CN101886074B - 棉花绿色组织高效表达的GhPsbP启动子 - Google Patents

Abstract

本发明从棉花中分离到一个GhPsbP基因的启动子序列。该启动子可驱动基因在植物的绿色组织包括叶片和茎中高效特异表达。该启动子可作为功能基因的调控序列应用于转基因植物。

Description

棉花绿色组织高效表达的GhPsbP启动子

技术领域

本发明涉及一种绿色组织高效表达的棉花启动子，该启动子驱动基因在绿色组织包括叶片和茎中高效表达。这种启动子可应用于调控外源目的基因在绿色组织中高效表达，而在根部、生殖组织等部位不表达或少量表达，从而提高外源基因表达的针对性，节省植物体的能量和物质。 

背景技术

基因表达和调控是植物基因工程研究的重要内容，而启动子在决定基因表达方面起着转录调控中心的作用，它在很大程度上决定着目的基因表达的时间、空间和强度。目前在商业化转基因作物中使用的启动子往往都是组成型启动子，如：花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、水稻肌动蛋白Actl启动子、玉米泛素Ubi启动子等。然而组成型启动子驱动外源基因在植物中持续表达，表达往往造成能量和物质的非必要浪费，增加植株的代谢负担，有时甚至还会引起植株的形态发生改变，影响植株的生长发育，但是在需要外源基因高表达的部位因表达量的不足而缺乏针对性，在某些应用中可能达不到预期效果。应用组织特异性启动子作为相关外源基因在转基因作物中的表达调控元件，不仅能够充分发挥外源基因的相关功能，而且使外源基因的表达更具有针对性，避免了其它组织因不必要的表达而造成的能量和物质浪费，减轻了转基因植物的生长及代谢负担。因此，用特异性启动子取代组成型启动子，使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表达是植株基因工程研究的重要内容。 

为了使外源基因在转基因植物体绿色组织中高效表达，发挥相关的功能，同时尽可能减少对受体植物的不利影响，本发明的主要目的是克隆在绿色组织中高效表达基因的启动子，使由该启动子驱动的外源功能基因(例如：抗除草剂基因、抗病基因等)，只在需要其表达的绿色组织中高效表达，在其它非绿色组织中不表达或只保持极低水平的本地表达。使其可以应用于培育需要外源基因在绿色组织中特异表达的不同转基因植物中(例如：转基因抗除草剂植物、转基因抗病植物等)。这样既能避免外源基因无针对性的长期高效表达所引起的负效应，又能使植物具有抗除草剂及病害等的特性，从而有效地解决目前外源基因受强组成型表达启动子驱动，外源基因在植物体内长期高效表达，影响植物生长和产量的问题。 

克隆绿色组织高效表达基因的启动子、增强子及各种决定绿色组织高效表达的DNA序列，可以为外源基因在植物体内定时、定点、定量表达提供调控元件。 

GhPsbP启动子是在绿色组织中高效表达的启动子，目前在NCBI/nr/BLAST中尚未见该启动子的注册信息，并且尚未见有关草甘膦诱导表达启动子的报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种GhPsbP基因的转录调控区核苷酸序列或与其具有相同功能的类似物衍变体核苷酸序列，该启动子是从棉花中分离的，是一种能驱动与其相关联的DNA在绿色组织中高效表达的组织特异性启动子。 

本发明提供的GhPsbP启动子序列具有SEQ ID NO：1所示的第1位到第2363位的启动子区核苷酸序列，由于对本发明的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸序列的***、替换和/或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的，因而本发明也包括与SEQ ID NO：1所示的具有至少50％的同源性，优选至少90％的同源性，并同时具有相同功能的类似物。 

本发明中的GhPsbP基因5′端调控序列的“衍生变体”是指在SEQ ID NO：1序列中1到2363位核苷酸之间序列的基础上，经片段缺失、碱基改变、碱基添加或再次分离的一部分、几部分或其组合。本发明提供了启动子顺式元件所在的大致区段，并构建了从其5′端逐级缺失的衍生变体。本发明中衍生变体的启动子活性可以通过在启动子下游嵌合报告基因，诸如β-葡糖醛酸酶基因(GUS)，以GUS的表达情况得以确认。 

本发明的再一个目的是提供包含有上述绿色组织特异性启动子序列及其具有相同功能的类似物衍生突变体的表达载体和其重组宿主细胞。包括重组细菌、酵母、农杆菌及棉花重组植物细胞。根据本发明提供的绿色组织特异性启动子，可以构建包含该启动子的双元表达载体，其启动子下游可以嵌合感兴趣的将要表达的基因，通过转化植物，实现外源基因在转基因植物绿色组织中的高效特异表达。 

附图表说明 

图1为棉花GhPsbP基因的5’RACE电泳图。其中泳道M为分子量标记，泳道2为GhPsbP基因的5’RACE产物； 

图2为棉花GhPsbP全长启动子的PCR扩增结果。其中泳道M为分子量标记，泳道1为GhPsbP全长启动子的PCR扩增结果 

图3为棉花GhPsbP全长启动子P1、缺失启动子P2、P3、P4和P5的酶切图谱。其中泳道M为分子量标记，泳道7、6、5、3和1分别为P1、P2、P3、P4和P5的酶切结果。 

图4为转P1、P2、P3、P4和P5烟草的PCR鉴定结果。其中泳道M为分子量标记，泳道1为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3-7分别为转P1、P2、P3、P4和P5烟草的PCR鉴定结果。 

图5为转GhPsbP全长启动子P1烟草根、茎和叶中GUS的real-time PCR结果。 

图6为转P1、P2、P3、P4和P5烟草GUS组织化学染色结果。 

图7为转P1、P2、P3、P4和P5烟草叶片中GUS的real-time PCR结果。 

图8为转P1、P2、P3、P4和P5烟草叶片中GUS蛋白活性。 

具体实施方式

下文通过实施例对本发明做进一步说明 

实施例1绿色组织高效表达GhPsbP启动子克隆 

1.绿色组织特异表达GhPsbP基因的5’RACE 

热硼酸法提取棉花Y18系总RNA 

1)将冷冻的叶片放入预冷的研钵中，研磨成粉状； 

2)取200mg于1.5ml微量离心管中，加1ml预热至80℃的基本提取液，10μl DTT贮备液和25μl蛋白酶K贮备液混匀； 

3)42℃100r/min温和摇动1.5h； 

4)每管加入80μl 2mol/L的Kcl溶液，至Kcl终浓度160mmol/L，混匀、冰浴1h； 

5)12000r/min离心20min，取900μl上清液，加入300μl 8mol/L Licl，混匀，冰浴过夜沉淀； 

6)如上所述离心后，沉淀用2mol/LLicl(冰预冷)洗2～3次，直到上清近乎无色； 

7)悬浮Licl-RNA于400μl10mmol/LTris-Hcl(pH7.5)，加入1/10体积的2mol/LKCA(pH 5.5)，混匀，冰浴15min后，沉淀； 

8)离心除去盐不溶性物质(上清中含有RNA)； 

9)用2.5倍体积的无水乙醇-20℃沉淀过夜或-70℃沉淀2～3h； 

10)用70％冷乙醇洗涤RNA沉淀，真空快速干燥，溶于DEPC水中或者TE缓冲液(10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，pH8)； 

RACE法扩增GhPsbP 5’末端 

1)使用Alkaline Phosphatase(CIAP)对Total RNA中裸露的5’磷酸基团进行去磷酸反应。按下列组份配制去磷酸反应液，50℃反应1h，获得CIAP-treated RNA。 

Total RNA(1μg/μl)                                        1μl 

RNase Inhibitor(40U/μl)                                   1μl 

10×Alkaline Phosphatase Buffer(MgCl₂ Free)                5μl 

Alkaline Phosphatase(Calf intestine)(16U/μl)              0.6μl 

RNase Free ddH₂O up to                                     50μl 

2)使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5’帽子结构，保留一个磷酸基团。按下列组份配制“去帽子”反应液，37℃反应1h，获得CIAP/TAP-treated RNA。 

CIAP-treated RNA                                           7μl 

RNase Inhibitor(40U/μl)                                   1μl 

10×TAP Reaction Buffer                                    1μl 

Tobacco Acid Pyrophosphatase(0.5U/μl)                     1μl 

Total Volume                                                10μl 

3)5’RACE Adaptor的连接。配制下列溶液。 

CIAP/TAP-treated RNA                                        5μl 

5’RACE Adaptor(15μM)                                      1μl 

RNase Free ddH₂O                                            4μl 

65℃保温5分钟后冰上放置2分钟，然后加入下列试剂。 

RNase Inhibitor(40U/μl)                                    1μl 

5×RNA Ligation Buffer                                      8μl 

40％PEG#6000                                                20μl 

T4 RNA Ligase(40U/μl)                                      1μl 

16℃反应1小时，获得Ligated RNA。 

4)反转录反应。按下列组份配制反转录反应液。 

Ligated RNA                                                 6μl 

Random 9mers(50μM)                                         0.5μl 

5×M-MLV Buffer                                             2μl 

dNTP(10mM each)                                             1μl 

RNase Inhibitor(40U/μl)                                    0.25μl 

Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(200U/μl)             0.25μl 

Total Volume                                                10μl 

反转录反应条件如下：30℃10min；42℃1hr；70℃15min。 

5)Outer PCR反应。按下列组份配制Outer PCR反应液。 

上述4的反转录反应液                                         2μl 

1×cDNA Dilution Buffer II                                  8μl 

10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺Free)                              4μl 

MgCl(25mM)                                                  3μl 

TaKaRa LA Taq(5U/μl)                                       0.25μl 

5’RACE Control Outer Primer(10μM)                         2μl 

5’RACE Outer Primer(10μM)                                 2μl 

ddH₂O                                                       28.75μl 

Total                                                       50μl 

PCR反应条件如下： 

6)Inner PCR反应。按下列组份配制Inner PCR反应液。 

Outer PCR反应液                                             1μl 

10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺Free)                              5μl 

MgCl(25mM)                                                  5μl 

dNTP Mixture(2.5mM each)                                    8μl 

TaKaRa LA Taq(5U/μl)                                       0.5μl 

5’RACE Control Inner Primer(10μM)                         2μl 

5’RACE Inner Primer(10μM)                                 2μl 

dH₂O                                                        26.5μl 

Total                                                       50μl 

2)PCR反应条件如下： 

7)反应结束后，取5μl PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收图1中2号泳道0.3kb的目的条带，将其连接到PGEM-T后转化大肠杆菌，提取质粒经酶切鉴定后，将阳性克隆的质粒测序分析，获得GhPsbP5’端的序列信息。 

2.绿色组织特异表达GhPsbP基因启动子的克隆 

完成GhPsbP基因的5’RACE后，确定了该基因的转录起始位点。根据已测序的棉花Y18包含GhPsbP基因及其启动子的G2-J-15BAC克隆，在GhPsbP基因转录起始位点的5’端上游2363bp-1bp，分别设计引物： 

P1F：5’-CCCAAGCTTTGGATGACTATAGTTGCTCCGACC-3’； 

PR：5’-CGGATCCCGCGCATTAGTGCCAGTGGCAG-3’。 

以棉花Y18基因组为模板，扩增获得GhPsbP基因启动子全长。 

PCR反应体系如下： 

Y18基因组模板DNA                                         1μl 

P1F(10μmol)                                             1μl 

PR(10μmol)                                              1μl 

dNTP Mixture(2.5mmol)                                    4μl 

buffer                                                   5μl 

Taq酶                                                    1μl 

ddH₂O                                                    37μl 

Total                                                    50μl 

PCR反应条件如下： 

反应结束后，对PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收图2中2.3kb的目的条带，将其连接到Pmd-18T载体后转化大肠杆菌，提取质粒，酶切鉴定，见图3第7泳道，切出2.3kb的条带，将阳性克隆的质粒测序分析，获得GhPsbP启动子的序列信息，将该段序列命名为P1，将克隆命名为pMDGhPsbPP。其序列如SEQ ID NO：1所示。NCBI/nr/BLAST结果表明：核酸(nr)库中无任何与GhPsbP启动子同源的序列。 

实施例2棉花GhPsbP启动子表达特性分析 

1.构建GhPsbP启动子驱动GUS的植物表达载体pBIGhPsbPP 

1)提取pMDGhPsbPP和pBI121的质粒，用HindIII和BamHI双酶切质粒，37℃酶切5h。酶切体系如下： 

pMDGhPsbPP质粒    5μl          pBI121载体    30μl 

HindIII           3μl          HindIII       3μl 

BamHI             3μl          BamHI         3μl 

BufferR           5μl          BufferR       5μl 

ddH₂O             34μl         ddH₂O         6μl 

Total             50μl         Total         50μl 

2)分别回收GhPsbPP和pBI121载体序列，进行连接反应，16℃连接12h，连接体系如下： 

pBI121载体                                1μl 

突变体片段                                3μl 

T4-ligase                                 1μl 

Buffer                                    1μl 

去离子水                                  4μl 

总体系                                    10μl 

3)转化连接产物，挑取克隆，酶切鉴定。将酶切鉴定及测序均正确的表达载体命名为pBIGhPsbPP。 

2.植物表达载体pBIGhPsbPP转化根癌农杆菌LB4404 

在200μl LBA4404感受态细胞中加入2μg重组质粒DNA，冰浴5min，然后转至液氮中冷冻8min；迅速于37℃水浴中温5min后，加入800μl YEB液体培养基；28℃、250rpm预表达培育4～5h小时，然后涂铺含有卡那霉素、链霉素的YEB平板，28℃培育24～48h后可出现菌落；挑取菌落做菌落PCR鉴定，确定正确后保存于-70℃备用。 

3.叶盘法转化烟草 

1)农杆菌介导转化烟草 

取烟草无菌苗的嫩叶片，用刀切成约0.5cm的小方块，在农杆菌悬液中浸泡5～10min，然后用无菌滤纸吸干；共培养：将叶块摆放在共培养培养基中(上面铺2层滤纸)于25℃避光共培养3d；选择培养：将叶片转移到选择培养基中，于25℃光照培养箱(光照12h，黑暗12h)中培养至抗性芽的出现；抗性小芽的获得：将2～3cm长的抗性芽移到生根培养基中，7d左右逐渐长出根来。约一个月后待小苗长到5～6cm高时，移栽到含有营养土的小塑料钵中； 

2)转基因烟草的PCR分子鉴定 

设计GUS引物： 

GUSF：5’-GTGGGCATTCAGTCTGGATCG-3’； 

GUSR：5’-TTGCCGTTTTCGTCGGTAATC-3’； 

以烟草基因组为模板，分别以GUS引物、启动子引物及GUS和启动子配对引物进行PCR扩增，采用50μl体系，含模板DNA1μl，10μmol引物各1μl，2.5mmoldNTP 4μl，buffer 5μl，Taq酶1μl，加去离子水补足50μl；反应进行条件是94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。鉴定结果见图4第3泳道，表明获得了转pBIGhPsbPP的烟草植株。 

3.转基因烟草GUS的real-time PCR 

1)分别设计烟草actin引物和GUS基因引物用于real-time PCR： 

actinF：5’-TTCCTGGCATTGCAGATCGTAT-3’； 

actinR：5’-ATCCTCCAATCCAGACACTGTACTTG-3’； 

GUSF：5’-GTTTCGATGCGGTCACTCATTA-3’； 

GUSR：5’-GTCTGCCAGTTCAGTTCGTTGTT-3’。 

设计标准参照荧光定量引物设计原则，设计的引物扩增产物长度范围从150-250bp； 

2)荧光定量PCR的反应体系20μl：10μl 2×Realtime PCR Master Mix(采用的TOYOBO)，10uM正向和反向引物，以及2μl的cDNA，每个反应三个重复。PCR扩增应是在MJR DNA Engine Opticon 2 ContinuousFluorescence Detector下进行的，反应程序如下：94℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸15s，82℃和85℃分别读板2s，随后熔解曲线分析来证明扩增的产物的特异性； 

3)用软件Opticon Monitor Version 2.02(MJ Research)分析定量PCR产物； 

4)数据分析，相对定量基因的表达采用的是ΔC_T的方法，β-actin作为内参照基因，ΔC_T是样品的平均C_T值减去内参照基因的平均C_T值所得的数值，它用来均一化每一个反应中不同cDNA模板的总数以及RT反应步骤反应效率不同所带来的影响。比较两个样品，就分别用两个样品的ΔC_T值相减，得到的数值即ΔΔC_T，GUSmRNA拷贝数的相对值可以用2^-ΔΔCT来计算。转基因烟草根、茎、叶中GUS的相对表达量见图5，从图中可以看出转基因烟草叶、茎中GUS的转录水平分别是根中的15倍和11倍。 

实施例3棉花GhPsbP启动子功能区域的确定 

根据预测的调控元件分布情况，分别设计缺失突变启动子引物如下： 

P2F：5’-CCCAAGCTTTTCAAAGGCTATGAGTTTTG-3’ 

P3F：5’-CCCAAGCTTCTTGCTACCATTTCTCTGCG-3’ 

P4F：5’-CCCAAGCTTTGGTACTTGAAGGTAACAATG-3’ 

P5F：5’-CCCAAGCTTGGCAAATCAACAATATGTTAAC-3’ 

将P2F、P3F、P4F和P5F分别与PR扩增，采用扩增P1的PCR方法获得了4个GhPsbP启动子5′端变缺失片段，分别命名为P2(对应于SEQ ID NO：1第286位至2363位核苷酸)、P3(对应于SEQ ID NO：1第740位至2363位核苷酸)、P4(对应于SEQ ID NO：1第1693位至2363位核苷酸)和P5(对应于SEQID NO：1第2154位至2363位核苷酸)。采用前面提到的方法分别将P2、P3、P4和P5克隆到pMD18-T载体上后，酶切后测序验证，酶切结果见图3第6、5、3、1泳道，再酶切连接到pBI121载体上，转化农杆菌后通过叶盘法转化烟草，通过PCR鉴定分别获得转P2、P3、P4和P5的烟草，转P2、P3、P4和P5烟草的PCR鉴定结果见图4的第4-第7泳道。 

1.转基因烟草GUS组织化学染色。 

1)染色液组成为：0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)20ml，0.5M EDTA溶液1ml，Triton X-100 0.5ml，亚铁***(Pataxium ferrocyamide)42.5mg，铁***(Pataxium ferricyamide)33mg，氯霉素(Chloramphenicol5mg，X-Gluc50mg，甲醇(Methanol)溶液10ml，加水至50ml。脱色液组成为：50％乙醇，醋酸5％，3.7％甲醛溶液.配好GUS染液避光4℃保存； 

2)用染色液在37℃处理烟草幼苗2-24h； 

3)染色后样品固定在70％的乙醇中脱色；染色结果见图6，说明P1、P2、P3、P4和P5均能驱动基因在植物的绿色组织中高效特异表达，但表达水平是P1＞P2＞P3＞P4＞P5。 

2.转基因烟草GUS的real-time PCR 

采取上述real-time PCR的方法，分别对转P1、P2、P3、P4和P5烟草的叶片进行real-time PCR，结果见图7，可以看到启动子全长和缺失突变体均能驱动GUS转录，但转录水平是P1＞P2＞P3＞P4＞P5，和转基因烟草GUS组织化学染色结果相一致。 

3.转基因烟草GUS蛋白活性测定 

分别取转P1、P2、P3、P4和P5的烟草适量材料用液氮研磨成粉末，取约0.6克粉末装入1.5mL离心管中；加入1mL蛋白提取液，摇匀，在冰上放至沉淀；4℃13000rpm离心15分钟；吸取上清，冰箱中保存；采用Bradford法测定蛋白含量，将100μg/mL BSA标准溶液按下表制成BSA梯度液，见表1；分别取上述浓度的BSA溶液1mL至装有3mL考马斯亮蓝G-250溶液的10mL离心管中，摇匀，室温放置5分钟；用分光光度计Du640测定各样品在595nm下的吸光度；以BSA浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；取GUS蛋白20μL稀释至1mL，加入至3ml考马斯亮蓝G-250溶液中，摇匀，室温放置5分钟，测定595nm下的吸光度，根据标准曲线计算蛋白质样品的浓度；在10mL离心管中加入400μL GUS蛋白提取缓冲液、100μgGUS蛋白、10μL40mM 4-MUG，37℃反应1小时；加入1.6mL反应终止液；预热荧光分光光度计，在激发光365nm、发射光455nm条件下测定其读数；按表2浓度梯度配制4-MU溶液，以反应终止液为空白溶液，绘制标准曲线；酶活力单位定义为：每分钟水解4-MUG生成1nmol或1mg、1μg、1ng 4-MU的酶量为一个活力单位，根据定义求出各样品的酶活力。转P1、P2、P3、P4和P5的烟草叶中GUS蛋白含量见图8，可以看到启动子全长和缺失突变体均能驱动GUS转录，但转P1和P2烟草植株GUS蛋白活性最高，大概是转P5烟草植株的4倍，其次为转P3和P4的烟草植株，其GUS蛋白活性是转P5烟草植株的2倍，和转基因烟草GUS组织化学染色结果及转基因烟草GUS的real-time PCR结果相一致。 

表1BSA标准溶液的配制 

Table1 Standard curve for the measurement of BSA 

表24-MU标准溶液的配制 

Table2 Standard curve for the measurement of4-MU 

本说明书中所涉及的棉花GhPsbP启动子的保藏信息如下： 

1.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

2.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所 

3.保藏日期：2010年6月1日 

4.保藏编号：3880 

5.分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli) 。 

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>棉花GhPsbP全长启动子

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2363

<212>DNA

<213>G.hirsutum

<400>1

tggatgacta tagttgctcc gaccagtatg acagcatatc tttatctcta ctctaatgga    60

gaagaatcat tggctgctac ccaactagtg taatagatgt aattttacca tatattaaat    120

tttaagatca acaatgtaat tttatcgtat attaatttat aattctatct tttttaaagg    180

tactaaacat atttttttaa tattttgggg gctaaagtgc aattttacca tagatcaatt    240

tataatttta ttctttctaa agggactgaa ttgaaaatat tttatttcaa aggctatgag    300

ttttgatttt ttatttcaca tatgaaaaga actaatgtta ctaaaattta gtaattttta    360

tgtaaaattt aaaggttttt atttcaccaa aagattgcta taaattattc atttattaaa    420

gagtatacct tataattaat tgttgttatc atgttattat aatggataaa ataaaatata    480

aaaatatgtt ttctattaaa ataaaatgtt attagaggat tagtatatcg tctgttaaac    540

tcattttaat attggcgatt atgacctaag agaacatatg tgagaggcta ggcaaatata    600

ttaggtattg aaatattctt aataataatt ttatattaaa aatgctatta aattataaat    660

tattttatta aattgtattt aataataatt atgttaaaat atgattaaat tattcctcac    720

atttctctaa catgtttaac ttgctaccat ttctctgcgc caactctgtt taagaagggt    780

gttcattgac ttctcttatt cctcttttct ccttttatca gtttgtattt tcttaaattt    840

gtcttctatc atttaaatct ggtcttaaaa ggctataaaa gaataaatgt ttgatgaata    900

gttagattta tgttcattta tcaaattaaa taaataaata tgaacaagat ttcaaggctc    960

gtttattaaa cgaattgata cgaacaaaac ttattcaatt tatttatgct aatttaaaac    1020

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aatatatatg tttgtttatt tatttattgt taattatcca tgaacattat ttgtgaatat    1200

attcaattat gtgttcatga atatgttcgt tcaacttaaa cgaatgaaca tgatatatat    1260

atacatataa ttttaaacaa acgaacatga atagaaattt gaaattctta acaagcatga    1320

atcaaatata aatacatttt aaagaataaa caaatgacta taattagaag ttattcattt    1380

aaactcaatg agttatatgt ttttgccaat taattgcaat tttcaattaa aaagttcctt    1440

ggtatgatgt aaaattattt tacgaaggct aaattgattg ttaatttttg attaactact    1500

taattaattg taatttttaa ttaaaaatta attattttta gttattttac aaaagtttcg    1560

ttttatcatt taagctttcc ttttgggttt aatatataat ttggtactct aatttgacat    1620

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agttatacat tttggtactt gaaggtaaca atgttaattt ttttagcgtc tcattcgtat    1740

tttaaaatta atttgatgaa aattattaac aaataatatt ataaattaac ttttatcgaa    1800

tcaatcttaa aatctaaaat aaatcatatt tataagcttt tgtttgataa attaaatgca    1860

aaactaaata aattcacaat caaaactaaa tttattttat taacaaaatc atgaaaaatt    1920

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attaaaaatt taacaccatt atcattaaat atcaaaatat ataattttta tcaaatgcat    2040

acattaaatt agataataat aaaaaaaaaa gaagaagaag aagaactcaa attccccatt    2100

aaaaaaataa aaaatgatat gttaagcgtc attttactac gcattatttc tttggcaaat    2160

caacaatatg ttaacatagc tgaaaatcaa gataaattga gctgttttcg accgttggat    2220

cagccacaac acaattaaga taaccaatca gaaactgcca cgcatgcatc gcatcacaca    2280

atttgatcca acccaaaact ctatcctttt gctgctgccc tctcttgtcc tcgcctgctg    2340

ccactgccac tggcactaat gcg                                            2363

Claims (5)

1.一种来源于棉花的转录调控区DNA片段，其特征在于，所述DNA片段为P1，SEQ ID NO：1所示的第1位至第2363位的启动子区全部核苷酸序列，及其缺失突变体：P2、P3、P4和P5；P2，对应于SEQ IDNO：1第286位至2363位核苷酸；P3，对应于SEQ ID NO：1第740位至2363位核苷酸；P4，对应于SEQ ID NO：1第1693位至2363位核苷酸；P5，对应于SEQ ID NO：1第2154位至2363位核苷酸。

2.如权利要求1所述的转录调控区DNA片段，其特征在于，所述DNA片段能驱动与其相关联基因在植物绿色组织中转录。

3.一种含有任意一个权利要求1所述的转录调控区DNA片段的重组DNA，其特征在于：将其重新导入植物后，能够启动相关联基因的转录、表达。

4.含有权利要求1所述转录调控区DNA片段的表达载体。

5.权利要求1所述的转录调控区DNA片段的应用，其特征在于：P1、P2、P3、P4和P5任一DNA片段用作分子标记从棉花中再分离调控序列。

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