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Von Überempfindlichkeitsreaktionen
auf Nahrungsmittel sind bis zu 6% der Kinder in ihren ersten Lebensjahren
betroffen (Bock, S. A., 1987, Pediatrics 79: 683–688), wobei Milch, Eier und
Erdnüsse
für die
meisten der dokumentierten allergischen Reaktionen verantwortlich
sind (James, J. M. und Sampson, H. A., 1992, Pediatr. Allergy & Immunol. 3: 67–78). Die
meisten Kinder, die gegen Milch allergisch sind, entwickeln eine Überempfindlichkeit auf
Kuhmilch innerhalb des ersten Lebensjahres, und dann überwinden
ungefähr
80% ihre Empfindlichkeit (d. h. werden klinisch tolerant) bis zum
Alter von drei Jahren (Host, A., 1994, Pediatr. Allergy Immunol.
5: 5–36).
Die Überempfindlichkeit
auf Hühnereier
und Erdnüsse
wird häufiger
im zweiten Lebensjahr erkannt. Die Eiallergie scheint länger anzuhalten
als die Kuhmilchallergie, während
die Erdnussallergie sehr selten überwunden
wird (Bock, S. A., 1982, J. Allergy Clin. Immunol. 69: 173–177; Sampson,
H. A. und S. M. Scanlon, 1989, J. Pediatr. 115: 23–27; Bock,
S. A. und F. M. Atkins, 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 900–904). Die
Basis für
diese Unterschiede bezüglich
der Dauer der klinischen Überempfindlichkeit
auf verschiedene Nahrungsmittelallergene ist unbekannt.
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Eine
Eiallergie kommt bei fast zwei Dritteln der Kinder mit atopischer
Dermatitis vor (Sampson, H. A., 1997, Roy. Soc. Med. 90 (Suppl.
30): 3–9). Wenn
Kinder, die allergisch gegen Eier sind, auf eine Diät gesetzt
werden, die keine Eiproteine enthält, entwickelt ungefähr ein Drittel
innerhalb von zwei Jahren eine klinische Toleranz auf Eier, auch
wenn IgE-Antikörper
gegen Eier (z. B. positive Prick-Hauttests) mehrere Jahre nachweisbar
bleiben (Sampson 1989). Ovomucoid (Gal d 1) ist das vorherrschende Allergen
im Hühnerei,
und Kinder mit anhaltender Eiallergie haben signifikant höhere Konzentrationen
an IgE-Antikörpern
gegen Ovomucoid als diejenigen, die ihre Reaktivität überwinden
(Bernhisel-Broadbent, J., et al. 1994, J. Allergy Clin. Immunol.
93: 1047–1059).
Ovomucoid ist ein Glycoprotein, das aus 186 Aminosäuren besteht,
die in drei Tandemdomänen
angeordnet sind, die neun Disulfidbindungen innerhalb der Domänen sowie
fünf Kohlenhydrat-Seitenketten
enthalten (Kato et al, 1987, Biochemistry 26: 193–201).
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Das
Hauptallergen der Erdnuss, Ara ha 2 wird von Serum-IgE von > 90% der Patienten
mit einer Erdnussüberempfindlichkeit
erkannt (Stanley et al, 1997, Archives of Biochemistry and Biophysics, Bd.
342(2): 244–253).
Die linearen Hauptepitope dieses Allergens, die Immun globulin E
(IgE) binden, wurden mit Hilfe überlappender
Peptide kartiert. Drei Epitope wurden von allen getesteten Patienten
erkannt, und es wurde gezeigt, dass sie die immundominanten Epitope
des Ara-h-2-Proteins sind (Stanley et al., 1997, oben).
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Es
ist ein Ziel dieser Erfindung, einen Test, der Verfahren und Reagenzien
einschließt,
zur Vorhersage der Wahrscheinlichkeit, dass Kinder eine Allergie,
insbesondere eine Nahrungsmittelallergie, überwinden, bereit zu stellen.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
und Reagenzien für
das Screenen auf das Vorliegen von Antikörpern gegen lineare versus
konformationelle Epitope in Proben von Patienten bereit zu stellen.
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Es
ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
und Reagenzien für
das Screenen von Patienten mit entzündlichen Darmkrankheiten zur
Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, dass sie einen eher progressiveren,
refraktären
Verlauf zeigen, bereit zu stellen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
werden Verfahren und Reagenzien für die Verwendung zur Vorhersage
der Wahrscheinlichkeit bereit gestellt, dass ein Kind eine Allergie,
insbesondere eine Nahrungsmittelallergie, überwindet, und zwar durch das
Screenen bezüglich
der Immunreaktivität
von IgE-Antikörpern gegenüber linearen
Epitopen im Vergleich zu konformationellen Epitopen. Das Kind wird
zunächst
mittels Standardtechniken gescreent, um zu bestimmen, gegen welche
Antigene das Kind allergisch ist. Die Immunglobuline in der Probe
des Patienten werden dann entweder unter Einsatz des natürlichen
gereinigten Antigens, eines rekombinanten Antigens, eines reduzierten
und alkylierten Antigens, proteolytischer Fragmente des Antigens
oder synthetischer Peptide mit einer Länge von 4 bis 40 Aminosäuren, vorzugsweise
6 bis 10 Aminosäuren,
die für
ein schnelles und genaues Screening immobilisiert werden können, charakterisiert.
Die Antikörper
des Patienten, die typischerweise in einer Serum- oder Plasmaprobe
vorliegen, lässt
man dann mit dem Protein oder den Peptiden reagieren, um zu bestimmen,
welche Peptide von den Antikörpern
gebunden werden. Diese Antikörper
werden dann charakterisiert, um zu bestimmen, ob die Epitope, an
die sie binden, linear oder konformationell sind. Diejenigen Patienten,
die Antikörper
besitzen, die primär
mit konformationellen Epitopen reagieren (d. h., die mit nativem
Protein oder proteolytischen Fragmenten reagieren, im Vergleich
zu reduziertem und alkyliertem Protein oder synthetischen linearen
Peptiden), werden typischerweise ihre Allergien überwinden. Diejenigen, die
in erster Linie mit linearen Epitopen reagieren, können ihre
Reaktivität
möglicherweise
nicht überwinden
und müssen
möglicherweise
behandelt werden, um eine Toleranz zu induzieren.
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Das
Screening-Verfahren wird in einem Beispiel demonstriert, in dem
gepoolte Seren von Patienten, die auf Eier allergisch sind, und überlappende synthetische
Decapeptide, die von der Sequenz des Ovomucoids abgeleitet wurden,
eingesetzt werden. Es wurde gefunden, dass das Ovomucoid fünf allergene,
IgE-bindende Epitope besitzt. Die Untersuchung der allergenen Epitope
mit einzelnen Seren von Patienten zeigte drei Muster der Epitopbindung: eine
extensive IgE-Bindung an Decapeptide in allen drei Ovomucoid-Domänen, eine
IgE-Bindung vorwiegend an Peptide der ersten Domäne, und praktisch keine IgE-Bindung
an beliebige synthetische Peptide, was anzeigte, dass die meisten
IgE-Antikörper
in der letzteren Gruppe konformationelle Epitope erkannten. Alle
Patienten zeigten eine extensive Bindung der IgG-Antikörper an
die linearen, synthetischen Peptide, während alle Kontrollen, die
nicht auf Eier allergisch waren, nur die konformationellen Epitope
erkannten. Die Patienten in der Gruppe mit extensiver IgE-Bindung an lineare
Decapeptide tendierten dazu, älter
zu sein und nach dem Essen von Eiern schwerere, generalisierte allergische
Symptome zu zeigen als die Patientengruppe mit wenigen IgE-Antikörpern gegen
synthetische Peptide. Diese Befunde zeigen, dass Unterschiede bei
der Antigenprozessierung und Unterschiede bei der Epitoperkennung
durch den Antikörper
eine Rolle beim klinischen Verlauf einer Allergenempfindlichkeit
spielen.
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Ein ähnliches
Verfahren zur Beurteilung von IgG- oder IgA-Antikörpern kann
eingesetzt werden, um die Prognose bestimmter entzündlicher
Krankheiten, insbesondere derjenigen, die den Magen-Darm-Trakt betreffen,
wie des Morbus Crohn, der Colitis ulcerosa und der Zöliakie,
vorherzusagen.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1. Kumulative SPOTs-IgE-Gal-d-1-OD-Scores
für jedes
der 89 überlappenden
synthetischen Decapeptide, die auf der SPOTs-Membran erzeugt wurden.
Die Scores reflektieren die Gesamtbindung der 17 auf Eier allergischen
Patienten, die untersucht wurden.
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2. Kumulative SPOTs-IgG-Gal-d-1-OD-Scores
für jedes
der 89 überlappenden
synthetischen Decapeptide, die auf der SPOTs-Membran erzeugt wurden.
Die Scores reflektieren die Gesamtbindung der 17 auf Eier allergischen
Patienten, die untersucht wurden. weiter Seite 4 Zeile 4
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3a–c.
Muster der Bindung von Ovomucoid-spezifischem IgE an synthetisierte
Decapeptide, gezeigt als Mediane der kumulativen SPOTs-IgE-Gal-d-1-OD-Scores:
Gruppe 1, 3a, besaß IgE-Antikörper gegen
Epitope in allen drei Ovomucoid-Domänen. Gruppe 2, 3b, hatte Ovomucoid-spezifische IgE-Antikörper primär gegen Epitope
der ersten Ovomucoid-Domäne;
und Gruppe 3, 3c, hatte
vernachlässigbare
IgE-Antikörper gegen
beliebige synthetische Decapeptide.
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4a–e.
Mediane kumulative SPOTs-IgG-Gal-d-1-OD-Scores von Patienten mit
Eiallergie (4a–4c) und Kontrollen ohne Eiallergie/Patienten
mit atopischer Dermatitis ohne Eiallergie (4d) und normalen Kontrollen ohne Eiallergie (4e).
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5a–b.
Es wurde das Verhältnis
von Ovomucoid-spezifischen IgE-Antikörpern (5a) und IgG-Antikörpern (5b) gegen natives und „linearisiertes" (reduziertes und
alkyliertes) Ovomucoid für
jede Gruppe der gegen Eier allergischen Patienten verglichen.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Bei
der Bildung von IgE-spezifischen Antikörpern werden B-Zellen nach
der Bindung von IgM an oberflächlich
exponierte Oligopeptide des nativen Proteins aktiviert. Daraufhin
erzeugte IgE-Antikörper können gegen
lineare Epitope gerichtet sein, die 8–20 konsekutive (aufeinanderfolgende)
Aminosäuren
darstellen, oder gegen konformationelle Epitope, die Aminosäurereste
aus unterschiedlichen Bereichen des Allergens umfassen. Es wurden
sowohl lineare (z. B. Phl p 1, Timotheus-Gras (Ball et al, 1994, J.
Biol. Chem. 269: 28232–28242))
als auch konformationelle (Bet v 1, Birkenpollen (Laffer et al.
1996, J. Immunol. 157: 4953–4962)),
B-Zell-Epitope für inhalierte
Allergene in der Luft definiert, obwohl man annimmt, dass die letzteren überwiegen.
Da Nahrungsmittelallergene vor der Resorption und der Aufnahme durch
Zellen des mit dem Darm assoziierten lymphoiden Gewebes einem extensiven
chemischen und proteolytischen Verdau unterzogen werden, wurde geschlossen,
dass die Epitope von Nahrungsmittelallergenen in erster Linie linear
sind. Jedoch wurde in einer kürzlich
durchgeführten
Studie, bei der gepoolte Seren von Patienten eingesetzt wurden,
die gegen Eier allergisch sind, 5 Bindungsstellen für IgE-Antikörper und
7 für IgG-Antikörper unter
den 186 Aminosäureresten
identifiziert, die das Ovomucoid ausmachen (Cooke und Sampson, J.
Immunol., 1997, 159: 2026–2032).
Die Untersuchung des reduzierten und alkylierten, d. h. „linearisierten" Ovomucoids legte
nahe, dass nicht alle Patienten Antikörper gegen das Ovomucoid, die
lineare Epitope erkannten, hatten, und das einige von ihnen Antikörper hatten,
die in erster Linie gegen konformationelle Epitope gerichtet waren.
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Im
folgenden Beispiel wurden überlappende lineare
Decapeptide sowie linearisiertes (reduziertes und alkyliertes) ganzes
Ovomucoid eingesetzt, um die Erkennung linearer Ovomucoid-Epitope
durch das IgE einzelner Patienten zu vergleichen. Es wurden die
Seren von 17 gegen Eier allergischen Kindern mit relativ hohen Spiegeln
an eispezifischen IgE-Antikörpern
(größer als
oder gleich 35 kUA/L) für das
Screening der Ovomucoid-Epitope ausgewählt. Als die IgE-Bindung an
die synthetisierten Decapeptide verglichen wurde, sah es so aus,
dass drei verschiedene Muster der Antikörperbindung existierten. Wie
in der 3a–3c dargestellt ist, erkannten
die IgE-Antikörper
der einen Patientengruppe die meisten der allergenen Ovomucoid-Epitope,
die zuvor identifiziert worden waren (Cooke und Sampson, 1997),
die IgE einer Gruppe erkannten allergene Epitope vorwiegend in der
ersten Ovomucoid-Domäne, und
die dritte Gruppe zeigte praktisch keine IgE-Bindung an beliebige
der synthetisierten Decapeptide. Bei den gegen Eier allergischen
Patienten, die untersucht wurden, wurden drei Muster einer Ovomucoid-spezifischen
Bindung von IgE an die synthetisierten Decapeptide gesehen. Wie
sich in den medianen kumulativen SPOTs-IgE-Gal-d-1-OD-Scores widerspiegelt,
besaß eine
Gruppe von Patienten (Gruppe 1, 3a)
IgE-Antikörper
gegen Epitope in allen drei Ovomucoid-Domänen, eine Gruppe hatte für Ovomucoid
spezifische IgE-Antikörper
primär
gegen Epitope in der ersten Ovomucoid-Domäne (Gruppe 2, 3b), und eine Gruppe hatte vernachlässigbare IgE-Antikörper gegen
beliebige synthetische Decapeptide (Gruppe 3, 3c).
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Da
die Mengen der eispezifischen IgE-Antikörper in den drei Gruppen ähnlich waren,
legte das nahe, dass die dritte Patientengruppe Ovomucoid-spezifische
IgE-Antikörper
besaß,
die in erster Linie konformationelle Epitope erkannten. Diese Annahme
wurde durch Befunde unterstützt,
bei denen die Bindung von Ovomucoid-spezifischem IgE von Patienten
an „natives" und „linearisiertes" (reduziertes und
alkyliertes) Ovomucoid verglichen wurde (5a). Während die Bindung von Ovomucoid-spezifischen
IgE-Antikörpern
an natives Ovomucoid in allen 3 Patientengruppen ähnlich war,
banden nur ungefähr
22% des Ovomucoid-spezifischen IgE der dritten Gruppe linearisiertes
Ovomucoid im Vergleich zur nativen Form, während mehr als 50% des Ovomucoid-spezifischen
IgE der ersten Gruppe die linearisierte Form des Ovomucoids banden.
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Diese
Untersuchungen haben zur Entwicklung eines Verfahrens und eines
Test-Kits zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Individuum
eine Allergie, insbesondere eine Nahrungsmittelallergie, überwindet,
geführt.
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Test zur Bestimmung der
Wahrscheinlichkeit des Überwindung
einer Allergie
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Verfahren
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Das
Verfahren basiert auf der Entdeckung, dass Kinder mit größerer Wahrscheinlichkeit
gegenüber
Allergien gegen konformationelle Epitope als gegen lineare Epitope
tolerant werden. Deshalb wird der Test typischerweise unter Verwendung
von Blut- oder Serumproben durchgeführt, am bevorzugtesten von
Kindern, obwohl Individuen beliebigen Alters getestet werden können. Diese
Individuen werden zuerst durch ein Allergie-Screening mittels Standardtests
identifiziert, z. B. durch einen Prick-Haut-Test, oder über die
Injektion eines Antigens oder mehrerer Antigene in unterschiedlichen
Titern, um zu bestimmen, ob das Individuum allergisch auf das Antigen ist,
und um das Ausmaß zu
bestimmen, in dem das Individuum allergisch ist. Die Antikörper werden
typischerweise durch die Entnahme einer Blutprobe des Patienten erhalten,
wonach die roten Blutkörperchen entfernt
werden und das verbleibende Serum oder Plasma getestet wird. Die
Proben können
direkt bezüglich
einer Reaktivität
des IgE mit definierten Epitopen, die vom Antigen präsentiert
werden, getestet werden (Cooke und Sampson, 1997), oder die IgE-Antikörper werden
mittels Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind,
von den anderen Antikörpern
abgetrennt und auf ihre Reaktivität getestet. Gegebenenfalls
kann die Probe auch auf IgG-Antikörper, die mit den Epitopen
reagieren, gescreent werden.
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Zwar
entwickelten alle der 17 gegen Eier allergischen Patienten der Studie,
die im Beispiel beschrieben wird, ihre Überempfindlichkeit gegen Eier in
den ersten beiden Lebensjahren, aber die ersten Patientengruppe
war älter
und zeigte nach dem Verzehr von Eiern stärker ausgeprägte allergische
Reaktionen als die dritte Patientengruppe. Die extensive Bindung
Ovomucoid-spezifischer IgE-Antikörper
der ersten Patientengruppe an zahlreiche lineare allergene Epitope
ist derjenigen ähnlich,
die man bei Patienten, die gegen Erdnüsse allergisch sind, an Ara
h 1 und Ara h 2, Hauptallergene der Erdnuss, sieht (Stanley et al.,
1997, Arch. Biochem. & Biophys.
342, 244–253).
Patienten mit einer Allergie gegen Erdnüsse neigen dazu, eine „protrahierte" (lebenslange) Reaktivität auf Erdnüsse zu zeigen
(Bock und Atkins, 1989), was die Möglichkeit nahe legt, dass eine „protrahierte" Nahrungsmittelüberempfindlichkeit
mit der Entwicklung signifikanter Mengen von IgE-Antikörpern gegen
lineare Epitope assoziiert ist. Bemerkenswerterweise hat ein 32
Jahre altes, gegen Eier allergisches Individuum, das nicht zu der
ursprünglichen
Gruppe von 17 gehörte,
die getestet wurde, und der wiederholt anaphylaktische Reaktionen
auf Eier zeigte, Ovomucoid-spezifische IgE-Antikörper mit einer extensiven Bindung
an lineare Decapeptide, wie man sie in der ersten Patientengruppe
dieser Studie sieht.
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Dieses
Beispiel unterstützt
die Assoziation zwischen der Bindung von IgE an die Epitopstruktur, d.
h. linear versus konformationell, und der Entwicklung einer „protrahierten" Nahrungsmittelüberempfindlichkeit.
Von Kindern wurde gezeigt, dass sie in ihrem Kreislauf nach den
Mahlzeiten erhöhte
Spiegel an Nahrungsproteinen zeigen, wobei angenommen wird, dass
es sich um einen sekundären
Effekt als Folge einer verzögerten
Reifung von Verdauungsprozessen, z. B. der Azidität des Magens,
der Aktivität proteolytischer
Enzyme, der Zusammensetzung des Mucins etc. sowie einer erhöhten Antigenaufnahme handelt
(Hyman et al., 1985, J. Pediatr. 106: 467–471, Lebenthal, E. und P.
C. Lee, 1980, Pediatrics 66: 556–560, Shub et al. 1983, Biochem.
J. 215: 405–411,
Bresson et al. 1984, Pediatr. Res. 18: 984–987). Der „durchlässige" Darm der Kinder würde es möglich machen, dass signifikante
Mengen an konformationell intakten Nahrungsproteinen zu lokalen
B-Zellen gelangen können,
die nach ihrer Aktivierung in genetisch prädisponierten Wirten Ovomucoid-spezifische
IgE-Antikörper
erzeugen. Mit der Reifung des Gastrointestinaltraktes würde weniger
konformationell intaktes Protein für die Aktivierung von Darm-assoziiertem
lymphoidem Gewebe und von IgE-tragenden Gewebemastzellen zur Verfügung stehen,
was zu einem Verlust der klinischen Reaktivität und schließlich zu
einem Verlust der Synthese allergenspezifischer IgE-Antikörper führen würde. Der vollständige Ausschluss
von Eiprotein aus der Nahrung würde
den Verlust der klinischen Reaktivität weiter fördern, während die fortgesetzte Exposition
gegen geringste Mengen an Eiprotein zur Entwicklung von IgE-Antikörpern gegen
lineare Ovomucoid-Epitope und zu einer protrahierten Reaktivität führen könnte. Im
reifen Darm penetrieren nur kleinste Mengen immunologisch intakter
Proteine (wahrscheinlich lineare Epitope) die gastrointestinale
Barriere (Host, 1994, Brunner, M. und Walzer, M., 1928, Arch. Intern. Med.
42: 173–179,
Wilson S. J. und Walzer M., 1935, Am. J. Dis. Child 50: 49–54: Hubsy
et al., 1985, Scand. J. Immunol. 22: 83–92). Konformationell intakte
Proteine werden wahrscheinlich ausgeschlossen. Das stimmt mit der
Beobachtung überein,
dass die Wahrscheinlichkeit, die klinische Reaktivität zu verlieren,
mit dem Alter des Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose, dem Ausmaß der Vermeidung
des verantwortlichen Allergens und dem jeweiligen Allergen (Allergien
gegen Erdnüsse,
Baumnüsse
und Meerestiere werden kaum jemals überwunden) assoziiert ist.
Jüngere
Kinder erzeugen konformationelles IgE. Je jünger der Patient zu dem Zeitpunkt
ist, an dem die Nahrungsmittelempfindlichkeit diagnostiziert wird,
und/oder je strikter das Allergen vermieden wird, desto größer ist
die Wahrscheinlichkeit, dass der Patient/die Patientin seine/ihre
Nahrungsmittelallergie überwinden
wird (Bock, 1982, Sampson und Scanlon, 1989, Pastorello et al.,
1989, J. Allergy. Clin. Immunol. 84: 475–483).
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Allergene
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Es
kann jedes beliebige Antigen für
ein Screening, wie es hier beschrieben wird, verwendet werden. Die
typischsten Antigene sind Nahrungsantigene, wie Eier, Baumnüsse, Erdnüsse und
Milch. Zu weiteren verbreiteten Allergenen gehören Pollen, Schimmelpilze und
Hausstaubmilben sowie Insekten, Haustiere (Hunde, Katzen, Vögel) und
Pflanzen. Allergene sind Antigene, die zu einer IgE-Reaktion führen.
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Zur
Testung auf eine Reaktivität
gegenüber konformationellen
Epitopen können
die Allergene als intaktes Protein, als rekombinantes Protein oder
in Form proteolytischer Fragmente eingesetzt werden. Die Eigenschaften
des Allergens können über die Auswahl
des Expressionswirtes modifiziert werden; z. B. glycosylieren bakterielle
Expressionssysteme typischerweise keine Proteine, Hefesysteme und
Baculovirus/Insekten-Systeme liefern eine modifizierte Glycosylierung,
und sogar innerhalb eukaryotischer Expressionssysteme können Modifikationen
bezüglich
der Glycosylierung und Phosphorylierung vorliegen, so dass die Reaktivität des Epitops
verändert und
weiter charakterisiert werden kann.
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Lineare
Epitope können
kurze proteolytische Fragmente oder Peptide sein, die über die
Expression rekombinanter DNA oder synthetisch durch den Einsatz
von Standardtechniken hergestellt werden. Die Peptide haben typischerweise
eine Länge
von vier bis vierzig Aminosäuren,
bevorzugter von sechs bis zwanzig, und am bevorzugtesten von acht.
Sie werden auf der Basis der bekannten Aminosäuresequenz, die im allgemeinen über öffentliche
Quellen, wie GenBank, verfügbar
ist, konstruiert. Die Peptide werden bei der bevorzugten Ausführungsform
beginnend mit den Aminosäuren
1 bis 9, 2 bis 10 usw. bis zum Ende des Proteins synthetisiert.
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Das
Allergen oder der Teil davon, der bezüglich der Bindung getestet
werden soll, wird vorzugsweise immobilisiert, z. B. in einer 96-Well-Platte
oder auf einem Stück
Chromatographiepapier, und dann wie im Beispiel beschrieben bezüglich der
Bindung getestet. Das Allergen kann für die Testung in Lösung oder
für die
Testung in einem ELISA oder mittels einer fluorimetrischen Technik
an ein Teilchen oder an eine andere Vorrichtung gebunden werden.
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Kits
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Das
Verfahren wird vorzugsweise unter Einsatz von Kits durchgeführt, die
die Reagenzien zur Identifizierung der IgE-Antikörper in der Probe eines Patienten,
die mit genügenden
linearen und konformationellen Epitopen reaktiv sind, enthalten,
so dass die Prognose des Patienten charakterisiert werden kann.
Ein typischer Kit enthält
eine Multiwell-Vorrichtung, die darin immobilisiert entweder lineare
oder konformationelle Epitope eines Allergens oder mehrerer Allergene
enthält.
Der Kit enthält
auch Reagenzien für
den Nachweis oder die Trennung von IgE von IgG, wie fluoreszenzmarkierte
Immunglobuline, die spezifisch für
IgE sind, und Puffer für
das Entfernen ungebundener Materialien durch Waschen. Der Kit kann
dazu verwendet werden, die relativen Mengen von IgE bezüglich linearem
und konformationellem Antikörper
zu bestimmen, indem die Reaktivität gegenüber einem oder mehreren linearen
Epitopen) und gegenüber
einem oder mehren konventionellen Epitopen) bei unterschiedlichen
Titern bestimmt wird und dann ihre relativen Verhältnisse
bestimmt werden.
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Das
Ergebnis des Tests ist typischerweise ein Verhältnis der Anteile des IgE,
die mit linearen versus konformationellen Epitopen reagieren, ohne dass
auf eine Negativ- oder Positivkontrolle Bezug genommen wird, obwohl
es erstrebenswert sein kann, positive und negative IgE-Proben mitzuführen, die
entweder mit linearen oder mit konformationellen Epitopen reagieren,
um die Integrität
der Testkitreagenzien und der Testbedingungen sicher zu stellen.
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Verfahren zur Behandlung
von Allergien, insbesondere von Nahrungsmittelallergien
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Diejenigen
Individuen, die in erster Linie über IgE
verfügen,
das mit konformationellen Epitopen reagiert, werden ihre Allergie
mit größerer Wahrscheinlichkeit überwinden
als diejenigen, die im Prinzip durch eine Reaktivität mit linearen
Epitopen gekennzeichnet sind. Das wird weiter in den Beispielen
demonstriert. Bei Kindern, die für
eine Atopie prädisponiert
sind, kann die Entwicklung von IgE-Antikörpern gegen konformationelle
versus lineare Epitope zum Teil eine verzögerte Reifung und/oder molekulare Unterschiede
der Antigen-Prozessierung durch den Gastrointestinaltrakt, eine
Unreife des Darmes und eine Allergen-Exposition anzeigen. Studien
zur Prävention
von Allergien bei Kindern, die einem „hohen Risiko" einer Atopieentwicklung
ausgesetzt sind, haben gezeigt, dass das vollständige Vermeiden von Kuhmilch
(eines Hauptnahrungsmittelallergens) wenigstens während des
ersten Lebensjahres zu weniger Milchallergien führt als bei Kindern, die keiner
Diätbeschränkung unterworfen
wurden (Zeiger et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 84: 72–89; Halken
et al. 1992, Allergy 47: 545–553).
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Auf
der Basis der oben genannten Information ist es möglich, generalisierte
Screeningverfahren und Formulierungen für ein Screening zu entwickeln, um
die Entscheidung zu erleichtern, ob ein Patient immuntherapeutischen
Modalitäten
zur Hervorrufung einer Toleranz bei allergischen Patienten unterzogen werden
sollte oder nicht. Zu den immuntherapeutischen Modalitäten, die
basierend auf den Ergebnissen des Screenings verordnet werden könnten, gehören eine
vollständige
Vermeidung des Allergens, z. B. des Nahrungsmittels, das die Epitope
enthält,
die mit dem IgE des Patienten reagieren, oder eine Desensibilisierungstherapie.
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Verfahren
zur Beurteilung der Prognose bei entzündlichen Erkrankungen
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IgG-Antikörper gegen
Nahrungsmittelproteine können
praktisch bei allen Individuen nachgewiesen werden, die gegen Nahrungsmittelantigene
exponiert sind (Johansson et al., Ann. Allergy 53: 665–672, Savilhati
et al., 1987, Acta Paediatr. Scand. 76: 1–6), auch wenn die Spiegel
der nahrungsmittelspezifischen IgG-Antikörper tendenziell mit dem Alter abnehmen
(Kletter et al., 1971, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 40: 656–666). Patienten
mit Nahrungsmittelallergien oder entzündlichen Darmkrankheiten (z.
B. Zöliakie,
entzündlicher
Darmerkrankung etc.) neigen dazu, deutlich erhöhte Spiegel an nahrungsmittelspezifischen
IgG aufzuweisen (May et al., 1977, Clin. Allergy 7: 583–595). Das
gleiche würde
man im Falle von IgA-Antikörpern
erwarten, die sich vorwiegend in der Auskleidung des Gastrointestinaltraktes finden.
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Das
Beispiel zeigt, dass Patienten mit protrahierter Allergie gegen
Eier große
Mengen von IgE-Antikörpern
besitzen, die an lineare Ovomucoid-Epitope binden, während jüngere Patienten
in erster Linie IgE-Antikörper
besitzen, die an konformationelle Epitope binden. Außerdem entwickeln
Patienten mit einer Allergie gegen Eier signifikante Mengen von
Ovomucoid-spezifischen IgG-Antikörpern
gegen lineare und konformationelle Epitope, während Individuen, die nicht
gegen Eier allergisch sind, Ovomucoid-spezifische IgG entwickeln,
die fast ausschließlich gegen
konformationelle Epitope gerichtet sind.
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Wie
oben erwähnt
wurde, werden erhöhte Spiegel
an nahrungsmittelspezifischen IgG-Antikörpern auch bei Erkrankungen
gesehen, die durch eine Entzündung
des Gastrointestinaltraktes gekennzeichnet sind, z. B. dem Morbus
Crohn, der ulzerativen Colitis, der Zöliakie etc. (Sampson, H. A.,
1995, 11(6), 548–553).
Man nimmt an, dass die Erhöhung der
nahrungsmittel spezifischen Antikörper
die sekundäre
Folge einer erhöhten
Permeabilität
des Darmes bei diesen Erkrankungen ist, und dass sie nicht pathogen
ist. Bei unkomplizierten entzündlichen Darmerkrankungen
ist es wahrscheinlich, dass diese nahrungsmittelspezifischen IgG-Antikörper gegen konformationelle
Epitope gerichtet sind. Bei der progressiven, refraktären Darmerkrankung
wird jedoch angenommen, dass nahrungsmittelspezifische IgG-Antikörper gegen
lineare Epitope gerichtet sind, was eine anormale Immunreaktion
und eine ungünstige
Prognose anzeigt.
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Wie
im Beispiel gezeigt wird, wurden, wenn die Bindung Ovomucoid-spezifischer
IgG-Antikörper an
lineare Decapeptide untersucht wurde, signifikante Unterschiede
zwischen Patienten mit Eiallergie und Kontrollen gesehen. Die erste
Patientengruppe, die die größte Menge
an Ovomucoid-spezifischen IgE gegen lineare Decapeptide aufwies,
zeigte eine signifikant geringere Bindung Ovomucoid-spezifischer
IgG-Antikörper
an die Ovomucoid-Decapeptide als
die zweite und die dritte Patientengruppe (4a–4c). Wie sich in den medianen
kumulativen SPOTs-IgG-Gal-d-1-OD-Scores widerspiegelt, zeigten gegen
Eier allergische Patienten (4a–4c) eine extensive IgG-Bindung
an Epitope in allen drei Ovomucoid-Domänen und signifikant mehr Ovomucoid-spezifische
IgG-Antikörper
gegen die SPOTs-Decapeptide als die nicht gegen Eier allergischen
Kontrollen/Patienten mit atopischer Dermatitis ohne Eiallergie (4d) und die nicht-allergischen normalen
Kontrollen (4e). Die
zweite (4b) und die
dritte (4c) Gruppe von
Patienten mit Eiallergie hatten eine signifikant höhere Bindung
von IgG-Antikörpern
an die synthetisierten Peptide als die erste Gruppe (4a). Es gab jedoch keinen
signifikanten Unterschied bezüglich
des Prozentsatzes der Ovomucoid-spezifischen IgG-Bindung an das „linearisierte" Ovomucoid im Vergleich
zu der an die native Form (5b).
Kontrollgruppen, die aus Patienten mit atopischer Dermatitis, die
nicht allergisch gegen Eier waren, und aus nicht-allergischen normalen Kontrollen
bestanden, hatten signifikante Mengen von IgG-Antikörpern gegen
natives Ovomucoid, aber praktisch keine Ovomucoid-spezifischen IgG-Antikörper gegen
die linearen Decapeptide (4d–4e). Diese Ergebnisse legen
einen qualitativen Unterschied auf dem Niveau der Antigen-Prozessierung zwischen
Individuen, die gegen Nahrungsmittel allergisch sind, und solchen,
die nicht allergisch sind, bezüglich
ihrer Immunreaktion auf oral aufgenommene Allergene nahe.
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Es
ist deshalb möglich,
auf diejenigen Individuen zu screenen, die entzündliche Erkrankungen haben,
die wahrscheinlich durch eine progressive refraktäre Darmerkrankung
charakterisiert sind und nicht durch unkomplizierte entzündliche
Darmerkrankungen. Die Verfahren und Reagenzien ähneln denjenigen die für die Bestimmung
der Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum eine Allergie überwinden wird,
auf der Basis der relativen Anteile des IgE, die mit linearen versus
konformationellen Epitopen immunreaktiv sind, wobei jedoch die Immunreaktivität von IgG
mit linearen versus konformationellen Epitopen untersucht wird.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die Bezugnahme auf das folgende,
nichteinschränkende Beispiel
noch besser verständlich
werden.
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Beispiel: Screening von
Proben von Patienten zur Charakterisierung der Immunreaktivität von gegen Eier
gerichtetem IgE und IgG
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METHODEN UND
MATERIALIEN
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Abkürzungen
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- PBS = Phosphat-gepufferte Saline
- SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
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Patientenpopulation
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Bei
17 Kindern (Medianwert des Alters: 4 Jahre, Bereich: 1–15 Jahre,
10 männlich,
7 weiblich), die wegen einer Untersuchung auf atopische Dermatitis
die Klinik aufgesucht hatten, wurde eine Überempfindlichkeit gegen Eier über eine
als Doppelblindversuch durchgeführte,
Placebo-kontrollierte Provokation mit Eiern diagnostiziert, wie
es bei Sampson, H. A. und C. C. McCaskill, 1985, J. Pediatr. 107: 669–675, und
bei Sampson, H. A., 1992, Acta Derm. Veneorol. (Stockholm) Suppl.
176: 34–37,
beschrieben wurde. Es wurde Blut durch Venenpunktion abgenommen,
und die Seren wurden abgetrennt und eingefroren bei –20°C gelagert,
bis sie in der Studie eingesetzt wurden. Die Konzentrationen des
für Eier spezifischen
Serum-IgE wurden mittels des CAP-RAST-FEIATM-Systems
(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Schweden) bestimmt.
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Präparation von reduziertem und
alkyliertem Ovomucoid
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Ovomucoid
wurde reduziert und alkyliert, indem ganzes Ovomucoid in PBS in
einer Konzentration von 50 mg/ml gelöst wurde, wie es bei Cooke
und Sampson, J. Immunol., 1997, beschrieben wurde.
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SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
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Die
Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, wie es kürzlich veröffentlicht
wurde (Bernhisel-Broadbent et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 84:
701–709).
Die Konzentrationen der Proteinproben wurden so optimiert, dass
beim Färben
mit Amidoschwarz und der Analyse mittels Laser-Densitometrie äquivalente
Signale erhalten wurden. Die aufgetrennten Proteine wurden anschließend auf
Nitrocellulose transferiert und dann mit Amidoschwarz gefärbt, um
den Transfer der gesamten Proteine zu prüfen, oder es wurde für die Testung
mit Patientenseren mit PBS-Tween und 0,5% Schweinegelatine geblockt.
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Testung von
Immunoblots mit Patientenseren
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Die
Patientenseren wurden 1 : 10 mit PBS-Tween plus Gelatine verdünnt, 2 Stunden
unter sanftem Bewegen bei Raumtemperatur mit den Immunoblots inkubiert
und wie kürzlich
beschrieben (Cooke und Sampson 1997) bezüglich IgE- und IgG-Antikörpern entwickelt.
Die Immunoblots wurden mit BCIP/NBT entwickelt (Sigma FAST, Sigma
Chemical, St. Louis, Missouri) und mit einem Laserdensitometer (Ultrascan
SL, Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) gescannt, um die
Menge der gebundenen Ovomucoid-spezifischen Antikörper zu
bestimmen.
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Screening
auf IpE- und IgG-Epitope
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In
dieser Studie wurde die SPOTsTM-Membran
(Genosys Biosystems, The Woodlands, Texas), eine derivatisierte
Cellulose-Membran, zur Erzeugung von Decapeptiden in einer 8 × 12-Matrix
aus kleinen runden Spots verwendet. Mittels dieses Verfahrens wurden
89 Decapeptide, die die gesamte Sequenz von Gal d 1 repräsentierten,
erzeugt. Die Peptide überlappten
um 8 Aminosäuren,
z. B. Peptid Nr. 1 = Gal-d-1-Aminosäuren 1–10, Peptid Nr. 2 = Gal-d-1-Aminosäuren 3–12, Peptid
Nr. 3 = Gal-d-1-Aminosäuren
5–15 etc.
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Vor
dem Screenen der überlappenden Gal-d-1-Peptide
mit Patientenseren wurde die SPOTs-Membran mit PBS (pH 7,2), die
0,01% Tween 20, 0,5% Schweinegelatine und 1 menschliches Serum (von
einem Spender mit keinem nachweisbarem IgE gegen Eiproteine) enthielt,
geblockt. Die einzelnen Patientenseren wurden 1 : 12 mit PBS mit
0,01% Tween 20 und 0,5% Schweinegelatine (PBS-Tween + Gel) verdünnt, auf
einer Schüttelplattform
2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und wie kürzlich beschrieben (Cooke und
Sampson, 1997) bezüglich IgE-Antikörpern entwickelt.
Für den
Nachweis von IgG-Antikörpern
der Patienten wurden die Patientenseren 1 : 10 in PBS-Tween + Gel
verdünnt.
Die Inkubationszeiten und die Waschungen waren die gleichen wie
für den
IgE-Antikörper.
Der für
den Nachweis eingesetzte Antikörper
war ein Kaninchen-anti-Mensch-IgG-HRP-Konjugat (Dako Corp., Santa Barbara,
Kalifornien). Die Membran wurde mit dem ECL-Chemilumineszenz-HRP-Detektionskit (Amersham,
Arlington Heights, Illinois) entwickelt.
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Nach
dem Entwickeln des Röntgenfilms
wurde die optische Dichte (OD) eines jeden einzelnen Peptid-Spots
mittels eines Reflexionsdensitometers (The Answer II MacBeth, Newburgh,
New York) gemessen. Die OD eines jeden Peptid-Spots wurde als die
Differenz zwischen der gemessenen OD des Peptid-Spots und der Hintergrund-OD
des Filmes bestimmt. Jedem der 89 Decapeptide wurde ein „kumulativer
SPOTs-IgE- und IgG-Gal-d-1-OD-Score" zugeordnet, der die Summe der ODs für alle der
89 Gal-d-1-SPOT-Peptide der 17 untersuchten Patienten darstellte.
Jeder Patient erhielt einen „kumulativen
Patienten IgE- und IgG-Gal-d-1-OD-Score", der die Summe der
ODs für
alle 89 Gal-d-1-SPOT-Peptide des Patienten darstellte.
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Die
SPOTs-Membran konnte 8- bis 10-mal regeneriert und erneut getestet
werden. Nach dem gründlichen
Waschen der Membran mit entionisiertem destilliertem Wasser wurde
sie dreimal mit 8 M Harnstoff gewaschen, der 35 mM SDS und 0,1% BME
enthielt, und zwar jedes Mal 10 Minuten für ein Stripping des IgE oder
30 Minuten für
ein Stripping des IgG. Die Membran wurde dann dreimal (10-Minuten-Waschungen)
mit 50% Ethanol und 10% Essigsäure
gewaschen, zweimal (10-Minuten-Waschungen) mit Methanol und dann
wieder für
eine erneute Testung geblockt. Die Inkubation der Membran mit lediglich
dem sekundären
Antikörper
(Anti-Mensch-IgE oder -IgG) nach der Strippingprozedur in Abwesenheit
eines Patientenserums ließ keine
unspezifische Bindung erkennen, was anzeigte, dass die Strippingprozedur
die SPOTs-Membran erfolgreich regeneriert hatte.
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Statistische
Analyse
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Alle
Datenanalysen wurden mittels nicht-parametrischer Tests durchgeführt, und
zwar mittels des Vorzeichentests für zwei verbundene Stichproben
und des Mann-Whitney-Tests.
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ERGEBNISSE
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Es
wurden die Seren von 17 Kindern mit einer Eiallergie, die durch
einen als Doppelblindversuch durchgeführten, Placebo-kontrollierten
Nahrungsmittelprovokationstest bestätigt wurde, in dieser Studie
eingesetzt. Alle hatten deutlich erhöhte eispezifische IgE im Serum;
Medianwert – 83
kUA/L; Bereich – 35
bis über
100 kUA/L. Die einzelnen Patientenseren wurden dazu verwendet, die SPOTs-Membran
auf Peptid-spezifische IgE- und IgG-Antikörper zu testen. Die 1 zeigt die kumulativen
SPOTs-IgE-Gal-d-1-OD-Scores für
alle 89 synthetischen Peptide. Die Peptide Nr. 1, Nr. 5, Nr. 6,
Nr. 24, Nr. 25 und Nr. 57 wurden von den IgE-Antikörpern von mehr als 50% der
Patienten gebunden, was anzeigte, dass diese Peptide „allergene
Hauptepitope" repräsentieren.
Diese allergenen Hauptepitope repräsentieren die Gal-d-1-Aminosäuren 1–10 (Peptid 1,
AEVDCSRFPN), 9–20
(Peptide 5 und 6, PNATDKEGKDVL). 47–58 (Peptide 24 und 25, SIEFGTNISKEH)
und 113–122
(Peptid 57, VEQGASVDKR). Zu weiteren synthetischen Peptiden mit
signifikanten IgE-Gal-d-1-SPOTs-OD-Scores gehörten die Peptide 2 (Aminosäuren 3–12, VDCSRFPNAT),
4 (Aminosäuren
7–16,
RFPNATDKEG), 21 (Aminosäuren
41–50, CLLCAYSIEF),
38 und 39 (Aminosäuren
75–86,
NTTSEDGKVMVL), 53 (Aminosäuren
105–114,
ECLLCAHKVE) und 89 (Aminosäuren
177–86,
TLTLSHFGKC). Die meisten dieser Peptide wurden von IgE-Antikörpern von
6 oder mehr Patienten gebunden. Die 2 stellt
die kumulativen IgG-Gal-d-1-SPOTs-OD-Scores für alle 89 synthetischen Decapeptide
dar. Die Bindung von IgG-Antikörpern
an die synthetischen Gal-d-1-Peptide war größer als die IgE-Bindung.
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Wenn
für jeden
Patienten die Bindung von IgE-Antikörpern an die Decapeptide der SPOTs-Membranen
verglichen wurde, wurden drei verschiedene Muster der Peptidbindung gesehen: Gruppe
1 – Die
IgE-Antikörper
banden Epitope in zwei oder mehr Gal-d-1-Domänen; Gruppe 2 – Die IgE-Antikörper waren
spezifisch für
Peptide primär
in der ersten Gal-d-1-Domäne, und
Gruppe 3 – vernachlässigbare
IgE-Bindung an ein beliebiges der Decapeptide auf der SPOTs-Membran.
Auch wenn zwischen den drei Patientengruppen keine signifikanten
Unterschiede (p > 0,4)
bezüglich
der Konzentrationen an eispezifischem IgE im Serum bestanden (Gruppe
1 (n = 5) – 80
kUA/L, Gruppe 2 (n = 5) – 92 kUA/L
und Gruppe 3 (n = 7) – 73
kUA/L), so unterschieden sich doch die medianen kumulativen SPOTs-IgE-Gal-d-1-OD-Scores
für die
drei Patientengruppen signifikant. Die Patienten der Gruppe 1 hatten
eine signifikant höhere
IgE-Bindung (mediane kumulative
OD = 27,9) an die synthetisierten Gal-d-1-Decapeptide sowohl als
Gruppe 2 (mediane kumulative OD = 7,0; p < 0,05) als auch als Gruppe 3 (mediane
kumulative OD = 2,7; p < 0,01),
und Gruppe 2 zeigte eine signifikant höhere IgE-Bindung an die Gal-d-1-Peptide als die Gruppe
3 (p < 0,05). Die mediane
IgE-Bindung an die einzelnen Decapeptide ist für jede Patientengruppe in der 3 dargestellt. Interessanterweise
tendierten die Patienten in den Gruppen 1 und 2 dazu, älter zu
sein und eine länger bestehende
Eiallergie zu haben als die Patienten in der Gruppe 3; das mediane
Alter lag bei 10 bzw. 6 Jahren, wobei bei allen Patienten die Diagnose
in den ersten beiden Lebensjahren gestellt worden war.
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Die 4a–4e stellt
die mediane IgG-Bindung an die einzelnen Decapeptide für jede der
drei Patientengruppen und zwei Kontrollgruppen dar. Es wurden signifikante
Unterschiede der medianen kumulativen IgG-Gal-d-1-OD-Scores der
Patienten zwischen den drei Patientengruppen und den Kontrollen gesehen:
Gruppe 1 – 52,4
Gruppe 2 – 706,
Gruppe 3 – 69,8,
Kontrollen mit atopischer Dermatitis ohne Nahrungsmittelallergie
(n = 5) – 9,6,
nicht-allergische Kontrollen (n = 5) – 11,6. Die Patienten der Gruppe
1 zeigten eine signifikant geringere Bindung von IgG-Antikörpern an
die Gal-d-1-Decapeptide als die Gruppen 2 und 3 (p < 0,01), während es
keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen 2 und 3 gab
(p = 0,4). Die drei Patientengruppen mit der Eiallergie zeigten
eine signifikant höhere
IgG-Bindung an die Ovomucoid-Decapeptide
als die beiden Kontrollgruppen ohne Eiallergie (p < 0,01). Die Patientenkontrolle
mit der atopischen Dermatitis ohne Eiallergie und die nicht-atopischen
Kontrollen zeigten eine ähnliche
(p = 0,4), minimale Bindung von IgG-Antikörpern an die 89 SPOTs-Decapeptide.
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Das
Fehlen einer IgE-Bindung an die synthetisierten Peptide bei den
Patienten mit Eiallergie der Gruppe 3 legte nahe, dass der größere Teil
ihrer Ovomucoid-spezifischen IgE-Antikörper konformationelle
Epitope erkannte. Um das zu untersuchen wurde die Bindung von IgE-Antikörpern an
natives sowie an reduziertes und alkyliertes (linearisiertes) Ovomucoid
in den drei Patientengruppen verglichen. Die 5a–b stellen die Verhältnisse der Bindung der IgE-Antikörper (OD)
an reduziertes und alkyliertes Ovomucoid im Vergleich zur Bindung
der IgE-Antikörper
an natives Ovomucoid dar. Das Verhältnis der Ovomucoid-spezifischen
IgE- und IgG-Antikörper gegen
natives und „linearisiertes" (reduziertes und
alkyliertes) Ovomucoid wurde für
jede der Patientengruppen mit Eiallergie verglichen. Zwar waren
die Konzentrationen der IgE-Antikörper gegen natives Ovomucoid
für alle
Gruppen vergleichbar, aber die Patienten der Gruppe 1, die älter waren
und eine länger
andauernde Eiallergie hatten, hatten signifikant mehr IgE-Antikörper gegen
linearisiertes Ovomucoid als die Patienten der Gruppe 3, die jünger waren (5a)(5a – Mediane:
52% versus 22% für
die Gruppen 1 bzw. 3, p < 0,05).
Es wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Verhältnisses von
IgG-Antikörpern
gegen linearisiertes und gegen natives Ovomucoid unter den Patientengruppen
mit Eiallergie gesehen (5b).