JPH09252674A - アグロバクテリウム属の微生物による遺伝子導入方法及び形質転換植物の作出方法 - Google Patents
アグロバクテリウム属の微生物による遺伝子導入方法及び形質転換植物の作出方法Info
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- JPH09252674A JPH09252674A JP8070584A JP7058496A JPH09252674A JP H09252674 A JPH09252674 A JP H09252674A JP 8070584 A JP8070584 A JP 8070584A JP 7058496 A JP7058496 A JP 7058496A JP H09252674 A JPH09252674 A JP H09252674A
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- plant
- genus
- culture medium
- brassica
- tissue
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ブラシカ属の植物の組織片を組織片培養
培地で前培養した後、アグロバクテリウム属の微生物を
含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を前記組織片培養
培地で共存培養し、次いで、共存培養後の組織片からカ
ルスを誘導し、得られたカルスを再分化することによ
り、ブラシカ属の形質転換植物を作出する方法におい
て、組織片培養培地のｐＨを特定範囲とすること、組織
片培養培地にフィーダーセルを添加すること、又は、感
染液への浸漬時間、共存培養時の温度、及び共存培養期
間の３者を特定の値とすること、を特徴とするブラシカ
属の形質転換植物の作出方法。 【効果】 アグロバクテリウム属の微生物を用いて、効
率的にブラシカ属の植物に遺伝子を導入し、形質転換植
物を作出する方法を提供する。
培地で前培養した後、アグロバクテリウム属の微生物を
含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を前記組織片培養
培地で共存培養し、次いで、共存培養後の組織片からカ
ルスを誘導し、得られたカルスを再分化することによ
り、ブラシカ属の形質転換植物を作出する方法におい
て、組織片培養培地のｐＨを特定範囲とすること、組織
片培養培地にフィーダーセルを添加すること、又は、感
染液への浸漬時間、共存培養時の温度、及び共存培養期
間の３者を特定の値とすること、を特徴とするブラシカ
属の形質転換植物の作出方法。 【効果】 アグロバクテリウム属の微生物を用いて、効
率的にブラシカ属の植物に遺伝子を導入し、形質転換植
物を作出する方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アグロバクテリウ
ム属の微生物を用いて、効率的にブラシカ属の植物に遺
伝子を導入し、形質転換植物を作出する方法に関する。
ム属の微生物を用いて、効率的にブラシカ属の植物に遺
伝子を導入し、形質転換植物を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】バイオテクノロジーが急速に進展する中
で、組織培養、葯培養、細胞培養などのバイオテクノロ
ジー技術を利用して、多様な特性を有する品種が育成さ
れてきた。更に組換えＤＮＡ技術の発達により通常交配
不可能な他の生物種の遺伝子を導入することにより、従
来期待し得なかった特性を有する品種が育成されてい
る。
で、組織培養、葯培養、細胞培養などのバイオテクノロ
ジー技術を利用して、多様な特性を有する品種が育成さ
れてきた。更に組換えＤＮＡ技術の発達により通常交配
不可能な他の生物種の遺伝子を導入することにより、従
来期待し得なかった特性を有する品種が育成されてい
る。
【０００３】アメリカでは既に、日持ちの良いトマトと
してポリガラクツロナーゼ遺伝子のアンチセンスを導入
したトマト（フレバーセーバー）が市場に出回ってい
る。また、BT-Toxinを導入した耐虫性バレイショ、トウ
モロコシ、除草剤耐性遺伝子を導入したワタ、大豆、ウ
ィルスの外被タンパク質を導入したカボチャが、いずれ
も食品としての安全性が認可され、実用化の段階にあ
る。
してポリガラクツロナーゼ遺伝子のアンチセンスを導入
したトマト（フレバーセーバー）が市場に出回ってい
る。また、BT-Toxinを導入した耐虫性バレイショ、トウ
モロコシ、除草剤耐性遺伝子を導入したワタ、大豆、ウ
ィルスの外被タンパク質を導入したカボチャが、いずれ
も食品としての安全性が認可され、実用化の段階にあ
る。
【０００４】カナダでは除草剤耐性のナタネが安全評価
を終え、実用化の段階にある。これら組換えＤＮＡ技術
を利用した作物の商品化は今後ますます進む傾向にあ
る。組換えＤＮＡを利用した品種の作出には優良な遺伝
子の単離と植物への遺伝子導入技術が必要とされる。植
物への遺伝子導入方法にはアグロバクテリウム法、エレ
クトロポレーション法、パーティクルガン法などがあ
る。アグロバクテリウム法はナス科、ウリ科の植物では
高率で形質転換植物を作出できるが、アブラナ科の植物
では成功率が低く、効率的な遺伝子導入技術及び再分化
技術の開発が急がれている。特にアブラナ、ハクサイ、
カブ、ツケナなどを含むブラシカ・ラパ（Brassica rap
a）は組織片からの再分化能が低いため、遺伝子を導入
した細胞を個体レベルにまで分化できたという報告は少
ない（Radke et al, Plant CellRep (1992) 11:499-50
5, Mukhopadhyay et al, Plant Cell Rep (1992) 11: 5
06-513, Jun et al. Plant CellRep. (1995) 14: 620-6
25)）。
を終え、実用化の段階にある。これら組換えＤＮＡ技術
を利用した作物の商品化は今後ますます進む傾向にあ
る。組換えＤＮＡを利用した品種の作出には優良な遺伝
子の単離と植物への遺伝子導入技術が必要とされる。植
物への遺伝子導入方法にはアグロバクテリウム法、エレ
クトロポレーション法、パーティクルガン法などがあ
る。アグロバクテリウム法はナス科、ウリ科の植物では
高率で形質転換植物を作出できるが、アブラナ科の植物
では成功率が低く、効率的な遺伝子導入技術及び再分化
技術の開発が急がれている。特にアブラナ、ハクサイ、
カブ、ツケナなどを含むブラシカ・ラパ（Brassica rap
a）は組織片からの再分化能が低いため、遺伝子を導入
した細胞を個体レベルにまで分化できたという報告は少
ない（Radke et al, Plant CellRep (1992) 11:499-50
5, Mukhopadhyay et al, Plant Cell Rep (1992) 11: 5
06-513, Jun et al. Plant CellRep. (1995) 14: 620-6
25)）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アグ
ロバクテリウム属の微生物によるブラシカ属の形質転換
植物の効率的な作出方法を提供すると共に、組換えＤＮ
Ａ技術を利用したブラシカ属の植物の品種作出方法を提
供する。
ロバクテリウム属の微生物によるブラシカ属の形質転換
植物の効率的な作出方法を提供すると共に、組換えＤＮ
Ａ技術を利用したブラシカ属の植物の品種作出方法を提
供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意検討を重ねた結果、組織片培養培地のｐ
Ｈを特定の値とすること、又は組織片培養培地にフィー
ダーセルを添加することにより遺伝子導入率が著しく向
上することを見出し、また、感染液への浸漬時間、共存
培養時の温度、共存培養期間の３つのパラメーターが密
接に関連し、これらを特定の値とすることにより、形質
転換植物の作出効率が著しく向上することを見出し、こ
れらの知見に基づき本発明を完成した。
解決すべく鋭意検討を重ねた結果、組織片培養培地のｐ
Ｈを特定の値とすること、又は組織片培養培地にフィー
ダーセルを添加することにより遺伝子導入率が著しく向
上することを見出し、また、感染液への浸漬時間、共存
培養時の温度、共存培養期間の３つのパラメーターが密
接に関連し、これらを特定の値とすることにより、形質
転換植物の作出効率が著しく向上することを見出し、こ
れらの知見に基づき本発明を完成した。
【０００７】即ち、本発明は、ブラシカ属の植物の組織
片を組織片培養培地で前培養した後、アグロバクテリウ
ム属の微生物を含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を
前記組織片培養培地で共存培養することにより、ブラシ
カ属の植物に遺伝子を導入する方法において、組織片培
養培地のｐＨを５．０〜６．９とすることを特徴とする
ブラシカ属の植物の遺伝子導入方法である。
片を組織片培養培地で前培養した後、アグロバクテリウ
ム属の微生物を含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を
前記組織片培養培地で共存培養することにより、ブラシ
カ属の植物に遺伝子を導入する方法において、組織片培
養培地のｐＨを５．０〜６．９とすることを特徴とする
ブラシカ属の植物の遺伝子導入方法である。
【０００８】また、本発明は、ブラシカ属の植物の組織
片を組織片培養培地で前培養した後、アグロバクテリウ
ム属の微生物を含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を
前記組織片培養培地で共存培養することにより、ブラシ
カ属の植物に遺伝子を導入する方法において、組織片培
養培地がフィーダーセルを含むことを特徴とするブラシ
カ属の植物の遺伝子導入方法である。
片を組織片培養培地で前培養した後、アグロバクテリウ
ム属の微生物を含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を
前記組織片培養培地で共存培養することにより、ブラシ
カ属の植物に遺伝子を導入する方法において、組織片培
養培地がフィーダーセルを含むことを特徴とするブラシ
カ属の植物の遺伝子導入方法である。
【０００９】さらに、本発明は、ブラシカ属の植物の組
織片を組織片培養培地で前培養した後、アグロバクテリ
ウム属の微生物を含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片
を前記組織片培養培地で共存培養し、次いで、共存培養
後の組織片からカルスを誘導し、得られたカルスを再分
化することにより、ブラシカ属の形質転換植物を作出す
る方法において、下記の式 ８２ ＜ ｘ／１０＋（ｙ−１９）2 ＋ｚ ＜ １４５ 〔但し、ｘは感染液に浸漬する時間（分）、ｙは共存培
養時の温度（℃）、ｚは共存培養の期間（時）〕を満た
すようにｘ、ｙ、ｚの値を設定することを特徴とするブ
ラシカ属の形質転換植物の作出方法である。
織片を組織片培養培地で前培養した後、アグロバクテリ
ウム属の微生物を含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片
を前記組織片培養培地で共存培養し、次いで、共存培養
後の組織片からカルスを誘導し、得られたカルスを再分
化することにより、ブラシカ属の形質転換植物を作出す
る方法において、下記の式 ８２ ＜ ｘ／１０＋（ｙ−１９）2 ＋ｚ ＜ １４５ 〔但し、ｘは感染液に浸漬する時間（分）、ｙは共存培
養時の温度（℃）、ｚは共存培養の期間（時）〕を満た
すようにｘ、ｙ、ｚの値を設定することを特徴とするブ
ラシカ属の形質転換植物の作出方法である。
【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
遺伝子導入方法は、ブラシカ属の植物の組織片を組織片
培養培地で前培養した後、アグロバクテリウム属の微生
物を含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を前記組織片
培養培地で共存培養することにより、ブラシカ属の植物
に遺伝子を導入する。また、本発明の形質転換植物の作
出方法は、前記方法により遺伝子を導入した組織片から
カルスを誘導し、得られたカルスを再分化することによ
り、ブラシカ属の形質転換植物を作出する。
遺伝子導入方法は、ブラシカ属の植物の組織片を組織片
培養培地で前培養した後、アグロバクテリウム属の微生
物を含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を前記組織片
培養培地で共存培養することにより、ブラシカ属の植物
に遺伝子を導入する。また、本発明の形質転換植物の作
出方法は、前記方法により遺伝子を導入した組織片から
カルスを誘導し、得られたカルスを再分化することによ
り、ブラシカ属の形質転換植物を作出する。
【００１１】ここで用いるブラシカ属の植物は、ブラシ
カ属に属する限り、どのような種でもよく、例えば、ブ
ラシカ・ラパ、ブラシカ・オレアシア等を用いることが
できる。これらの種の中でもブラシカ・ラパを好ましい
種として例示できる。ブラシカ・ラパに属する植物の中
でもハクサイ（B. rapa ssp. pekinensis ）、カブ（B.
rapa ssp. rapa ）、ツケナ（B.rapa ssp. chinensis
）を特に好ましい植物として例示できる。好ましい品
種としては、ツケナでは、友好菜（カネコ（株））、紅
菜苔（（株）サカタのタネ）、おそめ（タキイ種苗
（株））、カブでは本紅大丸カブ（渡辺採種場
（株））、日野菜カブ（タキイ種苗（株））、聖護院カ
ブ（タキイ種苗（株））、ハクサイでは、ストロングＣ
Ｒ（渡辺採種場（株））、郷風（（株）サカタのタネ）
等を例示できる。
カ属に属する限り、どのような種でもよく、例えば、ブ
ラシカ・ラパ、ブラシカ・オレアシア等を用いることが
できる。これらの種の中でもブラシカ・ラパを好ましい
種として例示できる。ブラシカ・ラパに属する植物の中
でもハクサイ（B. rapa ssp. pekinensis ）、カブ（B.
rapa ssp. rapa ）、ツケナ（B.rapa ssp. chinensis
）を特に好ましい植物として例示できる。好ましい品
種としては、ツケナでは、友好菜（カネコ（株））、紅
菜苔（（株）サカタのタネ）、おそめ（タキイ種苗
（株））、カブでは本紅大丸カブ（渡辺採種場
（株））、日野菜カブ（タキイ種苗（株））、聖護院カ
ブ（タキイ種苗（株））、ハクサイでは、ストロングＣ
Ｒ（渡辺採種場（株））、郷風（（株）サカタのタネ）
等を例示できる。
【００１２】前培養に用いる植物の組織片は、遺伝子導
入後、個体レベルにまで分化できる能力を有するもので
あればどのようなものでもよく、例えば、花茎、葉、子
葉片、胚軸などを用いることができる。
入後、個体レベルにまで分化できる能力を有するもので
あればどのようなものでもよく、例えば、花茎、葉、子
葉片、胚軸などを用いることができる。
【００１３】組織片培養培地は、植物の組織片の培養に
必要な成分、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、固形
剤、植物ホルモン等を含むものであればどのようなもの
でもよい。炭素源としては、例えば、スクロース、グル
コース等を用いることができ、無機塩類としては、ＭＳ
無機塩、Ｂ５無機塩等を用いることができ、固形剤とし
ては、寒天、ゲルライト等を用いることができ、植物ホ
ルモンとしては、２，４−Ｄ、α−ナフタレン酢酸（Ｎ
ＡＡ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン（Zeati
n）等を用いることができる。また、組織片培養培地
は、フィーダーセルを含むことが好ましい。フィーダー
セルにより、ブラシカ属の植物の遺伝子導入率が向上す
る。フィーダーセルとしては、例えば、タバコ、トマト
のサスペンジョン等を用いることができる。組織片培養
培地中のフィーダーセルの濃度は１．５ ml/90cm シャーレ
程度とするのが好ましい。組織片培養培地のｐＨは、
５．０〜６．９とするのが好ましく、５．２〜５．８と
するのが更に好ましい。培地のｐＨをこのような範囲と
することにより、ブラシカ属の植物の遺伝子導入率が向
上する。前培養時の温度は、植物の組織片に悪影響を及
ぼさない範囲であれば特に制限はないが、２０〜２８℃
とするのが好ましい。
必要な成分、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、固形
剤、植物ホルモン等を含むものであればどのようなもの
でもよい。炭素源としては、例えば、スクロース、グル
コース等を用いることができ、無機塩類としては、ＭＳ
無機塩、Ｂ５無機塩等を用いることができ、固形剤とし
ては、寒天、ゲルライト等を用いることができ、植物ホ
ルモンとしては、２，４−Ｄ、α−ナフタレン酢酸（Ｎ
ＡＡ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン（Zeati
n）等を用いることができる。また、組織片培養培地
は、フィーダーセルを含むことが好ましい。フィーダー
セルにより、ブラシカ属の植物の遺伝子導入率が向上す
る。フィーダーセルとしては、例えば、タバコ、トマト
のサスペンジョン等を用いることができる。組織片培養
培地中のフィーダーセルの濃度は１．５ ml/90cm シャーレ
程度とするのが好ましい。組織片培養培地のｐＨは、
５．０〜６．９とするのが好ましく、５．２〜５．８と
するのが更に好ましい。培地のｐＨをこのような範囲と
することにより、ブラシカ属の植物の遺伝子導入率が向
上する。前培養時の温度は、植物の組織片に悪影響を及
ぼさない範囲であれば特に制限はないが、２０〜２８℃
とするのが好ましい。
【００１４】用いるアグロバクテリウム属の微生物は、
特に制限はないが、アグロバクテリウム・トメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens ）が好ましく、特
に、CIB542/A136 系統、又はEHA101系統のものが好まし
い。アグロバクテリウムEHA101系統は、バイナリーベク
ターpIG12Hm を有する。このベクターのＴ−ＤＮＡ領域
を図１に示す。図１が示すように、このベクターはレポ
ーター遺伝子となるＧＵＳ遺伝子のほか、選抜マーカー
遺伝子となるカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）及びハ
イグロマイシン耐性遺伝子（ＨｙｇＲ）を有する。感染
液中のアグロバクテリウム属の微生物の濃度は、特に制
限はないが、１．２×１０8cells/ml 程度が好ましい。
特に制限はないが、アグロバクテリウム・トメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens ）が好ましく、特
に、CIB542/A136 系統、又はEHA101系統のものが好まし
い。アグロバクテリウムEHA101系統は、バイナリーベク
ターpIG12Hm を有する。このベクターのＴ−ＤＮＡ領域
を図１に示す。図１が示すように、このベクターはレポ
ーター遺伝子となるＧＵＳ遺伝子のほか、選抜マーカー
遺伝子となるカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）及びハ
イグロマイシン耐性遺伝子（ＨｙｇＲ）を有する。感染
液中のアグロバクテリウム属の微生物の濃度は、特に制
限はないが、１．２×１０8cells/ml 程度が好ましい。
【００１５】感染液に植物の組織片を浸漬する時間、共
存培養時の温度、及び共存培養の期間は、遺伝子導入
率、及びその後の再分化率に大きな影響を与える要素で
ある。遺伝子導入率の向上を図るという観点からは、浸
漬時間及び共存培養期間を長くし、共存培養時の温度を
高くすることが好ましい。但し、浸漬時間及び共存培養
期間を長くし、共存培養時の温度を高くすることによ
り、遺伝子を導入した組織片の再分化率が低下する。従
って、形質転換植物の作出効率を向上させるためには、
浸漬時間、培養温度、培養期間を総合的に勘案し、好適
な範囲に定める必要がある。具体的には、浸漬時間をｘ
分、培養温度をｙ℃、培養期間をｚ時間とした場合に、
ｘ、ｙ、ｚを下式 ８２ ＜ ｘ／１０＋（ｙ−１９）2 ＋ｚ ＜ １４５ を満たすように設定するのが好ましく、 ９８ ≦ ｘ／１０＋（ｙ−１９）2 ＋ｚ ≦ １１３ を満たすように設定するのがより好ましい。浸漬時間、
培養温度、培養期間は、上記の式を満たす限り、任意の
値をとり得るが、浸漬時間は１０〜３０分とするのが好
ましく、培養温度は２０〜３０℃とするのが好ましく、
培養期間は２４〜７２時間とするのが好ましい。
存培養時の温度、及び共存培養の期間は、遺伝子導入
率、及びその後の再分化率に大きな影響を与える要素で
ある。遺伝子導入率の向上を図るという観点からは、浸
漬時間及び共存培養期間を長くし、共存培養時の温度を
高くすることが好ましい。但し、浸漬時間及び共存培養
期間を長くし、共存培養時の温度を高くすることによ
り、遺伝子を導入した組織片の再分化率が低下する。従
って、形質転換植物の作出効率を向上させるためには、
浸漬時間、培養温度、培養期間を総合的に勘案し、好適
な範囲に定める必要がある。具体的には、浸漬時間をｘ
分、培養温度をｙ℃、培養期間をｚ時間とした場合に、
ｘ、ｙ、ｚを下式 ８２ ＜ ｘ／１０＋（ｙ−１９）2 ＋ｚ ＜ １４５ を満たすように設定するのが好ましく、 ９８ ≦ ｘ／１０＋（ｙ−１９）2 ＋ｚ ≦ １１３ を満たすように設定するのがより好ましい。浸漬時間、
培養温度、培養期間は、上記の式を満たす限り、任意の
値をとり得るが、浸漬時間は１０〜３０分とするのが好
ましく、培養温度は２０〜３０℃とするのが好ましく、
培養期間は２４〜７２時間とするのが好ましい。
【００１６】遺伝子を導入した組織片は、カルスを誘導
した後、不定芽、シュート等を経由して最終的に個体レ
ベルにまで分化させる。このような再分化は常法に従っ
て行うことができる。
した後、不定芽、シュート等を経由して最終的に個体レ
ベルにまで分化させる。このような再分化は常法に従っ
て行うことができる。
【００１７】
【００１８】
【実施例】最初に、実施例及び試験例において使用する
培地の組成を下記に示す。
培地の組成を下記に示す。
【００１９】＜播種培地＞ＭＳ無機塩、塩酸ピリミジ
ン：５０μg/L 、ニコチン酸：５０μg/L 、グリシン：
２００μg/L 、フィトアガー：０．６％、ｐＨ５．８ ＜組織片培養培地＞ＭＳ無機塩、ミオイノシトール：１
００mg/L、塩酸チアミン：１．３mg/L、ＫＨ2 ＰＯ4 ：
２００mg/L、２，４−Ｄ：１mg/L、スクロース：３％、
フィトアガー：０．６％
ン：５０μg/L 、ニコチン酸：５０μg/L 、グリシン：
２００μg/L 、フィトアガー：０．６％、ｐＨ５．８ ＜組織片培養培地＞ＭＳ無機塩、ミオイノシトール：１
００mg/L、塩酸チアミン：１．３mg/L、ＫＨ2 ＰＯ4 ：
２００mg/L、２，４−Ｄ：１mg/L、スクロース：３％、
フィトアガー：０．６％
【００２０】＜カルス誘導培地＞Ｂ５無機塩、Ｂ５ビタ
ミン、２，４−Ｄ：１mg/L、スクロース：３％、フィト
アガー：０．６％、ｐＨ５．８ ＜不定芽形成培地＞Ｂ５無機塩、Ｂ５ビタミン、ＢＡ：
３mg/L、ゼアチン：１mg/L、スクロース：１％、フィト
アガー：０．６％、ｐＨ５．８ ＜不定芽成熟培地＞Ｂ５無機塩、Ｂ５ビタミン、スクロ
ース：１％、フィトアガー：０．６％、ｐＨ５．８
ミン、２，４−Ｄ：１mg/L、スクロース：３％、フィト
アガー：０．６％、ｐＨ５．８ ＜不定芽形成培地＞Ｂ５無機塩、Ｂ５ビタミン、ＢＡ：
３mg/L、ゼアチン：１mg/L、スクロース：１％、フィト
アガー：０．６％、ｐＨ５．８ ＜不定芽成熟培地＞Ｂ５無機塩、Ｂ５ビタミン、スクロ
ース：１％、フィトアガー：０．６％、ｐＨ５．８
【００２１】＜発根培地＞Ｂ５無機塩、Ｂ５ビタミン、
スクロース：１％、フィトアガー：０．６％、ＩＢＡ：
２mg/L、ｐＨ５．８ ＜ＹＢＥ培地＞バクトペプトン：５g/L 、イーストエキ
ストラクト：１g/L 、ビーフエキストラクト：５g/L 、
ＭｇＣｌ2 ：０．５g/L 、スクロース：５g/L 、バクト
アガー：１．５％
スクロース：１％、フィトアガー：０．６％、ＩＢＡ：
２mg/L、ｐＨ５．８ ＜ＹＢＥ培地＞バクトペプトン：５g/L 、イーストエキ
ストラクト：１g/L 、ビーフエキストラクト：５g/L 、
ＭｇＣｌ2 ：０．５g/L 、スクロース：５g/L 、バクト
アガー：１．５％
【００２２】〔試験例１〕アグロバクテリウム属の微生
物の遺伝子導入率は、この微生物のVir遺伝子発現に大
きく依存する。Vir遺伝子の発現は低pH、単糖類の添
加、アセトシリンゴン（Acetosyringone）などのフェノ
ール化合物の添加等により更に高められることが知られ
ている。そこで、組織片培養培地のｐＨを変え、また、
培地に糖、アセトシリンゴン、又はフィーダーセルを加
え、遺伝子導入率に与える影響を調べた。
物の遺伝子導入率は、この微生物のVir遺伝子発現に大
きく依存する。Vir遺伝子の発現は低pH、単糖類の添
加、アセトシリンゴン（Acetosyringone）などのフェノ
ール化合物の添加等により更に高められることが知られ
ている。そこで、組織片培養培地のｐＨを変え、また、
培地に糖、アセトシリンゴン、又はフィーダーセルを加
え、遺伝子導入率に与える影響を調べた。
【００２３】まず、組織片培養培地のｐＨを５．８又は
５．２に調整し、また、培地中にグルコース、アセトン
シリンゴン、又はフィーダーセルを添加した。グルコー
スは培地中の濃度が０．１M に、アセトシリンゴンは培
地中の濃度が１００μM になるように添加した。また、
フィーダーセルはタバコ（ＢＹ−２）を使用し、培地中
のフィーダーセルの濃度１．５ ml/90cm シャーレ になるよ
うにした。
５．２に調整し、また、培地中にグルコース、アセトン
シリンゴン、又はフィーダーセルを添加した。グルコー
スは培地中の濃度が０．１M に、アセトシリンゴンは培
地中の濃度が１００μM になるように添加した。また、
フィーダーセルはタバコ（ＢＹ−２）を使用し、培地中
のフィーダーセルの濃度１．５ ml/90cm シャーレ になるよ
うにした。
【００２４】次に、コマツナ品種（おそめ）の播種後６
−７日目の実生から５−１０mmの胚軸を採取し、これ
を、上記のようにｐＨ及び成分を調整した組織片培養培
地に置床し、１日間、前培養した。前培養した後の胚軸
は、アグロバクテリウムEHA101(pIG121Hm ）を含む感染
液に１０分間浸漬した。この感染液は、アグロバクテリ
ウムEHA101(pIG121Hm ）をＹＢＥ液体培地で一晩培養
し、培養液の濁度がＯＤ680 ＝１．０となったものを組
織片培養培地で１０倍に希釈することにより調製した。
感染液に浸漬した胚軸は、前培養した培地に戻し、２５
℃で２日間共存培養した。
−７日目の実生から５−１０mmの胚軸を採取し、これ
を、上記のようにｐＨ及び成分を調整した組織片培養培
地に置床し、１日間、前培養した。前培養した後の胚軸
は、アグロバクテリウムEHA101(pIG121Hm ）を含む感染
液に１０分間浸漬した。この感染液は、アグロバクテリ
ウムEHA101(pIG121Hm ）をＹＢＥ液体培地で一晩培養
し、培養液の濁度がＯＤ680 ＝１．０となったものを組
織片培養培地で１０倍に希釈することにより調製した。
感染液に浸漬した胚軸は、前培養した培地に戻し、２５
℃で２日間共存培養した。
【００２５】バイナリーベクターpIG121HmはＧＵＳ遺伝
子を有するので、遺伝子導入が起こった場合には、その
胚軸はＧＵＳ活性が陽性となる。そこで、ＧＵＳ活性を
指標として遺伝子導入が生じたかどうかを判断した。結
果を表１に示す。
子を有するので、遺伝子導入が起こった場合には、その
胚軸はＧＵＳ活性が陽性となる。そこで、ＧＵＳ活性を
指標として遺伝子導入が生じたかどうかを判断した。結
果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】表１が示すように、培地のｐＨは５．８よ
りも５．２とした方が、遺伝子導入率が相対的に高かっ
た。また、培地へフィーダーセルを添加することによっ
ても遺伝子導入率が向上した。なお、培地への糖の添加
は遺伝子導入率に影響を及ぼさなかった。
りも５．２とした方が、遺伝子導入率が相対的に高かっ
た。また、培地へフィーダーセルを添加することによっ
ても遺伝子導入率が向上した。なお、培地への糖の添加
は遺伝子導入率に影響を及ぼさなかった。
【００２８】〔試験例２〕共存培養の温度・期間、及び
感染液への胚軸の浸漬時間を変え、遺伝子導入率に与え
る影響を調べた。試験例１と同様の胚軸を、フィーダー
セル（タバコ〔ＢＹ−２〕）を添加し、ｐＨを５．２に
調製した組織片培養培地に置床し、１日間前培養した
後、試験例１と同様にして調製した感染液に、前培養後
の胚軸を１０分又は３０分浸漬した。浸漬後、胚軸を組
織片培養培地に戻し、１〜３日共存培養を行った。共存
培養時の温度は２５℃又は２８℃とした。共存培養後の
ＧＵＳ活性を試験例１と同様に調べた。結果を表２に示
す。
感染液への胚軸の浸漬時間を変え、遺伝子導入率に与え
る影響を調べた。試験例１と同様の胚軸を、フィーダー
セル（タバコ〔ＢＹ−２〕）を添加し、ｐＨを５．２に
調製した組織片培養培地に置床し、１日間前培養した
後、試験例１と同様にして調製した感染液に、前培養後
の胚軸を１０分又は３０分浸漬した。浸漬後、胚軸を組
織片培養培地に戻し、１〜３日共存培養を行った。共存
培養時の温度は２５℃又は２８℃とした。共存培養後の
ＧＵＳ活性を試験例１と同様に調べた。結果を表２に示
す。
【００２９】
【表２】
【００３０】アグロバクテリウムの遺伝子導入率は共存
培養温度２８℃の方が２５℃よりも高い傾向にあった。
また、共存培養期間を１日間から３日間に延ばすに従っ
て遺伝子導入率は向上した。感染液への浸漬時間を３０
分間にすることによって更に遺伝子導入率は向上した。
アグロバクテリウム属の微生物の培養は一般に２８℃、
２４時間で行われる。２８℃はアグロバクテリウムの増
殖に最適温度であると思われる。遺伝子導入率はアグロ
バクテリウムの増殖率に比例して、増加する傾向にある
と考えられる。
培養温度２８℃の方が２５℃よりも高い傾向にあった。
また、共存培養期間を１日間から３日間に延ばすに従っ
て遺伝子導入率は向上した。感染液への浸漬時間を３０
分間にすることによって更に遺伝子導入率は向上した。
アグロバクテリウム属の微生物の培養は一般に２８℃、
２４時間で行われる。２８℃はアグロバクテリウムの増
殖に最適温度であると思われる。遺伝子導入率はアグロ
バクテリウムの増殖率に比例して、増加する傾向にある
と考えられる。
【００３１】〔試験例３〕試験例２に示すように、感染
液の浸漬時間を３０分、共存培養を２８℃、３日間する
ことにより、感染率は７４．５％まで増加させることが
できた。しかし、共存培養中のアグロバクテリウム属の
微生物の増殖により、胚軸からの再分化率が低下する可
能性があり、最終的な形質転換効率は低下するかもしれ
ない。そこで、高い遺伝子導入率をを示した６つ感染条
件における形質転換植物の作出率を調べた。結果を表３
に示す。
液の浸漬時間を３０分、共存培養を２８℃、３日間する
ことにより、感染率は７４．５％まで増加させることが
できた。しかし、共存培養中のアグロバクテリウム属の
微生物の増殖により、胚軸からの再分化率が低下する可
能性があり、最終的な形質転換効率は低下するかもしれ
ない。そこで、高い遺伝子導入率をを示した６つ感染条
件における形質転換植物の作出率を調べた。結果を表３
に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】共存培養温度を２５℃とした場合は、アグ
ロバクテリウム属の微生物の増殖は胚軸からの再分化に
影響を及ばさなかった。遺伝子導入率の増加に従い、得
られるカナマイシン耐性カルスとシュート数は増加し、
感染液への浸漬時間３０分、共存培養期間３日の場合に
は、５％の形質転換体作出率が得られた。
ロバクテリウム属の微生物の増殖は胚軸からの再分化に
影響を及ばさなかった。遺伝子導入率の増加に従い、得
られるカナマイシン耐性カルスとシュート数は増加し、
感染液への浸漬時間３０分、共存培養期間３日の場合に
は、５％の形質転換体作出率が得られた。
【００３４】一方、共存培養温度を２８℃とした場合
は、アグロバクテリウム属の微生物の増殖が胚軸からの
再分化に大きく影響を及ぼした。感染率の増加に伴い、
褐変枯死する胚軸の数が急増し、得られるカナマイシン
耐性カルスとシュート数は減少する傾向が見られた。
は、アグロバクテリウム属の微生物の増殖が胚軸からの
再分化に大きく影響を及ぼした。感染率の増加に伴い、
褐変枯死する胚軸の数が急増し、得られるカナマイシン
耐性カルスとシュート数は減少する傾向が見られた。
【００３５】以上のように、共存培養温度を高くした場
合には遺伝子導入率は向上するが、再分化率が低下する
ため、最終的な作出率はあまりよくない。逆に共存培養
温度を低くした場合には再分化率は向上するが、遺伝子
導入率が低下し、やはり作出率はあまりよくない。そこ
で、共存培養温度のほか、遺伝子導入率及び再分化率に
影響を与える、感染液への浸漬時間及び共存培養期間の
３つのパラメーターの和を一定の範囲内に設定すること
により、作出率を向上させることができると考えられ
る。但し、浸漬時間は遺伝子導入率及び再分化率に与え
る影響が最も少ないので１０で割り、また、培養温度は
他のパラメータの比べ変化の割合が小さいので、アグロ
バクテリウム属の微生物の増殖が低下する１９℃からの
上昇温度とするため１９で引き、さらに２乗することに
し、下記の式を設定した。
合には遺伝子導入率は向上するが、再分化率が低下する
ため、最終的な作出率はあまりよくない。逆に共存培養
温度を低くした場合には再分化率は向上するが、遺伝子
導入率が低下し、やはり作出率はあまりよくない。そこ
で、共存培養温度のほか、遺伝子導入率及び再分化率に
影響を与える、感染液への浸漬時間及び共存培養期間の
３つのパラメーターの和を一定の範囲内に設定すること
により、作出率を向上させることができると考えられ
る。但し、浸漬時間は遺伝子導入率及び再分化率に与え
る影響が最も少ないので１０で割り、また、培養温度は
他のパラメータの比べ変化の割合が小さいので、アグロ
バクテリウム属の微生物の増殖が低下する１９℃からの
上昇温度とするため１９で引き、さらに２乗することに
し、下記の式を設定した。
【００３６】浸漬時間〔分〕／１０＋（培養温度〔℃〕
−１９）2 ＋培養期間（時）表３が示すようにこの式値
が８２より大きく、１４５より小さい場合に、形質転換
植物の作出効率が高くなる。
−１９）2 ＋培養期間（時）表３が示すようにこの式値
が８２より大きく、１４５より小さい場合に、形質転換
植物の作出効率が高くなる。
【００３７】〔実施例１〕B. rape ssp. chinensisの一
品種「おそめ」（タキイ種苗（株））の種子を７０％エ
タノールに２分間浸漬し、その後、Tween 20を１滴添加
した１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で１５−２０分間
滅菌し、滅菌水で３回洗浄した。滅菌操作が終わった種
子は、播種培地の入ったアグリポットに１５粒ずつ播種
し、２５℃、４５−５５μE 、１６時間日長下で６−７
日間育成した。
品種「おそめ」（タキイ種苗（株））の種子を７０％エ
タノールに２分間浸漬し、その後、Tween 20を１滴添加
した１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で１５−２０分間
滅菌し、滅菌水で３回洗浄した。滅菌操作が終わった種
子は、播種培地の入ったアグリポットに１５粒ずつ播種
し、２５℃、４５−５５μE 、１６時間日長下で６−７
日間育成した。
【００３８】播種後６−７日目の４−５cmに育った実生
から５−１０mmの胚軸を切り出し、組織片培養培地に並
べた（胚軸 ５０本／シャーレ）。予め、組織片培養培
地には、４日前に継代したタバコ（ＢＹ−２）の懸濁培
養液を１．５mLを分注し、その上に滅菌ろ紙を敷いてお
いた。。シャーレ（９cm）は、サージカルテープ（３Ｍ
社：Micropore）でシールし、２５℃、暗黒下で２４時
間前培養した。
から５−１０mmの胚軸を切り出し、組織片培養培地に並
べた（胚軸 ５０本／シャーレ）。予め、組織片培養培
地には、４日前に継代したタバコ（ＢＹ−２）の懸濁培
養液を１．５mLを分注し、その上に滅菌ろ紙を敷いてお
いた。。シャーレ（９cm）は、サージカルテープ（３Ｍ
社：Micropore）でシールし、２５℃、暗黒下で２４時
間前培養した。
【００３９】アグロバクテリウムEHA101(pIG121Hm) グ
リセロールストックからＹＢＥ培地に移し、２８℃、３
日間、インキュベートした。アグロバクテリウムEHA101
の単一コロニーをカナマイシン及びハイグロマイシンを
含むＹＢＥ液体培地（Ｋｍ５０mg/L, Ｈｙｇ50mg/L )
に懸濁し、濁度がＯＤ680 ＝１．０になるまで、２８
℃, ２００rpm 、１８−２４時間振盪培養した。ｐＨを
５．２に調整した組織片培養培地を１３．５mLを分注し
た９cmシャーレに、前記微生物懸濁液１．５mLを加え、
感染液を作成した。感染液に胚軸を浸漬させ（２００本
／シャーレ）、室温, ４０rpm,３０分間振盪した。ピペ
ットマンで感染液を吸い取った後、滅菌キムタオルに胚
軸を移し、余分な感染液を除いた。胚軸を組織片培養培
地に戻し、シャーレをパラフィルムでシールし、２５
℃, 暗所, ３日間、共存培養した。
リセロールストックからＹＢＥ培地に移し、２８℃、３
日間、インキュベートした。アグロバクテリウムEHA101
の単一コロニーをカナマイシン及びハイグロマイシンを
含むＹＢＥ液体培地（Ｋｍ５０mg/L, Ｈｙｇ50mg/L )
に懸濁し、濁度がＯＤ680 ＝１．０になるまで、２８
℃, ２００rpm 、１８−２４時間振盪培養した。ｐＨを
５．２に調整した組織片培養培地を１３．５mLを分注し
た９cmシャーレに、前記微生物懸濁液１．５mLを加え、
感染液を作成した。感染液に胚軸を浸漬させ（２００本
／シャーレ）、室温, ４０rpm,３０分間振盪した。ピペ
ットマンで感染液を吸い取った後、滅菌キムタオルに胚
軸を移し、余分な感染液を除いた。胚軸を組織片培養培
地に戻し、シャーレをパラフィルムでシールし、２５
℃, 暗所, ３日間、共存培養した。
【００４０】共存培養後、アグロバクテリウム属の微生
物の除菌のためカルベニシリン５００mg/Lを含むカルス
誘導培地に胚軸を移植した( ４０胚軸／シャーレ）。以
後、シャーレはサージカルテープでシールした。２５
℃、４５−５５μE 、１６時間日長下で７日間培養し
た。
物の除菌のためカルベニシリン５００mg/Lを含むカルス
誘導培地に胚軸を移植した( ４０胚軸／シャーレ）。以
後、シャーレはサージカルテープでシールした。２５
℃、４５−５５μE 、１６時間日長下で７日間培養し
た。
【００４１】胚軸をカルベニシリン５００mg/L, カナマ
イシン１０mg/Lを含む不定芽形成培地に移植し（３０胚
軸／シャーレ）、２５℃、４５−５５μE 、１６時間日
長下で２週間培養した。不定芽が形成されるまで胚軸を
カルベニシリン５００mg/L,カナマイシン１０mg/Lを含
む不定芽形成培地に２週間ごとに継代を繰り返した。約
６−８週間でカナマイシン耐性シュートが形成された。
イシン１０mg/Lを含む不定芽形成培地に移植し（３０胚
軸／シャーレ）、２５℃、４５−５５μE 、１６時間日
長下で２週間培養した。不定芽が形成されるまで胚軸を
カルベニシリン５００mg/L,カナマイシン１０mg/Lを含
む不定芽形成培地に２週間ごとに継代を繰り返した。約
６−８週間でカナマイシン耐性シュートが形成された。
【００４２】得られたカナマイシン耐性シュートをカル
ベニシリン５００mg/L, カナマイシン５０mg/Lを含む不
定芽成熟培地に移植した。２５℃、４５−５５μE 、１
６時間日長下で３−４週間培養した。カナマイシン耐性
遺伝子の導入されていないシュートは白く色が抜ける。
ベニシリン５００mg/L, カナマイシン５０mg/Lを含む不
定芽成熟培地に移植した。２５℃、４５−５５μE 、１
６時間日長下で３−４週間培養した。カナマイシン耐性
遺伝子の導入されていないシュートは白く色が抜ける。
【００４３】成熟したカナマイシン耐性シュートをカル
ベニシリン２５０mg/L, カナマイシン５０mg/Lを含む発
根培地を入れたアグリポットに移植し、発根を誘導し
た。２５℃、４５−５５μE 、１６時間日長下で３−４
週間培養した。十分発根した幼植物をポット（バーミキ
ュライト：育苗培土１：１）に移植する。滅菌水を十分
にかけて、ビニール袋を掛けておいた。２０℃、４５−
５５μE 、１２時間日長下で育成させた。徐々にビニー
ル袋に穴をあけて馴化させた。
ベニシリン２５０mg/L, カナマイシン５０mg/Lを含む発
根培地を入れたアグリポットに移植し、発根を誘導し
た。２５℃、４５−５５μE 、１６時間日長下で３−４
週間培養した。十分発根した幼植物をポット（バーミキ
ュライト：育苗培土１：１）に移植する。滅菌水を十分
にかけて、ビニール袋を掛けておいた。２０℃、４５−
５５μE 、１２時間日長下で育成させた。徐々にビニー
ル袋に穴をあけて馴化させた。
【００４４】〔実施例２〕実施例１と同様の方法で、ツ
ケナ品種友好菜、紅菜苔、カブ品種本紅大丸カブ、日野
菜カブについて遺伝子導入植物を作出した。各品種の作
出率等を表４に示す。
ケナ品種友好菜、紅菜苔、カブ品種本紅大丸カブ、日野
菜カブについて遺伝子導入植物を作出した。各品種の作
出率等を表４に示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】〔参考例１〕ＧＵＳ遺伝子をプローブとし
たサザンブロット解析により、形質転換体における導入
ＧＵＳ遺伝子及び導入遺伝子数を調べた。実施例１で得
られたコマツナ品種「おそめ」の６個体から葉を採取
し、これからMurray and thompson(1980) Nucl. Acids
Res. 8:4321-4325記載の方法によりＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡを、制限酵素BamHI又はHindIIIで処理
し、ＧＵＳ遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。
たサザンブロット解析により、形質転換体における導入
ＧＵＳ遺伝子及び導入遺伝子数を調べた。実施例１で得
られたコマツナ品種「おそめ」の６個体から葉を採取
し、これからMurray and thompson(1980) Nucl. Acids
Res. 8:4321-4325記載の方法によりＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡを、制限酵素BamHI又はHindIIIで処理
し、ＧＵＳ遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。
【００４７】BamHIで処理した場合を図２に、HindIIIで
処理した場合を図３にそれぞれ示す。図中のＣは非形質
転換体の「おそめ」（コントロール）を示し、１〜６は
形質転換体の「おそめ」の個体番号を示す。図２が示す
ように、供試した６個体すべてにＧＵＳ遺伝子断片（4.
0kb）が組み込まれていることを確認できた。また、図
３が示すように組み込まれた遺伝子数は１−３で個体に
よって様々であった。これらの形質転換体は正常な生育
を示し、形態的にも種子由来の対照品種と同様であった
（図４）。また、花粉稔性も正常で自殖種子を得ること
ができた。
処理した場合を図３にそれぞれ示す。図中のＣは非形質
転換体の「おそめ」（コントロール）を示し、１〜６は
形質転換体の「おそめ」の個体番号を示す。図２が示す
ように、供試した６個体すべてにＧＵＳ遺伝子断片（4.
0kb）が組み込まれていることを確認できた。また、図
３が示すように組み込まれた遺伝子数は１−３で個体に
よって様々であった。これらの形質転換体は正常な生育
を示し、形態的にも種子由来の対照品種と同様であった
（図４）。また、花粉稔性も正常で自殖種子を得ること
ができた。
【００４８】〔参考例２〕アグロバクテリウム属の微生
物はナス科、ウリ科の植物では高い遺伝子導入率を示す
が、アブラナ科植物に対しては一般的に低いので、宿主
範囲の広いアグロバクテリウムの系統を使用が望まれ
る。そこで、５系統のアグロバクテリウム属の微生物を
用いて遺伝子導入率を調べた。試験例１と同様の胚軸
を、フィーダーセル（タバコ〔ＢＹ−２〕）を添加し、
ｐＨを５．２に調整した組織片培養培地に置床し、１日
間前培養した。
物はナス科、ウリ科の植物では高い遺伝子導入率を示す
が、アブラナ科植物に対しては一般的に低いので、宿主
範囲の広いアグロバクテリウムの系統を使用が望まれ
る。そこで、５系統のアグロバクテリウム属の微生物を
用いて遺伝子導入率を調べた。試験例１と同様の胚軸
を、フィーダーセル（タバコ〔ＢＹ−２〕）を添加し、
ｐＨを５．２に調整した組織片培養培地に置床し、１日
間前培養した。
【００４９】一方、 LBA4404(pLBA4404)、 C58C1Rif(pM
90) 、 C58C1Rif(pGV2260)、 CIB542/A136(pCIB542) 、
EHA101 （pEHA101)の５系統のアグロバクテリウム属の
微生物をＹＢＥ液体培地で一晩培養し、得られた培養液
を組織片培養培地で１０倍に希釈し、感染液を調製し
た。これら５種類の感染液に、前培養後の胚軸を１０分
間浸漬し、再び組織片培養培地に戻し、２５℃で２日間
共存培養した。共存培養後の胚軸ＧＵＳ活性を試験例１
と同様に調べた。結果を表５に示す。
90) 、 C58C1Rif(pGV2260)、 CIB542/A136(pCIB542) 、
EHA101 （pEHA101)の５系統のアグロバクテリウム属の
微生物をＹＢＥ液体培地で一晩培養し、得られた培養液
を組織片培養培地で１０倍に希釈し、感染液を調製し
た。これら５種類の感染液に、前培養後の胚軸を１０分
間浸漬し、再び組織片培養培地に戻し、２５℃で２日間
共存培養した。共存培養後の胚軸ＧＵＳ活性を試験例１
と同様に調べた。結果を表５に示す。
【００５０】
【表５】
【００５１】表２が示すように、CIB542/A136 、 EHA10
1は、それぞれ４５％、４８．５％の高い遺伝子導入率
を示した。これらの系統は共にアグロバクテリウム野生
株 A281に由来するTiプラスミドを有する系統であり、
広い宿主範囲を示す。なお、ナス科、ウリ科で一般的に
用いられるLBA4404では感染は認められなかった。
1は、それぞれ４５％、４８．５％の高い遺伝子導入率
を示した。これらの系統は共にアグロバクテリウム野生
株 A281に由来するTiプラスミドを有する系統であり、
広い宿主範囲を示す。なお、ナス科、ウリ科で一般的に
用いられるLBA4404では感染は認められなかった。
【００５２】
【発明の効果】本発明は、アグロバクテリウム属の微生
物を用いて、効率的にブラシカ属の植物に遺伝子を導入
し、形質転換植物を作出する方法を提供する。
物を用いて、効率的にブラシカ属の植物に遺伝子を導入
し、形質転換植物を作出する方法を提供する。
【図１】バイナリーベクターpIG121HmのＴ−ＤＮＡ領域
を示す図
を示す図
【図２】BamHIで処理したＤＮＡのサザンブロッテイン
グの結果を示す図
グの結果を示す図
【図３】HindIIIで処理したＤＮＡのサザンブロッテイ
ングの結果を示す図
ングの結果を示す図
【図４】形質転換植物の生物の形態を示す写真
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
Claims (3)
- 【請求項１】 ブラシカ属の植物の組織片を組織片培養
培地で前培養した後、アグロバクテリウム属の微生物を
含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を前記組織片培養
培地で共存培養することにより、ブラシカ属の植物に遺
伝子を導入する方法において、組織片培養培地のｐＨを
５．０〜６．９とすることを特徴とするブラシカ属の植
物の遺伝子導入方法。 - 【請求項２】 ブラシカ属の植物の組織片を組織片培養
培地で前培養した後、アグロバクテリウム属の微生物を
含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を前記組織片培養
培地で共存培養することにより、ブラシカ属の植物に遺
伝子を導入する方法において、組織片培養培地がフィー
ダーセルを含むことを特徴とするブラシカ属の植物の遺
伝子導入方法。 - 【請求項３】 ブラシカ属の植物の組織片を組織片培養
培地で前培養した後、アグロバクテリウム属の微生物を
含む感染液に浸漬し、浸漬後の組織片を前記組織片培養
培地で共存培養し、次いで、共存培養後の組織片からカ
ルスを誘導し、得られたカルスを再分化することによ
り、ブラシカ属の形質転換植物を作出する方法におい
て、下記の式 ８２ ＜ ｘ／１０＋（ｙ−１９）2 ＋ｚ ＜ １４５ 〔但し、ｘは感染液に浸漬する時間（分）、ｙは共存培
養時の温度（℃）、ｚは共存培養の期間（時）〕を満た
すようにｘ、ｙ、ｚの値を設定することを特徴とするブ
ラシカ属の形質転換植物の作出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8070584A JPH09252674A (ja) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | アグロバクテリウム属の微生物による遺伝子導入方法及び形質転換植物の作出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8070584A JPH09252674A (ja) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | アグロバクテリウム属の微生物による遺伝子導入方法及び形質転換植物の作出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09252674A true JPH09252674A (ja) | 1997-09-30 |
Family
ID=13435762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8070584A Pending JPH09252674A (ja) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | アグロバクテリウム属の微生物による遺伝子導入方法及び形質転換植物の作出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09252674A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100335618C (zh) * | 1998-02-26 | 2007-09-05 | 嘉吉有限公司 | 粒子轰击转化芸苔属植物 |
| JP2010259378A (ja) * | 2009-05-08 | 2010-11-18 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 細胞培養方法、細胞培養システム |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07501446A (ja) * | 1991-11-15 | 1995-02-16 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 植物からのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼ１１遺伝子 |
-
1996
- 1996-03-26 JP JP8070584A patent/JPH09252674A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07501446A (ja) * | 1991-11-15 | 1995-02-16 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 植物からのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼ１１遺伝子 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100335618C (zh) * | 1998-02-26 | 2007-09-05 | 嘉吉有限公司 | 粒子轰击转化芸苔属植物 |
| JP2010259378A (ja) * | 2009-05-08 | 2010-11-18 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 細胞培養方法、細胞培養システム |
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