DE69220591T2

DE69220591T2 - Enzymbiosensor und Verfahren zur Herstellung desselben

Info

Publication number: DE69220591T2
Application number: DE1992620591
Authority: DE
Inventors: Shiro Nankai; Toshihiko Yoshioka
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1991-03-04
Filing date: 1992-03-04
Publication date: 1997-12-18
Anticipated expiration: 2012-03-05
Also published as: EP0502504B1; JP2671693B2; DE69220591D1; EP0502504A1; JPH05119013A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor, der eine spezifische Komponente in einer Probenflüssigkeit leicht, genau und schnell bestimmen kann, sowie ein Herstellungsverfahren für denselben; insbesondere betrifft sie einen Biosensor zur Quantifizierung einer spezifischen Komponente in einer Probenflüssigkeit durch Reduktion eines Elektronenakzeptors unter Verwendung von Elektronen, die durch die Umsetzung der spezifischen Komponente in der Probenflüssigkeit mit einem Enzym erzeugt werden, welches spezifisch mit der Komponente reagiert, und anschließende Messung der reduzierten Menge an Elektronenakzeptor, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben.
In jüngerer Zeit sind verschiedene Typen von Biosensoren, welche die spezifische Katalyse von Enzymen nutzen, entwickelt worden. Ms ein Beispiele für diese Biosensoren läßt sich ein Saccharidbiosensor beschreiben.
Als Verfahren zur quantitativen Analyse von Sacchariden sind ein optisches Rotationsverfahren, kolorimetrische Verfahren und andere, verschiedene Chromatographietypen nutzende Verfahren entwickelt worden. Aufgrund der relativ geringen Spezifität gegenüber Sacchariden kann jedoch keines dieser Verfahren hohe Genauigkeit liefern. Darüber hinaus ist das Verfahren der optischen Rotation zwar einfach in der Durchführung, wird jedoch in großem Umfang von der Betriebstemperatur beeinflußt. Dementsprechend ist es für eine allgemeine Anwendung zu Hause und dergleichen nicht geeignet.
Die in Früchten enthaltenen Saccharide werden im allgemeinen in Saccharidgraden bestimmt. Häufig wird ein Refraktometer eines Lichtbrechungssystemes zur Quantifizierung der Saccharidgrade verwendet. Dies Refraktometer funktioniert, indem es die von der Konzentration der Flüssigkeit verursachte Änderung des Brechungsindex nutzt. Dementsprechend wird das Refraktometer des Lichtbrechungssystems durch alle in der Probenflüssigkeit gelösten Komponenten beeinflußt, beispielsweise durch organische Säuren, wie Zitronensäure oder Äpfelsäure, die im Fruchtsaft, wenn der Sac charidgehalt der Frucht bestimmt wird, in großen Mengen vorhanden sind. Demzufolge ist eine exakte Quantifizierung mit Hilfe dieses Refraktometers unmöglich.
Als Beispiel für einen im Klinikbereich verwendeten Biosensor soll nun ein Glukosesensor beschrieben werden.
Ein übliches Verfahren zur Quantifizierung von im Blut enthaltener Glukose besteht darin, daß man einem Patienten entnommenes Blut zentrifugiert und anschließend das so erhaltene Blutplasma mißt. Dieses Verfahren erfordert viel Zeit und Mühe. Daher wurde ein Verfahren angestrebt, das direkt die im vom Patienten erhaltenen Blut enthaltene Glukose messen kann.
Als einfacher Glukosesensor wurde ein Sensor ähnlich einem Testpapierstreifen für die Urinanalyse entwickelt. Der Glukosesensor umfaßt einen Träger in Form eines Stiftes und einen auf dem Träger befestigten Halter. Der Halter enthält ein Enzym, das nur mit Glukose reagiert, sowie einen Farbstoff, dessen Farbe sich als Reaktion auf ein Produkt der Enzymreaktion ändert. Blut wird auf den Träger des Glukosesensors getropft und die Änderung des Farbstoffs nach einer bestimmten Zeit mit bloßem Auge abgelesen oder optisch gemessen, wodurch sich der Glukosegehalt im Blut bestimmen läßt. Das diesen Glukosesensor verwendende Quantifizierungsverfahren ist jedoch wegen der Störungen durch gefarbte Materialien im Blut nur ungenau.
Die JP-OS 1-114747 offenbart den folgenden Glukosesensor mit hoher Genauigkeit als ein Quantiflzierungsverfahren für eine spezifische Komponente in einer Probenflüssigkeit aus einem lebenden Körper wie Blut ohne Verdünnen oder Rühren der Probenflüssigkeit:
Wie in Fig.7 gezeigt, umfaßt dieser Glukosesensor eine elektrisch isolierende Grundlage 51, ein Elektrodensystem 54, einschließlich einer Arbeitselektrode 52 und einer Gegenelektrode 53, die auf der isolierenden Grundlage 51 mittels Drucken aufgebracht werden, eine auf der isolierenden Grundlage 51 ausgebildete, elektrisch isolierende Schicht 55, eine auf der elektrisch isolierenden Schicht 55 bereitgestellte Haftstruktur 56, eine von der Haftstruktur 56 gehaltene Filtrationsschicht 57, einen auf der Filtrationsschicht 57 vorgesehenen Halterungsrahmen 58, sowie Halterungsschichten für den Elektronenakzeptor 59, für das Enzym 60 und das Puffersalz 61 und eine Expansionsschicht 62, die alle vom Halterungsrahmen 58 geträgert werden. Zwischen dem Elektrodensystem 54 und der Filtrationsschicht 57 ist ein Hohlraum 63 zur Aufnahme der Probenflüssigkeit ausgebildet.
Die Filtrationsschicht 57 besteht aus einem porösen Polycarbonatfilm. Die Halterungsschicht für den Elektronenakzeptor 59, die Enzymhalterungsschicht 60 und die Puffersalzhalterungsschicht 61 verwenden jeweils poröse Cellulose als Träger.
Der Betrieb eines solchen Glukosesensors erfolgt wie folgt: Die auf die Expansionsschicht 62 getropfte Probenflüssigkeit wird über die Wirkung der Puffersalze in der Puffersalzhalterungsschicht 61 auf den pH eingestellt, der die stabilste Enzymaktivität gestattet. Anschließend reagieren die Glukoseoxidase in der Enzymhalterungsschicht 60 und die Glukose in der Probenflüssigkeit in der Enzymhalterungsschicht 60 spezifisch miteinander. Dann wird das in der Halterungsschicht für den Elektronenakzeptor 59 enthaltenen Kaliumferricyanid mit Hilfe der in der obigen Umsetzung erzeugten Elektronen zu Kaliumferrocyanid reduziert. Die Menge des zu diesem Zeitpunkt erzeugten Kaliumferrocyanids ist der Glukosekonzentration in der Probenflüssigkeit proportional. Anschließend werden Materialien mit größerem Molekulargewicht wie Proteine in der Filtrationsschicht 57 ausgefiltert und die filtrierte Flüssigkeit tropft in den Hohlraum 63 über dem Elektrodensystem 54. Damit läßt sich die Menge an Kaliumferrocyanid in der Flüssigkeit über den Oxidationsstrom der Flüssigkeit durch das Elektrodensystem 54 messen, wodurch die Glukosekonzentration bestimmt wird.
Bei üblichen Glukosesensoren mit obiger Struktur kann wegen des unbeständigen Flusses der Flüssigkeit im Hohlraum 63 Schaum im Hohlraum verbleiben, was die Meßwert der Glukosekonzatrion beeinflußt.
Da die Puffersalzhalterungsschicht 61 in Kontakt mit der Enzymhalterungsschicht 60 steht, mischen sich Enzym und Puffersalze an der Grenzfläche zwischen beiden Schichten, wenn der Glukosesensor Feuchtigkeit absorbiert, wodurch sich die Enzymaktivität über chemische Wechselwirkungen verschlechtert. Im Ergebnis läßt sich der Glukosesensor dieses Typs nur schwierig in stabilem Zustand lagern.
Da als Träger für die Filtrationsschicht 57 sowie die Halterungsschichten 59, 60 und 61 im herkömmlichen Glukosesensor unlösliche poröse Materialien verwendet werden, muß die auf den Glukosesensor aufgebrachte Probenflüssigkeit darüber hinaus durch jedes dieser porösen Materialien hindurch dringen, bevor sie das Elektrodensystem 54 erreicht. Dementsprechend weist der Glukosesensor den Nachteil auf, daß es längere Zeit dauern kann, bis eine Reaktion erhalten wird und/oder daß die Anspruchswerte wegen der schwankenden Umsetzungszeiten schwanken können. Weiterhin erfordert der Glukosesensor so viele Schritte bei der Produktion, einschließlich eines so komplizierten Schrittes wie dem Zusammenbau einer Vielzahl poröser Materialien, daß es nur schwierig ist, ihn billig zu produzieren.
Die EP-A-O 359 831 offenbart einen Biosensor mit einer isolierenden Basisplatte, auf der in dieser Reihenfolge Leitungen, ein im wesentlichen aus Kohlenstoff bestehendes Elektrodensystem, eine isolierende Schicht und eine Reaktionsschicht ausgebildet sind, die aus einem Enzym und einem Elektronenakzeptor besteht und ggf. eine hydrophile hochmolekulare Substanz wie Stärke, Carboxymethylcellulose, Gelatine, Acrylat, Vinylalkohol, Vinylpyrrolidon und Maleinsäureanhydrid enthält. Es werden keine Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um den pH der Probenlösung einzustellen. Insbesondere umfaßt dieser Sensor kein Puffersystem.

Zusammenfassung der Erfindung

Der erfindungsgemäße Biosensor zur Quantifizierung eines in einer Probenflüssigkeit enthaltenen Substrats durch Reduktion eines Elektronenakzeptors mittels Elektronen, die in der Reaktion des Substrats mit dem Enzym erzeugt werden, und anschließende elektrochemische Messung der Menge an reduziertem Elektronenakzeptor, der die oben angesprochenen sowie zahlreiche andere Nachteile bzw. Defizite des Standes der Technik überwindet, umfaßt eine elektrisch isolierende Grundlage, ein Elektrodensystem, enthaltend mindestens eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, die auf der isolierenden Grundlage ausgebildet sind, eine Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem, enthaltend das Enzym und ein hydrophiles Polymer, wobei das Enzym und das Polymer in einer Mischschicht vorliegen oder auf zwei Schichten aufgeteilt sind, und eine Schicht zum Einstellen der Wasserstoffionenkonzentration (H-Ionen-Einstellschicht), wobei die Reaktionsschicht mit dem Elektrodensystem in Kontakt steht und der Elektronenakzeptor entweder in der Reaktionsschicht oder der H-Ionen-Einstellschicht enthalten ist, und ist dadurch gekennzeichnet, daß die H-Ionen-Einstellschicht von der Reaktionsschicht getrennt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die H-Ionen-Einstellschicht räumlich von der Reaktionsschicht getrennt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die H-Ionen-Einstellschicht von der Reaktionsschicht durch eine Schicht aus einem zweiten hydrophilen Polymer getrennt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reaktionsschicht eine Schicht aus einem zweiten hydrophilen Polymer und Elektronenakzeptoren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Reaktionsschicht gebildet, indem man eine erste ein hydrophiles Polymer und Enzym enthaltende Schicht, eine zweite Schicht, enthaltend ein zweites hydrophiles Polymer, und eine die Elektronenakzeptoren enthaltende Schicht in dieser Reihenfolge laminiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die H-Ionen-Einstellschicht auf dem Elektrodensystem bereitgestellt; die Reaktionsschicht, die außerdem ein hydrophiles Polymer und die Elektronenakzeptoren enthält, wird oben auf der H-Ionen-Einstellschicht bereitgestellt und ist von dieser durch eine Schicht aus hydrophilem Polymer getrennt, die zwischen der Reaktionsschicht und der H-Ionen-Einstellschicht vorgesehen ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Elektrode im wesentlichen aus Kohlenstoff.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die H-Ionen-Einstellschicht ein Puffersalz, das aus der aus Kaliumbiphosphat-Dikaliumphosphat, Kaliumbiphosphat- Dinatriumphosphat, Zitronensäure-Dinatriumphosphat, Zitronensäure-Trinatriumcitrat, Kaliumbicitrat-Natriumhydroxid und Äpfelsäuremononatriumsalz-Natriumhydroxid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophile Polymer aus einer Gruppe ausgewählt, welche aus Polyvinylalkohol und Cellulosederivaten besteht, genauer aus Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose und Carboxymethylethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und deren Derivaten, (Meth)acrylsäure und deren Salzen, Starke oder deren Derivaten sowie Maleinsäure und deren Derivaten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Enzym aus der aus Fruktosedehydrogenase, Invertase, Mutarotase, Glukoseoxidase, Alkoholoxidase, Mactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Cholesteroloxidase, Xanthinoxidase und Aminosäureoxidase be stehenden Gruppe ausgewählt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der Elektronenakzeptor aus der aus Kaliumferricyanid, p-Benzochinon, Phenazinmethosulfat und Ferrocen bestehenden Gruppe gewählt.
Alternativ stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Biosensors zur Quantifizierung eines in einer Probenflüssigkeit enthaltenen Substrats durch Reduktion eines Elektronenakzeptors mittels Elektronen, die in der Reaktion des Substrats mit dem Enzym erzeugt werden, und anschließende elektrochemische Messung der Menge an reduziertem Elektronenakzeptor zur Verfügung, welches die folgenden Schritte umfaßt: erstens, Bereitstellen eines Elektrodensystems mit mindestens einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode auf einer elektrisch isolierenden Grundlage; zweitens, Ausbilden einer H-Ionen-Einstellschicht, die die Elektronenakzeptoren enthält, auf der isolierenden Grundlage, und schließlich, Bilden der das hydrophile Polymer und das Enzym enthaltenden Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem, wobei das Polymer und das Enzym in einer oder in getrennten Schichten enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, daß die H-Ionen-Einstellschicht getrennt von der Reaktionsschicht ausgebildet wird.
Dementsprechend gestattet die hier beschriebene Erfindung das Erreichen folgender Ziele: das Bereitstellen (1) eines Biosensors, in dem die Wasserstoffionenkonzentration einer Probenflüssigkeit bestmöglich an den in der Reaktionsschicht enthaltenen Enzymtyp angepaßt werden kann, ohne vorherige Einstellung der Wasserstoffionenkonzentration in der Probenflüssigkejt, (2) eines Biosensors, der leicht, schnell und genau ein spezifisches, in einer Probenflüssigkeit enffialtenes Substrat quantifizieren kann, (3) eines Biosensors, bei dem sich die Zuverlässigkeit der Leistung verbessern läßt, indem man das in der H-Ionen-Einstellschicht enthaltene Puffersalz von in der Reaktionsschicht enthaltenem Enzym mit Hilfe einer Schicht aus hydrophilem Polymer abtrennt, (4) eines Verfahrens zur Herstellung eines Biosensors in kurzer Zeit durch Heizen von Schichten wie der die Elektronenakzeptoren enthaltenden H-Ionen-Einstellschicht und (5) eines Verfahrens zur Herstellung eines Biosensors, bei dem die Kristalldurchmesser der in einer Schicht enthaltenen Elektronenakzeptoren optimal eingestellt werden konnen, indem man die Temperatur bei Erhitzen der Schicht einstellt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung läßt sich unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen besser verstehen und ihre zahlreichen Aufgaben und Vorzüge werden dem Fachmann dadurch offenbar, wobei:
Fig.1 einen Schnitt durch die Grundlage eines Fruktosesensors als einem Beispiel eines erfindungsgemäßen Biosensors darstellt;
Fig.2 und 3 perspektivische Explosionsdarstellungen des Fruktosesensors aus Fig. 1 sind;
Fig.4 ein Diagramm ist, das die Anspruchscharakteristiken des Fruktosesensors zeigt;
Fig.5 einen Schnitt durch die Grundlage eines Fruktosesensors als einem weiteren Beispiel eines erfindungsgemäßen Biosensors darstellt;
Fig.6 eine perspektivische Explosionsdarstellung des Fruktosesensors aus Fig.5 ist und
Fig.7 eine Darstellung eines herkömmlichen Biosensors zeigt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Ein erfindungsgemäßer Biosensor umfaßt eine elektrisch isolierende Grundlage, ein Elektrodensystem, einschließlich einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode auf der isolierenden Grundlage, eine auf dem Elektrodensystem vorgesehene, das Enzym enthaltende Reaktionsschicht und eine H-Ionen-Einstellschicht, die von der Reaktionsschicht getrennt ist.
Erfindungsgemäß wird das Enzym nicht durch das in der H-Ionen-Einstellschicht enthaltene Puffersalz beeinflußt, da die das Enzym enthaltende Reaktionsschicht separat von der H-Ionen-Einstellschicht ausgebildet wird. Dementsprechend kann das Enzym bei Lagerung des Biosensors in stabilem Zustand gehalten werden.
Im allgemeinen entspricht der pH der Probenflüssigkeit nicht notwendigerweise demjenigen des entsprechenden Enzyms in der Reaktionsschicht, der die höchste Enzymaktivität gestattet. Erfindungsgemäß kann der pH der Probenflüssigkeit dem Wert angenähert werden, der die höchste Enzymaktivität gestattet, indem man die dem Sensor zugeführte Probenflüssigkeit die H-Ionen-Einstellschicht erreichen läßt. Im Ergebnis kann der Sensor einfach betrieben werden, da der pH der Probenflüssigkeit nicht mit Hilfe einer Pufferlösung oder ähnlichem eingestellt werden muß.
Ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors umfaßt die Schritte, des Bereitstellens eines Elektrodensystems mit mindestens einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode auf einer elektrisch isolierenden Grundlage, des Ausbildens einer H-Ionen-Einstellschicht, die mindestens die Elektronenakzeptoren enthält, auf der isolierenden Grundlage, und schließlich des Bildens der das hydrophile Polymer und das Enzym enthaltenden Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem, jedoch getrennt von der H-Ionen-Einstellschicht.
Im allgemeinen wird die Enzymaktivität bei Behandlung bei Temperaturen von mehreren Zehnergraden in großem Umfang verringert. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Reaktionsschicht nicht bei einer so hohen Temperatur behandelt, daß die Enzymaktivität inhibiert würde, da die die Elektronenakzeptoren enthaltende H-Ionen- Einstellschicht vor der Bildung der das Enzym enthaltenden Reaktionsschicht geformt wird. Dementsprechend ist es möglich, die Hitzebehandlungsbedingungen für die Hlonen-Einstelischicht frei zu wählen, je nach den Zielvorgaben des Biosensors. Beispielsweise können der Kristalldurchmesser des Elektronenakzeptors oder dessen Trocknungsbedingungen so eingestellt werden, daß sie am besten geeignet sind, durch Abkürzen der Erwärmungszeiten der H-Ionen-Einstellschicht und/oder durch Einstellen der Erwärmungstemperatur der H-Ionen-Einstellschicht.
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Biosensors hängt vom jeweiligen, in der Probenflüssigkeit enthaltenen Substrat (der spezifischen Komponente) ab, d.h. von dem zu messenen Objekt. Der Sensor kann beispielsweise als Fruktose-, Saccharose-, Glukose-, Alkohol-, Milchsäure-, Cholestrin- und Aminosäuresensor verwendet werden.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Enzym hängt vom in der Probenflüssigkeit enthaltenen Substrat ab und unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Bei den einsetzbaren Enzymen handelt es sich beispielsweise um Fruktosedehydrogenase, Invertase, Mutarotase, Glukoseoxidase, Alkoholoxidase, Lactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Cholestroloxidase, Xanthinoxidase und Aminosäureoxidase.
Zur Bildung der H-Ionen-Einstellschicht kann jede Pufferlösung mit einem pH, der die höchste Aktivität des für die Herstellung des Biosensors verwendeten Enzyms ermöglicht, gewählt werden. Bei den verwendbaren Pufferlösungen handelt es sich beispielsweise um eine Phosphatpufferlösung, eine Mcllvaine-Pufferlösung, eine Zitronensäure-Trinatriumcitrat-Lösung, eine Kaliumbicitrat-Natriumhydroxid-Lösung und eine Lösung des Äpfelsäuremononatriumsalzes mit Natriumhydroxid. Darüber hinaus kann eine Pufferlösung, die bei üblichen Temperaturen eine Flüssigkeit darstellt, verwendet werden wie ein Essigsäure-Natriumacetat-Puffer. In diesem Fall kann die H-Ionen- Einstellschicht zusammen mit einem Polymer mit langer Lebensdauer gebildet werden.
Das erfindungsgemäß verwendete hydrophile Polymer unterliegt keinen Beschränkungen. Verwendbare Polymere sind zum Beispiel Polyvinylalkohol und Cellulosederivate wie genauer Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine oder deren Derivate, (Meth)acrylsäure oder deren Salze, Starke oder deren Derivate sowie Maleinsäureanhydrid oder dessen Salze.
Als Elektronenakzeptoren für die Erfindung können Kaliumferricyanid, p-Benzochinon, Phenazinmethosulfat und Ferrocen verwendet werden.
Das oben angesprochene Elektrodensystem ist nicht auf ein Zwei-Elektrodensystem mit nur einer Arbeits- und einer Gegenelektrode beschränkt. Beispielsweise kann ein Drei-Elektrodesystem mit einer weiteren Referenzelektrode eingesetzt werden, so daß genauere Meßwerte erhalten werden.

Beispiele

In den Zeichnungen, die in der folgenden Beschreibung der Beispiele erwähnt sind, werden gleiche Elemente mit gleichen Bezugszeichen angesprochen. Teile der Beschreibung des Herstellungsverfahrens wurden je nach Notwendigkeit ausgelassen.

Beispiel I

Als Beispiel für einen Biosensor soll nun ein Fruktosesensor beschrieben werden.
Ein erfindungsgemäßer Biosensor umfaßt eine Grundlage 10, einen auf der Grundlage 10 befestigten Abstandhalter 20 sowie eine auf dem Abstandhalter befestigte Abdeckung 30, wie in Fig. 1 bis 3 gezeigt. Fig. 1 zeigt einen Schnitt durch die Grundlage 10 des Fruktosesensors; Fig.2 zeigt eine Explosionsdarstellung des Fruktosesensors, bei der die Reaktionsschicht 15 sowie die H-Ionen-Einstellschicht 11 von der Grundlage 10 entfernt wurden. Fig.3 zeigt ebenfalls eine Explosionsdarstellung des Fruktosesensors.
Silberpaste wurde mittels Siebdruck auf eine elektrisch isolierende Grundlage 1 aus Polyethylenterephthalat gedruckt, um die Leitungen 2 und 3 zu bilden. Anschließend wurden ein Elektrodensystem 14 (eine Arbeitselektrode 4 und eine Gegenelektrode 5) aus leitfähiger Kohlenstoffpaste mit einem Harzbindemittel und eine Isolierschicht 6 aus einer isolierenden Paste mittels Siebdruck geformt. Die Isolierschicht 6 bedeckte die Leitungen 2 und 3 mit Ausnahme der Verbindungspunkte 12 und 13 zu einem Anschluß, so daß die vorbestimmten Flächen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 exponiert waren.
Anschließend wurden die exponierten Flächen der Arbeits- und der Gegenelektrode 4 und 5 geschliffen und 4 Stunden bei 100 ºC in Luft hitzebehandelt.
Nach der Erstellung des Elektrodensystems 14 mit der Arbeistelektrode 4 und der Gegenelektrode 5 wurde eine wäßrige Lösung aus 0,5 gew.-% Carboxymethylcellulose (im folgenden CMC) als hydrophilem Polymer auf das Elektrodensystem getropft und getrocknet, um eine CMC-Schicht zu bilden. Anschließend wurde eine wäßrige Lösung aus Fruktosedehydrogenase als Enzym (hergestellt von Toyo Boseki Kabushiki Knisha, EC 1.1.99.11) so aufgetropft, daß die CMC-Schicht bedeckt war, und getrocknet, um eine CMC-Fruktosedehydrogenase-Schicht 7 zu bilden. In dieser CMC-Fruktosedehydrogenase-Schicht 7 mischten sich die CMC-Schicht und die Fruktosedehydrogenase- Schicht nur in einer Dicke von wenigen Mikrometern an der Grenzfläche, d.h. beide Schichte waren nicht vollstandig gemischt.
Eine 0,5 gew.-% Polyvinylpyrrolidon (PVP) als hydrophiles Polymer enthaltende ethanolische Lösung wurde so aufgetropft, daß die CMC-Fruktosedehydrogenase- Schicht vollständig bedeckt war und getrocknet, um eine PVP-Schicht 8 zu bilden.
Wird ein feste Bestandteile wie den Sarcocarp enthaltender Fruchtsaft als Probenflüssigkeit eingesetzt, werden die festen Bestandteile von der PVP-Schicht 8 aufgehalten, die auf der CMC-Fruktosedehydrogenase-Schicht 7 vorgesehen ist, wodurch die Adsorption der festen Bestandteile auf der Oberfläche des Elektrodensystems 14 verhindert wird. Infolgedessen wird der Verschlechterung der Ansprechfunktion des Sensors vorgebeugt. Da die PVP-Schicht 8 außerdem die CMC-Fruktosedehydrogenase-Schicht 7 vom unten beschriebenen Kaliumferricyanid trennt, lassen sich die Konservierungs- und Stabilitätseigenschaften des Sensors erheblich verbessern.
Eine Dispersion mit Kaliumferricyanidkristallen (Teilchendurchmesser 0,5 - 4 µm), also mit Elektronenakzeptoren, die in einer 0,5 gew.-% Lecithin als Dispergiermittel enthaltenden Toluollösung enthalten sind, wurde aufgetropft und zur Bildung einer Kaliumferricyanidschicht 9 auf der PVP-Schicht 8 bei Raumtemperatur getrocknet.
Auf diese Weise wurde die die CMC-Fruktosedehydrogenase-Schicht 7, die PVP- Schicht 8 und die Kaliumferricyanidschicht 9 enthaltende Reaktionsschicht 15 hergestellt.
Anschließend wurden 3 M¹ einer Phosphatpufferlösung (eine Mischung aus 0,2 M K&sub2;HPO&sub4; und 0,2 M KH&sub2;PO&sub4;, pH = 4,5) auf einen Teil zwischen der Reaktionsschicht 15 und der Spitze der isolierenden Grundlage, die einer Einlaßöffnung 21 entspricht, aufgetropft, um die H-Ionen-Einstellschicht, wie in Fig. 1 und 3 gezeigt, zu bilden.
Das in diesem Fruktosesensor verwendete Enzym, d.h. die Fruktosedehydrogenase, zeigt ihre höchsten Aktivitäten bei einem pH von 4,5 (bei 37 ºC). Da die Fruktosestandardiösung nahezu neutral ist, wird ein pH der Lösung von 4,5 eingestellt, wenn die Standardlösung die H-Ionen-Einstellschicht erreicht, wodurch die höchste Enzymaktivität erzielt wird. Ist die Lösung alternativ dazu alkalisch oder sauer, wird der pH der Lösung auf etwa 4,5 eingestellt, wenn diese Flüssigkeit die H-Ionen-Einstellschicht 11 erreicht. Dementsprechend wird die Enzymaktivität in der Flüssigkeit, die durch die H- Ionen-Einstellschicht 11 hindurchtritt höher als in der ursprünglich eingefüllten Probenflüssigkeit.
Darüber hinaus ist das Enzym in der Reaktionsschicht 15 von der H-Ionen-Einstellschicht 11 getrennt, indem die H-Ionen-Einstellschicht 11 separat von der Reaktionsschicht 15 ausgebildet ist, wodurch die Konservierungseigenschaften des Sensors verbessert werden.
Nach Herstellung der Grundlage 10 mit der Reaktionsschicht 15 und der H-Ionen- Einstellschicht 11 wie oben beschrieben, wurden die Grundlage 10, der Abstandhalter 20 und die Abdeckung 30 zur Befestigung wie in Fig.2 und 3 mit gestrichelten Linien gezeigt laminiert. Ein Reservoir für die Probenflüssigkeit wurde in Form eines Hohlraumes ausgebildet, der durch die Grundlage 11, die Wände eines Einschnittes 22 des Abstandhalters 20 und die Abdeckung 30 definiert ist. Im Ergebnis wurde so ein Einlaß für die Probenflüssigkeit 21 an einem Ende des Reservoirs gebildet. Eine Luftöffnung 31 wurde in einem Teil der Abdeckung 30 am gegenüberliegenden Ende des Reservoirs gebildet.
Eine Probenflüssigkeit wird in das Reservoir eingefüllt und der Reaktionsschicht 15 zugeführt, indem man nur die Probenflüssigkeit mit der Probeneinlaßöffnung 21 an der Spitze des Sensors in Kontakt bringt. Da die zur Verfügung gestellte Menge der Probenflüssigkeit vom Volumen des Reservoirs abhängt, ist keine Vorabquantifizierung der Flüssigkeit erforderlich. Weiterhin läßt sich die Verdampfung der Probenflüssigkeit während der Messung minimieren, was zu Messungen mit höchster Genauigkeit führt.
Der so hergestellte Fruktosesensor wurde durch die Probeneinlaßöffnung 21 mit 3 µl Fruktosestandardlösung als Probenflüssigkeit befüllt. Zwei Minuten nach der Füllung wurde ein Spannungspuls von +0,5 V, bezogen auf die Spannung an der Gegenelektrode 5, an die Arbeitselektrode 4 angelegt. Anschließend wurde der Anodenstrom 5 Sekunden nach dem Anlegen gemessen.
Wenn die Probenflüssigkeit, die nach Passage der H-Ionen-Einstellschicht 11 den gewünschten pH erreicht hat, die Reaktionsschicht 15 erreicht, lösen sich die Kaliumferricyanid-Lecithin-Schicht 9, die PVP-Schicht 8 und die CMC-Fruktosedeydrogenase-Schicht 7 nacheinander in dieser Reihenfolge in der Probenflüssigkeit. Die in der Probenflüssigkeit enthaltene Fruktose wird von der Fruktosedehydrogenase oxidiert; durch transportierte Elektronen wird gleichzeitig das Kaliumferricyanid zu Kaliumferrocyanid reduziert. Anschließend wird ein der Konzentration des erzeugten Kaliumferrocyanids entsprechender Oxidationsstrom durch Anlegen des obigen Spannungspulses hervorgerufen. Der Stromwert entspricht der Substratkonzentration, d.h. in diesem Fall der Fruktosekonzentration.
Fig.4 zeigt die zwei Minuten nach der Füllung mit dem Fruktosesensor dieses Beispiels gemessenen Ansprecheigenschaften. Im Graphen zeigt die Kurve a die Antworten des Fruktosesensors dieses Beispiels. Die Kurve b zeigt die Antworten eines auf dieselbe Art und Weise wie in diesem Beispiel erhaltenen Vergleichsfruktosesensors, bei dem die H-Ionen-Einstellschicht 11 von der Grundlage 10 des Fruktosesensors entfernt wurde.
Aus Fig.4 ist ersichtlich, daß die Beziehung zwischen der Fruktosekonzentration und der Sensorantwort bis hinauf zu 25 mM Fruktose, d.h. dem Substrat, proportional war. Andererseits entsprach bei dem Fruktosesensor ohne die H-Ionen-Einstellschicht die Fruktosekonzentration nur bis hinauf zu 10 mM Fruktose der Sensorantwort.
In Fig.4 war in dem Bereich, in dem die Beziehung zwischen Fruktosekonzentration und Sensorantwort eine gerade Linie ist, die Stromantwort, die mit dem Fruktosesensor dieses Beispiels erhalten wurde, um etwa 20 % höher als diejenige des Vergleichsfruktosesensors ohne die H-Ionen-Einstellschicht 11.
Das Beispiel belegt, daß ein Biosensor mit breitem Meßbereich und hoher Sensitivität erhalten werden kann, indem man die H-Ionen-Einstellschicht 11 auf der Grundlage 10 zur Verfügung stellt.
Darüber hinaus wurde mit dem Fruktosesensor dieses Beispiels eine Antwort, die einer geraden Linie entspracht, bei einer auf 1 Minute gesetzten Meßdauer bis zu 15 mM Fruktose erhalten. Auch die Wiederholbarkeit der Antworten des Sensors war ausgezeichnet. Beispielsweise lag der Variationskoeffizient (CV-Wert) bei Verwendung von 30 Sensoren gegenüber der Probenflüssigkeit bei 7 % oder darunter.

Beispiel 2

Ein Elektrodensystem 14 mit einer Arbeitselektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 wie in Fig. 1 gezeigt wurde auf einer isolierenden Grundlage 1 aus Polyethylenterephthalat mittels Siebdruck wie in Beispiel 1 aufgedruckt, geschliffen und erhitzt. Eine gemischte wäßrige Lösung aus 0,5 gew.-% CMC, Fruktosedehydrogenase und Kaliumferricyanid wurde auf das Elektrodensystem 14 aufgetropft und 10 Minuten lang bei 40 ºC in einem Warmlufttrockner getrocknet, um eine Reaktionsschicht 15 zu bilden.
Das Herstellungsverfahren für den Biosensor läßt vereinfachen, indem man die Reaktionsschicht 15 durch Auftropfen und Trocknen einer Mischlösung aus hydrophilem Polymer, Enzym und Elektronenakzeptor auf das Elektrodensystem auf die obige Weise formt.
Anschließend wurden 3 µl einer Mcllvaine-Pufferlösung (Gemisch aus 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Dinatriumphosphat, pH 4,5) auf einen Teil zwischen der Reaktionsschicht 15 und der Spitze der isolierenden Grundlage 1, die einer Probeneinlaßöffnung 21 entspricht, aufgetropft und zur Bildung einer H-Ionen-Einstellschicht 11 getrocknet. Die so erhaltene Grundlage 10, ein Abstandhalter 20 und eine Abdeckung 30 wurden zur Haftung wie in Beispiel 1 laminiert, wie es in Fig. 2 und 3 mit gestrichelten Linien angedeutet ist.
Durch die Probeneinlaßöffnung 21 wurden 3 µl einer Fruktosestandardlösung in den so erhaltenen Fruktosesensor eingefüllt. Zwei Minuten nach dem Befüllen wurde ein Spannungspuls von +0,5 V, bezogen auf die Spannung an der Gegenelektrode 5, an die Arbeitselektrode 4 angelegt. Anschließend wurde der Anodenstrom 5 Sekunden nach dem Anlegen gemessen, wodurch der Antwortstromwert, der der Fruktosekonzentration in der Flüssigkeit entspracht, erhalten wurde. Alternativ dazu wurde die Probenflüssigkeit auf dieselbe Art und Weise zugeführt und die Spannung nach 90 Sekunden angelegt. Der erhaltene Antwortstrom war nahezu mit dem nach zwei Minuten erhaltenen identisch. Darüber hinaus lag der Variationskoeffizient (CV-Wert) bei Verwendung von 30 Sensoren gegenüber derselben Probenflüssigkeit bei 5 % oder darunter. Auch die Wiederholbarkeit war ausgezeichnet.
Bei dem Fruktosesensor dieses Beispiels liegt die Fruktosedehydrogenase gemischt mit Kaliumferricyanid in der Reaktionsschicht 15 vor. Dementsprechend lösen sich beide, Fruktosedehydrogenase und Kaliumferricyanid, leicht, schnell und homogen in der Probenflüssigkeit auf. Die schnelle Umsetzung in der Probenflüssigkeit verringert die zur Messung erforderliche Zeit und macht den Antwortstrom konstant.
Der mit dem Fruktosesensor dieses Beispiels erhaltene Antwortstrom war um etwa 20 % höher als deijenige des Vergleichsfruktosesensors ohne die H-Ionen-Einstellschicht, wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Ein Elektrodensystem 14 mit einer Arbeitselektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 wie in Fig. 1 gezeigt wurde auf einer isolierenden Grundlage 1 aus Polyethylenterephthalat mittels Siebdruck wie in Beispiel 1 aufgedruckt, geschliffen und erhitzt. Anschließend wurden 3 µl einer Kaliumferricyanid enthaltenden Phosphatpufferlösung (0,2 M K&sub2;HPO&sub4; und 0,2 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 4,5) auf eine Teil zwischen dem Elektrodensystem 14 und der Spritze der isolierenden Grundlage, die der Probeneinlaßöffnung 21 entspricht, aufgetropft, und durch Erwärmen für 5 Minuten bei 100 ºC getrocknet, wie in den Fig. 1 und 3 gezeigt, um eine das Kaliumferricyanid enthaltende H-Ionen- Einstellschicht 11 zu erhalten.
Die zum Trocknen der H-Ionen-Einstellschicht 11 erforderliche Zeit hängt von der Temperatur ab, auf die die Schicht erwärmt wird. Dementsprechend läßt sich der Kristalldurchmesser des in der H-Ionen-Einstellschicht 11 enthaltenen Kaliumferricyanids über die Bedingungen der Hitzebehandlung einstellen. Der Kristalldurchmesser des Kaliumferricyanids nimmt ab, wenn die Trockendauer kürzer wird, was zu einer Beschleunigung der Auflösegeschwindigkeit in der Probenflüssigkeit führt. Dementsprechend läßt sich die Ansprechgeschwindigkeit des Sensors steigern. Andererseits verringert sich dann, wenn das Kaliumferricyanid zusammen mit dem Enzym in der Reaktionsschicht 15 vorliegt, die Enzymaktivität durch Erhitzen der Reaktionsschicht 15 auf hohe Temperaturen. Demzufolge kann die Erwärmungstemperatur der Schicht nicht frei gewählt werden.
Darüber hinaus läßt sich dann, wenn das Enzym in der Reaktionsschicht 15 dadurch vom Kaliumferricyanid getrennt ist, daß das Kaliumferricyanid in der H-Ionen-Einstellschicht 11 enthalten ist, die Lagerzeit des Sensors in bemerkenswerter Weise steigern.
Anschließend wurde eine gemischte wäßrige Lösung aus 0,5 gew.-% CMC und Fruktosedehydrogenase auf das Elektrodensystem 14 aufgetropft und 10 Minuten lang bei 40 ºC in einem Warmlufttrockner getrocknet, um die Reaktionsschicht 15 zu bilden. Die so hergestellte Grundlage 10, der Abstandhalter 20 und die Abdeckung 30 wurden zum Erhalt eines Fruktosesensors laminiert.
Durch die Probeneinlaßöffnung 21 wurden 3 µl einer Fruktosestandardiösung in den so erhaltenen Fruktosesensor eingefüllt. Zwei Minuten nach dem Befüllen wurde die Sensorantwort wie in Beispiel 1 gemessen. Der erhaltene Stromwert entsprach der Fruktosekonzentration in der Probenflüssigkeit Alternativ dazu war der Antwortstromwert, wenn die Spannung 90 Sekunden nach Einfüllen der Probenflüssigkeit wie oben angelegt wurde, nahezu mit dem nach zwei Minuten erhaltenen identisch. Dies beruht darauf, daß sich das Kaliumferricyanid aufgrund des geringeren Kristalldurchmessers des Kaliumferricyanids (0,05-0,3 Mm) schnell auflöst.
Der mit dem Fruktosesensor dieses Beispiels erhaltene Antwortstrom war um etwa 20 % höher als derjenige des Vergleichsfruktosesensors ohne die H-Ionen-Einstellschicht, wie in Beispiel 1.

Beispiel 4

Als ein weiteres Beispiel für einen Biosensor soll nun ein Saccharosesensor beschrieben werden.
Ein Elektrodensystem 14 mit einer Arbeitselektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 wie in Fig.1 gezeigt wurde auf eine isolierenden Grundlage 1 aus Polyethylenterephthalat wie in Beispiel 1 aufgedruckt, geschliffen und erhitzt. Anschließend wurde eine 0,5 gewc- % CMC enthaltende wäßrige Lösung auf das Elektrodensystem 14 aufgetropft und zum Erhalt einer CMC-Schicht getrocknet. Dann wurde eine gemischte wäßrige Lösung aus 0,5 gew.-% CMC, Invertase (EC 3.52.1.26), Mutarotase (EC 5.1.3.3), Glukoseoxidase (EC 1.1.3.4) und Kaliumferricyanid auf die CMC-Schicht aufgetropft und 10 Minuten lang bei 40 ºC in einem Warmlufttrockner getrocknet, um eine Reaktionsschicht 15 zu bilden.
Anschließend wurden 3 µl einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) auf einen Teil zwischen der Reaktionsschicht 15 und der Spitze der isolierenden Grundlage 1, die einer Probeneinlaßöffnung 21 entspricht, aufgetropft und zur Bildung einer H-Ionen- Einstellschicht 11 getrocknet. Die so erhaltene Grundlage 10, ein Abstandhalter 20 und eine Abdeckung 30 wurden zur Bildung eines Saccharosesensors laminiert.
Durch die Probeneinlaßöffnung 21 wurden 3 µl einer Saccharosestandardlösung in den so erhaltenen Saccharosesensor eingefüllt. Zwei Minuten nach dem Befüllen wurde ein Spannungspuls von +0,5 V bezogen auf die Spannung an der Gegenelektrode 5 an die Arbeitselektrode 4 angelegt. Anschließend wurde der Anodenstrom 5 Sekunden nach dem Anlegen gemessen. Im Ergebnis entsprach der erhaltene Antwortstromwert der Saccharosekonzentration in der Flüssigkeit.

Beispiel 5

Ein Elektrodensystem 14 mit einer Arbeitselektrode 4 und einer Gegenelektrode 5, wie in Fig. 1 gezeigt, wurde auf einer isolierenden Grundlage 1 aus Polyethylenterephthalat mittels Siebdruck, wie in Fig.5 gezeigt, aufgedruckt, geschliffen und erhitzt. Eine gemischte wäßrige Lösung aus 0,5 gew.-% CMC, Fruktosedehydrogenase und Kaliumferricyanid wurde auf das Elektrodensystem 14 aufgetropft und 10 Minuten bei 40 ºC in einem Warmlufttrockner getrocknet, um eine Reaktionsschicht 16 zu bilden.
Anschließend wurde eine 0,5 gew.- % PVP als hydrophiles Polymer enthaltende ethanolische Lösung so aufgetropft, daß die gesamte CMC-Fruktosedehydrogenase- Kaliumferricyanid-Schicht 16 bedeckt war und zum Erhalt einer PVP-Schicht 8 getrocknet. Auf die PVP-Schicht 8 wurden 3 µl einer McIlvaine-Pufferlösung (Mischung aus 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Dinatriumphosphat, pH 4,5) aufgetropft und zur Bildung einer H-Ionen-Einstellschicht 11 getrocknet.
In diesem Beispiel mischen sich die H-Ionen-Einstellschicht 11 und die PVP-Schicht 8 nur in einer Dicke von einigen Mikrometern an ihrer Grenzfläche, da es sich bei PVP um ein hydrophiles Polymer handelt. Dementsprechend ist die CMC-Fruktosedehydrogenase-Kaliumferricyanid-Schicht 16 durch die PVP-Schicht von der H-Ionen- Einstellschicht 11 getrennt. In diesem Beispiel umfaßt die Reaktionsschicht 15 die CMC-Fruktosedehydrogenase-Kaliumferricyanid-Schicht 16.
Dementsprechend löst sich die Reaktionsschicht 15 nach dem Auflösen der H-Ionen- Einstellschicht 11 in der Probenflüssigkeit, da die H-Ionen-Einstellschicht 11 auf der Reaktionsschicht 15 ausgebildet ist, was die zum Ansprechen des Sensors erforderliche Zeit verringert.
Darüber hinaus unterscheidet sich für die in diesem Beispiel als Enzym eingesetzte Fruktosedehydrogenase der die höchste Enzymaktivität gestattende pH von dem pH, der für eine hohe Lagerstabilität sorgt. Dementsprechend verschlechtert sich die Lagerzeit bei dem in Fig.7 gezeigten herkömmlichen Biosensor, da der Sensor pH- Bedingungen ausgesetzt ist, die sich von den für hohe Stabilität der Fruktosedehydrogenase sorgenden Bedingungen unterscheiden, wenn der Biosensor Feuchtigkeit absorbiert.
Der Biosensor dieses Beispiels kann die oben genannten Nachteile überwinden, da die CMC-Fruktosedehydrogenase-Kaliumferricyanid-Schicht 16 durch die PVP-Schicht 8 von der H-Ionen-Einstellschicht 11 getrennt werden kann.
Bei dem Biosensor dieses Beispiels ist es weiterhin nicht notwendig, zwischen einer im Sensor vorgesehenen Probeneinlaßöffnung 21 und einer Luftöffnung 31 zu unterscheiden. Daher kann die Probeneinlaßöffnung 21 als Luftöffnung verwendet werden, durch welche wiederum die Probenflüssigkeit eingefüllt werden kann.
Nach Herstellung der Grundlage 10 mit der Reaktionsschicht 15 und der H-Ionen- Einstellschicht 11 auf obige Weise, wurden die Grundlage 10, ein Abstandhalter 20 und eine Abdeckung wie in Fig.6 mit gestrichelten Linien angedeutet zur Befestigung laminiertc
Der so erhaltene Fruktosesensor wurde mit 3 µl einer Fruktosestandardlösung als Probenflüssigkeit durch die Probeneinlaßöffnung 21 befüllt und die Sensorantwort wie in Beispiel 1 gemessen. Das Ergebnis war eine proportionale lineare Beziehung bis hinauf zu 25 mM Fruktose. Außerdem lag der Variationskoeffizient (CV-Wert), der unter Verwendung von 30 Sensoren erhalten wurde, bei 6 % oder darunter. Damit war die Wiederholbarkeit ausgezeichnet.

Beispiel 6

Ein Elektrodensystem 14 mit einer Arbeitselektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 wurde auf einer isolierenden Grundlage 1 aus Polyethylenterephthalat mittels Siebdruck wie in Beispiel 1 aufgedruckt, geschliffen und erhitzt. Eine wäßrige Lösung aus CMC und Kaliumferricyanid wurde auf das Elektrodensystem 14 aufgetropft und mittels Erwärmen zum Erhalt einer CMC und Kaliumferricyanid enthaltenden Schicht getrock netc
Die zum Trocknen erforderliche Zeit hängt von der Erwärmungstemperatur ab. Daher läßt sich der Kristalldurchmesser des in der Schicht enthaltenen Kaliumferricyanids durch die Bedingungen der Hitzebehandlung einstellen. Eine kürzere Trockendauer verkleinert den Kristalldurchmesser des Kaliumferricyanids, wodurch die Lösegeschwindigkeit in die Probenflüssigkeit steigt. Auf diese Weise läßt sich die Ansprechgeschwindigkeit erhöhen. Liegt andererseits das Kaliumferricyanid zusammen mit dem Enzym in der Reaktionsschicht vor, kann die Erwärmungstemperatur nicht frei gewählt werden, da die Enzymaktivität durch Erhitzen auf hohe Temperaturen vermindert wird.
Anschließend wird eine 0,5 gew.-% PVP enthaltende ethanolische Lösung so aufgetropft, daß die gesamte CMC und Kaliumferricyanid enthaltende Schicht bedeckt ist, und zum Erhalt einer PVP-Schicht getrocknet. Weiterhin wurde eine Fruktosedehydrogenaselösung auf die PVP-Schicht getropft und zum Erhalt einer Fruktosedehydrogenaseschicht getrocknet.
Anschließend wurde eine 0,5 gew.-% Hydroxyethylcellulose enthaltende ethanolische Lösung so aufgetropft, daß die gesamte Fruktosedehydrogenaseschicht bedeckt war, und zum Erhalt einer Hydroxyethylcelluloseschicht getrocknet. Weiterhin wurde eine Phosphatpufferlösung (pH 4,5) auf die Hydroxyethylcelluloseschicht aufgetropft und zum Bilden einer H-Ionen-Einstellschicht 11 getrocknet. Die so erhaltene Grundlage 10, ein Abstandhalter 20 und eine Abdeckung 30 wurden wie in Beispiel 1 zur Herstellung eines Fruktosesensors laminiert.
Bei PVP und Hydroxyethylcellulose handelt es sich um hydrophile Polymerec Dementsprechend vermischen sich, wenn eine wäßrige Fruktosedehydrogenase enthaltende Lösung auf die PVP-Schicht aufgetropft wird, beide Schicht nicht vollständig, sondern nur in einer Dicke von einigen Mikrometern an ihrer Grenzfläche. Ebenso mischen sich, wenn die Phosphatpufferlösung auf die Hydroxyethylcelluloseschicht aufgetropft wird, die Hydroxyethylcelluloseschicht und die H-Ionen-Einstellschicht nicht vollständig, sondern nur in einer Dicke von einigen Mikrometern an ihrer Grenzfläche.
Auf diese Weise wird die CMC-Kaliumferricyanid-Schicht von der Fruktosedehydrogenase-Schicht bzw. der H-Ionen-Einstellschicht getrennt.
Der gemäß dem obigen Verfahren hergestellte Fruktosesensor wurde durch eine Probeneinlaßöffnung mit 3 µl einer Fruktosestandardlösung befüllt. Die nach zwei Minuten auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 1 erhaltene Sensorantwort entsprach der Fruktosekonzentration in der Probenflüssigkeit Wurde alternativ dazu die Spannung 90 Sekunden nach dem Befüllen angelegt, war der erhaltene Antwortstrom nahezu mit dem nach 2 Minuten erhaltenen identisch. Dies beruht darauf, daß sich das Kaliumferricyanid aufgrund des kleineren Kristalldurchmessers des Kaliumferricyanids schneller in der Probenflüssigkeit auflöste.
Die Antwortströme, die mit dem Fruktosesensor dieses Beispiels erhalten wurden, waren um circa 20 % größer als diejenigen, die mit einem Vergleichsfruktosesensor ohne die H-Ionen-Einstellschicht 11, wie in Beispiel 1, erhalten wurden.

Claims

1. Biosensor zur Quantifizierung eines in einer Probenflüssigkeit enthaltenen Substrats durch Reduktion eines Elektronenakzeptors mittels Elektronen, die in der Reaktion des Substrats mit einem Enzym erzeugt werden, und anschließende elektrochemische Messung der Menge an reduziertem Elektronenakzeptor, umfaßend:

- eine elektrisch isolierende Grundlage (1), ein Elektrodensystem (14), enthaltend mindestens eine Arbeitselektrode (4) und eine Gegenelektrode (5), die auf der isolierenden Grundlage (1) ausgebildet sind,

- eine Reaktionsschicht (15), die auf dem Elektrodensystem (14) ausgebildet ist und das Enzym und ein hydrophiles Polymer enthält, wobei das Enzym und das Polymer in einer Mischschicht vorliegen oder auf zwei Schichten aufgeteilt sind, und

- eine Schicht (11) zum Einstellen der Wasserstoffionenkonzentration (H- Ionen-Einstellschicht),

- wobei die Reaktionsschicht (15) mit dem Elektrodensystem (14) in Kontakt steht und der Elektronenakzeptor entweder in der Reaktionsschicht oder der H-Ionen-Einstellschicht enthalten ist,

dadurch gekennzeichnet, daß die H-Ionen-Einstellschicht (11) von der Reaktionsschicht (15) getrennt ist.

2. Biosensor gemäß Anspruch 1, bei dem die H-Ionen-Einstellschicht (11) räumlich von der Reaktionsschicht (15) getrennt ist.

3. Biosensor gemäßß Anspruch 1, bei dem die H-Ionen-Einstellschicht (11) von der Reaktionsschicht (15) durch eine Schicht aus einem zweiten hydrophilen Polymer getrennt ist.

4. Biosensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Reaktionsschicht (15) zusätzlich eine Schicht aus einem zweiten hydrophilen Polymer und Elektronenakzeptoren enthält.

5. Biosensor gemäß einem der Ansprüche 2 oder 4, bei dem die Reaktionsschicht (15) gebildet wird, indem man eine erste, ein hydrophiles Polymer und Enzym enthaltende Schicht, eine zweite Schicht, enthaltend ein zweites hydrophiles Polymer, und eine die Elektronenakzeptoren enthaltende Schicht in dieser Reihenfolge laminiert.

6. Biosensor gemäß Anspruch 3, bei dem

- die H-Ionen-Einstellschicht (11) auf dem Elektrodensystem (14) vorgesehen ist,

- die Rekktionsschicht (15), die außerdem ein hydrophiles Polymer und die Elektronenakzeptoren enthält, oben auf der H-Ionen-Einstellschicht (11) angeordnet und von dieser durch eine Schicht aus hydrophilem Polymer getrennt ist, die zwischen der Reaktionsschicht (15) und der H-Ionen-Einstellschicht (11) vorgesehen ist.

7. Biosensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Elektrode im wesentlichen aus Kohlenstoff besteht.

8. Biosensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die H-Ionen-Einstellschicht (11) ein Puffersalz enthält, das aus der aus Kaliumbiphosphat-Dikaliumphosphat, Kaliumbiphosphat-Dinatriumphosphat, Zitronensäure-Dinatriumphosphat, Zitronen säure-Trinatriumcitrat, Kaliumbicitrat-Natriumhydroxid und Apfelsäuremononatrium salz-Natriumhydroxid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

9. Biosensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem das hydrophile Polymer aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose und Carboxymethylethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und deren Derivaten, (Meth)acrylsäure und deren Salzen, Stärke oder deren Derivaten sowie Maleinsäure und deren Derivaten besteht.

10. Biosensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem das Enzym aus der aus Fruktosedehydrogenase, Invertase, Mutarotase, Glukoseoxidase, Alkoholoxidase, Lactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Cholesteroloxidase, Xanthinoxidase und Aminosäureoxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

11. Biosensor gemaß einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem der Elektronenakzeptor aus der aus Kaliumferricyanid, p-Benzochinon, Phenazinmethosulfat und Ferrocen bestehenden Gruppe gewählt ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines Biosensor zur Quantifizierung eines in einer Probenflüssigkeit enthaltenen Substrats durch Reduktion eines Elektronenakzeptors mittels Elektronen, die in einer Reaktion des Substrats mit einem Enzym erzeugt werden, und anschließende elektrochemische Messung der Menge an reduziertem Elektronenakzeptor, welches die folgenden Schritte umfaßt:

- erstens, Bereitstellen eines Elektrodensystems (14) mit mindestens einer Arbeitselektrode (4) und einer Gegenelektrode (5) auf einer elektrisch isolierenden Grundlage (1);

- zweitens, Ausbilden einer H-Ionen-Einstellschicht (11), die die Elektronenakzeptoren enthält, auf der isolierenden Grundlage (1); und

- schließlich, Bilden der das hydrophile Polymer und das Enzym enthaltenden Reaktionsschicht (15) auf dem Elektrodensystem (14), wobei das Polymer und das Enzym in derselben oder in getrennten Schichten enthalten sind,

dadurch gekennzeichnet, daß die H-Ionen-Einstellschicht (11) getrennt von der Reaktionsschicht (15) ausgebildet wird.