DE69801266T2

DE69801266T2 - Diazoniumionen enthaltende Reagentien und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE69801266T2
Application number: DE69801266T
Authority: DE
Inventors: Jennifer S. Bournique; Matthew F. Gnezda; Tracey E. Gordon; Sharanpal K. Walker
Original assignee: Roche Diagnostics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 1998-11-17
Publication date: 2002-04-18
Anticipated expiration: 2018-11-18
Also published as: JPH11228517A; JP3569139B2; CA2254357A1; CA2254357C; US5935861A; DE69801266D1; ES2161011T3; EP0918220A1; EP0918220B1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft stabile Diazoniumion-Verbindungen und Verfahren für deren Verwendung bei der Durchführung von Analysen für den Nachweis und die quantitative Analyse von Bilirubin in Plasma, Blut oder anderen Proben.

Technischer Hintergrund

Bilirubin ist eine Hauptkomponente des Gallenpigments in Körperflüssigkeiten. Das im Serum vorhandene Bilirubin ist ein Zersetzungsprodukt von Häm, das vom Hämoglobin in den roten Blutzellen stammt. Zwei Fraktionen von Bilirubin liegen in Blutserum vor, unkonjugiertes und konjugiertes Bilirubin. Konjugiertes Bilirubin ist Bilirubin, das mit Glucuronsäure in der Leber konjugiert und wasserlöslich gemacht wird. Das konjugierte Bilirubin wird auch als "direktes" Bilirubin bezeichnet, und das nicht mit Glucuronsäure konjugierte Bilirubin wird als "indirektes" Bilirubin oder unkonjugiertes Bilirubin bezeichnet. Normalerweise sind nur kleine Mengen Bilirubin im Blut anzutreffen, wobei die normale Konzentration für direktes Bilirubin bis zu etwa 0,25 mg/100 ml Serum (≤4,3 umol/l) und für indirektes Bilirubin bis zu etwa 0,75 mg/100 ml Serum (≤12,7 umol/l) beträgt. Der Gehalt an Bilirubin im Blut nimmt mit vermehrter Zersetzung von Hämoglobin und bei nachlassender Leberfunktion zu.
Die Bestimmung der beiden Bilirubin-Fraktionen ist in der medizinischen Diagnose von Bedeutung. Normalerweise wird Bilirubin mit der Gallenflüssigkeit aus der Gallenblase in den Darm sezerniert. Dieser Mechanismus ist jedoch bei verschiedenen Krankheitszuständen gestört. So kann z. B. das Bilirubin-Konjugationssystem im Falle eines vermehrten Hämoglobinabbaus überlastet sein, so daß sich das Verhältnis von direktem/indirektem Bilirubin ändert. Bei einer Schädigung der Leberzellen, Abflußstörungen in den Gallenkapillaren oder Gallengangverschlüssen ist die Sekretion von Bilirubin über die Gallenblase in den Darm vermindert oder völlig blockiert. Dies führt zu erhöhten Bilirubinkonzentrationen im Blut. Dadurch können die absolute Konzentration des Bilirubins und das Verhältnis von direktem/indirektem Bilirubin beeinflußt werden. Durch Messen der beiden Werte lassen sich so wichtige diagnostische Schlußfolgerungen hinsichtlich Natur und Lokalisierung bestimmter Krankheiten von Leber, Gallenblase und Intestinaltrakt vornehmen. Allgemein wird normalerweise zunächst das Gesamtbilirubin bestimmt und danach der Gehalt an direktem Bilirubin gemessen. Der Anteil an indirektem Bilirubin wird aus der Differenz der beiden Werte erhalten. Verfahren zur Messung von Serumbilirubin sind bei Doumas und Wu, Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 28, 415-445 (1991); und bei Lott und Doumas, Clin Chem. 39, 641-647 (1993), besprochen.
Analytische Tests, die die quantitative Analyse von Bilirubin ermöglichen, sind klinisch sehr nützlich. Die verbreitetste Analyse auf Bilirubin ist das sogenannte Diazo-Verfahren. Beim. Diazo-Verfahren wird eine Probe, die mutmaßlich Bilrubin enthält, mit einer Reagenzienzusammensetzung zusammengebracht, die ein Diazonium-Salz enthält. Das Diazonium-Salz reagiert mit Bilirubin unter Bildung zweier Azobilirubin-Fragmente. Das Azobilirubin hat einen Extinktionskoeffizienten, der höher ist als derjenige von Bilirubin selbst, und ist problemlos nachweisbar.
Es werden zahlreiche Diazonium-Salze beim Diazo-Verfahren zur Bilirubin-Bestimmung verwendet. Beispielsweise kuppelt diazotierte Sulfanilsäure an Bilirubin unter Bildung eines gelben Diazobilirubin-Pigments. Die Einzelheiten des Diazo-Verfahrens zur quantitativen Analyse von Bilirubin sind beschrieben bei Doumas et al., Clin. Chem. 31, 1779-1789 (1985); M. Michaelsson, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 13 (Suppl.), 1-80 (1961); H. Malloy, J. Biol. Chem. 119, 481 (1939); und Z. K. Shihabi et al., American Journal of Medical Technology 43(10), 1004-1007 (1977), deren Offenbarungen hiermit erwähnt seien. Andere Diazonium-Salze wie etwa 2,4- und 2,5-Dichlorphenyldiazonium-Salze werden zum Nachweis von Bilirubin in Serum und Urin verwendet. Bekanntermaßen sind jedoch die Verfahren, bei denen diese Diazonium-Salze verwendet werden, relativ unempfindlich, und manche dieser Diazonium-Salze sind im trockenen Zustand explosiv instabil, d. h. zersetzen sich durch Schlag; US-Patent Nr. 4 468 467 an Babb et al.. Eine andere Diazonium- Verbindung, die für die Bestimmung von Bilirubin verwendet wird, ist diazotiertes Sulfanilamid; Chin-Chung Chen et al., Clin. Chem. 26, 990 (1980). SynermedTM-Gesamtbilirubin-Reagens (Synermed, Inc., Quebec, Kanada) ist im Handel erhältlich und enthält ein stabilisiertes Diazonium-Salz von 3,5-Dichloranilin, d. h., 3,5-Dichlorphenyldiazonium-tetrafluoroborat, das mit Bilirubin unter Bildung von Azobilirubin reagiert, welches bei 540 nm maximal absorbiert. Das gebildete rote Azobilirubin kann durch Zugabe von Alkali in einen blauen Farbstoff überführt werden, der bei 600 nm absorbiert. Coffein und Tenside werden als Reaktionsbeschleuniger verwendet.
US-Patent Nr. 4 468 467 an Babb et al. beschreibt bestimmte substituierte: Sulfanilamid- und Carbonamid-Diazonium-Salze für Bilirubin-Analysen. US-Patent Nr. 4 902 477 an Katsuyama et al. offenbart ein analytisches Element zur quantitativen Analyse von Bilirubin mit Hilfe eines Diazo-Verfahrens, das bestimmte Aryldiazonium- Salze umfaßt, die in der Arylgruppe einen Substituenten aufweisen, bei dem es sich um eine Alkoxycarbonyl- Gruppe, eine Alkylaminosulfonyl-Gruppe oder eine Alkylaminocarbonyl-Gruppe handelt. US-Patent Nr. 4 892 833 an Weiss et al. offenbart Aryldiazonium-Salze zur Verwendung bei der Bilirubin-Bestimmung, bei denen die Arylgruppe mit Halogengruppen und Niederalkoxygruppen substituiert ist.
US 4 268 437 offenbart ein Verfahren zur kontinuierlichen Diazotierung eines primären aromatischen Amins.
US 3 880 588 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin mit Teststreifen, umfassend ein Adsorbens mit einem Diazoniumion.
Bei vielen der bei gängigen Analysen verwendeten Analysenreagenzien bestehen Probleme, die mit deren Anwendung verbunden sind. Bei automatisierten Bilirubin-Analysen zum Beispiel, bei denen ein im Handel erhältliches Dichloranilin-Diazoniumtetrafluoroborat-Salz verwendet wird, wechselwirkt die Diazonium-Form der Chloranilin- Derivate bekanntermaßen stark mit Indican, einer Verbindung, die im Serum von Nierendialysepatienten anzutreffen ist, so daß sie für diese Probenart ungeeignet wird. Auch hämolysierte Proben können aufgrund weitreichender Störungen durch Hämoglobin bei vielen dieser Analysen nicht verwendet werden. Einige dieser Reagenzien weisen eine relativ niedrige Löslichkeit in wäßrigen Systemen auf, so daß sie in diesen Systemen weniger brauchbar sind. Außerdem sind viele dieser Reagenzien in flüssiger Form instabil, können nicht ohne weiteres transportiert werden und haben keine brauchbare Lebensdauer.
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Diazoniumion-Verbindungen, die als Analysenreagenzien für den Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeitsproben eingesetzt werden können. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Diazoniumion-Verbindungen, die thermisch stabil sind, so daß ein Transport über größere Entfernungen eher möglich ist. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Diazoniumion-Verbindungen, die thermisch stabil sind, lange Lebensdauer aufweisen und unter Beibehaltung ihrer Wirksamkeit gelagert werden können, zum Beispiel über Zeiträume von einem Jahr oder länger.

Offenbarung der Erfindung

Es werden Diazoniumionen verfügbar gemacht, die als Reagenzien für die Analyse des Bilirubingehalts in einer Probe wie z. B. einer Körperflüssigkeitsprobe brauchbar sind. Ebenfalls verfügbar gemacht werden Analysenverfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Bilirubin in einer Probe, wobei eine Probe, die mutmaßlich Bilirubin enthält, mit einer Diazoniumion-Verbindung wie hierin offenbart zusammengebracht und dann das Produkt der Reaktion von Diazoniumion und Bilirubin z. B. spektrophotometrisch nachgewiesen wird.
In einer Ausführungsform werden Diazoniumion-Verbindungen der Formel I bereitgestellt: Formel I
worin wenigstens eines der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; oder R&sub5; H, Alkyl, Sulfonat oder Nitro ist, und wobei die Verbindung imstande ist, mit Bilirubin in einer Probe unter Bildung eines nachweisbaren Produkts zu reagieren.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, worin: eines der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; oder R&sub5; C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, bevorzugt Methyl ist;
eines der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; oder R&sub5; Sulfonat oder Nitro, bevorzugt Nitro ist; und
die übrigen R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; H sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Diazoniumion 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion (2-Methyl-3-nitro-1-benzoldiazoniumion) mit der Struktur: 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion
Zu den weiteren bevorzugten Verbindungen zählt das 4-Aminotoluol-3-sulfonsäure-Diazoniumion.
Bevorzugte Verbindungen sind Diazoniumion-Verbindungen, die aus Vorläuferverbindungen mit einer Amingruppe gebildet werden, wobei die Vorläufer-Aminverbindungen eine Löslichkeit von wenigstens etwa 0,038 mg/ml in sauren wäßrigen Lösungen aufweisen, z. B. in 100 mM HCl bei einem pH von etwa 1,0.
Bereitgestellt werden auch Reagenzienzusammensetzungen, die Diazoniumionen enthalten. Die Reagenzienzusammensetzungen können in flüssiger oder fester Form vorliegen und können zudem auch andere Komponenten wie etwa Puffer, Träger und/oder Lösungsvermittler enthalten. Ebenfalls bereitgestellt werden Salze, die das Diazoniumion und ein Gegenanion enthalten. Zu den bevorzugten Salzen gehören Tetrafluoroborate, Hexafluorophosphate und Metalldoppelsalze wie etwa die Zinkdoppelchloride.
Mit den hierin offenbarten Analyseverfahren läßt sich die Gesamtmenge Biliruhin in einer Probe quantifizieren. In einer anderen Ausführungsform enthält die Probe direktes und indirektes Bilirubin, und das Verfahren kann des weiteren die Erfassung der Konzentration von direktem und indirektem Bilirubin in der Probe umfassen. Somit lassen sich die Gehalte von direktem, indirektem und Gesamtbilirubin in einer Probe messen und mit dem Vorliegen oder Fehlen einer Erkrankung oder Störung z. B. an Leber, Gallenblase oder Darm korrelieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abb. 1 ist ein Diagramm der Extinktion gegen die Gesamtbilirubin-Konzentration, erhalten bei einer Bilirubin-Analyse mit 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion.

Beste Durchführungsart der Erfindung

Es werden Diazonium-Verbindungen bereitgestellt, die als Analysenreagenzien brauchbar sind. Die Diazonium-Verbindungen sind insbesondere bei Analysen zum Nachweisen und Quantifizieren von Bilirubin in einer Körperflüssigkeitsprobe brauchbar. In einer Ausführungsform werden Diazoniumverbindungen der nachstehenden allgemeinen Formel I bereitgestellt: Formel I
worin wenigstens eines der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; oder R&sub5; H, Alkyl, Sulfonat oder Nitro ist, und wobei die Verbindung imstande ist, mit Bilirubin in einer Probe unter Bildung eines nachweisbaren Produkts zu reagieren. Zu den bevorzugten Alkylgruppen gehören C&sub1;-C&sub3;-Alkylgruppen, darunter Methyl, Ethyl und Propyl. Eine besonders bevorzugte Alkylgruppe ist Methyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eines der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; oder R&sub5; C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, bevorzugt Methyl;
ist eines der R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; oder R&sub5; Sulfonat oder Nitro, bevorzugt Nitro; und
sind die übrigen R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; H.
Zu den beispielhaften Verbindungen gehört 4-Aminotoluol-3-sulfonsäure-Diazoniumion. Zu den weiteren beispielhaften Verbindungen zählen die Diazoniumionen von 2-Methyl-4-nitroanilin, 2-Methyl-5-nitroanilin, 2-Methyl- 5-nitroanilin-hydrat, 2-Methyl-6-nitroanilin und 5-Methyl-2-nitroanilin.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung das nachstehend gezeigte Diazoniumion von 2-Methyl- 3-nitroanilin: 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion
Die Verbindungen können vorteilhaft bei Analysen zum Nachweisen und Quantifizieren von Bilirubin in einer Körperflüssigkeitsprobe, etwa einer Probe mit Serum, verwendet werden. Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind diejenigen, die thermisch stabil sind und eine lange Lebensdauer aufweisen. Die Verbindungen können zur Feststellung von Krankheitszuständen wie z. B. beeinträchtigte Funktion von Leber, Gallenblase oder Intestinaltrakt verwendet werden.
Bevorzugte Verbindungen sind Diazoniumion-Verbindungen, die aus Vorläuferverbindungen mit einer Amingruppe gebildet werden, wobei die Vorläuferverbindungen eine Löslichkeit von wenigstens etwa 0,038 mg/ml oder gegebenenfalls wenigstens etwa 0,5 mg/ml oder bevorzugt wenigstens etwa 2,0 mg/ml in sauren wäßrigen Lösungen aufweisen, z. B. 100 mM HCl bei einem pH von etwa 1,0. Zum Beispiel hat 2-Methyl-3-nitroanilin, der Vorläufer von 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion, eine Löslichkeit von etwa 2,3 mg/ml in 100 mM HCl bei einem pH von etwa 1,0.

Synthese von Diazonium-Verbindungen

Die Diazonium-Verbindungen können synthetisiert werden unter Anwendung von Verfahren zur Erzeugung von Diazoniumkationen, die in der Fachwelt bekannt sind; Heinrich Zollinger, "Diazo Chemistry I, Aromatic and Heteroaromatic Compounds", VCH Puolishers, New York, NY, 1994, Kapitel 2. Allgemein lassen sich die Diazoniumionen herstellen durch Diazotierung des freien Arylamins mit Natriumnitrit und einer Säure wie etwa Salzsäure, um so das gewünschte Diazonium-Salz zu ergeben. Das gewünschte Anion für das Diazonium-Salz kann durch Beigabe eines Salzes des Anions zur Diazotierungsreaktionsmischung bereitgestellt werden. Wird z. B. Natriumhexafluorophosphat der Reaktionsmischung beigegeben, so wird das Hexafluorophosphat-Diazoniumsalz erzeugt. Alternativ kann das Tetrafluoroborat-Salz hergestellt werden. Zu den weiteren Salzen zählen die Metalldoppelsalze, insbesondere das Zinkdoppelchlorid ZnCl&sub4;²&supmin;. Die Zusammensetzungen im Umfang der Erfindung enthalten somit Salze der Diazoniumkationen.
Eine beispielhafte Synthese ist die Synthese von 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion (2). Bei diesem Ausführungsbeispiel wird 2-Methyl-3-nitroanilin (1) durch Reaktion mit Natriumnitrit in saurem wäßrigen Medium in das Diazoniumion (2) überführt. Die Reaktion ist nachstehend in Schema I erläutert. Das 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion (2) kann mit Bilirubin unter Bildung eines nachweisbaren Produkts reagieren und ist somit brauchbar bei Analysen zum Nachweisen und Quantifizieren von Bilirubin in einer Probe. Vorteilhaft weist auch die Vorstufe von 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion, 2-Methyl-3-nitroanilin, gute Löslichkeit in wäßrigen Systemen auf. 2-Methyl-3-nitroanilin hat eine Löslichkeit von wenigstens etwa 2,3 mg/ml in 100 mM HCl bei einem pH von etwa 1,0. Schema I

Reagenzienzusammensetzungen

Reagenzienzusammensetzungen, die die Diazoniumion- Verbindungen zur Verwendung bei Analysen enthalten, können in einer Vielzahl von Formen bereitgestellt werden, darunter Lösungen und feste Formen.
In einer Ausführungsform liegt die Reagenzienzusammensetzung in Form einer stabilen flüssigen Reagenzienlösung vor. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Diazoniumion-Verbindung in einer sauren wäßrigen Lösung mit einer bevorzugten Konzentration von etwa 0,25 mM bis 15 mM bei einem pH von unterhalb etwa 7, vorzugsweise etwa pH 0,5 bis 2 bereitgestellt. Die feste oder flüssige Reagenzienzusammensetzung kann zudem gegebenenfalls weitere beigegebene Stoffe wie etwa Puffer oder Lösungsvermittler enthalten.
Zu den verwendbaren Puffersystemen gehören Citronensäure/Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Citronensäure/wäßrige Natriumhydroxidlösung, Essigsäure/wäßrige Natriumhydroxidlösung, Essigsäure/Natriumacetat, Kaliumhydrogenphthalat/wäßrige Natriumhydroxidlösung oder Phosphatpuffer. Zu den bevorzugten Puffersystemen zählt ein Acetat-System, etwa das System Natriumacetat/Essigsäure.
Die bei den Bilirubin-Analysen verwendeten Lösungen können Lösungsvermittler und Detergenzien enthalten. Zu den beispielhaften Lösungsvermittlern gehören Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Dioxan und verschiedene Glycole wie etwa Polyethylenglycol. Zu den weiteren beispielhaften Lösungsvermittlern zählen nicht- ionische Detergenzien wie etwa polyoxyethyliertes Octylphenol (z. B. Triton® X 100, Rahm & Haas, Philadelphia, PA), das in einer Konzentration von z. B. 0,1 bis 1,0% (Gew./Vol.) zugegeben werden kann. Zu den weiteren Beispielen für verwendbare nichtionische Detergenzien gehören Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (z. B. Tween® 20, ICI, Wilmington, DE), Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat (Tween® 40, ICI, Wilmington, DE), sowie Polyglycolether-Tenside wie etwa Tergitol® 15 S-30 (Union Carbide Corp., Houston, TX). Ionische Detergenzien wie etwa Alkylbetain (Empigen BB, Albright und Wilson, Ashland, VA) können ebenfalls Verwendung finden. In einer Ausführungsform werden wäßrige Testlösungen bereitgestellt, die einen Lösungsvermittler enthalten, etwa 1 bis 13% (Gew./Vol.) Lösungsvermittler, wobei der pH kleiner als 7 ist, vorzugsweise etwa pH 0,5 bis 7.
Die Diazoniumion-Verbindung kann in einer Formulierung in Kombination mit irgendeinem aus einer Vielzahl von Materialien wie etwa Träger, Puffer und/oder Lösungsvermittler bereitgestellt werden. Zu den geeigneten Trägern zählt Wasser, bevorzugt eine saure wäßrige Lösung. Salze, die die Diazoniumion-Verbindung und ein Gegenanion enthalten, werden ebenfalls bereitgestellt. Zu den bevorzugten Salzen gehören Tetrafluoroborat, Hexafluorophosphat und die Metalldoppelsalze, etwa die Zinkdoppelchloride.
Die Reagenzienzusammensetzungen können auch die Diazoniumion-Verbindung oder ein Salz derselben und eine Säure enthalten. Die Diazoniumion-Verbindung oder deren Salz können bei saurem pH gelagert werden. Liegt die Reagenzienzusammensetzung in Form einer wäßrigen Lösung vor, so zählen Mineralsäuren wie etwa Salzsäure und Schwefelsäure zu den brauchbaren Säuren. Für eine Trockenreagenzienzusammensetzung können Säuren, die im wasserfreien Zustand fest sind, wie etwa Malein-, Sulfosalicyl-, Wein-, Bernstein-, Cyclohexansulfamin-, p-Toluolsulfon- und Citronensäure verwendet werden. Enthält die Reagenzienzusammensetzung einen Träger, so kann eine Säure beigegeben werden, die die Trägermatrix nicht zersetzt. Alternativ kann eine Kombination von Materialien beigegeben werden, die imstande sind, die Säure bei Kontakt mit Wasser in situ zu generieren, etwa ein festes Addukt eines Friedel-Crafts-Salzes und einer organischen Lewis- Base mit einer schwachen Säure, etwa einer organischen Säure wie in US-Patent Nr. 3 814 586 beschrieben. Die Gegenwart der Säure kann das Kuppeln von Diazoniumion- Salz mit Bilirubin fördern. Die Menge an Säure im Reagens kann variieren. Zum Beispiel kann eine wäßrige Lösung der Diazoniumion-Verbindung mit Säuren in wirksamer Menge versetzt werden, um eine Reagenzienlösung zu ergeben, die einen pH kleiner als etwa 7, vorzugsweise etwa pH 0,5 bis 2 aufweist. Die Säure kann auch in einem Trockenanalysenelement vorliegen, das bei der Analyse verwendet wird.
Die Reagenzienzusammensetzung, die die Diazoniumion- Verbindung enthält, kann in einer Vielzahl von festen Formen oder einer Kombination von Formen hergestellt werden. Die Reagenzienzusammensetzung kann als Pulver oder in Form von Tabletten hergestellt werden, die mit Wasser oder einem geeigneten Verdünnungsmittel auf die gewünschte Konzentration verdünnt werden, um eine Reagenzienlösung zu ergeben. Es können die Techniken zur Herstellung fester Formen von Reagenzienzusammensetzungen und die Materialien wie z. B. Füllstoffe und Bindemittel eingesetzt werden, die in der Fachwelt bekannt sind.
Ein Trockenanalysenelement, das die Reagenzienzusammensetzung auf einem geeigneten Trägermaterial enthält, kann ebenfalls verwendet werden. Bei Kontakt des Trägermaterials mit einer Probe kann sich die Reagenzienzusammensetzung lösen, und sodann wird das Vorhandensein von Bilirubin in der Probe nachgewiesen. Es können Trockenanalysenelemente formuliert werden, die eine mit der Reagenzienzusammensetzung imprägnierte Trägermatrix umfassen. Brauchbare Trägermaterialien sind unlöslich und bewahren ihre strukturelle Unversehrtheit, wenn Wasser oder physiologische Flüssigkeiten wie etwa Serum oder Urin auf sie einwirken. Zu den beispielhaften Matrices zählen Papier, Zellstoff, Holz, Glasfaser sowie Gewebe und Faservliese. Ein Trockenanalysenelement kann z. B. durch Aufbringen einer Lösung, die die Reagenzienzusammensetzung enthält, auf die Matrix und anschließendes Trocknen hergestellt werden.

Analysen

In einer Ausführungsform werden Reagenzienzusammensetzungen, die stabile Diazoniumion-Verbindungen enthalten, in Lösung bereitgestellt, die bei einer Analyse zum Nachweisen oder Quantifizieren von Bilirubin in einer Körperflüssigkeitsprobe verwendet werden kann. Das Bilirubin in der Probe reagiert in saurer Lösung mit der Diazoniumion-Verbindung unter Bildung von Azobilirubin, das bei etwa 540 nm maximal absorbiert. In alkalischen Medien wird der Chromophor z. B. nach etwa 600 nm verschoben. Das Reaktionsprodukt kann mit Hilfe eines Spektrophotometers oder mit anderen Analysengeräten nachgewiesen werden, die imstande sind, die Extinktion bei der gewünschten Wellenlänge zu messen. Beispielsweise kann die Hitachi-Reihe der Analysengeräte (Boehringer Mannheim Diagnostics Inc., Indianapolis, IN) verwendet werden. Die Gehalte von Bilirubin in einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe können so mit Hilfe der Diazonium-Verbindungen genau gemessen werden.
Für viele diagnostische Anwendungen ist die Quantifizierung von direktem Bilirubin neben Gesamtbilirubin von Bedeutung. Verfahren zur Quantifizierung von direktem, indirektem und Gesamtbilirubin unter Verwendung von Diazoreagenzien sind in der Fachwelt entwickelt. Siehe z. B. Lott und Doumas, Clin. Chem. 39, 641-647 (1993); und Doumas und Wu, Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 28, 415-445 (1991).
Zur Quantifizierung von Gesamtbilirubin wird die Diazonium-Verbindung mit einer Probe, die mutmaßlich Bilirubin enthält, in Gegenwart eines Beschleunigers wie etwa Coffein umgesetzt. Nachdem die Reaktion (etwa 10 Minuten) vollständig ist, wird das Azobilirubin-Produkt spektrophotometrisch durch die Extinktion bei etwa 540 nm nachgewiesen. Alternativ kann die Lösung z. B. durch Zugabe von alkalischem Tartrat-Reagens alkalisch gemacht und die Extinktion bei etwa 598 nm gemessen werden. Zu den weiteren verwendbaren beschleunigenden Reagenzien (oder Promotoren), die die Bildung von Diazobilirubin fördern, gehören Dyphyllin, Natriumacetat, Natriumbenzoat und Gummi arabicum. Die Extinktion wird mit Hilfe einer Blindprobe erfaßt, die die Analysekomponenten ohne die Bilirubin-Probe enthält. Zur Herstellung von Standardlösungen zur Eichung der Bilirubin- Analyse kann Bilirubin vom National Institute for Standards and Technology (NIST), SRM 916a, verwendet werden.
Bei einigen diagnostischen Anwendungen ist es wichtig, direktes Bilirubin ohne Reaktion der Diazonium-Verbindung mit dem unkonjugerten Bilirubin nachweisen zu können. Im allgemeinen werden die direkt reagierenden Bilirubine (Bilirubinmono- und -diglucuronid und Delta- Bilirubin) mit Diazoniumion ohne Beschleuniger umgesetzt. Bei der Analyse wird die Diazoniumion-Verbindung mit der Bilirubin-Probe, etwa einer Serumprobe, zusammengegeben. Weitere Komponenten der Analysenlösung können Wasser, Puffer, Stabilisatoren und HCl sein. Am Ende der Kupplungsreaktion (etwa 10 Minuten) wird die Extinktion des Azopigments um 540 nm oder nach Zugabe einer Base wie z. B. alkalischem Tartrat um 598 nm gemessen. Der pH ist vorzugsweise so niedrig wie möglich, um die Reaktion des unkonjugierten Bilirubins zu verhindern. Um unkonjugiertes Bilirubin von der Reaktion auszuschließen, kann die Serumprobe mit HCl (zum Beispiel 100 mmol/l) verdünnt und wenigstens etwa 5 Minuten lang vor der Zugabe des Diazo-Reagens inkubiert werden.
Die Analyse wird bevorzugt in wäßrigen Systemen durchgeführt. In einer beispielhaften Analyse auf Gesamtbilirubin in einer Probe, etwa einer Plasma- oder Serumprobe, werden zwei Analysenformulierungen bereitgestellt, eine Formulierung mit einem sauren Lösungsvermittler, (hierin als Gesamtbilirubin-Formulierung R1 bezeichnet) und eine Reagenzienformulierung, (hierin als Gesamtbilirubin-Formulierung R2 bezeichnet), welche die Diazoniumion-Verbindung (siehe Tabellen 1 und 2) enthält. Die hierin beschriebene Analyse kann z. B. durch Ändern der Komponenten der Formulierungen R1 und R2 und der Inkubationszeiten oder -temperaturen abgewandelt werden. Die folgenden Analysebedingungen und Formulierungen seien beispielhaft gegeben.
Bei der Analyse werden 4-6 ul der Probe zu 250 ul der Gesamtbilirubin-Formulierung R1 gegeben und vermischt (Verhältnis Probe/Formulierung R1 etwa 1 : 62 bis etwa 1 : 42). Erweist sich die Konzentration von Bilirubin in der Probe größer als 35 mg/dl, so kann die Probe mit physiologischer Kochsalzlösung 1+1 verdünnt und erneut analysiert werden. Die Mischung wird z. B. etwa 3 bis 5 Minuten lang bei 25, 30 oder 37ºC inkubiert. Für jede Patienten-, Standard- und Kontrollprobe wird eine Blindprobe mitgeführt. Nach etwa 5 Minuten werden 65 ul der sauren Gesamtbilirubin-Formulierung R2 zugesetzt (Volumen gleich etwa 13/50 des Volumens von Formulierung R1). Die Lösung wird gemischt, und die Extinktion bei etwa 540 nm wird mit einem Spektrophotometer vorzugsweise früher als etwa 10 Minuten nach dem Ende der Inkubationsreaktion erfaßt. Die Extinktion wird mit einem Standard bekannter Gesamtbilirubin-Konzentration verglichen und dadurch die Konzentration der Probe bestimmt.
Nichteinschränkende Beispiele für Formulierungen zur Analyse von Gesamtbilirubin sind nachstehend in den Tabellen 1 und 2 gezeigt:

Tabelle 1: Gesamtbilirubin-Formulierung R1

Komponente Konzentration
Alkylbetain (Empigen BB) 4-13% (Gew./Vol.), z. B. 11% (Gew./Vol.)
Kaliumiodid 0-12,5 mM, z. B. 12,5 mM
Antifoam FG-10 Emulsion 1500 ppm
Natriumacetat·3 H&sub2;O 50-150 mM, z. B. 85 mM
Sulfaminsäure 50-200 mM, z. B. 110 mM

Tabelle 2: Gesamtbilirubin-Formulierung R2

Komponente Konzentration
HOI 50-500 mM, z. B. 100 mM
2-Methyl-3-nitroanilin 1-15 mM, z. B. 3 mM
Natriumnitrit 1-20 mM, z. B. 8 mM
Sulfaminsäure 1-25 mM, z. B. 5 mM
Die Komponenten der Gesamtbilirubin-Formulierungen R1 und R2 können von kommerziellen Anbietern erhalten werden. Zum Beispiel kann Alkylbetain (C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub4;-Alkylbetain, Empigen BB) von Albright & Wilson, (Ashland, VA) erhalten werden; Kaliumiodid, Sulfaminsäure und HCl sind von J. T. Baker (Phillipsburgh, NJ) erhältlich; Antifoam FG- 10 Emulsion (eine Emulsion mit Polydimethylsiloxan) ist erhältlich von Dow Corning (Midland, MI); Natriumacetat·3H&sub2;O ist erhältlich von Fischer Scientific (Itaska, IL); 2-Methyl-3-nitroanilin ist erhältlich von Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO; und Natriumnitrit ist erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO.
Die oben genannten Formulierungen werden alle in Wasser aufbereitet. Beim Zusammengeben der Komponenten zur Herstellung der Formulierung R2 reagiert das Nitrit mit der Säure unter Bildung von salpetriger Säure, die anschließend mit dem 2-Methyl-3-nitroanilin unter Bildung von 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion reagiert. Nach der Reaktion sind also Nitrit und 2-Methyl-3-nitroanilin in der Formulierung R2 im wesentlichen nicht mehr vorhanden.
Direktes Bilirubin in einer Probe kann ebenfalls quantifiziert werden. In einer beispielhaften Analyse auf direktes Bilirubin in einer Probe, etwa einer Plasma- oder Serumprobe, werden wiederum zwei Analysenformulierungen bereitgestellt, eine saure Formulierung (hierin als Direktbilirubin-Formulierung R1 bezeichnet) und eine Reagenzienformulierung (hierin als Direktbilirubin-Formulierung R2 bezeichnet), welche die Diazoniumion-Verbindung enthält (siehe nachstehende Tabellen 3 und 4). Während die Komponenten der Formulierungen R1 und R2 sowie die Inkubationszeiten unter Anwendung von Kenntnissen über Bilirubin-Analysen, die in der Fachwelt entwickelt wurden, formuliert und optimiert werden können, seien die folgenden Analysebedingungen und Formulierungen beispielhaft gegeben.
In einer beispielhaften Analyse der Konzentration von direktem Bilirubin in einer Serumprobe werden 6 ul der Probe zu 250 ul Direktbilirubin-Formulierung R1 gegeben und vermischt (Verhältnis Probe/Formulierung R1 etwa 1 : 42). Ist die Konzentration von Bilirubin in der Probe größer als 20 mg/dl, so kann die Probe mit physiologischer Kochsalzlösung 1+1 verdünnt und erneut analysiert werden. Die Mischung wird bei 25, 30 oder 37ºC etwa 30 Sekunden bis 5 Minuten lang inkubiert. Für jede Patienten-, Standard- und Kontrollprobe wird eine Blindprobe mitgeführt. Nach 5 Minuten werden 65 ul der Direktbilirubin-Formulierung R2 zugegeben (Volumen gleich etwa 13/50 des Volumens der Direktbilirubin-Formulierung R1). Die Lösung wird gemischt und die Extinktion bei etwa 540 nm wird mit Hilfe eines Spektrophotometers vorzugsweise früher als 10 Minuten nach dem Ende der Inkubationsreaktion erfaßt. Die Extinktion wird mit einer Standardkurve korreliert, die unter Verwendung von Proben mit bekannter Gesamtbilirubin-Konzentration erstellt wurde, wodurch die Bestimmung der Konzentration von direktem Bilirubin in der Probe möglich wird.
Nichteinschränkende Beispiele für Formulierungen zur Analyse des direkten Bilirubins sind nachstehend in den Tabellen 3 und 4 gezeigt:

Tabelle 3: Direktbilirubin-Formulierung R1

Komponente Konzentration
Betain-monohydrat 1-8% (Gew./Vol.), z. B. 2% (Gew./Vol.)
Thesit® 0,05-0,3% (Gew./Vol.), z. B. 0,2% (Gew./Vol.)
Kaliumiodid 0,1-12 mM, z. B. 2 mM
Natriumacetat·3H&sub2;O 50-150 mM, z. B. 85 mM
Sulfaminsäure 50-300 mM, z. B. 200 mM

Tabelle 4: Direktbilirubin-Formulierung R2

Komponente Konzentration
HCl 100 mM
2-Methyl-3-nitroanilin 0,25-12 mM, z. B. 3 mM
Natriumnitrit 8-11 mM, z. B. 8 mM
Sulfaminsäure 5 mM
Die Komponenten der Direktbilirubin-Formulierungen R1 und R2 können von kommerziellen Anbietern bezogen werden. Zum Beispiel können Betain-monohydrat und Natriumnitrit von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten werden. Thesit® (Dodecylpoly(ethylenglycolether)n) kann von Boehringer Mannheim Corporation (Indianapolis, IN) erhalten werden; Kaliumiodid, Sulfaminsäure und HCl können von J. T. Baker (Phillipsburgh, NJ) erhalten werden; Natriumacetat·3H&sub2;O ist erhältlich bei Fischer Scientific (Itaska, IL); 2-Methyl-3-nitroanilin ist erhältlich bei Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO).
Die obigen Formulierungen werden alle in Wasser aufbereitet. Wie bereits vorstehend erwähnt, reagiert beim Mischen der Komponenten der Formulierung R2 das Nitrit mit der Säure unter Bildung von salpetriger Säure, die anschließend mit dem 2-Methyl-3-nitroanilin unter Bildung von 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion reagiert. So sind nach der Reaktion Nitrit und 2-Methyl- 3-nitroanilin in der Formulierung im wesentlichen nicht mehr vorhanden.

Vorteile und Eigenschaften der Diazoniumionen

Bevorzugte Diazoniumion-Verbindungen im Umfang der Erfindung sind Verbindungen, die imstande sind, mit Bilirubin unter Bildung eines Produkts zu reagieren, das z. B. spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann. Besonders bevorzugt sind Verbindungen, die gegenüber Bilirubin in hohem Maße reaktiv sind.
Ebenfalls bevorzugt sind wie hierin definierte Diazoniumion-Verbindungen, die thermisch stabil sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich "thermisch stabil" auf Verbindungen und/oder diese Verbindungen enthaltenden Reagenzienformulierungen, bei denen etwa 60% der Verbindung unzersetzt und wirksam bleiben, nachdem sie wenigstens einen Tag einer Temperatur von etwa 42ºC ausgesetzt waren. Die Diazonium-Verbindungen sind bevorzugt stabil genug, um den thermischen Anforderungen für den internationalen Transport zu genügen. Nach einer thermischen Belastung des Reagens hat dieses bevorzugt noch genügend Anteile der ursprünglichen wirksamen Komponenten in der Größenordnung von wenigstens etwa 60%, so daß sich eine Lebensdauer von wenigstens 12 Monaten bei 4ºC ergibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform reagieren die Verbindungen auch im wesentlichen nicht mit möglicherweise störenden Verbindungen in einer Körperflüssigkeit oder einer anderen Probe, etwa mit Hämoglobin oder Indican. Bevorzugt erlaubt die Verbindung genaue Messung von Bilirubin selbst in einer Probe, die bis zu 2000 mg/dl Hämoglobin enthält. In einer anderen Ausführungsform erlaubt die Verbindung die genaue Messung von Bilirubin sogar in einer Probe, die bis zu 10 mg/dl Indican enthält. Ebenfalls bevorzugt sind aus Amin-Vorläufern gebildete Verbindungen, die in einem wäßrigen System löslich sind. Ein Problem mit Verbindungen im Stand der Technik ist die niedrige Löslichkeit in wäßrigen Systemen.
Ein Beispiel für eine bevorzugte Diazoniumion-Verbindung ist 2-Methy-3-nitroanilin-Diazoniumion. Diese Verbindung reagiert nicht wesentlich mit störenden Verbindungen in einer Serumprobe oder einer anderen Körperflüssigkeitsprobe. Diese Verbindung erlaubt die genaue Messung von Bilirubin in Proben, die stark hämolysiert sind und äußerst hohe Hämoglobinkonzentrationen, z. B. so hoch wie 2000 mg·dl&supmin;¹, enthalten. Andere störende Verbindungen wie etwa Indican reagieren auch nicht wesentlich mit 2- Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion. Bilirubin kann sogar in Proben mit Indican-Anteilen z. B. in einer Höhe von 10 mg·dl&supmin;¹ analysiert werden. Dies ermöglicht die Analyse eines breiten Probenspektrums.
Auch ist das 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion in hohem Maße reaktiv gegenüber Bilirubin und ist thermisch stabil. Diese Verbindung ist stabil genug, um den thermischen Anforderungen für den international Transport zu genügen. Das 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion hält relativ hohen Temperaturen (42ºC) für wenigstens einen Tag lang stand, wobei die Zersetzung weniger als 40% beträgt. Nach thermischer Belastung der Verbindung, z. B. in Form eines flüssigen Reagens wie vorstehend im einzelnen beschrieben, weist diese noch genügend Anteile an wirksamen Komponenten auf, so daß sich eine Lebensdauer von wenigstens 12 Monaten bei 4ºC ergibt.
Arrhenius-Berechnungen der Stabilität bei 4ºC zeigen, daß das 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion etwa 2-2,5 mal stabiler ist als das Sulfanilamid-Diazoniumion, das gegenwärtig zur Quantifizierung von Bilirubin verwendet wird. So erfüllt dieses Reagens die strengen Anforderungen im Hinblick auf die thermische Belastung und bewahrt genügend Anteile an wirksamen Komponenten, um eine Lebensdauer von wenigstens 12 Monaten bei 4ºC aufrechtzuerhalten. Das 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion ist auch sehr gut in Wasser oder anderen wäßrigen Systemen löslich.
Somit hat das 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion als Bilirubin-Analysenreagens viele Vorteile. Die Verbindung ist thermisch stabil, ist in hohem Maße reaktiv gegenüber Bilirubin und erlaubt genaue Messungen selbst in Gegenwart hoher Anteile Hämoglobin oder anderer störender Verbindungen wie etwa Indican. Die Verwendung dieser Verbindung ermöglicht die Analyse eines breiten Spektrums von Probenarten, darunter Körperflüssigkeiten wie Serum, Urin und Plasma. Die Analyse der Spiegel von Gesamtbilirubin oder direktem Bilirubin in einer Körperflüssigkeitsprobe ermöglicht somit den Nachweis und die Diagnose einer Vielzahl von Stoffwechselstörungen, anomalen Zuständen und Erkrankungen, die mit Änderungen in den Spiegeln von Gesamtbilirubin, direktem oder indirektem Bilirubin einhergehen, darunter solchen, die Leber, Gallenblase und Darm beeinträchtigen.
Die Erfindung läßt sich anhand der nachfolgenden nicht- einschränkenden Beispiele besser verstehen.

Beispiele

Beispiel 1: Herstellung von 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion und Analyse auf Bilirubin.

Die Menge an direktem und Gesamtbilirubin in einer Serum- oder Plasmaprobe wird nachgewiesen. 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion wird in einer Formulierung für die Gesamtbilirubin-Analyse (Gesamtbilirubin-Formulierung R2) und in einer Formulierung zur Analyse auf direktes Bilirubin (Direktbilirubin-Formulierung R2) erzeugt. Zusätzlich werden saure Lösungen für die Gesamtbilirubin-Analyse (Gesamtbilirubin-Formulierung R1) und für die Analyse von direktem Bilirubin (Direktbilirubin- Formulierung R1) bereitgestellt. Die zur Bildung der Formulierungen verwendeten Komponenten, die in Wasser aufbereitet werden, sind nachstehend in den Tabellen 5-8 gezeigt. Tabelle 5: Gesamtbilirubin-Formulierung R1 Tabelle 6: Gesamtbilirubin-Formulierung R2 Tabelle 7: Direktbilirubin-Formulierung R1 Tabelle 8: Direktbilirubin-Formulierung R2
Da das Nitrit mit der Säure unter Bildung von salpetriger Säure reagiert, welche anschließend mit dem 2-Methyl-3-nitroanilin unter Bildung von 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion reagiert, liegt bei den Gesamt- und Direktbilirubin-Formulierungen R2 im wesentlichen weder Nitrit als solches noch 2-Methyl-3-nitroanilin im Reagens vor. Die Formulierungen R2 sind nach dem Mischen der Komponenten wenigstens etwa 18 Monate bei 4ºC stabil.
Zur Herstellung der R2-Lösung wird 2-Methyl-3-nitroanilin in 100 mM HCl bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird auf ~4ºC abgekühlt. Die entsprechende Menge festen Natriumnitrits wird langsam zugegeben, während man die Lösung kalt hält und alles Nitrit sich völlig auflösen läßt. Die entsprechende Menge fester Sulfaminsäure wird der Lösung zugegeben, während man die Lösung kalt hält und die vollständige Auflösung der Sulfaminsäure sicherstellt.
Der Nachweis wird mit einem klinischen Analysengerät durchgeführt, etwa der Hitachi®-Reihe klinischer Analysengeräte H717, H917 oder H747 von Boehringer Mannheim Diagnostics Inc., (Indianapolis, IN). Der Eichstandard ist Precical (Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN), eine im Handel erhältliche Eichsubstanz mit einem definierten Bilirubinanteil. Kontrollsubstanzen für serumbasierte Bilirubinproben, die bekannte Bilirubinkonzentration aufweisen und ebenfalls verwendet werden können, sind Precitrol-A (PTA), eine Anomalkontrollsubstanz, und Precitrol-N (PTN), eine Normalkontrollsubstanz. Die verwendete Blindprobe oder Nulleichsubstanz ist physiologische Kochsalzlösung.
Bei der Analyse werden 6 ul der Probe und 250 ul der R1- Formulierung 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Anschließend werden 65 ul der Formulierung R2 zugegeben, und die Lösung wird 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Extinktion bei 546 nm wird 5 Minuten nach Zugabe der Formulierung R2 gemessen und zur Bestimmung der Bilirubinkonzentration mit dem Standard korreliert. Das Hitachi-Analysengerät subtrahiert auch die Extinktion bei einer Sekundärwellenlänge, z. B. 660 oder 700 nm.
Abb. 1 zeigt eine graphische Darstellung der Extinktion gegen die Gesamtbilirubin-Konzentration, die erhalten wurde mit Hilfe dieses Verfahrens zur Analyse von Proben auf der Grundlage normalen menschlichen Serums, das mit verschiedenen Konzentrationen von reinem unkonjugierten Bilirubin (NIST-nachweisbar) versetzt worden war. Zur Analyse der Proben wurde der Hitachi Clinical Analyzer 717 nach Eichung mit Precical verwendet. Die korrigierte Extinktion auf der y-Achse entspricht der Probenextinktion abzüglich der Extinktion der Blindprobe (physiologische Kochsalzlösung). Diese graphische Darstellung zeigt die Konzentration, die aus der Probenextinktion relativ zur Extinktion der Eichsubstanz erhalten wurde, wie auch die Linearität des Verfahrens.
Zwar wurde die obige Erfindung mit Hilfe der Erläuterungen und Beispiele zum Zweck der Klarheit und des Verständnisses ausführlicher beschrieben, doch wird für einen Fachmann offenkundig sein, daß bestimmte Änderungen und Abwandlungen vorgenommen werden können. Beschreibung und Beispiele dürfen daher keinesfalls so ausgelegt werden, daß sie den Umfang der Erfindung einschränken.

Claims

1. Diazoniumion, bestehend aus 2-Methyl-3-nitroanilin- Diazoniumion mit der Struktur:

2. Reagenzienzusammensetzung, umfassend ein Salz der Verbindung nach Anspruch 1.

3. Reagenzienzusammensetzung, umfassend eine wäßrige Lösung der Verbindung nach Anspruch 1.

4. Reagenzienzusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der pH der Lösung kleiner als 7 ist.

5. Reagenzienzusammensetzung nach Anspruch 3, umfassend 0,25-15 mM Diazoniumionverbindung, wobei der pH der Lösung 0,5 bis 7 ist.

6. Salz, umfassend die Verbindung nach Anspruch 1 und ein daran komplexiertes Anion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetrafluoroborat, Hexafluorophosphat und einem Metalldoppelsalz.

7. Feste Reagenzienzusammensetzung, umfassend die Verbindung nach Anspruch 1.

8. Reagenzienzusammensetzung, umfassend eine wäßrige Lösung des Diazoniumions nach Anspruch 1.

9. Reagenzienzusammensetzung nach Anspruch 8, wobei der pH der Lösung kleiner als 7 ist.

10. Reagenzienzusammensetzung nach Anspruch 8, umfassend 0,25-15 mM 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion, wobei der pH der Lösung 0,5 bis 7 ist.

11. Salz, umfassend das Diazoniumion nach Anspruch 1 und ein daran komplexiertes Anion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetrafluoroborat, Hexafluorophosphat und einem Metalldoppelsalz.

12. Feste Reagenzienzusammensetzung, umfassend das Diazoniumion nach Anspruch 1 und einen Träger.

13. Reagenzienzusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Verbindung 4-Aminotoluol-3-sulfonsäure-Diazoniumion ist.

14. Reagenzienzusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Methyl-4-nitroanilin-Diazoniumion, 2-Methyl-5- nitroanilin-Diazoniumion, 2-Methyl-6-nitroanilin-Diazoniumion und 5-Methyl-2-nitroanilin-Diazoniumion.

15. Verfahren zur Prüfung auf Bilirubin in einer Probe, umfassend:

a) Zusammenbringen einer Probe, die mutmaßlich Bilirubin enthält, mit einer Diazoniumionverbindung der Formel I:

worin: ein R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; oder R&sub5; jeweils Methyl ist, ein R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; oder R&sub5; jeweils Sulfonat oder Nitro ist; und

die übrigen R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; H sind;

b) Reagierenlassen der Verbindung mit dem Bilirubin in der Probe, um ein nachweisbares Produkt zu erzeugen; und

c) Nachweisen des Produkts.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Diazoniumionverbindung 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion mit der Struktur

ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Produkt spektrophotometrisch nachgewiesen wird.

18. Verfahren nach Anspruch 15, des weiteren umfassend das Quantifizieren des Bilirubins in der Probe.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Probe direktes und indirektes Bilirubin enthält, des weiteren umfassend die Ermittlung der Konzentration von direktem Bilirubin und Gesamtbilirubin in der Probe.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Verfahren das Feststellen einer Erkrankung oder Störung der Leber, der Gallenblase oder des Darms auf der Grundlage der festgestellten Konzentrationen des direkten und indirekten Bilirubins umfaßt.

21. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Schritt a) das Zusammenbringen der Probe mit einer wäßrigen, 0,25-15 mM Diazoniumionverbindung umfassenden Lösung umfaßt, wobei der pH der Lösung 0,5 bis 7 ist.

22. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Produkt spektrophotometrisch nachgewiesen wird.

23. Verfahren nach Anspruch 16, des weiteren umfassend das Quantifizieren des Bilirubins in der Probe.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Probe direktes und indirektes Bilirubin enthält, des weiteren umfassend die Ermittlung der Konzentration von direktem Bilirubin und Gesamtbilirubin in der Probe.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Verfahren das Feststellen einer Erkrankung oder Störung der Leber, der Gallenblase oder des Darms auf der Grundlage der festgestellten Konzentrationen des direkten und indirekten Bilirubins umfaßt.

26. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Schritt a) das Zusammenbringen der Probe mit einer wäßrigen, 0,25- 15 mM 2-Methyl-3-nitroanilin-Diazoniumion umfassenden Lösung umfaßt, wobei der pH der Lösung 0,5 bis 7 ist.

27. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Schritt c) das Zusammenbringen der Lösung nach Schritt b) mit einer sauren Lösung und das Ermitteln der Extinktion des Produkts umfaßt.

28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Schritt c) das Zusammenbringen der Lösung nach Schritt b) mit einer sauren Lösung und das Ermitteln der Extinktion des Produkts umfaßt.

29. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Diazoniumionverbindung 4-Aminotoluol-3-sulfonsäure-Diazoniumion ist.

30. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Diazoniumionverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Methyl-4-nitroanilin-Diazoniumion, 2-Methyl-5- nitroanilin-Diazoniumion, 2-Methyl-6-nitroanilin-Diazoniumion und 5-Methyl-2-nitroanilin-Diazoniumion.