DE69922997T2

DE69922997T2 - Verwendung von isatinderivaten als ionenkanalaktivierende mittel

Info

Publication number: DE69922997T2
Application number: DE69922997T
Authority: DE
Inventors: Bo Skaaning Jensen; Tino Dyhring JÖRGENSEN; Philip K. Ahring; Palle Christophersen; Dorte STRÖBAEK; Lene Teuber; Sören Peter OLESEN
Original assignee: Neurosearch AS
Current assignee: NTG Nordic Transport Group AS
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2019-12-04
Also published as: ATE285769T1; JP2002531498A; EP1135123A1; US6969729B2; US20020016354A1; WO2000033834A1; EP1135123B1; AU1648600A; DE69922997D1; US20030114513A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Ionenkanal aktivierende Mittel. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine besondere Klasse von chemischen Verbindungen, die sich als Öffner von SK_Ca- und IK_Ca-Kanälen wirksam erwiesen haben. In weiteren Aspekten bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung dieser SK/IK-Kanal aktivierenden Mittel für die Herstellung von Medikamenten und auf pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die SK/IK-Kanal aktivierenden Mittel umfassen.
Die SK/IK-Kanal aktivierenden Mittel der Erfindung sind verwendbar zur Behandlung oder Erleichterung von Krankheiten und Zuständen, die mit den SK/IK-Kanälen verbunden sind, insbesondere respiratorische Erkrankungen, wie Asthma, cystische Fibrose, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung und Rhinorrhea, Krämpfe, Gefäßspasmen, Koronararterienspasmen, renale Erkrankungen, polyzystische Nierenerkrankung, Blasenspasmen, Urininkontinenz, Blasenausflussobstruktion, irritables Darmsyndrom, gastrointestinale Störung, sekretorische Diarrhoe, Ischämie, zerebrale Ischämie, ischämische Herzerkrankung, Angina pectoris, koronare Herzerkrankung, traumatischer Hirnschaden, Psychose, Angstzustände, Depression, Demenz, Gedächtnis- und Aufmerksamkeitsdefizite, Alzheimersche Erkrankung, Dysmenorrhoe, Narkolepsie, Reynaudsche Erkrankung, intermittierende Claudicatio, Sjorgren-Syndrom, Migräne, Arrhythmie, Bluthochdruck, Absenzen, myotone Muskeldystrophie, Xerostomie, Diabetes Typ II, Hyperinsulinämie, vorzeitige Wehen, Kahlheit, Krebs und Immunsuppression.
STAND DER TECHNIK
Ionenkanäle sind Transmembranproteine, welche den Transport von anorganischen Ionen durch Zellmembranen hindurch katalysieren. Die Ionenkanäle nehmen an Vorgängen teil, die so verschieden sind wie die Erzeugung und das Timing von Aktionspotenzialen, synaptische Übertragungen, Sekretion von Hormonen, Muskelkontraktionen usw.
Zahlreiche Wirkstoffe üben ihre Wirkungen über eine Modulation von Ionenkanälen aus. Beispiele sind antiepileptische Verbindungen, wie Phenytoin und Lamotrigin, welche spannungsabhängige Na⁺-Kanäle im Gehirn blockieren, blutdrucksenkende Wirkstoffe, wie Nifedipin und Diltiazem, welche spannungsabhängige Ca²⁺-Kanäle in glatten Muskelzellen blockieren, und Stimulatoren der Insulinfreisetzung, wie Glibenclamid und Tolbutamid, welche einen ATP-regulierten K⁺-Kanal im Pankreas blockieren.
Sämtliche Säugerzellen exprimieren Kaliumkanäle (K⁺-Kanäle) in ihren Zellmembranen, und die Kanäle spielen eine herausragende Rolle in der Regulierung des Membranpotenzials. In Nerven- und Muskelzellen regulieren sie die Frequenz und Form des Aktionspotenzials, die Freisetzung von Neurotransmittern und den Grad der Broncho- und Vasodilatation.
Unter einem molaren Gesichtspunkt repräsentieren die K⁺-Kanäle die größte und unterschiedlichste Gruppe von Ionenkanälen. Für einen Überblick können sie in fünf große Subfamilien unterteilt werden: spannungsabhängige K⁺-Kanäle (K_v), lang QT verwandte K⁺-Kanäle (KvLQt), nach innen gerichtete Gleichrichter (K_IR), Zweiporen-K⁺-Kanäle (K_TP) und calciumaktivierte K⁺-Kanäle (K_ca).
Die letztere Gruppe, die Ca²⁺-aktivierten K⁺-Kanäle, bestehen aus drei gut definierten Subtypen: SK-Kanäle, IK-Kanäle und BK-Kanäle. SK, IK und BK beziehen sich auf die Einkanal-Leitfähigkeit (kleine, mittlere und große Leitfähigkeit des K-Kanals). Die SK-, IK- und BK-Kanäle weisen Unterschiede in der Spannungs- und Calciumempfindlichkeit, der Pharmakologie, der Verteilung und der Funktion auf.
Ca²⁺-aktivierte SK-Kanäle sind in zahlreichen Zentralneuronen und Ganglien vorhanden, wo ihre primäre Funktion ist, Nervenzellen folgend auf ein Aktionspotenzial oder einige Aktionspotenziale zu hyperpolarisieren, um das Auftreten langer Folgen von epileptogener Aktivität zu verhindern. Die SK-Kanäle sind auch in einigen peripheren Zellen vorhanden, einschließlich Skelettmuskel, Drüsenzellen, Leberzellen und T-Lymphocyten.
Die Bedeutung von SK-Kanälen in normalem Skelettmuskel ist nicht klar, aber ihre Anzahl ist in denerviertem Muskel signifikant erhöht, und die große Anzahl von SK-Kanälen in dem Muskel von Patienten mit myotoner Muskeldystrophie legt eine Rolle in der Pathogenese der Krankheit nahe.
Es existiert eine Anzahl von Blockern von SK-Kanälen, z.B. Apamin, Atracurium, Pancuronium und Tubocurarin, und sie sind alle positiv geladene Moleküle, die als Porenblocker wirken.
Der Ca²⁺-aktivierte IK-Kanal teilt eine Anzahl von Charakteristiken mit dem Ca²⁺-aktivierten SK-Kanal, da er hoch K-selektiv ist, durch submikromolekulare Konzentrationen von Ca²⁺ aktiviert wird und eine nach innen gerichtete Gleichrichter-Leitfähigkeit hat. Es gibt jedoch auch beträchtliche Unterschiede. Die Einheitsleitfähigkeit des IK-Kanals ist 4- bis 5-fach höher als diejenige des SK-Kanals, und die Verteilung des IK-Kanals ist auf das Blut und die Gefäße beschränkt. Somit wird der IK-Kanal im Nervensystem und in Muskeln nicht exprimiert, jedoch in Endothelzellen, Zellen von epithelischem Ursprung und in roten Blutzellen.
In den roten Blutzellen, wo der IK-Kanal als Gardos-Kanal bezeichnet worden ist, öffnet ein Anstieg der Konzentration von intrazellulärem Ca²⁺ den Kanal und verursacht einen Kaliumverlust und eine Zelldehydratation, einen Zustand, der in der Sichelzellenanämie verschlimmert ist. Vielversprechende therapeutische Möglichkeiten gegen Sichelzellenanämie umfassen eine spezifische Blockierung des IK-Kanals.
IK-Kanäle sind auch in den Mikrogefäßen der Niere beteiligt, wo sie für vasodilatorische Wirkungen von Bradykinin verantwortlich sein können. Die Abnahme des Blutdrucks während eines septischen Schocks wird durch eine erhöhte NO-Produktion durch die Endothelzellen hervorgerufen, und die IK-Kanäle in diesen Zellen sind für das Aufrechterhalten des Ca²⁺-Zuflusses verantwortlich, welcher die Ca²⁺-empfindliche NO-Synthase aktiviert.
In Kapillarendothelzellen des Gehirns verschieben IK-Kanäle, aktiviert durch Endothelin, das durch Neuronen und Glia hergestellt wird, überschüssiges K⁺ in das Blut. Neurotrophile Granulocyten, d.h. bewegliche phagocytische Zellen, welche den Körper gegen mikrobielle Angreifer verteidigen, gehen eine große Depolarisation nachfolgend zu agonistischer Stimulation ein, und IK-Kanäle sind beim Depolarisieren des stimulierten Granulocyten beteiligt.
EP 432,648 beschreibt Isatinderivate mit exzitatorischer Aminosäure-Antagonisierwirkung. EP 432,648 beschreibt oder legt jedoch nicht eine mit diesen Isatinverbindungen verbundene SK- oder IK-Kanalaktivität nahe.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist nun festgestellt worden, dass eine besondere Gruppe von Isatinderivaten eine wertvolle Aktivität als Öffner von SK_ca- und/oder IK_Ca-Kanälen besitzt, und die Erfindung ist auf Isatinderivate zur Verwendung als SK/IK-Kanal aktivierende Mittel gerichtet.
In ihrem ersten Aspekt stellt die Erfindung neue Isatinderivate der allgemeinen Formel I
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Oxid oder ein Hydrat davon bereit, worin
R¹ Wasserstoff, eine C_1–6-Alkylgruppe oder eine Gruppe der Formel -CH₂CO₂R' bedeutet, worin R' Wasserstoff oder C_1–3-Alkyl bedeutet, und
R² Wasserstoff oder eine C_1–6-Alkylgruppe bedeutet,
R³ und R⁴ unabhängig voneinander Halogen oder eine C_1–3-Alkylgruppe bedeuten, und
R⁵ und R⁶ Wasserstoff bedeuten.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Isatinderivats der Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Additionssalz davon, zusammen mit wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Die Verbindungen der Erfindung sind insbesondere verwendbar zur Behandlung oder Erleichterung von Asthma, zystischer Fibrose, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung und Rhinorrhea, Krämpfen, Gefäßspasmen, Koronararterienspasmen, renaler Erkrankungen, polyzystischer Nierenerkrankung, Blasenspasmen, Urininkontinenz, Blasenausflussobstruktion, irritablem Darmsyndrom, gastrointestinaler Störung, sekretorischer Diarrhoe, Ischämie, zerebraler Ischämie, ischämischer Herzerkrankung, Angina pectoris, koronarer Herzerkrankung, traumatischem Hirnschaden, Psychose, Angstzuständen, Depression, Demenz, Gedächtnis- und Aufmerksamkeitsdefiziten, Alzheimerscher Erkrankung, Dysmenorrhoe, Narkolepsie, Reynaudscher Erkrankung, intermittierender Claudicatio, Sjorgren-Syndrom, Migräne, Arrhythmie, Bluthochdruck, Absenzen, myotoner Muskeldystrophie, Xerostomie, Diabetes Typ II, Hyperinsulinämie, vorzeitiger Wehen, Kahlheit, Krebs und Immunsuppression.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist nun festgestellt worden, dass eine besondere Gruppe von Isatinderivaten eine wertvolle Aktiviät als Öffner von SK_Ca- und/oder IK_Ca-Kanälen besitzt.
Neue Isatinderivate
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung neue Isatinderivate bereit, wiedergegeben durch die allgemeine Formel (I)
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Oxid oder ein Hydrat davon, worin
R¹ Wasserstoff, eine C_1–6-Alkylgruppe oder eine Gruppe der Formel -CH₂CO₂R' bedeutet, worin R' Wasserstoff oder C_1–3-Alkyl bedeutet,
R² Wasserstoff oder eine C_1–6-Alkylgruppe bedeutet,
R³ und R⁴ unabhängig voneinander Halogen oder eine C_1–3-Alkylgruppe bedeuten, und
R⁵ und R⁶ Wasserstoff bedeuten.
In einer bevorzugtesten Ausführungsform ist das neue Isatinderivat der Erfindung
6,7-Dichlorisatin-3-oxim,
O-Methyl-6,7-dichlorisatin-3-oxim,
O-Methyl-6,7-dichlor-1-methylisatin-3-oxim,
6,7-Dichlor-1-methylisatin-3-oxim,
Kalium-2-(6,7-dichlorisatin-1-yl-3-oxim)acetat,
O-t-Butyl-6,7-dichlorisatin-3-oxim,
6,7-Difluorisatin-3-oxim,
6,7-Dimethylisatin-3-oxim,
O-(Carboxymethyl)-6,7-dichlorisatin-3-oxim,
6-Chlor-7-methylisatin-3-oxim,
6-Fluor-7-methylisatin-3-oxim oder
6-Fluor-7-methoxyisatin-3-oxim
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Oxid oder ein Hydrat davon.
Die neuen Isatinderivate der Erfindung können vom Fachmann durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Ausgangsmaterialien hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Isatinderivate der Erfindung unter Verwendung der in den nachstehenden Ausführungsbeispielen beschriebenen Verfahren hergestellt.
Definition von Substituenten
Im Zusammenhang dieser Erfindung bedeutet Halogen ein Fluor-, ein Chlor-, ein Brom- oder ein Iodatom.
Im Zusammenhang dieser Erfindung bezeichnet eine Alkylgruppe eine einwertige gesättigte, geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette. Die Kohlenwasserstoffkette enthält bevorzugt 1 bis 12 Kohlenstoffatome (C_1–12-Alkyl), bevorzugter 1 bis 6 Kohlenstoffatome (C_1–6-Alkyl, Niederalkyl), einschließlich Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, tert-Pentyl, Hexyl und Isohexyl. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet Alkyl eine C_1–4-Alkylgruppe, einschließlich Butyl, Isobutyl, sec-Butyl und tert-Butyl. In einer bevorzugtesten Ausführungsform bedeutet Alkyl eine C_1–3-Alkylgruppe, die insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl sein kann.
Im Zusammenhang dieser Erfindung bezeichnet eine Acylgruppe eine Carboxygruppe oder eine Alkylcarbonylgruppe, worin Alkyl wie vorstehend definiert ist. Beispiele von bevorzugten Alkylgruppen der Erfindung sind Carboxy, Acetyl und Propionyl.
Pharmazeutisch annehmbare Salze
Die SK/IK-Kanal aktivierenden Mittel der Erfindung können in jeder für die beabsichtigte Verabreichung geeigneten Form bereitgestellt werden. Geeignete Formen umfassen pharmazeutisch (d.h. physiologisch) annehmbare Salze und Pre- oder Prodrug-Formen der chemischen Verbindung der Erfindung.
Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Additionssalzen umfassen ohne Beschränkung die nicht toxischen, anorganischen und organischen Säureadditionssalze, wie das von Essigsäure abgeleitete Acetat, das von Aconitsäure abgeleitete Aconitat, das von Ascorbinsäure abgeleitete Ascorbat, das von Benzolsulfonsäure abgeleitete Benzolsulfonat, das von Benzoesäure abgeleitete Benzoat, das von Zimtsäure abgeleitete Cinnamat, das von Citronensäure abgeleitete Citrat, das von Embonsäure abgeleitete Embonat, das von Önanthsäure abgeleitete Önanthat, das von Ameisensäure abgeleitete Formiat, das von Fumarsäure abgeleitete Fumarat, das von Glutaminsäure abgeleitete Glutamat, das von Glycolsäure abgeleitete Glycolat, das von Chlorwasserstoffsäure abgeleitete Hydrochlorid, das von Bromwasserstoffsäure abgeleitete Hydrobromid, das von Milchsäure abgeleitete Lactat, das von Maleinsäure abgeleitete Maleat, das von Malonsäure abgeleitete Malonat, das von Mandelsäure abgeleitete Mandelat, dasvon Methansulfonsäure abgeleitete Methansulfonat, das von Naphthalin-2-sulfonsäure abgeleitete Naphthalin-2-sulfonat, das von Salpetersäure abgeleitete Nitrat, das von Perchlorsäure abgeleitete Perchlorat, das von Phosphorsäure abgeleitete Phosphat, das von Phthalsäure abgeleitete Phthalat, das von Salicylsäure abgeleitete Salicylat, das von Sorbinsäure abgeleitete Sorbat, das von Stearinsäure abgeleitete Stearat, das von Bernsteinsäure abgeleitete Succinat, das von Schwefelsäure abgeleitete Sulfat, das von Weinsäure abgeleitete Tartrat, das von p-Toluolsulfonsäure abgeleitete p-Toluolsulfonat und Ähnliche. Solche Salze können nach im Stand der Technik bekannten und beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Andere Säuren, wie Oxalsäure, die nicht als pharmazeutisch annehmbar angesehen werden können, können bei der Herstellung von Salzen verwendbar sein, die als Zwischenprodukte zum Erhalt einer chemischen Verbindung der Erfindung und ihres pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes verwendbar sind.
Metallsalze einer chemischen Verbindung der Erfindung umfassen Alkalimetallsalze, wie das Natriumsalz einer chemischen Verbindung der Erfindung, die eine Carboxygruppe enthält.
Die chemische Verbindung der Erfindung kann in ungelösten oder solvatisierten Formen zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Lösemitteln, wie Wasser, Ethanol und Ähnliches, bereitgestellt werden. Solvatisierte Formen können auch hydratisierte Formen umfassen, wie das Monohydrat, das Dihydrat, das Hemihydrat, das Trihydrat, das Tetrahydrat und Ähnliche. Im Allgemeinen werden für die Zwecke dieser Erfindung die solvatisierten Formen als Äquivalent zu ungelösten Formen angesehen.
Sterische Isomere
Die SK/IK-Kanal aktivierenden Mittel der vorliegenden Erfindung können sowohl in (+)- und (–)-Formen als auch in racemischen Formen vorliegen. Die Racemate dieser Isomere und die einzelnen Isomere selbst sind innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Racemische Formen können in die optischen Antipoden durch bekannte Verfahren und Techniken aufgelöst werden. Ein Weg zur Trennung der diastereomeren Salze erfolgt unter Verwendung einer optisch aktiven Säure und der Freisetzung der optisch aktiven Aminverbindung durch Behandlung mit einer Base. Ein anderes Verfahren zur Auftrennung von Racematen in die optischen Antipoden basiert auf der Chromatografie auf einer optisch aktiven Matrix. Racemische Verbindungen der vorliegenden Erfindung können so in ihre optischen Antipoden, z.B. durch fraktionierte Kristallisation von d- oder I-Tartraten, -Mandelaten oder -Camphersulfonaten aufgetrennt werden.
Die chemischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch durch Bildung diastereomerer Amide durch Umsetzen der chemischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer optisch aktiven, aktivierten Carbonsäure, wie derjenigen, die von (+)- oder (–)-Phenylalanin, (+)- oder (–)-Phenylglycin, (+)- oder (–)-Camphansäure oder durch Bildung diastereomerer Carbamate durch Umsetzen der chemischen Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einem optisch aktiven Chlorformiat oder Ähnlichem aufgetrennt werden.
Weitere Verfahren zum Auftrennen der optischen Isomere sind im Stand der Technik bekannt. Solche Verfahren umfassen diejenigen, die von Jaques J., Collet A. & Wilen S. in "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, New York (1981) beschrieben sind.
Darüber hinaus können einige der chemischen Verbindungen der Erfindung, die Oxime sind, in zwei Formen, der syn- und anti-Form (Z- und E-Form) vorliegen in Abhängigkeit von der Anordnung der Substituenten an der -C=N-Doppelbindung. Eine chemische Verbindung der vorliegenden Erfindung kann daher die syn- oder die anti-Form (Z- und E-Form) sein, oder sie kann eine Mischung davon sein.
Biologische Aktivität
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist nun festgestellt worden, dass die Isatinderivate der Erfindung eine wertvolle Aktivität als Öffner von SK_Ca- und/oder IK_Ca-Kanälen besitzen.
Die SK/IK-Kanal aktivierende Wirkung kann unter Verwendung von herkömmlichen elektrophysiologischen Verfahren, wie Patch-Clamp-Techniken, oder herkömmlichen spektroskopischen Verfahren, wie dem FLIPR-Assay (Fluoreszenz-Bildplattenablese gerät, erhältlich von Molecular Devices) gemessen werden. Diese Verfahren umfassen allgemein das Unterwerfen einer SK_Ca oder IK_Ca enthaltenden Zelle der Wirkung der chemischen Verbindung der Erfindung, gefolgt durch das Überwachen des Membranpotenzials der SK_Ca oder IK_Ca enthaltenden Zelle, um die Änderungen des Membranpotenzials nachzuweisen, die durch die Wirkung der Verbindung der Erfindung hervorgerufen werden.
Im Beispiel 5 wird die biologische Aktivität der Verbindungen der Erfindung unter Verwendung elektrophysiologischer Patch-Clamp-Techniken gezeigt.
Auf der Grundlage ihrer biologischen Aktivität werden die Verbindungen der Erfindung als für die Behandlung oder Erleichterung von Krankheiten oder Zuständen verwendbar betrachtet, die auf die Aktivierung von SK_Ca- und/oder IK_Ca-Kanäle ansprechen, einschließlich Krankheiten oder Zustände, wie respiratorische Erkrankungen, wie Asthma, zystische Fibrose, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung und Rhinorrhea, Krämpfe, Gefäßspasmen, Koronararterienspasmen, renale Erkrankungen, polyzystische Nierenerkrankung, Blasenspasmen, Urininkontinenz, Blasenausflussobstruktion, irritables Darmsyndrom, gastrointestinale Störung, sekretorische Diarrhoe, Ischämie, zerebrale Ischämie, ischämische Herzerkrankung, Angina pectoris, koronare Herzerkrankung, traumatischer Hirnschaden, Psychose, Angstzustände, Depression, Demenz, Gedächtnis- und Aufmerksamkeitsdefizite, Alzheimersche Erkrankung, Dysmenorrhoe, Narkolepsie, Reynaudsche Erkrankung, intermittierende Claudicatio, Sjorgren-Syndrom, Migräne, Arrhythmie, Bluthochdruck, Absenzen, myotone Muskeldystrophie, Xerostomie, Diabetes Typ II, Hyperinsulinämie, vorzeitige Wehen, Kahlheit, Krebs und Immunsuppression.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen der Erfindung verwendet zur Behandlung oder Erleichterung von respiratorischen Erkrankungen, wie Asthma, zystische Fibrose, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung und Rhinorrhea, oder zur Behandlung oder Erleichterung von Blasenspasmen, Urininkontinenz oder Blasenausflussobstruktion.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung neue pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge einer chemischen Verbindung mit SKca- und/oder IK_Ca-aktivierender Wirkung enthalten.
Obwohl eine chemische Verbindung der Erfindung zur Verwendung in der Therapie in Form der Rohchemikalie verabreicht werden kann, ist es bevorzugt, den aktiven Wirkstoff, optional in Form eines physiologisch annehmbaren Salzes, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem oder mehreren Adjuvanzien, Arzneimittelträgern, Trägern, Puffern, Verdünnungsmitteln und/oder anderen üblichen pharmazeutischen Hilfsstoffen anzubieten.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche die SK/IK-Kanal aktivierenden Mittel der Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Derivat davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern hierfür und optional anderen therapeutischen und/oder prophylaktischen Bestandteilen enthalten, die im Stand der Technik bekannt sind und verwendet werden. Der bzw. die Träger müssen "annehmbar" in dem Sinn sein, dass sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und für ihren Empfänger nicht schädlich sind.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können solche sein, die für orale, rektale, bronchiale, nasale, topische (einschließlich buccale und sublinguale), transdermale, vaginale oder parenterale (einschließlich kutane, subkutane, intramuskuläre und intravenöse Injektion) Verabreichung geeignet sind oder in einer geeigneten Form für die Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation vorliegen.
Die chemische Verbindung der Erfindung, zusammen mit einem herkömmlichen Adjuvans, Träger oder Verdünnungsmittel, kann somit in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen und Einheitsdosierungen davon gebracht werden. Solche Formen umfassen Feststoffe, und insbesondere Tabletten, gefüllte Kapseln, Pulver und Pelletformen, und Flüssigkeiten, insbesondere wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Elixiere und mit diesen gefüllte Kapseln, sämtliche für die orale Verwendung, Suppositorien für die rektale Verabreichung und sterile injizierbare Lösungen für die parenterale Verwendung. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen und Einheitsdosierformen davon können herkömmliche Bestandteile in herkömmlichen Anteilen, mit oder ohne zusätzliche aktive Verbindungen oder Prinzipien, enthalten, und solche Einheitsdosierformen können jede geeignete wirksame Menge des aktiven Bestandteils enthalten, welche dem beabsichtigten anzuwendenden täglichen Dosierungsbereich entspricht.
Die chemische Verbindung der vorliegenden Erfindung kann in einer großen Vielzahl von oralen und parenteralen Dosierformen verabreicht werden. Es ist dem Fachmann klar, dass die folgenden Dosierformen als aktive Komponente entweder eine chemische Verbindung der Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer chemischen Verbindung der Erfindung enthalten können.
Zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen aus einer chemischen Verbindung der vorliegenden Erfindung können pharmazeutisch annehmbare Träger entweder fest oder flüssig sein. Präparationen in fester Form umfassen Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln, Kachets, Suppositorien und dispergierbare Körnchen. Ein fester Träger kann eine oder mehrere Substanzen sein, die auch als Verdünnungsmittel, Aromatisierungsmittel, Löslichmacher, Gleitmittel, Suspendiermittel, Bindemittel, Konservierungsmittel, Tablettensprengmittel oder als ein Einkapselungsmaterial wirken können.
In Pulvern ist der Träger ein fein verteilter Feststoff, welcher in einer Mischung mit der fein verteilten aktiven Komponente vorliegt.
In Tabletten ist die aktive Komponente mit dem Träger vermischt, welcher die notwendige Bindungskapazität in geeigneten Anteilen hat, und in die gewünschte Form und Größe verpresst.
Die Pulver und Tabletten enthalten vorzugsweise fünf oder zehn bis etwa siebzig Prozent der aktiven Verbindung. Geeignete Träger sind Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talkum, Zucker, Lactose, Pektin, Dextrin, Stärke, Gelatine, Tragant, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, ein niedrig schmelzendes Wachs, Kakaobutter und Ähnliches. Der Ausdruck "Präparation" soll die Formulierung der aktiven Verbindung mit Einkapselungsmaterial als Träger umfassen, die eine Kapsel bereit stellt, in welcher die aktive Komponente, mit oder ohne Träger, von einem Träger umgeben ist, der so in Verbindung mit ihr steht. In ähnlicher Weise sind Kachets und Pastillen umfasst. Tabletten, Pulver, Kapseln, Pillen, Kachets und Pastillen können als feste Formen verwendet werden, die für die orale Verabreichung geeignet sind.
Zur Herstellung von Suppositorien wird ein niedrig schmelzendes Wachs, wie eine Mischung von Fettsäureglycerid oder Kakaobutter, zuerst geschmolzen, und die aktive Komponente wird darin, z.B. durch Rühren, homogen dispergiert. Die geschmolzene homogene Mischung wird dann in Formen von geeigneter Größe gegossen, abkühlen und dadurch fest werden gelassen.
Für die vaginale Verabreichung geeignete Zusammensetzungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprays vorliegen, die zusätzlich zu dem aktiven Bestandteil solche Träger enthalten, wie sie im Stand der Technik als geeignet bekannt sind.
Flüssige Präparationen umfassen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, z.B. Wasser oder Wasser-Propylenglycol-Lösungen. Flüssige Präparationen zur parenteralen Injektion können z.B. als Lösungen in wässriger Polyethylenglycol-Lösung formuliert werden.
Die chemische Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung kann somit für die parenterale Verabreichung (z.B. durch Injektion, z.B. Bolus-Injektion oder kontinuierliche Infusion) formuliert werden, und sie kann in Einheitsdosisform in Ampullen, vorgefüllten Spritzen, kleinvolumigen Infusionsbehältern oder Mehrtachdosenbehältern mit einem zugesetzten Konservierungsmittel vorliegen. Die Zusammensetzungen können solche Formen haben, wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln, und sie können Formulierungsmittel enthalten, wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel. Alternativ kann der aktive Wirkstoff in Pulverform vorliegen, erhalten durch aseptische Isolierung eines sterilen Feststoffs oder durch Gefriertrocknung aus einer Lösung, zur Wiederherstellung mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung.
Wässrige Lösungen, die für die orale Verwendung geeignet sind, können durch Auflösen der aktiven Komponente in Wasser und Zugabe von geeigneten Färbemitteln, Aromastoffen, Stabilisier- und Verdickungsmitteln, wie erwünscht, hergestellt werden.
Wässrige Suspensionen, die für die orale Verwendung geeignet sind, können durch Dispergieren der fein verteilten aktiven Komponente in Wasser mit viskosem Material, wie natürlichen oder synthetischen Gummen, Harzen, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose oder anderen bekannten Suspendiermitteln, hergestellt werden.
Ebenfalls umfasst sind Präparationen in fester Form, die kurz vor der Verwendung in Präparationen in flüssiger Form für die orale Verabreichung umgewandelt werden sollen. Solche flüssigen Formen umfassen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Diese Präparationen können zusätzlich zu der aktiven Komponente Färbemittel, Aromastoffe, Stabilisatoren, Puffer, künstliche und natürliche Süßstoffe, Dispergiermittel, Verdickungsmittel, Löslichmacher und Ähnliches enthalten.
Für die topische Verabreichung auf die Epidermis kann die chemische Verbindung gemäß der Erfindung als Salben, Cremes oder Lotionen oder als ein transdermales Kissen formuliert werden. Salben und Cremes können z. B. mit einer wässrigen oder öligen Grundlage unter Zugabe von geeigneten Verdickungs- und/oder Geliermitteln formuliert werden. Lotionen können mit einer wässrigen oder öligen Grundlage formuliert werden und enthalten im Allgemeinen eines oder mehrere Emulgiermittel, Stabilisatoren, Dispergiermittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel oder Färbemittel.
Für die topische Verabreichung im Mund geeignete Formulierungen umfassen Pastillen, die das aktive Mittel in einer aromatisierten Grundlage enthalten, gewöhnlich Sucrose und Akaziengummi oder Tragant; Pastillen, die den aktiven Bestandteil in einer inerten Grundlage enthalten, wie Gelatine und Glycerin oder Sucrose und Akaziengummi; und Mundspülungen, die den aktiven Bestandteil in einem geeigneten flüssigen Träger enthalten.
Lösungen oder Suspensionen werden direkt in der Nasenhöhle durch herkömmliche Maßnahmen angewendet, z.B. mit einer Tropfeinrichtung, einer Pipette oder einem Spray. Die Zusammensetzungen können in Form von Einzeldosen oder Mehrfachdosen vorliegen. Im letzteren Fall einer Tropfeinrichtung oder einer Pipette kann dies durch den Patienten durch Verabreichen eines geeigneten, vorbestimmten Volumens der Lösung oder Suspension erreicht werden. Im Falle eines Sprays kann dies z.B. mittels einer Vernebelungs-Sprühdosierpumpe erreicht werden.
Eine Verabreichung an den Atmungstrakt kann auch mittels einer Aerosol-Formulierung erreicht werden, in welcher der aktive Bestandteil in einer mit Druck beaufschlagten Packung mit einem geeigneten Treibmittel, wie Chlorfluorkohlenstoff (CFC), z.B Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan oder Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas, vorgesehen ist. Das Aerosol kann in geeigneter Weise auch ein oberflächenaktives Mittel, wie Lecithin, enthalten. Die Dosis des Wirkstoffs kann geregelt werden, indem ein Dosierventil vorgesehen ist.
Alternativ können die aktiven Bestandteile in der Form eines trockenen Pulvers, z.B. einer Pulvermischung der Verbindung in einer geeigneten Pulvergrundlage, wie Lactose, Stärke, Stärkederivate, wie Hydroxypropylmethylcellulose, und Polyvinylpyrrolidon (PVP), vorgesehen sein. Der Pulverträger bildet in geeigneter Weise ein Gel in der Nasenhöhle. Die Pulverzusammensetzung kann in einer Einheitsdosisform vorliegen, z.B. in Kapseln oder Hülsen von z.B. Gelatine, oder Blister-Packungen, aus welchen das Pulver mittels eines Inhalators verabreicht werden kann.
In Zusammensetzungen, deren Verabreichung an den Atmungstrakt beabsichtigt ist, einschließlich intranasaler Zusammensetzungen, wird die Verbindung allgemein eine kleine Teilchengröße, z.B. in der Größenordnung von 5 Mikron oder weniger, haben. Eine solche Teilchengröße kann durch im Stand der Technik bekannte Maßnahmen erhalten werden, z.B. durch Mikronisieren.
Wenn es erwünscht ist, können Formulierungen verwendet werden, die so angepasst sind, dass sie eine verzögerte Freisetzung des aktiven Wirkstoffs ergeben.
Die pharmazeutischen Präparationen sind vorzugsweise Einheitsdosierformen. In einer solchen Form ist die Präparation in Einheitsdosen unterteilt, die geeignete Mengen der aktiven Komponente enthalten. Die Einheitsdosierform kann eine verpackte Präparation sein, wobei die Verpackung getrennte Mengen der Präparation enthält, wie verpackte Tabletten, Kapseln und Pulver in Vialen oder Ampullen. Die Einheitsdosierform kann auch selbst eine Kapsel, eine Tablette, ein Kachet oder eine Pastille sein, oder sie kann eine geeignete Anzahl von sämtlichen von diesen in verpackter Form sein.
Tabletten oder Kapseln für die orale Verabreichung und Flüssigkeiten für die intravenöse Verabreichung und die kontinuierliche Infusion sind bevorzugte Zusammensetzungen.
Weitere Einzelheiten betreffend Techniken für die Formulierung und Verabreichung können in der letzten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA) gefunden werden.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf diejenige Menge des aktiven Bestandteils, welcher die Symptome oder den Zustand verbessert. Die therapeutische Wirksamkeit und die Toxizität, d.h. ED₅₀ und LD₅₀, können nach pharmakologischen Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen der therapeutischen Wirkung und der toxischen Wirkung ist der therapeutische Index und kann durch das Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche hohe therapeutische Indices aufweisen, sind bevorzugt.
Die verabreichte Dosis muss natürlich sorgfältig sowohl auf das Alter, das Gewicht und den Zustand des zu behandelnden Individuums als auch auf den Verabreichungsweg, die Dosierungsform und die Therapie und auf das erwünschte Ergebnis eingestellt werden, und die exakte Dosierung sollte natürlich vom Arzt bestimmt werden.
Die exakte Dosierung hängt von der Natur und der Schwere der zu behandelnden Krankheit und von dem Verabreichungsweg ab und steht im Ermessen des Arztes und kann durch Bemessung der Dosierung auf die besonderen Umstände dieser Erfindung variiert werden, um die erwünschte therapeutische Wirkung hervorzurufen. Derzeit wird jedoch davon ausgegangen, dass pharmazeutische Zusammensetzungen, die etwa 0,1 bis etwa 500 mg des aktiven Bestandteils pro Einzeldosis, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 100 mg, am bevorzugtesten etwa 1 bis etwa 10 mg, enthalten, für therapeutische Behandlungen geeignet sind.
Der aktive Bestandteil kann in einer Dosis oder mehreren Dosen pro Tag verabreicht werden. Ein zufriedenstellendes Ergebnis kann in bestimmten Fällen mit einer Dosierung so niedrig wie 0,1 μg/kg i.v. und 1 μg/kg p.o. erhalten werden. Als obere Grenze des Dosierungsbereichs werden derzeit etwa 10 mg/kg i.v. und 100 mg/kg p.o. angesehen. Bevorzugte Bereiche betragen etwa 0,1 μg/kg bis etwa 10 mg/kg/Tag i.v. und etwa 1 μg/kg bis etwa 100 mg/kg/Tag p.o.
Beispiele
Die Erfindung wird weiter mit Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert, die in keiner Weise als den Bereich der beanspruchten Erfindung beschränkend angesehen werden dürfen.
Tabelle 1 Substituierte Isatinoxime
Beispiel 1 Herstellungsbeispiel
5-Bromisatin-3-oxim (1a). Eine Mischung von 5-Bromisatin (2,4 g, 10,0 mmol), Hydroxylamin-Hydrochlorid (0,76 g, 11 mmol) und Natriumcarbonat (1,1 g, 10,4 mmol) in 96 %igem Ethanol (30 ml) wurde bei Umgebungstemperatur 2 Stunden gerührt. Wasser (50 ml) wurde zugesetzt, und das Rohprodukt wurde abfiltriert. Die Umkristallisation aus Ethanol ergab reines 5-Bromisatin-3-oxim (2,2 g, 91 %). Fp. 250 – 251 °C.
Die folgenden Verbindungen wurden in analoger Weise hergestellt:
5,6-Dichlor-1-methylisatin-3-oxim (1b) aus 5,6-Dichlor-1-methylisatin. Ausbeute: 79 %. Fp. 232 – 236°C.
4,5-Dichlorisatin-3-oxim (1c) aus 4,5-Dichlorisatin. Ausbeute: 51 %. Fp. 245 – 247°C.
4,5-Dichlor-1-methylisatin-3-oxim (1d) aus 4,5-Dichlor-1-methylisatin. Ausbeute: 97 %. Fp. 140 – 142°C.
O-Methyl-4,5-dichlor-1-methylisatin-3-oxim (1e) aus 4,5-Dichlor-1-methylisatin und O-Methylhydroxylamin-Hydrochlorid. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 64 %. Fp. 180 – 183°C.
Benzo[e]isatin-3-oxim (1f) aus Benzo[e]isatin. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Fp. 230°C.
6,7-Dichlorisatin-3-oxim (1g) aus 6,7-Dichlorisatin. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 70 %. Fp. 277 – 278°C.
O-Methyl-6,7-dichlorisatin-3-oxim (1h) aus 6,7-Dichlorisatin und O-Methylhydroxylamin-Hydrochlorid. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 43 %. Fp. > 250°C.
O-Methyl-6,7-dichlor-1-methylisatin-3-oxim (1i) aus 6,7-Dichlor-1-methylisatin und O-Methylhydroxylamin-Hydrochlorid. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 74 %. Fp. 189 – 191 °C.
6,7-Dichlor-1-methylisatin-3-oxim (1j) aus 6,7-Dichlor-1-methylisatin. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 52 %. Fp. > 200°C.
Kalium-2-(6,7-dichlorisatin-1-yl-3-oxim)acetat (1k) aus 2-(6,7-Dichlorisatin-1-yl)-essigsäure (Beispiel 2a). Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Das Produkt fiel als Kaliumsalz nach der Zugabe von Kalium-t-Butanolat zu einer ethanolischen Lösung aus. Ausbeute: 60 %. Fp. > 300°C.
O-t-Butyl-6,7-dichlorisatin-3-oxim (1l) aus 6,7-Dichlorisatin und O-t-Butylhydroxylamin-Hydrochlorid. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 78 %. Fp. 220 – 221 °C.
O-((4-Phenylpiperazin-1-yl)carbonylmethyl)-6,7-dichlorisatin-3-oxim (1m) aus O-((4-Phenylpiperazin-1-yl)carbonylmethyl)hydroxylamin-Hydrochlorid und 6,7-Dichlorisatin. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 76 %. Fp. 237 – 238°C.
O-(4-Chlorbenzylamino)methyl-6,7-dichlorisatin-3-oxim (1n) aus 6,7-Dichlorisatin und O-((4-Chlorbenzylamino)methyl)hydroxylamin. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 69 %. Fp. 232 – 234°C.
6,7-Difluorisatin-3-oxim (1o) aus 6,7-Difluorisatin und Hydroxylamin-Hydrochlorid. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 100 %. Fp. 263 – 264°C.
6,7-Dimethylisatin-3-oxim (1p) aus 6,7-Dimethylisatin und Hydroxylamin-Hydrochlorid. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 98 %. Fp. 283 – 284°C.
5,6-Dichlorisatin-3-oxim (1q) aus 5,6-Dichlorisatin und Hydroxylamin-Hydrochlorid. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 52 %. Fp. 274 – 275°C.
O-Carboxymethyl-5-bromisatin-3-oxim (1r) aus 5-Bromisatin und O-Carboxymethylhydroxylamin-Hydrochlorid. THF wurde als Lösemittel verwendet, und die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 76 %. Fp. 214 – 216°C.
O-(Ethoxycarbonylmethyl)-5-bromisatin-3-oxim (1s) aus 5-Bromisatin und O-(Carboxymethyl)hydroxylamin-Hydrochlorid. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt, und es erfolgte keine Zugabe einer Base. Ausbeute: 6 %. Fp. 167 – 169°C.
O-(Carboxymethyl)-6,7-dichlorisatin-3-oxim (1t) aus 6,7-Dichlorisatin und O-(Carboxymethyl)hydroxylamin-Hydrochlorid. Die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 71 %. Fp. 245 – 246°C.
6-Chlor-7-methylisatin-3-oxim (1u) aus 6-Chlor-7-methylisatin und Hydroxylamin-Hydrochlorid. THF wurde als Lösemittel verwendet, und die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 56 %. Fp. > 300°C.
6-Fluor-7-methylisatin-3-oxim (1v) aus 6-Fluor-7-methylisatin und Hydroxylamin-Hydrochlorid. THF wurde als Lösemittel verwendet, und die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 92 %. Fp. 286°C unter Zersetzung.
6-Fluor-7-methoxyisatin-3-oxim (1w) aus 6-Fluor-7-methoxyisatin und Hydroxylamin-Hydrochlorid. THF wurde als Lösemittel verwendet, und die Reaktionsmischung wurde auf Rückfluss erhitzt. Ausbeute: 87 %. Fp. 268 – 270°C.
Beispiel 2 Zwischenverbindungen
5,6-Dichlor-1-methylisatin (2a). Zu einer Lösung von 5,6-Dichlorisatin (0,15 g, 0,7 mmol) in wasserfreiem DMF (5 ml) wurde Natriumhydrid (40 mg, 60 %ige Dispersion in Mineralöl) zugesetzt. Wenn die Wasserstoffentwicklung beendet war, wurde Iodmethan (0,1 ml) zugesetzt, und die Mischung wurde 20 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Wasser (15 ml) und Eisessig (0,1 ml) wurden zugesetzt, und das Produkt wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet und ergab 5,6-Dichlor-1-methylisatin (0,13 g, 81 %).
Die folgenden Verbindungen wurden in analoger Weise hergestellt:
4,5-Dichlor-1-methylisatin (2b) aus 4,5-Dichlorisatin und 6,7-Dichlor-1-methylisatin aus 6,7-Dichlorisatin.
Beispiel 2a
2-(6,7-Dichlorisatin-1-yl)essigsäure (2c). Eine Lösung von 5,6-Dichlorisatin (1,0 g, 4,65 mmol) in DMF (20 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt. Natriumhydrid (5,11 mmol, 0,20 g einer 60 %igen Dispersion in Mineralöl) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 20 Minuten gerührt. Ethyl-2-bromacetat (0,37 ml, 5,11 mmol) wurde zugesetzt, und das Rühren wurde 2 Stunden fortgesetzt. Die erhaltene Mischung wurde in verdünnte Chlorwasserstoffsäure (200 ml, 4 M) gegossen, 2 Stunden auf Rückfluss erhitzt, filtriert, abgekühlt und mit Ethylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne verdampft, wodurch das erwünschte Produkt zurückblieb (0,85 g, 67 %).
Beispiel 3 Zwischenverbindungen
Die folgenden Isatine wurden gemäß dem vorstehenden Schema durch das in Organic Syntheses, Coll. Vol. I, Seite 327, beschriebenen Verfahren hergestellt.
5,6-Dichlorisatin (3a) und 4,5-Dichlorisatin (3b) wurden als eine Isomerenmischung aus 3,4-Dichloranilin hergestellt. Die Isomere wurden durch fraktionierte Kristallisation aus Ethylacetat getrennt.
6,7-Dichlorisatin (3c) wurde aus 2,3-Dichloranilin hergestellt.
6,7-Difluorisatin (3d) wurde aus 2,3-Difluoranilin hergestellt.
6,7-Dimethylisatin (3e) wurde aus 2,3-Dimethylanilin hergestellt.
6-Chlor-7-methylisatin (3f) wurde aus 3-Chlor-2-methylanilin hergestellt.
6-Fluor-7-methylisatin (3g) wurde aus 3-Fluor-2-methylanilin hergestellt.
6-Fluor-7-methoxyisatin (3h) wurde aus 3-Fluor-o-anisidin hergestellt.
Beispiel 4
Benzo[e]isatin (4a). Eine Mischung von Diethyloxomalonat (1,4 ml, 9 mmol), 2-Aminonaphthalin (1 g, 7 mmol) und Natriumcarbonat (0,2 g, 19 mmol) in Essigsäure (15 ml) wurde 10 Minuten auf Rückfluss erhitzt. Das Lösemittel wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in wässrigem Natriumhydroxid (4 M, 30 ml) suspendiert. Die Suspension wurde 5 Stunden auf Rückfluss erhitzt, während welcher Zeit Luft durch die Reaktionsmischung geblasen wurde. Die abgekühlte Mischung wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure angesäuert, und das Rohprodukt wurde abfiltriert. Die Umkristallisation aus Ethanol ergab reines Benzo[e]isatin (0,3 g. Fp. 245°C).
Beispiel 5
Elektrophysiologische Versuche
In diesem Beispiel wird die biologische Aktivität der Verbindungen der Erfindung unter Verwendung elektrophysiologischer Patch-Clamp-Techniken gezeigt.
Ca²⁺-aktivierte K⁺-Kanäle mit mittlerer Leitfähigkeit (IK-Kanäle) sind aus menschlicher Plazenta geklont und stabil in HEK293-Zellen exprimiert worden. Der Ionenstrom durch die Kanäle wird im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Technik aufgezeichnet.
Stabile Expression von IK in HEK293-Zellen
Menschliche IK (hIK) wurde aus pT3T7 (GenBank Acc. Nr. N56819) unter Verwendung von EcoR I und Not I ausgeschnitten und in dem Säugerexpressionsvektor pNS1Z (NeuroSearch), ein auf den Kunden zugeschnittenes Derivat von pcDNA3Zeo (InVitrogen), subkloniert und ergab das Plasmidkonstrukt pNS1Z_hIK.
HEK293-Gewebekulturzellen wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), ergänzt mit 10 % FCS (fötales Kalbserum) bei 37°C in 5 % CO₂ wachsen gelassen. Einen Tag vor der Transfektion wurden 10⁶ Zellen in einer Zellkultur-T25-Flasche plattiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen unter Verwendung der Lipofektion transfiziert (20 μl Lipofectamin^®, Life Technologies, mit 2,5 μg des Plasmids pNS1Z_hIK in einem Gesamtvolumen von 540 μl).
Die Zellen wurden mit der Lipofektionsmischung überschichtet und 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann mit normalem Medium gespült und 72 Stunden in DMEM, 10 % FCS bei 37°C in 5 % CO₂ wachsen gelassen.
72 Stunden nach der Transfektion wurden mit pNS1Z_hIK transfizierte Zellen in Medien, ergänzt mit 0,25 mg/ml Zeocin, selektiert. Einzelne Klone wurden entnommen und in Selektionsmedien vermehrt, bis eine ausreichende Zahl von Zellen zum Gefrieren vorhanden war. Danach wurden die Zellen in normalem Medium ohne Selektionsmittel kultiviert.
Die Expression von funktionellen hlK-Kanälen wurde durch Patch-Clamp-Messungen nachgewiesen.
Ganzzell-Aufzeichnungen
Versuche werden auf einer von mehreren Patch-Clamp-Anordnungen durchgeführt. Auf Deckgläser plattierte Zellen werden in eine 15 μl-Perfusionskammer (Durchflussrate ~ 1 ml/min) verbracht, die auf einem IMT-2-Mikroskop, ausgerüstet mit Nomarski- oder Hoffmann-Optik montiert ist. Die Mikroskope werden auf schwingungsfreie Tische in geerdeten Faraday-Käfigen verbracht. Sämtliche Versuche werden bei Raumtemperatur (20 – 22°C) durchgeführt. EPC-9-Patch-Clamp-Verstärker (HEKA-Electronics, Lambrect, Deutschland) sind mit Macintosh-Computern über ITC16-Schnittstellen verbunden. Daten werden direkt auf der Festplatte gespeichert und durch die IGOR-Software (Wave-Metrics, Lake Oswega, V.St.A.) analysiert.
Es wird die Ganzzell-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik angewandt. Die Spitze einer Borsilikat-Pipette (Widerstand 2 – 4 MΩ) wird vorsichtig (entferntes Kontrollsystem) auf die Zellmembran verbracht. Leichtes Ansaugen führt zu einer Giga-Abdichtung (der Pipettenwiderstand steigt auf mehr als 1 GΩ an), und die Zellmembran wird dann durch stärkeres Ansaugen aufgebrochen. Die Zellkapazität wird elektronisch kompensiert, und der Widerstand zwischen der Pipette und dem Zellinneren (der Vorwiderstand Rs) wird gemessen und kompensiert. Gewöhnlich liegt die Zellkapazität im Bereich von 5 bis 20 pF (abhängig von der Zellgröße), und der Vorwiderstand liegt im Bereich von 3 bis 6 MΩ. Sowohl die Rs-Kompensation als auch die Kapazitätskompensation werden während der Versuche (vor jedem Reiz) aktualisiert.
Sämtliche Versuche mit weglaufenden Rs-Werten werden verworfen. Lecksubtraktionen werden nicht durchgeführt.
Lösungen
Die folgenden fünf Verbindungen 1a, 1g, 1h, 1i und 1j der Tabelle 1 wurden diesem Versuch unterworfen.
Die extrazelluläre (Bad)lösung enthält: 144 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES (pH = 7,4). Die Prüfverbindungen werden in DMSO aus einer Vorratslösung aufgelöst und dann auf eine Endkonzentration von etwa 10 μM in der extrazellulären Lösung verdünnt. Die Konzentration von CaCl₂ beträgt 7,6 mM, und diejenige von MgCl₂ beträgt 1,2 mM, was berechnete freie Konzentrationen von 300 nM bzw. 1 mM ergibt.
Quantitative Bestimmung
Nach der Einrichtung der Ganzzell-Konfiguration werden Spannungsanstiege (gewöhnlich –100 bis +100 mV) alle 5 Sekunden an die Zelle angelegt. Es wird ein stabiler Grundlinienstrom innerhalb eines Zeitraums von 100 bis 300 Sekunden erhalten, und die Verbindungen werden dann zugesetzt, indem zu einer die zu prüfende Verbindung enthaltenden extrazellulären Lösung gewechselt wird. Sehr geringe endogene Ströme (< 200 pA bei 100 mV, im Vergleich zu 2 – 20 nA IK-Strom) werden unter diesen Umständen in nativen HEK293-Zellen aktiviert.
Ergebnisse
Sämtliche geprüfte Verbindungen in diesem Versuch zeigten eine Aktivität bei einer Endkonzentration von etwa 10 μM oder weniger, und diese Verbindungen sind daher wirksame Aktivierungsmittel der Erfindung für SK/IK-Kanäle.

Claims

Isatinderivat, wiedergegeben durch die allgemeine Formel I
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Oxid oder ein Hydrat davon, worin R¹ Wasserstoff, eine C_1–6-Alkylgruppe oder eine Gruppe der Formel -CH₂CO₂R' bedeutet, worin R' Wasserstoff bedeutet, R² Wasserstoff oder eine C_1–6-Alkylgruppe bedeutet, und R³ und R⁴ unabhängig voneinander Halogen oder eine C_1–3-Alkylgruppe bedeuten, und R⁵ und R⁶ Wasserstoff bedeuten, mit der Maßgabe, dass das Isatinderivat nicht 6,7-Dichlorisatin-3-oxim ist.
Isatinderivat gemäß Anspruch 1, welches O-Methyl-6,7-dichlorisatin-3-oxim, O-Methyl-6,7-dichlor-1-methylisatin-3-oxim, 6,7-Dichlor-1-methylisatin-3-oxim, O-t-Butyl-6,7-dichlorisatin-3-oxim, 6,7-Difluorisatin-3-oxim, 6,7-Dimethylisatin-3-oxim, O-(Carboxymethyl)-6,7-dichlorisatin-3-oxim, 6-Chlor-7-methylisatin-3-oxim, 6-Fluor-7-methylisatin-3-oxim oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Oxid oder ein Hydrat davon ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Isatinderivats gemäß entweder den Ansprüchen 1 und 2 oder des Isatinderivats 6,7-Dichlorisatin-3-oxim oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, zusammen mit wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3 zur Verwendung bei der Behandlung oder Erleichterung von respiratorischen Erkrankungen, wie Asthma, cystische Fibrose, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung und Rhinorrhea, oder von Blasenspasmen, Urininkontinenz oder Blasenausflussobstruktion.