DE69932255T2

DE69932255T2 - Hgh-rh(1-29)nh2 analoge mit antagonistischer aktivität gegen igf-i und -ii

Info

Publication number: DE69932255T2
Application number: DE69932255T
Authority: DE
Inventors: V. Andrew Metairie SCHALLY; Jozsef Varga; Marta Zarandi
Original assignee: Tulane University
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1999-11-23
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: CN100422211C; PL349877A1; WO2000031136A9; AU2029100A; CA2351665A1; BG65137B1; SK7252001A3; BG105638A; HK1036461A1; TR200101492T2; HUP0105094A2; EP1133522A1; HUP0105094A3; EP1133522B1; NZ511307A; KR100629013B1; DK1133522T3; ATE332310T1; ES2264279T3; AU757222B2

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Vorliegende Erfindung wurde teilweise mit Unterstützung der Regierung seitens des Medical Research Service of the Veterans Affairs Department gemacht. Die Regierung hat an vorliegender Anmeldung gewisse Rechte.
Vorliegende Erfindung betrifft neue synthetische Peptide, welche die Freisetzung von Wachstumshormon aus der Hypophyse bei Säugetieren hemmen sowie therapeutische Zusammensetzungen mit einem Gehalt an diesen neuen Peptiden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Wachstumshormon („GH") ist ein Peptid mit 191 Aminosäuren, welches die Bildung zahlreicher unterschiedlicher Wachstumsfaktoren, wie z. B. den insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) stimuliert und so das Wachstum zahlreicher Gewebe (Skelett, Bindegewebe, Muskel und Eingeweide) sowie physiologische Aktivitäten (Erhöhung der Nukleinsäure- und Proteinsynthese und Lypolyse, jedoch Verringerung der Erniedrigung der Harnstoffsekretion) fördert.
Die Freisetzung von GH ist unter der Steuerung von Freisetzung- und Hemmungsfaktoren, die vom Hypothalamus abgesondert werden. Der primäre Freisetzungsfaktor ist das Wachstumshormon freisetzende Hormon („GH-RH"); menschliches Wachstumshormon freisetzendes Hormon („hGH-RH") ist ein Peptid mit 44 Aminosäuren. Die neuen Peptide gemäß vorliegender Erfindung betreffen Analoge von hGH-RH mit lediglich Resten 1-29 („hGH-RH(1-29)NH₂"), d.h. Analoge des Peptids, welches die Aminosäuresequenz
Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile⁵-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys-Val-Leu-Gly¹⁵-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp²⁵-Ile-Met-Ser-Arg²⁹-NH₂
besitzt.
GH wurde mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht. Eine Krankheit, in die GH verwickelt ist, ist die Akromegalie, bei der übermäßige GH-Spiegel vorliegen. Die abnorm vergrößerten facialen Knochen und Knochen der Extremität dieser Erkrankung kann durch Verabreichung eines GH-RH-Antagonisten behandelt werden.
Weitere Krankheiten, die mit GH zu tun haben, sind die diabetische Retinopathie und diabetische Nephropathie. Die Schädigung der Retina bzw. der Nieren bei diesen Krankheiten, von der angenommen wird, dass sie dem GH zuzuschreiben sind, führt zur Blindheit oder zur Verminderung der Nierenfunktion. Die Schädigung kann durch Verabreichung eines wirksamen GH-RH-Antagonisten verhindert oder verlangsamt werden.
Die Hauptanwendung von GH-RH-Antagonisten liegt jedoch auf dem Krebsgebiet (A.V. Schally u.a. in Growth Hormone Secretagogues in Clinical Practice, Herausgeb. Bercu, B.B. und Walker, R.F., Dekker, New York, S. 145-162, 1998). IGF-I und -II sind für verschiedene Krebsarten stark wirksame Mitogene. Durch Unterdrückung der GH-Sekretion verringern GH-RH-Antagonisten die Synthese von IGF-I in der Leber und anderen Geweben. GH-RH-Antagonisten vermindern auch die autokrine und parakrine Bildung von IGF-I und/oder IGF-II durch verschiedene Tumore. Bei verschiedenen experimentellen Krebsarten führt die Behandlung mit Antagonisten von GH-RH zu einer Verminderung von IGF-I und IGF-II, begleitet von einer Hemmung des Tumorwachstums.
In einer Anstrengung, in diese Krankheiten und andere Zustände einzugreifen, versuchten einige Forscher, unter Verwendung von Somatostatin, einem Hemmer der GH-Freisetzung, die GH-Spiegel zu steuern. Jedoch unterdrückt Somatostatin, wenn es allein verabreicht wird, nicht die GH- oder IGF-I-Spiegel auf einen gewünschten Grad. Viel besser verbessert Somatostatin die Unterdrückung von IGF-I-Spiegeln, wenn es in Kombination mit einem GH-RH-Antagonisten verabreicht wird.
Wissenschaftler untersuchten verschiedene Modifikationen von GH-RH, um das Verhältnis der Struktur von GH-RH zu seiner Aktivität in Bemühen, synthetische Artverwandte mit verbesserten agonistischen oder antagonistischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen. So war frühzeitig bewiesen, dass ein GH-RH-Fragment, das die Reste 1 bis 29 oder GH-RH(1-29) umfasst, die für eine biologische Wirksamkeit erforderliche minimale Sequenz ist. Dieses Fragment behält 50% oder mehr der Wirksamkeit von nativem GH-RH bei.
Es wurde gefunden, dass der zuerst beschriebene GH-RH-Antagonist, [Ac-Tyr¹, D-Arg²]hGH-RH(1-29)NH₂], der in der Literatur in der Regel als „Standardantagonist" bezeichnet wird, die Aktivierung der Adenylatcyclase der Rattenadenohypophyse durch hGH-RH(1-29)NH₂ verhindert. Das gleiche Peptid blockierte die Wirkung von GH-RH auf seine Rezeptoren in der Hypophyse und im Hypothalamus und hemmte die pulsierende Wachstumshormon-Sekretion.
Eine beträchtliche Anzahl von Patenten und Publikationen in der offenen Literatur offenbart Analoge von GH-RH, welche entweder als Agonisten von GH-RH wirken (d.h., sie wirken unter Stimulierung der Freisetzung von GH) oder aber als Antagonisten von GH-RH wirken (d.h. sie wirken unter Hemmung der Freisetzung von GH). Die meisten dieser Peptide leiten sich von der Peptidsequenz GH-RH(1-29) ab, mit speziellen strukturellen Modifizierungen, welche für ihre erhöhten agonistischen oder antagonistischen Eigenschaften verantwortlich sind.
So offenbart das U.S.-Patent 4.659.693 antagonistische GH-RH-Analoga, welche in der Stellung 2 der GH-RH(1-29)-Sequenz bestimmte N,N'-Dialkyl-omegaguanidino-α-aminoacylreste enthalten.
Die veröffentlichte Anmeldung WO 91/16923 gibt einen Überblick über frühere Versuche, die Sekundärstruktur von hGH-RH durch Modifizieren seiner Aminosäuresequenz zu verändern. Diese früheren Versuche umfassen: Ersatz von Tyr¹, Ala², Asp³ oder Asn⁸ durch ihre D-Isomeren; Ersatz von Asn⁸ mit L- oder D-Ser, D-Arg, Asn, Thr, Gln oder D-Lys; Ersatz von Ser⁹ mit Ala zur Erhöhung der Amphilizät des Bereichs; und Ersatz von Gly¹⁵ mit Ala oder Aib. Wenn in den Analogen R² = D-Arg ist, und R⁸, R⁹ und R¹⁵ wie zuvor angegeben substituiert sind, soll sich eine antagonistische Aktivität ergeben. Diese antagonistischen Peptide sollen zur Verabreichung als pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Zuständen geeignet sein, welche übermäßigen Spiegeln von GH zugeordnet werden, d.h. Akromegalie.
Die antagonistische Wirksamkeit des hGH-RH-Analogen „[Ser⁹-ψ[CH₂-NH]Tyr¹⁰]hGH-RH(1-29)" des U.S.-Patents 5.084.555 soll aus der Pseudopeptidbindung (d.h., eine Peptidbindung, die auf eine Bindung [CH₂-NH] vermindert ist) zwischen den Resten R⁹ und R¹⁰ resultieren. Jedoch wird gesagt, dass die antagonistischen Eigenschaften von [Ser⁹-ψ[CH₂-NH]Tyr¹⁰]hGH-RH(1-29) gegenüber dem Standardantagonisten [N-Ac-Tyr¹, D-Arg²]GH-RH(1-29)NH₂ unterlegen sind.
Das U.S.-Patent 5.550.212 und die US-Patentanmeldung 08/642.472, auf den gleichen Bevollmächtigten wie bei vorliegender Anmeldung übertragen, offenbart Analoga von hGH-RH(1-29)NH₂, welche erhöhte antagonistische Eigenschaften und eine verlängerte Wirkungsdauer besitzen sollen. Es wird angenommen, dass diese Eigenschaften sich aus dem Ersatz verschiedener Aminosäuren und einer Acylierung mit aromatischen oder nicht-polaren Säuren am N-Terminus von GH-RH(1-29)NH₂ ergeben. Es wird vermerkt, dass im zuvor genannten U.S-Patent und der zuvor genannten U.S-Patentanmeldung R⁹ immer Ser, R¹⁶ Gln oder eine, eine Lactambrücke bildende Aminosäure (d.h. Glu), R²⁸ ist Ser, Asn, Asp, Ala oder Abu und R²⁹ Agm sind, Arg-NH₂, Arg-OH, Cit-NH₂, Cit-OH, Har-NH₂, Har-OH oder eine Aminosäure sind, welche eine Lactambrücke bildet (d.h. Lys oder Orn).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wird eine neue Reihe synthetischer Analoga von hGH-RN(1-29)NH₂ zur Verfügung gestellt. Diese Analoga hemmen die Aktivität von endogenem hGH-RH und verhindern deshalb die Freisetzung von Wachstumshormon. Die stärkeren Hemmungswirksamkeiten der neuen Analoga im Vergleich zu zuvor beschriebenen ergibt sich aus dem Ersatz verschiedener Aminosäuren.
Im Speziellen betrifft vorliegende Erfindung Peptide, umfassend die Formeln:
X-R¹-R²-Asp-Ala-R⁵-R⁶-Thr-R⁸-R⁹-R¹⁰-Arg-R¹²-R¹³-R¹⁴-R¹⁵-R¹⁶-Leu-R¹⁸-R¹⁹-Arg-R²¹-R²²-Leu-Gln-Asp-Ile-R²⁷-R²⁸-R²⁹-NH₂
worin X PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- oder 2-Npr oder Fpr ist,
R¹ Tyr oder His,
R² D-Arg oder D-Cit,
R⁵ Ile oder Val,
R⁶ Phe, Nal oder Phe(Y), worin Y = F, Cl, Br,
R⁸ Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu oder Aib,
R⁹ Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn oder Cit sind.
R¹⁰ ist Tyr oder Phe(Y), worin Y = H, F, Cl, Br oder OCH₃,
R¹² ist Lys, D-Lys oder Orn,
R¹³ ist Val oder Nle,
R¹⁴ ist Leu oder Nle,
R¹⁵ ist Gly, Ala, Abu, Nle oder Gln,
R¹⁶ ist Gln oder Arg,
R¹⁸ ist Ser oder Nle,
R¹⁹ ist Ala oder Abu,
R²¹ ist Lys oder Orn,
R²² ist Leu, Ala oder Aib,
R²⁷ ist Met; Leu, Nle, Abu oder D-Arg,
R²⁸ ist Arg oder D-Arg,
R²⁹ ist Arg, D-Arg, Har oder D-Har, sowie deren pharmazeutisch brauchbaren Salze.
Unter den bevorzugten Ausführungsformen sind Peptide, worin X PhAc, IndAc oder Nac, R¹ Tyr oder His, R² d-Arg, R⁵ Ile, R⁶ Phe(pCl), R⁸ Asn oder Abu, R⁹ Arg oder Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn oder Cit ist, R¹ Tyr oder Tyr(Me), R¹² Lys, R¹³ Val oder Nle, R¹⁴ Leu oder Nle, R¹⁵ Abu, Ala oder Nle, R¹⁶ Gln oder Arg, R¹⁸ Ser oder Nle, R¹⁹ Ala oder Abu, R²¹ Lys, R²⁷ Nle oder D-Arg, R²⁸ D-Arg oder Arg, R²⁹ D-Arg, Har oder D-Har sind.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Aminosäurereste von 30-44 des nativen GH-RH-Moleküls für die Wirksamkeit nicht wesentlich erscheinen; noch scheint ihre Identität kritisch zu sein. Infolgedessen scheint es, dass die Hinzufügung eines oder sämtlicher dieser weiteren Aminosäurereste zum C-Terminus der hGH-RH(1-29)-NH₂-Analoga vorliegender Erfindung die Wirksamkeit dieser Analoga als hGH-RH-Antagonisten nicht beeinflusst. Wenn eine oder alle diese Aminosäuren dem C-Terminus der hGH-RH(1-29)NH₂-Analoga zugefügt wird, können die zugefügten Aminosäurereste die gleichen wie die Reste 30-44 in der nativen hGH-RH-Sequenz oder vernünftige Äquivalente sein.
Syntheseverfahren
Die synthetischen Peptide werden nach einem geeigneten Verfahren wie z. B. durch ausschließliche Festphasenverfahren, durch partielle Festphasen verfahren, durch Fragmentkondensation oder durch klassische Lösungsphasensynthese hergestellt.
Wenn die Analoga gemäß vorliegender Erfindung nach dem Festphasen-Verfahren hergestellt werden, wird der C-Terminusrest (im vorliegenden R²⁹) zweckmäßigerweise an einen inerten festen Träger (Kunstharz) gebunden (verankert), während sie Schutzgruppen für ihre α-Aminogruppe (und, wenn zweckmäßig, für ihre funktionelle Seitenkettengruppe) tragen. Nach Abschluss dieser Stufe wird die α-Amino-Schutzgruppe vom verankerten Aminosäurerest entfernt, und der nächste Aminosäurerest, R²⁸, wird zugegeben, während seine α-Aminogruppe (ebenso wie jegliche geeignete funktionelle Seitenkettengruppe) in geeigneter Weise geschützt wird, und so weiter. Die N-Terminus-Schutzgruppen werden nach Zugabe eines jeden Rests entfernt, aber die Seitenkette-Schutzgruppen werden noch nicht entfernt. Nachdem alle erwünschten Aminosäuren in der richtigen Sequenz verbunden wurden, wird das Peptid vom Träger abgespalten und von der Seitenketten-Schutzgruppe bzw. allen Seitenkettenu-Schtzgruppen unter Bedingungen befreit, die hinsichtlich Resten in der Sequenz minimal schädlich sind. Dies wird durch eine sorgfältige Reinigung und peinlich genaue Charakterisierung des synthetischen Produkts erreicht, um zu gewährleisten, dass die erwünschte Struktur tatsächlich die erhaltene ist.
Es wird besonders bevorzugt, die α-Aminofunktion der Aminosäuren während der Kopplungsstufe mit einer säure- oder baseempfindlichen Schutzgruppe zu schützen. Derartige Schutzgruppen sollten die Eigenschaften einer Stabilität unter den Bedingungen einer Peptidbindungsbildung besitzen, während sie ohne Beschädigung der Wachstumspeptidkette und ohne Racemisierung irgendeiner der hierin enthaltenen chiralen Zentren leicht entfernbar sind. Geeignete α-Amino-Schutzgruppen sind Boc und Fmoc.
Medizinische Anwendungen
Die hGH-RH-Antagonistpeptide oder Salze dieser Peptide können in pharmazeutische Dosierungsformen formuliert werden, welche wirksame Mengen derselben enthalten, und sie können Menschen oder Tieren zur therapeutischen oder diagnostischen Zwecken verabreicht werden. Die Peptide können zur Unterdrückung von GH-Spiegeln und zur Behandlung von Zuständen verwendet werden, welche mit übermäßigen Spiegeln von GH, d.h., diabetischer Retinophathie und Nephropathie sowie Akromegalie verbunden sind, zu behandeln. Auch werden Verfahren zur Behandlung dieser Krankheiten durch Verabreichung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung an ein Individuum bereitgestellt, welches eine derartige Behandlung benötigt. Die Hauptverwendungen von GH-RH-Antagonisten liegen jedoch auf dem Krebsgebiet, wie z. B. menschlichen Karzinomen der Brust, Lunge, des Dickdarms, Gehirns, der Bauchspeicheldrüse und Prostata, wo die Rezeptoren für IGF-I oder IGF-II vorliegen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
I ist ein Schaubild der Volumenveränderungen von MXT-Brustkarzinomen bei der Maus während der Behandlung mit bestimmten GH-RH-Antagonisten, aufgetragen gegen die Behandlungstage.
II ist ein Schaubild der Volumenveränderungen von menschlichen MDAMB-468 Brustkarzinomen bei enthaarten Mäusen während der Behandlung mit bestimmten GH-RH-Antagonisten, aufgetragen gegen die Behandlungstage.
III ist ein Schaubild der Volumenveränderungen von menschlichen HAT-29 Brustkarzinomen bei enthaarten Mäusen während der Behandlung mit bestimmten GH-RH-Antagonisten, aufgetragen gegen die Behandlungstage.
IV ist ein Schaubild der Volumenveränderungen von menschlichem U87MG Glioblastomen bei enthaarten Mäusen während der Behandlung mit einem GH-RH-Antagonisten, aufgetragen gegen die Behandlungstage.
V ist ein Schaubild der Volumenveränderungen von menschlichen PC-3 Prostatakarzinomen bei enthaarten Mäusen während der Behandlung mit bestimmten GH-RH-Antagonisten, aufgetragen gegen die Behandlungstage.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
A. Abkürzungen
Die zur Definition der Peptide verwendete Nomenklatur ist diejenige welche durch IUPAC-IUB Commissioner on Biochemical Nomenclature ausgewiesen ist, wobei in Übereinstimmung mit herkömmlicher Darstellung die Aminogruppe am N-Terminus links, und die Carboxylgruppe am C-Terminus rechts erscheint. Der im vorliegenden verwendete Begriff „natürliche Aminosäure" bedeutet eine der üblichen, natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, die in natürlich vorkommenden Proteinen gefunden werden: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met Phe, Tyr, Pro, Trp und His. Wenn der natürliche Aminosäurerest isomere Formen aufweist, ist es die L-Form der Aminosäure, die im vorliegenden dargestellt wird, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben ist.
Nicht-kodierte Aminosäuren oder Aminosäureanaloga sind auch in die GH-RH-Antagonisten einbezogen. („Nicht-codierte" Aminosäuren sind diejenigen Aminosäuren, welche nicht unter den nahezu 20 natürlichen Aminosäuren bei natürlich vorkommenden Peptiden gefunden werden.) Unter den nicht-codierten Aminosäuren oder Aminosäureanaloga, welche bei den hGH-RH-Antagonistpeptiden benutzt werden können, sind folgende: unter Abu wird α-Aminobuttersäure verstanden, unter Aib wird α-Aminoisobuttersäure verstanden, unter Har wird Homoarginin verstanden, unter Nal wird 2-Naphthylanalin verstanden, unter Nle wird Norleucin verstanden, während unter Orn Ornithin verstanden wird. Wenn diese nicht-codierten Aminosäuren oder Aminosäureanaloga isomere Formen besitzen, ist es die L-Form der Aminosäure, welche dargestellt ist, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben.
Im vorliegenden verwendete Abkürzungen sind:

Abu: α-Aminobuttersäure
Ac: Acetyl
AcOH: Essigsäure
Ac₂O: Acetanhydrid
Aib: α-Aminoisobuttersäure
Boc: tert. Butyloxycarbonyl
Bom: Benzyloxymethyl
2BrZ: 2-Brombenzyloxycarbonyl
cHx: Cyclohexyl
Cit: Citrullin(2-amino-5-ureidovaleriansäure)
2ClZ: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
DCM: Dichlormethan
DIC: N,N'-Diisopropylcarbodiimid
DIEA: Diisopropylethylamin
DMF: Dimethylformamid
Fmoc: Fluorenylmethyloxycarbonyl
Fpr: 3-Phenylpropionyl
GH: Wachstumshormon
GH-RH: GH freisetzendes Hormon
Har: Homoarginin
HBTU: 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat
hGH-RH: menschliches GH-RH
HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol
HPLC: Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
Ibu: Isobutyryl
IndAc: Indol-3-acetyl
MBHA: para-Methylbenzylhydrylamin
MeOH: Methanol
MeCN: Acetonitril
Nac: 1-Naphthylacetyl
Nal: 2-Naphthylalanin
NMM: N-Methylmorpholin
Npr: Naphthylpropionyl
PAM: Phenylacetamidomethyl
Phe(pCl): para-Chlorphenylalanin
PhAc: Phenylacetyl
rGH-RH: GH-RH der Ratte
RP-HPLC: Umkehrphasen-HPLC
TFA: Trifluoressigsäure
Tos: para-Toluolsulfonyl
Tyr(Me): Tyrosinmethylether
Z: Benzyloxycarbonyl

B. Die GH-RH-Analoga
Die hGH-RH-Analoga gemäß vorliegender Erfindung wurden entwickelt, um die Affinitäten der Peptide zum Rezeptor zu erhöhen, die metabolische Stabilität zu verbessern und die amphiphile Sekundärstruktur der Moleküle zu maximieren. Viele dieser Analoga verursachen eine sehr wirksame und lang anhaltende Hemmung der durch hGH-RH(1-29)NH₂ stimulierten GH-Freisetzung in vitro und in vivo.
Folgende Ausführungsformen sind speziell bevorzugt, da sie beachtliche Bioaktivität aufweisen:
Sechs äußerst bevorzugte Ausführungsformen besitzen die Formeln:
Unter gut eingeführter Übereinkunft können diese wie folgt abgekürzt werden:
C. Herstellungsverfahren
1. Übersicht über die Synthese
Die Peptide werden nach geeigneten Verfahren hergestellt, beispielsweise durch ausschließliche Festphasenverfahren, durch partielle Festphasenverfahren, durch Fragmentkondensation oder durch klassische Lösungsphasensynthese. Beispielsweise sind die Verfahren einer ausschließlichen Festphasensynthese in den Leitfäden „Solid Phase Peptide Synthesis", J. M. Stewart und J. D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 1984 (2. Auflage) und M. Bodanszky, „Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag, 1984 dargelegt. Die hGH-RH-Antagonistpeptide werden vorzugsweise unter Anwendung einer Festphasensynthese hergestellt, wie z. B. allgemein von Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 S. 2149 (1963) beschrieben, obgleich andere bekannte, gleichwertige chemische Synthesen ebenfalls angewandt werden können, wie zuvor erwähnt.
Die Synthese wird mit Aminosäuren durchgeführt, welche an ihrer α-Aminogruppe geschützt sind. Schutzgruppen vom Urethantyp (Boc oder Fmoc) werden vorzugsweise zum Schutz der α-Aminogruppe verwendet. Die bevorzugte Schutzgruppe ist Boc.
Bei der Festphasensynthese wird der N-α-geschützte Aminosäurerest, welcher die Aminoacylgruppe des Endpeptids am C-Terminus bildet, über eine chemische Bindung an einen Polymerkunstharzträger gebunden. Nach Abschluss der Kopplungsreaktion wird die α-Amino-Schutzgruppe selektiv entfernt, um zu ermöglichen, dass nachfolgende Kopplungsreaktionen am Amino-Terminus stattfinden, vorzugsweise mit 50%iger TFA in DCM, wenn die N-α-Schutzgruppe Boc ist. Die restlichen Aminosäuren mit ähnlich durch Boc geschützten α-Aminogruppen werden stufenweise an die freie Aminogruppe der vorhergehenden Aminosäure am Kunstharz gekoppelt, um die erwünschte Peptidsequenz zu erhalten. Weil die Aminosäurereste an die α-Aminogruppe des C-Terminusrests gekoppelt werden, beginnt der Wachstum der synthetischen hGH-RH-Analogapeptide am C-Terminus und schreitet in Richtung des N-Terminus fort. Wenn die erwünschte Sequenz erhalten wurde, wird das Peptid am N-Terminus acyliert und von dem Trägerpolymer entfernt.
Jede geschützte Aminosäure wird im Überschuss (2,5 oder 3 Äquivalente) verwendet, und die Kopplungsreaktionen werden üblicherweise in DCM, DMF oder deren Gemischen durchgeführt. Das Ausmaß des Abschlusses der Kopplungsreaktion wird bei jeder Stufe durch die Ninhydrinreaktion überwacht. In Fällen, wo eine unvollständige Kopplung nachgewiesen wird, wird das Kopplungsverfahren wiederholt, oder eine Verkappung (capping) durch Acetylierung nicht-umgesetzter Aminogruppen wird vor der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe vor dem Koppeln der nächsten Aminosäure durchgeführt.
Ein typischer Synthesezyklus wird in folgender Tabelle I gezeigt: Tabelle I Protokoll für einen typischen Synthesezyklus unter Anwendung der Boc-Strategie
Nach Abschluss der Synthese kann unter Anwendung in der Peptidchemie gut bekannter Verfahren die Spaltung des Peptids vom Kunstharz vorgenommen werden.
Einige der Aminosäurereste der Peptide besitzen funktionelle Seitengruppen, welche mit Reagenzien reaktionsfähig sind, die beim Koppeln oder der Schutzgruppenentfernung benutzt werden. Wenn derartige Seitenkettengruppen vorliegen, werden geeignete Schutzgruppen mit diesen funktionellen Gruppen vereint, um unerwünschte chemische Umsetzungen zu verhindern, welche während den zur Bildung der Peptide benutzten Umsetzungen auftreten. Bei der Auswahl einer speziellen Seitenkettenschutzgruppe werden folgende allgemeinene Richtlinien befolgt:
(a) die Schutzgruppe behält vorzugsweise ihre schützenden Eigenschaften bei und wird unter den Kopplungsbedingungen nicht abgespalten, (b) die Schutzgruppe sollte unter den Bedingungen zur Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe bei jeder Synthesestufe stabil sein, (c) die Seitenkettenschutzgruppe muss nach Abschluss der Synthese von der erwünschten Aminosäuresequenz unter Reaktionsbedingungen entfernbar sein, die die Peptidkette nicht unerwünscht verändern.
Die reaktionsfähigen funktionellen Seitenkettengruppen werden vorzugsweise wie folgt geschützt: Benzyl für Thr und Ser; 2-Brom-benzyloxycarbonyl für Tyr; p-Toluol-sulfonyl oder Nitro für Arg und Har; 2-Chlorbenzyloxycarbonyl oder Fluorenylmethyloxycarbonyl für Lys, Orn; Benzyloxymethyl für His; und Cyclohexyl oder Fluorenylmethyl für Asp und Glu. Die Seitenketten von Asn und Gln werden nicht geschützt.
3. Stufenweises Koppeln von Aminosäureresten an das Trägerpolymer
Die hGH-RH-Antagonistpeptide können an den verschiedensten Trägerpolymeren, z. B. MBHA, Merrifield, PAM oder Wang-Kunstharzen synthetisiert werden. Wenn zur Synthese N-α-Boc-geschützte Aminosäuren verwendet werden, ist das bevorzugte Kunstharz MBHA. In diesem Fall werden nach der Abspaltung Peptide mit einem amidierten C-Terminus erhalten.
Zuerst wird die C-terminale Aminosäure an das neutralisierte MBHA-Kunstharz gebunden, wonach die nachfolgenden Aminosäure-Kopplungen durchgeführt werden. Jede geschützte Aminosäure wird in einem etwa dreifach molaren Überschuss gekoppelt bezüglich der Kunstharz gebundenen freien Aminoreste, und das Koppeln kann in einem Medium wie DMF: CH₂Cl₂ (1:1) oder in DMF oder CH₂Cl₂ allein durchgeführt werden. Die Auswahl eines geeigneten Kopplungsreagenz liegt innerhalb der Fachkenntnis. Besonders geeignet als Kopplungsreagenzien sind N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) oder HBTU, kombiniert mit HOBt. Der Erfolg der Kopplungsreaktion in jeder Stufe der Synthese wird vorzugsweise durch die Ninhydrinreaktion überwacht. In Fällen, wo eine unvollständige Kopplung auftritt, wird entweder das Kopplungsverfahren wiederholt, oder die Kunstharz gebundenen, nicht-umgesetzten Aminoreste werden unter Verwendung von Ac₂O/DCM acetyliert.
Die Endacylierung des N-Terminus des Peptids wird auf dem gleichen Weg wie die vorhergehenden Kopplungen vorgenommen, mit dem Unterschied, dass die geeignete Carbonsäure anstelle einer Aminosäure benutzt wird.
4. Entfernung des Peptids vom Trägerpolymer
Wenn die Synthese vollständig ist, wird das Peptid von der Trägerphase abgespalten. Die Entfernung des Peptids vom Kunstharz wird durch Behandlung mit einem Reagenz wie Flusssäure durchgeführt, welche auch alle restlichen Seitenketten-Schutzgruppen abspaltet.
Zweckmäßigerweise wird das getrocknete und geschützte Peptid-Kunstharz mit einem Gemisch behandelt, das aus 1,0 ml m-Cresol und 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff pro Gramm Peptid-Kunstharz während 60 Minuten bei 0°C behandelt, um das Peptid vom Kunstharz abzuspalten sowie alle Seitenketten-Schutzgruppen zu entfernen. Nach Entfernung des Fluorwasserstoffs unter einem Stickstoffstrom und Vakuum werden die freien Peptide mit Äther ausgefällt, filtriert, mit Äther und Ethylacetat gewaschen, mit 50%iger Essigsäure extrahiert und gefriergetrocknet.
5. Reinigung
Die Reinigung der rohen Peptide kann unter Anwendung in der Peptidchemie gut bekannter Verfahren vorgenommen werden. Beispielsweise kann eine Reinigung an einem MacRabbit HPLC-Systems (Rainin Instrument Co., Woburn, MA) mit einem Knauer UV-Photometer und einem Kipp und Zonen BD40-Rekorder unter Verwendung einer Vydac 218TP5010 Umkehrphasenkolonne (10 × 250 mm, gepackt mit C18 Silicagel, Porengröße 300 Å, Teilchengröße 5 μm; (The Separations Group Inc., Hesperia, CA) durchgeführt werden. Die Säule wird mit einem Lösungsmittelsystem eluiert, das besteht aus: (A) 0,1 %iger wässeriger TFA und (B) 0,1 %iger TFA in 70%igem wässerigen MeCN auf Art eines linearen Gradienten (wie z. B. 30-55% B in 120 Minuten). Das Eluat wird bei 220 nm überwacht, und Fraktionen werden durch analytische HPLC unter Verwendung eines Flüssigkeitschromatographen Hewlett-Packard Model HP-1090 geprüft und vereint, um maximale Reinheit zu erhalten. Die analytische HPLC wird an einer Vydac 218TP52 Umkehrphasensäule (2 × 250 mm, C18, 300 Å, 5 μm) unter Anwendung einer isokratischen Elution mit einem Lösungsmittelsystem, das aus (A) und (B), wie weiter oben definiert, bestand durchgeführt. Die Peaks wurden bei 220 und 280 nm überwacht. Durch analytische HPLC wurde beurteilt, dass sie im wesentlichen (> 95%) rein waren. Die erwartete Aminosäurezusammensetzung wird ebenfalls durch Aminosäureanalyse bestätigt.
D. Pharmazeutische Zusammensetzung
Die erfindungsgemäßen Peptide können in Form pharmazeutisch brauchbarer nicht-toxischer Salze, wie z. B. Säureadditionssalze, verabreicht werden. Beispielhaft für derartige Säureadditionssalze sind das Hydrochlorid, Hydrobromit, Sulfat, Phosphat, Fumarat, Gluconat, Tannat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Alginat, Pamoat, Malat, Ascorbat, Tartarat und dergleichen. Besonders bevorzugte Antagonisten sind Salze geringer Löslichkeit, wie z. B. Pamoatsalze und dergleichen. Diese zeigen eine lange Dauer der Wirksamkeit.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden in geeigneter Weise an Menschen oder Tieren subkutan, intramuskulär oder intravenös; intranasal oder durch Lungeninhalation oder aber in Depotform (wie z. B. Mikrokapseln, Mikrogranalien oder zylindrische stabähnliche Implantate, formuliert aus einem bioabbaubaren geeigneten Polymeren (wie z. B. D, L-Lactid-coglycolid) verabreicht, wobei die ersten beiden Depotarten bevorzugt werden. Andere gleichwertige Verabreichungsarten liegen ebenfalls innerhalb des Erfindungsbereichs, was heißt, ein kontinuierlicher Tropf, Depotinjektionen, Infusionspumpe und zeitliche Freisetzungsarten wie Mikrokapseln und dergleichen. Die Verabreichung erfolgt in irgendeinem physiologisch brauchbaren injizierbaren Träger, wobei eine physiologische Kochsalzlösung akzeptabel ist, obgleich auch andere bekannte Träger verwendet werden können.
Die Petide werden vorzugsweise parenteral, intramuskulär, subkutan oder intravenös mit einem pharmazeutisch brauchbaren Träger wie isotonischer Kochsalzlösung verabreicht. Die Peptide können aber auch als intranasaler Spray mit einem geeigneten Träger oder durch Lungeninhalation verabreicht werden. Ein geeigneter Verabreichungsweg ist eine Depotform, formuliert aus einem geeigneten bioabaubaren Polymeren, wie z. B. Poly-D-lactid-coglycolid als Mikrokapseln, Mikrogranalien oder zylindrische Implantate mit einem Gehalt an dispergierten antagonistischen Verbindungen. Die erforderliche Peptidmenge hängt von der Verabreichungsart und dem beabsichtigten Ergebnis ab. In der Regel liegt die Dosierung zwischen 1 bis 100 μg/kg Körpergewicht des Wirts pro Tag.
E. Therapeutische Anwendungen von GH-RH-Antagonisten
hGH-RH-Antagonisten können bei der Behandlung von Zuständen benutzt werden, welche durch übermäßiges Wachstumshormon verursacht werden, wie z. B. Akromegalie, welche sich durch eine abnormale Vergrößerung der Knochen des Gesichts und der Extremitäten äußert. Die GH-RH-Antagonisten können auch zur Behandlung einer diabetischen Nephrophatie (die Hauptursache der Blindheit bei Diabetikern) und diabetischen Retinopathie verwendet werden, bei denen eine Schädigung des Auges bzw. der Niere infolge des GH angenommen wird.
Die hGH-RH-Antagnoisten wurden entwickelt, um die Bindung und infolge dessen die Wirkung von GH-RH zu blockieren, welches die Sekretion von GH, das die Sekretion von GH stimuliert, zu blockieren, das seinerseits die Bildung von IGF-I stimuliert. GH-RH-Antagonisten können allein oder zusammen mit Somatostatinanalogen verabreicht werden, eine Kombination, welche vollständiger die IGF-I- Spiegel unterdrückt. Es ist von Vorteil, Antagonisten von GH-RH anstelle von Somatostatin zu verabreichen, aufgrund der Tatsache, dass GH-RH-Antagonisten in Situationen angewandt werden können, wo Zielstellen keine Somatostatinrezeptoren aufweisen.
Die Hauptanwendungen von GH-RH-Antagonisten liegen jedoch auf dem Krebsgebiet. Dem liegen folgende Erwägungen zugrunde: GH-RH-Antagonisten sind entwickelt, um die Bindung und damit die Wirkung von GH-RH zu blockieren, welches die Sekretion von GH stimuliert, das seinerseits die Bildung von insulinähnlichem Wachstumsfaktor I (IGF-I) auch Somatomedin-C genannt, stimuliert. Die Beteiligung von IGF-I (Somatomedin-C) beim Brustkrebs, Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, Knochentumoren und anderen bösartigen Erkrankungen ist gut bewiesen, und Somatostatinanaloge allein unterdrücken die GH- und IGF-I-Spiegel nicht ausreichend. Eine völlige Unterdrückung von IGF-I-Spiegeln oder -Sekretion ist erforderlich für eine bessere Hemmung des Tumorwachstums. Eine autokrine Bildung von IGF-I durch verschiedene Tumore könnte auch unter der Steuerung von GH-RH sein und infolgedessen durch GH-RH-Antagonisten gehemmt werden. GH-RH-Antagonisten könnten auch die Bildung von IGF-I hemmen. Ein genauerer theoretischer Hintergrund der Anwendungen von GH-RH auf dem Gebiet der Onkologie (Krebs) ist wie folgt: die Rezeptoren für IGF-I liegen in menschlichen primären Brustkarzinomen, Prostatakarzinomen, Lungenkarzinomen, Dickdarmkarzinomen, Gehirntumoren, Bauchspeicheldrüsenkrebs und bei renalen Zellenkarzinomen vor.
Die Anwesenheit von IGF-I-Rezeptoren in diesen Tumoren scheinen sich zu beziehen auf eine maligne Übertragung und Prolieferationen dieser Karzinome. IGF-I kann als endokriner, parakriner oder autokriner Wachstumsfaktor für verschiedene menschliche Krebsarten wirken, d.h., dass das Wachstum dieser Neoplasmen von IGF-I abhängt. GH-RH-Antagonisten setzen die Bildung von IGF-I durch Unterdrückung der GH-Sekretion herab. Da IGF-I das Wachstum dieser verschiedenen Neoplasmen (Karzinomen) stimuliert, sollte die Herabsetzung zirkulierender IGF-I- Spiegel zur Hemmung des Tumorwachstums führen. Es ist möglich, dass GH-RH-Antagonisten auch die parakrine oder autokrine Bildung von IGF-I durch die Tumore verringern, was auch zur Hemmung einer Krebsprolieferation führen sollte. Diese Ansichten stehen in Übereinstimmung mit modernen Konzepten der klinischen Onkologie. GH-RH-Antagonisten sollten allein oder zusammen mit Somatostatinanalogen gegeben werden, und eine Kombination würde eine vollständigere Unterdrückung von IGF-I-Spiegeln, eine Eliminierung von Gewebe-IGF-I-Spiegeln zum Beispiel bei menschlichen Osteosarkomen sowie Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Prostatakrebs und nicht-kleinem Zellenlungenkrebs (non-SCLC) erreichen.
Der Vorteil von GH-RH-Antagonisten über Somatostatinanaloga gründet sich auf die Tatsache, dass GH-RH-Antagonisten zur Unterdrückung von Tumoren verwendet werden können, welche keine Somatostatinrezeptoren besitzen, wie z. B. menschliche osteogene Sarkome.
Es wurde gezeigt, dass antagonistische Analoga von GH-RH das Wachstum verschiedener Tumore in vivo unterdrücken. Diese Wirkung wird teilweise durch Hemmung der GH-RH-IGF-I-Achse ausgeübt. Dessen ungeachtet ist bei vielen Tumoren eine autokrine/parakrine Steuerung der Prolieferation durch IGF-II auch ein Hauptfaktor. Die Interferenz mit dieser autokrinen wachstumsstimulierenden Leitungsbahn bietet einen Zugang zur Tumorsteuerung. Antagonistische Analoga von GH-RH, MZ-4-71 {[Ibu⁰, Tyr¹, D-Arg², Abu¹⁵, Nle²⁷]hGH-RH(1-28) Agm} und MZ-5-156 {[PhAc⁰, D-Arg², Abu¹⁵, Nle²⁷]hGH-RH(1-28) Agm} hemmten die Prolieferationsrate von Brustkrebs-(MDA-MB-468, ZR-75-1), Prostatakrebs-(PC-3 und DU-145) sowie Bauchspeicheldrüsenkrebs-(MiaPaCa-2, SW-1990 und Capan-2) Zelllinien in vitro, wie durch kolorimetrische und [³H]-Thymidin-Einverleibungstest, verringerten die Expression von IGF-II mRNA in den Zellen sowie die Konzentration der in das Kulturmedium abgesonderten IGF-II. Die gleichen GH-RH-Antagonisten führten zu ähnlichen Ergebnissen in vivo (Hemmung der Prolieferation und Verringerung der IGF-II-Bildung) bei Prostatatumoren (PC-3, DU-145), Renalem Adenokarzinom (Caki-I) und nicht-kleinen Zellen-Lunctenkarzinomen (H157). Diese Entdeckungen legen nahe, dass antagonistische Analoga von GH-RH das Tumorwachstum nicht nur durch Hemmung der GH-RN-IGF-I-Achse sondern auch durch Verringerung der Bildung von IGF-II in verschiedenen Tumorzellen hemmen können, indem sie so ihre autokrine regulatorische Leitungsbahn unterbrechen.
Vorliegende Erfindung wird im Zusammenhang mit nachfolgenden Beispielen beschrieben, welche lediglich zur Veranschaulichung dargelegt werden. In den Beispielen werden optisch aktive geschützte Aminosäuren in der L-Konfiguration verwendet, mit der Ausnahme, wo sie speziell angegeben sind.
Nachfolgende Beispiele liegen geeigneten Syntheseverfahren für die neuen GH-RH-Antagonisten nach der Festphasentechnik dar.
BEISPIEL I
Die Synthese wird stufenweise unter Verwendung einer manuellen Ausrüstung für eine Festphasen-Peptidsynthese durchgeführt. Kurz gesagt, wird para-Methylbenzhydrylaminharz (MBHA-Harz) (Bachem, Californien) (720 mg, 0,50 mMol) 5%iges DIEA in CH₂Cl₂ neutralisiert und gemäß dem in Tabelle I beschriebenen Protokoll gewaschen. Die Lösung von POC-Har (NO₂)-OH (500 mg, 1,5 mMol) in DMF/CH₂Cl₂ (1:1) mit dem neutralisierten Harz und DIC (235 μl, 1,5 mMol) in einer Vorrichtung für eine Festphasen-Peptidsynthese eine Stunde geschüttelt. Nachdem der Abschluss der Kupplungsreaktion durch einen negativen Ninhydrintest nachgewiesen ist, wird die Schutzgruppenentfernung mit 50%iger Trifluoressigsäure in CH₂Cl₂ und die Neutralisation mit 5%igem DIEA in CH₂Cl₂ durchgeführt; die Peptidkette wird stufenweise durch Kuppeln folgender geschützter Aminosäuren in der angegebenen Reihenfolge auf das Kunstharz aufgebaut, um die erwünschte Peptidsequenz zu erhalten:
Diese geschützten Aminosäurereste (auch allgemein von Bachem, Co. erhältlich) sind oben gemäß einer gut angenommenen Übereinkunft vorgestellt. Die geeignete Schutzgruppe für die funktionelle Seitenkettengruppe spezieller Aminosäuren erscheint in Klammern. Die OH-Gruppen in den obigen Formeln zeigen, dass der Carboxylterminus eines jeden Rests frei ist.
Die geschützten Aminosäuren (jeweils 1,5 mMol) werden mit DIC (235 μl, 1,5 mMol) mit den Ausnahmen von Boc-Asn-OH und Boc-Gln-OH gekoppelt, welche mit ihren zuvor gebildeten HOBt-Estern gekoppelt werden. Nach Entfernung der Schutzgruppe N^a-Boc von Tyr¹, wird das Peptid mit Phenylessigsäure (PhAc) (272 mg, 2 mMol) unter Verwendung von DIC (313 μl, 2 mMol) acyliert.
Zur Abspaltung des Peptids von dem Kunstharz und um es von der Schutzgruppe zu befreien, wird das getrocknete Peptidharz (218 g) mit 2 ml m-Cresol und 20 ml Fluorwasserstoff (HF) bei 0°C 1 Stunde gerührt. Nach Abdampfen des HF unter Vakuum wird der Rest mit trockenem Diethylether und Ethylacetat gewaschen. Das abgespaltete und Schutzgruppen befreite Peptid wird in 50%iger Essigsäure gelöst und vom Harz abfiltriert. Nach Verdünnung mit Wasser und Gefriertrocknung werden 1,51 g Rohprodukt erhalten.
Das rohe Peptid wird unter Verwendung eines Flüssigkeitschromatographen Hewlett-Packard Modell HP-1090 mit einer Vydac 218TP52 Umkehrphasensäule (2 × 250 mm, gepackt mit Silicagel C18, Porengröße 300 Å, Teilchengröße 5 μm) (The Separations Group Inc., Hesperia, CA) durch analytische HPLC und lineare Gradientenelution (z. B. 40-70% B) mit einem Lösungsmittelsystem überprüft, das aus (A) 0,1 %iger wässeriger TFA und (B) 0,1 %iger TFA in 70%igem wässerigen MeCN besteht. 80 mg des rohen Peptids wird in AcOH/H₂O gelöst, gerührt, filtriert und auf eine Säule Vydac 218TP5010 aufgebracht (10 × 150 mm), gepackt mit Silicagel C8 gepackt. Die Säule wird mit dem weiter oben beschriebenen Lösungsmittelsystem auf Art eines linearen Gradienten eluiert (z. B. 30-55% B innerhalb von 120 Minuten); Strömungsrate 2 ml/Minute. Das Eluat wird bei 220 nm überwacht, und Fraktionen werden durch analytische HPLC überprüft. Fraktionen mit einer Reinheit von mehr als 95% werden vereint und gefriergetrocknet, um 9,6 mg Reinprodukt zu ergeben. Die analytische HPLC wird mit einer zuvor beschriebenen Vydac C 18 Umkehrphasensäule unter Anwendung einer isokratischen Elution mit einem zuvor beschriebenen Lösungsmittelsystem und einer Strömungsrate von 0,2 ml/Minute durchgeführt. Die Peaks werden bei 220 und 280 nm überwacht. Das Produkt wird als im wesentlichen aufgrund einer analytischen HPLC als im wesentlichen rein (>95%) beurteilt. Die Molekularmasse wird durch Elektrosprüh-Massenspektrometrie geprüft, und die erwartete Aminosäurezusammensetzung wird durch Aminosäureanalyse bestätigt.
BEISPIEL II
Die Synthese wird unter Verwendung eines Geräts zur manuellen Festphasen-Peptidsynthese stufenweise durchgeführt. Kurz gesagt wird para-Methylbenzydrylamin (MBHA-Kunstharz) (Bachem, Californien) (100 mg, 0,070 mMol) mit 5%igem DIEA in CH₂Cl₂ neutralisiert und gemäß dem in Tabelle 1 beschriebenen Protokoll gewaschen. Die Lösung von Boc-Har(NO₂)-OH (83, mg, 0,25 mMol) in DMF-CH₂Cl₂ (1:1) wird mit dem neutralisierten Kunstharz und DIC (44 μl, 0,275 mMol) in einem Gerät zur manuellen Festphasen-Peptidsynthese 1 Stunde geschüttelt. Nachdem durch einen negativen Ninhydrintest der Abschluss der Kopplungsreaktion nachgewiesen wurde, die Schutzgruppe mit 50%iger TFA in CH₂Cl₂ entfernt und mit 5%igem DIEA in CH₂Cl₂ neutralisiert wurde, wird das Peptid stufenweise durch Koppeln folgender geschützter Aminosäuren in der angegebenen Reihenfolge auf dem Kunstharz aufgebaut, um die gewünschte Peptidsequenz zu erhalten: Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Lys(2ClZ)-OH, Bc-Arg(Tos)OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Lys(2ClZ)OH, Bc-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(Me)-OH, Boc-Har(NO₂)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(2Br)-OH.
Diese geschützten Aminosäurereste (auch allgemein von Bachem Co. erhältlich) sind oben gemäß einer gut angenommenen Übereinkunft wiedergegeben. Die geeignete Schutzgruppe für die funktionelle Seitenkettengruppe spezieller Aminosäuren erscheint in Klammern. Die OH-Gruppen in den obigen Formeln zeigen, dass der Carboxylterminus eines jeden Rests frei ist.
Die geschützten Aminosäuren (jeweils 0,25 mMol) werden mit DIC (44 μl, 0,275 mMol) mit Ausnahme von Boc-Asn-OH und Boc-Gln-OH, die mit ihren zuvor gebildeten HOBt-Estern gekuppelt werden, gekuppelt. Nach Entfernung der Schutzgrupe N^a-Boc von Tyr¹ wird das Peptid mit Phenylessigsäure (PhAc) (54 mg, 0,4 mMol) unter Verwendung von DIC (70 μl, 0,44 mMol) acyliert.
Um das Peptid vom Kunstharz abzuspalten und es von der Schutzgruppe zu befreien, wird das getrocknete Peptidharz (206 mg) mit 0,5 ml m-Cresol und 5 ml Flusssäure (HF) bei 0°C 1 Stunde gerührt. Nach Abdampfen der Flusssäure unter Vakuum wird der Rest mit trockenen Diethylether und Ethylacetat gewaschen. Das abgespaltene und von der Schutzgruppe befreite Peptid wird in 50%iger Essigsäure gelöst und vom Kunstharz abfiltriert. Nach Verdünnen mit Wasser und Gefriertrocknen werden 112 mg Rohprodukt erhalten.
Das rohe Peptid wird durch analytische HPLC unter Verwendung eines Flüssigkeitschromatographen Hewlett Packard Modell HP-1090 mit einer Vydac 218TP52 Umkehrphasenkolonne (2 × 250 mm, gepackt mit Silicagel C18 Porengröße 300 Å, Teilchengröße 5 μm) (The Separations Group Inc., Hesperia, CA) und lineare Gradientenelution (z. B. 40-70% B) mit einem Lösungsmittelsystem geprüft, das aus (A) 0,1 %iger wässeriger TFA und (B) 0,1 %iger TFA in 70%igem wässerigen MecN besteht. 80 mg des rohen Peptids werden in AcOH/H₂O gelöst, gerührt, filtriert und auf eine Säule Vydac 218TP5010 (10 × 250 mm) aufgebracht. Die Säule wird mit einem zuvor beschriebenen Lösungsmittelsystem auf Art eines linearen Gradienten (z. B. 30-55% B in 120 Minuten) bei einer Strömungsrate von 2 ml/Minute eluiert. Das Eluat wird bei 220 nm überwacht, und Fraktionen werden durch analytische HPLC geprüft. Fraktionen mit einer Reinheit von mehr als 95% werden vereint und gefriergetrocknet, um 9,6 mg Reinprodukt zu ergeben. Die analytische HPLC wird auf einer zuvor beschriebenen Umkehrphasensäule Vydac C18 unter Anwendung einer isokratischen Elution mit einem weiter oben beschriebenen Lösungsmittelsystem mit einer Strömungsrate von 0,2 ml/Minute durchgeführt. Die Peaks werden bei 220 und 280 nm überwacht. Das Produkt wird durch analytische HPLC beurteilt, dass es im wesentlichen (> 95%) rein ist. Die Molekularmasse wird durch Elektrosprüh-Massenspektrometrie geprüft, und die erwartete Aminosäurezusammensetzung wird durch Aminosäureanalyse bestätigt.
Die Peptide 2 sowie Peptide 4 bis 30 werden auf die gleiche Weise wie Peptid 1 und Peptid 3 mit der Ausnahme synthetisiert, dass diese Peptide auch andere Substitutionen enthalten, um zu ergeben:
BEISPIEL III
Biologische Wirksamkeit
Die Peptide gemäß vorliegender Erfindung wurden in Tests auf ihre Fähigkeit, die durch hGH-RH(1-29)NH₂ bewirkte Freisetzung von GH zu hemmen in vitro und in vivo getestet.
Rattenhypophyse-Superfusionssystem
Die Analoga wurden in vitro in einem früher beschriebenen Test (S. Vigh und A.V. Schally, Peptides 5:241-347, 1984) mit einer Modifikation (Z. Rekasi und A.V. Schally, P.N.A.S. 90:2146-2149, 1993) getestet. Kurz gesagt wurden die Zellen mit Peptiden 9 Minuten (3 ml) bei verschiedenen Konzentrationen preinkubiert. Unmittelbar nach der Inkubation wird ein nM hGH-RH(1-29)NH₂ 3 Minuten verabreicht (1 ml) [0 Minuten ansprechen]. Um die Dauer der antagonistischen Wirkung des Analogen zu überprüfen, wird ein nM hGH-RH(1-29)NH₂ 30, 60, 90 und 120 Minuten später 3 Minuten angewandt, [30, 60, 90, 120 Minuten ansprechen]. Die Nettointegralwerte der GH-Reaktionen werden bewertet. Die GH-Reaktionen werden verglichen und als Prozentsatz der durch 1 nM GH-RH(1-29)NH₂ bewirkten ursprünglichen GH-Reaktion ausgedrückt. Die Wirkung der neuen Antagonisten wird mit derjenigen von [Ac-Tyr¹, D-Arg²]hGH-RH(1-29)NH₂, dem „Standardantagonisten", verglichen.
Wachstumshormon-Radioimmunoassay
Ratten-GH-Spiegel in gleichen Teilen von unverdünnten und verdünnten Superfusionsproben wurden durch einen Doppelantikörper-Radioimmunoassay unter Verwendung von Materialien gemessen, welche von National Hormone and Pituitary Program, Baltimore, Maryland geliefert wurden. Die Testergebnisse des RIA wurden mit einem Computerprogramm analysiert, das in unserem Institut entwickelt wurde, (V. Csernus und A.V. Schally in „Neuroendocrine Research Methods", Harwood Academic (Greenstein B.D., Herausgeber, London, S. 71-109, 1991)); diese Monographie wird durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen. Die Interassayvariation betrug weniger als 15% und die Intraassayvariation war geringer als 10%.
GH-RH-Bindungstest
Zur Bestimmung der Bindungseigenschaften der Antagonisten von GH-RH wurde ein empfindlicher Radiorezeptor-Bindungstest entwickelt (G. Halmos, A. V. Schally u.a., Receptor 3, 8-97, 1993), diese Publikation wird durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen. Dieser Test basiert auf der Bindung von markiertem [His¹, Nle²⁷]hGH-RH(1-32)NH₂ an Homogenate der Ratten-Adenohypophysenmembran. Iodierte Derivate von [His¹, Nle²⁷]hGH-RH(1-32)NH₂ werden nach dem Chloramin-T-Verfahren (F.C. Greenwood u.a., Biochemistry 89: 114-123, 1963) hergestellt; diese Publikation wird durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen. Hypophysen von männlichen Sprague-Dawley-Ratten 250-300 g) wurden zur Herstellung von rohen Membranen benutzt. Für Sättigungsbindungsanalysen werden Membranhomogenate mit mindestens 6 Konzentrationen von [His¹, ¹²⁶I-Tyr¹⁰, Nle²⁷]hGH-RH(1-32)NH₂, inkubiert, welche im Bereich von 0,005 bis 0,35 nM liegen, in An- oder Abwesenheit überschüssigen unmarkierten Peptids (1 μM).
In einem Gammazähler wird das Pellet auf seine Radioaktivität ausgezählt. Die Affinitäten der getesteten Antagonistenpeptide zu Rattenhypophysen-GH-RH-Rezeptoren werden in kompetitiven Bindungsversuchen bestimmt. Die Bindungsendaffinitäten werden durch K_i (Dissoziationskonstante des Komplexes Inhibitor-Rezeptor) geschätzt und durch den Ligand PC sowie McPherson-Computerprogramme von Munson und Rodbard bestimmt (P. J. Munson und D. Rodbard, Anal. Biochem. 107, 220-239, 1980).
Die relativen Affinitäten im Vergleich zu [Ac-Tyr¹, D-Arg²]hGH-RH(1-29)NH₂, dem Standardantagonisten, werden als das Verhältnis von K_i des getesteten GH-RH-Antagonisten zum K_i des Standardantagonisten berechnet.
In vivo-Tests
Die antagonistische GH-RH-Wirkung der Analoga wurde an jungen männlichen Sprague-Dawley-Ratten (200-250 g) getestet. Bei jedem Versuch wurden fünf Gruppen von jeweils sieben Tieren benutzt. Die Verbindungen (80 μg/kg) und GH-RH(1-29)NH₂ (3 μg/kg) wurden in 5,5% Mannit gelöst und intravenös in die Halsvene der Ratten unter Nembutalanästhesie verabreicht. Die Zeit, die zwischen den Verabreichungen des Antagonisten und GH-RH verging, schwankte zwischen den Gruppen gemäß nachfolgendem Schema. Die erste Gruppe der Tiere erhielt eine GH-RH-Injektion 5 Minuten nach Verabreichung des Antagonisten; bei der zweiten, dritten und vierten Tiergruppe betrug die Zeitspanne, welche zwischen der Injektion des Antagonisten und derjenigen von GH-RH verstrich, 15, 30 bzw. 60 Minuten. Die Kontrollgruppe wurde zuerst mit dem Lösungsmittel allein anstelle des Antagonisten injiziert, gefolgt von einer GH-RH-Injektion 5 Minuten später.
Vor der Verabreichung des Antagonisten wurden Blutproben von 0,4 ml für den GH-Radioimmunoassay genommen („Blut0"), und 5 Minuten nach der Injektion von GH-RH („Blut1"). Die GH-Reaktion wurde in jeder Gruppe berechnet als rGH = (GHBlut₁/GHBlut₀), Mittel ± S.E.M. der individuellen Unterschiede. Die relative Hemmung der GH-Reaktion (%) in jeder behandelten Gruppe wurde berechnet als 100 × (rGH_behandelt – 1)/(rGH_Kontrolle – 1).
Ergebnisse in vitro
Die Ergebnisse der im Hypophysen-Superfusionssystem der Ratte und Bindungstest getesteten antagonistischen Aktivitäten in vitro sind in Tabelle Π bzw. Tabelle III zusammengefasst. Wie aus diesen Daten ersichtlich ist, bewirken die in den Molekülen vorhandenen Substitutionen eine immense Erhöhung der Rezeptorbindung sowie bei der Hemmung der GH-Freisetzung in vitro im Vergleich zum Standardantagonisten. Der wirksamste Antagonist in vitro, das Peptid 1, bewirkte eine vollständige Hemmung der durch GH-RH verursachten GH-Freisetzung für 90 Minuten unter den Standardtestbedingungen. Das erste Anzeichen der Wiedergewinnung der GH-RH-Ansprechbarkeit wurde 120 Minuten nach dem Aussetzen diesem Analogen nachgewiesen.
Tabelle II Hemmung der GH-Freisetzung im Superfusionssystem der Rattenhypophyse
Tabelle III K_i-Werte und relative Affinitäten (R.A.) von hGH-RH-Antagonisten
Ergebnisse in vivo
Tabelle IV zeigt die Serum-GH-Reaktionen und ihre relativen Hemmungen in Ratten, welche mit GH-RH-Antagonisten vorbehandelt wurden. Alle getesteten Analoga (Peptid 1, Peptid 2, Peptid 3, Peptid 4, Peptid 8, Peptid 9, Peptid 11 und Peptid 16) führten zu einer starken und einer langanhaltenden Hemmung der durch hGH-RH(1-29)NH₂ stimulierten GH-Freisetzung. Peptid 1 und Peptid 2 sind die kurzzeitig wirksamsten Antagonisten, welche die GH-Reaktion um 95% und 91 % hemmen, wenn sie 5 Minuten vor dem hGH-RH(1-29)NH₂ verabreicht werden. Die Wirkung dieser beiden Peptide hält mindestens 30 Minuten an. Andererseits wirken die Peptide 11 und 3, welche kurzzeitig geringfügig weniger wirksam sind, sind extrem lang wirkend: ihre Wirkung dauert mindestens 60 Minuten an.
Tabelle IV Serum-GH-Reaktionen und relative Hemmungen von GH-Reaktionen bei Ratten, die mit GH-RH-Antagonisten zu verschiedenen Zeitspannen verabreicht wurden, vor der Verabreichung von hGH-RH(1-29)NH₂
Beispiel IV
Onkoligische Tests
Die Antitumor-Aktivitäten der Peptide gemäß vorliegender Erfindung wurden in verschiedenen Krebsmodellen getestet. Die Antitumorwirkungen dieser neuen Peptide wurden mit denjenigen früherer Analoga (MZ-4-71 und MZ-5-156, Gegenstand des U.S.-Patents 5.550.212 und der U.S.-Patentanmeldung 08/642.472) verglichen.
Wirkung von GH-RH-Antagonisten auf MXT-Brusttumore bei der Maus
Estrogen-unabhängige MXT-Tumore wurden subkutan auf weibliche BDF-Mäuse transplantiert. Ein Tag nach der Transplantation wurden die Mäuse in Gruppen von jeweils 10 Tieren unterteilt, und die Behandlung wurde begonnen. Die Mäu se in den Gruppen 1, 2, 3 und 4 erhielten subkutan einzelne Injektionen verschiedener GH-RH-Antagonisten täglich in einer Dosis von 20 μg pro Tag während 18 Tagen. In den Gruppen 5 und 6 wurden die Peptide durch osmotische Alzet-Pumpen unter Freisetzung einer täglichen Menge von 20 μg Peptid verabreicht. Die Tumore wurden regelmäßig gemessen, und das Tumorvolumen wurde berechnet. Die Mäuse wurden am Tag 18 getötet, und die Tumorgewichte wurden gemessen.
Ergebnisse
Die Peptide Peptid 1 und Peptid 3 hatten eine ähnliche starke Hemmungswirkung auf MXT-Brustkarzinome bei der Maus. Die Behandlung mit MZ-5-156 führte auch zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums, jedoch war seine Wirkung schwächer als diejenige von Peptid 1 oder Peptid 3 (vgl. Tabelle V und 1).
Tabelle V Wirkung der Behandlung mit GH-RH-Antagonisten auf Brusttumore bei der Maus

*p < 0,05 **p < 0,01

Wirkung von GH-RH-Antagonisten auf menschliche MDA-MB-468 Brustkrebstransplantate bei enthaarten Mäusen
Enthaarte Mäuse, welche ein hormonunabhängiges menschliches MDA-MB-468 Brustkrebstransplantat trugen, wurden in Gruppen von jeweils 10 Tieren unterteilt. Die behandelten Gruppen empfingen einmal täglich subkutan Injektionen von 20 μg der GH-RH-Antagonisten. Eine Gruppe wurde mit dem Peptid 1 behandelt, eine zweite Gruppe wurde mit MZ-5-156 zum Vergleich behandelt. Die Kontrollgruppe wurde mit dem als Vehikel verwendeten Lösungsmittel injiziert. Die Behandlung wurde fünf Wochen fortgesetzt. Die Tumore wurden einmal pro Woche gemessen, und das Tumorvolumen wurde berechnet. Die Mäuse wurden am Ende des Versuchs getötet, und die Tumorgewichte wurden gemessen.
Ergebnisse
Beide Peptide übten signifikante tumorhemmende Wirkungen auf MDA-MB-468 Transplantate aus. In der mit Peptid 1 und 4 injizierten Gruppe zeigten 4 Tumore eine konstante Rückbildung während des Versuchs. Ebenfalls verursachte MZ-5-156 eine Rückbildung von drei Tumoren. Nach fünfwöchiger Behandlung bildeten sich diese Karzinome zu kleinen narbenähnlichen Geweberesten zurück. Eine histologische Prüfung dieser Gewebe zeigte undifferenzierte Epiteltumore mit intensiver Nekrose und lediglich einer engen Marginallinie lebenden Tumorgewebes. Im Gegensatz hierzu schritten alle Tumore bei den Kontrolltieren stetig fort. Das Tumorendvolumen und -gewicht in den behandelten Gruppen waren signifikant vermindert (vgl. Tabelle VI und 2), wobei Peptid 1 eine stärkere Wirkung hatte.
Tabelle VI Wirkung der Behandlung mit GH-RH-Antagonisten auf menschliche MDA-MB-468 Brustkrebs-Transplantate bei enthaarten Mäusen

*p < 0,05 **p < 0,01

Wirkung von GH-RH-Antagonisten auf menschliche HT-29 Dickdarmkrebs-Transplantate bei enthaarten Mäusen
Menschliche Dickdarmkarzinome HT-29 wurden subkutan in männliche enthaarte Mäuse transplantiert. 19 Tage nach Transplantation wurden die Mäuse in Gruppen von je 10 Tieren unterteilt, und die Behandlung wurde begonnen. Die Mäuse erhielten einmal täglich Injektionen verschiedener GH-RH-Antagonisten subkutan in einer Tagesdosis von 20 μg während 6 Wochen. Die Tumore wurden regelmäßig gemessen, und das Tumorvolumen wurde berechnet. Die Mäuse wurden am Ende des Versuchs getötet, und die Tumorgewichte wurden gemessen.
Ergebnisse
Die Peptide Peptid 1 und MZ-5-156 hatten eine gleich starke Hemmungswirkung auf menschliche Dickdarmkarzinome HT-29. Die Behandlung mit Peptid 9 führte zu einer geringeren, jedoch noch signifikanten Hemmung des Tumorwachstums. Peptid 11 und MZ-4-71 hatten lediglich eine geringe, nicht signifikante Wirkung. (Die Ergebnisse sind in Tabelle VII und 3 zusammengefasst).
Tabelle VII Wirkung der Behandlung mit GH-RH-Antagonisten auf menschliche HT-29 Dickdarmkrebs-Transplantate bei enthaarten Mäusen

*p < 0,05

Wirkung des GH-RH-Antagonistenpeptid 1 auf menschliche U87MG-Gliobastom-Transplantate bei enthaarten Mäusen
Mäuse wurden subkutan mit Gliobastmen U87MG implantiert und, wenn Tumore ein Volumen von annähernd 70 mm³ erreichten, wurden die Mäuse willkürlich in zwei Versuchsgruppen unterteilt. Eine Gruppe wurde mit dem Peptid 1 in Einzelinjektionen von 20 μg täglich 28 Tage injiziert, während die andere Gruppe als Kontrolle diente.
Ergebnisse
Die Behandlung mit Peptid 1 hemmte das Tumorwachstum um 77% gegenüber der Kontrollgruppe nach vierwöchiger Behandlung (vgl. VIII und 4)
Tabelle VIII Wirkung der Behandlung mit dem GH-RH-Antagonistenpeptid 1 auf menschliche U87MG Glioblastom-Transplantate bei enthaarten Mäusen

**p < 0,01

Wirkung von GH-RH-Antagonisten auf menschliche PC-3 Prostatakrebs-Transplantate bei enthaarten Mäusen
Enthaarte männliche Mäuse wurden subkutan mit 3 mm³ großen Stücken von menschlichem, hormonunabhängigen PC-3 Prostatakrebs-Gewebe in beide Schenkel implantiert. Als die Tumore ein Volumen von annähernd 40-50 mm³ erreichten, wurden die Mäuse in drei Versuchsgruppen unterteilt. Die erste und zweite Gruppe wurden mit den Peptiden Peptid 3 bzw. MZ-5-156 in täglich einzelnen subkutanen Injektionen von 20 μg während 21 Tagen behandelt, während die dritte Gruppe als Kontrolle diente. Die Tumorvolumina wurden in wöchentlichen Abständen gemessen, während die Tumorgewichte am Ende des Versuchs gemessen wurden.
Ergebnisse
Beide GH-RH-Antagonisten hemmten das Wachstum der PC-3 Tumore (vgl. Tabelle IX und 5). Das Peptid 3 übte eine stärkere Wachstumshemmung aus (65%ige Hemmung des Tumorvolumens und 62% des Tumorgewichts) als MZ-5-156 (52% bzw. 46%).
Tabelle IX Wirkung der Behandlung mit GH-RH-Antagonisten auf menschliche PC-3-Prostatakrebs-Transplantate bei enthaarten Mäusen

*p < 0,05

Claims

Peptid, das aus der Gruppe mit der Formel X-R¹-R²-Asp-Ala-R⁵-R⁶-Thr-R⁸-R⁹-R¹⁰-Arg-R¹²-R¹³-R¹⁴-R¹⁵-R¹⁶-Leu-R¹⁸-R¹⁹-Arg-R²¹-R²²-Leu-Gln-Asp-Ile-R²⁷-R²⁸-R²⁹-NH₂ ausgewählt wird, wobei X PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- oder 2-Npr oder Fpr ist, R¹ Tyr oder His ist, R² D-Arg oder D-Cit ist, R⁵ Ile oder Val ist, R⁶ Phe, Nal oder Phe(Y) ist, wobei Y = F, Cl, Br, R⁸ Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu oder Aib ist, R⁹ Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit ist, R¹⁰ Tyr oder Phe(Y) ist, wobei Y = H, F, Cl, Br oder OCH₃, R¹² Lys, D-Lys oder Orn ist, R¹³ Val oder Nle ist, R¹⁴ Leu oder Nle ist, R¹⁵ Gly, Ala, Abu, Nle oder Gln ist, R¹⁶ Gln oder Arg ist, R¹⁸ Ser oder Nle ist, R¹⁹ Ala oder Abu ist, R²¹ Lys oder Orn ist, R²² Leu, Ala oder Aib ist, R²⁷ Met, Leu, Nle, Abu oder D-Arg ist, R²⁸ Arg oder D-Arg ist, R²⁹ Arg, D-Arg, Har oder D-Har ist, und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
Verbindung von Anspruch 1, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 1, [IndAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGh-RH(1-29)NH₂ Peptid 2, [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Har⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGh-RH(1-29)NH₂ Peptid 3, [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 6, [PhAc⁰, His¹, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 7, und [Nac⁰, His¹, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 8 besteht.
Verbindung von Anspruch 1 mit der Formel [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 1.
Verbindung von Anspruch 1 mit der Formel [IndAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGh-RH(1-29)NH₂ Peptid 2.
Verbindung von Anspruch 1 mit der Formel [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Har⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGh-RH(1-29)NH₂ Peptid 3.
Verbindung von Anspruch 1 mit der Formel [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 6.
Verbindung von Anspruch 1 mit der Formel [PhAc⁰, His¹, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 7.
Verbindung von Anspruch 1 mit der Formel [Nac⁰, His¹, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 8.
Verwendung eines Polypeptids, das aus der Gruppe mit der Formel X-R¹-R²-Asp-Ala-R⁵-R⁶-Thr-R⁸-R⁹-R¹⁰-Arg-R¹²-R¹³-R¹⁴-R¹⁵-R¹⁶-Leu-R¹⁸-R¹⁹-Arg-R²¹-R²²-Leu-Gln-Asp-Ile-R²⁷-R²⁸-R²⁹-NH₂ ausgewählt wird, wobei X PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- oder 2-Npr oder Fpr ist, R¹ Tyr oder His ist, R² D-Arg oder D-Cit ist, R⁵ Ile oder Val ist, R⁶ Phe, Nal oder Phe(Y) ist, wobei Y = F, Cl, Br, R⁸ Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu oder Aib ist, R⁹ Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit ist, R¹⁰ Tyr oder Phe(Y) ist, wobei Y = H, F, Cl, Br oder OCH₃, R¹² Lys, D-Lys oder Orn ist, R¹³ Val oder Nle ist, R¹⁴ Leu oder Nle ist, R¹⁵ Gly, Ala, Abu, Nle oder Gln ist, R¹⁶ Gln oder Arg ist, R¹⁸ Ser oder Nle ist, R¹⁹ Ala oder Abu ist, R²¹ Lys oder Orn ist, R²² Leu, Ala oder Aib ist, R²⁷ Met, Leu, Nle, Abu oder D-Arg ist, R²⁸ Arg oder D-Arg ist, R²⁹ Arg, D-Arg, Har oder D-Har ist, und von pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon, für die Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung von überhöhten GH-Spiegeln.
Verwendung eines Polypeptids, das aus der Gruppe mit der Formel X-R¹-R²-Asp-Ala-R⁵-R⁶-Thr-R⁸-R⁹-R¹⁰-Arg-R¹²-R¹³-R¹⁴-R¹⁵-R¹⁶-Leu-R¹⁸-R¹⁹-Arg-R²¹-R²²-Leu-Gln-Asp-Ile-R²⁷-R²⁸-R²⁹-NH₂ ausgewählt wird, wobei X PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- oder 2-Npr oder Fpr ist, R¹ Tyr oder His ist, R² D-Arg oder D-Cit ist, R⁵ Ile oder Val ist, R⁶ Phe, Nal oder Phe(Y) ist, wobei Y = F, Cl, Br, R⁸ Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu oder Aib ist, R⁹ Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit ist, R¹⁰ Tyr oder Phe(Y) ist, wobei Y = H, F, Cl, Br oder OCH₃, R¹² Lys, D-Lys oder Orn ist, R¹³ Val oder Nle ist, R¹⁴ Leu oder Nle ist, R¹⁵ Gly, Ala, Abu, Nle oder Gln ist, R¹⁶ Gln oder Arg ist, R¹⁸ Ser oder Nle ist, R¹⁹ Ala oder Abu ist, R²¹ Lys oder Orn ist, R²² Leu, Ala oder Aib ist, R²⁷ Met, Leu, Nle, Abu oder D-Arg ist, R²⁸ Arg oder D-Arg ist, R²⁹ Arg, D-Arg, Har oder D-Har ist, und von pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Krebses, der Rezeptoren für IGF-I oder -II trägt.
Verwendung eines Polypeptids, das aus der Gruppe mit der Formel X-R¹-R²-Asp-Ala-R⁵-R⁶-Thr-R⁸-R⁹-R¹⁰-Arg-R¹²-R¹³-R¹⁴-R¹⁵-R¹⁶-Leu-R¹⁸-R¹⁹-Arg-R²¹-R²²-Leu-Gln-Asp-Ile-R²⁷-R²⁸-R²⁹-NH₂ ausgewählt wird, wobei X PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- oder 2-Npr oder Fpr ist, R¹ Tyr oder His ist, R² D-Arg oder D-Cit ist, R⁵ Ile oder Val ist, R⁶ Phe, Nal oder Phe(Y) ist, wobei Y = F, Cl, Br, R⁸ Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu oder Aib ist, R⁹ Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit ist, R¹⁰ Tyr oder Phe(Y) ist, wobei Y = H, F, Cl, Br oder OCH₃, R¹² Lys, D-Lys oder Orn ist, R¹³ Val oder Nle ist, R¹⁴ Leu oder Nle ist, R¹⁵ Gly, Ala, Abu, Nle oder Gln ist, R¹⁶ Gln oder Arg ist, R¹⁸ Ser oder Nle ist, R¹⁹ Ala oder Abu ist, R²¹ Lys oder Orn ist, R²² Leu, Ala oder Aib ist, R²⁷ Met, Leu, Nle, Abu oder D-Arg ist, R²⁸ Arg oder D-Arg ist, R²⁹ Arg, D-Arg, Har oder D-Har ist, und von pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon, für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von IGF-II-Spiegeln in Tumoren (Krebsen) und der Expression von mRNA für IGF-II in den selben Tumoren.
Verwendung gemäß Anspruch 9, die den Einsatz einer Verbindung mit der Formel [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 1 umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 9, die den Einsatz einer Verbindung mit der Formel [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Har⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 3 umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 10, die den Einsatz einer Verbindung mit der Formel [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 1 umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 10, die den Einsatz einer Verbindung mit der Formel [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Har⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGh-RH(1-29)NH₂ Peptid 3 umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 11, die den Einsatz einer Verbindung mit der Formel [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ Peptid 1 umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 11, die den Einsatz einer Verbindung mit der Formel [PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Har⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGh-RH(1-29)NH₂ Peptid 3 umfasst.