ES2229673T3 - Ensayo para pronosticar alergia o inflamacion. - Google Patents
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Abstract
Un método para predecir el pronóstico de un trastorno alérgico o inflamatorio, que comprende, preparar una biblioteca de epítopos lineales y conformacionales, evaluar en una muestra de anticuerpos del individuo la inmuno-reactividad con epítopos lineales frente a conformacionales, y correlacionar la presencia de anticuerpos IgE, IgA o IgG reactivos con epítopos lineales frente a conformacionales con el pronóstico a largo plazo del trastorno.
Description
Ensayo para pronosticar alergia o
inflamación.
Las reacciones de hipersensibilidad a alimentos
afectan a hasta un 6% de los niños durante sus primeros años de
vida (Bock, S.A. 1987. Pediatrics
79:683-688), siendo las respuestas alérgicas más
documentadas las referentes a la leche, al huevo y al cacahuete
(James JM y Sampson HA. 1992. Pediatr Allergy & Immunol
3:67-78). La mayor parte de los niños alérgicos a la
leche desarrollan hipersensibilidad a la leche de vaca durante el
primer año de vida y, después, aproximadamente el 80% de estos niños
"superan" su reactividad (es decir, se hacen clínicamente
tolerantes) a los tres años de edad (Host, A. 1994. Pediatr
Allergy Immunol 5:5-36). La hipersensibilidad
al huevo de gallina y al cacahuete se reconoce más a menudo durante
el segundo año de vida. La alergia al huevo parece ser más
persistente que la alergia a la leche de vaca, mientras que la
alergia al cacahuete se "supera" en muy pocas ocasiones (Bock,
S.A. 1982. J Allergy Clin Immunol 69:173-17;
Sampson, H.A. y S.M. Scanlon. 1989. J Pediatr
115:23-27; Bock, S.A. and F.M. Atkins. 1989. J
Allergy Clin Immunol 83:900-904). Se desconoce
la base para estas diferencias en la persistencia de
hipersensibilidad clínica a diferentes alergenos alimentarios.
La alergia al huevo está presente en casi dos
terceras partes de los niños con dermatitis atópica (Sampson, H.A.
J. 1997 Roy. Soc. Med. 90(suppl
30):3-9). Cuando a los niños alérgicos al huevo se
les pone una dieta que carece de todas las proteínas del huevo,
aproximadamente una tercera parte desarrollan tolerancia clínica al
huevo en 2 años, aunque los anticuerpos IgE contra el huevo (por
ejemplo, ensayo de pinchazos en la piel positivos) persisten
durante varios años (Sampson 1989). El ovomucoide (Gal d 1)
es el alergeno dominante en el huevo de la gallina, y los niños con
alergia persistente al huevo tienen concentraciones
significativamente mayores de anticuerpos IgE
anti-ovomucoide que aquellos que "superan" su
reactividad (Bernhisel-Broadbent, J., et
al. 1994. J Allergy Clin Immunol 93:1047-1059).
El ovomucoide es una glucoproteína compuesta por 186 aminoácidos
dispuestos en tres dominios en tándem que contienen nueve enlaces
disulfuro intra-dominio y cinco cadenas laterales
de carbohidrato (Kato, et al. 1987. Biochemistry
296:193-201).
El alergeno principal del cacahuete, Ara h 2, se
reconoce por la IgE del suero en >90% de los pacientes con
hipersensibilidad al cacahuete (Stanley et al, 1997, Archives
of Biochemistry and Biophysics, vol.
342(2):244-253). Los principales epítopos
lineales de unión a inmunoglobulina E (IgE) de este alergeno se
localizaron en el mapa genético usando péptidos solapantes. Se
reconocieron tres epítopos en todos los pacientes ensayados y se
demostró que eran los epítopos inmuno-dominantes de
la proteína Ara h 2 (Stanley et al, 1997, supra).
Un objeto de esta invención es proporcionar un
ensayo que incluya métodos y reactivos para predecir la probabilidad
que tienen los niños de superar una alergia, especialmente una
alergia alimentaria.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método y reactivos para evaluar la presencia de
anticuerpos contra epítopos lineales frente a conformacionales en
las muestras de los pacientes.
Otro objeto más de la presente invención es
proporcionar un método y reactivos para evaluar pacientes con
enfermedad inflamatoria intestinal para determinar la probabilidad
de que tengan un desarrollo más progresivo y refractario.
Se proporcionan métodos y reactivos para uso en
la predicción de la probabilidad de que un niño supere una alergia,
especialmente una alergia alimentaria, mediante la evaluación de la
inmunorreactividad de anticuerpos IgE con epítopos lineales en
comparación con epítopos conformacionales. El niño primero se evalúa
usando técnicas convencionales para determinar los antígenos a los
que el niño es alérgico. Después se caracterizan las
inmunoglobulinas de la muestra del paciente usando el antígeno
purificado natural, un antígeno recombinante, un antígeno reducido
y alquilado, fragmentos proteolíticos del antígeno o péptidos
sintéticos con una longitud comprendida entre 4 y 40 aminoácidos,
preferiblemente de seis a diez aminoácidos, que pueden inmovilizarse
para una evaluación rápida y precisa. Los anticuerpos del paciente,
típicamente presentes en una muestra de suero o plasma, se hacen
reaccionar con la proteína o los péptidos para determinar los
péptidos que se unen por los anticuerpos. Estos anticuerpos después
se caracterizan para determinar si los epítopos a los que se unen
son lineales o conformacionales. Los pacientes que tengan
anticuerpos principalmente reactivos con epítopos conformacionales
(es decir, reactivos con la proteína nativa o con fragmentos
proteolíticos, en comparación con la proteína reducida y alquilada
o péptidos lineales sintéticos) típicamente superarán sus alergias.
Los que son reactivos principalmente con epítopos lineales es
posible que no superen su reactividad y pueden necesitar tratamiento
para inducir tolerancia.
El método de evaluación se demuestra en un
ejemplo utilizando suero recogido de pacientes alérgicos al huevo y
decapéptidos sintéticos solapantes derivados de la secuencia del
ovomucoide. Se descubrió que el ovomucoide posee cinco epítopos
alergénicos de unión a IgE. La evaluación de los epítopos
alergénicos con sueros de pacientes individuales reveló tres
modelos de unión a los epítopos: unión considerable de IgE a
decapéptidos de los tres dominios del ovomucoide, unión de IgE
predominantemente a péptidos del primer dominio, y prácticamente
ausencia de unión de IgE a ningún péptido sintético, lo que indica
que la mayoría de los anticuerpos IgE del último grupo reconocían
epítopos conformacionales. En todos los pacientes se observó una
unión considerable de anticuerpos IgE a péptidos sintéticos
lineales, mientras que todos los controles no alérgicos al huevo
reconocieron sólo epítopos conformacionales. Los pacientes del grupo
con una unión considerable de IgE a decapéptidos lineales solían
tener mayor edad y solían tener síntomas alérgicos más severos y
generalizados después de la ingestión de huevo que el grupo de
pacientes con pocos anticuerpos IgE contra péptidos sintéticos.
Estos hallazgos indican que el procesamiento de antígenos
diferencial y el reconocimiento estructural
anticuerpo-epítopo participan en el curso clínico
de la sensibilidad a alergenos.
Puede usarse un método similar para evaluar los
anticuerpos IgG o IgA para predecir el pronóstico de ciertos
trastornos inflamatorios, especialmente aquellos en los que está
implicado el tracto gastrointestinal, tales como la enfermedad de
Crohn, la colitis ulcerosa y la enfermedad celíaca.
Figura 1. Puntuaciones acumulativas de DO de IgE
Gal d 1 en SPOTs para cada uno de los 89 decapéptidos
sintéticos solapantes generados en la membrana SPOTs. Las
puntuaciones reflejan la unión total de los 17 pacientes alérgicos
al huevo estudiados.
Figura 2. Puntuaciones acumulativas de DO de IgG
Gal d 1 en SPOTs para cada uno de los 89 decapéptidos
sintéticos solapantes generados en la membrana SPOTs. Las
puntuaciones reflejan la unión total de los 17 pacientes alérgicos
al huevo estudiados.
Figuras 3a-c. Modelos de unión
de IgE específica de ovomucoide a decapéptidos sintetizados,
mostrados como puntuaciones medias acumulativas de DO de IgE Gal
d 1 en SPOTs: Grupo 1; Figura 3a, poseía anticuerpos IgE contra
epítopos en los tres dominios del ovomucoide, Grupo 2; Figura 3b,
tenía anticuerpos IgE específicos de ovomucoide principalmente
contra epítopos del primer dominio del ovomucoide, y Grupo 3, Figura
3c, tenía una cantidad insignificante de anticuerpos IgE contra
cualquier decapéptido sintético.
Figuras 4a-e. Puntuaciones
medias acumulativas de DO de IgG Gal d 1 en SPOTs, pacientes
alérgicos al huevo (Figuras 4a-4c) y controles no
alérgicos al huevo: pacientes con dermatitis atópica sin alergia al
huevo (Figura 4d) y controles normales no alérgicos (Figura 4e).
Figuras 5a-b. Se comparó la
relación entre anticuerpos IgE (Figura 5a) e IgG (Figura 5b)
específicos de ovomucoide y ovomucoide nativo y "linealizado"
(reducido y alquilado) para cada grupo de pacientes alérgicos al
huevo.
En la generación de anticuerpos específicos de
IgE, las células B se activan después de la unión de la IgM de la
superficie a oligopéptidos expuestos en la proteína nativa.
Posteriormente, los anticuerpos IgE producidos pueden dirigirse a
epítopos lineales que representan 8-20
aminoácidos consecutivos (secuenciales) o a epítopos
conformacionales que comprenden restos aminoacídicos de
diferentes regiones del alergeno. Se han definido tanto los
epítopos lineales (por ejemplo, Phl p 1; heno de fleo (Ball,
et al. 1994. J Biol Chem
269:28232-28242) y conformacionales (Bet v 1;
polen de abedul (Laffer, et al. 1996. J Immunol
157:4953-4962)) de células B contra aeroalergenos
inhalados, aunque se supone que predominan los últimos. Como los
alergenos alimentarios se someten a una digestión química y
proteolítica considerable antes de la absorción y la captación por
las células del tejido linfoide asociado con el intestino, se ha
deducido que los epítopos alergénicos alimentarios tienen una
naturaleza predominantemente lineal. Sin embargo, en un estudio
previo que utiliza sueros recogidos de pacientes alérgicos al huevo,
se identificaron 5 sitios de unión a anticuerpos IgE y 7 sitios de
unión a anticuerpos IgG a lo largo de los 186 restos aminoacídicos
que constituyen el ovomucoide (Cooke y Sampson J. Immunol.
1997 159, 2026-2032). La evaluación del ovomucoide
reducido y alquilado, es decir "linealizado" sugirió que no
todos los pacientes tenían anticuerpos
anti-ovomucoide que reconocían epítopos lineales, y
que algunos tenían anticuerpos predominantemente contra epítopos
conformacionales.
En el siguiente ejemplo, se utilizaron
decapéptidos lineales solapantes y ovomucoide entero linealizado
(reducido y alquilado) para comparar el reconocimiento de
anticuerpos IgE de pacientes individuales de epítopos lineales del
ovomucoide. Se seleccionaron sueros de 17 niños alérgicos al huevo
con niveles relativamente altos de anticuerpos IgE específicos de
huevo (mayores o iguales a 35 kUA/L) para evaluar los epítopos del
ovomucoide. Cuando se comparó la unión de IgE a los decapéptidos
sintetizados, parecía que había tres modelos diferentes de unión de
anticuerpos. Como se representa en la Figura 3a - 3c, los
anticuerpos IgE de un grupo de pacientes reconocieron la mayor
parte de los epítopos alergénicos del ovomucoide previamente
identificados (Cooke y Sampson 1997), la IgE de un grupo reconoció
epítopos alergénicos principalmente en el primer dominio del
ovomucoide, y el tercer grupo prácticamente no presentó ninguna
unión de IgE a ninguno de los decapéptidos sintetizados. En los
pacientes alérgicos al huevo estudiados, se observaron tres modelos
de unión de IgE específica de ovomucoide a los decapéptidos
sintetizados. Como se refleja en las puntuaciones medias
acumulativas de OD de IgE Gal d en SPOTs, un grupo de
pacientes (Grupo 1; Figura 3a) poseía anticuerpos IgE contra
epítopos de los tres dominios del ovomucoide, otro grupo tenía
anticuerpos IgE específicos del ovomucoide principalmente contra
epítopos del primer dominio del ovomucoide (Grupo 2; Figura 3b) y
otro grupo tenía un nivel insignificante de anticuerpos IgE contra
cualquier decapéptido sintético (Grupo 3; Figura 3c).
Como las cantidades de anticuerpos IgE
específicos de huevo fueron similares en los tres grupos, esto
sugirió que el tercer grupo de pacientes poseía anticuerpos IgE
específicos de ovomucoide que reconocían epítopos principalmente
conformacionales. Esta suposición se confirmó por hallazgos que
comparaban la unión de IgE específica de ovomucoide de pacientes a
ovomucoide "nativo" y "linealizado" (reducido y alquilado)
(Figura 5a). Aunque la unión de anticuerpo IgE específico de
ovomucoide al ovomucoide nativo fue similar en tres grupos de
pacientes, sólo aproximadamente un 22% de la IgE específica de
ovomucoide del tercer grupo se unía al ovomucoide linealizado en
comparación con la forma nativa, mientras que más del 50% de la IgE
específica de ovomucoide del primer grupo se unía a la forma
linealizada del ovomucoide.
Estos estudios han llevado al desarrollo de un
método y un kit de ensayo para determinar la probabilidad de que
cualquier individuo particular "supere" una alergia,
especialmente una alergia alimentaria.
El método se basa en el descubrimiento de que
los niños tienen mayor probabilidad de hacerse tolerantes o de
"superar" alergias contra epítopos conformacionales en
comparación con epítopos lineales. Por lo tanto, el ensayo
típicamente se realizará usando muestras de sangre o suero, más
preferiblemente de niños, aunque pueden someterse al ensayo
individuos de cualquier edad. Estos individuos primero se
identifican por medio de la evaluación de las alergias usando
ensayos convencionales, por ejemplo, mediante el ensayo de pinchazos
en la piel o la inyección de uno o más antígenos a titulaciones
diferentes para determinar si el individuo es alérgico al antígeno
y la medida en la que el individuo es alérgico. Los anticuerpos
típicamente se obtienen extrayendo una muestra de la sangre del
paciente, después retirando los glóbulos rojos y ensayando el suero
o plasma restante. En las muestras después puede evaluarse la
reactividad de la IgE con epítopos definidos presentados por el
antígeno (Cooke y Sampson 1997) o los anticuerpos IgE pueden
separarse de los otros anticuerpos usando métodos conocidos por los
especialistas en la técnica y evaluarse su reactividad.
Opcionalmente, en la muestra también pueden evaluarse los
anticuerpos IgG reactivos con los epítopos.
Aunque los 17 pacientes alérgicos al huevo del
estudio descritos en el ejemplo desarrollaron su hipersensibilidad
al huevo los dos primeros años de vida, el primer grupo de pacientes
tenía más edad y tenía reacciones alérgicas más pronunciadas
después de la ingestión de huevo que el tercer grupo de pacientes.
La unión considerable del anticuerpo IgE específico de ovomucoide
del primer grupo de pacientes a numerosos epítopos alergénicos
lineales es similar a la unión observada en pacientes alérgicos al
cacahuete a los alergenos principales del cacahuete Ara h 1
y Ara h 2, (Stanley, et al. 1997 Arch. Biochem.
& Biophysic. 342, 244-253). Los pacientes
con alergia al cacahuete suelen tener una reactividad
"prolongada" (a lo largo de la vida) al cacahuete (Bock y
Atkins 1989), lo que sugiere la posibilidad de que la
hipersensibilidad alimentaria "prolongada" esté asociada con
el desarrollo de cantidades significativas de anticuerpos IgE contra
epítopos lineales. Debe tenerse en cuenta que un individuo alérgico
al huevo de 32 años, que no forma parte de los 17 pacientes
originales que se ensayaron, que había experimentado reacciones
anafilácticas repetidas al huevo, tenía anticuerpos IgE específicos
de ovomucoide con una unión considerable a los decapéptidos
lineales, como se observa en el primer grupo de pacientes de este
estudio.
El ejemplo confirma la asociación entre la unión
de IgE a la estructura del epítopo, es decir, lineal frente a
conformacional, y el desarrollo de hipersensibilidad alimentaria
"prolongada". Se ha demostrado que los niños tienen mayores
niveles de proteínas alimentarias en la circulación después de las
comidas, lo cual se supone que es secundario a un retraso en la
maduración en el desarrollo del procesos digestivos, por ejemplo,
acidez de estómago, actividad de enzimas proteolíticas, composición
de mucina etc., y una mayor captación de antígenos (Hyman, et
al. 1985. J. Pediatr 106:467-471;
Lebenthal, E. y P. C. Lee. 1980. Pediatrics
66:556-560; Shub, et al. 1983. Biochem
J 215:405-411; Bresson, et al. 1984.
Pediatr Res 18:984-987). El intestino "con
fugas" del niño permitiría el acceso de cantidades significativas
de proteínas alimentarias conformacionalmente intactas a células B
locales que tras la activación generan anticuerpos IgE específicos
de ovomucoide en hospedadores genéticamente predispuestos. Con la
maduración del tracto gastrointestinal, tendrían acceso menos
proteínas conformacionalmente intactas para activar el tejido
linfoide asociado con el sistema digestivo y mastocitos de tejidos
que llevan IgE, dando como resultado una pérdida de reactividad
clínica y la pérdida final de síntesis de anticuerpos IgE
específicos de alergeno. La exclusión total de la dieta de la
proteína del huevo promovería adicionalmente la pérdida de
reactividad clínica, mientras que una exposición continuada a
pequeñas cantidades de proteína del huevo podría dar como resultado
el desarrollo de anticuerpos IgE contra epítopos lineales del
ovomucoide y una reactividad prolongada. En el intestino maduro,
pequeñas cantidades de proteínas inmunológicamente intactas
(probablemente epítopos lineales) atraviesan la barrera
gastrointestinal (Host 1994; Brunner, M y Walzer M. 1928. Arch
Intern Med 42: 173-179; Wilson SJ y Walzer M.
1935. Am J Dis Child 50:49-54; Husby, et
al. 1985. Scand J Immunol 22:83-92).
Probablemente quedan excluidas las proteínas
conformacionalmente intactas. Esto es coherente con la observación
de que la probabilidad de perder reactividad clínica está asociada
con la edad del paciente en el momento del diagnóstico, el grado de
evitación del alergeno responsable, y el alergeno en cuestión (las
alergias al cacahuete, la nuez y al marisco rara vez "se
superan"). Los niños más pequeños producen IgE conformacional.
Cuando menor sea la edad del paciente en el momento en el que se
diagnostica la sensibilidad alimentaria y/o cuanto más rigurosa sea
la evitación del alergeno, más probabilidad tendrá el paciente de
"superar" su alergia alimentaria (Bock 1982; Sampson and
Scanlon 1989; Pastorello, et al 1989. J Allergy Clin
Immunol 84:475-483).
Para la evaluación descrita en este documento
puede usarse cualquier antígeno. Los antígenos más típicos serán
alergenos alimentarios, tales como huevo, nueces, cacahuetes y
leche. Otros alergenos comunes incluyen polen, moho y ácaros del
polvo, así como insectos, animales domésticos (perro, gato, pájaro)
y plantas. Los alergenos son antígenos que proporcionan una
respuesta de IgE.
Para ensayar la reactividad con epítopos
conformacionales, los alergenos pueden utilizarse como la proteína
intacta, una proteína recombinante o fragmentos proteolíticos. Las
propiedades del alergeno pueden modificarse por selección del
hospedador de expresión - por ejemplo, los sistemas de expresión
bacterianos típicamente no glicosilan proteínas, los sistemas de
levadura y baculovirus/insecto producen una glicosilación
modificada, e incluso dentro de los sistemas de expresión
eucariotas, puede haber modificaciones en la glicosilación y
fosforilación, para alterar la reactividad y caracterizar
adicionalmente el epítopo.
Los epítopos lineales pueden ser fragmentos
proteolíticos cortos o péptidos obtenidos por la expresión de ADN
recombinante o sintéticamente usando la tecnología convencional. Los
péptidos típicamente tendrán una longitud de cuatro a cuarenta
aminoácidos, más preferiblemente de seis a veinte, y aún más
preferiblemente ocho. Se diseñan basándose en la secuencia de
aminoácidos conocida, normalmente disponible en una fuente pública
tal como el GenBank. En la realización preferida, los péptidos se
sintetizan empezando en uno a nueve restos aminoacídicos, dos a
diez y así sucesivamente hasta el final de la proteína.
El alergeno o la porción del mismo a ensayar con
respecto a la unión preferiblemente se inmoviliza, por ejemplo, en
una placa de 96 pocillos o en una pieza de papel cromatográfico, y
después se ensaya con respecto a la unión como se describe en el
ejemplo. El alergeno puede unirse a una partícula o a otro medio
conocido para el ensayo en fase de solución, o puede ensayarse en
un ELISA o usando una técnica fluorométrica.
El método preferiblemente se realiza usando kits
que contienen los reactivos para identificar los anticuerpos IgE en
una muestra de un paciente reactiva con suficientes epítopos
lineales y conformacionales para caracterizar el pronóstico del
paciente. Un kit típico incluirá un dispositivo de múltiples
pocillos que tiene inmovilizados epítopos lineales o
conformacionales contra uno o más alergenos. El kit también incluirá
reactivos para la detección o separación de IgE de IgG, tales como
inmunoglobulina marcada fluorescente que sea específica para IgE, y
tampones para retirar por medio de lavado el material no unido. El
kit puede usarse para determinar las cantidades relativas de IgE
contra anticuerpos lineales frente a conformacionales evaluando la
reactividad a diferentes titulaciones a uno o más epítopos lineales
y a uno o más epítopos conformacionales, y después determinando sus
proporciones relativas.
El resultado del ensayo típicamente es una
relación de la proporción de IgE reactiva con epítopos lineales
frente a conformacionales, sin hacer referencia a un control
negativo o positivo, aunque puede ser deseable incluir muestras de
IgE positivas y negativas reactivas con epítopos lineales o
conformacionales para asegurar la integridad de los reactivos del
kit de ensayo y las condiciones de ensayo.
Los individuos que tienen IgE principalmente
reactiva con epítopos conformacionales tiene mayor probabilidad de
superar la alergia que los caracterizados principalmente por la
reactividad con epítopos lineales. Esto se demuestra adicionalmente
por los ejemplos. En niños con predisposición a padecer atopia, el
desarrollo de anticuerpos IgE contra epítopos conformacionales
frente a lineales puede reflejar en parte un retraso en la
maduración y/o diferencias moleculares en el procesamiento de los
antígenos por el tracto gastrointestinal, inmadurez del intestino,
y exposición a alergenos. Ciertos estudios sobre la prevención de la
alergia en niños con "alto riesgo" de desarrollar atopia han
demostrado que la evitación completa de la leche de vaca (un
alergeno alimentario importante) durante al menos el primer año de
vida tiene como resultado menos alergia a la leche en comparación
con los niños no sometidos a la restricción dietética (Zeiger, et
al. 1989, J. Allergy Clin Immunol
84:72-89; Halken, et al. 1992, Allergy
47:545-553).
Basándose en la información anterior, se pueden
desarrollar métodos de evaluación generalizados y formulaciones
para la evaluación, para ayudar en la decisión de si un paciente
debe someterse o no a una modalidad inmunoterapéutica para inducir
tolerancia en pacientes alérgicos. Las modalidades
inmunoterapéuticas que pueden prescribirse basándose en los
resultados de la evaluación incluyen una evitación completa del
alergeno, por ejemplo, el alimento que contiene los epítopos
reactivos con la IgE del paciente, o una terapia de
desensibilización.
Pueden detectarse anticuerpos IgG contra
proteínas alimentarias en prácticamente todos los individuos
expuestos a antígenos alimentarios (Johansson, et al. Ann
Allergy 53: 665-672; Savilhati et al.
1987. Acta Paediatr Scand 76:1-6) aunque los
niveles de anticuerpos IgG específicos de alimentos tienden a
disminuir con la edad (Kletter, et al. 1971. Int Arch
Allergy Appl Immunol 40:656-666). Los pacientes
con alergias alimentarias o trastornos inflamatorios del intestino
(por ejemplo, enfermedad celíaca, enfermedad inflamatoria del
intestino, etc.) tienden a tener niveles notablemente elevados de
IgG específica de alimentos (May, et al. 1977, Clin
Allergy 7:583-595). Esto mismo se esperaría en
el caso de anticuerpos IgA, que se encuentran predominantemente en
el revestimiento del tracto gastrointestinal.
El ejemplo demuestra que los pacientes con
alergia al huevo prolongada poseen grandes cantidades de anticuerpos
IgE que se unen a epítopos lineales del ovomucoide, mientras que
los pacientes de menor edad poseen principalmente anticuerpos IgE
que se unen a epítopos conformacionales. Además, los pacientes
alérgicos al huevo desarrollan cantidades significativas de
anticuerpos IgG específicos de ovomucoide contra epítopos lineales y
conformacionales, mientras que los individuos no alérgicos al huevo
desarrollan IgG específica de ovomucoide casi exclusivamente contra
epítopos conformacionales.
Como se ha indicado anteriormente, también se
observan niveles elevados de anticuerpos IgG específicos de
alimentos en trastornos marcados por una inflamación del tracto
gastrointestinal, por ejemplo enfermedad de Crohn, colitis
ulcerosa, enfermedad celíaca, etc. (Sampson, H.A.: 1995
11(6), 548-553). Se cree que la elevación de
los anticuerpos específicos de alimentos es secundaria al aumento de
la permeabilidad del intestino en estos trastornos y que no es
patogénica. En trastornos inflamatorios del intestino sin
complicaciones, es probable que estos anticuerpos IgG específicos
de alimentos se dirijan a epítopos conformacionales. Sin embargo,
en la enfermedad intestinal progresiva y refractaria, se cree que
los anticuerpos IgG específicos de alimentos se dirigen a epítopos
lineales, indicando una respuesta inmune anormal y un pronóstico
desfavorable.
Como se muestra por el ejemplo, cuando se evaluó
la unión de anticuerpos IgG específicos de ovomucoide a decapéptidos
lineales, se observaron diferencias significativas entre los grupos
de pacientes alérgicos al huevo y los controles. El primer grupo de
pacientes, que tenía la mayor cantidad de IgE específica de
ovomucoide contra los decapéptidos lineales, mostraba una unión de
anticuerpos IgG específicos de ovomucoide a los decapéptidos del
ovomucoide significativamente menor que el segundo y el tercer
grupos de pacientes (Figuras 4a - 4c). Como se refleja en las
puntuaciones medias acumulativas de DO de IgG Gal d 1 en
SPOTs, los pacientes alérgicos al huevo (Figuras
4a - 4c) tenían una unión considerable de IgG a epítopos de los tres dominios del ovomucoide y significativamente más anticuerpos IgG específicos de ovomucoide contra los decapéptidos de SPOTs que los controles no alérgicos al huevo: pacientes con dermatitis atópica sin alergia al huevo (Figura 4d) y controles normales no alérgicos (Figura 4e). El segundo (Figura 4b) y tercer (Figura 4c) grupos de pacientes alérgicos al huevo tuvieron significativamente más unión de anticuerpos IgG a los péptidos sintetizados que el primer grupo (Figura 4a). Sin embargo, no hubo ninguna diferencia significativa en el porcentaje de unión de IgG específica de ovomucoide al ovomucoide "linealizado" en comparación con la forma nativa (Figura 5b). Los grupos de control que constaban de pacientes con dermatitis atópica que no eran alérgicos al huevo y los controles normales no alérgicos tuvieron anticuerpos IgG significativos contra el ovomucoide nativo, pero prácticamente no tuvieron anticuerpos IgG específicos de ovomucoide contra los decapéptidos lineales (Figuras 4d - 4e). Estos resultados sugieren una diferencia cualitativa a nivel del procesamiento de antígenos entre individuos alérgicos y no alérgicos a los alimentos en su respuesta inmune contra alergenos ingeridos.
4a - 4c) tenían una unión considerable de IgG a epítopos de los tres dominios del ovomucoide y significativamente más anticuerpos IgG específicos de ovomucoide contra los decapéptidos de SPOTs que los controles no alérgicos al huevo: pacientes con dermatitis atópica sin alergia al huevo (Figura 4d) y controles normales no alérgicos (Figura 4e). El segundo (Figura 4b) y tercer (Figura 4c) grupos de pacientes alérgicos al huevo tuvieron significativamente más unión de anticuerpos IgG a los péptidos sintetizados que el primer grupo (Figura 4a). Sin embargo, no hubo ninguna diferencia significativa en el porcentaje de unión de IgG específica de ovomucoide al ovomucoide "linealizado" en comparación con la forma nativa (Figura 5b). Los grupos de control que constaban de pacientes con dermatitis atópica que no eran alérgicos al huevo y los controles normales no alérgicos tuvieron anticuerpos IgG significativos contra el ovomucoide nativo, pero prácticamente no tuvieron anticuerpos IgG específicos de ovomucoide contra los decapéptidos lineales (Figuras 4d - 4e). Estos resultados sugieren una diferencia cualitativa a nivel del procesamiento de antígenos entre individuos alérgicos y no alérgicos a los alimentos en su respuesta inmune contra alergenos ingeridos.
Por lo tanto, es posible seleccionar los
individuos que tienen trastornos inflamatorios con probabilidad de
caracterizarse por enfermedad inflamatoria progresiva y refractaria,
en comparación con trastornos inflamatorios del intestino sin
complicaciones. Los métodos y reactivos son similares a los
utilizados para determinar la probabilidad de que un individuo
supere una alergia basándose en las proporciones relativas de IgE
inmunorreactiva con epítopos lineales frente a epítopos
conformacionales, pero examinando la inmunorreactividad de IgG
contra epítopos lineales frente a epítopos conformacionales.
La presente invención se entenderá
adicionalmente haciendo referencia al siguiente ejemplo no
limitante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
Abreviaturas:
PBS - solución salina tamponada con fosfato
SDS-PAGE = electroforesis en gel
de poliacrilamida y dodecilsulfato sódico
A diecisiete niños (edad media: 4 años,
intervalo: 1 - 15 años; 10 niños, 7 niñas) que se presentaron para
la evaluación de dermatitis atópica se les diagnosticó
hipersensibilidad al huevo mediante una exposición al huevo
controlada con placebo doble ciego, como se describe por Sampson,
H.A. y C.C. McCaskill, 1985. J Pediatr
107:669-675; y Sampson, H.A. 1992. Acta Derm
Veneorol (Stockh) Suppl. 176:34-37. Se
obtuvo sangre por punción venosa y el suero se separó y se almacenó
congelado a -20ºC hasta que se usó en el estudio. Se determinaron
las concentraciones de IgE específicas de huevo en suero utilizando
el sistema CAP-RAST FEIA^{TM} (Pharmacia
Diagnostics; Uppsala, Suecia).
El ovomucoide se redujo y se alquiló disolviendo
ovomucoide entero en PBS a una concentración de 50 mg/ml, como
describen Cooke y Sampson. J. Immunol. 1997.
Las proteínas se separaron por
SDS-PAGE como se ha publicado previamente
(Bernhisel-Broadbent, et al. 1989, J
Allergy Clin Immunol 84:701-709). Las
concentraciones de muestra de proteína se optimizaron para
proporcionar una señal equivalente cuando se tiñeron por negro
amido y se analizaron por densitometría láser. Las proteínas
resueltas posteriormente se transfirieron a nitrocelulosa y después
se tiñeron con negro amido para buscar la transferencia de proteína
total, o se bloquearon con PBS-Tween con gelatina
porcina al 0,5% para el sondeo con sueros de pacientes.
Los sueros de los pacientes se diluyeron a 1:10
en PBS-Tween más gelatina, se incubaron con
inmunotransferencias durante 2 horas con agitación suave a
temperatura ambiente y se revelaron para determinar los anticuerpos
IgE e IgG como se ha descrito previamente (Cooke y Sampson 1997).
Las inmunotransferencias se revelaron con BCIP/NBT (SigmaFAST:
Sigma Chemical, St. Louis, MO) y se exploraron con un densitómetro
láser (Ultrascan SL; Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) para
determinar la cantidad de anticuerpo específico de ovomucoide
unido.
En este estudio se usó la membrana SPOTs^{TM}
(Genosys Biosystems; The Woodlands, TX), una membrana de celulosa
modificada, para generar decapéptidos en una matriz de 8 x 12 de
pequeñas manchas circulares. Usando este método, se generaron 89
decapéptidos que representaban la secuencia entera de Gal d
1; los péptidos solapaban en 8 aminoácidos, por ejemplo, péptido nº
1 = aminoácidos 1-10 de Gal d 1, péptido nº 2
= aminoácidos 3 -12 de Gal d 1, péptido nº 3 = aminoácidos
5-14 de Gal d 1, etc.
Antes de la evaluación de los péptidos Gal
d 1 solapantes con los sueros de los pacientes, la membrana
SPOTs se bloqueó con PBS (pH 7,2) que contenía Tween 20 al 0,01%,
gelatina porcina al 0,5% y suero humano al 1% (de un donante sin
IgE detectable contra proteínas del huevo). Los sueros de los
pacientes individuales se diluyeron 1:12 en PBS con Tween 20 al
0,01% y gelatina porcina al 0,5% (PBS-Tween+gel), se
incubaron en una plataforma oscilante a temperatura ambiente
durante 2 horas y se revelaron para determinar los anticuerpos IgE
como se ha descrito previamente (Cooke y Sampson 1997). Para
detectar los anticuerpos IgG de los pacientes, los sueros de los
pacientes se diluyeron 1:10 en
PBS-Tween-gel. Los tiempos de
incubación y los lavados fueron los mismos que para el anticuerpo
IgE. El anticuerpo de detección usado fue conjugado de
IgG-HRP de conejo anti-humano (Dako
Corp, Santa Barbara, CA). La membrana se reveló con el kit de
detección de HRP quimioluminiscente ECL (Amersham, Arlington
Heights, IL).
Después del revelado de la película de rayos X,
se midió la densidad óptica (DO) de cada péptido individual usando
un densitómetro de reflexión (The Answer II MacBeth, Newburgh, NY).
La DO de cada mancha de péptido se registró como la diferencia
entre la DO de la mancha de péptido real y la DO de fondo de la
película. A cada uno de los 89 decapéptidos se le asignó una
puntuación acumulativa de DO de IgE e IgG Gal d 1 de SPOTs
que representaba la suma de las DO para cada uno de los 89 péptidos
SPOT Gal d 1 para los 17 pacientes estudiados. Cada paciente
recibió una puntuación "acumulativa de paciente" de DO de IgE e
IgG Gal d 1 que representaba la suma de las DO para los 89
péptidos SPOT Gal d 1 para ese paciente.
La membrana SPOTs pudo regenerarse y volverse a
sondear de 8 a 10 veces. Después de aclarar la membrana
minuciosamente en agua destilada desionizada, se lavó tres veces en
urea 8 M que contenía SDS 35 mM y BME al 0,1% durante 10 minutos
cada vez para eliminar la IgE o 30 minutos para eliminar la IgG. La
membrana después se lavó tres veces (lavados de 10 minutos) en
etanol al 50% y ácido acético al 10%, dos veces (lavados de 10
minutos) en metanol, y después se volvió a bloquear para el segundo
sondeo. La incubación de la membrana con el anticuerpo secundario
solo (IgE o IgG anti-humana) después del
procedimiento de purificación en ausencia del suero del paciente no
reveló ninguna unión no específica, lo cual indicó que el
procedimiento de depuración había regenerado satisfactoriamente la
membrana SPOTs.
Todos los análisis de los datos se realizaron
con ensayos no paramétricos, el ensayo de los signos de 2 muestras
por parejas y el ensayo de Mann Whitney.
En el estudio se utilizaron sueros de 17 niños
con alergia al huevo confirmada por exposiciones a alimentos doble
ciego controladas por placebo. Todos tenían unos niveles séricos de
IgE específica de huevo notablemente elevados; media - 83 Kua/L;
intervalo - de 35 a más de 100 kUA/L. Los sueros de los pacientes
individuales se usaron para sondear en la membrana SPOTs
anticuerpos específicos de péptidos IgE e IgG. La Figura 1
representa las puntuaciones acumulativas de D.O. de IgE Gal
d 1 en SPOTs para cada uno de los 89 péptidos sintéticos. Los
péptidos nº 1, nº 5, nº 6, nº 24, nº 25 y nº 57 se unieron por los
anticuerpos IgE en más de un 50% de los pacientes, indicando que
estos péptidos representan "epítopos alergénicos principales".
Estos epítopos alergénicos principales representan los aminoácidos
1-10 de Gal d 1 (péptido 1, AEVDCSRFPN),
9-20 (péptidos 5 y 6, PNATDKEGKDVL),
47-58 (péptidos 24 y 25, SIEFGTNISKEH), y
113-122 (péptido 57, VEQGASVDKR). Otros péptidos
sintéticos con puntuaciones de DO de IgE Gal d 1 en SPOTs
significativas incluían los péptidos 2 (aminoácidos
3-12, VDCSRFPNAT), 4 (aminoácidos
7-16, RFPNATDKEG), 21 (aminoácidos
41-50, CLLCAYSIEF), 38 y 39 (aminoácidos
75-86, NTTSEDGKVMVL), 53 (aminoácidos
105-114, ECLLCAHKVE) y 89 (aminoácidos
177-186, TLTLSHFGKC). La mayoría de estos péptidos
se unieron por anticuerpos IgE de 6 o más pacientes. La Figura 2
representa las puntuaciones acumulativas de DO de IgG Gal d
1 de SPOTs para cada uno de los 89 decapéptidos sintéticos. Hubo una
unión más considerable de anticuerpos IgG a los péptidos sintéticos
de Gal d 1 en comparación con la unión de IgE.
Cuando los anticuerpos IgE se unían a las
membranas SPOTs; se compararon los decapéptidos para cada paciente,
observándose tres modelos diferentes de unión a péptidos: Grupo 1 -
los anticuerpos IgE se unieron a epítopos en dos o más dominios de
Gal d 1, Grupo 2 - anticuerpos IgE específicos para péptidos
principalmente en el primer dominio de Gal d 1 y Grupo 3 -
unión insignificante de IgE a ninguno de los decapéptidos en la
membrana SPOTs. Aunque no hubo diferencias significativas (p>0,4)
en las concentraciones séricas de IgE específica de huevo entre los
3 grupos de pacientes (Grupo 1 (n=5) - 80 kUA/L, Grupo 2 (n=5) - 92
kUA/L y Grupo 3 (n=7) - 73 kUA/L), las puntuaciones medias
acumulativas de DO de IgE Gal d 1 de SPOTs para los tres
grupos de pacientes diferían significativamente. Los pacientes del
Grupo 1 tuvieron significativamente más unión de IgE (DO media
acumulativa = 27,9) a los decapéptidos de Gal d 1
sintetizados que el Grupo 2 (DO media acumulativa = 7,0; p<0,05)
o el Grupo 3 (DO media acumulativa = 2,7; p<0,01), y el Grupo 2
tuvo significativamente más unión de IgE a los péptidos Gal d
1 que el Grupo 3 (p<0,05). En la Figura 3 se representa la unión
media de IgE a decapéptidos individuales para cada grupo de
pacientes. De manera interesante, los pacientes de los Grupos 1 y 2
solían tener mayor edad con una alergia al huevo más antigua en
comparación con los pacientes del Grupo 3; edad media 10 y 6 años,
respectivamente, habiéndose diagnosticado la alteración en los
pacientes en los 2 primeros años de vida.
La Figura 4a - 4e representa la unión media de
IgG a decapéptidos individuales para cada uno de los 3 grupos de
pacientes y 2 series de controles. Se vieron diferencias
significativas en las puntuaciones medias acumulativas de los
pacientes de DO de IgG Gal d 1 entre los tres grupos de
pacientes y los controles: Grupo 1 - 52,4 Grupo 2 - 70,6, Grupo 3 -
69,8, controles con dermatitis atópica sin alergia alimentaria (n=5)
- 9,6, controles no alérgicos (n=5) - 11,6. Los pacientes del Grupo
1 tuvieron significativamente menos unión de anticuerpos IgG a
decapéptidos de Gal d 1 que los Grupos 2 y 3 (p<0,01),
mientras que no hubo ninguna diferencia significativa entre los
Grupos 2 y 3 (p=0,4). Los tres grupos de pacientes alérgicos al
huevo tuvieron significativamente más unión de IgG a los
decapéptidos del ovomucoide que los dos grupos de control no
alérgicos al huevo (p<0,01). Los controles de pacientes con
dermatitis atópica no alérgicos al huevo y los controles no atópicos
mostraron una unión de anticuerpos IgG mínima similar (p=0,4) a los
89 decapéptidos SPOTs.
La falta de unión de IgE a los péptidos
sintetizados por los pacientes alérgicos al huevo del Grupo 3
sugirió que la mayoría de sus anticuerpos IgE específicos de
ovomucoide reconocían epítopos conformacionales. Para examinar
esto, se compararon las uniones de anticuerpos IgE al ovomucoide
nativo y reducido y alquilado (linealizado) en los tres grupos de
pacientes. Las Figuras 5a-b representan la
relaciones entre la unión de anticuerpos IgE (DO) al ovomucoide
reducido y alquilado en comparación con la unión del anticuerpo IgE
al ovomucoide nativo. Las relaciones entre anticuerpos IgE e IgG
específicos de ovomucoide y ovomucoide nativo y "linealizado"
(reducido y alquilado) se compararon para cada grupo de pacientes
alérgicos al huevo. Aunque las concentraciones de anticuerpos IgE
contra el ovomucoide nativo fueron comparables para todos los
grupos, los pacientes del Grupo 1, que tenían mayor edad con un
alergia al huevo antigua, tenían significativamente más anticuerpos
IgE contra el ovomucoide linealizado que los pacientes del Grupo 3,
que tenían menor edad (Figura 5a). (Figura 5a - medias: 52% frente
a 22% para los Grupos 1 y 3, respectivamente, p<0,05). No se
observaron diferencias significativas en la relación entre
anticuerpos IgG y ovomucoide linealizado-nativo
entre los grupos de pacientes alérgicos al huevo (Figura 5b).
Claims (30)
1. Un método para predecir el pronóstico de un
trastorno alérgico o inflamatorio, que comprende,
preparar una biblioteca de epítopos lineales y
conformacionales,
evaluar en una muestra de anticuerpos del
individuo la inmuno-reactividad con epítopos
lineales frente a conformacionales, y
correlacionar la presencia de anticuerpos IgE,
IgA o IgG reactivos con epítopos lineales frente a conformacionales
con el pronóstico a largo plazo del trastorno.
2. El método de la reivindicación 1, donde los
epítopos de la biblioteca se seleccionan entre el grupo compuesto
por antígeno purificado natural, antígeno recombinante, antígeno
reducido y alquilado, fragmentos proteolíticos del antígeno, y
péptidos sintéticos con una longitud comprendida entre 4 y 40
aminoácidos.
3. El método de la reivindicación 2, donde los
epítopos de la biblioteca se inmovilizan para la evaluación.
4. El método de la reivindicación 1, donde el
individuo se ha evaluado para determinar los antígenos a los que el
individuo es alérgico.
5. El método de la reivindicación 1, para
determinar la probabilidad de que un individuo supere una alergia,
que comprende
evaluar en una muestra que comprende anticuerpos
IgE de un individuo con una alergia la reactividad de los
anticuerpos IgE con uno o más epítopos lineales y uno o más epítopos
conformacionales, y determinar si la IgE es principalmente reactiva
con epítopos de la biblioteca que son epítopos conformacionales
seleccionados entre el grupo compuesto por proteína nativa y
fragmentos proteolíticos de proteína nativa, caso en el que se
predice que el individuo superará la alergia a los epítopos
reactivos con la IgE, o si la IgE es principalmente reactiva con
epítopos de la biblioteca que son epítopos lineales seleccionados
entre el grupo compuesto por proteínas reducidas y alquiladas y
péptidos lineales sintéticos, caso en el que se predice que el
individuo no superará la alergia a los epítopos reactivos con la
IgE.
6. El método de la reivindicación 5, donde los
epítopos proceden de antígenos seleccionados entre el grupo
compuesto por alimentos, polen, polvo, mohos, insectos, animales y
proteínas vegetales.
7. El método de la reivindicación 6, donde los
antígenos proceden de alimentos.
8. El método de la reivindicación 7, donde los
epítopos proceden de antígenos seleccionados entre el grupo
compuesto por cacahuete, huevo, nueces, leche, pescado y
marisco.
9. El método de la reivindicación 1 para
determinar la probabilidad de que un trastorno inflamatorio sea
progresivo y refractario, que comprende
evaluar en una muestra que comprende anticuerpos
IgG o IgA de un individuo con un trastorno inflamatorio la
reactividad de los anticuerpos IgG o IgA con uno o más epítopos
lineales y uno o más epítopos conformacionales, y determinar si la
IgG o IgA es principalmente reactiva con epítopos de la biblioteca
que son epítopos conformacionales seleccionados entre el grupo
compuesto por proteína nativa y fragmentos proteolíticos de proteína
nativa, caso en el que el trastorno inflamatorio probablemente no
es progresivo y refractario, o la IgG o IgA es principalmente
reactiva con epítopos de la biblioteca que son epítopos lineales
seleccionados entre el grupo compuesto por proteína reducida y
alquila-
da y péptidos lineales sintéticos, caso en el que el trastorno inflamatorio probablemente es progresivo y refractario.
da y péptidos lineales sintéticos, caso en el que el trastorno inflamatorio probablemente es progresivo y refractario.
10. El método de la reivindicación 9, donde el
trastorno inflamatorio es del tracto gastrointestinal.
11. El método de la reivindicación 10, donde el
trastorno inflamatorio se selecciona entre el grupo compuesto por
enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, y enfermedad celíaca.
12. El método de la reivindicación 11, donde los
anticuerpos son anticuerpos IgA.
13. Un kit que comprende:
una primera composición que comprende al menos
un epítopo lineal de un antígeno, careciendo dicha composición de
cualquier epítopo conformacional del antígeno;
una segunda composición que comprende al menos
un epítopo conformacional del antígeno; y
reactivos para la detección de anticuerpos IgE,
IgA o IgG.
14. El kit de la reivindicación 13, donde la
primera composición comprende sustancialmente todos los epítopos
lineales del antígeno.
15. El kit de las reivindicaciones 13 o 14,
donde la primera composición comprende antígeno reducido y alquilado
o un fragmento reducido y alquilado del mismo.
16. El kit de la reivindicación 13, donde la
primera composición comprende uno o más péptidos con una longitud
comprendida entre aproximadamente 4 y 40 aminoácidos.
17. El kit de la reivindicación 16, donde la
primera composición comprende una colección de péptidos solapantes
que abarcan la longitud del antígeno.
18. El kit de la reivindicación 13, donde la
segunda composición comprende antígeno natural purificado.
19. El kit de la reivindicación 13, donde la
segunda composición comprende uno o más fragmentos de antígeno,
reteniendo al menos un fragmento una estructura tridimensional
suficiente para la retención de al menos un epítopo
conformacional.
20. El kit de la reivindicación 13, donde el
antígeno es un antígeno proteico.
21. El kit de la reivindicación 13, donde el
antígeno está asociado con un trastorno inflamatorio.
22. El kit de la reivindicación 13, donde el
antígeno esta asociado con la enfermedad inflamatoria del
intestino;
y los reactivos detectan IgA o IgG.
23. El kit de la reivindicación 22, donde el
trastorno inflamatorio se selecciona entre el grupo compuesto por
enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad celíaca.
24. El kit de la reivindicación 13, donde el
antígeno está asociado con la alergia.
25. El kit de la reivindicación 24, donde el
antígeno está asociado con la alergia a alimentos, polen, polvo,
moho, insectos, animales o plantas.
26. El kit de la reivindicación 24, donde el
antígeno está asociado con alergia alimentaria.
27. El kit de la reivindicación 26, donde el
antígeno está asociado con alergia al cacahuete, huevo, nueces,
leche, pescado o marisco.
28. El kit de la reivindicación 26, donde el
antígeno es una proteína de cacahuete, huevo o leche.
29. El kit de la reivindicación 13, donde el
antígeno está asociado con alergia y
los reactivos detectan IgE.
30. El kit de la reivindicación 13, donde una o
tanto la primera como la segunda composiciones comprenden epítopos
de más de un antígeno.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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