DE69735883T2

DE69735883T2 - Methode zur behandlung von muskelkrankheiten

Info

Publication number: DE69735883T2
Application number: DE69735883T
Authority: DE
Inventors: Royal Free Hospital School Geoffrey GOLDSPINK; Shi Yu Yang
Original assignee: University College London
Current assignee: University College London
Priority date: 1996-03-11
Filing date: 1997-03-11
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2017-03-12
Also published as: DE69735883D1; DK0894136T3; JP2000506729A; EP0894136B1; PT1726651E; DK1726651T3; US6221842B1; EP1726651A1; DE69739737D1; EP0894136A1; ES2265649T3; WO1997033997A1; ATE326534T1; PT894136E; GB9605124D0; ATE454451T1; EP1726651B1; ES2337917T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen bei der Behandlung von Muskelerkrankungen und damit verwandten Zuständen unter Verwendung des insulinartigen Wachstumsfaktors I.
Beim insulinartigen Wachstumsfaktor I (IGF-I) handelt es sich um ein Peptid, das im Plasma und anderen Körperflüssigkeiten vorkommt. In seiner reifen prozessierten Form umfasst es 70 Aminosäuren und kann das Wachstum eines weiten Bereiches von Zelltypen stimulieren. Humaner IGF-I wurde kloniert und seine cDNA-Sequenz findet sich bei Jansen et al., Nature, 1993 (Druckschrift 11). Die cDNA-Sequenz kodiert für einen Vorläufer (auch als D-Kette bekannt), ein reifes Peptid mit 70 Aminosäuren, das die Regionen B, C und A und eine C-terminale Region, die als E-Peptid bezeichnet wird, umfasst. Kürzlich wurde festgestellt, dass das E-Peptid in verschiedenen Isoformen vorliegen kann. Dies ist das Ergebnis einer alternativen Spleißung auf dem mRNA-Niveau. Chew et al. berichten über die Existenz von 3 alternativ gespleißten C-terminalen Regionen von humanem IFG-I. Eine der erzeugten Isoformen ist ein Ergebnis der Spleißung zwischen den Exons 4, 5 und 6 des Gens, woraus sich ein präpro-IGF-I-Molekül mit 158 Aminosäuren, einschließlich eines C-terminalen Peptids, des Ec-Peptids mit einer Länge von 24 Aminosäuren, vorhersagen lässt. Dieses Ec-Peptid scheint dem in Ratten-IGF-I gefundenen Eb-Peptid zu entsprechen.
Die Verwendung von IGF-I wurde bei einer Anzahl von Störungen in Zusammenhang mit Muskelatrophie und damit verwandten Zuständen vorgeschlagen. Beispielsweise schlägt WO-92/11865 die Verwendung von humanem IFG-I für die Prophylaxe oder Therapie von Herzstörungen und für die Förderung der Herzmuskel-Proteinsynthese, zur Prophylaxe oder Therapie von Kardiomyopathien, akutem Herzversagen oder akuten Störungen, einschließlich Myokarditis oder Myokardinfarkt und zur Verbesserung des Herzminutenvolumens durch Erhöhung des Schlagvolumens des Herzens vor. WO-95/13290 betrifft die Verwendung von IGF-I zur Behandlung von Muskelkrankheiten, wie muskulärer Dystrophie und damit verwandter progressiver Skelettmuskelschwäche und -schwund.
WO-93/09236 lehrt gentherapeutische Verfahren unter Verwendung von myogenen Vektorsystemen, die zur Verwendung von Muskelzellen geeignete Promotoren umfassen. Derartige Vektoren können einem humanen Patienten zur Behandlung einer Muskelatrophie bei alternden Personen, von Muskelatrophie, die durch Rückenmarkverletzungen herbeigeführt worden ist, oder neuromuskulärer Krankheiten zugeführt werden.
Eine Schwierigkeit bei der Verwendung von IGF-I besteht darin, dass dieses Peptid für einen breiten Bereich von Wirkungen im menschlichen Körper verantwortlich ist. Obgleich IGF-I in Muskelzellen erzeugt wird, wird es auch in der Leber gebildet, von wo aus es zirkuliert und an der Stoffwechselregulation beteiligt ist. Die Verabreichung von IGF-I kann somit Nebenwirkungen herbeiführen, einschließlich Hypoglykämie.
De Vol et al., Am. J. Physiol., Bd. 259 (1990), E89–E95, berichten darüber, dass die IGF-I-Expression während des tätigkeitsbedingten Skelettmuskelwachstums erhöht ist. Wir untersuchten die Erzeugung von IGF-I in Skelettmuskeln und stellten überraschenderweise fest, dass zwar ruhende Muskeln normalerweise die Leber-IGF-I-Isoform einschließlich des Ea-Peptids bilden, dass aber Muskelzellen, die zu einer raschen Hypertrophie unter Anwendung von aktiver Streckung induziert werden, rasch die Erzeugung einer unterschiedlichen IGF-I-Isoform herauf regulieren. Wir haben dabei festgestellt, dass die IGF-I-Ec-Isoform beim Menschen, die der IGF-I-Eb-Isoform in Ratten und Kaninchen entspricht, eine wichtige Rolle bei der Zielrichtung der Wirkung von IGF-I auf Muskelzellen spielen kann. Somit kann die Behandlung von muskulären Störungen, wie sie vorstehend erwähnt wurden, durch die Verwendung der humanen Ec-Isoform oder des Ec-Peptids von humanem IGF-I verbessert werden.
Demzufolge wird erfindungsgemäß die Verwendung eines Polypeptids des insulinartigen Wachstumsfaktors I (IGF-I) für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Muskelerkrankung bereitgestellt, wobei das Polypeptid folgendes umfasst:

(i) ein C-terminales Peptid des insulinartigen Wachstumsfaktors I (IGF-I), dessen Sequenz diejenige ist von
(a) dem humanen Ec-Peptid, das eine Länge von 24 Aminosäuren besitzt und beginnt mit Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys,
(b) dem aus Kaninchen stammenden Eb-Peptid, das Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys ist, oder
(c) dem aus der Ratte stammenden Eb-Peptid, das beginnt mit Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys oder
(ii) ein C-terminales Peptid von IGF-I, kodiert von einem muskelspezifischen RNA-Transkript, das spezifisch durch Streckung induziert wird.

Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die derartige Polypeptide zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfassen.
Die IGF-I-Isoform, auf die sich die Erfindung bezieht, kann somit bei Verfahren zur Behandlung von Störungen verwendet werden, die im Zusammenhang mit Muskelatrophie und damit verwandten Zuständen stehen. Hierzu gehört die Verwendung von humanem IGF-I zur Prophylaxe von Herzstörungen, Krankheiten, bei denen eine Förderung der Herzmuskel-Proteinsynthese eine günstige Behandlungsmaßnahme darstellt, Kardiomyopathien, akuter Herzinsuffizienz oder akuten Störungen, einschließlich Myokarditis oder Myokardinfarkt. Die IGF-Isoform kann auch zur Verbesserung des Herzminutenvolumens durch Erhöhung des Schlagvolumens des Herzens verwendet werden.
Zu weiteren muskulären Störungen, die behandelt werden können, gehören muskuläre Dystrophie, z. B. Duchenne- oder Becker-Muskeldystrophie, sowie autosomale Dystrophien und damit verwandte progressive Skelettmuskelschwäche und -schwund. Die Behandlung von Muskelatrophie bei alternden Menschen, Muskelatrophie, die durch Rückenmarkverletzungen induziert worden ist, oder neuromuskulären Krankheiten kann ebenfalls erfindungsgemäß erfolgen. Die Therapie mit dem geeigneten IGF-I kann auch die Heilung von Knochenbrüchen und die Aufrechterhaltung von Knochen in hohem Alter fördern.
Zu pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln gehören solche, die in für die orale oder parenterale (z. B. intramuskuläre oder intravenöse) Verabreichung geeigneten Zubereitungen verwendet werden. Die Zubereitungen können zweckmäßigerweise in Dosiseinheitsform dargereicht werden oder sie können nach beliebigen, auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden. Derartige Verfahren umfassen die Stufe des Zusammenbringens des Wirkstoffes mit dem Träger, der einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile darstellt. Im allgemeinen werden die Zubereitungen durch gleichmäßiges und inniges Zusammenbringen des Wirkstoffes mit flüssigen Trägern oder feinverteilten festen Trägern oder mit beiden und anschließend gegebenenfalls durch Formgebung des Produkts hergestellt.
Beispielsweise umfassen für die parenterale Verabreichung geeignete Zubereitungen wässrige und nicht-wässrige, sterile Injektionslösungen, die Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Bestandteile, die die Zubereitung mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers isotonisch machen, enthalten können; sowie wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel und Verdickungsmittel enthalten können, und Liposomen oder andere mikroteilchenförmige Systeme, die so konzipiert sind, dass sie das Polypeptid zielgerichtet zu Blutkomponenten oder zu einem oder mehreren Organen bringen.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auf einem beliebigen geeigneten Weg verabreicht werden, beispielsweise oral oder durch Injektion, z. B. durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, oder es kann alternativ in situ in einem Patienten als Ergebnis einer gentherapeutischen Behandlung, wie sie beispielsweise in WO-93/09236 beschrieben ist, erzeugt werden.
WO-95/13290 beschreibt Dosisbereiche von rekombinantem, humanem IGF-I (das reife Polypeptid mit 70 Aminosäuren) im Bereich von 0,06 bis 0,12 mg/kg pro Dosis, und IGF-I-Polypeptide, die das Ec-Peptid umfassen, können ebenfalls in diesem Dosisbereich verabreicht werden. Die Dosen können in täglichen Abständen oder weniger häufig, z. B. zweimal wöchentlich oder in wöchentlichen Abständen, verabreicht werden.
Bei IGF-I handelt es sich vorzugsweise um ein Polypeptid, das eine Sequenz von 70 Aminosäuren des reifen humanen IGF-I zusammen mit der Ec-Region, die beim Menschen der Eb-Region von Kaninchen-IGF-I entspricht, umfasst, wie in 3 der beigefügten Zeichnung dargelegt ist.
Die humane Ec-Region ist in 4 dargestellt. 5 zeigt die gesamte humane cDNA-Sequenz, die für die humane Ea-Isoform kodiert.
Ohne die Festlegung auf eine bestimmte Theorie nehmen wir an, dass die humane Ec-Isoform ihre Aktivität über eine Einwirkung auf einen Rezeptor, der sich vom normalen IGF-I-Rezeptor unterscheidet, ausübt. Es wird angenommen, dass das Vorliegen der Ec-Region für die Bindung an diesen Rezeptor verantwortlich ist und somit Derivate von IGF-I-Ec, die die Fähigkeit zur Induktion des Wachstums von Muskelgewebe beibehalten, verwendet werden können. Derartige Derivate können weitere N-terminale Schnittprodukte der reifen Sequenz mit 70 Aminosäuren umfassen. Dies kann durch Brückenverfahren ("bridging methods"), die dem Fachmann geläufig sind, beispielsweise durch Verabreichung derartiger Polypeptide (oder von Säugetieräquivalenten davon) an einen Säuger, wie ein Kaninchen oder eine Ratte und durch Beobachtung des Betrags des Muskelwachstums, getestet werden.
IGF-I-Ec kann durch beliebige geeignete Maßnahmen erzeugt werden. Üblicherweise erfolgt dies durch rekombinante Maßnahmen. Beispielsweise kann mRNA, die für die Ec-Isoform kodiert, unter Verwendung von PCR-Primern, wie sie in den beigefügten Beispielen beschrieben sind, amplifiziert werden und das amplifizierte Produkt kann in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert werden. IGF-I wird durch rekombinante Maßnahmen gewerblich erzeugt. Diese gewerblichen Verfahren können zur Erzeugung der IGF-I-Ec-Isoform herangezogen werden. Beim Vektor kann es sich um einen beliebigen geeigneten rekombinanten Vektor, der auf dem Gebiet der rekombinanten Proteine bekannt ist, handeln. Der Vektor enthält Kontrollsignale für die Expression des IGF-I-Ec-Proteins in funktioneller Verknüpfung mit einem offenen Leseraster, der für dieses Protein kodiert. Der Promotor ist mit einer geeigneten Wirtszelle, z. B. einer bakteriellen Zelle, Hefezelle, Insektenzelle oder Säugetierzelle, verträglich.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beim insulinartigen Wachstumsfaktor I (IGF-I) handelt es sich um ein 70 Reste aufweisendes Polypeptid mit wichtigen Funktionen bei der Regulation von somatischem Wachstum, Entwicklung und Differenzierung. Die Leber stellt das Hauptziel des Hypophysen-Wachstumshormons (GH) dar, das zur Synthese von IGF-I stimuliert wird. Die sich ergebende Steigerung des zirkulierenden IGF-I-Spiegels fördert die Zellteilung und stellt einen Hauptfaktor bei der Regulation des Wachstums des Körpers insgesamt dar. In mehreren Geweben gibt es ebenfalls offensichtlich ein lokales System der Wachstumsregulation, z. B. im Skelettmuskel, der zu einer raschen Hypertrophie befähigt ist, um eine Anpassung an eine Überlastung vorzunehmen. Es war daher von Bedeutung, die Rolle von IGF-I bei der lokal regulierten Wachstumsreaktion zu untersuchen.
Informationen über die Organisation des IGF-I-Gens sind nunmehr für mehrere Spezies verfügbar; darunter werden die humanen und Rattengene am eingehendsten untersucht [1–5]. Die Struktur des IGF-I-Gens ist unter Säugern gut konserviert und enthält mehrere bemerkenswerte Merkmale, einschließlich eine Größe von unerwartetem Ausmaß und das Vorliegen von alternativ gespleißten Exons. Beim Menschen umfasst das IGF-I-Gen mindestens 6 Exons (bezeichnet als Exon 1, 2, 3, 4, 5 und 6), die eine Region von über 90 Kilobasen (kb) von genomischer DNA überspannen. Die Exons 1 und 2 sind alternative Leader-Exons [4, 5] mit getrennten Transkriptionsstartstellen, die unterschiedlich vom gemeinsamen Exon 3 gespleißt sind und Klasse 1- bzw. Klasse 2-IGF-I-mRNA-Transkripts erzeugen [6–8]. Die Exons 3 und 4 kodieren für das reife IGF-I-Peptid (B-, C-, A- und D-Domäne) sowie für die ersten 16 Aminosäuren der E-Domäne. Die Exons 5 und 6 kodieren jeweils für einen alternativen Teil eines getrennten Extensionspeptids mit der Bezeichnung E-Domäne. Dieser folgen die Terminationscodons vom Vorläufer-IGF-I, 3'-untranslatierte Regionen und poly(A)-Additionssignalstellen [2]. Sequenzanalysen von IGF-I-Peptid, das aus humanem Plasma gereinigt worden ist, zeigten, dass reifer IGF-I A-, B-, C- und D-Domänen enthält. Die A- und B-Domänen sind homolog zu den A- und B-Ketten von Insulin [9].
Eine Analyse von Leber-IGF-I-cDNA-Sequenzen hat ebenfalls das Vorliegen einer E-Peptiddomäne gezeigt, bei der es sich um eine Extension der D-Peptiddomäne handelt [10–12]. Eine spätere Untersuchung unter Verwendung von Antikörpern gegen das E-Peptid von humanem IGF-I bestätigte, dass die mRNA-Sequenz, die für das E-Peptid kodiert, aktiv translatiert wird, und ließ darauf schließen, dass das E-Peptid als Teil des IGF-I-Prohormons zirkuliert [13]. In Rattenleber kodieren IGF-I-mRNAs für eine E-Peptidsequenz mit 35 Aminosäuren (IGF-IEa). Jedoch wurde eine Isoform (IGF-IEb) mit einer unterschiedlichen Eb-Domäne mit 41 Aminosäuren in sehr geringen Konzentrationen nachgewiesen [14]. Diese beiden mRNAs kodieren für ein alternatives E-Peptid aufgrund der Anwesenheit (IGF-IEb) oder der Abwesenheit (IGF-IEa) eines Inserts mit 52 Basen in der Region, die für die E-Domäne kodiert [10, 14]. Beim Menschen gibt es ferner IGF-I-cDNAs, die für drei verschiedene Ea-, Eb- und Ec-Domänen kodieren. Die Ea- und Eb-Typ-cDNAs enthalten völlig unterschiedliche 3'-Sequenzen, die verschiedene 3'-untranslatierte Sequenzen sowie verschiedene E-Domänenkodierungssequenzen spezifizieren [2]. Dies ist auf eine Spleißung in den 3'-Exons zurückzuführen [2]. Bei Ec handelt es sich um eine Exon-4-5-6-gespleißte cDNA, die einen Vorläufer-IGF-I mit 158 Aminosäureresten vorhersagt. Es handelt sich um das humane Gegenstück zu Ratten-Eb [15]. Die physiologische Rolle des alternativen E-Peptids, das aus IGF-IEa, IGF-IEb und IGF-Iec erzeugt wird, bleibt unbekannt.
Vom Skelettmuskel wurde gezeigt, dass er in Reaktion auf eine passive Streckung sehr rasch an Masse zunimmt. Der vordere Schienbeinmuskel des ausgewachsenen Kaninchens kann auf diese Weise innerhalb von vier Tagen eine Massezunahme von 35 % erfahren [16]. Aus früheren Arbeiten [17, 18] war bekannt, dass dies mit einer raschen Erzeugung von neuen Sarkomeren verbunden ist, die seriell an den Faserenden an existierende Myofibrillen addiert werden. Es wurde gezeigt, dass eine Muskelstreckung zu einer Zunahme von IGF-I-mRNA führt, wie durch RT-PCR gemessen wurde [19]. Es ist jedoch nicht bekannt, ob das IGF-I-Gen durch die Muskelfasern selbst oder durch Satellitenzellen exprimiert wird, oder welche Isoformen von IGF-I beteiligt sind. Die Regulierung des in vivo-Muskelwachstums ist nur wenig aufgeklärt, obgleich ursprüngliche Beobachtungen über eine kompensatorische Muskelhypertrophie darauf schließen ließen, dass eine Komponente der Regulierung des Muskelwachstums in einem lokalisierten, selbständigen und selbst begrenzenden Prozess besteht.
Vor diesmn Hintergrund dient die vorliegende Studie zur Feststellung, ob an einer lokalen Induktion des in vivo Muskelwachstums eine alternative IGF-I-Genexpression mit einer unterschiedlichen mRNA-Spleißung für IGF-I und eine lokalisierte Fasertyp-Expression beteiligt ist.
Materialien und Methoden
1. Tiere und Muskelstreckverfahren:
Es wurden weiße Neuseeland-Kaninchen verwendet. Der Muskel Extensor digitorum longus (EDL) wurde durch Immobilisieren der linken hinteren Gliedmaße in gedehnter Position unter Verwendung einer Gipsform einer akuten Streckung unterworfen. Wie früher berichtet, führt dies innerhalb von einigen Tagen zu einer 35 %-igen Zunahme der Muskelmasse. Nach 6 Tagen wurde eine Euthanasie durch intravenöse Injektion einer Überdosis an Natriumpentobarbital in die marginale Ohrvene herbeigeführt. Der EDL wurde sofort von den hinteren Beinen ausgeschnitten. Das rechte hintere Bein diente als Kontrolle. Jeder Muskel wurde dann in Querrichtung in zwei Teile zerschnitten, wovon ein Teil in frisch hergestelltem, 4 %-igem Paraformaldehyd-Fixativ 2 Stunden bei 4 °C fixiert wurde und später verarbeitet und in Paraffinwachs eingebettet wurde. Der zweite Teil wurde in ein 1,5 ml-Röhrchen gepackt, direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei – 70 °C für die spätere Isolierung der gesamten RNA aufbewahrt.
2. RNA-Isolierung:
Die gesamte zelluläre RNA wurde aus dem gestreckten und dem normalen Muskel unter Anwendung des Einstufenverfahrens mit saurer Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert [20).
3. Synthese von Sonden für die Northern-Blot-Analyse und die in situ-Hybridisierung:
Das Oligonucleotid 5'-TTGGGCATGTCAGTGTGG-3', das kompolimentär zur Sequenz des Exons 4 des IGF-I-Gens ist, wurde als Primer zur Synthese von cDNA der IGF-I-mRNA durch reverse Transcriptase (RAV-2, Amersham) verwendet. Die cDNA wurde sodann durch PCR unter Verwendung von zwei Oligonucleotid-Primern (5'-GCTTGCTCACCTTTACCAGC-3' und 5'-TTGGGCATGTCAGTGTGG-3') amplifiziert. Ein PCR-Produkt mit 280 Basenpaaren, das das Exon 3 und einen Teil des Exons 4 des IGF-I-Gens abdeckt, wurde in den pBS+-Phagemidvektor (Stratagene) unter Einschluss von T3- und T7-Promotoren subkloniert. Markierte sense- und antisense-RNA-Sonden wurden durch in vitro-Transkription mit RNA-Polymerase unter Verwendung von Digoxigen in markiertem Uridin-triphosphat als Substrat (Boehringer Mannheim) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Diese Sonden wurden sowohl für das Northern-Blotting als auch für die in situ-Hybridisierung verwendet.
4. Northern-Blotting:
Proben mit einem Gehalt an der gleichen Menge (20 μg) gesamter RNA wurden dem Northern-Blotting unterzogen. Es wurde die vorstehend beschriebene antisense-Sonde mit 280 bp verwendet. Eine Vorhybridisierung (1 Stunde) und eine Hybridisierung (15 Stunden) wurden bei 6 °C in Hybridisierungspuffer [50 % Formamid; 5 × SSC; 2 % Blockierungsreagenz; 0,1 % N-Lauroylsarcosin; 0,02 % SDS] durchgeführt. Ein Waschvorgang wurde mit hoher Stringenz 2-mal 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 1 × SSC und 0,1 % SDS und 2-mal 15 Minuten bei 68 °C mit 0,1 × SSC und 0,1 × SDS durchgeführt. Die hybridisierte Sonde wurde durch Chemilumineszenz gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen (Boehringer Mannheim). Der Blot-Filter wurde 6 Stunden auf Röntgenfilm aufgelegt.
5. In situ-Hybridisierung:
Die Muskelgewebe wurden zu 10 μm-Schnitten geschnitten. Es wurden sowohl Querschnitte als auch Längsschnitte vorgenommen und auf autoklavisierte Objektträger, die mit 2 % 3-Aminopropyltriethoxysilan (Sigma) beschichtet waren, montiert. Die Schnitte wurden durch 3-maliges Waschen für jeweils 2 Minuten in Xylol entwachst und in einer Serie von Methanollösungen rehydratisiert. Sodann wurden die Schnitte durch Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur in 0,2 N HCl denaturiert, 20 Minuten in 2 × SSC auf 70 °C erwärmt und mit Pronase (10 mg/ml, Boehringer Mannheim) in 50 mM Tris-HCl 15 Minuten verdaut und schließlilch in 0,1 M Triethanolamin (TEA)-Puffer gebracht, der mit Essigsäureanhydrid bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % versetzt wurde. Eine 10-minütige Inkubation wurde durchgeführt, um polare und geladene Gruppen in den Schnitten zu blockieren. Die Hybridisierung wurde in Hybridisierungspuffer durchgeführt [50 % entionisiertes Formamid, 5 × SSC, 5 × Dehnhardt-Lösung; 250 μg/ml Hefe-t-RNA, 250 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA; 4 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)] durchgeführt, der eine DIG-markierte antisense- oder sense-RNA-Sonde enthielt, bestehend aus der 280 bp-Sequenz, abgeleitet vom Exon 3 und einem Teil von Exon 4 des IGF-I-Gens. Die Endkonzentration der Sonde betrug 1000 ng/ml. Die Hybridisierung wurde 1 Stunde bei 68 °C durchgeführt. Sodann ließ man das Gemisch auf 42 °C abkühlen und bewahrte es über Nacht in einer feuchten Kammer auf. Nach Hybridisierung wurden die Schnitte mit RNase A (100 μg/ml, Sigma) inkubiert, um ungebundene, einzelsträngige RNA-Sonde zu entfernen. Ein Waschvorgang wurde mit hoher Stringenz 25 Minuten in 2 × SSC bei Raumtemperatur, 15 Minuten in 1 × SSC bei Raumtemperatur, 30 Minuten in 0,5 × SSC bei 42 °C und 30 Minuten in 0,5 × SSC bei Raumtemperatur durchgeführt. Die hybridisierte Sonde wurde durch anti-Digoxigenin-AP-Antikörper-Konjugat, Fab-Fragmente (1,5 U/ml, Boehringer Mannheim) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen.
6. Synthese und molekulare Klonierung von Muskel-IGF-I-cDNA:
Der erste cDNa-Strang wurde durch reverse Transcriptase (RAV-2, Amersham) aus gesamter Muskel-RNR mit oligo-dT-Primern synthetisiert und anschließend durch rasche 3'-Amplifikation von cDNA-Enden-Polymerase-Kettenreaktion (3'-RACEPCR) mit einem IGF-I-genspezifischen Primer (5'-GCTTGCTCACCTTTACCAGC-3'), der einen Teil der 5'-Endsequenz des Exons 3 von IGF-I darstellt, amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in den pCR^R-Vektor (Invitrogen) für die DNA-Sequenzierung kloniert. Die Fragmente wurden später durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren sequenziert [2]. Ingesamt 98 % der DNA-Sequenz wurden an beiden Strängen erhalten.
Ergebnisse
Northern-Blotting:
Die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse, die mit aus normalem und gestrecktem Extensor digitorum longus (EDL) durchgeführt wurden, sind in 1 dargestellt. Die 280 bp-IGF-I-antisense-Sonde mit einem Gehalt an den von Exon 3 und 4 des IGF-I-Gens abgeleiteten Sequenzen hybridisierte mit den zwei vorwiegenden IGF-I-mRNA-Spezies mit einer Länge von 1,2 kb und 7,5 kb. Die Expression beider Typen von mRNA-Spezies war im gestreckten Muskel größer, obgleich bei einigen Muskeln der Kontrollmuskel mehr 7,5 kb-mRNA als der gestreckte Muskel exprimierte.
Lokalisierung von IGF-I-mRNA in normalem und gestrecktem Muskel:
Die durch Hybridisierung unter Verwendung von antisense- und sense-RNA-Sonden untersuchte Expression von IGF-I-mRNA in normalem und gestrecktem Muskel ist in 2 dargestellt. Die Daten der in situ-Hybridisierung zeigen, dass mRNA von IGF-I in Reaktion auf eine Streckung auf dem Muskelfaserniveau als Ergebnis einer mechanischen Stimulation erzeugt wird. Diese Arbeit zeigte, dass die IGF-I-Genexpression nicht auf die Satellitenzellen begrenzt ist, sondern in den Muskelfasern selbst hochreguliert wird. In Querschnitten war die IGF-I-Botschaft in großen Muskelfasern lokalisiert, wurde aber tendenziell stark in den kleinen Fasern exprimiert, die die konischen Enden von Fasern darstellen, die im Muskelbauch enden [22]. In einigen Muskeln wurden gewisse Anzeichen für eine Degeneration und Regeneration mit höheren IGF-I-mRAA-Konzentrationen festgestellt. Diese Regionen befanden sich an der Oberfläche und zeigten, dass in diesen Fällen die Gipsform zu eng anlag. Die Studie unter in situ-Hybridisierung zeigte jedoch, dass bei Anwendung des einfachen Streckmodells die Hochregulierung von IGF-I in offensichtlich ungeschädigten Fasern erfolgte.
Molekulare Klonierung von Muskel-IGF-I-cDNAs:
Diese Studie dient zur Untersuchung der Frage, ob verschiedene Isoformen von IGF-I im Muskel exprimiert werden, wenn dieser einer mechanischen Aktivität unterzogen wird. 10 Klone, die die E-Domäne (Exons 3 bis 6) abdecken, wurden aus dem gestreckten und aus dem kontralateralen Kontrollmuskel isoliert und sequenziert. Zwei Klassen von cDNA-Klonen wurden unter Verwendung von RNA, die aus dem gestreckten Muskel isoliert worden war, erhalten. Unter diesen Klonen enthalten 30 % die für IGF-IEa kodierenden Sequenzen und 70 %, die für IGF-IEb kodierenden Sequenzen. Jedoch konnten auch nach wiederholten Versuchen nur Klone vom IGF-IEa-Typ aus ungestrecktem Kaninchenmuskel isoliert werden. Die klonierte cDNA-Sequenz beginnt am Exon 3, das für reifes IGF-I kodiert. Die Sequenzen der beiden Klassen von IGF-I-cDNA, die aus der gesamten RNA des gestreckten EDL-Muskels isoliert wurden, sind in 3 dargestellt. Die Sequenz kann in drei Abschnitte unterteilt werden. Eine Region, die für reifes IGF-I kodiert (Peptide B, C, A und D), ein Extensionspeptid E, das in IGF-IEb ein Insert von 52 Basen aufweist, das in IGF-IEa fehlt, und eine gemeinsame 3'-untranslatierte Region. In Bezug auf das carboxylterminale Extensionspeptid (E) ist die Kaninchen-Aminosäuresequenz mit der humanen Sequenz bis zum Rest E-16 identisch. An der ersten Base des Codons für den Rest E-17 unterscheiden sich die Aminosäuresequenzen der beiden cDNA-Klone aufgrund des 52 bp-Inserts im IGF-IEb-Klon. Das Insert verändert die abgeleitete Aminosäuresequenz sowie den Leseraster, was zu zwei möglichen carboxylterminalen Peptid E-Sequenzen und zur Anwesenheit von zwei verschiedenen UAG-Stopp-Codons in den Endvarianten führt.
Bei einem Vergleich des 52 bp-Inserts aus Kaninchenmuskel mit dem 52 bp-Insert in IGF-IEb, das in Rattenleber in sehr geringen Mengen exprimiert wird [14], und mit IGF-IEc, das kürzlich in humaner Leber nachgewiesen wurde [15], waren die Positionen, wo das Insert erscheint, gleich. Die Kaninchen-cDNA-Sequenz zeigt eine Homologie von 77 % mit Ratten IGF-IEb, wobei 12 der 17 Reste der erwarteten Aminosäuresequenz identisch sind und eine 99 %-ige Homologie mit humanem IGF-IEc, wobei 13 der 16 Reste der erwarteten Aminosäuresequenz identisch sind (4).
Diskussion
Experimentelle Modelle der Muskelregeneration zeigten, dass IGF-I als trophischer Faktor bei der Muskelregeneration wirken kann [23] und in proliferierenden Myoblasten und Satellitenzellen exprimiert wird [24]. In dieser Studie isolierten wir IGF-I-mRNA in Skelettmuskel, der zu einem raschen longitudinalen Wachstum veranlasst worden war. Dieses Modell wurde gewählt, da es nur zu einer sehr geringen Schädigung der Muskelfasern führt. Die hier vorgelegten Ergebnisse stimmen mit veröffentlichten Arbeiten [25–27] insofern überein, als IGF-I-mRNA in Muskelgewebe exprimiert wird. Sie zeigen jedoch ferner, dass das IGF-I-Gen in den Muskelfasern selbst und nicht nur in Satellitenzellen und Bindegewebszellen exprimiert wird. Die Expression der IGF-I-Transkripte war nicht gleichmäßig und üblicherweise sind es die kleineren Fasern, die hohe Konzentrationen an IGF-I-mRNA zeigen. Eine Untersuchung von Quer- und Längsschnitten zeigte, dass die kleinen Fasern, die IGF-I-mRNA exprimierten, auch die neonatale schwere Myosinkette (MyHC) exprimierte. Ferner wurde gezeigt, dass Fasern von geringem Durchmesser, die neonatales MyHC enthalten, die konischen Enden der größeren Fasern, die im Muskelbauch enden, darstellen [22]. Das longitudinale Wachstum von Skelettmuskel wird durch Addition von neuen Sarkomeren an den Enden der existierenden Myofibrillen erleichtert [28, 29] und das Anfangsstadium beinhaltet die Ablagerung von neonatalem Myosin [22]. Diese Daten stützen die Hypothese, dass die Enden von normalen adulten Fasern den Bereich für longitudinales Wachstum darstellen und dass IGF-I an diesem Prozess beteiligt ist.
Die Beurteilung der Expression der IGF-I-mRNA durch Northern-Blotting lässt darauf schließen, dass sowohl die 7,5 kb- als auch die 1,2 kb-IGF-I-mRNA-Spezies spezifisch durch eine mechanische Stimulation induziert werden, dass ihre Zunahme aber voneinander unabhängig zu sein scheint. Die 1,2 kb-mRNA stieg in sämtlichen gestreckten Muskeln an, was für die 7,5 kb-mRNA nicht immer der Fall war. Derzeit wissen wir nicht, welches Produkt das Transkript für IGF-IEb darstellt. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um diese mRNA zu charakterisieren und festzustellen, welche Kodierungssignalsequenz und andere Elemente diese umfassen.
Die Isolierung von zwei Klassen von cDNA-Klonen (IGF-IEa und IGF-IEb) aus gestrecktem Muskel zeigt, dass beide Formen von IGF-I-mRNA im gestreckten Muskel vorhanden sind. Die IGF-IEa- und die IGF-IEb-cDNA-3'-Sequenzen unterscheiden sich durch die Anwesenheit eines 52 bp-Inserts, das im letztgenannten Produkt die abgeleitete carboxylterminale Aminosäuresequenz verändert. Drei Mechanismen können für das 52 bp-Insert verantwortlich sein. Zunächst könnte das Insert durch eine alternative Spleiß-Donatorstelle von 52 bp in das 5'-Ende eines an dieser Position in der genomischen IGF-I-Sequenz vorhandenen Introns erzeugt werden. Alternativ kann es durch die Verwendung einer abwechselnden Spleiß-Akzeptorstelle 52 bp vom 3'-Ende des entsprechenden Introns erzeugt werden. Schließlich könnte das 52 bp-Insert aus einem vollständig getrennten Exon entstehen [10].
Ein Vergleich der Sequenz von Kaninchen-IGF-IEb mit der Sequenz von Ratten-IGF-IEb [10] und humanem IGF-IEc [15] zeigte, dass IGF-IEb, das erheblich in gestrecktem Muskel hochreguliert wird, offensichtlich das Kaninchen-Gegenstück zu Ratten-IGF-IEb und humanem IGF-IEc darstellt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Kaninchen-IGF-IEb (das Äquivalent zu humanem IGF-IEc) nur im gestreckten Muskel nachweisbar war. Die Tatsache, dass dies eine induzierbare Isoform darstellt, stimmt mit den Ergebnissen von Chew et al. [15] überein, die zeigten, dass nach Stimulation mit physiologischen Konzentrationen an GH das humane IGF-IEc-Transkript in humanem Hepatom-HepG2-Zellen (eine Hepatomlinie) im Vergleich zu humanen IGF-IEa zunimmt. Es wird angenommen, dass die Stelle für IGF-I-Bindungsprotein (BP) in der B-Domäne liegt [30]. Auch die C- und D-Domänen werden als "aktive Regionen" angesehen [31]. Jedoch bleibt die physiologische Rolle des alternativen E-Peptids, das aus IGF-IEa- und IGF-IEb-mRNA erzeugt wird, unbekannt [14]. Es wurde die Auffassung vertreten, dass dieses Peptid die Wechselwirkung von IGF-I mit seinem Rezeptor oder seinen Bindungsproteinen beeinflussen könnte. Ferner wurde die Auffassung vertreten, dass die E-Peptide selbst bestimmte biologische Rollen ausüben, nachdem sie vom Prohormon abgespalten worden sind [14]. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein Teil des E-Peptids ein amidiertes, wachstumsförderndes Peptid mit spezifischen Bindungsstellen in humanen Geweben enthält [32]. Gemäß unseren Befunden scheint das Eb-Peptid nur im gestreckten Muskel induziert zu werden. Dies legt es nahe, dass das Eb-Peptid eine Rolle bei der lokalen Wachstumssteuerung spielen kann, die beispielhaft durch die Längen- und Massenzunahme der Skelettmuskelfasern in Reaktion auf eine mechanische Streckung gezeigt wird. Das Eb-Peptid kann an der Externalisierung von IGF-I und auch an der Bindung von IGF-I an Muskelrezeptoren beteiligt sein.
Es gibt Anzeichen, die darauf schließen lassen, dass das Ea-Peptid in vivo glycosyliert wird. Bach et al. [33] stellten fest, dass das Ea-Peptid im Anschluss an eine in vitro-Translation in Gegenwart von Mikrosomen glycosyliert werden kann. Es wurden keine mutmaßlichen Glycosylierungsstellen aus den Muskel-IGF-IEb-Sequenzdaten festgestellt. Zu möglichen Funktionen für die Unterschiede in der Glycosylierung von Ea und Eb gehören die Verringerung der Halbwertszeit von IGF-IEb, eine unterschiedliche Lokalisierung der beiden Formen und unterschiedliche Affinitäten für Bindungsproteine. Daher ist möglicherweise IGF-IEb vom Typ eines gestreckten Muskels wesentlich kleiner bei einer jedoch kürzeren Halbwertszeit, verglichen mit den Isoformen, die vom normalen Muskel und der Leber erzeugt werden.
Devol et al. [34] berichteten, dass IGF-I-mRNA im Skelettmuskel unabhängig von GH und anderen Hypophysenhormonen ist und wiesen eine Verbindung zwischen lokaler Stimulation des Skelettmuskelwachstums und der IGF-I-Genexpression nach. Das nur im gestreckten Muskel exprimierte Eb stellt ein Anzeichen dafür dar, dass die Expression von IGF-IEb-mRNA möglicherweise bei mechanischer Stimulation eingeschaltet wird, wobei von dieser Stimulation bekannt ist, dass sie ein rasches Muskelwachstum induziert [16]. Das Eb-Peptid kann sodann einen spezifischen Faktor zur Unterscheidung zwischen mechanischer Stimulation und Mechanismen, die mit dem Muskelwachstum verbunden sind, darstellen.
Aus unserer Studie ist ersichtlich, dass verschiedene E-Peptide verschiedene Rollen bei der IGF-I-Aktivität spielen können. Weitere Studien sind erforderlich, um aufzuklären, ob das E-Peptid dieser alternativen IGF-I-mRNA in unterschiedlicher Weise mit dem IGF-I-Rezeptor oder mit IGF-I-Bindungsproteinen in Wechselwirkung tritt oder ob das alternative E-Peptid allein den Wachstumsfaktor dazu befähigt, in autokriner Weise zu wirken.
Literatur

[1] de Pagter-Holthuizen, P., van Schain, F.M.A, Verduijin G.M., van Ommen, G.J.B., Bouma, B.N., Jansen, M., and Sussenbach, J.S. (1986) FEBS Lett. 195, 179–184.
[2] Rotwein, P., Pollock, KM., Didier, D.K, Krivi G.G. (1986) J. Biol. Chem 261, 4828–4832.
[3] Shimatsu, A. and Rotwein, P. (2987) J. Biol/Chem 262, 7894–7900.
[4] Tobin, G., Yee, D., Brunner, N. and Rotwein, P. (1990) Mol. Endocrinol. 4 (12), 1914–1920.
[5] Jansen, E., Steenbergh, P.H., LeRoith, D., Roberts, CT Jr. and Sussenbach J.S. (1991) Mol. Cell. Endocrinol. 78 (1-2), 115–125.
[6] Adamo M.L., Ben-Hur, H., Roberts, CT Jr. and LeRoith, D. (1991) Mol. Endocrinol. 5(11), 1677–1686.
[7] Dickson, MC., Saunders JC. and Gilmour RS. (I 99 i) J. Mol. Endocrinol. 6 (1), 17–31.
[8] Weller, P.A., Dickson, M.C., Huskisson, N.S., Dauncey, M.J., Buttery P.J. and Gilmour, R.S. (1993) J. Mol. Endocrinol. 11, 201–211.
[9] Rinderknecht E. and Humbel R.E. (1987) J. Biol. Chem 253, 2769–2776.
[10] Roberts, CT Jr., Lasky, S.T., Lowe, WL Jr. Seaman, W.T. and LeRoith, D. (1987) Mol. Endocrinol. 1, 243–248.
[11] Jansen M. van Schaik F.M.A, Ricker A. T., Bullock B., Woods, D.E., Gabbay K.R., Nussbaum, A.L., Sussenbach, J. S. and Van den Brande. J.L. (1983) Nature 306, 609–611.
[12] Bell, G.I., Merryweather, J.P., Sanchez-Pescador, R., Stempien, M.M., Priestley, L., Scott, J. and Rall, LB. (1984) Nature 310, 775–777.
[13] Powell, D.R., Lee, P.D., Chang D. Liu, F. and Hintz, R.L. (1987) J. Clin. Endocrinol. Metab. 65, 868–875.
[14] Lowe, WL Jr., Lasky, S.R., LeRoith, D. and Roberts CT Jr. (1988) Mol. Endocrinol. 2, 528–535.
[15] Chew, S.L., Lavender P., Clark A.J.L. and Ross R.J.M. (1995) Endocrinology 136, 1939–1944.
[16] Goldspink, G., Scutt, A., Loughna P. T., Wells, D. J., Jaenicke, T. and Gerlach, G. F. (1992) Am. J. Physiol. 263 (3 Pt 2) R 356–363.
[17] Tabary, J.C., Tabary, C., Tardieu C. Tardieu G. and Goldspink G. (1972) J. Physiol. 224(1), 231–244.
[18] Golspink, D.F. Morton, A.J., Loughna, P. and Goldspink G. [1986) Pflugers Archiv-European Journal of Physiology 407 (3), 333–340.
[19] Goldspink, D.F., Cox, V.M., Smith, S.K, Eaves, L.A., Osbaldeston, N.J., Lee, D.M. and Mantle, D. (1995) Am. J. Physiol. 268, E288–E297.
[20] Chiomczynski, P. and Sacchi, N, (1987) Analyt. Blochem. 162, 156–159.
[21] Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 54635467.
[22] Benjamin, W.C., Donna, M.W., Stacey, D.L., Jacalyn, D.A. and Everett, B. (1995) The Anatomical Record 242, 462–470.
[23] Jennische, E., Skottner, A. and Hansson, H.A. (1987) Acta Physiol. Scand. 129, 9.
[24] Edwall, D., Schalling, M., Jennische, E. and Norstedt, G. (1989) Endocrinology 124, 820 825.
[25] Beck, F., Samani, N.J., Penschow, J.D., Thorley, B., Tregear, G.W. and Coghlan, J.P. (1987) Development 101, 175–184.
[26] Han, V.KM., D'Erocole, A.J. and Lund, P.K (1987) Science 236, 193–197.
[27] Caroni, P. and Schneider C. (1994) J. Neurosci. 14, 3378–3388.
[28] Williams, P.E. and Goldspink, G. [1971) J. Cell Sci 9, 751–767.
[29] Williams, P.E. and Goldspink, G. (1973) J. Anat. 116, 45–46.
[30] DeVroede, M.A., Rechler, M.M., Nissley, S.P., Josni, S., Burke, G.T. and Katsoyannis, P.G. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3010–3014.
[31] Pietrkowski, Z., Wernicke, D., Porcu, P., Jameson, B.A. and Baserga, R. (1992) Cancer Res. 52, 6447–6451.
[32] Siegfhed, L.M., Kasprzyk, P.G., Treston, A.M., Mulshine J. L., Quinn, KA and Cuttitta P. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (17), 8107–8111.
[33] Bach M.A., Roberts CT Jr., Smith E.P. and LeRoith, D. (1990) Mol Endocrinol. 4(6), 899–904.
[34] Devol, D.L., Rotwein, P., Sadow, J.L., Novakofski, J. and Bechtel, P.J. (1990) Am. J. Physiol. 259, E89–E95.

Legende zu den Figuren
1: Expression von IGF-I-mRNA, untersucht durch Northern-Blotting in gestrecktem (E)-Extensor digitorum longus (EDL)-Muskel und im entsprechenden Kontrollmuskel (C).
2: Lokalisierung und Verteilung von IGF-I-mRNA in gestrecktem (A: Querschnitt; B: Längsschnitt) Extensor digitorum longus (EDL)-Muskel und im entsprechenden Kontrollmuskel (C). Die sense-RNA-Sonde aus dem gleichen Klon wurde am gestreckten Muskel (D) als negative Kontrolle verwendet. Maßstabbalken: 30 μm.
3: DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenzen von Kaninchen-IGF-I-cDNA, isoliert aus gestrecktem Muskel. Die beiden Typen von cDNA-Sequenzen unterscheiden sich durch das Vorliegen (IGF-IEb) oder das Fehlen (IGF-IEa) eines 52 Basenpaar-Inserts (unterstrichen) von Position 288 bis Position 340. Das Insert veränderte die abgeleitete C-terminale Aminosäuresequenz des E-Peptids (Unterstreichung im Fall von IGF-IEb), veränderte die Leseraster und verwendete zwei verschiedene TAG-Stoppcodons (end). Die mutmaßliche Glycosylierungsstelle (Asn-Thr-Ser) (markiert mit ♦ ♦ ♦) ist im Ea-Peptid, jedoch nicht im Eb-Peptid vorhanden.
4: Ausrichtung der drei abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Inserts von Rattenleber (unten), humaner Leber (Mitte) und gestrecktem Kaninchenmuskel (oben). Identische Aminosäurereste sind eingerahmt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Polypeptids des Insulin-artigen Wachstumsfaktors I (IGF-I) für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Muskelerkrankung, wobei das Polypeptid folgendes umfasst: (i) ein C-terminales Peptid des Insulin-artigen Wachstumsfaktors I (IGF-I), dessen Sequenz diejenige ist von (a) dem humanen Ec-Peptid, das eine Länge von 24 Aminosäuren besitzt und beginnt mit Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys, (b) dem aus Kaninchen stammenden Eb-Peptid, das Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys ist, oder (c) dem aus der Ratte stammenden Eb-Peptid, das beginnt mit Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys; oder (ii) ein C-terminales Peptid von IGF-I, codiert von einem muskelspezifischen RNA-Transkript, das spezifisch durch Streckung induziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Muskelerkrankung Muskeldystrophie ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Muskelerkrankung Muskelatrophie oder ein verwandter Zustand ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Muskelatrophie bei alternden Menschen vorliegt oder Muskelatrophie ist, die durch Rückenmarksverletzungen oder eine neuromuskuläre Erkrankung verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments für die Verhinderung einer Herzmuskelerkrankung, einer Erkrankung, bei der die Förderung der Herzmuskelproteinsynthese eine nutzbringende Behandlung ist, einer Cardiomyopathie, akutem Herzversagen oder akutem Herzanfall.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der akute Herzanfall Myokarditis oder Myokardinfarkt ist.
Verwendung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung des Herzminutenvolumens durch Erhöhen des Herzschlagvolumens.
Polypeptid des Insulin-artigen Wachstumsfaktors I (IGF-I), umfassend: (i) ein C-terminales Peptid des Insulin-artigen Wachstumsfaktors I (IGF-I), dessen Sequenz diejenige ist von (a) dem humanen Ec-Peptid, das eine Länge von 24 Aminosäuren besitzt und beginnt mit Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys, (b) dem aus Kaninchen stammenden Eb-Peptid, das Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys ist, oder (c) dem aus der Ratte stammenden Eb-Peptid, das beginnt mit Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys; oder (ii) ein C-terminales Peptid von IGF-I, codiert von einem muskelspezifischen RNA-Transkript, das spezifisch durch Streckung induziert wird zur Verwendung in einem Verfahren der Behandlung oder Therapie des menschlichen oder tierischen Körpers.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Polypeptid des Insulin-artigen Wachstumsfaktors I (IGF-I), umfassend: (i) ein C-terminales Peptid des Insulin-artigen Wachstumsfaktors I (IGF-I), dessen Sequenz diejenige ist von (a) dem humanen Ec-Peptid, das eine Länge von 24 Aminosäuren besitzt und beginnt mit Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys, (b) dem aus Kaninchen stammenden Eb-Peptid, das Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys ist, oder (c) dem aus der Ratte stammenden Eb-Peptid, das beginnt mit Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lyst oder (ii) ein C-terminales Peptid von IGF-I, codiert von einem muskelspezifischen RNA-Transkript, das spezifisch durch Streckung induziert wird zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 in einer Formulierung, die für die orale oder parenterale Applikation geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 in einer Formulierung, die für die intravenöse oder intramuskuläre Applikation geeignet ist.