-12023, A-21282, 13-0300, MA1- 19170, MA1-19395, MA5-15086, MA5-16367, MA1-35377, MA1-06701 ou MA1- 20035), AbCam (Números de catálogo: ab10062, ab4648, ab68428, ab33922, ab207165, ab190288, ab115898 ou ab21837), EMD Millipore (Números de catálogo: FCMAB257P, MAB360, MAB3402, 04-1031, 04-1062, MAB5628), Santa Cruz (Números de catálogo: sc-166481, sc-166458, sc-58766, sc-58766, sc-56395, sc- 51908, sc-135921, sc-71143, sc-65343 ou sc-33673), Sigma-Aldrich (Números de catálogo: G3893 ou G6171) ou Sino Biological Inc. (Número de Catálogo: 100140- R012-50). O anticorpo anti-GFAP pode ser conjugado a um fluoróforo, tal como anticorpos de GFAP conjugados disponíveis a partir de ThermoFisher Scientific (Números de Catálogo: A-21295 ou A-21294), EMD Millipore (Números de Catálogo: MAB3402X, MAB3402B, MAB3402B ou MAB3402C3) ou AbCam (Números de catálogo: ab49874 ou ab194325). Outros anticorpos de GFAP que podem ser utilizados nos métodos aqui descritos incluem aqueles descritos em WO 2018/081649, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

d. Preparação / Produção de Anticorpo

[0400]Os anticorpos podem ser preparados por qualquer uma de uma variedade de técnicas, incluindo aquelas bem conhecidas dos versados na técnica.

Em geral, os anticorpos podem ser produzidos por técnicas de cultura de células, incluindo a geração de anticorpos monoclonais por meio de técnicas convencionais, ou por transfecção de genes de anticorpos, cadeias pesadas e / ou cadeias leves em hospedeiros celulares bacterianos ou de mamíferos adequados, a fim de permitir a produção de anticorpos, onde os anticorpos podem ser recombinantes. As várias formas do termo “transfecção” destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e similares. Embora seja possível expressar os anticorpos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas é preferencial e mais preferencial em células hospedeiras de mamíferos, porque essas células eucarióticas (e em particular as células de mamíferos) são mais prováveis do que as células procarióticas de montar e secretar um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo.

[0401]As células hospedeiras de mamíferos exemplificativas para expressar os anticorpos recombinantes incluem células de vário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas por Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 77: 4216 a 4220 (1980)), usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito por Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601 a 621 (1982), células de mieloma NS0, células COS e células SP2. Quando os vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando métodos padrão de purificação de proteínas.

[0402]As células hospedeiras também podem ser usadas para produzir fragmentos de anticorpos funcionais, tal como fragmentos Fab ou moléculas de scFv.

Será entendido que variações no procedimento acima podem ser realizadas. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificando fragmentos funcionais de cadeia leve e / ou de cadeia pesada de um anticorpo. A tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para remover parte ou todo o DNA codificando uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não são necessárias para a ligação aos antígenos de interesse. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são englobadas pelos anticorpos. Além disso, anticorpos bifuncionais podem ser produzidos nos quais uma cadeia pesada e uma cadeia leve são um anticorpo (ou seja, se liga ao GFAP humano) e a outra cadeia pesada e leve são específicas para um antígeno que não o GFAP humano, reticulando um anticorpo para um segundo anticorpo por métodos de reticulação química padrão.

[0403]Em um sistema preferencial para expressão recombinante de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, um vetor de expressão recombinante que codifica a cadeia pesada do anticorpo e a cadeia leve do anticorpo é introduzido nas células dhfr-CHO por transfecção mediada por fosfato de cálcio.

Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes das cadeias pesada e leve do anticorpo estão operacionalmente ligados aos elementos reguladores do promotor CMV / promotor AdMLP para conduzir altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando seleção / amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura. Adicionalmente, o método para sintetizar um anticorpo recombinante pode ser através da cultura de uma célula hospedeira em um meio de cultura adequado até que um anticorpo recombinante seja sintetizado. O método pode ainda compreender isolar o anticorpo recombinante a partir do meio de cultura.

[0404]Os métodos de preparação de anticorpos monoclonais envolvem a preparação de linhagens celulares imortais capazes de produzir anticorpos tendo a especificidade desejada. Tais linhagens celulares podem ser produzidas a partir de células do baço obtidas a partir de um animal imunizado. O animal pode ser imunizado com GFAP ou um fragmento e / ou variante do mesmo. O peptídeo utilizado para imunizar o animal pode compreender aminoácidos que codificam Fc humano, por exemplo, a região cristalizável do fragmento ou a região da cauda do anticorpo humano. As células do baço podem então ser imortalizadas, por exemplo, por fusão com um parceiro de fusão de células de mieloma. Uma variedade de técnicas de fusão pode ser empregue. Por exemplo, as células do baço e as células de mieloma podem ser combinadas com um detergente não iônico por alguns minutos e depois plaqueadas em baixa densidade em um meio seletivo que suporta o crescimento de células híbridas, mas não as células de mieloma. Uma dessas técnicas usa a seleção de hipoxantina, aminopterina, timidina (HAT). Outra técnica inclui eletrofusão. Após um tempo suficiente, geralmente cerca de 1 a 2 semanas, são observadas colônias de híbridos. Colônias únicas são selecionadas e seus sobrenadantes de cultura são testados quanto à atividade de ligação contra o polipeptídeo. Hibridomas com alta reatividade e especificidade podem ser utilizados.

[0405]Os anticorpos monoclonais podem ser isolados a partir dos sobrenadantes das colônias de hibridoma em crescimento. Além disso, várias técnicas podem ser empregues para aumentar o rendimento, tal como injeção da linhagem de células de hibridoma na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado adequado, tal como um camundongo. Os anticorpos monoclonais podem então ser colhidos a partir do líquido de ascite ou do sangue. Os contaminantes podem ser removidos dos anticorpos por técnicas convencionais, tal como cromatografia, filtração em gel, precipitação e extração. A cromatografia de afinidade é um exemplo de um método que pode ser usado em um processo para purificar os anticorpos.

[0406]A enzima proteolítica papaína cliva preferencialmente moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F(ab)) compreendem, cada um, um heterodímero covalente que inclui um sítio de ligação ao antígeno intacto. A enzima pepsina é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários fragmentos, incluindo o fragmento F(ab’)2, que compreende os dois sítios de ligação ao antígeno.

[0407]O fragmento Fv pode ser produzido por clivagem proteolítica preferencial de uma IgM e, em raras ocasiões, moléculas de imunoglobulina IgG ou IgA. O fragmento Fv pode ser derivado usando técnicas recombinantes. O fragmento Fv inclui um heterodímero VH :: VL não covalente incluindo um sítio de ligação ao antígeno que retém grande parte das capacidades de reconhecimento e ligação ao antígeno da molécula de anticorpo nativo.

[0408]O anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivativo pode compreender um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (“CDR”) de cadeia pesada e cadeia leve, respectivamente interpostas entre uma estrutura (“FR”) de cadeia pesada e de cadeia leve que fornece suporte às CDRs e define a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDRs pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve.

[0409]Outros métodos adequados de produção ou isolamento de anticorpos com a especificidade necessária podem ser utilizados, incluindo, mas não se limitados a, métodos que selecionam anticorpo recombinante a partir de uma biblioteca de peptídeos ou proteínas (por exemplo, mas não limitado a, uma biblioteca de exibição de bacteriófago, ribossomo, oligonucleotídeo, RNA, cDNA, levedura ou similar); por exemplo, conforme disponível a partir de vários fornecedores comerciais, tal como Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido), MorphoSys (Martinsreid / Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Escócia, Reino Unido) BioInvent (Lund, Suécia), usando métodos conhecidos na técnica. Ver Patentes U.S. Nos.

4.704.692, 5.723.323, 5.763.192, 5.814.476, 5.817.483, 5.824.514, 5.976.862.

Sci. USA, 95: 14130 a 14135); tecnologias de produção de anticorpos de célula única (por exemplo, método de anticorpo por linfócito selecionado (“SLAM”) (Patente US No.

Biol. Reports 19: 125 a 134 (1994)).

[0410]Um anticorpo de maturação de afinidade pode ser produzido por qualquer um de vários procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, ver Marks e outros, BioTechnology, 10: 779 a 783 (1992) que descreve maturação de afinidade por embaralhamento de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de CDR e / ou estrutura é descrita por Barbas e outros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809 a 3813 (1994); Schier e outros, Gene, 169: 147 a 155 (1995); Yelton e outros, J.

6.914.128 B1.

[0411]As variantes de anticorpo também podem ser preparadas usando a entrega de um polinucleotídeo codificando um anticorpo para um hospedeiro adequado, tal como para fornecer animais transgênicos ou mamíferos, tal como cabras, vacas, cavalos, ovelhas e similares, que produzem esses anticorpos em seu leite. Estes métodos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. Nos. 5.827.690, 5.849.992, 4.873.316, 5.849.992, 5.994.616,

5.565.362, e 5.304.489.

[0412]As variantes de anticorpos também podem ser preparadas pela entrega de um polinucleotídeo para fornecer plantas transgênicas e células vegetais cultivadas (por exemplo, mas não se limitadas a tabaco, milho e lentilha) que produzem esses anticorpos, porções ou variantes especificadas nas partes da planta ou em células cultivadas a partir delas. Por exemplo, Cramer e outros (1999) Curr. Top. Microbiol.

Immunol. 240: 95 a 118 e referências aqui citadas, descrevem a produção de folhas de tabaco transgênicas que expressam grandes quantidades de proteínas recombinantes, por exemplo, usando um promotor induzível. O milho transgênico tem sido utilizado para expressar proteínas de mamíferos em níveis de produção comercial, com atividades biológicas equivalentes às produzidas em outros sistemas recombinantes ou purificadas a partir de fontes naturais. Ver, por exemplo, Hood e outros, Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464: 127 a 147 e referências aqui citadas. As variantes de anticorpos também foram produzidas em grandes quantidades a partir de sementes de plantas transgênicas, incluindo fragmentos de anticorpos, tal como anticorpos de cadeia única (scFv’s), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. Ver, por exemplo, Conrad e outros (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101 a 109 e referência aqui citada. Assim, os anticorpos também podem ser produzidos usando plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos.

[0413]Os derivativos de anticorpo podem ser produzidos, por exemplo, adicionando sequências exógenas para modificar a imunogenicidade ou reduzir, aprimorar ou modificar a ligação, afinidade, taxa de associação, taxa de dissociação, avidez, especificidade, meia-vida ou qualquer outra característica adequada.

[0414]Pequenos fragmentos de anticorpo podem ser diacorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, em que os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH VL). Ver, por exemplo, EP 404.097, WO 93/11161; e Hollinger e outros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Ao usar um ligante muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Ver também a Patente U.S. No.

6.632.926 de Chen e outros que é aqui incorporada por referência em sua totalidade e descreve variantes de anticorpos que têm um ou mais aminoácidos inseridos em uma região hipervariável do anticorpo de origem e uma afinidade de ligação a um antígeno alvo que é pelo menos cerca de duas vezes mais forte do que a afinidade de ligação do anticorpo de origem ao antígeno.

[0415]O anticorpo pode ser um anticorpo linear. O procedimento para fabricar um anticorpo linear é conhecido na técnica e descrito por Zapata e outros (1995) Protein Eng. 8 (10): 1057 a 1062. Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[0416]Os anticorpos podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por métodos conhecidos, incluindo, entre outros, purificação de proteína A, precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração ácida, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita, e cromatografia de lectina. A cromatografia líquida de alto desempenho (“HPLC”) também pode ser usada para purificação.

[0417]Pode ser útil marcar de forma detectável o anticorpo. Os métodos para conjugar anticorpos a esses agentes são conhecidos na técnica. Apenas para fins ilustrativos, os anticorpos podem ser marcados com uma porção detectável, tal como um átomo radioativo, um cromóforo, um fluoróforo ou similar. Tais anticorpos marcados podem ser utilizados para técnicas de diagnóstico, in vivo ou em uma amostra de teste isolada. Eles podem ser ligados a uma citocina, a um ligando, a outro anticorpo. Agentes adequados para acoplamento a anticorpos para obter um efeito antitumoral incluem citocinas, tal como interleucina 2 (IL-2) e fator de necrose tumoral (TNF); fotossensibilizadores, para uso em terapia fotodinâmica, incluindo tetrassulfonato de ftalocianina de alumínio (III), hematoporfirina e ftalocianina; radionuclídeos, tal como iodo-131 (131I), ítrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto- 213 (213Bi), tecnécio-99m (99mTc), rênio-186 (186Re) e rênio-188 (188Re); antibióticos tal como doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina e carboplatina; toxinas bacterianas, vegetais e outras, tal como toxina da difteria, pseudomonas exotoxina A, enterotoxina estafilocócica A,

toxina abrina-A, ricina A (ricina desglicosilada A e ricina nativa A), toxina TGF-alfa, citotoxina de cobra chinesa (naja naja atra) e gelonina (uma toxina vegetal); proteínas de inativação de ribossomos de plantas, bactérias e fungos, tal como restrinocina (uma proteína de inativação de ribossomos produzida por Aspergillus restritus), saporina (uma proteína de inativação de ribossomos de Saponaria officinalis), e RNase; inibidores de tirosina quinase; ly207702 (um nucleosídeo de purina difluorado); lipossomas contendo agentes anti-císticos (por exemplo, oligonucleotídeos antissenso, plasmídeos que codificam toxinas, metotrexato, etc.); e outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, tal como F(ab).

[0418]A produção de anticorpos através do uso da tecnologia de hibridoma, o método de anticorpo por linfócito selecionado (SLAM), animais transgênicos e bibliotecas de anticorpos recombinantes é descrita em mais detalhes abaixo.

(1) Anticorpos monoclonais anti-GFAP usando a tecnologia de hibridoma

[0419]Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas, incluindo o uso de hibridoma, tecnologias de exibição recombinante e de fagos, ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma, incluindo as conhecidas na técnica, e descritos, por exemplo, por Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Manual, segunda edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling e outros, In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981). Também é observado que o termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado aqui, não está limitado aos anticorpos produzidos pela tecnologia de hibridoma. O termo “anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo que é derivativo de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou fago, e não o método pelo qual é produzido.

[0420]Métodos de geração de anticorpos monoclonais, bem como anticorpos produzidos pelo método, podem compreender a cultura de uma célula de hibridoma secretando um anticorpo em que, preferencialmente, o hibridoma é gerado pela fusão de esplenócitos isolados a partir de um animal, por exemplo, um rato ou camundongo, imunizados com GFAP com células de mieloma e depois triando os hibridomas resultantes da fusão para clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de se ligar a um polipeptídeo. Resumidamente, os ratos podem ser imunizados com um antígeno de GFAP. Em uma modalidade preferencial, o antígeno de GFAP é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Tais adjuvantes incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídeos de muramil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Esses adjuvantes podem proteger o polipeptídeo da rápida dispersão sequestrando-o em um depósito local, ou podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imunológico. De preferência, se um polipeptídeo estiver sendo administrado, o esquema de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipeptídeo, espalhadas por várias semanas; no entanto, uma única administração do polipeptídeo também pode ser usada.

[0421]Após a imunização de um animal com um antígeno de GFAP, anticorpos e / ou células produtoras de anticorpos podem ser obtidos a partir do animal. Um soro contendo anticorpo anti-GFAP é obtido a partir do animal sangrando ou sacrificando o animal. O soro pode ser utilizado como é obtido a partir do animal, uma fração de imunoglobulina pode ser obtida a partir do soro ou os anticorpos anti- GFAP podem ser purificados a partir do soro. O soro ou imunoglobulinas obtidas desta maneira são policlonais, tendo assim um conjunto heterogêneo de propriedades.

[0422]Uma vez que uma resposta imune é detectada, por exemplo, anticorpos específicos para o antígeno de GFAP são detectados no soro de rato, o baço do rato é colhido e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos por técnicas bem conhecidas a quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo, células da linhagem celular SP20 disponíveis a partir de American Type Culture Collection

(ATCC, Manassas, Va., US). Os hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitada. Os clones de hibridoma são então analisados por métodos conhecidos na técnica para células que secretam anticorpos capazes de se ligar a GFAP. O líquido de ascite, que geralmente contém altos níveis de anticorpos, pode ser gerado imunizando ratos com clones de hibridoma positivos.

[0423]Em outra modalidade, hibridomas imortalizados produtores de anticorpos podem ser preparados a partir do animal imunizado. Após a imunização, o animal é sacrificado e as células B esplênicas são fundidas com células de mieloma imortalizadas, como é bem conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, acima. Em uma modalidade preferencial, as células de mieloma não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linhagem celular não secretora). Após a fusão e a seleção de antibióticos, os hibridomas são triados usando GFAP, ou uma porção dele, ou uma célula que expressa GFAP. Em uma modalidade preferencial, a triagem inicial é realizada utilizando um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA), preferencialmente um ELISA. Um exemplo de triagem ELISA é fornecido na publicação PCT No. WO 00/37504.

[0424]Os hibridomas produtores de anticorpos anti-GFAP são selecionados, clonados e rastreados ainda quanto a características desejáveis, incluindo crescimento robusto de hibridoma, alta produção de anticorpos, e características desejáveis de anticorpos. Os hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo em animais singênicos, em animais que não têm um sistema imunológico, por exemplo, camundongos pelados ou em cultura de células in vitro. Os métodos de seleção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos dos versados na técnica.

[0425]Em uma modalidade preferencial, os hibridomas são hibridomas de rato. Em outra modalidade, os hibridomas são produzidos em espécies não humanas e não de ratos, tal como camundongos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos.

Ainda em outra modalidade preferencial, os hibridomas são hibridomas humanos, nos quais um mieloma não secretório humano é fundido com uma célula humana que expressa um anticorpo anti-GFAP.

[0426]Os fragmentos de anticorpos que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab’)2 podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tal como papaína (para produzir dois fragmentos Fab idênticos) ou pepsina (para produzir um fragmento F(ab’)2). O fragmento F(ab’)2 de uma molécula de IgG retém os dois sítios de ligação ao antígeno da molécula de IgG maior (“de origem”), incluindo as duas cadeias leves (contendo as regiões variáveis de cadeia leve e constantes de cadeia leve), os domínios CH1 das cadeias pesadas, e uma região de dobradiça formadora de dissulfeto da molécula de IgG de origem. Por conseguinte, um fragmento F(ab’)2 ainda é capaz de reticular moléculas de antígeno como a molécula de IgG de origem.

(2) Anticorpos monoclonais anti-GFAP usando SLAM

[0427]Em outro aspecto, os anticorpos recombinantes são gerados a partir de linfócitos isolados únicos, usando um procedimento chamado na técnica de método de anticorpo por linfócito selecionado (SLAM), como descrito na Patente US No.

Sci. USA, 93: 7843 a 7848 (1996). Neste método, células únicas que secretam anticorpos de interesse, por exemplo, linfócitos derivativos de qualquer um dos animais imunizados são triados usando um ensaio de placa hemolítica específica de antígeno, em que o antígeno de GFAP, uma subunidade de GFAP ou um fragmento do mesmo é acoplado a glóbulos vermelhos de ovelhas usando um ligante, tal como biotina, e usado para identificar células únicas que secretam anticorpos com especificidade para GFAP. Após a identificação das células de interesse secretoras de anticorpos, os cDNAs das regiões variáveis de cadeia pesada e leve são resgatados a partir das células por transcriptase reversa-PCR (RT-PCR) e essas regiões variáveis podem então ser expressas, no contexto de regiões constantes de imunoglobulina apropriadas (por exemplo, regiões constantes humanas), em células hospedeiras de mamíferos, tal como células COS ou CHO. As células hospedeiras transfectadas com as sequências de imunoglobulina amplificada, derivadas de linfócitos selecionados in vivo, podem então ser submetidas a análises e seleção adicionais in vitro, por exemplo, aderindo as células transfectadas para isolar células que expressam anticorpos para GFAP. As sequências de imunoglobulina amplificada podem ainda ser manipuladas in vitro, tal como pelo método de maturação de afinidade in vitro. Ver, por exemplo, a Publicação PCT No. WO 97/29131 e a Publicação PCT No. WO 00/56772.

(3) Anticorpos monoclonais anti-GFAP usando animais transgênicos

[0428]Em outra modalidade, os anticorpos são produzidos pela imunização de um animal não humano compreendendo parte ou todo o locus de imunoglobulina humana com um antígeno de GFAP. Em uma modalidade, o animal não humano é um camundongo transgênico XENOMOUSE®, uma cepa de camundongo manipulada que compreende grandes fragmentos dos lóci de imunoglobulina humana e é deficiente na produção de anticorpos em camundongos. Ver, por exemplo, Green e outros, Nature Genetics, 7: 13 a 21 (1994) e Patentes U.S. Nos. 5.916.771, 5.939.598,

5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598, e 6.130.364. Ver também as Publicações PCT Nos. WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560, e WO 00/37504. O camundongo transgênico XENOMOUSE® produz um repertório humano tipo adulto de anticorpos totalmente humanos, e gera anticorpos monoclonais humanos específicos de antígenos. O camundongo transgênico XENOMOUSE® contém cerca de 80% do repertório de anticorpos humanos através da introdução de fragmentos YAC de configuração de linhagem germinativa de tamanho de megabase dos lóci de cadeia pesada humana x lóci de cadeia leve. Ver Mendez e outros, Nature Genetics, 15: 146 a 156 (1997), Green e Jakobovits, J. Exp.

Med. 188: 483 a 495 (1998), cujas descrições são aqui incorporadas por referência.

(4) Anticorpos monoclonais anti-GFAP usando bibliotecas de anticorpos recombinantes

[0429]Os métodos in vitro também podem ser usados para produzir os anticorpos, em que uma biblioteca de anticorpos é triada para identificar um anticorpo tendo a especificidade de ligação a GFAP desejada. Os métodos para essa triagem de bibliotecas de anticorpos recombinantes são bem conhecidos na técnica e incluem métodos descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.223.409 (Ladner e outros); Publicação PCT No. WO 92/18619 (Kang e outros); Publicação PCT No. WO 91/17271 (Dower e outros); Publicação PCT No. WO 92/20791 (Winter e outros); Publicação PCT No. WO 92/15679 (Markland e outros); Publicação PCT No. WO 93/01288 (Breitling e outros); Publicação PCT No. WO 92/01047 (McCafferty e outros); Publicação PCT No. WO 92/09690 (Garrard e outros); Fuchs e outros, Bio / Technology, 9: 1369 a 1372 (1991); Hay e outros, Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81 a 85 (1992); Huse e outros, Science, 246: 1275 a 1281 (1989); McCafferty e outros, Nature, 348: 552 a 554 (1990); Griffiths e outros, EMBO J., 12: 725 a 734 (1993); Hawkins e outros, J. Mol. Biol., 226: 889 a 896 (1992); Clackson e outros, Nature, 352: 624 a 628 (1991); Gram e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576 a 3580 (1992); Garrard e outros, Bio / Technology, 9: 1373 a 1377 (1991); Hoogenboom e outros, Nucl. Acids Res., 19: 4133 a 4137 (1991); Barbas e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978 a 7982 (1991); Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2003/0186374; e Publicação PCT No. WO 97/29131, cujo conteúdo de cada um deles é incorporado aqui por referência.

[0430]A biblioteca de anticorpos recombinantes pode ser a partir de um indivíduo imunizado com GFAP ou uma porção de GFAP. Alternativamente, a biblioteca de anticorpos recombinantes pode ser de um indivíduo virgem, isto é, um que não foi imunizado com GFAP, tal como uma biblioteca de anticorpos humanos de um indivíduo humano que não foi imunizado com GFAP humano. Os anticorpos são selecionados triando a biblioteca de anticorpos recombinantes com o peptídeo compreendendo GFAP humano para selecionar, assim, aqueles anticorpos que reconhecem GFAP. Os métodos para realizar essa triagem e seleção são bem conhecidos na técnica, como descrito nas referências no parágrafo anterior. Para selecionar anticorpos com afinidades de ligação particulares ao GFAP, como aqueles que se dissociam do GFAP humano com uma constante de taxa Koff específica, o método conhecido na técnica de ressonância plasmônica de superfície pode ser usado para selecionar anticorpos com a constante de taxa de K off desejada. Para selecionar anticorpos com uma atividade neutralizante específica para hGFAP, tal como aqueles com uma IC50 específica, podem ser utilizados métodos padrão conhecidos na técnica para avaliar a inibição da atividade de GFAP.

[0431]Em um aspecto, a descrição refere-se a um anticorpo isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao GFAP humano. De preferência, o anticorpo é um anticorpo neutralizante. Em várias modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante ou um anticorpo monoclonal.

[0432]Por exemplo, os anticorpos também podem ser gerados usando vários métodos de exibição de fagos conhecidos na técnica. Nos métodos de exibição de fagos, os domínios funcionais de anticorpos são apresentados na superfície das partículas de fagos que transportam as sequências polinucleotídicas que os codificam.

Esse fago pode ser utilizado para exibir domínios de ligação ao antígeno expressos a partir de um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, humanos ou murinos). O fago que expressa um domínio de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, usando o antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado em uma superfície ou microesfera sólida. Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos, incluindo domínios de ligação fd e M13 expressos a partir de fagos com domínios de anticorpo Fab, Fv, ou Fv estabilizado com dissulfeto, fundidos de forma recombinante ao gene de fago III ou à proteína de gene VIII. Exemplos de métodos de exibição de fagos que podem ser utilizados para produzir os anticorpos incluem aqueles descritos por Brinkmann e outros, J. Immunol. Methods, 182: 41 a 50 (1995); Ames e outros, J. Immunol. Methods, 184: 177 a 186 (1995); Kettleborough e outros, Eur. J. Immunol. 24: 952 a 958 (1994); Persic e outros, Gene, 187: 9 a 18 (1997); Burton e outros, Advances in Immunology, 57: 191 a 280 (1994); Publicação PCT No. WO 92/01047; Publicações PCT Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, e Patentes U.S. Nos. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753,

5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743, e

5.969.108.

[0433]Como descrito nas referências acima, após a seleção do fago, as regiões codificadoras de anticorpos do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos, células vegetais, leveduras e bactérias, por exemplo, conforme descrito em detalhes abaixo. Por exemplo, técnicas para produzir de forma recombinante os fragmentos Fab, Fab’ e F(ab’) 2 também podem ser empregues usando métodos conhecidos na técnica, como os descritos na publicação PCT No. WO 92/22324; Mullinax e outros, BioTechniques, 12 (6): 864 a 869 (1992); Sawai e outros J. Reprod. Immunol. 34: 26 a 34 (1995); e Better e outros, Science, 240: 1041 a 1043 (1988). Exemplos de técnicas que podem ser utilizadas para produzir Fvs e anticorpos de cadeia única incluem os descritos nas Patentes U.S.

Nos. 4.946.778 e 5.258.498; Huston e outros, Methods in Enzymology, 203: 46 a 88

(1991); Shu e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995 a 7999 (1993); e Skerra e outros, Science, 240: 1038 a 1041 (1988).

[0434]Alternativa à triagem de bibliotecas de anticorpos recombinantes por exibição em fagos, outras metodologias conhecidas na técnica para triagem de grandes bibliotecas combinatórias podem ser aplicadas à identificação de anticorpos.

Um tipo de sistema de expressão alternativo é aquele em que a biblioteca de anticorpos recombinantes é expressa como fusões de RNA-proteína, como descrito na Publicação PCT No. WO 98/31700 (Szostak e Roberts), e por Roberts e Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297 a 12302 (1997). Nesse sistema, uma fusão covalente é criada entre um mRNA e o peptídeo ou proteína que ele codifica por tradução in vitro de mRNAs sintéticos que transportam puromicina, um antibiótico aceitador de peptidil, na extremidade 3’. Assim, um mRNA específico pode ser enriquecido a partir de uma mistura complexa de mRNAs (por exemplo, uma biblioteca combinatória) com base nas propriedades do peptídeo ou proteína codificada, por exemplo, anticorpo ou sua porção, tal como a ligação do anticorpo ou sua porção, ao antígeno de dupla especificidade. As sequências de ácido nucleico que codificam anticorpos, ou porções dos mesmos, recuperadas a partir da triagem de tais bibliotecas podem ser expressas por meios recombinantes, como descrito acima (por exemplo, em células hospedeiras de mamíferos) e, além disso, podem ser submetidos à maturação de afinidade adicional por qualquer rodada adicional de triagem de fusões de mRNA-peptídeo em que mutações foram introduzidas na(s) sequência(s) originalmente selecionada(s) ou por outros métodos para maturação de afinidade in vitro de anticorpos recombinantes, como descrito acima. Um exemplo preferencial dessa metodologia é a tecnologia de exibição PROfusion.

[0435]Em outra abordagem, os anticorpos também podem ser gerados usando métodos de exibição de leveduras conhecidos na técnica. Nos métodos de exibição de leveduras, métodos genéticos são usados para amarrar domínios de anticorpos à parede celular de leveduras e exibi-los na superfície da levedura. Em particular, essa levedura pode ser utilizada para exibir domínios de ligação ao antígeno expressos a partir de um repertório ou de uma biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, humanos ou murinos). Exemplos de métodos de exibição de leveduras que podem ser utilizados para produzir os anticorpos incluem aqueles descritos na Patente U.S. No. 6.699.658 (Wittrup e outros) aqui incorporada por referência.

e. Produção de anticorpos de GFAP recombinantes

[0436]Os anticorpos podem ser produzidos por qualquer uma de várias técnicas conhecidas. Por exemplo, expressão a partir de células hospedeiras, em que os vetores de expressão que codificam as cadeias pesada e leve são transfectados para uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo “transfecção” visam abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e similares. Embora seja possível expressar os anticorpos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas é preferencial, e mais preferencial em células hospedeiras de mamíferos, porque essas células eucarióticas (e em particular as células de mamíferos) são mais prováveis do que as células procarióticas de montar e secretar um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo.

[0437]As células hospedeiras de mamíferos exemplificativas para expressar os anticorpos recombinantes incluem células de ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas por Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 77: 4216 a 4220 (1980), usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito por Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601 a 621 (1982), células de mieloma NS0, células COS e células SP2. Quando os vetores de expressão recombinantes que codificam os genes de anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando métodos padrão de purificação de proteínas.

[0438]As células hospedeiras também podem ser usadas para produzir fragmentos de anticorpos funcionais, tal como fragmentos Fab ou moléculas de scFv.

Entende-se que variações no procedimento acima podem ser realizadas. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificando fragmentos funcionais da cadeia leve e / ou da cadeia pesada de um anticorpo. A tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para remover parte ou todo o DNA que codifica uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não são necessárias para a ligação aos antígenos de interesse. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são englobadas pelos anticorpos. Além disso, anticorpos bifuncionais podem ser produzidos nos quais uma cadeia pesada e uma cadeia leve são um anticorpo (ou seja, se liga ao GFAP humano) e a outra cadeia pesada e leve são específicas para um antígeno que não o GFAP humano, reticulando um anticorpo para um segundo anticorpo por métodos de reticulação química padrão.

[0439]Em um sistema preferencial para a expressão recombinante de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno, um vetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada do anticorpo quanto a cadeia leve do anticorpo é introduzido nas células dhfr-CHO por transfecção mediada por fosfato de cálcio.

Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes das cadeias pesada e leve do anticorpo estão operacionalmente ligados aos elementos reguladores do promotor CMV / promotor AdMLP para conduzir altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando seleção / amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras, e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura. Adicionalmente, a descrição fornece um método para sintetizar um anticorpo recombinante cultivando uma célula hospedeira em um meio de cultura adequado até que um anticorpo recombinante seja sintetizado.

O método pode ainda compreender isolar o anticorpo recombinante a partir do meio de cultura.

(1) Anticorpo Humanizado

[0440]O anticorpo humanizado pode ser um anticorpo ou uma variante, derivativo, análogo ou porção do mesmo que se liga imunoespecificamente a um antígeno de interesse e que compreende uma região estrutural (FR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e uma região determinante de complementaridade (CDR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. O anticorpo humanizado pode ser de um anticorpo de espécie não humana que se liga ao antígeno desejado tendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana.

[0441]Como usado aqui, o termo “substancialmente” no contexto de uma CDR refere-se a uma CDR tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de uma CDR de anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis (Fab, Fab’, F(ab’)2, FabC, Fv) nos quais todas ou praticamente todas as regiões CDR correspondem às de uma região de imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. De acordo com um aspecto, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém tanto a cadeia leve quanto pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões CH1, dobradiça, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada.

Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e / ou de uma cadeia pesada.

[0442]O anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo, sem limitação, IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. O anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais de uma classe ou isotipo, e domínios constantes particulares podem ser selecionados para otimizar as funções efetoras desejadas usando técnicas bem conhecidas.

[0443]As regiões CDR e estruturais de um anticorpo humanizado não precisam corresponder precisamente às sequências de origem, por exemplo, a CDR do anticorpo doador ou a estrutura consenso pode ser mutagenizada por substituição, inserção e / ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido, de modo que que a CDR ou resíduo de estrutura naquele sítio não corresponde ao anticorpo doador ou à estrutura consenso. Em uma modalidade, essas mutações, no entanto, não serão extensivas. Normalmente, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% dos resíduos de anticorpos humanizados corresponderão aos das sequências FR e CDR de origem. Como usado aqui, o termo “estrutura consenso” refere-se à região estrutural na sequência de imunoglobulina consenso. Como usado aqui, o termo “sequência de imunoglobulina consenso” refere-se à sequência formada a partir dos aminoácidos (ou nucleotídeos) que ocorrem com mais frequência em uma família de sequências de imunoglobulinas relacionadas (ver, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha) 1987)). Em uma família de imunoglobulinas, cada posição na sequência consenso é ocupada pelo aminoácido que ocorre com mais frequência nessa posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem com a mesma frequência, ambos podem ser incluídos na sequência consenso.

[0444]O anticorpo humanizado pode ser designado para minimizar a resposta imunológica indesejada contra anticorpos anti-humanos de roedores, o que limita a duração e a eficácia das aplicações terapêuticas dessas porções em receptores humanos. O anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos não humanos são frequentemente chamados de resíduos de “importação”, que geralmente são obtidos a partir de um domínio variável. A humanização pode ser realizada substituindo sequências da região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, esses anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente a partir de uma espécie não humana. Por exemplo, ver Patente U.S. No. 4.816.567, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. O anticorpo humanizado pode ser um anticorpo humano no qual alguns resíduos da região hipervariável, e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos nos anticorpos de roedores. A humanização ou engenharia de anticorpos da presente descrição pode ser realizada usando qualquer método conhecido, tal como, sem limitação, os descritos nas Patentes U.S. Nos. 5.723.323, 5.976.862, 5.824.514, 5.817.483,

5.814.476, 5.763.192, 5.723.323, 5.766.886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370,

5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.539, e 4.816.567.

[0445]O anticorpo humanizado pode reter alta afinidade para GFAP e outras propriedades biológicas favoráveis. O anticorpo humanizado pode ser preparado por um processo de análise das sequências de origem e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências de origem e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comumente disponíveis. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências candidatas de imunoglobulina selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise da provável função dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno. Deste modo, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptora e de importação, para que sejam alcançadas as características desejadas do anticorpo, como maior afinidade para GFAP. Em geral, os resíduos da região hipervariável podem estar direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.

[0446]Como uma alternativa à humanização, os anticorpos humanos (também aqui chamados de “anticorpos totalmente humanos”) podem ser gerados. Por exemplo, é possível isolar anticorpos humanos a partir de bibliotecas através de tecnologias relacionadas com PROfusion e / ou levedura. Também é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos que são capazes, após a imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, a deleção homozigótica da região de junção da cadeia pesada (JH) do anticorpo em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta em completa inibição da produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz de genes da imunoglobulina humana da linhagem germinativa nesses camundongos mutantes de linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos por provocação de antígeno. Os anticorpos totalmente humanos ou humanizados podem ser preparados de acordo com os métodos descritos nas patentes US 5.770.429, 5.833.985, 5.837.243,

5.922.845, 6.017.517, 6.096.311, 6.111.166, 6.270.765, 6.303.755, 6.365.116,

6.410.690, 6.682.928, e 6.984.720; aqui incorporadas por referência.

10. Variações nos métodos

[0447]Os métodos descritos para determinar a presença ou quantidade dos analitos de interesse (UCH-L1 e GFAP) presentes em uma amostra podem ser como aqui descritos. Os métodos também podem ser adaptados em vista de outros métodos para analisar analitos. Exemplos de variações bem conhecidas incluem, mas não estão limitados a, imunoensaio, tal como imunoensaio tipo sanduíche (por exemplo, imunoensaios tipo sanduíche monoclonal-monoclonal, imunoensaios tipo sanduíche monoclonal-policlonal, incluindo detecção enzimática (imunoensaio enzimático (EIA) ou ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA)), imunoensaio de inibição competitiva (por exemplo, frente e verso), técnica de imunoensaio multiplicado por enzima (EMIT), um ensaio de ligação competitiva, transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET), ensaio de detecção de anticorpos em uma etapa, ensaio homogêneo, ensaio heterogêneo, captura ensaio em tempo real, ensaio de detecção de molécula única, etc.

a. Imunoensaio

[0448]Os analitos de interesse e peptídeos de seus fragmentos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP e / ou peptídeos ou fragmentos dos mesmos, isto é, fragmentos de UCH-L1 e / ou GFAP), podem ser analisados usando anticorpos de UCH-L1 e de

GFAP em um imunoensaio. A presença ou quantidade de analitos (por exemplo, UCH- L1 e GFAP) pode ser determinada usando anticorpos e detectando ligação específica aos analitos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP). Por exemplo, o anticorpo, ou seu fragmento de anticorpo, pode se ligar especificamente aos analitos (por exemplo, UCH-L1 e / ou GFAP). Se desejado, um ou mais dos anticorpos podem ser utilizados em combinação com um ou mais anticorpos monoclonais / policlonais disponíveis comercialmente. Tais anticorpos estão disponíveis a partir de empresas tal como R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) e Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, PA).

[0449]A presença ou quantidade de analitos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) presentes em uma amostra corporal pode ser prontamente determinada usando um imunoensaio, tal como imunoensaio tipo sanduíche (por exemplo, imunoensaios tipo sanduíche monoclonal-monoclonal, imunoensaios tipo sanduíche monoclonal- policlonal, incluindo detecção de radioisótopos (radioimunoensaio (RIA)) e detecção enzimática (imunoensaio enzimático (EIA) ou ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) (por exemplo, ensaios Quantikine ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN)).

O dispositivo de tratamento que pode ser usado é o i-STAT® (Abbott, Laboratories, Abbott Park, IL). Outros métodos que podem ser utilizados incluem um imunoensaio quimioluminescente de micropartículas, em particular aquele que utiliza o analisador automático ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) como um exemplo.

Outros métodos incluem, por exemplo, espectrometria de massas, e imuno- histoquímica (por exemplo, com seções de biópsias de tecidos), usando anticorpos anti-analitos (por exemplo, anti-UCH-L1 e anti-GFAP) (monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado, humano, etc.) ou seus fragmentos de anticorpos contra os analitos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP). Outros métodos de detecção incluem os descritos, por exemplo, nas patentes US Nos. 6,143,576, 6.113.855, 6.019.944,

5.985.579, 5.947.124, 5.939.272, 5.922.615, 5.885.527, 5.851.776, 5.824.799,

5.679.526, 5.525.524, e 5.480.792, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade. A ligação imunológica específica do anticorpo com o analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) pode ser detectada por meio de marcadores diretas, tal como marcadores fluorescentes ou luminescentes, metais e radionuclídeos ligados ao anticorpo ou por marcadores indiretos, tal como fosfatase alcalina ou rábano peroxidase.

[0450]O uso de anticorpos imobilizados ou seus fragmentos de anticorpos pode ser incorporado no imunoensaio. Os anticorpos podem ser imobilizados em uma variedade de suportes, tais como partículas da matriz magnética ou cromatográfica, a superfície de uma placa de ensaio (tal como poços de microtitulação), pedaços de um material de substrato sólido e similares. Uma tira de ensaio pode ser preparada revestindo o anticorpo ou a pluralidade de anticorpos em uma matriz em um suporte sólido. Essa tira pode ser mergulhada na amostra de teste e processada rapidamente através de etapas de lavagem e detecção para gerar um sinal mensurável, tal como um ponto colorido.

[0451]Um formato homogêneo pode ser usado. Por exemplo, após a amostra de teste ser obtida a partir de um indivíduo, uma mistura é preparada. A mistura contém a amostra de teste que está sendo avaliada para os analitos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP), um primeiro parceiro de ligação específica e um segundo parceiro de ligação específica. A ordem na qual a amostra de teste, o primeiro parceiro de ligação específica e o segundo parceiro de ligação específica são adicionados para formar a mistura não é crucial. A amostra de teste é simultaneamente colocada em contato com o primeiro parceiro de ligação específica e o segundo parceiro de ligação específica. Em algumas modalidades, o primeiro parceiro de ligação específica e qualquer UCH-L1 ou GFAP contido na amostra de teste podem formar um complexo de antígeno primeiro parceiro de ligação específica - analito de interesse (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) - segundo parceiro de ligação específica. Em algumas modalidades, o segundo parceiro de ligação específica e qualquer UCH-L1 e / ou GFAP contido na amostra de teste podem formar um complexo de segundo parceiro de ligação específica - analito (por exemplo, UCH-L1) – antígeno e o primeiro parceiro de ligação específica pode formar um complexo de primeiro parceiro de ligação específica - analito de interesse (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) - segundo parceiro de ligação específica. O primeiro parceiro de ligação específica pode ser um anticorpo anti-analito (por exemplo, anticorpo anti-UCH-L1 que se liga a um epítopo tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos (3) três aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou anticorpo anti-GFAP que se liga a um epítopo tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos (3) três aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2). O segundo parceiro de ligação específica pode ser um anticorpo anti-analito (por exemplo, anticorpo anti-UCH-L1 que se liga a um epítopo tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos (3) três aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou anticorpo anti-GFAP que se liga a um epítopo tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos três (3) aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2). Além disso, o segundo parceiro de ligação específica é marcado com ou contém um marcador detectável como descrito acima.

[0452]Um formato heterogêneo pode ser usado. Por exemplo, após a amostra de teste ser obtida a partir de um indivíduo, uma primeira mistura é preparada. A mistura contém a amostra de teste que está sendo avaliada para os analitos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) e um primeiro parceiro de ligação específica, em que o primeiro parceiro de ligação específica e qualquer UCH-L1 ou GFAP contido na amostra de teste formam um complexo de primeiro parceiro de ligação específica – antígeno analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP). O primeiro parceiro de ligação específica pode ser um anticorpo anti-analito (por exemplo, anticorpo anti-UCH-L1 que se liga a um epítopo tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos (3) três aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou anticorpo anti-GFAP que se liga a um epítopo tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos (3) três aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2). A ordem na qual a amostra de teste e o primeiro parceiro de ligação específica são adicionados para formar a mistura não é crucial.

[0453]O primeiro parceiro de ligação específica pode ser imobilizado em uma fase sólida. A fase sólida usada no imunoensaio (para o primeiro parceiro de ligação específica e, opcionalmente, o segundo parceiro de ligação específica) pode ser qualquer fase sólida conhecida na técnica, tal como, mas não limitada a, uma partícula magnética, uma microesfera, um tubo de ensaio, uma placa de microtitulação, uma cuveta, uma membrana, uma molécula de andaime, um filme, um papel de filtro, um disco e um chip. Nas modalidades em que a fase sólida é uma microesfera, a microesfera pode ser uma esfera magnética ou uma partícula magnética. As esferas / partículas magnéticas podem ser ferromagnéticas, ferrimagnéticas, paramagnéticas, superparamagnéticas ou ferrofluídicas. Exemplos de materiais ferromagnéticos incluem Fe, Co, Ni, Gd, Dy, CrO2, MnAs, MnBi, EuO e NiO / Fe. Exemplos de materiais ferrimagnéticos incluem NiFe2O4, CoFe2O4, Fe3O4 (ou FeO.Fe2O3). As microesferas podem ter uma porção de núcleo sólido que é magnética e é circundada por uma ou mais camadas não magnéticas. Alternativamente, a porção magnética pode ser uma camada em torno de um núcleo não magnético. O suporte sólido no qual o primeiro membro de ligação específica está imobilizado pode ser armazenado na forma seca ou em um líquido. As microesferas magnéticas podem ser submetidas a um campo magnético antes ou depois do contato com a amostra com uma microesfera magnética na qual o primeiro membro de ligação específica é imobilizado.

[0454]Após a mistura contendo o complexo de primeiro parceiro de ligação específica – antígeno analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) ser formado, qualquer analito não ligado (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) é removido do complexo usando qualquer técnica conhecida. Por exemplo, o analito não ligado (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) pode ser removido por lavagem. Desejavelmente, no entanto, o primeiro parceiro de ligação específica está presente em excesso de qualquer analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) presente na amostra de teste, de modo que todo o analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) que está presente na amostra de teste está ligado ao primeiro parceiro de ligação específica.

[0455]Após a remoção de qualquer analito não ligado (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP), um segundo parceiro de ligação específica é adicionado à mistura para formar um complexo de primeiro parceiro de ligação específica - analito de interesse (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) - segundo parceiro de ligação específica. O segundo parceiro de ligação específica pode ser um anticorpo anti-analito (por exemplo, anticorpo anti-UCH-L1 que se liga a um epítopo tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos três (3) aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou anticorpo anti-GFAP que se liga a um epítopo tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos três (3) aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2). Além disso, o segundo parceiro de ligação específica é marcado com ou contém um marcador detectável como descrito acima.

[0456]O uso de anticorpos imobilizados ou seus fragmentos de anticorpos pode ser incorporado no imunoensaio. Os anticorpos podem ser imobilizados em uma variedade de suportes, tal como partículas de matriz magnética ou cromatográfica (tal como uma esfera magnética), partículas de látex ou partículas de látex de superfície modificada, polímero ou filme de polímero, plástico ou filme plástico, substrato plano, a superfície de uma placa de ensaio (tal como poços de microtitulação), pedaços de um material de substrato sólido, e similares. Uma tira de ensaio pode ser preparada revestindo o anticorpo ou a pluralidade de anticorpos em uma matriz em um suporte sólido. Essa tira pode ser mergulhada na amostra de teste e processada rapidamente através de etapas de lavagem e detecção para gerar um sinal mensurável, tal como um ponto colorido.

(1) Imunoensaio tipo sanduíche

[0457]Um imunoensaio tipo sanduíche mede a quantidade de antígeno entre duas camadas de anticorpos (isto é, pelo menos um anticorpo de captura) e um anticorpo de detecção (isto é, pelo menos um anticorpo de detecção). O anticorpo de captura e o anticorpo de detecção se ligam a diferentes epítopos no antígeno, por exemplo, analito de interesse, tal como UCH-L1 ou GFAP. Desejavelmente, a ligação do anticorpo de captura a um epítopo não interfere com a ligação do anticorpo de detecção a um epítopo. Os anticorpos monoclonais ou policlonais podem ser utilizados como anticorpos de captura e detecção no imunoensaio tipo sanduíche.

[0458]Geralmente, pelo menos dois anticorpos são empregues para separar e quantificar o analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) em uma amostra de teste.

Mais especificamente, os pelo menos dois anticorpos se ligam a certos epítopos do analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) formando um complexo imune que é chamado de um “sanduíche”. Um ou mais anticorpos podem ser usados para capturar os analitos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) na amostra de teste (esses anticorpos são frequentemente chamado de um anticorpo de “captura” ou anticorpos de “captura”) e um ou mais anticorpos são usados ligar um marcador detectável (ou seja, quantificável) ao sanduíche (esses anticorpos são frequentemente chamado de anticorpo de “detecção” ou anticorpos de “detecção”). Em um ensaio tipo sanduíche, a ligação de um anticorpo ao seu epítopo desejavelmente não é diminuída pela ligação de qualquer outro anticorpo no ensaio ao seu respectivo epítopo. Os anticorpos são selecionados de modo que os um ou mais primeiros anticorpos colocados em contato com uma amostra de teste suspeita de conter os analitos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) não se liguem a todo ou parte de um epítopo reconhecido pelo segundo ou pelos anticorpos subsequentes, interferindo assim com a capacidade de um ou mais segundos anticorpos de detecção se ligarem ao analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP).

[0459]Os anticorpos podem ser utilizados como um primeiro anticorpo no dito imunoensaio. O anticorpo se liga imunoespecificamente aos epítopos no analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP). Além dos anticorpos da presente descrição, o dito imunoensaio pode compreender um segundo anticorpo que se liga imunoespecificamente a epítopos que não são reconhecidos ou ligados pelo primeiro anticorpo.

[0460]Uma amostra de teste suspeita de conter os analitos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) pode ser colocada em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura (ou anticorpos) e pelo menos um segundo anticorpo de detecção simultânea ou sequencialmente. No formato de ensaio tipo sanduíche, uma amostra de teste suspeita de conter os analitos (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) é primeiro colocada em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo particular sob condições que permitem a formação de um complexo de primeiro anticorpo - antígeno analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP). Se mais de um anticorpo de captura for usado, um complexo de primeiro múltiplo anticorpo de captura – antígeno UCH-L1 ou GFAP é formado. Em um ensaio tipo sanduíche, os anticorpos, preferencialmente, pelo menos um anticorpo de captura, são utilizados em quantidades molares em excesso da quantidade máxima de analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) esperada na amostra de teste. Por exemplo, podem ser utilizados de cerca de 5 µg / mL a cerca de 1 mg / mL de anticorpo por ml de tampão de revestimento de micropartículas.

i. Anticorpo Anti-UCH-L1 e / ou de captura de GFAP

[0461]Opcionalmente, antes de colocar a amostra de teste em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura, pelo menos um primeiro anticorpo de captura pode ser ligado a um suporte sólido que facilita a separação do complexo de primeiro anticorpo - analito (por exemplo, UCH-L1 e / ou GFAP) da amostra de teste.

Qualquer suporte sólido conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, entre outros,

suportes sólidos feitos de materiais poliméricos nas formas de poços, tubos ou microesferas (tal como uma micropartícula). O anticorpo (ou anticorpos) pode ser ligado ao suporte sólido por adsorção, por ligação covalente usando um agente de acoplamento químico ou por outros meios conhecidos na técnica, desde que essa ligação não interfira na capacidade do anticorpo de se ligar ao analito (por exemplo, UCH-L1 e / ou GFAP). Além disso, se necessário, o suporte sólido pode ser derivatizado para permitir a reatividade com vários grupos funcionais no anticorpo.

Essa derivatização requer o uso de certos agentes de acoplamento, tais como, mas não limitados a, anidrido maleico, N-hidroxisucinimida e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida.

[0462]Após a amostra de teste suspeita de conter o analito (por exemplo, UCH-L1 e / ou GFAP) ser incubada para permitir a formação de um complexo de primeiro anticorpo de captura (ou múltiplo anticorpo) – analito (por exemplo, UCH-L1 e / ou GFAP). A incubação pode ser realizada a um pH de cerca de 4,5 a cerca de 10,0, a uma temperatura de cerca de 2° C a cerca de 45° C e por um período de pelo menos cerca de um (1) minuto a cerca de dezoito (18) horas, de 2 a 6 minutos, de 7 a 12 minutos, de 5 a 15 minutos, ou de 3 a 4 minutos.

ii. Anticorpo de Detecção

[0463]Após a formação do complexo de primeiro / múltiplo anticorpo de captura - analito (por exemplo, UCH-L1 e / ou GFAP), o complexo é então colocado em contato com pelo menos um segundo anticorpo de detecção (sob condições que permitem a formação de um complexo de primeiro / múltiplo anticorpo - antígeno analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) - segundo anticorpo). Em algumas modalidades, a amostra de teste é colocada em contato com o anticorpo de detecção simultaneamente com o anticorpo de captura. Se o complexo de primeiro anticorpo - analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) for colocado em contato com mais de um anticorpo de detecção, um complexo de primeiro / múltiplo anticorpo de captura -

analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) – múltiplo anticorpo de detecção é formado.

Como com o primeiro anticorpo, quando pelo menos o segundo (e subsequente) anticorpo é colocado em contato com o complexo de primeiro anticorpo - analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP), é necessário um período de incubação em condições semelhantes às descritas acima para a formação do complexo de primeiro / múltiplo anticorpo - analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) - segundo / múltiplo anticorpo. De preferência, pelo menos um segundo anticorpo contém um marcador detectável. O marcador detectável pode ser ligado a pelo menos um segundo anticorpo antes, simultaneamente com ou após a formação do complexo de primeiro / múltiplo anticorpo - analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) - segundo / múltiplo anticorpo.

Qualquer marcador detectável conhecido na técnica pode ser usado.

[0464]Os ensaios quimioluminescentes podem ser realizados de acordo com os métodos descritos por Adamczyk e outros, Anal. Chim. Acta 579 (1): 61 a 67 (2006).

Embora qualquer formato de ensaio adequado possa ser usado, um quimioluminômetro para microplacas (Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak Ridge, TN) permite o ensaio de multiplas amostras de pequenos volumes rapidamente. O quimioluminômetro pode ser equipado com vários injetores de reagentes usando microplacas de poliestireno preto de 96 poços (Costar # 3792).

Cada amostra pode ser adicionada a um poço separado, seguido pela adição simultânea / sequencial de outros reagentes, conforme determinado pelo tipo de ensaio empregue. Desejavelmente, é evitada a formação de pseudobases em soluções neutras ou básicas empregando um aril éster de acridínio, tal como por acidificação. A resposta quimioluminescente é então registrada poço a poço. A este respeito, o tempo para registrar a resposta quimioluminescente dependerá, em parte, do atraso entre a adição dos reagentes e o acridínio particular utilizado.

[0465]A ordem na qual a amostra de teste e o(s) parceiro(s) de ligação são adicionados para formar a mistura para o ensaio quimioluminescente não é crucial.

Se o primeiro parceiro de ligação específica for marcado de forma detectável com um composto de acridínio, formam-se complexos de primeiro parceiro de ligação específica - antígeno (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP). Alternativamente, se um segundo parceiro de ligação específica for usado e o segundo parceiro de ligação específica for detectável e marcado com um composto de acridínio, formam-se complexos de primeiro parceiro de ligação específica - analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) - segundo parceiro de ligação específica. Qualquer parceiro de ligação específico não ligado, marcado ou não, pode ser removido da mistura usando qualquer técnica conhecida, tal como lavagem.

[0466]O peróxido de hidrogênio pode ser gerado in situ na mistura ou fornecido à mistura antes, simultaneamente ou após a adição de um composto de acridínio descrito acima. O peróxido de hidrogênio pode ser gerado in situ de várias maneiras, como seria evidente para um versado na técnica.

[0467]Alternativamente, uma fonte de peróxido de hidrogênio pode ser simplesmente adicionada à mistura. Por exemplo, a fonte do peróxido de hidrogênio pode ser um ou mais tampões ou outras soluções conhecidas por conter peróxido de hidrogênio. A este respeito, uma solução de peróxido de hidrogênio pode ser simplesmente adicionada.

[0468]Após a adição simultânea ou subsequente de pelo menos uma solução básica à amostra, um sinal detectável, ou seja, um sinal quimioluminescente, indicativo da presença de analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) é gerado. A solução básica contém pelo menos uma base e tem um pH maior ou igual a 10, preferencialmente, maior ou igual a 12. Exemplos de soluções básicas incluem, mas não estão limitados a, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de amônio, hidróxido de magnésio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio, e bicarbonato de cálcio. A quantidade de solução básica adicionada à amostra depende da concentração da solução básica.

Com base na concentração da solução básica usada, um versado na técnica pode determinar facilmente a quantidade de solução básica a ser adicionada à amostra.

Outros marcadores que não sejam quimioluminescentes podem ser empregues. Por exemplo, podem ser empregues marcadores enzimáticos (incluindo mas não limitados à fosfatase alcalina).

[0469]O sinal quimioluminescente, ou outro sinal, que é gerado pode ser detectado usando técnicas de rotina conhecidas pelos versados na técnica. Com base na intensidade do sinal gerado, a quantidade de analito de interesse (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) na amostra pode ser quantificada. Especificamente, a quantidade de analito (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) na amostra é proporcional à intensidade do sinal gerado. A quantidade de analito (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) presente pode ser quantificada comparando a quantidade de luz gerada com uma curva padrão para o analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) ou por comparação com um padrão de referência. A curva padrão pode ser gerada usando diluições em série ou soluções de concentrações conhecidas de analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) por espectroscopia de massas, métodos gravimétricos e outras técnicas conhecidas. A quantificação para ensaios em painel e para ensaios multiplex também foi descrita na literatura científica e é conhecida dos versados na técnica.

(2) Ensaio de inibição competitiva direta

[0470]Em um formato competitivo direto, uma alíquota de analito marcado de interesse (por exemplo, analito (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) tendo um marcador fluorescente, uma etiqueta anexada a um ligante clivável, etc.) de uma concentração conhecida é usada para competir com o analito de interesse (por exemplo, UCH-L1 e GFAP) em uma amostra de teste para ligação ao analito do anticorpo de interesse (por exemplo, anticorpo de UCH-L1 ou GFAP).

[0471]Em um ensaio de competição direta, um parceiro de ligação específica imobilizado (tal como um anticorpo) pode ser sequencial ou simultaneamente colocado em contato com a amostra de teste e um analito marcado de interesse, fragmento de analito de interesse ou sua variante de analito de interesse. O analito do peptídeo interesse, analito do fragmento de interesse ou analito da variante de interesse pode ser marcado com qualquer marcador detectável, incluindo um marcador detectável constituído de etiqueta acoplada a um ligante clivável. Neste ensaio, o anticorpo pode ser imobilizado em um suporte sólido. Alternativamente, o anticorpo pode ser acoplado a um anticorpo, tal como um anticorpo antiespécie, que foi imobilizado em um suporte sólido, tal como uma micropartícula ou substrato plano.

[0472]O analito marcado de interesse, a amostra de teste e o anticorpo são incubados em condições semelhantes às descritas acima em conjunto com o formato de ensaio tipo sanduíche. Duas espécies diferentes de complexos de anticorpo - analito de interesse podem então ser geradas. Especificamente, um dos complexos de anticorpo - analito de interesse gerado contém um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente, etc.) enquanto o outro complexo de anticorpo - analito de interesse não contém um marcador detectável. O complexo de anticorpo - analito de interesse pode ser, mas não precisa ser, separado do restante da amostra de teste antes da quantificação do marcador detectável. Independentemente de se o complexo de anticorpo - analito de interesse é separado do restante da amostra de teste, a quantidade de marcador detectável no complexo de anticorpo - analito de interesse é então quantificada. A concentração de analito de interesse (tal como analito de interesse associado à membrana, analito de interesse solúvel, fragmentos de analito de interesse solúvel, variantes de analito de interesse (analito de interesse associado à membrana ou solúvel) ou qualquer combinação dos mesmos) na amostra de teste pode então ser determinada, por exemplo, como descrito acima.

(3) Ensaio de inibição competitiva reversa

[0473]Em um ensaio de competição reversa, um analito imobilizado de interesse (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) pode ser sequencial ou simultaneamente colocado em contato com uma amostra de teste e pelo menos um anticorpo marcado.

[0474]O analito de interesse pode ser ligado a um suporte sólido, tal como os suportes sólidos discutidos acima em conjunto com o formato de ensaio tipo sanduíche.

[0475]O analito imobilizado de interesse, a amostra de teste e pelo menos um anticorpo marcado são incubados em condições semelhantes às descritas acima em conjunto com o formato de ensaio tipo sanduíche. São então gerados duas espécies diferentes de complexos de analito de interesse - anticorpo. Especificamente, um dos complexos de analito de interesse - anticorpo gerado é imobilizado e contém um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente, etc.) enquanto o outro complexo de analito de interesse - anticorpo não é imobilizado e contém um marcador detectável. O analito não imobilizado do complexo de analito de interesse - anticorpo e o restante da amostra de teste são removidos da presença do complexo de analito de interesse imobilizado - anticorpo através de técnicas conhecidas, tal como lavagem. Uma vez removido o complexo de analito de interesse não imobilizado - anticorpo, a quantidade de marcador detectável no complexo de analito de interesse imobilizado - anticorpo é quantificada após a clivagem da etiqueta. A concentração de analito de interesse na amostra de teste pode então ser determinada comparando a quantidade de marcador detectável como descrito acima.

(4) Imunoensaio de uma etapa ou ensaio de “Captura em tempo real”

[0476]Em um imunoensaio de captura em tempo real, um substrato sólido é pré-revestido com um agente de imobilização. O agente de captura, o analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) e o agente de detecção são adicionados ao substrato sólido juntos, seguidos por uma etapa de lavagem antes da detecção. O agente de captura pode se ligar ao analito (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP) e compreende um ligando para um agente de imobilização. O agente de captura e os agentes de detecção podem ser anticorpos ou qualquer outra porção capaz de captura ou detecção, como aqui descrito ou conhecido na técnica. O ligando pode compreender uma etiqueta peptídica e um agente de imobilização pode compreender um anticorpo de etiqueta antipeptídeo. Alternativamente, o ligando e o agente de imobilização podem ser qualquer par de agentes capazes de se ligar um ao outro de modo a serem empregues para um ensaio de captura em tempo real (por exemplo, par de ligação específica e outros como são conhecidos na técnica). Mais de um analito pode ser medido. Em algumas modalidades, o substrato sólido pode ser revestido com um antígeno e o analito a ser analisado é um anticorpo.

[0477]Em certas outras modalidades, em um imunoensaio de uma etapa ou “captura em tempo real”, um suporte sólido (tal como uma micropartícula) pré- revestido com um agente de imobilização (tal como biotina, estreptavidina, etc.) e em pelo menos, um primeiro membro de ligação específica e um segundo membro de ligação específica (que funcionam como reagentes de captura e detecção, respectivamente) são usados. O primeiro membro de ligação específica compreende um ligando para o agente de imobilização (por exemplo, se o agente de imobilização no suporte sólido for estreptavidina, o ligando no primeiro membro de ligação específica pode ser biotina) e também se liga ao analito de interesse (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP). O segundo membro de ligação específica compreende um marcador detectável e se liga a um analito de interesse (por exemplo, UCH-L1 ou GFAP). O suporte sólido e o primeiro e o segundo membro de ligação específica podem ser adicionados a uma amostra de teste (sequencial ou simultaneamente). O ligando no primeiro membro de ligação específica liga-se ao agente de imobilização no suporte sólido para formar um complexo de suporte sólido / primeiro membro de ligação específica. Qualquer analito de interesse presente na amostra se liga ao complexo de suporte sólido / primeiro membro de ligação específica para formar um complexo de suporte sólido / primeiro membro de ligação específica / analito. O segundo membro de ligação específica se liga ao complexo de suporte sólido /

primeiro membro de ligação específica / analito e o marcador detectável é detectado.

Uma etapa de lavagem opcional pode ser empregue antes da detecção. Em certas modalidades, em um ensaio de uma etapa, mais de um analito pode ser medido. Em certas outras modalidades, mais de dois membros de ligação específica podem ser empregues. Em certas outras modalidades, múltiplos marcadores detectáveis podem ser adicionados. Em certas outras modalidades, múltiplos analitos de interesse podem ser detectados, ou suas quantidades, níveis ou concentrações, medidas, determinadas ou avaliadas.

[0478]O uso de um ensaio de captura em tempo real pode ser feito em uma variedade de formatos, como aqui descrito e conhecido na técnica. Por exemplo, o formato pode ser um ensaio tipo sanduíche, como descrito acima, mas alternativamente pode ser um ensaio de competição, pode empregar um único membro de ligação específica, ou usar outras variações, tal como são conhecidas.

(5) Ensaio de detecção de molécula única

[0479]Também podem ser usados ensaios e métodos de detecção de molécula única, tal como o uso de um dispositivo de nanoporos ou um dispositivo de nanopoços. Exemplos de dispositivos de nanoporos são descritos na Publicação Internacional de Patente No. WO 2016/161402, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Exemplos de dispositivo de nanopoços são descritos na Publicação Internacional de Patente No. WO 2016/161400, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Outros dispositivos e métodos apropriados para a detecção de molécula única também podem ser empregues.

11. Outros Fatores

[0480]Os métodos de diagnóstico, prognóstico e / ou avaliação, conforme descrito acima, podem incluir ainda o uso de outros fatores para o diagnóstico, prognóstico e avaliação. Em algumas modalidades, a lesão cerebral traumática pode ser diagnosticada usando a Escala de Coma de Glasgow ou o resultado da lesão cerebral traumática pode ser previsto usando a Escala de Resultados de Glasgow Estendida (GOSE). Outros testes, escalas ou índices também podem ser usados individualmente ou em combinação com a Escala de Coma de Glasgow. Um exemplo é a escala Ranchos Los Amigos. A escala Ranchos Los Amigos mede os níveis de consciência, cognição, comportamento e interação com o meio ambiente. A escala Ranchos Los Amigos inclui: Nível I: Sem resposta; Nível II: Resposta Generalizada; Nível III: Resposta Localizada; Nível IV: Confuso-agitado; Nível V: Confuso- inadequado; Nível VI: Confuso-apropriado; Nível VII: Automático-apropriado; e Nível VIII: Intencional-apropriado.

[0481]Outros sistemas de classificação baseados nos resultados da TC podem ser usados para prever o resultado em pacientes, tal como qualquer sistema de classificação conhecido na técnica. Um exemplo é a classificação de Marshall de lesão cerebral traumática, que coloca os pacientes em uma das seis categorias (I a VI) de aumento de gravidade, com base nos desfechos da TC sem contraste do cérebro. Categorias mais altas têm pior prognóstico e sobrevida. A classificação de Marshall preocupa-se principalmente com duas características: 1) grau de inchaço, como determinado pelo deslocamento da linha média e / ou compressão das cisternas basais, e 2) presença e tamanho das contusões / hemorragias chamadas de “lesões de densidade alta ou mista”. Outro exemplo é o escore de Rotterdam, que incorpora variáveis adicionais (por exemplo, hemorragia subaracnoidea) e tenta abordar algumas das limitações reconhecidas do sistema de Marshall, tal como lutar para classificar pacientes com lesões de vários tipos. A classificação de Rotterdam inclui quatro elementos com escore independente. Semelhante ao sistema de Marshall, a classificação de Rotterdam inclui 1) grau de compressão da cisterna basal e 2) grau de deslocamento da linha média. A classificação de Rotterdam, no entanto, não inclui contusões, mas restringe as lesões em massa a 3) hematomas epidurais, e adiciona 4) sangue intraventricular e / ou subaracnoideo. Cada uma delas recebe um escore,

e esses escores são registrados, com a adição de 1 ao total. Escores mais altos indicam pior prognóstico e sobrevida.

12. Amostras

[0482]Em algumas modalidades, a amostra é obtida depois que o indivíduo humano sofreu uma lesão na cabeça causada agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente. Em algumas modalidades, a amostra é obtida após o indivíduo humano ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de tais produtos químicos e / ou toxinas incluem fogo, fungos, amianto, pesticidas e inseticidas, solventes orgânicos, tintas, colas, gases (tal como monóxido de carbono, sulfeto de hidrogênio e cianeto), metais orgânicos (tal como metil mercúrio, chumbo tetraetílico e estanho orgânico) e / ou uma ou mais drogas de abuso. Em algumas modalidades, a amostra é obtida a partir de um indivíduo humano que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um ou mais vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[0483]Em ainda outra modalidade, os métodos aqui descritos usam amostras que também podem ser usadas para determinar se um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver lesão cerebral traumática leve, determinando os níveis de UCH-L1 e GFAP em um indivíduo usando os anticorpos anti-UCH-L1 e anti-GFAP descritos abaixo, ou seus fragmentos de anticorpos. Assim, em modalidades particulares, a descrição também fornece um método para determinar se um indivíduo que tem, ou corre risco de ter as lesões cerebrais traumáticas discutidas aqui e conhecidas na técnica, é candidato à terapia ou tratamento. Geralmente, o indivíduo é pelo menos aquele que: (i) sofreu uma lesão na cabeça; (ii) ingeriu e / ou foi exposto a um ou mais produtos químicos e / ou toxinas; (iii) sofreu de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um ou mais vírus, meningite, hidrocefalia ou sofre de qualquer combinação dos mesmos; ou (iv) quaisquer combinações de (i) - (iii); ou, que foi realmente diagnosticado como tendo ou estando em risco de ter LCT (tal como, por exemplo, indivíduos que sofrem de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um ou mais vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos), e / ou que demonstra uma concentração ou quantidade desfavorável (isto é, clinicamente indesejável) de UCH-L1 ou GFAP, ou fragmento de UCH-L1 ou GFAP, como aqui descrito.

a. Amostra de Teste ou Biológica

[0484]Como usado neste documento, “amostra”, “amostra de teste”, “amostra biológica” refere-se a amostra de fluido contendo ou suspeita de conter UCH-L1 e GFAP. A amostra pode ser derivada de qualquer fonte adequada. Em alguns casos, a amostra pode compreender um líquido, um sólido particulado fluente, ou uma suspensão fluida de partículas sólidas. Em alguns casos, a amostra pode ser processada antes da análise aqui descrita. Por exemplo, a amostra pode ser separada ou purificada a partir de sua fonte antes da análise; no entanto, em certas modalidades, uma amostra não processada contendo UCH-L1 e GFAP pode ser analisada diretamente. Em um exemplo particular, a fonte de UCH-L1 e GFAP é uma substância corporal humana (por exemplo, fluido corporal, sangue tal como sangue integral, soro, plasma, urina, saliva, suor, escarro, sêmen, muco, líquido lacrimal, fluido linfático, líquido amniótico, líquido intersticial, lavagem pulmonar, líquido cefalorraquidiano, fezes, tecidos, órgãos ou similares). Os tecidos podem incluir, mas não estão limitados a, tecido muscular esquelético, tecido hepático, tecido pulmonar, tecido do rim, tecido do miocárdio, tecido cerebral, medula óssea, tecido do colo do útero, pele, etc. A amostra pode ser uma amostra líquida ou um extrato líquido de uma amostra sólida. Em certos casos, a fonte da amostra pode ser um órgão ou tecido, tal como uma amostra de biópsia, que pode ser solubilizada por desintegração tecidual /

lise celular.

[0485]Uma ampla gama de volumes da amostra de fluido pode ser analisada.

Em algumas modalidades exemplificativas, o volume da amostra pode ser de cerca de 0,5 nL, cerca de 1 nL, cerca de 3 nL, cerca de 0,01 µL, cerca de 0,1 µL, cerca de 1 µL, cerca de 5 µL, cerca de 10 µL, cerca de 100 µL, cerca de 1 mL, cerca de 5 mL, cerca de 10 mL ou similares. Em alguns casos, o volume da amostra de fluido está entre cerca de 0,01 µL e cerca de 10 mL, entre cerca de 0,01 µL e cerca de 1 mL, entre cerca de 0,01 µL e cerca de 100 µL, ou entre cerca de 0,1 µL e cerca de 10 µL.

[0486]Em alguns casos, a amostra de fluido pode ser diluída antes do uso em um ensaio. Por exemplo, nas modalidades em que a fonte de UCH-L1 e GFAP é um fluido do corpo humano (por exemplo, sangue, soro), o fluido pode ser diluído com um solvente apropriado (por exemplo, um tampão tal como o tampão PBS). Uma amostra de fluido pode ser diluída cerca de 1 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 100 vezes ou mais, antes do uso. Em outros casos, a amostra de fluido não é diluída antes do uso em um ensaio.

[0487]Em alguns casos, a amostra pode passar por processamento pré- analítico. O processamento pré-analítico pode oferecer funcionalidade adicional, tal como remoção inespecífica de proteínas e / ou funcionalidade de mistura eficaz, ainda que implementável de forma não dispendiosa. Os métodos gerais de processamento pré-analítico podem incluir o uso de aprisionamento eletrocinético, eletrocinética AC, ondas acústicas de superfície, isotacoforese, dieletroforese, eletroforese ou outras técnicas de pré-concentração conhecidas. Em alguns casos, a amostra de fluido pode ser concentrada antes do uso em um ensaio. Por exemplo, nas modalidades em que a fonte de UCH-L1 e GFAP é um fluido corporal humano (por exemplo, sangue, soro), o fluido pode ser concentrado por precipitação, evaporação, filtração, centrifugação ou uma combinação dos mesmos. Uma amostra de fluido pode ser concentrada cerca de 1 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 100 vezes ou mais, antes do uso.

b. Controles

[0488]Pode ser desejável incluir um controle (tal como um controle positivo e / ou negativo, que é bem conhecido na técnica). O controle pode ser analisado simultaneamente com a amostra do indivíduo, como descrito acima. Os resultados obtidos a partir da amostra em questão podem ser comparados com os resultados ou informações obtidos a partir da amostra de controle. Podem ser fornecidas curvas padrão, com as quais os resultados do ensaio para a amostra podem ser comparados.

Tais curvas padrão apresentam níveis de marcador como uma função das unidades de ensaio (isto é, intensidade do sinal fluorescente, se for usado um marcador fluorescente). Usando amostras coletadas a partir de vários doadores, podem ser fornecidas curvas padrão para os níveis de referência de UCH-L1 e GFAP em indivíduos saudáveis normais, bem como para os níveis “em risco” de UCH-L1 e GFAP no tecido coletado a partir de doadores, que podem ter uma ou mais das características descritas acima. Em alguns casos, os controles podem estar relacionados a (por exemplo, com base em) amostras ou informações obtidas a partir de um indivíduo que sofreu uma lesão ortopédica, mas sem LCT aparente (“controles orto”) ou amostras ou informações obtidas a partir de indivíduos saudáveis que não têm lesão aparente (“controles saudáveis”). Em algumas modalidades, o método pode ser realizado em qualquer indivíduo, sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo, dos valores laboratoriais do indivíduo, da classificação do indivíduo como sofrendo de lesão cerebral traumática leve, moderada, grave ou moderada a grave, e do momento de qualquer evento em que o dito indivíduo possa ter sofrido uma lesão ortopédica.

[0489]Assim, em vista do exposto, é fornecido um método para determinar a presença, a quantidade ou a concentração de UCH-L1 e GFAP em uma amostra de teste. O método compreende analisar a amostra de teste para UCH-L1 e GFAP por um imunoensaio, por exemplo, empregando pelo menos um anticorpo de captura que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou GFAP e pelo menos um anticorpo de detecção que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou GFAP, que é diferente do epítopo para o anticorpo de captura e, opcionalmente, inclui uma marcador detectável, e compreendendo comparar um sinal gerado pelo marcador detectável como uma indicação direta ou indireta da presença, quantidade ou concentração de UCH-L1 ou GFAP na amostra de teste para um sinal gerado como uma indicação direta ou indireta da presença, quantidade ou concentração de UCH-L1 ou GFAP em um calibrador. O calibrador é opcional e, de preferência, parte de uma série de calibradores em que cada um dos calibradores difere dos outros calibradores da série pela concentração de UCH-L1 ou GFAP.

13. Kit

[0490]É fornecido aqui um kit, que pode ser usado nos métodos aqui descritos para analisar ou avaliar uma amostra de teste para UCH-L1 e GFAP, ou fragmento UCH-L1 e GFAP. O kit compreende pelo menos um componente para analisar a amostra de teste para instruções para analisar a amostra de teste para UCH-L1 e GFAP. Por exemplo, o kit pode compreender instruções para testar a amostra de teste para UCH-L1 e GFAP por imunoensaio, por exemplo, imunoensaio quimioluminescente de micropartículas. As instruções incluídas nos kits podem ser afixadas ao material da embalagem, podem ser incluídas como um folheto informativo, ou podem ser visualizadas ou baixadas de um site específico citado como parte da embalagem do kit ou dos materiais inseridos. Embora as instruções sejam tipicamente materiais escritos ou impressos, elas não se limitam a esses. Qualquer meio capaz de armazenar essas instruções e comunicá-las a um usuário final é considerado por esta descrição. Esses meios incluem, mas não estão limitados ao meio de armazenamento eletrônico (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips),

meios ópticos (por exemplo, CD ROM) e similares. Conforme usado aqui, o termo “instruções” pode incluir o endereço de um site da Internet que fornece as instruções.

[0491]Pelo menos um componente pode incluir pelo menos uma composição compreendendo um ou mais anticorpos isolados ou fragmentos de anticorpos que se ligam especificamente a UCH-L1 ou GFAP. O anticorpo pode ser um anticorpo de captura de UCH-L1 ou GFAP ou um anticorpo de detecção de UCH-L1 e / ou GFAP.

[0492]Alternativa ou adicionalmente, o kit pode compreender um calibrador ou controle, por exemplo, purificado e opcionalmente liofilizado, UCH-L1 ou GFAP e / ou pelo menos um recipiente (por exemplo, tubo, placas ou tiras de microtitulação, que pode ser já revestido com um anticorpo monoclonal anti-UCH-L1 ou anti-GFAP) para realizar o ensaio, e / ou um tampão, tal como um tampão de ensaio ou um tampão de lavagem, qualquer um dos quais pode ser fornecido como uma solução concentrada, uma solução de substrato para o marcador detectável (por exemplo, um marcador enzimático) ou uma solução de paragem. De preferência, o kit compreende todos os componentes, isto é, reagentes, padrões, tampões, diluentes, etc., que são necessários para realizar o ensaio. As instruções também podem incluir instruções para gerar uma curva padrão.

[0493]O kit pode ainda compreender padrões de referência para quantificação de UCH-L1 e GFAP. Os padrões de referência podem ser empregues para estabelecer curvas padrão para interpolação e / ou extrapolação das concentrações de UCH-L1 e GFAP. Os padrões de referência podem incluir um alto nível de concentração de UCH-L1 e GFAP, por exemplo, cerca de 100000 pg / mL, cerca de 125000 pg / mL, cerca de 150000 pg / mL, cerca de 175000 pg / mL, cerca de 2000000 pg / mL, cerca de 200000 pg / mL, cerca de 225000 pg / mL, cerca de 250000 pg / mL, cerca de 275000 pg / mL ou cerca de 300000 pg / mL; um nível médio de concentração de UCH-L1 e GFAP, por exemplo, de cerca de 25000 pg / mL, cerca de 40000 pg / mL, cerca de 45000 pg / mL, cerca de 50000 pg / mL, cerca de 50000 pg /

mL, cerca de 55000 pg / mL, cerca de 60000 pg / mL, cerca de 75000 pg / mL ou cerca de 100000 pg / mL; e um nível baixo de concentração de UCH-L1 e GFAP, por exemplo, de cerca de 1 pg / mL, cerca de 5 pg / mL, cerca de 10 pg / mL, cerca de 12,5 pg / mL, cerca de 15 pg / mL, cerca de 15 pg / mL, cerca de 20 pg / mL, cerca de 25 pg / ml, cerca de 30 pg / ml, cerca de 35 pg / ml, cerca de 40 pg / ml, cerca de 45 pg / ml, cerca de 50 pg / ml, cerca de 50 pg / ml, cerca de 55 pg / ml, cerca de 60 pg / ml, cerca de 65 pg / mL, cerca de 70 pg / mL, cerca de 75 pg / mL, cerca de 80 pg / mL, cerca de 85 pg / mL, cerca de 90 pg / mL, cerca de 95 pg / mL ou cerca de 100 pg / mL.

[0494]Quaisquer anticorpos fornecidos no kit, tal como anticorpos recombinantes específicos para UCH-L1 ou GFAP, podem incorporar um marcador detectável, tal como um fluoróforo, porção radioativa, enzima, marcador de biotina / avidina, cromóforo, marcador quimioluminescente, ou similares, ou o kit pode incluir reagentes para marcar os anticorpos ou reagentes para detectar os anticorpos (por exemplo, anticorpos de detecção) e / ou para marcar os analitos (por exemplo, UCH- L1 e GFAP) ou reagentes para detectar o analito (por exemplo, UCH-L1 e GFAP). Os anticorpos, calibradores e / ou controles podem ser fornecidos em recipientes separados ou pré-dispensados em um formato de ensaio apropriado, por exemplo, em placas de microtitulação,

[0495]Opcionalmente, o kit inclui componentes de controle de qualidade (por exemplo, painéis de sensibilidade, calibradores e controles positivos). A preparação de reagentes de controle de qualidade é bem conhecida na técnica e é descrita em folhetos informativos para uma variedade de produtos de imunodiagnóstico.

Opcionalmente, os membros do painel de sensibilidade são usados para estabelecer as características de desempenho do ensaio e, opcionalmente, são indicadores úteis da integridade dos reagentes do kit de imunoensaio e da padronização dos ensaios,

[0496]O kit também pode opcionalmente incluir outros reagentes necessários para realizar um ensaio de diagnóstico ou facilitar avaliações de controle de qualidade, tal como tampões, sais, enzimas, cofatores enzimáticos, substratos, reagentes de detecção e similares. Outros componentes, tal como tampões e soluções para o isolamento e / ou tratamento de uma amostra de teste (por exemplo, reagentes de pré-tratamento), também podem ser incluídos no kit. O kit também pode incluir um ou mais outros controles. Um ou mais dos componentes do kit podem ser liofilizados, caso em que o kit pode ainda compreender reagentes adequados para a reconstituição dos componentes liofilizados.

[0497]Os vários componentes do kit são opcionalmente fornecidos em recipientes adequados conforme necessário, por exemplo, uma placa de microtitulação. O kit pode ainda incluir recipientes para manter ou armazenar uma amostra (por exemplo, um recipiente ou cartucho para uma amostra de urina, sangue integral, plasma ou soro). Quando apropriado, o kit opcionalmente também pode conter vasos de reação, vasos de mistura e outros componentes que facilitam a preparação de reagentes ou da amostra de teste. O kit também pode incluir um ou mais instrumentos para auxiliar na obtenção de uma amostra de teste, tal como uma seringa, pipeta, pinça, colher de medida, ou similar.

[0498]Se o marcador detectável for pelo menos um composto de acridínio, o kit pode compreender pelo menos uma acridínio-9-carboxamida, pelo menos um acridínio-9-carboxilato aril éster ou qualquer combinação dos mesmos. Se o marcador detectável for pelo menos um composto de acridínio, o kit também poderá compreender uma fonte de peróxido de hidrogênio, tal como um tampão, solução e / ou pelo menos uma solução básica. Se desejado, o kit pode conter uma fase sólida, tal como partícula magnética, microesfera, tubo de ensaio, placa de microtitulação, cuveta, membrana, molécula de andaime, filme, papel de filtro, disco ou chip.

[0499]Se desejado, o kit pode ainda compreender um ou mais componentes, individualmente ou em combinação com instruções, para analisar a amostra de teste para outro analito, que pode ser um biomarcador, tal como um biomarcador de lesão ou distúrbio cerebral traumático.

a. Adaptação de Kit e Método

[0500]O kit (ou componentes do mesmo), bem como o método para avaliar ou determinar a concentração de UCH-L1 e GFAP em uma amostra de teste por um imunoensaio como descrito aqui, podem ser adaptados para uso em uma variedade de métodos automatizados e sistemas semiautomatizados (incluindo aqueles em que a fase sólida compreende uma micropartícula), como descrito, por exemplo, na Patente US No. 5.063.081, Publicações de Pedido de Patente US Nos. 2003/0170881, 2004/0018577, 2005/0054078 e 2006/0160164 e comercializado, por exemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como Abbott Point of Care (i-STAT® ou i-STAT Alinity, Abbott Laboratories), bem como os descritos nas Patentes US. Nos. 5.089.424 e 5.006.309 e comercialmente comercializados, por exemplo, pelos laboratórios Abbott (Abbott Park, IL) como ARCHITECT® ou a série de dispositivos Abbott Alinity.

[0501]Algumas das diferenças entre um sistema automatizado ou semiautomatizado em comparação com um sistema não automatizado (por exemplo, ELISA) incluem o substrato ao qual o primeiro parceiro de ligação específica (por exemplo, analito anticorpo ou anticorpo de captura) é fixado (que pode afetar a formação do sanduíche e a reatividade do analito), e o comprimento e o tempo da captura, detecção e / ou quaisquer etapas opcionais de lavagem. Enquanto um formato não automatizado, tal como um ELISA, pode exigir um tempo de incubação relativamente mais longo com amostra e reagente de captura (por exemplo, cerca de 2 horas), um formato automatizado ou semiautomatizado (por exemplo, ARCHITECT® e qualquer plataforma sucessora, Abbott Laboratories) pode ter um tempo de incubação relativamente menor (por exemplo, cerca de 18 minutos para ARCHITECT®). Da mesma forma, enquanto um formato não automatizado, tal como um ELISA, pode incubar um anticorpo de detecção tal como o reagente conjugado por um tempo de incubação relativamente mais longo (por exemplo, cerca de 2 horas), um formato automatizado ou semiautomatizado (por exemplo, ARCHITECT® e qualquer plataforma sucessora) pode ter um tempo de incubação relativamente menor (por exemplo, cerca de 4 minutos para o ARCHITECT® e qualquer plataforma sucessora).

[0502]Outras plataformas disponíveis a partir de Abbott Laboratories incluem, mas não estão limitadas a, AxSYM®, IMx® (ver, por exemplo, Patente US No.

5.294.404, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade), PRISM®, EIA (microesfera) e Quantum™ II, além de outras plataformas. Além disso, os ensaios, kits e componentes do kit podem ser empregues em outros formatos, por exemplo, em sistemas eletroquímicos ou outros sistemas de ensaios portáteis ou de ponto de atendimento. Como mencionado anteriormente, a presente descrição é, por exemplo, aplicável ao sistema de imunoensaio eletroquímico comercial Abbott Point of Care (i- STAT®, Abbott Laboratories) que executa imunoensaios tipo sanduíche. Os imunosensores e seus métodos de fabricação e operação em dispositivos de ensaio de uso único são descritos, por exemplo, na Patente US No. 5.063.081, Publicação de Pedido de Patente US. Nos. 2003/0170881, 2004/0018577, 2005/0054078 e 2006/0160164, que são incorporadas em sua totalidade por referência quanto a seus ensinamentos a respeito.

[0503]Em particular, no que diz respeito à adaptação de um ensaio ao sistema i-STAT®, é preferencial a seguinte configuração. Um chip de silicone microfabricado é fabricado com um par de eletrodos de trabalho amperométricos de ouro e um eletrodo de referência de cloreto de prata - prata. Em um dos eletrodos de trabalho, microesferas de poliestireno (0,2 mm de diâmetro) com anticorpo de captura imobilizado são aderidas a um revestimento de polímero de polivinil álcool padronizado sobre o eletrodo. Este chip é montado em um cartucho i-STAT® com um formato fluídico adequado para o imunoensaio. Em uma porção do chip de silício, há um parceiro de ligação específica para UCH-L1 ou GFAP, como um ou mais anticorpos de UCH-L1 ou GFAP (um ou mais anticorpos monoclonais / policlonais ou um fragmento dos mesmos, uma variante dos mesmos, ou um fragmento de uma variante do mesmo que pode se ligar a UCH-L1 ou GFAP) ou uma ou mais DVD-Igs anti-UCH-L1 e / ou anti-GFAP (ou um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou um fragmento de uma variante do mesmo que pode se ligar a UCH-L1 ou GFAP), qualquer um dos quais pode ser marcado de forma detectável. Dentro da bolsa de fluido do cartucho está um reagente aquoso que inclui fosfato de p-aminofenol.

[0504]Em operação, uma amostra de um indivíduo com suspeita de LCT é adicionada à câmara de retenção do cartucho de teste, e o cartucho é inserido no leitor i-STAT®. Um elemento de bomba dentro do cartucho empurra a amostra para um duto contendo o chip. A amostra é colocada em contato com os sensores, permitindo que o conjugado enzimático se dissolva na amostra. A amostra é oscilada através dos sensores para promover a formação do sanduíche de cerca de 2 a 12 minutos. Na penúltima etapa do ensaio, a amostra é empurrada para uma câmara de resíduos e o fluido de lavagem, contendo um substrato para a enzima fosfatase alcalina, é usado para lavar o excesso de conjugado enzimático e coletar a amostra do chip do sensor. Na etapa final do ensaio, o marcador fosfatase alcalina reage com o fosfato de p-aminofenol para clivar o grupo fosfato e permitir que o p-aminofenol liberado seja oxidado eletroquimicamente no eletrodo de trabalho. Com base na corrente medida, o leitor é capaz de calcular a quantidade de UCH-L1 e GFAP na amostra por meio de um algoritmo incorporado e curva de calibração determinada por fábrica. A adaptação de um cartucho para uso multiplex, como o usado para i-Stat, foi descrita na literatura de patentes, tal como, por exemplo, na Patente US No.

6.438.498, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

[0505]Os métodos e kits como aqui descritos necessariamente abrangem outros reagentes e métodos para a realização do imunoensaio. Por exemplo, são abrangidos vários tampões, como os conhecidos na técnica e / ou que podem ser prontamente preparados ou otimizados para serem empregues, por exemplo, para lavagem, como um diluente de conjugado e / ou como diluente de calibrador. Um diluente de conjugado exemplificativo é o diluente de conjugado ARCHITECT® empregue em certos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) e contendo ácido 2-(N- morfolino) etanossulfônico (MES), um sal, um bloqueador de proteínas, um agente antimicrobiano, e um detergente. Um diluente de calibrador exemplificativo é o diluente de calibrador humano ARCHITECT® empregue em certos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), que compreende um tampão contendo MES, outro sal, um bloqueador de proteínas e um agente antimicrobiano. Além disso, conforme descrito no Pedido de Patente US No. 61/142.048 depositado em 31 de dezembro de 2008, é possível obter uma melhor geração de sinal, por exemplo, em um formato de cartucho i-STAT®, usando uma sequência de ácido nucleico ligada ao anticorpo sinal como um sinal amplificador.

[0506]Embora certas modalidades aqui contidas sejam vantajosas quando empregues para avaliar doenças, tal como lesão cerebral traumática, os ensaios e kits também podem opcionalmente ser empregues para avaliar UCH-L1 e GFAP em outras doenças, distúrbios e condições, conforme apropriado.

[0507]O método de ensaio também pode ser usado para identificar um composto que melhora doenças, tal como lesão cerebral traumática. Por exemplo, uma célula que expressa UCH-L1 ou GFAP pode ser colocada em contato com um composto candidato. O nível de expressão de UCH-L1 ou GFAP na célula em contato com o composto pode ser comparado ao de uma célula de controle usando o método de ensaio descrito neste documento. Este pedido faz referência ao Pedido US No.

XX/XXX.XXX depositado em X de dezembro de 2017 com o título “Methods for Aiding in the Diagnosis and Determination of the extent of traumatic brain injury in a human subject using glial fibrillary acidic protein (GFAP) and / or ubiquitin carboxy-terminal hidrolase L1 (UCH-L1)”.

[0508]A presente descrição tem vários aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não limitantes.

14. Exemplos

[0509]Estará prontamente claro para os versados na técnica que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos da presente descrição são prontamente aplicáveis e apreciáveis, e podem ser feitas usando equivalentes adequados sem abandonar o escopo da presente descrição ou os aspectos e modalidades descritos neste documento. Tendo agora descrito a presente descrição em detalhes, o mesmo será mais claramente entendido com referência aos exemplos a seguir, que servem apenas para ilustrar alguns aspectos e modalidades da descrição, e não devem ser vistos como limitantes do escopo da descrição. As descrições de todas as referências de periódicos, Patentes US. e publicações aqui citadas são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[0510]A presente descrição tem múltiplos aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplo 1 Ensaios Usados em Exemplos

[0511]Ensaio de UCH-L1i-STAT®. O ensaio de UCH-L1 i-STAT® foi usado em um estudo populacional de pacientes com LCT. Foram utilizados pares de anticorpos monoclonais, tal como o Anticorpo A como um anticorpo monoclonal de captura e o Anticorpo B e C como um anticorpo monoclonal de detecção. O anticorpo A é um anticorpo anti-UCH-L1 exemplificativo que foi desenvolvido internamente em Abbott Laboratories (Abbott Park, IL). Os anticorpos B e C que reconhecem diferentes epítopos de UCH-L1 e aumentam a detecção de antígeno na amostra foram desenvolvidos por Banyan Biomarkers (Alachua, Flórida). A combinação dos anticorpos fornece um efeito sinérgico quando utilizados em conjunto e fornece um sinal aumentado em comparação com o uso dos anticorpos que não estão em combinação. Outros anticorpos que foram desenvolvidos internamente em Abbott Laboratories (Abbott Park, IL), ou outros anticorpos disponíveis comercialmente, também mostram ou espera-se que mostrem um aprimoramento semelhante do sinal quando usados juntos como anticorpos de captura ou anticorpos de detecção, em várias combinações. O modelo do ensaio de UCH-L1 foi avaliado em relação aos principais atributos de desempenho. A configuração do cartucho era Configuração de Anticorpo: Anticorpo A (Anticorpo de Captura) / Anticorpo B + C (Anticorpo de Detecção); Condições do reagente: 0,8% de sólidos, 125 µg / mL de conjugado de Fab Fosfatase Alcalina; e Impressão de entrada de amostra: padrão UCH-L1. O tempo de ensaio foi de 10 a 15 minutos (com 7 a 12 minutos de tempo de captura de amostra).

[0512]Ensaio de GFAP i-STAT®. O ensaio de GFAP i-STAT® foi utilizado em um estudo populacional de pacientes com LCT. Foram utilizados pares de anticorpos monoclonais, tal como o Anticorpo A como um anticorpo monoclonal de captura e o Anticorpo B como um anticorpo monoclonal de detecção. O anticorpo A e o anticorpo B são anticorpos anti-GFAP exemplificativos que foram desenvolvidos internamente em Abbott Laboratories (Abbott Park, IL). O anticorpo A e o anticorpo B se ligam a epítopos dentro do mesmo produto de decomposição de GFAP (BDP). A combinação dos anticorpos forneceu um efeito sinérgico quando utilizados em conjunto e forneceu um sinal aumentado em comparação com o uso dos anticorpos não combinados. O modelo do ensaio de GFAP foi avaliado em relação aos principais atributos de desempenho. A configuração do cartucho era Configuração de Anticorpo: Anticorpo A (Anticorpo de Captura) / Anticorpo B (Anticorpo de Detecção); Condições de reagente: 0,8% de sólidos, 250 µg / mL de conjugado de Fab fosfatase alcalina; e Impressão de entrada de amostra: específico para GFAP. O tempo de ensaio foi de 10 a 15 minutos (com 7 a 12 minutos de tempo de captura de amostra).

Exemplo 2

[0513]Estudo de População com LCT (TRACK-LCT)

[0514]O estudo Transforming Research and Clinical Knowledge in Traumatic Brain Injury (TRACK-TBI) é um projeto grande e complexo. Sua parceria institucional e público-privada é composta por mais de 11 sítios clínicos, 7 núcleos, para um total de quase 50 instituições, corporações e filantropia colaboradoras. Um estudo piloto de TRACK-TBI, baseado em dados clínicos de três sítios clínicos, ajudou a refinar TBI Common Data Elements e criou um protótipo de TBI Information Commons para o estudo de TRACK-TBI.

[0515]Grupos de indivíduos: Um total de 2.700 a 3.000 pacientes com LCT foram incluídos uniformemente em três grupos clínicos, diferenciados pelo caminho do atendimento clínico: 1. Pacientes avaliados no pronto-socorro e com alta (DE); 2.

Pacientes internados no hospital, mas não na UTI (ADM); e 3. Pacientes internados na UTI (UTI). Outros 100 pacientes por grupo clínico (n = 300) com trauma extracraniano, mas nenhuma LCT foram incluídos como controles para um total de 3000 pacientes. Esse plano de estratificação facilitou a análise da pesquisa de eficácia comparativa (CER) e não foi restringido por diferenciação tradicional em LCT “Leve / Moderada / Grave”. A coleta de dados dependeu do caminho do atendimento clínico (DE, ADM, UTI) e dos requisitos de cada objetivo. Os pacientes de cada grupo foram estratificados em três coortes que definem a extensão dos dados a serem coletados.

[0516]Os controles eram pacientes adultos com trauma ortopédico (“controles orto”) que atendiam aos seguintes critérios: 1. Um escore de lesão abreviada ≤ 4 (sem risco de vida) para sua extremidade e / ou lesão na pelve e / ou fratura de costela; 2.

Atendeu aos mesmos critérios de inclusão e exclusão que os indivíduos com LCT, exceto que o critério de ter sido submetido a uma TC ou RM em DE por suspeita de lesão na cabeça não se aplicava. A LCT foi descartada para a lesão atual, entrevistando-se possíveis controles sobre perda de consciência (LOC), distúrbio de consciência e amnésia pós-traumática (PTA)/RA; 3. Cada sítio forneceu um plano para o número de controles como alvo de acordo com as distribuições de idade e sexo derivadas da Coorte de LCT; e 4. Os controles foram inscritos na coorte de CA-RM para acompanhamento e encaminhamento para avaliação abrangente (CA) em 2 semanas, se não for possível concluir a visita à RM.

[0517]Elegibilidade do indivíduo: Pacientes adultos foram inscritos de todas as idades, apresentando-se ao Departamento de Emergência (DE) com histórico de LCT aguda, de acordo com os Critérios do American Congresso of Rehabilitation Medicine (ACRM), nos quais o paciente havia sofrido uma ruptura fisiológica induzida por trauma da função cerebral, manifestada por ≥ um dos seguintes: qualquer período de perda de consciência (LOC); qualquer perda de memória para eventos (por exemplo, amnésia) imediatamente antes ou após o acidente; qualquer alteração do estado mental no momento do acidente (sentindo-se atordoado, desorientado e / ou confuso); e / ou déficits neurológicos focais que podem ou não ser permanentes.

Induzida traumaticamente inclui a cabeça sendo atingida, a cabeça atingindo um objeto, ou o cérebro passando por um movimento de aceleração / desaceleração (por exemplo, chicotada) sem trauma externo direto na cabeça.

[0518]Os critérios de inclusão / exclusão utilizados são mostrados na Tabela

2.

Tabela 2

Critério Fonte de Comentários Dados Critérios de inclusão

1. Idade 0-89 Gráfico

2. LCT Documentada/verificada (Critérios Gráfico, ACRM) Entrevista

3. Lesão ocorreu < 24 horas atrás Gráfico, Entrevista

4. TC do cérebro aguda para atendimento Gráfico O indivíduo deve ter TC do cérebro. clínico

5. Acuidade visual / auditiva adequada para Gráfico, teste Entrevista

6. Fluência em Inglês ou Espanhol Gráfico, Bateria de testes ou disponibilidade de Entrevista profissionais.

7. Capacidade de fornecer consentimento Entrevista informado Critérios de exclusão

1. Politrauma significativo que interferiria Gráfico Trauma corporal significativo pode confundir com o acompanhamento e avaliação dos resultados do teste de LCT. resultados.

2. Prisioneiros ou pacientes sob custódia Gráfico, Entrevista

3. Gravidez em indivíduos fêmeas Gráfico, Entrevista

4. Pacientes em espera psiquiátrica Gráfico

5. Distúrbios de saúde mental debilitantes Gráfico, Distúrbios psiquiátricos debilitantes podem principais (por exemplo, esquizofrenia ou Entrevista impactar significativamente na confiabilidade transtorno bipolar) que interfeririam no de acompanhamento e/ou impor dificuldades acompanhamento e na validade da em atribuir índice de LCT. avaliação dos resultados

6. Doença neurológica debilitante grave Gráfico, O comprometimento cognitivo debilitante da (por exemplo, acidente vascular cerebral, Entrevista linha de base documentado confundirá AVC, demência, tumor) prejudicando a avaliação dos resultados, além de não ser consciência da linha de base ou a totalmente consentido. validade do acompanhamento e avaliação dos resultados

7. Histórico significativo de condições Gráfico, preexistentes que interfeririam no Entrevista

Critério Fonte de Comentários Dados acompanhamento e na avaliação dos resultados (por exemplo, abuso de substâncias, alcoolismo, HIV / AIDS, principais doenças transmissíveis que podem interferir no consentimento, câncer em estágio terminal, dificuldades de aprendizagem, distúrbios do desenvolvimento)

8. Contraindicações à RM (para coorte RM CA+RM) Triagem

9. Baixa probabilidade de Entrevista acompanhamento (por exemplo, participante ou família indicando pouco interesse, residência em outro estado ou país, falta de moradia ou falta de contatos confiáveis)

10. Participante atual em um estudo Gráfico, Exceção à exclusão de coinscrição é feita intervencionista (por exemplo, fármaco, Entrevista para os sítios que participam do Estudo dispositivo, comportamental) Ácido Tranexâmico Pré-Hospitalar do Consórcio de Resultados de Ressuscitação para LCT.

11. LCT Penetrante Gráfico

12. Lesão medular com escore ASIA de C Gráfico ou pior

[0519]Para cada um dos três grupos clínicos (por exemplo, DE, ADM e UTI), os indivíduos foram colocados em uma das três coortes de avaliação diferentes: Coorte de Avaliação Breve (Coorte BA), Coorte de Avaliação Compressiva (CA), ou Coorte de Avaliação Abrangente + RM (CA + RM). Consultar a Tabela 3 para obter o plano de Milestone com 80% de taxa de acompanhamento.

Tabela 3 Ano 1 Ano 2 Ano 3 Ano 4 Total Grupo CA+R CA N CA+R CA N CA BA N BA N

M M ED 150 87 237 50 58 108 155 100 255 300 900

ADM 150 87 237 50 58 108 155 100 255 300 900 ICU 150 87 237 50 58 108 155 100 255 300 900 Controles 0 99 99 0 66 66 135 0 135 0 300 Total 450 360 810 150 240 390 600 300 900 900 3000

[0520]A Coorte de Avaliação Breve (BA) incluiu 1200 indivíduos no total, com 400 indivíduos para os Grupos DE, ADM e UTI. Os seguintes dados foram coletados para a Coorte BA: dados demográficos e dados completos do curso clínico; coleta de sangue para soro, plasma, DNA e RNA no dia 1 (< 24 horas após a lesão); repetir a coleta de sangue para o soro dentro de 3 a 6 horas após a coleta da linha de base do Dia 1 (opcional para os sítios incluírem esse componente); TC de cérebro clínico do Dia 1 adquirida como parte do curso hospitalar; e dados de resultados coletados por entrevista telefônica estruturada em 2 semanas, 3, 6 e 12 meses usando as medidas de resultado de NIH TBI-CDEs v.2.0 Core, conforme publicado no site de NINDS CDE.

[0521]A coorte de avaliação compressiva (CA) incluiu 1200 indivíduos no total, com 300 indivíduos + 100 controles cada para os grupos DE, ADM e UTI. Os seguintes dados foram coletados para a Coorte CA: dados demográficos e do curso clínico completo; dados clínicos diários de alta densidade para os grupos ADM e UTI; coleta de sangue para soro, plasma, RNA e DNA no dia 1 (< 24 horas após a lesão); repetir a coleta de sangue para o soro dentro de 3 a 6 horas após a coleta da linha de base do Dia 1 (opcional para os sítios incluírem esse componente); coleta de sangue para soro, plasma e RNA do dia 3 (48 a 72 horas) e 5 (96 a 120 horas) para ADM e UTI; coleta de líquido cefalorraquidiano nos dias 1 a 5 (opcional para sítios que incluem esse componente); todas as TCs de cérebro adquiridas como parte do curso hospitalar; coleta de sangue para soro, plasma e RNA em 2 semanas e 6 meses; e dados de resultados coletados por entrevista ao vivo estruturada em 2 semanas, 6 e 12 meses e em 3 meses por entrevista telefônica estruturada usando as medidas de resultado de NIH LCT-CDEs v.2.0 Core, Basic and Supplemental.

[0522]A coorte de avaliação abrangente + RM (CA + RM) incluiu 600 indivíduos no total, sendo 200 cada um para os grupos DE, ADM e UTI. Os seguintes dados foram coletados para a coorte CA + RM: dados demográficos e do curso clínico completo; dados clínicos diários de alta densidade para os grupos ADM e UTI; coleta de sangue para soro, plasma, RNA e DNA no dia 1 (< 24 horas após a lesão); repetir a coleta de sangue para o soro dentro de 3 a 6 horas após a coleta da linha de base do Dia 1 (opcional para os sítios incluírem esse componente); coleta de sangue para soro, plasma e RNA no dia 3 (48 a 72 horas) e 5 (96 a 120 horas) para ADM e UTI; coleta de líquido cefalorraquidiano nos dias 1 a 5 (opcional para sítios incluírem esse componente); todas as TCs de cabeça adquiridas como parte do curso hospitalar; coleta de sangue para soro, plasma e RNA em 2 semanas e 6 meses; RM de pesquisa 3T adquirida em 2 semanas e 6 meses; e dados de resultados coletados por entrevista a vivo estruturada em 2 semanas, 6 e 12 meses e em 3 meses por entrevista telefônica estruturada, usando as medidas de resultado de NIH LCT-CDEs v.2.0 Core, Basic and Supplemental.

[0523]Após a inscrição, a coleta de dados começou no hospital. Para pacientes com CA + RM, a ressonância magnética de duas semanas foi concluída aos 14 dias  4 dias a partir da data da lesão. Os resultados correspondentes de 2 semanas foram concluídos  3 dias da RM de 2 semanas. Para pacientes com CA e BA, os resultados de 2 semanas foram concluídos  4 dias de 14 dias a partir da data da lesão. Os resultados aos 3 meses foram concluídos  7 dias de 90 dias a partir da data da lesão. Para pacientes com CA + RM, foram realizadas RMs aos 6 meses  14 dias de 180 dias a partir da data da lesão, com resultados correspondentes em 6 meses  14 dias da RM de 6 meses. Para pacientes com CA e BA, os resultados de 6 meses foram concluídos  14 dias de 180 dias a partir da data da lesão. O BTACT deve ser completado com  7 dias de resultados (mas não no mesmo dia e no máximo 201 dias após a lesão). Resultados aos 12 meses foram concluídos  30 dias de 360 dias a partir da data da lesão.

[0524]UCH-L1 e GFAP foram medidos em um pequeno tamanho de amostra de 59 pacientes TRACK TBI no formato de ensaio i-STAT (Tabela 4).

Tabela 4 - Características do indivíduo por TC e resultado de RM Características do Total (n = 59) TC ou RM Positivaa (n TC e RM Negativaa (n = Valor P indivíduo = 46, 77,97%) 13, 22,03%) Idade 46,0 [ 24,0 a 60,0 ] 45,5 [ 23,0 a 60,0 ] 50,0 [ 39,0 a 57,0 ] 0,7419 Sexo Macho 50 / 59 [85%] 39 / 46 (85%) 11 / 13 (85%) 1,0000 Fêmea 9 / 59 (15%) 7 / 46 (15%) 2 / 13 (15%) Raça / Etnicidade Afroamericano ou africano 6 / 58 (10%) 4 / 45 (9%) 2 / 13 (15%) 0,2398 Caucasiano 48 / 58 (83%) 39 / 45 (87%) 9 / 13 (69%) Hispânico 4 / 58 (7%) 2 / 45 (4%) 2 / 13 (15%) Histórico de LCT Sim, sem LOC 9 / 56 (16%) 3 / 43 (7%) 6 / 13 (46%) 0,0037 Sim, com LOC 8 / 56 (14%) 6 / 43 (14%) 2 / 13 (15%) Não antes de LCT 39 / 56 (70%) 34 / 43 (79%) 5 / 13 (38%) Apresentação de DE Perda de consciência Não 6 / 58 (10%) 2 / 45 (4%) 4 / 13 (31%) 0,0227 Sim 47 / 58 (81%) 38 / 45 (84%) 9 / 13 (69%) Desconhecido 5 / 58 (9%) 5 / 45 (11%) Escala de coma de 15,0 [ 3,0 a 15,0 ] 14,0 [ 3,0 a 15,0 ] 15,0 [ 15,0 a 15,0] 0,0162 Glasgow Classificação da escala de coma de Glasgow Grave (3 a 8) 16 / 59 (27%) 16 / 46 (35%) 0,0177 Moderada (9 a 12) 3 / 59 (5%) 3 / 46 (7%) Leve (13 a 15) 40 / 59 (68%) 27 / 46 (59%) 13 / 13 (100%) Mecanismo de lesão Veículo motor (motorista / 10 / 59 (17%) 9 / 46 (20%) 1 / 13 (8%) 0,2975 passageiro) Motocicleta / ATV / carro 5 / 59 (8%) 3 / 46 (7%) 2 / 13 (15%) de golfe (motorista / passageiro) Atingido individualmente 3 / 59 (5%) 2 / 46 (4%) 1 / 13 (8%) por qualquer tipo de veículo Queda de um objeto em 3 / 59 (5%) 3 / 46 (7%) movimento (bicicleta / skate / cavalo / etc.) Queda de um objeto 27 / 59 (46%) 20 / 46 (43%) 7 / 13 (54%) estacionário (teto / escada / etc.) Assalto 10 / 59 (17%) 9 / 46 (20%) 1 / 13 (8%) Atingido na cabeça por um 1 / 59 (2%) 1 / 13 (8%) objeto, não assalto (árvore

/ etc.) Nível de álcool (g / dL) 0,1 [ 0,0 a 0,2 ] 0,1 [ 0,0 a 0,2 ] 0,0 [ 0,0 a 0,0 ] 0,1588 Teste de drogas Negativo 51 / 59 (86%) 41 / 46 (89%) 10 / 13 (77%) 0,3567 Positivo 8 / 59 (14%) 5 / 46 (11%) 3 / 13 (23%) Resultados de biomarcadores Tempo de coleta desde a 771,0 (+/- 339,8) 779,4 (+/- 296,8) 743,0 (+/- 468,7) 0,7383 lesão (minutos) GFAP (pg / mL) 643,8 [ 188,6 a 213,6 ] 876,6 [ 519,7 a 2409,5 31,3 [ 26,3 a 166,2 ] < 0,0001 ] UCH-L1 (pg / mL) 342,5 [ 102,8 a 718,3 ] 514,0 [ 167,2 a 859,8 ] 62,4 [ 44,5 a 136,8 ] < 0,0001 Escores de Prognóstico Escala de Resultados de 6,0 [ 5,0 a 7,0 ] 5,5 [ 4,0 a 7,0 ] 7,0 [ 7,0 a 7,0 ] 0,0130 Glasgow (3 meses) Escala de Resultados de 6,0 [ 5,0 a 7,0 ] 6,0 [ 4,0 a 7,0 ] 7,0 [ 5,5 a 7,5 ] 0,1941 Glasgow (6 meses) Escala de Resultados de 7,0 [ 5,0 a 8,0 ] 6,5 [ 5,0 a 8,0 ] 7,0 [ 6,0 a 8,0 ] 0,4412 Glasgow (12 meses) Primeiro questionário 0,0 [ 0,0 a 2,0 ] 0,0 [ 0,0 a 2,5 ] 0,0 [ 0,0 a 2,0 ] 0,8378 Rivermead 3 Itens (6 meses) Último questionário 9,0 [ 4,0 a 15,0 ] 8,5 [4,0 a 15,0 ] 13,0 [ 0,0 a 27,0 ] 0,5449 Rivermead 13 Itens (6 meses) Índice de Velocidade de 30,0 [ 5,0 a 55,0 ] 30,0 [ 5,0 a 50,0 ] 43,0 [ 18,0 a 77,0 ] 0,3235 Processamento WAIS-III (6 meses) Escala de satisfação com a 21,5 ( +/- 6,2 ) 21,7 ( +/- 5,7 ) 20,4 ( +/- 8,5) 0,6205 vida (6 meses) Medida de Independência 126,0 [ 125,0 a 126,0 ] 126,0 [ 124,0 a 126,0 ] 126,0 [ 126,0 a 126,0 ] 0,2958 Funcional (6 meses) a 24 indivíduos receberam uma RM. Variáveis contínuas são representadas como média [25-75% Faixa Interquartil] e comparadas usando o teste de soma de classificação de Wilcoxon ou Média (+/- SD) e comparadas usando o teste t com base na distribuição dos dados. Variáveis categóricas são apresentadas como número / total (percentual) e comparadas usando o teste qui-quadrado e o teste exato de Fisher.

[0525]Além de uma coleta de sangue dentro de 24 horas após a lesão cerebral, cada paciente teve uma avaliação médica extensiva, incluindo TC da cabeça, testes neuropsiquiátricos, Escore de Coma de Glasgow (GCS), e muitos pacientes também tiveram uma RM de acompanhamento dentro de 2 semanas após a lesão. Após um meticuloso e padronizado protocolo de coleta de sangue e processamento, as amostras de plasma foram divididas em alíquotas para armazenamento a -80º C, posteriormente descongeladas e testadas. Cada amostra foi corrida em duplicado, com os resultados listados sendo uma média das duas corridas. Os níveis de UCH-L1 e GFAP correlacionaram-se com a lesão durante as primeiras 24 horas após a lesão (variação de cerca de 2 a 23 horas) em um subconjunto exemplificativo de indivíduos (dados não mostrados). A Tabela 4 mostra que os níveis de etanol (ETOH) não se correlacionaram com os níveis de biomarcadores (correlação de Pearson = 0,023, valor de p = 0,89), pois o consumo de ETOH está frequentemente relacionado com a LCT, em particular, LCT grave.

[0526]Para as várias condições presentes no conjunto de dados (Tabela 5), os níveis de GFAP e UCH-L1 foram medidos e calculados a média, o mínimo, o máximo, o percentil 5 e o percentil 95. Além de avaliar os níveis gerais de GFAP e UCH-L1 em mais de 48 horas após lesão (ou suspeita de lesão) na cabeça, também foi realizada análise em vários segmentos de tempo durante essas 48 horas após a lesão. Como mostrado abaixo, os níveis de GFAP (Tabela 6) e de UCH-L1 (Tabela 7) foram medidos e as médias, mínimo, máximo, percentil 5 e percentil 95 foram calculados de 0 a 4 horas, de 4 a 8 horas, de 8 a 12 horas, de 12 a 16 horas, de 16 a 20 horas, de 20 a 24 horas e de 24 a 48 horas.

Tabela 5 - Análise clínica dos dados TRACK TBI - Características dos indivíduos Desvio Biomarcador Condição n Mediana Média Min, Max Percentil 5 Percentil 95 Padrão Controle 17 11 11 6,5 0 27 0 27 Controle Orto 38 14 22 29,7 2 181 2 67 LCT Leve* 1123 244 803 2191,0 0 35085 9 3160

GFAP LCT Leve ou 1378 335 1828 6529,4 0 130418 9 6459 Moderada / Grave LCT Moderada / 201 3095 7116 14607,8 5 130418 123 26717 Grave** Controle 17 53 55 23,9 26 106 26 106 UCH-L1 Controle Orto 38 120 149 73,0 62 345 68 305

Desvio Biomarcador Condição n Mediana Média Min, Max Percentil 5 Percentil 95 Padrão

LCT Leve* 1123 175 292 416,0 1 6399 39 870

LCT Leve ou 1378 200 441 863,9 1 11020 42 1575 Moderada / Grave

LCT Moderada / 201 684 1157 1636,3 42 10390 92 3385 Grave**

* Escala de coma de Glasgow > = 13 ** Escala de coma de Glasgow <= 12

Tabela 6 - Análise clínica dos dados TRACK TBI - Níveis de GFAP por segmento de tempo Intervalo de Desvio Tipo n Média Min, Max Percentil 5 Percentil 95 tempo Padrão

LCT Leve* 86 162 243,8 3 1108 4 754

LCT Leve ou Moderada / 0 a 4 Horas 93 1726 13566,3 3 130418 4 931 Grave

LCT Moderada / Grave** 3 44204 74671,2 28 130418 28 130418

LCT Leve* 182 427 707,1 0 5251 10 1503

LCT Leve ou Moderada / 4 a 8 Horas 212 845 1744,9 0 11933 10 4192 Grave

LCT Moderada / Grave** 20 4230 3205,9 753 11933 802 10371

LCT Leve* 143 1030 3190,6 2 35085 12 3662

8 a 12 LCT Leve ou Moderada / 177 1677 4474,2 2 35085 12 6356 Horas Grave

LCT Moderada / Grave** 30 4969 7617,8 10 33907 202 24659

LCT Leve* 192 951 1859,9 0 16445 8 4359

12 a 16 LCT Leve ou Moderada / 242 2129 5759,3 0 53244 9 7894 Horas Grave

LCT Moderada / Grave** 42 6296 10701,7 73 53244 109 19745

LCT Leve* 208 869 1936,0 2 22515 9 3401

16 a 20 LCT Leve ou Moderada / 252 1619 3533,2 2 31671 9 6222 Horas Grave

LCT Moderada / Grave** 38 5775 6529,9 5 31671 358 16294

LCT Leve* 264 1030 2938,8 1 35004 11 3757

20 a 24 LCT Leve ou Moderada / 335 2265 7829,2 1 101104 12 8374 Horas Grave

LCT Moderada / Grave** 55 8731 16907,3 13 101104 83 31220

LCT Leve* 24 736 1270,5 5 6131 7 1634

Intervalo de Desvio Tipo n Média Min, Max Percentil 5 Percentil 95 tempo Padrão LCT Leve ou Moderada / 24 a 48 38 2966 7248,2 5 41781 7 17388 Grave Horas LCT Moderada / Grave** 8 2789 2708,1 14 7179 14 7179 * Escala de coma de Glasgow> = 13 ** Escala de coma de Glasgow <= 12 Tabela 7 - Dados TRACK TBI de análise clínica - Níveis de UCH-L1 por segmento de tempo Intervalo de Desvio Tipo n Média Min, Max Percentil 5 Percentil 95 tempo Padrão LCT Leve* 86 350 325,0 22 2235 77 870 LCT Leve ou Moderada / 0 a 4 Horas 93 555 1321,9 22 10390 77 1183 Grave LCT Moderada / Grave** 3 6036 5312,9 116 10390 116 10390 LCT Leve* 182 398 476,1 6 3134 56 1207 LCT Leve ou Moderada / 4 a 8 Horas 212 593 1054,3 6 9187 56 2124 Grave LCT Moderada / Grave** 20 2258 2537,5 48 9187 129 9182 LCT Leve* 143 387 570,2 4 3666 50 1160 LCT Leve ou Moderada / 8 a 12 Horas 177 546 958,3 4 8542 51 2447 Grave LCT Moderada / Grave** 30 1363 1771,2 100 8542 173 5816 LCT Leve* 192 312 581,4 6 6399 39 900 LCT Leve ou Moderada / 12 a 16 Horas 242 503 945,0 6 8235 43 2216 Grave LCT Moderada / Grave** 42 1262 1605,9 62 8235 72 4348 LCT Leve* 208 224 227,2 1 1424 34 686 LCT Leve ou Moderada / 16 a 20 Horas 252 343 474,6 1 3488 38 1256 Grave LCT Moderada / Grave** 38 920 735,5 90 2901 154 2532 LCT Leve* 264 203 215,1 9 1882 36 549 LCT Leve ou Moderada / 20 a 24 Horas 335 272 327,9 9 2062 38 996 Grave LCT Moderada / Grave** 55 632 525,8 42 2062 74 1634 LCT Leve* 24 164 152,0 20 717 27 444 LCT Leve ou Moderada / 24 a 48 Horas 38 679 1895,3 20 11020 27 4481 Grave LCT Moderada / Grave** 8 370 299,3 161 890 161 890 * Escala de coma de Glasgow> = 13 ** Escala de coma de Glasgow <= 12

[0527]As Figuras 1A a 1B incluem gráficos representativos representando os níveis médios de GFAP (Figura 1A) e de UCH-L1 (Figura 1B) em vários pontos no tempo no prazo de 48 horas após a lesão para os grupos de LCT moderada / grave, LCT leve e LCT leve e moderada / grave. Os níveis de GFAP e UCH-L1 são mais altos entre 0 e 4 horas após a lesão no grupo de LCT moderada / grave.

[0528]Dados similares foram obtidos a partir de controles saudáveis (sem trauma sofrido) e de controles orto (que sofreram uma lesão ortopédica, mas sem LCT). As Figuras 2A a 2B incluem gráficos representativos representando os níveis médios de GFAP (Figura 2A) e de UCH-L1 (Figura 2B) em vários pontos no tempo no prazo de 48 horas após a lesão para grupos de LCT leve, controle saudável e controle orto. Os níveis de GFAP e de UCH-L1 são elevados no grupo de LCT leve em comparação com controles saudáveis e controles orto de 0 a 48 horas após a lesão.

Os níveis de UCH-L1 também foram elevados no grupo de controle orto em comparação com controles saudáveis.

[0529]A análise dos dados também foi realizada para correlacionar os níveis médios de GFAP e UCH-L1 em vários pontos no tempo, mais de 48 horas após a lesão, com um diagnóstico de LCT com base em um resultado clínico (escore GCS, resultado de TC ou RM). As Figuras 3A a 3D incluem gráficos representativos dos níveis medianos de GFAP por ponto no tempo em indivíduos atribuídos com escores GCS (13 a 15 = LCT leve; 9 a 12 = LCT moderada; menor ou igual a 8 = LCT grave) (Figuras 3A e 3B), e com base nos resultados de imagiologia (resultado da TC na Figura 3C; resultado de RM na Figura 3D). As Figuras 4A a 4D incluem gráficos representativos dos níveis medianos de GFAP por ponto no tempo em indivíduos atribuídos com escores GCS (13 a 15 = LCT leve; 9 a 12 = LCT moderada; menor ou igual a 8 = LCT grave) (Figuras 4A e 4B), e com base nos resultados de imagiologia (resultado de TC na Figura 4C, resultado de RM na Figura 4D). Juntos, esses dados demonstram que os níveis elevados de GFAP e UCH-L1 em vários pontos no tempo ao longo de 48 horas após a lesão estão correlacionados bem com os resultados clínicos indicando a presença de uma LCT (por exemplo, “positiva”), incluindo LCT leve e LCT moderada / grave.

[0530]A análise de dados também foi realizada para correlacionar os níveis de GFAP e UCH-L1 com os escores de GOSE. As Figuras 5A a 5B incluem gráficos representativos de caixas dos níveis de GFAP (Figura 5A) e UCH-L1 (Figura 5B) em indivíduos agrupados de acordo com os escores de GOSE. Como demonstrado, os níveis de GFAP e UCH-L1 são elevados em indivíduos com escores de GOSE mais próximos de 1 (morte / LCT), em comparação com indivíduos com escores de GOSE mais próximos de 8 (recuperados / saudáveis).

[0531]Além de avaliar as correlações entre os níveis de GFAP e UCH-L1 individualmente com vários indicadores clínicos de LCT, os dados da presente descrição também abordam o valor diagnóstico preditivo de uma combinação dos níveis de referência de GFAP e UCH-L1 na determinação de se um indivíduo sofreu uma LCT. As análises foram baseadas no uso de valores de referência simultâneos, ou pontos de corte, para GFAP e UCH-L1. Se um nível de GFAP ou um nível de UCH- L1 medido ou detectado em um indivíduo for maior do que um valor de referência de GFAP ou UCH-L1 correspondente, prevê-se que um ou mais resultados clínicos sejam positivos ou indicativos de uma LCT nesse indivíduo. Se um nível de GFAP e um nível de UCH-L1 medidos ou detectados em um indivíduo forem ambos inferiores aos valores de referência correspondentes de GFAP ou UCH-L1, prevê-se que um ou mais resultados clínicos sejam negativos ou indicativos de um indivíduo que não sofreu uma LCT (indivíduo saudável).

[0532]Os níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no resultado da TC. A Figura 6 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no resultado da TC (TC positiva) e indivíduos saudáveis (TC negativa). Cada ponto de dados

(representado usando o sinal “+”) representa a sensibilidade e a especificidade associadas a um nível de GFAP e a um nível de UCH-L1 de um indivíduo diagnosticado como tendo uma LCT baseado em TC, ou de um indivíduo saudável (TC negativa). Como mostrado na Figura 6, combinações de níveis de referência para GFAP e UCH-L1 podem ser correlacionadas com um ou mais resultados clínicos, tal como resultado de TC, para determinar se um indivíduo sofreu uma LCT.

[0533]A Tabela 8 abaixo é um resumo dos dados que correlacionam os níveis de referência de GFAP e de UCH-L1 com faixas de sensibilidade e especificidade do ensaio em vários pontos no tempo no período de mais de 48 horas após a lesão.

Tabela 8 - Pontos de corte (níveis de referência) de biomarcadores para a combinação de GFAP / UCH-L1 com base no resultado da TC, escore GCS e

RM Suspeitos de LCT vs Faixa de Faixa de Faixa de Faixa de Faixa de NPV Faixa de PPV Saudáveis sensibilidade especificidade GFAP UCH-L1 (pg/mL) (pg/mL) (%) (pg/mL) (pg/mL) Todos 90,09 a 96,45 30,03 a 52,04 40 a 480 110 a 2000 84,13 a 93,65 43,29 a 52,61 0a4h 90,38 a 97,12 395 a 1000 710 a 2000 96,15 a 97,96 23,08 a 42,86 Menos de 70% 4a8h 91,53 a 98,31 30 a 62,35 20 a 1000 130 a 2000 94,05 a 98,73 32,39 a 45,83 TC 8 a 12 h 91,30 a 98,55 30,40 a 52 35 a 670 90 a 2000 86,36 a 97,44 42,00 a 51,22 12 a 16 h 90,52 a 99,14 30,49 a 61,59 20 a 1000 90 a 2000 84,72 a 98,04 48,65 a 62,50 16 a 20 h 90,65 a 99,07 30,25 a 53,09 35 a 1000 80 a 2000 87,18 a 98,00 47,91 a 56,07 20 a 24 h 90,32 a 96,77 30,46 a 55,84 30 a 1000 70 a 2000 82,14 a 92,42 51,25 a 62,01 24 a 48 h 80,00 a 100 48,57 a 82,86 30 a 1000 70 a 2000 87,50 a 100 51,35 a 72,73 Todos 90,05 a 97,51 30,01 a 65,65 70 a 1000 110 a 2000 96,11 a 98,68 17,77 a 29,77 0a4h 90,65 a 97,20 605 a 1000 740 a 2000 98,98 a 99,05 16,67 a 40,00 Menos de 70% 4a8h 90,00 a 100,00 42,58 a 85,65 280 a 1000 210 a 2000 98,88 a 100 13,67 a 37,50 GCS 8 a 12 h 90,00 a 96,67 30,49 a 79,27 80 a 1000 100 a 2000 96,70 a 98,82 20,28 a 44,26 12 a 16 h 90,48 a 97,62 30,41 a 64,52 75 a 1000 100 a 2000 94,87 a 98,73 20,53 a 33,04 16 a 20 h 92,11 a 97,37 30,30 a 66,23 60 a 1000 100 a 2000 97,87 a 99,19 18,69 a 30,97 20 a 24 h 90,91 a 98,18 30,30 a 61,28 65 a 1000 90 a 2000 95,74 a 98,91 19,77 a 30,30 24 a 48 h 100 61,7 a 65,96 540 a 1000 140 a 180 100 30,77 a 33,33 GOSE Todos 82,61 a 95,65 30 a 93,33 80 a 2000 130 a 2000 96,92 a 99,05 12,50 a 57,58 RM Todos 80,60 a 97,01 30,19 a 84,91 15 a 1000 50 a 2000 77,59 a 94,44 63,73 a 87,69

[0534]Por vários pontos no tempo, a sensibilidade e a especificidade do ensaio melhoraram usando uma combinação de níveis de referência para GFAP e

UCH-L1, em comparação com a sensibilidade e a especificidade do ensaio com base apenas no nível de referência de GFAP, como mostrado abaixo na Tabela 9.

Tabela 9 – Pontos de corte (níveis de referência) de biomarcadores para a combinação de GFAP / UCH-L1 em comparação com GFAP individualmente (com base no resultado da TC) Pontos de corte de biomarcadores GFAP combinados Individualmente Especificidade Especificidade GFAP (pg/mL) UCH-L1 (pg/mL) Sensibilidade (%) (%) (% diferença) 50 2000 97.5 51 42 (-9) 110 2000 95 62 50 (-12) 4a8 140 2000 91.5 66 61 (-5) horas Sensibilidade (% diferença) 500 1450 76 80 75 (-1) 840 2000 54 90 51 (-3) Especificidade Especificidade GFAP (pg/mL) UCH-L1 (pg/mL) Sensibilidade (%) (%) (% diferença) 115 110 97,5 32 21 (-11) 8 a 12 95 2000 95 45 37 (-8) horas 240 300 91,5 52 40 (-12) Sensibilidade (% diferença) 800 900 61 80 57 (-4) Especificidade Especificidade GFAP (pg/mL) UCH-L1 (pg/mL) Sensibilidade (%) (%) (% diferença) 190 90 99 36 5 (-31) 12 a 16 150 190 95 50 34 (-16) horas 285 190 91,5 60 50 (-10) 555 810 72 80 70 (-2) 880 810 66 85 62 (-4) 975 1580 60 87 58 (-2)

[0535]Os níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no escore GCS. A Figura 7 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos atribuídos com um escore GCS; os indivíduos que receberam escore GCS ≤ 12 foram positivos (LCT moderada ou grave) e os indivíduos que receberam escore GCS > 12 foram negativos (LCT leve ou controles saudáveis). Cada ponto de dados (representado usando o sinal “+”) representa a sensibilidade e a especificidade associadas a um nível de GFAP e a um nível de UCH-L1 de um indivíduo diagnosticado como tendo uma LCT com base em um escore GCS atribuído.

Como mostrado na Figura 7, combinações de níveis de referência para GFAP e UCH- L1 podem ser correlacionadas com um ou mais resultados clínicos, tal como o escore GCS, para determinar se um indivíduo sofreu uma LCT.

[0536]Por exemplo, além dos resultados da TC discutidos acima, a Tabela 6 inclui um resumo dos dados correlacionando os níveis de referência de GFAP e UCH- L1 com faixas de sensibilidade e especificidade do ensaio em vários pontos no tempo ao longo de 48 horas após a lesão, com base no escore GSC. Para vários pontos no tempo, a sensibilidade e a especificidade do ensaio melhoraram usando uma combinação de níveis de referência para GFAP e UCH-L1, em comparação com a sensibilidade e a especificidade do ensaio com base apenas em um nível de referência de GFAP, como mostrado abaixo na Tabela 10.

Tabela 10 – Pontos de corte (níveis de referência) de biomarcadores para a combinação de GFAP / UCH-L1 em comparação com GFAP individualmente (com base no escore GCS) Pontos de corte de biomarcadores GFAP combinados Individualmente Especificidade Especificidade GFAP (pg/mL) UCH-L1 (pg/mL) Sensibilidade (%) (%) (% diferença) 8 a 12 horas 240 860 97 51 40 (-11) 265 860 93 53 44 (-9) 890 920 90 79 45 (-34) Especificidade Especificidade GFAP (pg/mL) UCH-L1 (pg/mL) Sensibilidade (%) (%) (% diferença) 105 840 97,5 36 30 (-6) 370 110 95 33 31 (-2) 12 a 16 505 1580 90 66 63 (-3) horas Sensibilidade (% dierença) 695 1570 88 70 84 (-4) 150 2000 79 75 77 (-2)

[0537]Os níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no resultado da RM. A Figura 8 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no resultado da RM (RM positiva) e indivíduos de controle saudáveis (RM negativa). Cada ponto de dados (representado usando o sinal “+”) representa a sensibilidade e a especificidade associadas a um nível de GFAP e a um nível de UCH-L1 de um indivíduo diagnosticado como tendo uma LCT baseado em uma RM. Como mostrado na Figura 8, combinações de níveis de referência para GFAP e UCH-L1 podem ser correlacionadas com um ou mais resultados clínicos, como resultado de exame de RM, para determinar se um indivíduo sofreu uma LCT.

[0538]Os níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no escore GOSE. A Figura 9 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no escore de GOSE (1 = LCT / morte) e em indivíduos saudáveis (8 = saudáveis / recuperados).

Cada ponto de dados (representado usando o sinal “+”) representa a sensibilidade e a especificidade associadas a um nível de GFAP e a um nível de UCH-L1 de um indivíduo diagnosticado como tendo uma LCT com base no escore de GOSE de 8.

Como mostrado na Figura 9, combinações de níveis de referência para GFAP e UCH- L1 podem ser correlacionadas com um ou mais resultados clínicos, tal como os escores de GOSE, para prever a recuperação em um indivíduo que sofreu uma LCT.

[0539]Os níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos apresentados como tendo uma LCT. A Tabela 11 abaixo mostra que, em vários pontos no tempo (4 a 8 horas, 8 a 12 horas e 12 a 16 horas), a sensibilidade e a especificidade do ensaio melhoraram usando uma combinação de níveis de referência para GFAP e UCH-L1, em comparação com o ensaio de sensibilidade e especificidade com base apenas no nível de referência de GFAP.

Tabela 11 – Pontos de corte (níveis de referência) de biomarcadores para a combinação de GFAP / UCH-L1 em comparação com GFAP individualmente (suspeita de LCT) Pontos de corte de biomarcadores GFAP combinados Individualmente Especificidade Especificidade GFAP (pg/mL) UCH-L1 (pg/mL) Sensibilidade (%) (%) (% diferença) 15 70 97 59 35 (-24) 30 70 95 76 47 (-29) 4a8 40 100 90 94 64 (-30) horas Sensibilidade (% diferença) 30 110 98 100 76 (-22) Especificidade Especificidade GFAP (pg/mL) UCH-L1 (pg/mL) Sensibilidade (%) (%) (% diferença) 15 90 97 71 47 (-24) 8 a 12 15 150 95 82 53 (-29) horas Sensibilidade (% diferença) 30 110 92 100 89 (-3) Especificidade Especificidade GFAP (pg/mL) UCH-L1 (pg/mL) Sensibilidade (%) (%) (% diferença) 10 60 97.5 35 18 (-17) 12 a 16 20 60 95 65 35 (-30) horas Sensibilidade (% diferença) 30 110 90 100 86 (-4)

[0540]Os níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo um LCT vs. controles orto. Além de avaliar as correlações entre os níveis de GFAP e UCH-L1 individualmente com vários indicadores clínicos de LCT usando controles saudáveis, os dados da presente descrição também abordam o valor diagnóstico preditivo de uma combinação dos níveis de referência de GFAP e UCH- L1 na determinação de se um indivíduo que sofreu uma lesão ortopédica também sofreu uma LCT. As análises foram baseadas no uso de valores de referência simultâneos, ou pontos de corte, tanto para GFAP quanto para UCH-L1.

[0541]A Tabela 12 abaixo é um resumo dos dados correlacionando os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 com faixas de sensibilidade e especificidade do ensaio em vários pontos no tempo no período de mais de 48 horas após a lesão.

Tabela 12 – Pontos de corte (níveis de referência) de biomarcadores para a combinação de GFAP / UCH-L1 com base no resultado da TC, escore GCS e RM (Controles Orto) Suspeitos de LCT vs Faixa de Faixa de Faixa de Faixa de Faixa de NPV Faixa de PPV Orto Sensibilidade Especificidade GFAP UCH-L1 Todos 90,09 a 96,64 30 a 53,01 40 a 480 110 a 2000 84,04 a 93,98 42,54 a 52,55 0a4h Menos de 70% 90,40 a 97,60 370 a 1000 700 a 2000 96,8 a 98,32 25,00 a 42,86 4a8h 91,53 a 98,31 30,37 a 65,97 20 a 1000 130 a 2000 95,10 a 98,98 30,00 a 45,45 8 a 12 h 91,30 a 98,55 30,14 a 56,85 25 a 350 120 a 2000 89,09 a 97,92 39,29 a 50,00

TC 12 a 16 h 90,52 a 99,14 30,07 a 58,74 20 a 1000 70 a 2000 85,90 a 97,87 52,61 a 64,02 16 a 20 h 90,65 a 99,07 30,05 a 56,83 25 a 1000 100 a 2000 87,14 a 98,28 43,61 a 55,11 20 a 24 h 90,32 a 96,13 30,28 a 59,63 25 a 305 100 a 2000 82,14 a 93,33 48,29 a 61,74 24 a 48 h 70,00 a 100 32,14 a 91,07 25 a 1000 110 a 2000 89,47 a 100 32,73 a 75,00 Todos 90,05 a 97,51 30,06 a 66,22 65 a 1000 120 a 2000 96,17 a 98,7 17,54 a 29,77 0a4h Menos de 70% 90,63 a 97,66 395 a 1000 710 a 2000 99,15 a 99,21 14,29 a 40,00 4a8h 90,00 a 100,00 43,91 a 86,96 200 a 1000 210 a 2000 99,00 a 100 12,84 a 37,50 8 a 12 h 83,33 a 96,67 30,27 a 81,62 40 a 1000 110 a 2000 96,79 a 99,06 18,35 a 43,33

GCS 12 a 16 h 90,48 a 97,62 30,25 a 67,65 75 a 1000 110 a 2000 95,12 a 98,99 19,02 a 33,04 16 a 20 h 81,58 a 97,37 30,16 a 80,16 45 a 1000 120 a 2000 96,65 a 99,31 17,37 a 38,27 20 a 24 h 80,00 a 98,18 30,19 a 81,13 45 a 1000 100 a 2000 95,05 a 98,99 18,38 a 42,31 24 a 48 h 100 60,29 320 a 1000 180 a 220 100 22,86 GOSE Todos 82,61 a 95,65 30 a 93,33 80 a 2000 130 a 2000 96,92 a 99,05 12,50 a 57,58 RM Todos 80,60 a 97,01 31,08 a 89,19 15 a 1000 80 a 2000 82,43 a 96,36 55,26 a 87,69

[0542]Além disso, a Tabela 12 inclui um resumo dos dados que correlacionam os níveis de referência de GFAP e UCH-L1 com as faixas de sensibilidade e especificidade do ensaio em vários pontos no tempo no período de 48 horas após a lesão, com base no escore GCS. A Figura 10 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no resultado da RM (RM positiva) e em indivíduos de controle orto (RM negativa). Cada ponto de dados (representado usando o sinal “+”) representa a sensibilidade e a especificidade associadas a um nível de GFAP e a um nível de UCH-L1 de um indivíduo diagnosticado como tendo uma LCT baseado em uma RM. Como mostrado na Figura 10, combinações de níveis de referência para GFAP e UCH-L1 podem ser correlacionadas com um ou mais resultados clínicos, tal como o resultado de RM, para determinar se um indivíduo sofreu uma LCT.

[0543]A Figura 11 é um gráfico representativo comparando a sensibilidade e a especificidade do ensaio para vários níveis de GFAP e UCH-L1 em indivíduos diagnosticados como tendo uma LCT com base no escore GOSE (1 = LCT / morte) e em indivíduos de controle orto (8 = saudáveis / recuperados). Cada ponto de dados (representado usando o sinal “+”) representa a sensibilidade e a especificidade associadas a um nível de GFAP e a um nível de UCH-L1 de um indivíduo diagnosticado como tendo uma LCT com base no escore GOSE de 8. Como mostrado na Figura 11, combinações de níveis de referência para GFAP e UCH-L1 podem ser correlacionadas com um ou mais resultados clínicos, tal como os escores GOSE, para prever a recuperação em um indivíduo que sofreu uma LCT.

[0544]Entende-se que a descrição detalhada acima e os exemplos em anexo são meramente ilustrativos e não devem ser tomados como limitações ao escopo, que é definido apenas pelas reivindicações em anexo e seus equivalentes.

[0545]Várias alterações e modificações nas modalidades descritas serão evidentes para os versados na técnica. Tais alterações e modificações, incluindo, sem limitação, aquelas relacionadas às estruturas químicas, substituintes, derivativos, intermediários, sínteses, composições, formulações ou métodos de uso, podem ser feitas sem abandonar o espírito e o escopo.

[0546]Para completar, vários aspectos são descritos nas seguintes cláusulas numeradas:

[0547]Cláusula 1. Um método para auxiliar no diagnóstico ou determinar se um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça tem lesão cerebral traumática (LCT) moderada a grave, o método compreendendo: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 105 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 110 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 105 pg / mL a cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 110 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo mais provavelmente não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 890 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de cerca de 2000 pg / mL.

[0548]Cláusula 2. O método da cláusula 1, em que o indivíduo recebeu um escore na Escala de Coma de Glasgow (GCS) antes ou depois da realização do ensaio, e em que o indivíduo é suspeito de ter LCT moderada a grave com base no escore GCS.

[0549]Cláusula 3. O método da cláusula 2, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com indivíduos com LCT moderada a grave com base em um escore GCS menor ou igual a 12.

[0550]Cláusula 4. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 3, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a 79% e uma especificidade igual para ou superior a cerca de 33%.

[0551]Cláusula 5. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 4, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0552]Cláusula 6. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 5, em que o ensaio tem uma sensibilidade pelo menos 2% maior e uma especificidade pelo menos 3% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[0553]Cláusula 7. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 6, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97% e uma especificidade igual ou superior a 51%.

[0554]Cláusula 8. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 6, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97,5% e uma especificidade igual ou superior a 36%.

[0555]Cláusula 9. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 6, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 79%.

[0556]Cláusula 10. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 6, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 66%.

[0557]Cláusula 11. Método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar uma tomografia computadorizada (TC) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, o método compreendendo: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 50 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 90 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 50 pg / mL a cerca de 975 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 90 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 975 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[0558]Cláusula 12. O método da cláusula 11, em que o indivíduo recebeu uma TC antes ou após a realização do ensaio, e em que se suspeita que o indivíduo tenha uma LCT com base no resultado da TC.

[0559]Cláusula 13. O método da cláusula 12, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um resultado negativo da TC.

[0560]Cláusula 14. O método de qualquer uma das cláusulas 11 a 13, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 54% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 32%.

[0561]Cláusula 15. O método de qualquer uma das cláusulas 11 a 14, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0562]Cláusula 16. O método de qualquer uma das cláusulas 11 a 15, em que o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 2% maior e uma especificidade pelo menos 4% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[0563]Cláusula 17. O método de qualquer uma das cláusulas 11 a 16, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 62%.

[0564]Cláusula 18. O método de qualquer uma das cláusulas 11 a 16, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 300 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 91,5% e uma especificidade igual ou superior a 52%.

[0565]Cláusula 19. O método de qualquer uma das cláusulas 11 a 16, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 190 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 99% e uma especificidade igual ou superior a 36%.

[0566]Cláusula 20. Método para auxiliar na determinação ou determinar se um indivíduo humano que sofreu uma lesão na cabeça sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT), o método compreendendo: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após uma lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi- terminal de ubiquitina L1 (UCH- L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 70 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo provavelmente não sofreu uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 40 pg / mL, e o o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 70 pg / mL a cerca de 150 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo provavelmente não sofreu uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 40 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 150 pg / mL.

[0567]Cláusula 21. O método da cláusula 20, em que o nível de referência de

GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 90% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 35%.

[0568]Cláusula 22. O método das cláusulas 20 ou 21, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão.

[0569]Cláusula 23. O método de qualquer uma das cláusulas 20 a 21, em que o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 3% maior e uma especificidade pelo menos 17% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[0570]Cláusula 24. O método de qualquer uma das cláusulas 20 a 23, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 92% e uma especificidade igual ou superior a 99%.

[0571]Cláusula 25. O método de qualquer uma das cláusulas 20 a 23, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 99%.

[0572]Cláusula 26. O método de qualquer uma das cláusulas 20 a 23, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 40 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 100 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 94%.

[0573]Cláusula 27. O método de qualquer uma das cláusulas 20 a 23, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 82%.

[0574]Cláusula 28. O método de qualquer uma das cláusulas 20 a 23, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 65%.

[0575]Cláusula 29. Método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar um procedimento de ressonância magnética (RM) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, o método compreendendo: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou

(c) determinar que o indivíduo mais provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[0576]Cláusula 30. O método da cláusula 29, em que o indivíduo recebeu uma RM após a realização do ensaio, e em que o indivíduo é suspeito de ter uma LCT com base no resultado da RM.

[0577]Cláusula 31. O método da cláusula 30, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um resultado negativo de RM.

[0578]Cláusula 32. O método de qualquer uma das cláusulas 29 a 31, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 98% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 85%.

[0579]Cláusula 33. O método de qualquer uma das cláusulas 29 a 32, em que o indivíduo recebeu um resultado negativo na TC antes da realização do ensaio.

[0580]Cláusula 34. Método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar um procedimento de ressonância magnética (RM) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, o método compreendendo: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) ou um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 0 pg / mL a cerca de 68 pg / mL, ou o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 0 pg / mL a cerca de 99 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 68 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 99 pg / mL

[0581]Cláusula 35. O método da cláusula 34, em que o indivíduo recebeu uma RM após a realização do ensaio, e em que o indivíduo é suspeito de ter uma LCT com base no resultado da RM.

[0582]Cláusula 36. O método da cláusula 34, em que o nível de referência de GFAP ou o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um resultado negativo de RM.

[0583]Cláusula 37. O método de qualquer uma das cláusulas 34 a 36, em que o nível de referência de GFAP é determinado por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 90% a cerca de 95% e uma especificidade de cerca de 31% a cerca de 46%.

[0584]Cláusula 38. O método de qualquer uma das cláusulas 34 a 36, em que o nível de referência de UCH-L1 é determinado por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 81% a cerca de 84% e uma especificidade de cerca de 31% a cerca de 34%.

[0585]Cláusula 39. O método de qualquer uma das cláusulas 34 a 36, em que o indivíduo recebeu um resultado negativo da TC antes da realização do ensaio.

[0586]Cláusula 40. Método para auxiliar na previsão ou prever o resultado de um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, o método compreendendo:

realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) prever para o indivíduo um resultado favorável quando o nível de GFAP na amostra for menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 80 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra for menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 130 pg / mL; ou (b) prever para o indivíduo um resultado provavelmente mais desfavorável quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 80 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 130 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) prever para o indivíduo um resultado provavelmente mais desfavorável quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 2000 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[0587]Cláusula 41. O método da cláusula 40, em que o indivíduo recebeu um escore na Escala de Resultados de Glasgow Estendida (GOSE) após a realização do ensaio e em que o indivíduo é suspeito de ter um resultado ruim com base no escore GOSE.

[0588]Cláusula 42. O método da cláusula 41, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com indivíduos com um resultado ruim com base em um escore GOSE de 1.

[0589]Cláusula 43. O método de qualquer uma das cláusulas 40 a 42, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 97% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 95%.

[0590]Cláusula 44. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 43, em que a medição dos níveis de GFAP e UCH-L1 é medida ou detectada usando um imunoensaio ou ensaio químico clínico.

[0591]Cláusula 45. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 43, em que a medição dos níveis de GFAP e UCH-L1 é medida ou detectada usando um ensaio de detecção de molécula única.

[0592]Cláusula 46. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 43, em que a medição do nível de GFAP compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno GFAP - pelo menos um anticorpos de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de CFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[0593]Cláusula 47. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 43 e 46, em que a medição do nível de UCH-L1 compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado ao pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de um antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos de anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

[0594]Cláusula 48. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 47, em que a amostra é selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma.

[0595]Cláusula 49. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 48, em que a amostra é obtida depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente.

[0596]Cláusula 50. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 48, em que a amostra é obtida após a ingestão ou exposição do indivíduo a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina.

[0597]Cláusula 51. Método de qualquer uma das cláusulas 1 a 48, em que a amostra é obtida a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[0598]Cláusula 52. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 51, em que o dito método pode ser realizado em qualquer indivíduo, sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo, dos valores laboratoriais do indivíduo, da classificação do indivíduo como sofrendo de lesão cerebral traumática leve, moderada ou grave, da exibição do indivíduo de níveis baixos ou altos de UCH-L1, e do momento de qualquer evento em que o dito indivíduo possa ter sofrido uma lesão na cabeça.

[0599]Cláusula 53. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 52, compreendendo adicionalmente tratar o indivíduo com um tratamento para lesão cerebral traumática.

[0600]Cláusula 54. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 53, compreendendo adicionalmente monitorar o indivíduo.

[0601]Cláusula 55. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 52, em que a amostra é obtida após o indivíduo ter sofrido uma lesão ortopédica.

[0602]Cláusula 57. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 52, em que a amostra é uma amostra de sangue integral.

[0603]Cláusula 58. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 46, em que a amostra é uma amostra de soro.

[0604]Cláusula 59. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 46, em que a amostra é uma amostra de plasma.

[0605]Cláusula 60. O método de qualquer uma das cláusulas 57 a 59, em que o ensaio é um imunoensaio.

[0606]Cláusula 61. O método de qualquer uma das cláusulas 57 a 59, em que o ensaio é um ensaio químico clínico.

[0607]Cláusula 62. O método de qualquer uma das cláusulas 57 a 59, em que o ensaio é um ensaio de detecção de molécula única.

[0608]Cláusula 63. Método para auxiliar no diagnóstico ou determinar se um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça tem lesão cerebral traumática (LCT) moderada a grave, o método compreendendo: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão para medir uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 105 pg / mL a cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 110 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

[0609]Cláusula 64. O método da cláusula 63, em que o indivíduo recebeu um escore na Escala de Coma de Glasgow (GCS) antes ou depois da realização do ensaio, e em que se suspeita que o indivíduo tenha LCT moderada, grave, ou moderada a grave com base no escore GCS.

[0610]Cláusula 65. O método da cláusula 64, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com indivíduos com LCT moderada a grave com base em um escore GCS de 3 a 12.

[0611]Cláusula 66. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 65, em que a amostra é obtida a partir de um indivíduo: dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas de um real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de 24 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, com cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão ou dentro de 44 a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0612]Cláusula 67. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 66, em que: (a) o nível de referência de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; (b) o nível de referência de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (c) o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (d) o nível de referência de GFAP é de cerca de 265 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (e) o nível de referência de GFAP é de cerca de 370 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (f) o nível de referência de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; (g) o nível de referência de GFAP é de cerca de 695 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1570 pg / mL; ou (h) o nível de referência de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL.

[0613]Cláusula 68. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 66, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (b) cerca de 8 horas a cerca de

12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 265 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (c) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL; (d) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; (e) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 370 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (f) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 370 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (g) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1590 pg / mL; (h) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 695 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1570 pg / mL; ou (i) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL.

[0614]Cláusula 69. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 68, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 79% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 33%.

[0615]Cláusula 70. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 69, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo em cerca de 8 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0616]Cláusula 71. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 70, em que o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 2% maior e uma especificidade pelo menos 3% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou

UCH-L1 individualmente.

[0617]Cláusula 72. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 71, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97% e uma especificidade igual ou superior a 51%; (b) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97,5% e uma especificidade igual ou superior a 36%; (c) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 79%; ou (d) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 66%.

[0618]Cláusula 73. Método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar uma tomografia computadorizada (TC) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, o método compreendendo:

realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo em cerca de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão para medir uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e determinar que o indivíduo não precisa de uma tomografia computadorizada quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 50 pg / mL a cerca de 975 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 90 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

[0619]Cláusula 74. O método da cláusula 73, em que o indivíduo recebeu uma TC antes ou depois da realização do ensaio, e em que se suspeita que o indivíduo tenha uma LCT com base no resultado da TC.

[0620]Cláusula 75. O método da cláusula 74, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um resultado negativo da TC.

[0621]Cláusula 76. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 75, em que a amostra é obtida a partir de um indivíduo: dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a efetiva ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de 24 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, ou dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0622]Cláusula 77. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 76, em que (a) o nível de referência de GFAP é de cerca de 50 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (b) o nível de referência de GFAP é de cerca de 95 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (c) o nível de referência de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (d) o nível de referência de GFAP é de cerca de 115 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (e) o nível de referência de GFAP é de cerca de 140 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (f) o nível de referência de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 190 pg / mL; (g) o nível de referência de GFAP é de cerca de 190 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; (h) o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 300 pg / mL; (i) o nível de referência de GFAP é de cerca de 285 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 190 pg / mL; (j) o nível de referência de GFAP é de cerca de 500 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1450 pg / mL; (k) o nível de referência de GFAP é de cerca de 555 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 810 pg / mL; (l) o nível de referência de GFAP é de cerca de 800 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 900 pg / mL; (m) o nível de referência de GFAP é de cerca de 840 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (n) o nível de referência de GFAP é de cerca de 880 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 810 pg / mL; ou (o) o nível de referência de GFAP é de cerca de 975 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL.

[0623]Cláusula 78. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 76, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 50 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (b) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (c) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 140 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (d) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 500 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1450 pg / mL; (e) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL; (f) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; (g) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 370 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (h) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; (i) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 695 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 1570 pg / mL; ou (j) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL.

[0624]Cláusula 79. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 78, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 54% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 32%.

[0625]Cláusula 80. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 79, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0626]Cláusula 81. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 80, em que o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 2% maior e uma especificidade pelo menos 4% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[0627]Cláusula 82. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 81, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 62%; (b) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 300 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 91,5% e uma especificidade igual ou superior a 52%; ou (c) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 190 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 99% e uma especificidade igual ou superior a 36%.

[0628]Cláusula 83. Método para auxiliar na determinação ou determinar se um indivíduo humano que sofreu uma lesão na cabeça sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT), o método compreendendo: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão para medir uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e determinar que o indivíduo provavelmente não sofreu uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 40 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 70 pg / mL a cerca de 150 pg / mL.

[0629]Cláusula 84. O método de qualquer uma da cláusula 83, em que a amostra é obtida a partir de um indivíduo: dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão, dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão, dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão, entre 24 horas e 48 horas após a lesão, entre 28 horas e 32 horas após a lesão, entre 32 horas e 36 horas após a lesão, entre 36 horas e 40 horas após a lesão, cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão, ou dentro de 44 a cerca de 48 horas após a lesão.

[0630]Cláusula 85. O método das cláusulas 83 ou 84, em que (a) o nível de referência de GFAP é de cerca de 10 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; (b) o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 70 pg / mL; (c) o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; (d) o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL; (e) o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; (f) o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de

UCH-L1 é de cerca de 70 pg / mL; ou (g) o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL.

[0631]Cláusula 86. O método das cláusulas 83 ou 84, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 70 pg / mL; (b) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 70 pg / mL; (c) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 40 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 100 pg / mL; (d) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; (e) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL; (f) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (g) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 10 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; (h) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; ou (i) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão e o nível de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL.

[0632]Cláusula 87. O método das cláusulas 83 a 86, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 90% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 35%.

[0633]Cláusula 88. O método de qualquer uma das cláusulas 83 a 87, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão.

[0634]Cláusula 89. O método de qualquer uma das cláusulas 83 a 88, em que o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 3% maior e uma especificidade pelo menos 17% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

[0635]Cláusula 90. O método de qualquer uma das cláusulas 83 a 89, em que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH- L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 92% e uma especificidade igual ou superior a 99%; (b) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH- L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 99%; (c) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 40 pg / mL e o nível de referência de UCH- L1 é de cerca de 100 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 94%; (d) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH- L1 é de cerca de 150 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 82%; ou (e) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH- L1 é de cerca de 60 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 65%.

[0636]Cláusula 91. Método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar um procedimento de ressonância magnética (RM) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, o método compreendendo: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão, para medir uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina carboxi L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

[0637]Cláusula 92. O método da cláusula 91, em que o indivíduo recebeu uma RM após a realização do ensaio, e em que o indivíduo é suspeito de ter uma LCT com base no resultado da RM.

[0638]Cláusula 93. O método da cláusula 91, em que o nível de referência de

GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um resultado negativo de RM.

[0639]Cláusula 94. O método de qualquer uma das cláusulas 91 a 93, em que a amostra é obtida a partir de um indivíduo: dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a efetiva ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de 24 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, com cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, ou dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0640]Cláusula 95. O método de qualquer uma das cláusulas 91 a 94, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 98% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 85%.

[0641]Cláusula 96. O método de qualquer uma das cláusulas 91 a 95, em que o indivíduo recebeu um resultado negativo na TC antes da realização do ensaio.

[0642]Cláusula 97. Método para auxiliar na previsão ou prever o resultado de um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, o método compreendendo: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após uma lesão real ou suspeita de lesão em uma amostra obtida a partir do indivíduo para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível da hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e prever para o indivíduo um resultado provavelmente mais desfavorável quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 80 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL, e o nível de UCH- L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 130 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

[0643]Cláusula 98. O método da cláusula 97, em que o indivíduo recebeu um escore na Escala de Resultados de Glasgow Estendida (GOSE) após a realização do ensaio, e em que o indivíduo é suspeito de ter um resultado ruim com base no escore GOSE.

[0644]Cláusula 99. O método da cláusula 97, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com indivíduos com um resultado ruim com base em um escore GOSE de 1.

[0645]Cláusula 100. O método de qualquer uma das cláusulas 97 a 99, em que a amostra é obtida a partir de um indivíduo: dentro de cerca de 0 a cerca de 4 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 16 horas a cerca de 20 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 20 horas a cerca de 24 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 24 horas a cerca de 28 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de 24 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 28 horas a cerca de 32 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de

32 horas a cerca de 36 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de 36 horas a cerca de 40 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, dentro de cerca de 40 horas a cerca de 44 horas após a lesão real ou suspeita de lesão, ou dentro de cerca de 44 horas a cerca de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

[0646]Cláusula 101. O método de qualquer uma das cláusulas 97 a 100, em que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 97% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 95%.

[0647]Cláusula 102. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 101, em que a medição do nível de GFAP compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno GFAP - pelo menos anticorpos de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de CFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

[0648]Cláusula 103. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 102, em que a medição do nível de UCH-L1 compreende:

(a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos de anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado ao pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos de anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

[0649]Cláusula 104. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 103, em que a amostra é selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma.

[0650]Cláusula 105. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 104, em que a amostra é obtida: (a) depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma por força contundente; (b) após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico,

toxina ou combinação de produto químico e toxina; ou (c) a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[0651]Cláusula 106. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 105, em que o dito método pode ser realizado em qualquer indivíduo, sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo, dos valores laboratoriais do indivíduo, da classificação do indivíduo como sofrendo de lesão cerebral traumática leve, moderada ou grave, da exibição do indivíduo a níveis baixos ou altos de UCH-L1, e do momento de qualquer evento em que o dito indivíduo possa ter sofrido uma lesão na cabeça.

[0652]Cláusula 107. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 106, compreendendo adicionalmente tratar o indivíduo com um tratamento de lesão cerebral traumática.

[0653]Cláusula 108. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 107, compreendendo adicionalmente monitorar o indivíduo.

[0654]Cláusula 109. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 107, em que a amostra é obtida após o indivíduo ter sofrido uma lesão ortopédica.

[0655]Cláusula 110. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 109, em que a amostra é: (a) uma amostra de sangue integral; (b) uma amostra de soro; ou (c) uma amostra de plasma.

[0656]Cláusula 111. O método de qualquer uma das cláusulas 63 a 110, em que o ensaio é: (a) um imunoensaio; (b) um ensaio químico clínico; ou (c) um ensaio de detecção de molécula única.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para auxiliar no diagnóstico ou determinar se um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça tem lesão cerebral traumática (LCT) moderada a grave, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e determinar que o indivíduo não sofreu uma LCT moderada, grave ou moderada a grave quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 105 pg / mL a cerca de 890 pg / mL e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 110 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo recebeu um escore na Escala de Coma de Glasgow (GCS) antes ou depois da realização do ensaio, e em que o indivíduo é suspeito de ter uma LCT moderada, grave, ou moderada a grave com base no escore GCS.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com indivíduos com LCT moderada a grave com base em um escore GCS de 3 a 12.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) o nível de referência de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; (b) o nível de referência de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (c) o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (d) o nível de referência de GFAP é de cerca de 265 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; (e) o nível de referência de GFAP é de cerca de 370 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (f) o nível de referência de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; (g) o nível de referência de GFAP é de cerca de 695 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1570 pg / mL; ou (h) o nível de referência de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 79% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 33%.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 8 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o ensaio tem uma sensibilidade pelo menos 2% maior e uma especificidade pelo menos 3% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 860 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97% e uma especificidade igual ou superior a 51%; (b) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 105 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 840 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 97,5% e uma especificidade igual ou superior a 36%; (c) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 890 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 920 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 79%; ou (d) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 505 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 66%.

9. Método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar uma tomografia computadorizada (TC) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e determinar que o indivíduo não precisa de uma TC quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 50 pg / mL a cerca de 975 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 90 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo recebeu uma TC antes ou depois da realização do ensaio, e em que se suspeita que o indivíduo tenha uma LCT com base no resultado da TC.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um resultado negativo da TC.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o (a) nível de referência de GFAP é de cerca de 50 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (b) o nível de referência de GFAP é de cerca de 95 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (c) o nível de referência de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (d) o nível de referência de GFAP é de cerca de 115 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; (e) o nível de referência de GFAP é de cerca de 140 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (f) o nível de referência de GFAP é de cerca de 150 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 190 pg / mL; (g) o nível de referência de GFAP é de cerca de 190 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; (h) o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 300 pg / mL; (i) o nível de referência de GFAP é de cerca de 285 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 190 pg / mL; (j) o nível de referência de GFAP é de cerca de 500 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1450 pg / mL; (k) o nível de referência de GFAP é de cerca de 555 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 810 pg / mL; (l) o nível de referência de GFAP é de cerca de 800 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 900 pg / mL; (m) o nível de referência de GFAP é de cerca de 840 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; (n) o nível de referência de GFAP é de cerca de 880 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 810 pg / mL; ou (o) o nível de referência de GFAP é de cerca de 975 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 1580 pg / mL.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 54% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 32%.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o ensaio tem uma sensibilidade pelo menos 2% maior e uma especificidade pelo menos 4% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida a partir do indivíduo em: (a) cerca de 4 horas a 8 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 110 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 2000 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 62%; (b) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 240 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 300 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 91,5% e uma especificidade igual ou superior a 52%; ou (c) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão real ou suspeita de lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 190 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 99% e uma especificidade igual ou superior a 36%.

17. Método para auxiliar na determinação ou determinar se um indivíduo humano que sofreu uma lesão na cabeça sofreu uma lesão cerebral traumática (LCT), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão para medir uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e determinar que o indivíduo provavelmente teve uma LCT quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 40 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 70 pg / mL a cerca de 150 pg / mL.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que (a) o nível de referência de GFAP é de cerca de 10 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; (b) o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 70 pg / mL; (c) o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 90 pg / mL; (d) o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL; (e) o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; (f) o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 70 pg / mL; ou (g) o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL.

19. Método, de acordo com as reivindicações 17 ou 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade igual ou superior a cerca de 90% e uma especificidade igual ou superior a cerca de 35%.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19,

CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas após a lesão.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o ensaio tem pelo menos uma sensibilidade 3% maior e uma especificidade pelo menos 17% maior em comparação com um ensaio que mede ou detecta GFAP ou UCH-L1 individualmente.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida a partir do indivíduo dentro de: (a) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 92% e uma especificidade igual ou superior a 99%; (b) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 30 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 110 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 99%; (c) cerca de 4 horas a cerca de 8 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 40 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 100 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 90% e uma especificidade igual ou superior a 94%; (d) cerca de 8 horas a cerca de 12 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 15 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 150 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 82%; ou (e) cerca de 12 horas a cerca de 16 horas após a lesão; em que o nível de referência de GFAP é de cerca de 20 pg / mL e o nível de referência de UCH-L1 é de cerca de 60 pg / mL; e em que o ensaio tem uma sensibilidade igual ou superior a 95% e uma especificidade igual ou superior a 65%.

23. Método para auxiliar na determinação ou determinar se deve realizar um procedimento de ressonância magnética (RM) da cabeça em um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e (a) determinar que o indivíduo não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é menor do que um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é menor do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL; ou (b) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 15 pg / mL a cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 50 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL; ou (c) determinar que o indivíduo provavelmente não precisa de um procedimento de RM quando o nível de GFAP na amostra é maior do que um nível de referência de GFAP de cerca de 1000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 na amostra é maior do que um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 2000 pg / mL.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo recebeu uma RM após a realização do ensaio, e em que se suspeita que o indivíduo tenha uma LCT com base no resultado da RM.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com um resultado negativo de RM.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 98% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 85%.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo recebeu um resultado negativo da TC antes da realização do ensaio.

28. Método para auxiliar na previsão ou prever o resultado de um indivíduo humano que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do indivíduo dentro de 48 horas após a lesão real ou suspeita de lesão para medir ou detectar uma combinação de um nível de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) e um nível de hidrolase carboxi- terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1) na amostra; e prever para o indivíduo mais provavelmente um resultado desfavorável quando o nível de GFAP na amostra é igual a um nível de referência de GFAP de cerca de 80 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL, e o nível de UCH-L1 no amostra é igual a um nível de referência de UCH-L1 de cerca de 130 pg / mL a cerca de 2000 pg / mL.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo recebeu um escore na Escala de Resultados de Glasgow Estendida (GOSE) após a realização do ensaio, e em que o indivíduo é suspeito de ter um resultado ruim com base no escore GOSE.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 estão correlacionados com indivíduos com um resultado ruim com base em um escore

GOSE de 1.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de referência de GFAP e o nível de referência de UCH-L1 são determinados por um ensaio com uma sensibilidade de cerca de 80% a cerca de 97% e uma especificidade de cerca de 30% a cerca de 95%.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a medição do nível de GFAP compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de GFAP, que se liga a um epítopo em GFAP ou no fragmento de GFAP para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em GFAP que não está ligado ao anticorpo de captura de GFAP, para formar um complexo de antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de GFAP na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em pelo menos um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de GFAP - antígeno de GFAP - pelo menos um anticorpo de detecção de GFAP.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a medição do nível de UCH-L1 compreende: (a) colocar a amostra em contato, simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem com: (1) pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, que se liga a um epítopo em UCH-L1 ou no fragmento de UCH-L1 para formar um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1, e (2) pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1 que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em UCH-L1 que não está ligado por pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1, para formar um complexo de antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1, de modo que um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos anticorpo de detecção de UCH-L1 seja formado; e (b) medir a quantidade ou concentração de UCH-L1 na amostra com base no sinal gerado pelo marcador detectável em um complexo de pelo menos um anticorpo de captura de UCH-L1 - antígeno de UCH-L1 - pelo menos um anticorpo de detecção de UCH-L1.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra de sangue integral, uma amostra de soro, uma amostra de líquido cefalorraquidiano e uma amostra de plasma.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida: (a) depois que o indivíduo sofreu uma lesão na cabeça causada por agitação física, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou outros tipos de trauma contundente; (b) após o indivíduo ter ingerido ou ter sido exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina; ou (c) a partir de um indivíduo que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método pode ser realizado em qualquer indivíduo, sem levar em consideração fatores selecionados a partir do grupo que consiste da condição clínica do indivíduo, dos valores laboratoriais do indivíduo, da classificação do indivíduo como sofrendo de lesão cerebral traumática leve, moderada ou grave, da exposição do indivíduo de níveis baixos ou altos de UCH-L1, e do momento de qualquer evento em que o dito indivíduo possa ter sofrido uma lesão na cabeça.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente tratar o indivíduo com um tratamento para lesão cerebral traumática.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente monitorar o indivíduo.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida após o indivíduo ter sofrido uma lesão ortopédica.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é: (a) uma amostra de sangue integral; (b) uma amostra de soro; ou (c) uma amostra de plasma.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o ensaio é: (a) um imunoensaio; (b) um ensaio químico clínico; ou (c) um ensaio de detecção de molécula única.

Análise Clínica de LCT Dados TRACK TBI Gráfico de linha de GFAP: Média por Intervalo de tempo Tipos de LCT

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 338/359 LCT Moderada/Grave 1/20

Intervalo de Tempo

LCT Moderada/Grave LCT Leve LCT Leve ou Moderada/Grave

Análise Clínica de LCT Dados TRACK TBI Gráfico de linha de UCHL1: Média por Intervalo de tempo Tipos de LCT

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 339/359 LCT Moderada/Grave 2/20

Intervalo de Tempo

LCT Moderada/Grave LCT Leve LCT Leve ou Moderada/Grave

Análise Clínica de LCT Dados TRACK TBI Gráfico de linha de GFAP: Média por Intervalo de tempo LCT Leve vs.

Tipos de controle

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 340/359 Controle 3/20

Intervalo de Tempo

Controle LCT Leve Orto

Análise Clínica de LCT Dados TRACK TBI Gráfico de linha de UCHL1: Média por Intervalo de tempo LCT Leve vs.

Tipos de controle

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 341/359 Controle 4/20

Intervalo de Tempo

Controle LCT Leve Orto

Moderada Grave Leve Nível GCS

GFAP Médio

Moderada/Grave Leve

GFAP Médio

Positivo Negativo Resultado da TC

GFAP Médio

Positivo Negativo Resultado da RM

GFAP Médio

Moderada Grave Leve Nível GCS

UCHL1 Médio

Moderada/Grave Leve

UCHL1 Médio

Positivo Negativo Resultado da TC

UCHL1 Médio

Positivo Negativo Resultado da RM

UCHL1 Médio

Histogramas de GFAP por GOSE

Histogramas de UCHL1 por GOSE

Análise Clínica TRACK TBI – GFAP & UCHL1 combinados Sensibilidade e Especificidade usando múltiplos pontos de corte Controles saudáveis - TC (Positivo vs.

Negativo) Sensibilidade

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 352/359 15/20

1 - Especificidade

Análise Clínica TRACK TBI – GFAP & UCHL1 combinados Sensibilidade e Especificidade usando múltiplos pontos de corte Controles saudáveis –Escala de Coma de Glasgow ( 12 é Positivo, > 12 é Negativo) Sensibilidade

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 353/359 16/20

1 - Especificidade

Análise Clínica TRACK TBI – GFAP & UCHL1 combinados Sensibilidade e Especificidade usando múltiplos pontos de corte Controles saudáveis - RM (Positivo vs.

Negativo) Sensibilidade

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 354/359 17/20

1 - Especificidade

Análise Clínica TRACK TBI – GFAP & UCHL1 combinados Sensibilidade e Especificidade usando múltiplos pontos de corte Controles saudáveis – Escala de Coma de Glasgow Estendida (1 vs. 8) Sensibilidade

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 355/359 18/20

1 - Especificidade

Análise Clínica TRACK TBI – GFAP & UCHL1 combinados Sensibilidade e Especificidade usando múltiplos pontos de corte Controles orto - RM (Positivo vs.

Negativo) Sensibilidade

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 356/359 19/20

1 - Especificidade

Análise Clínica TRACK TBI – GFAP & UCHL1 combinados Sensibilidade e Especificidade usando múltiplos pontos de corte Controles orto – Escala de Coma de Glasgow Estendida (1 vs. 8) Sensibilidade

Petição 870200062478, de 20/05/2020, pág. 357/359 20/20

1 - Especificidade