JP2970966B2 - 微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法 - Google Patents
微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、５−アミノレブリン酸
を５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害物質を実質
的に含有しない複合培地で生産することができる菌と、
該菌を複合培地で培養して５−アミノレブリン酸を高収
率で製造する方法とに関する。
を５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害物質を実質
的に含有しない複合培地で生産することができる菌と、
該菌を複合培地で培養して５−アミノレブリン酸を高収
率で製造する方法とに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】５−ア
ミノレブリン酸は、テトラピロール化合物のプレカーサ
として生体系中の重要な役割を果たしている化合物であ
る。この５−アミノレブリン酸は、除草剤，殺虫剤とし
て優れた効果を示し、しかも人畜に対して毒性を示さ
ず、分解性が高いため環境への残留性もないという優れ
た性質を有する天然化合物である（特許出願公表６１−
５０２８１４号，特開平２−１３８２０１号公報参
照）。しかし、この天然の５−アミノレブリン酸は、コ
ストが高く、除草剤や殺虫剤として使用するには実用性
に欠ける（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｅｅｋ／Ｏｃｔｏｂｅ
ｒ，２９，１９８４）。このような現状において、多く
の化学合成法が検討されている（例えば、特開平２−１
１１７４７号公報参照）が、未だ充分な方法が開発され
ていない。
ミノレブリン酸は、テトラピロール化合物のプレカーサ
として生体系中の重要な役割を果たしている化合物であ
る。この５−アミノレブリン酸は、除草剤，殺虫剤とし
て優れた効果を示し、しかも人畜に対して毒性を示さ
ず、分解性が高いため環境への残留性もないという優れ
た性質を有する天然化合物である（特許出願公表６１−
５０２８１４号，特開平２−１３８２０１号公報参
照）。しかし、この天然の５−アミノレブリン酸は、コ
ストが高く、除草剤や殺虫剤として使用するには実用性
に欠ける（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｅｅｋ／Ｏｃｔｏｂｅ
ｒ，２９，１９８４）。このような現状において、多く
の化学合成法が検討されている（例えば、特開平２−１
１１７４７号公報参照）が、未だ充分な方法が開発され
ていない。
【０００３】一方、光合成細菌等の微生物を用いた５−
アミノレブリン酸の製造方法も検討されている（特開平
２−９２２９３号公報，特開平３−１７２１９１号公報
等参照）。５−アミノレブリン酸は、生体系中におい
て、グリシンとコハク酸により生合成され、５−アミノ
レブリン酸デヒドラターゼにより２分子が縮合されてポ
ルフォビリノーゲンとなり、逐次反応して各種のテトラ
ピロール化合物へと代謝されていくが、この５−アミノ
レブリン酸デヒドラターゼは一般に強い酵素であり、通
常生体系中に５−アミノレブリン酸が蓄積されることは
稀である。
アミノレブリン酸の製造方法も検討されている（特開平
２−９２２９３号公報，特開平３−１７２１９１号公報
等参照）。５−アミノレブリン酸は、生体系中におい
て、グリシンとコハク酸により生合成され、５−アミノ
レブリン酸デヒドラターゼにより２分子が縮合されてポ
ルフォビリノーゲンとなり、逐次反応して各種のテトラ
ピロール化合物へと代謝されていくが、この５−アミノ
レブリン酸デヒドラターゼは一般に強い酵素であり、通
常生体系中に５−アミノレブリン酸が蓄積されることは
稀である。
【０００４】この５−アミノレブリン酸を蓄積させるた
めには、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性を
弱める必要がある。この方法として、一般には、レブリ
ン酸に代表される５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ
の活性阻害物質を添加する方法が知られている（上記の
特開平２−９２２９３号や特開平３−１７２１９１号の
微生物を用いた５−アミノレブリン酸の製造方法でも、
５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性阻害物質と
してレブリン酸が使用されている）。
めには、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性を
弱める必要がある。この方法として、一般には、レブリ
ン酸に代表される５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ
の活性阻害物質を添加する方法が知られている（上記の
特開平２−９２２９３号や特開平３−１７２１９１号の
微生物を用いた５−アミノレブリン酸の製造方法でも、
５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性阻害物質と
してレブリン酸が使用されている）。
【０００５】ところで、一般に、微生物は酵母エキス等
の天然成分を含んだ培地（複合培地）で培養を行うと、
最小培地で培養した場合に比べ、非常に高い増殖性を示
す。従って、光合成細菌等の微生物を用いた５−アミノ
レブリン酸の製造方法においても、その培養に複合培地
を使用することにより菌体濃度を数倍に上昇させること
ができる。しかしながら、光合成細菌は複合培地中では
高増殖性を示しながらも、５−アミノレブリン酸デヒド
ラターゼの活性阻害物質の添加、無添加にかかわらず、
５−アミノレブリン酸を殆ど生成しない場合が多い。
の天然成分を含んだ培地（複合培地）で培養を行うと、
最小培地で培養した場合に比べ、非常に高い増殖性を示
す。従って、光合成細菌等の微生物を用いた５−アミノ
レブリン酸の製造方法においても、その培養に複合培地
を使用することにより菌体濃度を数倍に上昇させること
ができる。しかしながら、光合成細菌は複合培地中では
高増殖性を示しながらも、５−アミノレブリン酸デヒド
ラターゼの活性阻害物質の添加、無添加にかかわらず、
５−アミノレブリン酸を殆ど生成しない場合が多い。
【０００６】本発明は、以上の諸点を考慮し、５−アミ
ノレブリン酸デヒドラターゼ阻害物質を実質的に含有し
ない複合培地中でも５−アミノレブリン酸を生産するこ
とのできる５−アミノレブリン酸生産菌を提案するこ
と、及び複合培地を使用することにより菌体を高濃度化
し、５−アミノレブリン酸を高収率で製造する方法を提
案することを目的とする。
ノレブリン酸デヒドラターゼ阻害物質を実質的に含有し
ない複合培地中でも５−アミノレブリン酸を生産するこ
とのできる５−アミノレブリン酸生産菌を提案するこ
と、及び複合培地を使用することにより菌体を高濃度化
し、５−アミノレブリン酸を高収率で製造する方法を提
案することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために研究を重ねた結果、（１）光合成細
菌であるロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）を変異させた
ものの中に、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害
物質を実質的に含有しない複合培地で５−アミノレブリ
ン酸を生産する菌株が存在することを確認し、更に
（２）上記の菌株を使用すれば、複合培地での菌体の高
濃度化が計られ、５−アミノレブリン酸を高収率で製造
できることを確認して、本発明を開発するに至った。
的を達成するために研究を重ねた結果、（１）光合成細
菌であるロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）を変異させた
ものの中に、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害
物質を実質的に含有しない複合培地で５−アミノレブリ
ン酸を生産する菌株が存在することを確認し、更に
（２）上記の菌株を使用すれば、複合培地での菌体の高
濃度化が計られ、５−アミノレブリン酸を高収率で製造
できることを確認して、本発明を開発するに至った。
【０００８】すなわち、本発明の５−アミノレブリン酸
生産菌は、ロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄｏ
ｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）を変異処理し
て得られるものであって、５−アミノレブリン酸デヒド
ラターゼ阻害物質を実質的に含有しない複合培地で５−
アミノレブリン酸を生産できる菌株である。その例とし
て、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１
２５４２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）又は微工研菌
寄第１２５４３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）として
寄託されたものが挙げられる。本菌株は、上記の性質を
持つ変異株の例である。
生産菌は、ロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄｏ
ｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）を変異処理し
て得られるものであって、５−アミノレブリン酸デヒド
ラターゼ阻害物質を実質的に含有しない複合培地で５−
アミノレブリン酸を生産できる菌株である。その例とし
て、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１
２５４２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）又は微工研菌
寄第１２５４３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）として
寄託されたものが挙げられる。本菌株は、上記の性質を
持つ変異株の例である。
【０００９】本発明の５−アミノレブリン酸の製造方法
は、上記した本発明の５−アミノレブリン酸生産菌を複
合培地で培養し、５−アミノレブリン酸を製造させるこ
とを特徴とする。
は、上記した本発明の５−アミノレブリン酸生産菌を複
合培地で培養し、５−アミノレブリン酸を製造させるこ
とを特徴とする。
【００１０】以下、本発明の５−アミノレブリン酸生産
菌及び５−アミノレブリン酸の製造方法の詳細を説明す
る。先ず、本発明の５−アミノレブリン酸生産菌は、ロ
ドバクター・セファロイデスを親株とし、これを変異し
て得られるものであって、上記のように５−アミノレブ
リン酸デヒドラターゼ阻害物質を実質的に含有しない複
合培地中で５−アミノレブリン酸を生産することができ
る。このような性質を有する本発明の５−アミノレブリ
ン酸生産菌の分離方法の詳細を以下に例示する。
菌及び５−アミノレブリン酸の製造方法の詳細を説明す
る。先ず、本発明の５−アミノレブリン酸生産菌は、ロ
ドバクター・セファロイデスを親株とし、これを変異し
て得られるものであって、上記のように５−アミノレブ
リン酸デヒドラターゼ阻害物質を実質的に含有しない複
合培地中で５−アミノレブリン酸を生産することができ
る。このような性質を有する本発明の５−アミノレブリ
ン酸生産菌の分離方法の詳細を以下に例示する。
【００１１】上記の親株の増殖に必要な成分を試験管に
分注し、滅菌した後、親株を接種し、光照射下において
静置培養する。この培養液を緩衝液で洗浄した後、変異
操作を行う。この変異操作としては、通常の変異手法を
採用することができる。例えば、紫外線，電離放射線等
の物理的変異原を寒天培地上の親株に照射したり、エチ
ルメタンスルフォネート（ＥＭＳ），Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ），エチル
ニトロソ尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤やブロモデオ
キシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログ等の化
学的変異原を添加した緩衝液中で親株を培養したり、あ
るいはトランスポゾン変異法等の生物的変異原を用いる
方法がある。
分注し、滅菌した後、親株を接種し、光照射下において
静置培養する。この培養液を緩衝液で洗浄した後、変異
操作を行う。この変異操作としては、通常の変異手法を
採用することができる。例えば、紫外線，電離放射線等
の物理的変異原を寒天培地上の親株に照射したり、エチ
ルメタンスルフォネート（ＥＭＳ），Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ），エチル
ニトロソ尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤やブロモデオ
キシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログ等の化
学的変異原を添加した緩衝液中で親株を培養したり、あ
るいはトランスポゾン変異法等の生物的変異原を用いる
方法がある。
【００１２】上記のような変異手法によって上記の親株
を変異した後、更に緩衝液で洗浄し、寒天培地等に撒
き、培養する。なお、この培養により生育した変異株の
中から、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害物質
を実質的に含有しない複合培地において５−アミノレブ
リン酸を生産することのできる菌株を選択するには、こ
れらの変異株を後述するような複合培地で培養し、培養
液中の５−アミノレブリン酸を測定し、５−アミノレブ
リン酸が生成されているか否かを確認することによって
行われる。
を変異した後、更に緩衝液で洗浄し、寒天培地等に撒
き、培養する。なお、この培養により生育した変異株の
中から、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害物質
を実質的に含有しない複合培地において５−アミノレブ
リン酸を生産することのできる菌株を選択するには、こ
れらの変異株を後述するような複合培地で培養し、培養
液中の５−アミノレブリン酸を測定し、５−アミノレブ
リン酸が生成されているか否かを確認することによって
行われる。
【００１３】以上のような分離・変異操作に用いる培地
には、変異前の親株の場合，変異後の変異菌の場合とも
同様のものでよく、グルタミン酸，リンゴ酸，酢酸，ピ
ルビン酸，乳酸，コハク酸，フマル酸，酒石酸，グルコ
ン酸，エタノール，グリセロール，グルコース，フルク
トース，マンニトール，ソルビトール，酵母エキス等の
炭素源の他に、一般的な培地成分、あるいは通常ロドバ
クター・セファロイデスの培養に用いられる成分が添加
される。一般的な培地成分としては、窒素源として、例
えばアンモニア，塩化アンモニウム，燐酸アンモニウ
ム，硫酸アンモニウム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモ
ニウム，硝酸アンモニウム，硝酸ナトリウム，尿素等の
無機窒素化合物や、酵母エキス，乾燥酵母，ペプトン，
肉エキス，コーンスティープリカー，カザミノ酸等の有
機窒素源を用いることができる。また無機塩類として、
例えばカリウム，ナトリウム，鉄，マグネシウム，マン
ガン，銅，カルシウム，コバルト等の各塩類等を用いる
ことができる。
には、変異前の親株の場合，変異後の変異菌の場合とも
同様のものでよく、グルタミン酸，リンゴ酸，酢酸，ピ
ルビン酸，乳酸，コハク酸，フマル酸，酒石酸，グルコ
ン酸，エタノール，グリセロール，グルコース，フルク
トース，マンニトール，ソルビトール，酵母エキス等の
炭素源の他に、一般的な培地成分、あるいは通常ロドバ
クター・セファロイデスの培養に用いられる成分が添加
される。一般的な培地成分としては、窒素源として、例
えばアンモニア，塩化アンモニウム，燐酸アンモニウ
ム，硫酸アンモニウム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモ
ニウム，硝酸アンモニウム，硝酸ナトリウム，尿素等の
無機窒素化合物や、酵母エキス，乾燥酵母，ペプトン，
肉エキス，コーンスティープリカー，カザミノ酸等の有
機窒素源を用いることができる。また無機塩類として、
例えばカリウム，ナトリウム，鉄，マグネシウム，マン
ガン，銅，カルシウム，コバルト等の各塩類等を用いる
ことができる。
【００１４】培養条件としては、親株，変異株ともｐＨ
約５〜１０，温度約１５〜４５℃，培養時間約１〜１０
日間で、菌体を成育させるには、親株、変異株とも約
０．５〜５０Ｋｌｕｘの光照射嫌気条件下が好ましく、
また好気暗条件下であっても良い。
約５〜１０，温度約１５〜４５℃，培養時間約１〜１０
日間で、菌体を成育させるには、親株、変異株とも約
０．５〜５０Ｋｌｕｘの光照射嫌気条件下が好ましく、
また好気暗条件下であっても良い。
【００１５】以上の分離・変異操作によって得られる菌
株の例であるＣＲ−２８６及びＣＲ−２Ｓ５は、親株と
ほぼ同様の菌学的性質を有し、かつ５−アミノレブリン
酸デヒドラターゼ阻害物質を実質的に含有しない複合培
地中で５−アミノレブリン酸を生産する。このＣＲ−２
８６及びＣＲ−２Ｓ５株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている〔微工研菌寄第１２５４２号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）及び第１２５４３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）〕。
株の例であるＣＲ−２８６及びＣＲ−２Ｓ５は、親株と
ほぼ同様の菌学的性質を有し、かつ５−アミノレブリン
酸デヒドラターゼ阻害物質を実質的に含有しない複合培
地中で５−アミノレブリン酸を生産する。このＣＲ−２
８６及びＣＲ−２Ｓ５株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている〔微工研菌寄第１２５４２号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）及び第１２５４３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）〕。
【００１６】次に、本発明の５−アミノレブリン酸の製
造方法の詳細を説明する。本発明方法では、上記したＣ
Ｒ−２８６又はＣＲ−２Ｓ５株に代表される本発明の５
−アミノレブリン酸生産菌を使用する。これらの５−ア
ミノレブリン酸生産菌を、複合培地で培養することによ
り、５−アミノレブリン酸を高収率で製造することがで
きる。
造方法の詳細を説明する。本発明方法では、上記したＣ
Ｒ−２８６又はＣＲ−２Ｓ５株に代表される本発明の５
−アミノレブリン酸生産菌を使用する。これらの５−ア
ミノレブリン酸生産菌を、複合培地で培養することによ
り、５−アミノレブリン酸を高収率で製造することがで
きる。
【００１７】以下、ＣＲ−２８６又はＣＲ−２Ｓ５株を
用いた５−アミノレブリン酸の製造方法を説明する。先
ず、培地としては、上記の分離・変異操作に用いる培地
に、酵母エキス，乾燥酵母，ペプトン，肉エキス，麦芽
エキス，コーンスティープリカー，カザミノ酸等の天然
成分を添加した複合培地を使用する。培養条件は、前述
の分離・変異操作の条件と同様である。ただし、この場
合、約０．５〜５０Ｋｌｕｘの光照射嫌気条件が望まし
い。また、培養液のｐＨは５〜１０の範囲内で、ＨＣｌ
水溶液またはＮａＯＨ水溶液を用いて一定に保つことに
より、より高濃度の５−アミノレブリン酸を生成するこ
とができる。
用いた５−アミノレブリン酸の製造方法を説明する。先
ず、培地としては、上記の分離・変異操作に用いる培地
に、酵母エキス，乾燥酵母，ペプトン，肉エキス，麦芽
エキス，コーンスティープリカー，カザミノ酸等の天然
成分を添加した複合培地を使用する。培養条件は、前述
の分離・変異操作の条件と同様である。ただし、この場
合、約０．５〜５０Ｋｌｕｘの光照射嫌気条件が望まし
い。また、培養液のｐＨは５〜１０の範囲内で、ＨＣｌ
水溶液またはＮａＯＨ水溶液を用いて一定に保つことに
より、より高濃度の５−アミノレブリン酸を生成するこ
とができる。
【００１８】更に、培養中に５−アミノレブリン酸のプ
レカーサであるグリシンとコハク酸を添加すると、より
高濃度の５−アミノレブリン酸を生成することができる
が、培養と同時にグリシンとコハク酸を添加すると、菌
株の増殖速度が遅くなるため、ある程度増殖した時点で
添加することが好ましい。添加量は、グリシンとコハク
酸のいずれの場合も、余り少な過ぎると添加効果がな
く、逆に余り多過ぎても菌体の生育が阻害されるため、
培地全体に対し、約１０〜８０ｍｍｏｌ／ｌ、特に約１
５〜４５ｍｍｏｌ／ｌの範囲内とすることが好ましい。
添加方法は、一度に全量添加してもよいが、連続的に又
は断続的に添加してもよい。
レカーサであるグリシンとコハク酸を添加すると、より
高濃度の５−アミノレブリン酸を生成することができる
が、培養と同時にグリシンとコハク酸を添加すると、菌
株の増殖速度が遅くなるため、ある程度増殖した時点で
添加することが好ましい。添加量は、グリシンとコハク
酸のいずれの場合も、余り少な過ぎると添加効果がな
く、逆に余り多過ぎても菌体の生育が阻害されるため、
培地全体に対し、約１０〜８０ｍｍｏｌ／ｌ、特に約１
５〜４５ｍｍｏｌ／ｌの範囲内とすることが好ましい。
添加方法は、一度に全量添加してもよいが、連続的に又
は断続的に添加してもよい。
【００１９】また、このとき、５−アミノレブリン酸デ
ヒドラターゼの活性阻害物質を添加することもできる。
例えば、この阻害物質としてレブリン酸を使用する場
合、レブリン酸の添加方法は、菌株の培養開始時（ある
いはグリシンとコハク酸の添加時）から一定の間隔で少
量（同量）づつ添加してもよいし、培養開始時（あるい
はグリシンとコハク酸の添加時）に全量添加しておいて
もよい。菌の生育が対数増殖期中期を過ぎた後、添加す
るとなおよい。
ヒドラターゼの活性阻害物質を添加することもできる。
例えば、この阻害物質としてレブリン酸を使用する場
合、レブリン酸の添加方法は、菌株の培養開始時（ある
いはグリシンとコハク酸の添加時）から一定の間隔で少
量（同量）づつ添加してもよいし、培養開始時（あるい
はグリシンとコハク酸の添加時）に全量添加しておいて
もよい。菌の生育が対数増殖期中期を過ぎた後、添加す
るとなおよい。
【００２０】以上のようにして得られる培養液又は反応
液中の５−アミノレブリン酸は、常法により精製するこ
とができる。例えば、溶剤抽出等の方法によって回収す
ることができ、このときカラムクロマトグラフィ等の公
知の精製方法を適宜併用することもできる。
液中の５−アミノレブリン酸は、常法により精製するこ
とができる。例えば、溶剤抽出等の方法によって回収す
ることができ、このときカラムクロマトグラフィ等の公
知の精製方法を適宜併用することもできる。
【００２１】
【作用】本発明の５−アミノレブリン酸生産菌は、５−
アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害物質を実質的に含
有しない複合培地中で、親株では生成しない５−アミノ
レブリン酸を生成し、培養液中に５−アミノレブリン酸
を多量に蓄積する作用をなす。また、本発明の５−アミ
ノレブリン酸の製造方法では、上記のような作用をなす
本発明の５−アミノレブリン酸生産菌を使用して、５−
アミノレブリン酸を製造する。このように、本発明の製
造方法では、複合培地を使用するため、従来より菌体を
高濃度化する作用があり、この結果として５−アミノレ
ブリン酸を高収率で製造することができる。
アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害物質を実質的に含
有しない複合培地中で、親株では生成しない５−アミノ
レブリン酸を生成し、培養液中に５−アミノレブリン酸
を多量に蓄積する作用をなす。また、本発明の５−アミ
ノレブリン酸の製造方法では、上記のような作用をなす
本発明の５−アミノレブリン酸生産菌を使用して、５−
アミノレブリン酸を製造する。このように、本発明の製
造方法では、複合培地を使用するため、従来より菌体を
高濃度化する作用があり、この結果として５−アミノレ
ブリン酸を高収率で製造することができる。
【００２２】
実施例１ 表１に示す光合成細菌用の最小培地であるグルタメート
・マレート培地（培地１）の培地成分を、水道水１リッ
トルに溶かして培地１を調製した。培地１のｐＨは６．
８であった。
・マレート培地（培地１）の培地成分を、水道水１リッ
トルに溶かして培地１を調製した。培地１のｐＨは６．
８であった。
【００２３】
【表１】
【００２４】上記の培地１に酵母エキス２ｇ／ｌを添加
して調製した複合培地（培地２）を、外径２１ｍｍの試
験管に１０ｍｌ入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、光合
成細菌であるロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄ
ｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ１２
２０３を１白金耳植え継ぎ、３０℃，５Ｋｌｕｘの光照
射下で３日間静置培養した。別の試験管に培地２を１０
ｍｌ分注し、滅菌した。この培地２に上記の培養液１を
３白金耳植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで８時間往復
振盪培養した。この培養液２を、洗浄のため、１５，０
００ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、その上清を捨て、
遠心分離前の培養液２と同量になるようにトリス・マレ
イン酸バッファ（ｐＨ６．０）に懸濁させた。この洗浄
操作を更に２度繰り返した。
して調製した複合培地（培地２）を、外径２１ｍｍの試
験管に１０ｍｌ入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、光合
成細菌であるロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄ
ｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ１２
２０３を１白金耳植え継ぎ、３０℃，５Ｋｌｕｘの光照
射下で３日間静置培養した。別の試験管に培地２を１０
ｍｌ分注し、滅菌した。この培地２に上記の培養液１を
３白金耳植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで８時間往復
振盪培養した。この培養液２を、洗浄のため、１５，０
００ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、その上清を捨て、
遠心分離前の培養液２と同量になるようにトリス・マレ
イン酸バッファ（ｐＨ６．０）に懸濁させた。この洗浄
操作を更に２度繰り返した。
【００２５】この後、再び１５，０００ｒｐｍにて３０
秒間遠心分離し、その上清を捨て、化学的変異原である
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）を１００μｇ／ｍｌの濃度になるように添加
し、３０℃で８０分間静置インキュベートした。
秒間遠心分離し、その上清を捨て、化学的変異原である
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）を１００μｇ／ｍｌの濃度になるように添加
し、３０℃で８０分間静置インキュベートした。
【００２６】このようにして処理した菌１を、上記と同
様の方法で３回洗浄した後、別の試験管に分注し、滅菌
した培地２に植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで２日間
往復振盪培養した。培地２に寒天１７ｇ／ｌを添加して
調製した培地を１２１℃で１５分間滅菌し、同じく滅菌
したシャーレに撒いて、寒天平板培地を調製した。この
シャーレに、上記の培養液（菌１の培養液）３を滅菌水
で１，０００倍に希釈して塗布し、３０℃で４日間培養
した。上記のようにして得られたコロニー約１４，００
０個を、それぞれ培地２に植菌し、３０℃，５Ｋｌｕｘ
で１．５日間静置培養した。
様の方法で３回洗浄した後、別の試験管に分注し、滅菌
した培地２に植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで２日間
往復振盪培養した。培地２に寒天１７ｇ／ｌを添加して
調製した培地を１２１℃で１５分間滅菌し、同じく滅菌
したシャーレに撒いて、寒天平板培地を調製した。この
シャーレに、上記の培養液（菌１の培養液）３を滅菌水
で１，０００倍に希釈して塗布し、３０℃で４日間培養
した。上記のようにして得られたコロニー約１４，００
０個を、それぞれ培地２に植菌し、３０℃，５Ｋｌｕｘ
で１．５日間静置培養した。
【００２７】次いで、グリシンとコハク酸をそれぞれ３
０ｍｍｏｌ／ｌ、レブリン酸を１５ｍｍｏｌ／ｌになる
ように添加し、培養を更に２日間続けた。その後、培養
液の上清から５−アミノレブリン酸を定量した。これら
約１４，０００個の変異菌株の中に、培地２中で５−ア
ミノレブリン酸を生成する菌株が数株存在していた。こ
の５−アミノレブリン酸を生成する菌株のうち生成量の
多い２株を、それぞれロドバクター セファロイデス
ＣＲ−２８６及びＣＲ−２Ｓ５と命名した。
０ｍｍｏｌ／ｌ、レブリン酸を１５ｍｍｏｌ／ｌになる
ように添加し、培養を更に２日間続けた。その後、培養
液の上清から５−アミノレブリン酸を定量した。これら
約１４，０００個の変異菌株の中に、培地２中で５−ア
ミノレブリン酸を生成する菌株が数株存在していた。こ
の５−アミノレブリン酸を生成する菌株のうち生成量の
多い２株を、それぞれロドバクター セファロイデス
ＣＲ−２８６及びＣＲ−２Ｓ５と命名した。
【００２８】実施例２ 実施例１で得られた変異菌株ＣＲ−２８６（微工研菌寄
第１２５４２号）及びＣＲ−２Ｓ５（微工研菌寄１２５
４３号）を、それぞれ各３本づつ試験管に入れた複合培
地（実施例１の培地２を使用）（培地量１０ｍｌ）に接
種し、３０℃，５Ｋｌｕｘの光照射下で１．５日間静置
培養した。次いで、グリシンとコハク酸をそれぞれ３０
ｍｍｏｌ／ｌ、レブリン酸を０，１０，３０ｍｍｏｌ／
ｌになるように添加し、培養を続けた。その後、培養液
中に生成される５−アミノレブリン酸の量の経時変化を
測定した。この結果を、表２に示す。
第１２５４２号）及びＣＲ−２Ｓ５（微工研菌寄１２５
４３号）を、それぞれ各３本づつ試験管に入れた複合培
地（実施例１の培地２を使用）（培地量１０ｍｌ）に接
種し、３０℃，５Ｋｌｕｘの光照射下で１．５日間静置
培養した。次いで、グリシンとコハク酸をそれぞれ３０
ｍｍｏｌ／ｌ、レブリン酸を０，１０，３０ｍｍｏｌ／
ｌになるように添加し、培養を続けた。その後、培養液
中に生成される５−アミノレブリン酸の量の経時変化を
測定した。この結果を、表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】表２から明らかなように、レブリン酸を添
加していない複合培地において、親株は５−アミノレブ
リン酸を生成しないのに対し、ＣＲ−２８６及びＣＲ−
２Ｓ５は５−アミノレブリン酸を生成することが判る。
しかも、ＣＲ−２８６及びＣＲ−２Ｓ５は、レブリン酸
の有無に関わらず、複合培地中で多量の５−アミノレブ
リン酸を生成していることが判る。また、５−アミノレ
ブリン酸の生成量は、一定の時間が経過すると、減少し
てしまう。これは、培養液中に添加したレブリン酸が代
謝等により減少してしまうことにより、５−アミノレブ
リン酸デヒドラターゼへの阻害効果が弱まり、５−アミ
ノレブリン酸が代謝されるためと解される。従って、５
−アミノレブリン酸を高効率で製造するには、所定の時
間経過後（すなわち、５−アミノレブリン酸の生成量が
ピークとなった時点で）、培養を停止すればよい。
加していない複合培地において、親株は５−アミノレブ
リン酸を生成しないのに対し、ＣＲ−２８６及びＣＲ−
２Ｓ５は５−アミノレブリン酸を生成することが判る。
しかも、ＣＲ−２８６及びＣＲ−２Ｓ５は、レブリン酸
の有無に関わらず、複合培地中で多量の５−アミノレブ
リン酸を生成していることが判る。また、５−アミノレ
ブリン酸の生成量は、一定の時間が経過すると、減少し
てしまう。これは、培養液中に添加したレブリン酸が代
謝等により減少してしまうことにより、５−アミノレブ
リン酸デヒドラターゼへの阻害効果が弱まり、５−アミ
ノレブリン酸が代謝されるためと解される。従って、５
−アミノレブリン酸を高効率で製造するには、所定の時
間経過後（すなわち、５−アミノレブリン酸の生成量が
ピークとなった時点で）、培養を停止すればよい。
【００３１】
【発明の効果】以上詳述したように、本発明の５−アミ
ノレブリン酸生産菌は、ロドバクター・セファロイデス
を親株として容易な操作で作出することができる。ま
た、本発明の５−アミノレブリン酸生産菌によれば、複
合培地中において、親株では殆ど生成しない５−アミノ
レブリン酸を生成し、培養液中に５−アミノレブリン酸
を多量に蓄積することができる。
ノレブリン酸生産菌は、ロドバクター・セファロイデス
を親株として容易な操作で作出することができる。ま
た、本発明の５−アミノレブリン酸生産菌によれば、複
合培地中において、親株では殆ど生成しない５−アミノ
レブリン酸を生成し、培養液中に５−アミノレブリン酸
を多量に蓄積することができる。
【００３２】そして、本発明の５−アミノレブリン酸の
製造方法によれば、上記した本発明の５−アミノレブリ
ン酸生産菌を使用して、５−アミノレブリン酸を高収率
で製造することができる。
製造方法によれば、上記した本発明の５−アミノレブリ
ン酸生産菌を使用して、５−アミノレブリン酸を高収率
で製造することができる。
【００３３】このとき、５−アミノレブリン酸生産菌を
複合培地で培養すると、最小培地で培養した場合に比べ
非常に高い増殖率を示す。従って、本発明の５−アミノ
レブリン酸の製造方法によれば、製造中の菌体濃度を数
倍に上昇させることができ、製造効率が大幅に向上し、
５−アミノレブリン酸の製造コストを低減することがで
きる。
複合培地で培養すると、最小培地で培養した場合に比べ
非常に高い増殖率を示す。従って、本発明の５−アミノ
レブリン酸の製造方法によれば、製造中の菌体濃度を数
倍に上昇させることができ、製造効率が大幅に向上し、
５−アミノレブリン酸の製造コストを低減することがで
きる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 1/20 C12P 13/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 ロドバクター・セファロイデスに属し、
５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害物質を実質的
に含有しない複合培地において、５−アミノレブリン酸
を蓄積することを特徴とする５−アミノレブリン酸生産
菌。 - 【請求項２】 工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第１２５４２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）と
して寄託されたことを特徴とする請求項１記載の５−ア
ミノレブリン酸生産菌。 - 【請求項３】 工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第１２５４３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）と
して寄託されたことを特徴とする請求項１記載の５−ア
ミノレブリン酸生産菌。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の５−ア
ミノレブリン酸生産菌を複合培地で培養することを特徴
とする５−アミノレブリン酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28930391A JP2970966B2 (ja) | 1991-10-08 | 1991-10-08 | 微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28930391A JP2970966B2 (ja) | 1991-10-08 | 1991-10-08 | 微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0595782A JPH0595782A (ja) | 1993-04-20 |
| JP2970966B2 true JP2970966B2 (ja) | 1999-11-02 |
Family
ID=17741437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28930391A Expired - Fee Related JP2970966B2 (ja) | 1991-10-08 | 1991-10-08 | 微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2970966B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103320366A (zh) * | 2013-07-10 | 2013-09-25 | 南京工业大学 | 一株厌氧利用合成培养基高产丁二酸大肠杆菌的筛选及其应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK1018546T3 (da) | 1997-05-27 | 2005-07-25 | Cosmo Oil Co Ltd | Mikroorganismer, der producerer 5-aminolevulinsyre, og fremgangsmåder til fremstilling af 5-aminolevulinsyre ved anvendelse heraf |
-
1991
- 1991-10-08 JP JP28930391A patent/JP2970966B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103320366A (zh) * | 2013-07-10 | 2013-09-25 | 南京工业大学 | 一株厌氧利用合成培养基高产丁二酸大肠杆菌的筛选及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0595782A (ja) | 1993-04-20 |
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