DE69936312T2 - Mutanten von op-1 - Google Patents

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Description

  • Die Anmeldung inkorporiert hierin durch Bezugnahme die gesamte Offenbarung der gleichzeitig anhängigen Gebrauchsmusteranmeldungen Seriennr. 09/375,333 und 09/374,936 (Anwalts-Registernr. STK-075 und STK-077), hiermit am gleichen Datum angemeldet.
  • Bereich der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft modifizierte Proteine und DNAs, die dieselben codieren, die biosynthetische, chemosynthetische oder rekombinante Konstrukte sind, die von der TGF-β-Superfamilie von strukturell verwandten Proteinen abstammen, einschließlich modifizierter morphogener Proteine.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die TGF-β-Superfamilie schließt fünf verschiedene Formen von TGF-β (Sporn und Roberts (1990) in Peptide Growth Factors and Their Receptors, Sporn und Roberts, Hrsg., Springer-Verlag: Berlin S. 419-472) sowie die Differenzierungsfaktoren Vg-1 (Weeks und Melton (1987) Cell 51: 861-867), das DPP-C-Polypeptid (Padgett et al. (1987) Nature 325: 81-84), die Hormone Activin und Inhibin (Mason et al. (1985) Nature 318: 659-663; Mason et al. (1987) Growth Factors 1: 77-88), die Mullerian-Inhibiting-Substanz, MIS (Cate et al. (1986) Cell 45: 685-698), die osteogenen und morphogenen Proteine OP-1 ( PCT/US90/05903 ), OP-2 ( PCT/US91/07654 ), OP-3 ( PCT/WO94/10202 ), die BMPs (siehe U.S.-Patente Nr. 4,877,864 ; 5,141,905 ; 5,013,649 ; 5,116,738 ; 5,108,922 ; 5,106,748 ; und 5,155,058 ), das entwicklungsregulierte Protein Vgr-1 (Lyons et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4554-4558) und die Wachstums/Differenzierungsfaktoren GDF-1, GDF-3, GDF-9 und Dorsalin-1 (McPherron et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3444-3449; Basler et al. (1993) Cell 73: 687-702) ein, um nur ein paar zu nennen.
  • Die Proteine der TGF-β-Superfamilie sind Disulfid-verknüpfte Homo- oder Heterodimere, die als große Vorläufer-Polypeptidketten exprimiert werden, die eine hydrophobe Signalsequenz, eine lange und relativ schwach konservierte N-terminale Pro-Region-Sequenz von einigen hundert Aminosäuren, eine Spaltungsstelle, eine reife Domäne, umfassend eine N-terminale Region, die unter den Familienmitgliedern variiert, und eine hochkonservierte C-terminale Region enthalten. Diese C-terminale Region, die in den verarbeiteten reifen Proteinen von allen bekannten Familienmitgliedern vorhanden ist, enthält ungefähr 100 Aminosäuren mit einem charakteristischen Cystein-Motiv, das ein konserviertes sechs- oder sieben-Cysteine-Skelett aufweist. Obwohl die Position der Spaltungsstelle zwischen den reifen und den Pro-Regionen zwischen den Familienmitgliedern variiert, ist das Cystein-Muster des C-Terminus von allen Proteinen im identischen Format, das in der Sequenz Cys-X-Cys-X endet (Sporn und Roberts (1990), vorstehend).
  • Eine zugrundeliegende Eigenschaft der Biologie der Proteine der TGF-β-Superfamilie ist ihre Fähigkeit, Entwicklungs-Vorgänge, einschließlich der endochondralen Knochenmorphogenese, zu regulieren. Es ist identifiziert worden, dass diese strukturell verwandten Proteine in eine Vielfalt von Entwicklungs-Ereignissen involviert sind. Zum Beispiel scheinen TGF-β und die Polypeptide der Inhibin/Activin-Gruppe eine Rolle in der Regulierung von Zellwachstum und Differenzierung zu spielen. MIS verursacht eine Regression des Müllerschen Gangs in der Entwicklung des männlichen Säugerembryos, und dpp, das Genprodukt des decapentaplegischen Drosophila-Komplexes, ist für eine passende dorsal-ventrale Spezifizierung erforderlich. In ähnlicher Weise ist Vg-1 in die Mesoderm-Induzierung in Xenopus involviert, und Vgr-1 ist in einer Vielfalt von entstehenden murinen Geweben identifiziert worden. Im Bezug auf die Knochenbildung spielen Proteine in der TGF-β-Superfamilie, zum Beispiel OP-1 und eine Untergruppe von anderen Proteinen, die als BMPs (bone morphogenic Proteins – Knochen-morphogene Proteine) identifiziert wurden, die Hauptrolle. OP-1 (BMP-7) und andere osteogene Proteine sind unter Verwendung von rekombinanten Techniken produziert worden ( U.S.-Patent Nr. 5,011,691 und PCT-Anmeldung Nr. US 90/05903 ), und es ist gezeigt worden, dass sie in der Lage sind, die Bildung eines wahren endochondralen Knochens in vivo zu induzieren. Die osteogenen Proteine werden auf dem Fachgebiet im Allgemeinen als eine Untergruppe der TGF-β-Superfamilie von Wachstumsfaktoren klassifiziert (Hogan (1996), Genes & Development, 10:1580-1594).
  • Vor kurzem ist erkannt worden, dass bestimmte Mitglieder dieser selben Familie von Proteine morphogen, d.h. zum Induzieren der Entwicklungskaskade der Gewebemorphgenese in einem reifen Säuger in der Lage sind (Siehe PCT-Anmeldung Nr. US 92/01968 ). Insbesondere sind diese Morphogene zum Induzieren der Proliferation von nicht-determinierten Vorläuferzellen und zum Induzieren der Differenzierung dieser stimulierten Vorläuferzellen in einer gewebespezifischen Weise unter geeigneten Umweltbedingungen in der Lage. Zusätzlich sind die Morphogene zum Unterstützen des Wachstums und dem Aufrechterhalten dieser differenzierten Zellen in der Lage. Diese morphogenen Aktivitäten ermöglichen den Proteinen, die Entwicklungskaskade der Gewebemorphogenese in einer geeigneten, morphogen zulassenden Umgebung, die Stimulierung von Stammzellen, in einer gewebespezifischen Weise zu proliferieren und zu differenzieren, und das Induzieren des Fortschreitens von Ereignissen, die in einer neuen Gewebebildung gipfeln, zu initiieren und zu bewahren. Diese morphogenen Aktivitäten erlauben es den Proteinen auch, die „Re-Differenzierung" von Zellen, die vorher stimuliert wurden, um von ihrem Differenzierungspfad abzukommen, zu induzieren. Unter geeigneten Umweltbedingungen wird erwartet, dass diese Morphogene auch die „Re-Differenzierung" von determinierten Zellen stimulieren können.
  • Mitglieder dieser morphogenen Klasse von Proteinen schließen das osteogene Protein-1 von Säugern (OP-1, auch als BMP-7 und das Drosophila-Homolog 60A bekannt), das osteogene Protein-2 (OP-2, auch als BMP-8 bekannt), das osteogene Protein-3 (OP-3), BMP-2 (auch als BMP-2A oder CBMP-2A und das Drosophila-Homolog DPP bekannt), BMP-3, BMP-4 (auch als BMP-2B oder CBMP-2B bekannt), BMP-5, BMP-6 und sein murines Homolog Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF3 (auch als Vgr2 bekannt), GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (auch als CDMP-1 oder MP52 bekannt), GDF-6 (auch als CDMP-2 oder BMP-13 bekannt), GDF-7 (auch als CDMP-3 oder BMP-12 bekannt), das Xenopus-Homolog Vgl und NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP und NEURAL ein, um nur ein paar zu nennen.
  • Durch eine Illustration unter Verwendung von beispielhaften Familienmitgliedern sind die Tertiär- und Quartärstruktur sowohl von TGF-β2 als auch OP-1 bestimmt worden. Obwohl TGF-β2 und OP-1 nur etwa 35% Aminosäure-Identität in ihren entsprechenden Aminosäuresequenzen zeigen, sind die Tertiär- und Quartärstrukturen von beiden Molekülen auffallend ähnlich. Sowohl TGF-β2 als auch OP-1 sind von dimerer Natur und haben ein einzigartiges Faltungsmuster, das sechs der sieben C-terminalen Cystein-Reste involviert. In jeder Untereinheit binden vier Cysteine, um einen Acht-Restering herzustellen, und zwei zusätzliche Cystein-Reste bilden eine Disulfidbindung, die durch den Ring passiert, um eine Knoten-ähnliche Struktur zu bilden. Mit einem Nummerierungsschema, das mit dem am meisten N-terminal gelegenen Cystein von den 7 konservierten Cystein-Resten beginnt, dem die Nummer 1 zugeordnet wird, binden die 2. und 6. Cystein-Reste, um eine Seite des Acht-Resterings zu schließen, während die 3. und 7. Cystein-Reste die andere Seite schließen. Die 1. und 5. konservierten Cystein-Reste binden durch das Zentrum des Rings, um den Kern des Knotens zu bilden. Das 4. Cystein bildet eine Zwischenketten-Disulfidbindung mit dem korrespondierenden Rest in der anderen Untereinheit.
  • Die TGF-β2- und OP-1-Monomer-Untereinheiten umfassen drei strukturelle Hauptelemente und eine N-terminale Region. Die strukturellen Elemente sind aus Regionen einer durchgehenden Polypeptidkette aufgebaut, die über 50% Sekundärstruktur der folgenden Typen besitzt: (1) Schleife, (2) α-Helix und (3) β-Faltblatt. Darüber hinaus sind in diesen Regionen die N-terminalen und C-terminalen Stränge nicht mehr als 7 Å entfernt. Die Reste zwischen den 1. und 2. konservierten Cysteinen bilden eine strukturelle Region, die durch einen anti-parallelen β-Faltblatt-Finger charakterisiert ist, der hierin als die Finger-1-Region (F1) bezeichnet wird. In ähnlicher Weise bilden auch die Reste zwischen den 5. und 6. konservierten Cysteinen einen anti-parallelen β-Faltblatt-Finger, der hierin als die Finger-2-Region oder -Unterdomäne (f2) bezeichnet wird. Ein β-Faltblatt-Finger ist eine Einzel-Aminosäurekette, umfassend einen β-Strang, der sich auf sich selbst durch eine β-Schleife oder eine etwas größere Schleife rückfaltet, sodass die eintretenden und austretenden Stränge eine oder mehrere anti-parallele β-Faltblatt-Struktur(en) bilden.
  • Die dritte strukturelle Hauptregion, die die Reste zwischen den 3. und 4. konservierten Cysteinen involviert, wird durch eine α-Helix mit drei Kehren charakterisiert, die hierin als die Heelregion (H) bezeichnet wird. In den dimeren Formen von sowohl TGF-β2 als auch OP-1 sind die Untereinheiten so orientiert, dass die Heelregion von einer Untereinheit die Fingerregionen der anderen Untereinheit mit den Knoten-Regionen der verbundenen Untereinheiten kontaktiert, was den Kern des Moleküls bildet. Das 4. Cystein bildet eine Disulfidbrücke mit seinem Gegenstück auf der zweiten Kette, wodurch die Ketten im Zentrum der Handflächen äquivalent verbunden werden. Das so gebildete Dimer ist ein ellipsoides (Zigarren-förmiges) Molekül, wenn es von oben mit Blickrichtung nach unten durch die zweifache Achse der Symmetrie zwischen den Untereinheiten betrachtet wird.
  • Ob natürlich vorkommend oder rekombinant oder synthetisch hergestellt, wahre Morphogene innerhalb der TGF-β-Superfamilie wie osteogene Proteine können die Rekrutierung und Stimulierung von Vorläuferzellen induzieren, wodurch deren Differenzierung z.B. in Chondrocyten und Osteoblasten induziert wird und weiterhin die Differenzierung von intermediärem Knorpel, die Vaskularisierung, Knochenbildung, Umgestaltung und schließlich Knochenmarksdifferenzierung induziert wird. Zahlreiche Praktiker haben die Fähigkeit von osteogenen Proteinen gezeigt, wenn sie mit entweder Matrixmaterialien aus natürlichen Quellen wie Kollagen oder synthetisch hergestellten polymeren Matrixmaterialien gemischt werden, um wahre Knochenbildung, einschließlich endochondrale Knochenbildung, unter Bedingungen zu induzieren, wo andernfalls ein wahrer Ersatzknochen nicht auftreten würde. Wenn sie zum Beispiel mit einem Matrixmaterial kombiniert werden, induzieren diese osteogenen Proteine die Bildung von neuem Knochen in großen segmentalen Knochendefekten, Defekten des Schädeldachs, Wirbelsäulen-Fusionen und Frakturen, um nur ein paar zu nennen.
  • Auf dem Fachgebiet stützt man sich auf bakterielle und andere prokaryontische Expressionssysteme als bevorzugte Mittel zum Herstellen von sowohl natürlichen als auch biosynthetischen oder rekombinanten Proteinen. Weiterhin ist eine vollständige chemische Synthese eine entstehende Möglichkeit für das Produzieren von kleinen Proteinen. Prokaryontische Systeme wie E. coli sind für das Produzieren von kommerziellen Mengen von Proteinen sowie für das Bewerten von biologischen und chemischen Eigenschaften von natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Mutanten und Analogen nützlich. Typischerweise aggregiert ein überexprimiertes eukaryontisches Protein in ein unlösliches intrazelluläres Präzipitat („Einschlusskörper") in der prokaryontischen Wirtszelle. Das aggregierte Protein wird dann aus den Einschlusskörpern gewonnen, unter Verwendung von einem oder mehreren Standard-Denaturierungsmittel(n) solubisiert, und ihm wird dann erlaubt, in einen funktionellen Status rückzufalten, oder es wird dazu induziert. Chemisch synthetisierte Proteine würden auch eine korrekte Rückfaltung erfordern.
  • Eine optimale Rückfaltung erfordert eine korrekte Bildung von allen Disulfid-Bindungen, um eine biologisch aktive Proteinstruktur zu bilden und zu stabilisieren. Dennoch falten sich nicht alle natürlich vorkommenden Proteine leicht rück, wenn sie solubilisiert werden. Trotz einer vorsichtigen Manipulation der Chemien für die Rückfaltung bleiben die Erträge eines optimal rückgefalteten stabilen und/oder biologisch aktiven Proteins niedrig. Viele der vorher erwähnten Proteine, einschließlich der BMPs, fallen in die Kategorie der schwachen Rückfalter-Proteine. Während zum Beispiel manche Mitglieder der BMP-Proteinfamilie relativ wirksam in vitro gefaltet werden können, wie zum Beispiel wenn sie in E. coli oder anderen prokaryontischen Wirten produziert werden, können es viele andere, einschließlich BMP-5, BMP-6 und BMP-7, nicht. Siehe z.B. EP 0433225 und US 5,399,677 , US 5,756,308 und US 5,804,416 .
  • Es bleibt ein Bedarf für verbesserte Mittel für das Gestalten und erfolgreiche Produzieren von rekombinanten, chemosynthetischen und/oder biosynthetischen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie von Proteinen, einschließlich der morphogenetischen Proteine.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Ausführungsformen, wie in den Ansprüchen definiert.
  • Die vorliegende Beschreibung beschreibt modifizierte Proteine und DNAs, die dieselben codieren, der TGF-β-Superfamilie, einschließlich morphogener Proteine. Wie hierin verwendet, bezeichnen die Begriffe „modifizierte TGF-β-Superfamilie", „mutante TGF-β-Superfamilie", „mutantes Protein", „mutantes Konstrukt" und „mutant” jedes synthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Konstrukt, in dem spezifische Aminosäuren durch andere Aminosäuren ausgetauscht worden sind oder wo eine oder alle einer Finger-2-Subdomäne eines TGF-β-Superfamilie-Mitglieds durch eine oder alle einer Finger-2-Subdomäne eines anderen TGF-β-Superfamilie-Mitglieds ersetzt ist. Hierin auch in Betracht gezogen werden mutante Proteine, die rekombinante und/oder biosynthetische und/oder chemosynthetische Proteine umfassen. Zusätzlich haben die hierin beschriebenen mutanten Proteine veränderte Rückfaltungseigenschaften im Vergleich zu natürlich vorkommenden Proteinen. Die hierin beschriebenen mutanten Proteine können eine veränderte Stabilität, spezifische Aktivität, Solubilität, Bioaktivität und/oder biologische Spezifitätseigenschaften haben und sind für Gewebe-spezifisches Targeting nützlich.
  • Hierin beschrieben sind synthetische mutante Proteine, die die Rückfaltungseigenschaften der natürlichen „schwachen Rückfalter"-Proteine verbessern. Wie hierin verwendet, bedeutet ein „schwaches Rückfalter"-Protein irgendein Protein, das, wenn es induziert wird, um unter typischerweise geeigneten Rückfaltungsbedingungen rückzufalten, weniger als etwa 1% optimal rückgefaltetes Material (siehe unten) ergibt. Genau werden schwache Rückfalter durch spezifische Aminosäuresequenz-Änderungen innerhalb der C-terminalen Finger-2-Subdomäne des schwachen Rückfalters in gute Rückfalter transformiert. Die Faltungsfähigkeiten des Proteins des schwachen Rückfalter-Proteins werden auch durch Erhöhen der Zahl von hydrophilen Resten, insbesondere der sauren (negativ geladenen) Reste in der Finger-2-Subdomäne des Proteins verstärkt.
  • Das Erhöhen der Zahl von sauren Resten in der Basisregion der Finger-2-Subdomäne verbessert die Rückfaltungseigenschaften der ausgetauschten Sequenz im Vergleich zu den Rückfaltungseigenschaften der nicht-ausgetauschten Elternsequenz. Die Faltungsfähigkeiten des schwachen Rückfalter-Proteins werden auch durch Erhöhen der Zahl von Hydroxylgruppen, die polare Reste in der Finger-2-Subdomäne des Proteins tragen, insbesondere in der Basisregion der Finger-2-Subdomäne verstärkt. Weiterhin ist entdeckt worden, dass individuelle Subdomänen der C-terminalen aktiven Region eines TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteins ausgetauscht werden können, um eine erwünschte biologische oder biochemische Eigenschaft zu erwerben.
  • Ein Teil oder die gesamte Finger-2-Basisregion eines schwachen Rückfalters wird mit der Finger-2-Basisregion eines guten Rückfalters ausgetauscht, um die Faltungseigenschaften des Elternproteins zu verbessern, ohne die biologische Spezifität des TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteins wesentlich zu beeinflussen. Es wird erwartet, dass die Rezeptorbindungs-Spezifität eines TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteins durch Austauschen der Finger-2-Spitzenregion eines TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteins mit jener eines anderen TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteins verändert wird, ohne die Faltungseigenschaften des Elternproteins wesentlich zu beeinflussen.
  • Als ein Ergebnis dieser Entdeckungen sind jetzt Mittel für das Vorhersagen und Gestalten von de novo-TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Mutanten verfügbar, die veränderte Eigenschaften, einschließlich veränderter Faltungsfähigkeiten, veränderter Solubilität, veränderter Stabilität, veränderter isoelektrischer Punkte, veränderter Oberflächen- oder Trägerstoff-Bindungseigenschaften und/oder veränderter biologischer Aktivitäten und Spezifitäten, wie erwünscht, haben. Die Beschreibung beschreibt auch Mittel für ein leichtes und schnelles Bewerten von biologischen und/oder biochemischen Eigenschaften von chimeren Konstrukten, Einschließlich des Kartierens von Epitopen. Insbesondere werden Kandidaten mit bestimmten spezifischen Aminosäuresequenzen in der Finger-2-Subdomäne konstruiert, wodurch die Expression der Kandidatensequenz in einem prokaryontischen Wirt wie E. coli, gefolgt von einer Rückfaltung in vitro ermöglicht wird.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet ein „schwaches Rückfalter-Protein" jedes Protein, dass, wenn es induziert wird, um sich unter typischerweise geeigneten Rückfaltungsbedingungen rückzufalten, weniger als etwa 1% optimal rückgefaltetes Material ergibt, gemessen unter Verwendung eines Standardprotokolls. Wie hierin in Betracht gezogen, sind „typischerweise geeignete Rückfaltungsbedingungen" Bedingungen, unter denen die Proteine in dem Ausmaß rückgefaltet werden können, das erforderlich ist, um eine Funktionalität zu verleihen. Ein Fachmann wird erkennen, dass zumindest Abschnitt I.B.1.(c) und Beispiel 3 nicht-limitierende Beispiele von solchen Rückfaltungsbedingungen offenbaren. Strukturelle Parameter, die für die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung relevant sind, schließen eine oder mehrere Disulfidbrücke(n) ein, die korrekt durch die Struktur des dimeren Proteins verteilt sind und die einen Reduktions-Oxidations („Redox")-Reaktionsschritt erfordern, um eine gefaltete Struktur zu ergeben. Redox-Reaktionen erfolgen typischerweise bei neutralen pH-Werten. Dementsprechend schließen „geeignete Rückfaltungsbedingungen", wie hierin verwendet, einen Redox-Reaktionsschritt bei einem im Wesentlichen neutralen pH-Wert ein, d.h. im Bereich von etwa pH 5,0-10,0, typischerweise im Bereich von etwa pH 6,0-9,0 und vorzugsweise unter physiologisch verträglichen Bedingungen. Der Fachmann wird die optimalen Bedingungen für einen Erfolg abschätzen und erkennen.
  • Die Beschreibung beschreibt rekombinante, chemosynthetische oder biosynthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine, die unter neutralen oder anderweitig physiologisch verträglichen Bedingungen veränderte Rückfaltungseigenschaften aufweisen. Nur als Beispiel haben die rekombinanten, chemosynthetischen oder biosynthetischen Proteine der Erfindung veränderte Rückfaltungseigenschaften bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,0-10,0, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,0-9,0, mehr bevorzugt im Bereich von etwa 7,0-8,5, einschließlich im Bereich von etwa pH 7,5-8,5.
  • Die Beschreibung beschreibt rekombinante, chemosynthetische oder biosynthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine, die unter neutralen oder anderweitig physiologisch verträglichen Bedingungen veränderte Solubilitätseigenschaften aufweisen. Die hierin beschriebenen Proteine haben eine veränderte Solubilität bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,0-10,0, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,0-9,0, mehr bevorzugt im Bereich von etwa 6,0-8,5, einschließlich im Bereich von etwa pH 7,0-7,5. Darüber hinaus wird die Stabilität eines Proteins durch die hierin beschriebenen Modifikationen und Manipulationen verändert. „Verändert" soll verschieden von der (den) Eigenschaft(en) des natürlichen Proteins bedeuten und schließt Ausführungsformen ein, die stabiler oder weniger stabil und/oder löslicher oder weniger löslich usw. sein können.
  • Die Beschreibung beschreibt auch rekombinante, chemosynthetische oder biosynthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine, die kompetent sind, sich unter physiologisch verträglichen Bedingungen rückzufalten, und veränderte isoelektrische Punkte im Vergleich zum natürlichen Protein aufweisen. Die Beschreibung beschreibt rekombinante, chemosynthetische oder biosynthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine, die im Vergleich zum natürlichen Protein veränderte Rückfaltungseigenschaften haben, und in denen die mutanten Proteine auch zum Beispiel eine veränderte Rezeptorbindungs-Spezifität, veränderte Stabilität, veränderte Solubilität und/oder veränderte biologische Aktivität haben.
  • In einem anderen Aspekt beschreibt die Beschreibung rekombinante chemosynthetische oder biosynthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine, die im Vergleich zum Elternprotein verbesserte Rückfaltungseigenschaften haben, und in denen mindestens ein Rest, vorzugsweise zwei, mehr bevorzugt drei oder mehrere Reste in der Ansatz- oder Basisregion einer Finger-2-Subdomäne eines schwachen Rückfalter-Proteins mit einem sauren Rest ersetzt wird (werden). Manchmal werden mehr als fünf Reste ersetzt. Einer der Austausch-Aminosäurereste ist Glu oder Asp. Der saure Rest ersetzt einen basischen Rest oder einen eine Amidgruppe tragenden hydrophilen Rest in der Basisregion. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Elternprotein OP-1. Weiterhin beschrieben sind BMP-5, BMP-6, OP-2, OP-3 oder 60-A, einschließlich Chimere, Heterodimere und Aminosäurevarianten davon. Der Austausch mit einem sauren Rest wird zu mindestens an einer der folgenden Positionen durchgeführt: 4(Q), 6(N), 25(R), 26(N), 30(R) und potenziell auch bei 22(K), 23(K) und 31(A). Gezählt von dem ersten Rest nach dem Cystein-Doppel in der C-terminalen Domäne von OP-1. (Siehe z.B. 1). Das Elternprotein kann auch eines von NODAL, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5 sein, und der Austausch erfolgt an einer oder mehreren der folgenden Positionen, 4(K, D, T, A, V), 6 (K, E, D), 24 (K, S), 25 (D, N), 29 (E, K, R) und möglicherweise 30 (E, S, A).
  • In einem anderen Aspekt beschreibt die Beschreibung rekombinante, chemosynthetische oder biosynthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine, die im Vergleich zum Elternprotein verbesserte Rückfaltungseigenschaften haben, und in denen mindestens ein Rest, zwei, drei oder mehrere Reste in der Ansatz oder Basisregion einer Finger-2-Subdomäne eines schwachen Rückfalter-Proteins mit einem eine Hydroxylgruppe tragenden polaren Rest ersetzt wird. Es können auch mehr als fünf Reste ersetzt werden. Der polare Austauschrest ist z.B. Ser oder Thr. Der Austauschrest ersetzt dadurch einen basischen Rest oder einen eine Amidgruppe tragenden hydrophilen Rest in der Basisregion. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Elternprotein OP-1. Weiterhin beschrieben sind BMP-5, BMP-6, OP-2, OP-3 oder 60-A, einschließlich Chimere, Heterodimere und Aminosäurevarianten davon, und der Austausch mit einem sauren Rest wird an zu mindestens einer der folgenden Positionen durchgeführt: 4, 6, 25, 26, 30, potenziell 22, 23 und 31 vom ersten Rest nach dem Cystein-Doppel in der C-terminalen Domäne. (Siehe z.B. 1). Das Elternprotein kann auch eines von NODAL, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5 sein, und der Austausch erfolgt an einer oder mehreren der Positionen 4, 6, 24, 25, 29 und potenziell 30.
  • In einer Ausführungsform erfolgt der Austausch von Resten mit einem sauren Rest und/oder einem eine Hydroxylgruppe tragenden polaren Rest an zu mindestens einer der folgenden Positionen in OP-1 (SEQ ID NO: 39): 400, 421, 422, 426, die den Resten 4, 6, 9, 25, 26 beziehungsweise 30 entsprechen, wenn man vom ersten Rest nach dem konservierten Cystein-Doppel in der C-terminalen aktiven Domäne zählt (siehe 1). Solche Austausche sind auch an den Positionen 402 und 405 in OP-1 beschrieben.
  • In einem anderen Aspekt werden rekombinante, chemosynthetische oder biosynthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine, einschließlich Heterodimere und Chimeren beschrieben, in denen der C-terminale Rest, mit einem der Aminosäurereste: Arginin, Serin, Isoleucin, Leucin oder Alanin ersetzt worden ist und im Vergleich zu der nicht-ausgetauschten Eltern-TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteinsequenz verbesserte Rückfaltungseigenschaften aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das TGF-β-Superfamilie-Mitglied OP-1. Das TGF-β-Superfamilie-Mitglied kann auch eines von BMP-5, BMP-6, 60-A oder OP-2 sein. Darüber hinaus ist das TGF-β-Superfamilie-Mitglied ein beliebiges von GDF-3, SCREW oder NODAL. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Austauschrest Arginin. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der C-terminale Rest in der Elternsequenz, der ersetzt wird, Histidin. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Elternprotein das schwache Rückfalter-Protein OP-1 (andere Beispiele sind BMP-5, BMP-6, OP-2, OP-3, 60-A, NODAL, GDF-3 oder SCREW), Chimere und/oder Aminosäurevarianten davon, und der C-terminale Austauschrest ist Arginin. Das Elternprotein kann auch jedes schwache Rückfalter-Protein sein, eingeschlossen in der Liste von TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5, einschließlich Chimere und/oder Aminosäurevarianten davon, und der C-terminale Austauschrest ist Arginin. Diese C-terminal ausgetauschten Proteine schließen weiterhin einen oder mehrere Aminosäurerest-Austausche in der Finger-2-Subdomäne ein, um die Zahl der sauren (negativ geladenen) Reste in dieser Region auf mindestens 3, 4 oder 5 zu erhöhen. Der Austausch saurer Reste kann auch in der Ansatz oder Basisregion der Finger-2-Subdomäne gemacht werden. In einer Ausführungsform ist der Austausch-Aminosäurerest Asp oder Glu. In noch einer anderen Ausführungsform ersetzen die sauren Reste hydrophile Reste, insbesondere eine Amidgruppe tragende und/oder positiv geladene Reste in dieser Region. Diese ersetzten Reste schließen ein: Asn, Gln, His, Arg und Lys. In einer anderen Ausführungsform schließen die C-terminal ausgetauschten Proteine weiterhin einen oder mehrere Aminosäurerest-Austausch(e) in der Finger-2-Subdomäne ein, um die Zahl der eine Amidgruppe tragenden Reste und/oder positive geladenen Reste in dieser Region zu reduzieren. In einer Ausführungsform hat die ausgetauschte Finger-2-Subdomäne weniger als fünf positiv geladene Reste, vorzugsweise 4 oder weniger, mehr bevorzugt 3 oder weniger positiv geladene Reste in der Basisregion von Finger-2. Die C-terminal ausgetauschten Proteine schließen weiterhin einen oder mehrere Aminosäurerest-Austausch(e) in der Finger-2-Subdomäne ein, um die Zahl der eine Hydroxylgruppe tragenden Reste in dieser Region zu erhöhen. Der polare Austauschrest ist z.B. Ser oder Thr. Der Austauschrest kann einen basischen oder eine Amidgruppe tragenden Rest ersetzen.
  • Die modifizierten Proteine der Erfindung können im Zusammenhang mit einer biologisch verträglichen Matrix wie Kollagen, Hydroxyapatit, Keramik oder Carboxymethylcellulose oder einem anderen geeigneten Matrixmaterial verwendet werden. Solche Kombinationen sind in Verfahren für das Regenerieren von Knochen, Knorpel und/oder anderen nicht-mineralisierten Skelett- oder Bindegeweben wie Band, Sehne, Muskel, Gelenkknorpel, Faserknorpel, Gelenkkapsel, Menisci, Bandscheiben, synovialem Membrangewebe und Faszien, aber nicht darauf beschränkt, besonders nützlich, um nur ein paar zu nennen. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,496,552 5,674,292 , 5,840,325 und U.S.S.N 08/253,398 , bald erteilt als U.S. _, gleichzeitig anhängige U.S.S.N. 08/459,129 und 08,458,811 , jeweils eingereicht am 2. Juni, 1995. Die vorliegende Anmeldung zieht in Betracht, dass die Bindungs- und/oder Adhärenzeigenschaften an solche Matrixmaterialien unter Verwendung der spezifischen Mutationen und Techniken, die hierin offenbart sind, verändert werden können.
  • Die Beschreibung beschreibt ein Verfahren zum Falten jener natürlichen TGF-β-Superfamilie-Proteine, die schwache Rückfalter sind, wie BMP-Homodimere und -Heterodimere, sowie für das Falten der mutanten Proteine der vorliegenden Erfindung unter physiologisch verträglichen und/oder neutralen pH-Bedingungen. Das Verfahren umfasst die Schritte des Bereitstellens von einer oder mehreren solubilisierten ausgetauschten TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Mutanten, Aussetzen der solubilisierten Mutante einer Redox-Reaktion in einem geeigneten Rückfaltungspuffer und das Rückfaltenlassen der Protein-Untereinheiten in Homodimere und/oder Heterodimere, wie gewünscht. Das Redox-Reaktionssystem kann oxidierte und reduzierte Formen von Glutathion, DTT, β-Mercaptoethanol, β-Mercaptomethanol, Cystin und Cystamin anwenden. Das Redox-Reaktionssystem beruht auf der Luftoxidation, vorzugsweise in der Anwesenheit eines Metall-Katalysators wie Kupfer. Die Verhältnisse von Reduktionsmittel zu Oxidationsmittel von etwa 1:10 bis etwa 10:1, vorzugsweise im Bereich von etwa 1:2 bis 2:1 können verwendet werden. Das mutante Protein wird in der Anwesenheit eines Detergens, einschließlich eines nicht-ionischen Detergens, z.B. Digitonin, N-Octylglucosid oder von zwitterionischen Detergenzien wie 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfat (CHAPS) solubilisiert. In noch einer anderen Ausführungsform erfolgt die Rückfaltungsreaktion in einem pH-Bereich von etwa 5,0-10,0, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,0-9,0, mehr bevorzugt im Bereich von etwa 7,0-8,5. Die Rückfaltungsreaktion erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von etwa 0-32°C oder im Bereich von etwa 4-25°C. Wo Heterodimere gebildet werden, können die optimalen Verhältnisse für das Zugeben der zwei verschiedenen Untereinheiten leicht empirisch und ohne unnötiges Experimentieren bestimmt werden.
  • Die Reinigung der Heterodimere kann durch Anpassen der zwei monomeren Sequenzen, sodass sie sich in einer Eigenschaft unterscheiden, die für die Reinigung nützlich ist, wie die Netto-Ladung, erleichtert werden.
  • Bestimmte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise gemäß den Prinzipien, die hierin offenbart sind, durch Anordnung von Nucleotiden und/oder verknüpften DNA-Restriktionsfragmenten, um synthetische DNAs zu produzieren, hergestellt. Die DNAs werden in ein geeignetes Proteinexpressionsvehikel transfiziert, das codierte Protein exprimiert, gefaltet und gereinigt. Bestimmte Konstrukte können auf eine Agonist-Aktivität in vitro getestet werden. Die Tertiärstruktur der Kandidatenkonstrukte kann durch ortsgerichtete oder Nucleotidsequenz-gerichtete Mutagenese, die durch die hierin offenbarten Prinzipien, Computer-basierendes Proteinstruktur-Modellieren und kürzlich entwickelte rationale Molekulardesign-Techniken unterstützt werden, um spezifische Eigenschaften eines Moleküls von Interesse zu verbessern oder zu modulieren, schrittweise verfeinert und moduliert werden. Ein bekanntes Phagen-Display oder andere Expressionssysteme können ausgenutzt werden, um gleichzeitig eine große Zahl von Kandidatenkonstrukten zu produzieren. Der Pool von Kandidatenkonstrukten kann dann unter Verwendung zum Beispiel einer Chromatographiesäule, umfassend Oberflächen-immobilisierte Rezeptoren, Salzgradientenelution, um Kandidaten mit starker Bindung auszuwählen und sie zu konzentrieren, und in vitro-Tests, um zu bestimmen, ob bestimmte isolierte Kandidaten als Agonisten der Aktivität des Matrizen-Superfamilie-Mitglieds/der Mitglieder wirken oder nicht, auf eine veränderte und/oder verbesserte Bindungsspezifität durchmustert werden. Die Identifizierung eines nützlichen Konstrukts wird von der Produktion von Zelllinien, die kommerziell nützliche Mengen des Konstrukts für eine Laborverwendung und schließlich für das Produzieren von therapeutisch nützlichen Molekülen exprimieren, gefolgt. Es wird auch in Betracht gezogen, dass bevorzugte Konstrukte, sobald sie durch die hierin beschriebenen Protein- und die DNA-Methoden identifiziert und charakterisiert sind, durch chemische Standardsynthese-Methoden produziert werden können.
  • In einem anderen Aspekt beschreibt die Beschreibung Verfahren zum Produzieren von TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteinen in einer Wirtszelle, einschließlich einem bakteriellen Wirt oder irgendeiner anderen Wirtszelle, wo das überexprimierte Protein in einer Form aggregiert, die eine Solubilisierung und/oder Rückfaltung in vitro erfordert. Das Verfahren umfasst die Schritte des. Bereitstellens einer Wirtszelle, die mit Nucleinsäuremolekülen transfiziert ist, die ein oder mehrere der rekombinante(n) oder biosynthetische(n) Proteine der Erfindung codieren, das Züchten der Wirtszellen unter Bedingungen, die für das Exprimieren des rekombinanten Proteins geeignet sind, das Gewinnen des aggregierten Proteins und das Solubilisieren und Rückfalten des Proteins unter Verwendung der oben behandelten Schritte. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren den zusätzlichen Schritt des Transfizierens der Wirtszelle mit einer Nucleinsäure, die das rekombinante oder biosynthetische Protein, wie hierin beschrieben, codiert.
  • In einem anderen Aspekt beschreibt die Beschreibung rekombinante, chemosynthetische oder biosynthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine, die im Vergleich zu der Elternsequenz einen geringen oder keinen wesentlichen Anstieg in der immunogenen Wirkung in einem Säuger haben. Die immunogene Wirkung eines Moleküls kann leicht durch Injizieren des Moleküls oder eines Teils davon in ein Tier, z.B. eine Testmaus, und Testen auf Antikörper, die durch das Tier als Antwort auf die Injektion produziert werden und für das Molekül spezifisch sind, nachgewiesen werden. Nützliche Tests schließen jedes Standardprotokoll für das Nachweisen von Antikörpern im Serum ein, zum Beispiel Standard-Western Blots, ELISA's oder Radioimmun-Tests.
  • Die Beschreibung beschreibt auch Verfahren zum Bilden von rekombinanten, chemosynthetischen oder biosynthetischen TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteinen, die veränderte biologische Eigenschaften haben, einschließlich chimere Konstrukte. In einer Ausführungsform können individuelle Subdomänen der C-terminalen aktiven Region zwischen den TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Molekülen ausgetauscht werden, um ein chimeres Konstrukt mit der erwünschten Eigenschaft zu bilden. Zum Beispiel kann die Finger-2-Subdomäne eines schwachen Rückfalters mit der Finger-2-Subdomäne eines guten Rückfalters ausgetauscht werden, um die Faltungseigenschaften des Elternproteins zu verbessern. Nur nicht-konservierte Reste, die mit dem Ansatz- oder Basisregion-Finger-2 korrespondieren, dürfen ausgetauscht werden, und die Schleifen- oder Spitzensequenz der Elternsequenz wird erhalten, um die biologische Aktivität der Elternsequenz zu erhalten. Alternativ können die biologische Aktivität und die Faltungseigenschaften eines schwachen Rückfalter-Elternproteins durch Verändern von nicht-konservierten Resten in sowohl Ansatz/Basisregion als auch der Spitzen/Schleifenregion von Finger-2 verändert werden. Umgekehrt kann die biologische Aktivität eines guten Rückfalters durch Ersetzen der Finger-1-Subdomäne des Elternproteins und/oder der Heel-Subdomäne mit jener eines TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteins, das die erwünschte Aktivität hat, verändert werden, ohne die Rückfaltungseigenschaften des Proteins wesentlich zu beeinflussen, wodurch ein mutantes Protein produziert wird. Alternativ können nur nicht-konservierte Reste in der Spitze von Finger-2 verändert werden.
  • Die vorhergehenden und andere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung offensichtlicher gemacht werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 listet die ausgerichteten C-terminalen Reste auf, die die Finger-2-Subdomäne für verschiedene bekannte Mitglieder der BMP-Familie und anderer TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine definieren, beginnend mit dem ersten Rest nach dem Cystein-Doppel.
  • 2 ist eine schematische Darstellung eines Schleifen-Modells einer C-terminalen aktiven BMP-Domäne, die das sieben Cysteine-Skelett und die drei verschiedenen Subdomänen: Heel (10), Finger-1 (12) und Finger-2 (14), einschließlich der Ansatz- oder Basisregion (16) und der Spitzen- oder Schleifenregion (18) zeigt.
  • 3A ist eine Nucleotid- und die entsprechende Einzelbuchstaben-Aminosäuresequenz, die die C-terminale aktive sieben Cysteine-Domäne von OP-1 codiert.
  • 3B ist die Nucleotid- und die entsprechende Einzelbuchstaben-Aminosäuresequenz von BMP-5 und ihre Änderungen für die Rückfaltung.
  • 4A ist eine schematische Darstellung von beispielhaften Ausführungsformen von chimeren Proteinkonstrukten der vorliegenden Erfindung.
  • 4B ist eine schematische Darstellung von beispielhaften Ausführungsformen der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die mit den Eigenschaften der Rückfaltung und der ROS-Aktivität in Beziehung stehen.
  • 5 illustriert eine Korrelation zwischen der Rückfaltungs-Wirksamkeit und den geladenen Aminosäuren in der TGF-β-7Cysteine-Domäne.
  • Die 6A, 6B und 6C sind Sequenzausrichtungen unter Verwendung des Einzelbuchstaben-Aminosäure-Codes, angeordnet, um die Homologien der Finger-1-, Heel- beziehungsweise Finger-2-Regionen von einigen bekannten Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie anzuzeigen. Gezeigt sind die entsprechenden Aminosäuren, umfassend jede Region des menschlichen TGF-β1 bis TGF-β5 (die TGF-β-Subgruppe), die Vg/dpp-Subgruppe, bestehend aus dpp, Vg-1, Vgr-1, 60A (siehe gleichzeitig anhängiges U.S.S.N. 08/271,556 ); BMP-2A (in der Literatur auch als BMP-2 bekannt), Dorsalin, BMP-2B (in der Literatur auch als BMP-4 bekannt), BMP-3, BMP-5, BMP-6, OP-1 (in der Literatur auch als BMP-7 bekannt), OP-2 (siehe PCT/US91/07635 und U.S.-Patent Nr. 5,266,683 ) und OP-3 ( U.S.S.N. 07/971,091 ), die GDF-Subgruppe, bestehend aus GDF-1, GDF-3 und GDF-9, die Inhibin-Subgruppe, bestehend aus Inhibin-α, Inhibin-βA und Inhibin-βB. Die Striche (–) zeigen eine Peptidbindung zwischen benachbarten Aminosäuren an. Ein Konsensus-Sequenzmuster für jede Subgruppe ist unter jeder Subgruppe gezeigt.
  • 7 ist eine Einzelbuchstaben-Code-Auflistung der Aminosäuresequenzen, die mit einem Großbuchstaben im Einzelbuchstaben-Aminosäure-Standardcode identifiziert sind, und mit Kleinbuchstaben, um Gruppen von Aminosäuren zu identifizieren, die an jener Stelle nützlich sind, in der die Kleinbuchstaben für die Aminosäuren stehen, die gemäß der Muster-Definitionsschlüssel-Tabelle, die in 8 dargestellt ist, angezeigt sind. 7 identifiziert bevorzugte Mustersequenzen für das Konstituieren der Finger-1-, Heel- und Finger-2-Regionen von biosynthetischen Konstrukten der Erfindung. Die Striche (–) zeigen eine Peptidbindung zwischen benachbarten Aminosäuren an.
  • 8 ist eine Muster-Definitionstabelle, die gemäß der Lehre von Smith und Smith (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:118-122, hergestellt wurde.
  • Detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
  • Bevor weiter mit einer detaillierten Beaschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, wird eine Erklärung von bestimmten Begriffen und Formulierungen geliefert werden. Dementsprechend wird verstanden, dass jeder der Begriffe oder Formulierungen, die unten dargelegt sind, hierin wie folgt definiert wird:
    Wie hierin verwendet, werden „saure" . oder „negativ geladene Reste" so verstanden, dass sie einen beliebigen Aminosäurerest, natürlich vorkommend oder synthetisch, einschließen, der unter neutralen pH-Werten, einschließlich aber nicht limitiert auf physiologisch verträgliche Bedingungen, eine negative Ladung auf seiner R-Gruppe trägt. Beispiele schließen ohne Einschränkung Asparginsäure („Asp") und Glutaminsäure („Glu") ein. In ähnlicher Weise schließen basische oder positiv geladene Reste jeden Aminosäurerest, natürlich vorkommend oder synthetisch gebildet, ein, der unter physiologischen Bedingungen eine positive Ladung auf seiner R-Gruppe trägt. Beispiele schließen ohne Einschränkung Arginin („Arg"), Lysin („Lys") und Histidin („His") ein. Wie hierin verwendet, schließen „hydrophile" Reste sowohl saure als auch basische Aminosäurereste sowie ungeladene Reste, die Amidgruppen auf ihren R-Gruppen tragen, einschließlich ohne Einschränkung Glutamin („Gln") und Aspargin („Asn"), und polare Reste ein, die Hydroxylgruppen auf ihren R-Gruppen tragen, einschließlich ohne Einschränkung Serin („Ser") und Threonin („Thr").
  • Wie hierin verwendet bedeutet „Biosynthese” oder „biosynthetisch", als ein Ergebnis von oder abstammend von einer Ligierung von natürlich oder synthetisch abgeleiteten Fragmenten auftretend. Zum Beispiel, aber nicht limitiert darauf, sind die ortsgerichtete Mutagenese und das Ligieren von Peptid- oder Nucleinsäurefragmenten, die einer oder mehreren Subdomäne(n) (oder Fragmenten davon) entsprechen, hierin offenbart. „Chemosynthese" oder „chemosynthetisch" bedeutet das Aufsetzen als ein Ergebnis von oder das Abstammen von chemischen Produktionsmitteln. Zum Beispiel, aber nicht begrenzt darauf, die Synthese einer Peptid- oder Nucleinsäuresequenz unter Verwendung eines automatisierten Standard-Synthesegeräts von einer kommerziell erhältlichen Quelle. Es wird in Betracht gezogen, dass sowohl natürliche als auch nicht-natürliche Aminosäuren verwendet werden können, um die erwünschten Eigenschaften, wie hierin gelehrt, zu erhalten. „Rekombinante” Produktion oder Technologie bedeutet das Auftreten als ein Ergebnis von oder das Abstammen von einem gentechnisch veränderten Produktionsmittel. Zum Beispiel, aber nicht begrenzt darauf, die Expression einer gentechnisch manipulierten DNA-Sequenz oder eines Gens, das ein chimeres Protein (oder Fragment davon) der vorliegenden Erfindung codiert. In die vorstehende Definition sind auch die Lehren, die nachstehend zumindest in den Abschnitten I.B.1. (a) und (b); Abschnitt II; und zumindest in den Beispielen 1, 2 und 9 (Abschnitt III) dargelegt sind, eingeschlossen. „Synthetisch" bedeutet, nicht-natürlich auftretend oder abstammend, d.h. nicht natürlich vorkommend.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet „entsprechende Restposition” eine Restposition in einer Proteinsequenz, die mit einer Position in einer Bezugs-Aminosäuresequenz korrespondiert, wenn die zwei Sequenzen ausgerichtet werden. Wie durch Fachleute anerkannt werden und wie in 1 illustriert wird, sind die Sequenzen der BMP-Familienmitglieder in der C-terminalen aktiven Domäne und insbesondere in der Finger-2-Subdomäne hochgradig konserviert. Aminosäuresequenz-Ausrichtungsverfahren und -Programme sind auf dem Fachgebiet gut entwickelt. Siehe z.B. das Verfahren von Needleman, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, die bequem durch Computerprogramme wie das Align-Programm (DNAstar, Inc.) eingeschlossen sind. Interne Lücken und Aminosäure-Insertionen in der zweiten Sequenz werden für die Zwecke des Berechnens der Anpassung ignoriert. Zur Erleichterung der Beschreibung wird hOP-1 (menschliches OP-1, auf dem Fachgebiet auch als „BMP-7" bezeichnet) nachstehend als ein repräsentatives TGF-β-Superfamilie-Mitglied bereitgestellt. Es wird jedoch anerkannt werden, dass OP-1 nur repräsentativ für die TGF-β-Subklasse von wahren Gewebemorphogenen ist, die kompetent sind, um eine Gewebemorphogenese zu induzieren.
  • „Osteogenes Protein" oder Knochen-morphogenes Protein" bedeutet ein TGF-β-Superfamilie-Protein, das die vollständige Kaskade der morphogenen Ereignisse induzieren kann, die in einer Skelettgewebe-Bildung gipfelt, einschließlich aber nicht beschränkt auf Knorpel-, Band-, Sehnen- und/oder endochondraler Knochenbildung. Osteogene Proteine, die hierin nützlich sind, schließen alle bekannten natürlich vorkommenden nativen Proteine ein, einschließlich eines allelischen, phylogenetischen Gegenstücks und anderer Varianten davon, ob natürlich vorkommend oder biosynthetisch produziert (z.B. einschließlich „Muteine" oder „mutante Proteine"), sowie neue, osteogenisch aktive Mitglieder der allgemeinen morphogenen Familie von Proteinen. Wie hierin beschrieben, wird diese Klasse von Proteinen im Allgemeinen durch das menschliche osteogene Protein (hOP-1) repräsentiert. Andere osteogene Proteine schließen die osteogenisch aktiven Formen der Proteine ein, die in der Liste eingeschlossen sind: OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, dpp, Vg-1, Vgr, 60A-Protein, CDMP-1, CDMP-2, CDMP-3, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, MP-52, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP oder NEURAL, einschließlich Aminosäuresequenz-Varianten davon und/oder Heterodimere davon. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform ist das osteogene Protein, das in der Anwendung der Erfindung nützlich ist, OP-1 (andere Beispiele sind BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-12, BMP-13, GDF-5, GDF-6, GDF-7, CDMP-1, CDMP-2, CDMP-3, MP-52) und Aminosäuresequenz-Varianten und Homologe davon, einschließlich Spezies-Homologe davon. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform haben nützliche osteogenisch aktive Proteine Polypeptidketten mit Aminosäuresequenzen, umfassend eine Sequenz, die durch eine Nucleinsäure codiert wird, die unter niedrigen, mittleren oder hohen Stringenz-Hybridisierungsbedingungen an DNA oder RNA hybridisiert, die osteogene Bezugssequenzen codiert, z.B. C-terminale Sequenzen, die die konservierten sieben-Cysteine-Domänen von OP-1 definieren. (Andere Beispiele sind OP-2, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 60A, GDF-5, GDF-6, GDF-7 und dergleichen). Wie hierin verwendet, werden mittel-stringente Hybridisierungsbedingungen als eine Hybridisierung gemäß bekannter Techniken in 40% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung und 0,1% SDS bei 37°C über Nacht und Waschen in 0,1 × SSPE, 0,1% SDS bei 50°C definiert. Standard-Stringenzbedingungen werden in den kommerziell verfügbaren Standardtexten über molekulares Clonieren gut charakterisiert. Siehe zum Beispiel Molecular Cloning A Laborstory Manual, 2. Aufl., Hrsg. Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laborstory Press: 1989); DNA Cloning, Bände I und II (D.N. Glover Hrsg. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait Hrsg., 1984): Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harnes & S.J. Higgins Hrsg. 1984); und B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984). Siehe auch U.S.-Patent Nr. 5,750,651 und 5,863,758 .
  • Andere Mitglieder der TGF-β-Superfamilie von verwandten Proteinen, die eine Brauchbarkeit in der Anwendung der vorliegenden Erfindung haben, schließen native schwache Rückfalt-Proteine aus der Liste: TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5, verschiedene Inhibine, Aktivine, BMP-11 und MIS ein, um ein paar zu nennen. 1 listet die C-terminalen Reste, die die Finger-2-Subdomäne definieren, zusammen mit den flankierenden Cysteinen von verschiedenen bekannten Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie auf. Jedes der Proteine auf der Liste, das ein schwacher Rückfalter ist, kann durch die hierin beschriebenen Verfahren verbessert werden, wie es auch andere bekannte oder entdeckbare Familienmitglieder werden können. Wie weiterhin hierin beschrieben, können die biologisch aktiven osteogenen Proteine, die geeignet sind, durch Routineexperimentieren unter Verwendung des Biotests, der durch Reddi und Sampath beschrieben ist, wie er auf dem Fachgebiet anerkannt wird, identifiziert werden. Eine detaillierte Beschreibung von nützlichen Proteinen folgt. Äquivalente können durch den Fachmann unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimentieren und einem durchschnittlichen Fachwissen identifiziert werden.
  • „Morphogene" oder „morphogene Proteine", wie hierin in Betracht gezogen, schließen Mitglieder der TGF-β-Superfamilie ein, von denen erkannt worden ist, dass sie morphogen, d.h. zum Induzieren der Entwicklungskaskade der Gewebemorphogenese in einem reifen Säuger in der Lage sind (Siehe PCT Anmeldung Nr. US 92/01968 ). Insbesondere sind diese Morphogene zum Induzieren der Proliferation von nicht-determinierten Vorläuferzellen und Induzieren der Differenzierung dieser stimulierten Vorläuferzellen in einer gewebespezifischen Weise unter geeigneten Umweltbedingungen in der Lage. Zusätzlich sind die Morphogene zum Unterstützen des Wachstums und der Erhaltung dieser differenzierten Zellen in der Lage. Diese morphogenen Aktivitäten erlauben es den Proteinen, die Entwicklungskaskade der Gewebemorphogenese in einer geeigneten, morphogen permissiven Umwelt, das Stimulieren von Stammzellen, zu proliferieren und in einer gewebespezifischen Weise zu differenzieren, und das Induzieren des Fortschreitens der Ereignisse, die in einer neuen Gewebebildung gipfeln, zu initiieren und beizubehalten. Diese morphogenen Aktivitäten erlauben es dem Protein auch, die „Redifferenzierung" von Zellen, die vorher stimuliert wurden, um von ihrem Differenzierungspfad abzukommen, zu induzieren. Unter geeigneten Umweltbedingungen wird erwartet, dass diese Morphogene auch die „Redifferenzierung" von determinierten Zellen stimulieren können. Um den Fachmann zu leiten, sind hierin zahlreiche Mittel zum Testen von morphogenen Proteinen in einer Vielfalt von Geweben und für eine Vielfalt von Eigenschaften, die typisch für morphogene Proteine sind, beschrieben. Es wird verstanden werden, dass diese Lehren verwendet werden können, um morphogene Eigenschaften von natürlichen Proteinen sowie chimeren Proteinen zu bewerten. Siehe zum Beispiel Abschnitte III, Beispiele 11A-11G für die Lehren, die mit der Morphogenese von Gehirn, Leber, um nur ein paar zu nennen, in Beziehung stehen.
  • Nützliche native oder Elternproteine schließen auch jene ein, die mindestens 70% Aminosäuresequenz-Homologie mit der C-terminalen sieben-Cysteine-Domäne des menschlichen OP-1 teilen. Um den Prozentsatz der Homologie einer Kandidaten-Aminosäuresequenz mit der konservierten sieben-Cysteine-Domäne zu bestimmen, werden die Kandidatensequenz und die sieben-Cysteine-Domäne ausgerichtet. Der erste Schritt für das Durchführen einer Ausrichtung ist, ein Ausrichtungsmittel, wie den dynamischen Programmierungsalgorithmus, der in Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) beschrieben wird, und das Align Program, eine kommerzielle Software-Packung, die von DNAstar, Inc. produziert wird, zu verwenden. Nachdem die anfängliche Ausrichtung gemacht ist, wird sie dann durch Vergleich mit einer mehrfachen Sequenzausrichtung einer Familie von verwandten Proteinen verfeinert. Sobald die Ausrichtung zwischen der Kandidatensequenz und der sieben-Cysteine-Domäne gemacht und verfeinert ist, wird ein Prozent-Homologiewert berechnet. Die individuellen Aminosäuren von jeder Sequenz werden sequenziell gemäß ihrer Ähnlichkeit mit einander verglichen. Ähnlichkeitsfaktoren schließen ähnliche Größe, Form und elektrische Ladung ein. Ein besonders bevorzugtes Verfahren des Bestimmens der Aminosäureähnlichkeiten ist die PAM250-Matrix, beschrieben in Dayhoff et al., 5 Atlas of Protein Sequence and Structure 345-352 (1978 & Ergänz.). Ein Ähnlichkeitswert wird zuerst als die Summe der ausgerichteten paarweisen Aminosäure-Ähnlichkeitswerte berechnet. Insertionen und Deletionen werden zu Zwecken der Prozent-Homologie und Identität ignoriert. Dementsprechend werden Lücken-Nachteile in dieser Berechnung nicht verwendet. Der grobe Wert wird dann durch Teilen desselben durch das geometrische Mittel der Werte der Kandidatenverbindung und der sieben-Cysteine-Domäne normalisiert. Das geometrische Mittel ist die Quadratwurzel aus dem Produkt dieser Werte. Der normalisierte grobe Wert ist die Prozent-Homologie.
  • Wie hierin verwendet, sind „konservative Austausche" Reste, die physikalisch oder funktionell ähnlich zu den korrespondierenden Bezugsresten sind, z.B. die ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung, chemische Eigenschaften, einschließlich der Fähigkeit, kovalente oder Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden, oder dergleichen haben. Besondere konservative Austausche sind jene, die die Kriterien, die für eine akzeptierte Punktmutation in Dayhoff et al. (1978), 5 Atlas of Protein Sequence and Structure, Ergänz. 3, Kap. 22 (S. 354-352), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. 20007, definiert sind, erfüllen. Beispiele von konservativen Austauschen schließen den Austausch von einer Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen Charakteristika ein, z.B. sind Austausche innerhalb der folgenden Gruppen wohlbekannt: (a) Glycin, Alanin; (b) Valin, Isoleucin, Leucin; (c) Asparginsäure, Glutaminsäure; (d) Aspargin, Glutamin; (e) Serin, Threonin; (f) Lysin, Arginin, Histidin; und (g) Phenylalanin, Tyrosin. Der Begriff „konservative Variante" oder „konservative Variation" schließt auch die Verwendung einer ausgetauschten Aminosäure anstelle einer nicht-ausgetauschten Eltern-Aminosäure in einer Polypeptidkette ein, vorausgesetzt, dass die Antikörper, die eine Bindungsspezifität für die resultierende ausgetauschte Polypeptidkette haben, auch eine Bindungsspezifität für die nicht-ausgetauschte oder Eltern-Polypeptidkette haben (d.h. damit „kreuzreagieren" oder „immunreagieren").
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet eine „konservierte Restposition" eine Stelle in einer Bezugs-Aminosäuresequenz, die durch dieselbe Aminosäure oder eine konservative Variante davon in mindestens einer anderen Mitglieds-Sequenz besetzt ist. Zum Beispiel sind in 1 unter Vergleichen von BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-6 mit OP-1 als die Bezugssequenz Positionen wie 2(P), 3(T), 5(L), 7(A), 8(I) und 9(S) usw. konservierte Positionen, und Positionen wie 4 (K, E) und 6 (N, S) usw. sind nicht-konservierte Positionen.
  • Wie hierin verwendet, wird die „Basis"- oder „Ansatz"-Region der Finger-2-Subdomäne durch die Reste 1-10 und 22-31 definiert, wie durch OP-1 beispielhaft dargestellt wird, und wenn vom ersten Rest nach dem Cystein-Doppel in der C-terminalen aktiven Domäne gezählt wird. (Siehe 1). Wie aus einer Sequenzausrichtung von anderen TGF-β-Superfamilie-Protein-Mitgliedern mit OP-1 leicht offensichtlich wird, wird die korrespondierende Basis- oder Ansatzregion für ein längeres Protein wie BMP-9 oder Dorsalin durch die Reste 1-10 und 23-32 definiert; für ein kürzeres Protein wie NODAL wird die korrespondierende Region durch die Reste 1-10 und 21-30 definiert (Siehe 1). In der SEQ ID NO: 39 (menschliches OP-1) sind die Reste, die mit der Basis- oder Ansatzregion der Finger-2-Subdomäne korrespondieren, die Reste 397-406 (korrespondierend mit den Resten 1-10 in 1) und die Reste 418-427 (korrespondierend mit den Resten 22-31 in 1).
  • Wie hierin verwendet, schließt die „Aminosäuresequenz-Homologie" sowohl die Aminosäuresequenz-Identität als auch -Ähnlichkeit ein. Homologe Sequenzen teilen identische und/oder ähnliche Aminosäurereste, wobei ähnliche Reste konservative Austausche für oder „erlaubte Punktmutationen" von korrespondierenden Aminosäureresten in einer ausgerichteten Bezugssequenz sind.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnen die Begriffe „chimeres Protein", „Chimere", „chimere Polypeptidkette", „chimeres Konstrukt" und „chimere Mutante" jedes synthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Konstrukt, in dem die Aminosäuresequenz von mindestens einer definierten Region, Domäne oder Subdomäne wie einer ersten Finger-1-, Finger-2- oder Ballen-Subdomäne ganz oder zum Teil (z.B. mindestens etwa 3, 5, 10 oder 15 aufeinanderfolgende Aminosäurereste) mit einer zweiten Aminosäuresequenz von mindestens einem anderen, verschiedenen TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Protein ersetzt worden ist, sodass das resultierende Konstrukt eine Aminosäuresequenz hat, die als nicht-natürlicherweise vorkommend und von der anderen Proteinquelle abstammend erkennbar ist. Bestimmte Chimeren enthalten eine Subdomäne von einem dritten verschiedenen TGF-β-Superfamilie-Protein oder enthalten zwei verschiedene Subdomänen vom zweiten Protein. Es wird verstanden, dass ein Markenzeichen der bevorzugten Ausführungsformen eine rückgefaltete Struktur ist, in der die konservierten Disulfidbrücken der TGF-β-Superfamilie bewahrt werden; siehe Abschnitt I.A. nachstehend für eine Diskussion der konservierten 1., 2., 3., 5., 6. und 7. Cystein-Reste gegenüber dem semikonservierten 4. Rest.
  • Wie hierin verwendet, schließen nützliche Expressions-Wirtszellen Prokaryonten und Eukaryonten ein, einschließlich jeder Wirtszelle, die zum Herstellen eines Einschlusskörpers in der Lage ist. Besonders nützliche Wirtszellen schließen ohne Einschränkung bakterielle Wirte wie E. coli sowie B. subtilis und Pseudomonas ein. Andere nützliche Wirte schließen niedrigere Eukaryonten wie Hefe (Saccharomyces cereviceae) und höhere Eukaryonten, einschließlich Insektenzellen wie Drosophila, Säugerzellen wie CHO und dergleichen ein. Ein alternatives Mittel der Produktion würde die chemische Synthese des mutanten Konstrukts, gefolgt von einer korrekten Rückfaltung sein.
  • Die vorliegende Beschreibung beschreibt rekombinante, chemosynthetische oder biosynthetische TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine, die veränderte Rückfaltungseigenschaften und veränderte Aktivitätsprofile im Vergleich zu den natürlich vorkommenden Formen haben. Mutante Konstrukte umfassen Aminosäureaustausche in natürlich vorkommenden TGF-β-Superfamilie-Migliedern. Die detaillierte Beschreibung, die unten geliefert wird, beschreibt die Anordnung von Austauschen, die in verbesserten morphogenen und pharmazeutischen Eigenschaften resultieren. Die Verfahren zum Produzieren von mutanten Konstrukten werden auch beschrieben.
  • Die Eigenschaften von nativen BMPs oder anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie von Proteinen, einschließlich Heterodimeren und Homodimeren davon, werden durch Ersetzen von einem oder mehreren definierten Aminosäurerest(en) in der C-terminalen Finger-2-Subdomäne mit einem anderen Aminosäurerest verändert. Als ein Ergebnis dieser Entdeckung ist es möglich, TGF-β-Superfamilie-Proteine zu gestalten, die (1) rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen exprimiert oder unter Verwendung von Polypeptid- oder Nucleotid-Synthesegeräten chemisch synthetisiert werden; (2) veränderte Faltungseigenschaften haben; (3) eine veränderte Solubilität unter neutralen pH-Werten, einschließlich aber nicht beschränkt auf physiologisch verträgliche Bedingungen, haben; (4) veränderte isoelektrische Punkte haben; (5) eine veränderte Stabilität haben; (6) eine veränderte Gewebe- oder Rezeptorspezifität haben; (7) eine umgestaltete, veränderte biologische Aktivität haben; (8) veränderte Bindungs- oder Adhärenzeigenschaften an feste Oberflächen, wie biologisch verträgliche Matrices oder Metalle, aber nicht beschränkt darauf, haben und/oder (9) die Fähigkeit haben, eine Formulierung zu ermöglichen. Durch Verwerten der hierin offenbarten Entdeckungen können mutante Proteine, die anderweitig nicht optimal in einem prokaryontischen Wirt wie E. coli exprimiert werden könnten, jetzt gestaltet werden, um die Expression in E. coli und eine optimale Rückfaltung in vitro zu ermöglichen.
  • Daher kann die vorliegende Erfindung Mechanismen für das Gestalten von Schnellfreisetzungs-, Langsamfreisetzungs- und/oder zeitlich festgelegten Freisetzungs-Präparaten bereitstellen, die ein bevorzugtes chimeres Protein enthalten. Andere Vorteile und Eigenschaften werden aus den nachstehenden Lehren offensichtlich werden. Darüber hinaus können durch das Verwerten der hierin offenbarten Entdeckungen modifizierte Proteine, die veränderte Oberflächenbindungs/Oberflächen-Adhärenz-Eigenschaften haben, gestaltet und ausgewählt werden. Die Oberflächen von besonderer Signifikanz schließen feste Oberflächen ein, die natürlich vorkommen können, wie Knochen; oder poröse partikuläre Oberflächen wie Kollagen oder andere biologisch verträgliche Matrices; oder die angefertigten Oberflächen von protethischen Implantaten, einschließlich Metalle, sind aber nicht darauf beschränkt. Wie hierin in Betracht gezogen, kann nahezu jede Oberfläche auf eine unterschiedliche Bindung von Konstrukten getestet werden. So umspannt die vorliegende Beschreibung eine Vielfalt von funktionellen Molekülen, die Änderungen in ihren Oberflächenbindungs/Oberflächen-Adhärenz-Eigenschaften haben, wodurch solche Konstrukte nützlich für veränderte in vivo-Anwendungen, einschließlich Langsamfreisetzungs-, Schnellfreisetzungs- und/oder zeitlich festgelegte Freisetzungs-Präparate, gemacht werden.
  • Der Fachmann wird anerkennen, dass ein beliebiges Kombinieren von irgendeinem oder mehreren der oben rezitierten Eigenschaften spezifische Möglichkeiten liefert, um die Verwendungen von maßgefertigten mutanten Proteinen (und DNAs, die dieselben codieren) zu manipulieren. Zum Beispiel kann die Eigenschaft der veränderten Stabilität ausgenutzt werden, um den Durchsatz von mutanten Proteinen in vivo zu manipulieren. Darüber hinaus gibt es im Fall von mutanten Proteinen, die auch Eigenschaften wie eine veränderte Rückfaltung und/oder Funktion haben, eine wahrscheinliche Querverbindung zwischen Faltung, Funktion und Stabilität. Siehe zum Beispiel Liscomb et al., 7 Protein Sci. 765-73 (1998); und Nikolova et al., 95 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14675-80 (1998). Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung können Stabilitätsänderungen unter Verwendung von wohlbekannten Techniken des Circulardichroismus oder anderer Indizes der Stabilität wie eine Funktion der Denaturierungsmittel-Konzentration oder der Temperatur routinemäßig überwacht werden. Man kann auch eine Routine-Rasterkalorimetrie verwenden. In ähnlicher Weise gibt es eine wahrscheinliche Querverbindung zwischen jeder der vorhergehenden Eigenschaften und der Eigenschaft der Solubilität. Im Fall der Solubilität ist es möglich, diese Eigenschaft so zu manipulieren, dass ein chimeres Protein unter physiologisch verträglichen Bedingungen entweder mehr oder weniger löslich ist und es folglich leicht diffundiert beziehungsweise lokalisiert bleibt, wenn es in vivo verabreicht wird.
  • Nachstehend werden detaillierte Beschreibungen von geeigneten rekombinanten, chemosynthetischen oder biosynthetischen Proteinen und DNAs sowie Verfahren, die in der Anwendung der Erfindung nützlich sind, und Verfahren zum Verwenden und Testen der Proteinkonstrukte geliefert; nachstehend werden auch zahlreiche nicht-limitierende Beispiele geliefert, die 1) die Nützlichkeit der rekombinanten, chemosynthetischen oder biosynthetischen Proteine, DNAs und Verfahren, die hierin beschrieben sind, illustrieren; und 2) Tests bereitstellen, mit denen diese Protein- und DNA-Konstrukte getestet und verwendet werden.
  • I. PROTEIN-ERWÄGUNGEN
  • A. Biochemische, strukturelle und funktionelle Eigenschaften von beispielhaften Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie.
  • Jede der Untereinheiten in TGF-β2 oder OP-1 hat ein charakteristisches Faltungsmuster, das sechs der sieben C-terminalen Cystein-Reste involviert. Kurz, vier der Cystein-Reste in jeder Untereinheit bilden zwei Disulfid-Bindungen, die zusammen einen Acht-Reste-Ring bilden, während zwei zusätzliche Cystein-Reste eine Disulfidbindung bilden, die durch den Ring tritt, so dass eine knotenähnliche Struktur entsteht. Mit einem Nummerierungsschema, das mit dem am meisten N-terminal gelegenen Cystein der 7 konservierten Cystein-Reste, dem die Nummer 1 zugeordnet wird, beginnt, sind der 2. und 6. Cystein-Rest Disulfid-verbunden, um eine Seite des Acht-Reste-Rings zu schließen, während der 3. und 7. Cystein-Rest Disulfid-verbunden sind, um die andere Seite des Rings zu schließen. Der 1. und 5. konservierte Cystein-Rest sind durch das Zentrum des Rings Disulfid-verbunden, um den Kern des Knotens zu bilden. Aminosäuresequenz-Ausrichtungsmuster legen nahe, dass dieses strukturelle Motiv zwischen den Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie konserviert ist. Das 4. Cystein ist semi-konserviert, und wenn es vorhanden ist, bildet es typischerweise eine Interketten-Disulfidbindung (ICDB) mit dem korrespondierenden Cystein-Rest in der anderen Untereinheit.
  • Die Struktur von jeder Untereinheit von TGF-β2 und OP-1 umfasst drei tertiärstrukturelle Hauptelemente und eine N-terminale Region. Die strukturellen Elemente sind aus den Regionen einer kontinuierlichen Polypeptidkette zusammengestellt, die über 50% Sekundärstruktur der folgenden Typen besitzt: (1) Schleife, (2) α-Helix und (3) β-Faltblatt. Ein anderes definierendes Kriterium für jede strukturelle Region ist, dass die eintretenden (N-terminalen) und austretenden (C-terminalen) Peptidstränge ziemlich eng beisammen sind, sie sind etwa 7A voneinander entfernt.
  • Die Aminosäuresequenz zwischen den 1. und 2. konservierten Cysteinen bildet eine strukturelle Region, die durch einen anti-parallelen β-Faltblatt-Finger charakterisiert ist, der hierin als die Finger-1-Region bezeichnet wird. In ähnlicher Weise bilden die Reste zwischen den 5. und 6. konservierten Cysteinen auch einen anti-parallelen β-Faltblatt-Finger, der hierin als die Finger-2-Region bezeichnet wird. Ein β-Faltblatt-Finger ist eine einzelne Aminosäurekette, umfassend einen β-Strang, der durch eine β-Kehre oder eine etwas größere Schleife auf sich selbst zurückfaltet, sodass die Polypeptidkette, die in die Region eintritt oder daraus austritt, eine oder mehrere anti-parallele β-Faltblatt-Strukturen bildet. Die dritte strukturelle Hauptregion, die die Reste zwischen den 3. und 5. konservierten Cysteinen involviert, wird durch eine Drei-Kehren-α-Helix charakterisiert, die hierin als die Heelregion bezeichnet wird. Die Organisation der Monomerstruktur ist ähnlich zu jener einer linken Hand, wo die Knotenregion an der Position lokalisiert ist, die der Handfläche entspricht, die Finger-1-Region ist äquivalent zu dem Zeige- und Mittelfinger, die α-Helix oder Heelregion ist äquivalent zum Handballen, und die Finger-2-Region ist äquivalent zu den Ring- und kleinen Finger. Von der N-terminale Region, deren Sequenz nicht über die gesamte TGF-β-Superfamilie konserviert ist, wird vorhergesagt, dass sie an einer Position liegt, die grob äquivalent zum Daumen ist.
  • In einem konformationell aktiven TGF-β2-Dimerkomplex sind die zwei Monomer-Untereinheiten im Dimerkomplex mit einer zweifach Rotationssymmetrie orientiert, sodass die Heelregion der einen Untereinheit die Fingerregionen der anderen Untereinheit kontaktiert, wobei die Knotenregionen der verbundenen Untereinheiten den Kern des Moleküls bilden. Das 4. Cystein bildet eine Interketten-Disulfidbindung mit seinem Gegenstück auf der zweiten Kette, wodurch die Ketten im Zentrum der Handflächen äquivalent verbunden werden. Das so gebildete Dimer ist ein ellipsoides (zigarrenförmiges) Molekül, wenn es von oben mit Blickrichtung nach unten durch die zweifache Achse der Symmetrie zwischen den Untereinheiten betrachtet wird. Von der Seite betrachtet ähnelt das Molekül einer gebogenen „Zigarre", da die zwei Untereinheiten in einem leichten Winkel zueinander orientiert sind.
  • Die Heelregion der einen Untereinheit und die Finger-1- beziehungsweise Finger-2-Regionen der anderen Untereinheit interagieren miteinander. Diese drei Elemente arbeiten zusammen, um eine Struktur zu definieren, die mit der Ligandenbindungs-interaktiven Oberfläche des verwandten Rezeptors interaktiv und komplementär dazu ist.
  • Auswahl der Finger- und Heelregionen
  • Es wird in Betracht gezogen, dass die Aminosäuresequenzen, die die Finger- und Heelregionen definieren, mit den entsprechenden Finger- und Heelregionsequenzen von jedem bekannten Mitglied der TGF-β-Superfamilie korrespondieren können. Darüber hinaus wird auch in Betracht gezogen, dass die Größe der Konstrukte der Erfindung durch Verkürzen der natürlichen Finger- und Heelregionen des Matrizen-TGF-β-Superfamilie-Mitglieds signifikant reduziert werden kann.
  • Wie oben erwähnt, können die Aminosäuresequenzen, die die Finger- und Heelregionen definieren, von den entsprechenden Finger- und Heelregionsequenzen jedes bekannten TGF-β-Superfamilie-Mitglieds, das hierin identifiziert wird, oder von Aminosäuresequenzen eines neuen Superfamilie-Mitglieds, das hierin nachstehend entdeckt wird, stammen und werden hierin beschrieben.
  • 6 fasst die Aminosäuresequenzen der derzeit identifizierten TGF-β-Superfamilie-Mitglieder zusammen, die nach Finger-1- (6A), Heel- (6B) und Finger-2- (6C) Regionen ausgerichtet sind. Die Sequenzen wurden durch einen Computer-Algorithmus ausgerichtet, der, um die Sequenzen optimal auszurichten, Lücken in die Regionen der Aminosäuresequenz inserierte, von denen bekannt ist, dass sie eher Schleifenstrukturen als Regionen einer Aminosäuresequenz definieren, von denen bekannt ist, dass sie eine konservierte Aminosäuresequenz oder eine Sekundärstruktur haben. Zum Beispiel wurden, wenn möglich, keine Lücken in die Aminosäuresequenzen der Finger-1- und Finger-2-Regionen, die durch ein β-Faltblatt definiert sind, oder Heelregionen, die durch eine α-Helix definiert sind, eingebracht. Die Striche (–) zeigen eine Peptidbindung zwischen benachbarten Aminosäuren an. Ein Konsensussequenz-Muster für jede Subgruppe ist unter jeder Subgruppe gezeigt.
  • Nachdem die Aminosäuresequenzen von jedem der TGF-β-Superfamilie-Mitglieder ausgerichtet waren, wurden die ausgerichteten Sequenzen verwendet, um Aminosäuresequenz-Ausrichtungsmuster zu produzieren, die Aminosäurereste identifizieren, die durch eine andere Aminosäure oder eine Gruppe von Aminosäuren ausgetauscht werden kann, ohne dass die Gesamttertiärstruktur des resultierenden Konstrukts verändert wird. Die Aminosäuren oder Gruppen von Aminosäuren, die an einer bestimmten Position in den Finger- und Heel-Regionen nützlich sein können, wurden durch einen Computer-Algorithmus identifiziert, der die Aminosäure-Hierachiemuster-Struktur, die in 8 gezeigt ist, anwendet.
  • Kurz, der Algorithmus führt vier Ebenen der Analyse durch. Auf der Ebene I bestimmt der Algorithmus, ob ein bestimmter Aminosäurerest an einer spezifischen Position innerhalb der Aminosäuresequenz mit einer Häufigkeit auftritt, die größer als 75% ist. Zum Beispiel wird, wenn ein Glycinrest 8 von 10-mal an einer bestimmten Position in einer Aminosäuresequenz auftritt, dann an jener Position ein Glycin bestimmt. Wenn die zu testende Position aus allen Lücken besteht, dann wird der Position ein Lückencharakter (–) zugeschrieben, andernfalls, wenn mindestens eine Lücke besteht, dann wird der Position ein „z" (das für einen beliebigen Rest oder eine Lücke steht) zugeschrieben. Wenn in 75% der Kandidatensequenzen an einer bestimmten Position keine Aminosäure auftritt, führt der Algorithmus die Ebene II-Analyse durch.
  • Die Ebene II definiert die Mustersätze a, b, d, l, k, o, n, i und h, wobei l, k und o einen gemeinsamen Aminosäurerest teilen. Der Algorithmus bestimmt dann, ob 75% oder mehr der Aminosäurereste an einer bestimmten Position in der Aminosäuresequenz eines der vorher erwähnten Muster erfüllen. Wenn ja, dann wird das Muster jener Position zugeschrieben. Es ist jedoch möglich, dass beide Muster l und k gleichzeitig erfüllt werden können, weil sie dieselbe Aminosäure, insbesondere Asparginsäure, teilen. Wenn eine gleichzeitige Zuschreibung von l und k erfolgt, dann wird jener Position das Muster m (Ebene III) zugeschrieben. In ähnlicher Weise ist es möglich, dass die beiden Muster k und o gleichzeitig zugeschrieben werden können, weil sie dieselbe Aminosäure, genauer die Glutaminsäure, teilen. Wenn eine gleichzeitige Zuschreibung von k und o erfolgt, dann wird jener Position das Muster q (Ebene III) zugeschrieben. Wenn weder ein Ebene II-Muster noch die Ebene III-Muster m und q die bestimmte Position in der Aminosäuresequenz erfüllen, dann führt der Algorithmus eine Ebene III-Analyse durch.
  • Die Ebene III definiert die Mustersätze c, e, m, q, p und j, wobei m, q und p einen gemeinsamen Aminorest teilen. Das Muster q wird jedoch nicht in der Ebene III-Analyse getestet. Es ist möglich, dass die beiden Muster m und p gleichzeitig erfüllt werden können, weil sie dieselbe Aminosäure, genauer die Glutaminsäure teilen. Wenn eine gleichzeitige Zuschreibung von m und p erfolgt, dann wird jener Position das Muster r (Ebene IV) zugeschrieben. Wenn 75% der Aminosäuren an einer vorselektierten Position in den ausgerichteten Aminosäuresequenzen ein Ebene III-Muster erfüllen, dann wird jener Position das Ebene III-Muster zugeschrieben. Wenn jener Position kein Ebene III-Muster zugeschrieben werden kann, dann führt der Algorithmus eine Ebene IV-Analyse durch.
  • Die Ebene IV umfasst die zwei nicht überlappenden Muster f und r. Wenn 75% der Aminosäuren an einer bestimmten Aminosäuresequenz ein Ebene IV-Muster erfüllen, dann wird der Position das Muster zugeschrieben. Wenn kein Ebene IV-Muster zugeschrieben wird, schreibt der Algorithmus ein X zu, das jede Aminosäure (Ebene V) für jene Position repräsentiert.
  • In 8 listet Ebene in Großbuchstaben im Einzelaminosäure-Code der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren auf. Die Ebenen II-V definieren in Kleinbuchstaben Gruppen von Aminosäuren, basierend auf der Aminosäurehierachie, die in Smith et al., vorstehend, dargelegt ist. Die in 6 dargelegten Aminosäuresequenzen wurden unter Verwendung der vorher erwähnten Computer-Algorithmen ausgerichtet.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass, wenn der Fachmann ein Konstrukt basierend auf den derzeit identifizierten Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie zu produzieren wünscht, der Fachmann dann die Aminosäuresequenzen verwenden kann, die in 6 gezeigt sind, um die Finger-1-, Finger-2- und Heelregionen bereitzustellen, die in der Produktion der Mutanten, die hierin beschrieben sind, nützlich sind. Im Fall der Mitglieder der TGF-β-Superfamilie, die nachstehend entdeckt werden, kann die Aminosäuresequenz des neuen Mitglieds entweder manuell oder durch einen Computer-Algorithmus ausgerichtet werden, wobei die in 6 dargelegten Sequenzen die Heel- und Fingerregionen definieren, die in der hierin beschriebenen Anwendung nützlich sind.
  • Die nachstehende Tabelle 1 fasst Publikationen zusammen, die die Aminosäuresequenzen jedes TGF-β-Superfamilie-Mitglieds beschreiben, die verwendet wurden, um die Sequenzausrichtungsmuster, die in den 6-8 dargelegt sind, zu produzieren. Tabelle 1.
    TGF-β-Superfamilie-Mitglied SEQ ID NO: Veröffentlichung
    TGF-β1 40 Derynck et al. (1987) Nucl. Acids. Res. 15:3187
    TGF-β2 41 Burt et al. (1991) DNA Cell Biol. 10:723-734
    TGF-β3 42 Ten Dijke et al.(1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:4715-4791; Derynck et al. (1988) EMBO J. 7:3737-3743.
    TGF-β4 43 Burt et al. (1992) Mol. Endcrinol. 6:989-922.
    TGF-β5 44 Kondaiah et al. (1990) J. Biol. Chem 265:1089-1093
    dpp 45 Padgett et al. (1987) Nature 325:81-84; Paganiban et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10:2669-2677.
    vg-1 46 Weeks et al. (1987) Cell 51:861-867
    vgr-1 47 Lyons et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:4554-4558
    60A 48 Wharton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9214-9218; Doctor et al. (1992) Dev. Biol. 151:491-505
    BMP-2A 49 Wozney et al. (1988) Science 242: 1528-1534
    BMP-3 50 Wozney et al. (1988) Science 242: 1528-1534
    BMP-4 51 Wozney et al. (1988) Science 242: 1528-1534
    BMP-5 52 Celeste et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843-9847
    BMP-6 53 Celeste et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843-9847
    Dorsalin 54 Basler et al. (1993) Cell 73:687-702
    OP-1 55 Ozkaynak et al. (1990) Embo J. 9:2085-2093; Celeste et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843-9847
    OP-2 56 Ozkaynak et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220-25227
    OP-3 57 Ozkaynak et al. PCT/WO94/10203 SEQ ID NO: 1
    GDF-1 58 Lee (1990) Mol. Endocrinol. 4: 1034-1040
    GDF-3 59 McPherron et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3444-3449
    GDF-9 60 McPherron et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3444-3449
    Inhibin α 61 Mayo et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5849-5853; Stewart et al. (1986) FEBS Lett 206:329-334; Mason et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 135: 957-964
    Inhibin βA 62 Forage et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3091-3095; Chertov et al. (1990) Biomed. Sci. 1:499-506
    Inhibin βB 63 Mason et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 135:957-964
  • Insbesondere wird in Betracht gezogen, dass die Aminosäuresequenzen, die die Finger-1-Regionen definieren, mit der Aminosäuresequenz korrespondieren, die eine Finger-1-Region für jedes TGF-β-Superfamilie-Mitglied definiert, das hierin identifiziert wird. Die Finger-1-Subdomäne kann mindestens (eine) biologische und/oder funktionelle Eigenschaft(en) verleihen, die für das natürliche Protein charakteristisch sind. Nützliche intakte Finger-1-Regionen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf:
    TGF-β1 SEQ ID NO: 40, Reste 2 bis 29,
    TGF-β2 SEQ ID NO: 41, Reste 2 bis 29,
    TGF-β3 SEQ ID NO: 42, Reste 2 bis 29,
    TGF-β4 SEQ ID NO: 43, Reste 2 bis 29,
    TGF-β5 SEQ ID NO: 44, Reste 2 bis 29,
    dpp SEQ ID NO: 45, Reste 2 bis 29,
    Vg-1 SEQ ID NO: 46, Reste 2 bis 29,
    Vgr-1 SEQ ID NO: 47, Reste 2 bis 29,
    60A SEQ ID NO: 48, Reste 2 bis 29,
    BMP-2A SEQ ID NO: 49, Reste 2 bis 29,
    BMP-3 SEQ ID NO: 50, Reste 2 bis 29,
    BMP-4 SEQ ID NO: 51, Reste 2 bis 29,
    BMP-5 SEQ ID NO: 52, Reste 2 bis 29,
    BMP-6 SEQ ID NO: 53, Reste 2 bis 29,
    Dorsalin SEQ ID NO: 54, Reste 2 bis 29,
    OP-1 SEQ ID NO: 55, Reste 2 bis 29,
    OP-2 SEQ ID NO: 56, Reste 2 bis 29,
    OP-3 SEQ ID NO: 57, Reste 2 bis 29,
    GDF-1 SEQ ID NO: 58, Reste 2 bis 29,
    GDF-3 SEQ ID NO: 59, Reste 2 bis 29,
    GDF-9 SEQ ID NO: 60, Reste 2 bis 29,
    Inhibin α SEQ ID NO: 61, Reste 2 bis 29,
    Inhibin βA SEQ ID NO: 62, Reste 2 bis 29,
    Inhibin βB SEQ ID NO: 63, Reste 2 bis 29,
    CDMP-1/GDF-5 SEQ ID NO: 83, Reste 2 bis 29,
    CDMP-2/GDF-6 SEQ ID NO: 84, Reste 2 bis 29,
    GDF-6 (murin) SEQ ID NO: 85, Reste 2 bis 29,
    CDMP-2 (bovin) SEQ ID NO: 86, Reste 2 bis 29 und
    GDF-7 (murin) SEQ ID NO: 87, Reste 2 bis 29.
  • Die Beschreibung zieht weiterhin die Verwendung von korrespondierenden Finger-1-Subdomänesequenzen von den wohlbekannten Proteinen BMP-12 und BMP-13 in Betracht (wie im U.S. Patent-Nr. 5,658,882 offenbart) in Betracht.
  • Es wird auch in Betracht gezogen, dass die Aminosäuresequenzen, die die Heelregionen definieren, die in der Anwendung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, der Aminosäuresequenz entsprechen, die eine intakte Heelregion für jedes TGF-β-Superfamilie-Mitglied, das hierin identifiziert wird, definiert. Die Heelregion kann zu mindestens die Eigenschaften des natürlichen Proteins, einschließlich funktioneller und/oder Faltungseigenschaften, beeinflussen. Nützliche intakte Heelregionen können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf
    TGF-β1 SEQ ID NO: 40, Reste 35 bis 62,
    TGF-β2 SEQ ID NO: 41, Reste 35 bis 62,
    TGF-β3 SEQ ID NO: 42, Reste 35 bis 62,
    TGF-β4 SEQ ID NO: 43, Reste 35 bis 62,
    TGF-β5 SEQ ID NO: 44, Reste 35 bis 62,
    dpp SEQ ID NO: 45, Reste 35 bis 65,
    Vg-1 SEQ ID NO: 46, Reste 35 bis 65,
    Vgr-1 SEQ ID NO: 47, Reste 35 bis 65,
    60A SEQ ID NO: 48, Reste 35 bis 65,
    BMP-2A SEQ ID NO: 49, Reste 35 bis 64,
    BMP-3 SEQ ID NO: 50, Reste 35 bis 66,
    BMP-4 SEQ ID NO: 51, Reste 35 bis 64,
    BMP-5 SEQ ID NO: 52, Reste 35 bis 65,
    BMP-6 SEQ ID NO: 53, Reste 35 bis 65,
    Dorsalin SEQ ID NO: 54, Reste 35 bis 65,
    OP-1 SEQ ID NO: 55, Reste 35 bis 65,
    OP-2 SEQ ID NO: 56, Reste 35 bis 65,
    OP-3 SEQ ID NO: 57, Reste 35 bis 65,
    GDF-1 SEQ ID NO: 58, Reste 35 bis 70,
    GDF-3 SEQ ID NO: 59, Reste 35 bis 64,
    GDF-9 SEQ ID NO: 60, Reste 35 bis 65,
    Inhibin α SEQ ID NO: 61, Reste 35 bis 65,
    Inhibin βA SEQ ID NO: 62, Reste 35 bis 69,
    Inhibin βB SEQ ID NO: 63, Reste 35 bis 68,
    CDMP-1/GDF-5 SEQ ID NO: 83, Reste 35 bis 65,
    CDMP-2/GDF-6 SEQ ID NO: 84, Reste 35 bis 65,
    GDF-6 (murin) SEQ ID NO: 85, Reste 35 bis 65,
    CDMP-2 (bovin) SEQ ID NO: 86, Reste 35 bis 65 und
    GDF-7 (murin) SEQ ID NO: 87, Reste 35 bis 65.
  • Die Beschreibung zieht weiterhin die Verwendung von entsprechenden Heelregionsequenzen von den wohlbekannten Proteinen BMP-12 und BMP-13 in Betracht (wie im U.S. Patent Nr. 5,658,882 offenbart).
  • Es wird auch in Betracht gezogen, dass die Aminosäuresequenzen, die die Finger-2-Regionen definieren, der Aminosäuresequenz entsprechen, die eine intakte Finger-2-Region für jedes TGF-β-Superfamilie-Mitglied, das hierin identifiziert wird, definiert. Die Finger-2-Subdomäne kann mindestens (eine) Faltungseigenschaft(en) verleihen, die für das natürliche Protein charakteristisch ist(sind). Nützliche intakte Finger-2-Regionen können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf:
    TGF-β1 SEQ ID NO: 40, Reste 65 bis 94,
    TGF-β2 SEQ ID NO: 41, Reste 65 bis 94,
    TGF-β3 SEQ ID NO: 42, Reste 65 bis 94,
    TGF-β4 SEQ ID NO: 43, Reste 65 bis 94,
    TGF-β5 SEQ ID NO: 44, Reste 65 bis 94,
    dpp SEQ ID NO: 45, Reste 68 bis 98,
    Vg-1 SEQ ID NO: 46, Reste 68 bis 98,
    Vgr-1 SEQ ID NO: 47, Reste 68 bis 98,
    60A SEQ ID NO: 48, Reste 68 bis 98,
    BMP-2A SEQ ID NO: 49, Reste 67 bis 97,
    BMP-3 SEQ ID NO: 50, Reste 69 bis 99,
    BMP-4 SEQ ID NO: 51, Reste 67 bis 97,
    BMP-5 SEQ ID NO: 52, Reste 68 bis 98,
    BMP-6 SEQ ID NO: 53, Reste 68 bis 98,
    Dorsalin SEQ ID NO: 54, Reste 68 bis 99,
    OP-1 SEQ ID NO: 55, Reste 68 bis 98,
    OP-2 SEQ ID NO: 56, Reste 68 bis 98,
    OP-3 SEQ ID NO: 57, Reste 68 bis 98,
    GDF-1 SEQ ID NO: 58, Reste 73 bis 103,
    GDF-3 SEQ ID NO: 59, Reste 67 bis 97,
    GDF-9 SEQ ID NO: 60, Reste 68 bis 98,
    Inhibin α SEQ ID NO: 61, Reste 68 bis 101,
    Inhibin βA SEQ ID NO: 62, Reste 72 bis 102,
    Inhibin βB SEQ ID NO: 63, Reste 71 bis 101,
    CDMP-1/GDF-5 SEQ ID NO: 83, Reste 68 bis 98,
    CDMP-2/GDF-6 SEQ ID NO: 84, Reste 68 bis 98,
    GDF-6 (murin) SEQ ID NO: 85, Reste 68 bis 98,
    CDMP-2 (bovin) SEQ ID NO: 86, Reste 68 bis 98 und
    GDF-7 (murin) SEQ ID NO: 87, Reste 68 bis 98.
  • Die Beschreibung zieht weiterhin die Verwendung von entsprechenden Finger-2-Subdomäne-Sequenzen von den wohlbekannten Proteinen BMP-12 und BMP-13 in Betracht (wie im U.S. Patent Nr. 5,658,882 offenbart).
  • Zusätzlich wird in Betracht gezogen, dass die Aminosäuresequenzen der entsprechenden Finger- und Heelregionen durch Aminosäureaustausch verändert werden können, zum Beispiel durch Ausnutzen von Austauschresten, wie hierin offenbart, oder ausgewählt gemäß den Prinzipien, die in Smith et al. (1990), vorstehend, offenbart sind. Kurz, Smith et al. offenbaren eine Aminosäure-Klassenhierachie, die ähnlich zu der ist, die in 8 zusammengefasst ist, die verwendet werden kann, um eine Aminosäure vernünftig durch eine andere auszutauschen, während grobe konformative Verformungen des Typs, die die Proteinfunktion beeinträchtigen könnten, minimiert werden. In jedem Fall wird in Betracht gezogen, dass viele synthetische erster-Finger-, zweiter-Finger- und Heelregionsequenzen, die nur 70% Homologie mit den natürlichen Regionen, vorzugsweise 80% und am meisten bevorzugt mindestens 90% aufweisen, verwendet werden können, um die Konstrukte, wie beschrieben, zu produzieren.
  • Aminosäuresequenzmuster, die Aminosäuren bevorzugt an jeder Stelle in den Finger- und Heelregionen zeigen, die gemäß den Prinzipien, die in Smith et al. (1990) vorstehend, beschrieben werden, abgeleitet werden, sind auch in den 6-7 gezeigt und werden als die: TGF-β-, Vg/dpp-; GDF-; und Inhibin-Subgruppen-Muster bezeichnet. Die Aminosäuresequenzen, die die Finger-1-, Heel- und Finger-2-Sequenzmuster von jeder Subgruppe definieren, sind in den 6A, 6B beziehungsweise 6C dargelegt. Zusätzlich sind die Aminosäuresequenzen, die die gesamten TGF-β-, Vg/dpp-, GDF- und Inhibin-Subgruppen-Muster definieren, im Sequenzprotokoll als die SEQ ID NOs: 64, 65, 66 beziehungsweise 67 dargelegt.
  • Die bevorzugten Aminosäuresequenzmuster für jede Subgruppe, die in den 6A, 6B und 6C offenbart und in 7 zusammengefasst sind, ermöglichen es einem Fachmann, alternative Aminosäuren zu identifizieren, die an bestimmten Positionen in den Finger-1-, Heel- und Finger-2-Elementen inkorporiert werden können. Die Aminosäuren, die in Großbuchstaben in einem Einzelbuchstaben-Aminosäure-Code identifiziert werden, identifizieren konservierte Aminosäuren, von denen angenommen wird, dass sie zusammen strukturelle und funktionelle Elemente der Finger- und Heelregionen definieren. Der Großbuchstabe „X" in den 6 und 7 weist darauf hin, dass jede natürlich vorkommende Aminosäure an jener Position akzeptierbar ist. Der Kleinbuchstabe „z" in den 6 und 7 weist darauf hin, dass an jener Position entweder eine Lücke oder eine der natürlich vorkommenden Aminosäuren akzeptabel ist. Die Kleinbuchstaben stehen für die Aminosäuren, die gemäß der Muster-Definitionstabelle, die in 8 dargelegt ist, angezeigt sind, und identifizieren Gruppen von Aminosäuren, die an jener Stelle nützlich sind.
  • In Übereinstimmung mit den Aminosäuresequenz-Subgruppenmustern, die in den 6-7 dargelegt sind, wird zum Beispiel in Betracht gezogen, dass ein Fachmann vorhersagen kann, dass, wo es anwendbar ist, eine Aminosäure durch eine andere ausgetauscht werden kann, ohne zerstörende stereochemische Änderungen innerhalb des resultierenden Proteinkonstrukts zu induzieren. Zum Beispiel wird in 6A im Vg/dpp-Subgruppenmuster bei den Restnummern 2 und 3 in Betracht gezogen, dass entweder ein Lysinrest (K) oder eine Argininrest (R) an dieser Position vorhanden sein kann, ohne die Struktur des resultierenden Konstrukts zu beeinflussen. Dementsprechend enthält das Sequenzmuster an der Position 2 und 3 ein „n", das gemäß der 8 einen Aminosäurerest definiert, der aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus Lysin oder Arginin. Es wird daher in Betracht gezogen, dass viele synthetische Finger-1-, Finger-2- und Heelregion-Aminosäuresequenzen, die eine 70%ige Homologie, 80%ige oder mindestens 90%ige mit den natürlichen Regionen haben, verwendet werden können, um konformationell aktive Konstrukte, wie hierin beschrieben, zu produzieren.
  • Gemäß diesen Prinzipien wird in Betracht gezogen, dass man ein synthetisches Konstrukt durch Beginnen mit den Aminosäuresequenzmustern, die zu den TGF-β-, Vg/dpp-, GDF- oder Inhibin-Subgruppenmustern gehören, die in den 6 und 7 gezeigt sind, gestalten kann. Danach kann eine vorselektierte Aminosäure durch Verwenden von konventionellen rekombinanten oder synthetischen Methodiken durch eine andere ausgetauscht werden, wie durch die Prinzipien hierin gelenkt, und das resultierende Proteinkonstrukt getestet werden, wie nachstehend bereitgestellt.
  • Das TGF-β-Subgruppenmuster, SEQ ID NO: 64, beherbergt die Homologien, die unter den Mitgliedern der TGF-β-Subgruppe, die bis jetzt identifiziert wurden, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5, geteilt werden. Die generische Sequenz, die nachstehend gezeigt ist, schließt sowohl die konservierten Aminosäuren (Drei-Buchstaben-Standardcode) als auch alternative Aminosäuren (Xaa) ein, die an den variablen Positionen innerhalb der Sequenz vorhanden sind und durch die Regeln, die in 8 dargelegt sind, definiert sind. TGF-β-Subgruppenmuster
    Figure 00400001
  • Jedes Xaa kann unabhängig aus einer Gruppe von einer oder mehreren spezifizierten Aminosäuren ausgewählt werden, die wie folgt definiert werden:
    Figure 00400002
  • Das Vg/dpp-Subgruppenmuster, SEQ ID NO: 65, beherbergt die Homologien, die unter der Mitgliedern der Vg/dpp-Subgruppe, die bis jetzt identifiziert wurden, einschließlich dpp, vg-1, vgr-1, 60A, BMP-2A (BMP-2), Dorsalin, BMP-2B (BMP-4), BMP-3, BMP-5, BMP-6, OP-1 (BMP-7), OP-2 und OP-3, geteilt werden. Die generische Sequenz nachstehend schließt sowohl die konservierten Aminosäuren (Drei-Buchstaben-Standardcode) als auch alternative Aminosäuren (Xaa) ein, die an den variablen Positionen innerhalb der Sequenz vorhanden sind und durch die Regeln, die in 8 dargelegt sind, definiert sind. Vg/dpp-Subgruppenmuster
    Figure 00410001
  • Jedes Xaa kann unabhängig aus einer Gruppe von einer oder mehreren spezifizierten Aminosäure(n) ausgewählt werden, die wie folgt definiert werden:
    Figure 00420001
    Figure 00430001
  • Das GDF-Subgruppenmuster, SEQ ID NO: 66, beherbergt die Homologien, die unter der Mitgliedern der GDF-Subgruppe, die bis jetzt identifiziert wurden, einschließlich GDF-1, GDF-3 und GDF-9, geteilt werden. Die generische Sequenz, die nachstehend gezeigt ist, schließt sowohl die konservierten Aminosäuren (Drei-Buchstaben-Standardcode) als auch alternative Aminosäuren (Xaa) ein, die an den variablen Positionen innerhalb der Sequenz vorhanden sind und durch die Regeln, die in 8 dargelegt sind, definiert sind. GDF-Subgruppenmuster
    Figure 00440001
  • Jedes Xaa kann unabhängig aus einer Gruppe von einer oder mehreren spezifizierten Aminosäure(n) ausgewählt werden, die wie folgt definiert werden:
    Figure 00450001
    Figure 00460001
    Figure 00470001
  • Das Inhibin-Subgruppenmuster, SEQ ID NO: 67, beherbergt die Homologien, die unter den Mitgliedern der Inhibin-Subgruppe, die bis jetzt identifiziert wurden, einschließlich Inhibin α, Inhibin βA und Inhibin βB, geteilt werden. Die generische Sequenz, die nachstehend gezeigt ist, schließt sowohl die konservierten Aminosäuren (Drei-Buchstaben-Standardcode) als auch alternative Aminosäuren (Xaa) ein, die an den variablen Positionen innerhalb der Sequenz vorhanden sind und durch die Regeln, die in 8 dargelegt sind, definiert sind. Inhibin-Subgruppenmuster
    Figure 00480001
  • Jedes Xaa kann unabhängig aus einer Gruppe von einer oder mehreren spezifizierten Aminosäure(n) ausgewählt werden, die wie folgt definiert werden:
    Figure 00490001
    Figure 00500001
    Figure 00510001
  • B. Rekombinante Produktions-Erwägungen
  • 1. Gestaltung und Produktion der Protein- und DNA-Konstrukte
  • Wie vorstehend erwähnt, können die hierin beschriebenen Konstrukte durch Verwenden von konventionellen rekombinanten DNA-Methodiken, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt und genau dokumentiert sind, sowie durch Verwenden von wohlbekannten biosynthetischen und chemosynthetischen Methodiken unter Verwendung von Routine-Peptid- oder Nucleotidchemien und automatisierten Peptid- oder Nucleotid-Synthesegeräten hergestellt werden. Solche Routinemethodiken sind zum Beispiel in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben, deren Lehren hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind: Hilvert, 1 Chem. Biol. 201-3 (1994); Muir et al., 95 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6705-10 (1998); Wallace, 6 Curr. Opin. Biotechnol. 403-10 (1995); Miranda et al., 96 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1181-86 (1999); Liu et al., 91 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6584-88 (1994). Geeignet für die Verwendung sind natürlich vorkommende Aminosäuren und Nucleotide; nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren und Nucleotide; modifizierte oder ungewöhnliche Aminosäuren; modifizierte Basen; Aminosäuresequenzen, die post-translational modifizierte Aminosäuren und/oder modifizierte Bindungen, Vernetzungen und End-Kappen, Nicht-Peptidyl-Bindungen usw. enthalten; und weiterhin einschließend ohne Einschränkung jene Einheiten, die im Word Intellectual Property Organization (WIPO) Handbook an Industrial Property Information and Documentation, Standard St. 25 (1998), einschließlich Tabellen 1 bis 6 im Anhang 2 offenbart sind. Äquivalente des Vorhergehenden werden durch Fachleute anerkannt werden, die sich nur auf Routineexperimente zusammen mit dem Fachwissen stützen.
  • Zum Beispiel können die in Betracht gezogenen DNA-Konstrukte durch die Anordnung von synthetischen Nucleotidsequenzen und/oder Verbinden von DNA-Restriktionsfragmenten hergestellt werden, um ein synthetisches DNA-Molekül zu produzieren. Die DNA-Moleküle werden dann in ein Expressionsvehikel, zum Beispiel ein Expressionsplasmid, ligiert und in eine geeignete Wirtszelle, zum Beispiel E. coli, transfiziert. Das in Betracht gezogene Proteinkonstrukt, das durch das DNA-Molekül codiert wird, wird dann exprimiert, gereinigt, rückgefaltet, in vitro auf bestimmte Eigenschaften, z.B. die Bindungsaktivität mit einem Rezeptor, der eine Bindungsaffinität für das Matrizen-TGF-β-Superfamilie-Mitglied hat, getestet und danach getestet, um zu bewerten, ob das biosynthetische Konstrukt andere bevorzugte Eigenschaften des Matrizen-Superfamilie-Mitglieds nachahmt.
  • Alternativ kann eine Genbank von synthetischen DNA-Konstrukten gleichzeitig zum Beispiel durch die Anordnung von synthetischen Nucleotidsequenzen hergestellt werden, die sich in der Nucleotidzusammensetzung in einer vorher ausgewählten Region unterscheiden. Zum Beispiel wird in Betracht gezogen, dass während der Produktion eines Konstrukts der Fachmann basierend auf einem spezifischen TGF- β-Superfamilie-Mitglied geeignete Finger- und Heelregionen für solch ein Superfamilie-Mitglied auswählen kann (zum Beispiel von den 6-7). Sobald die geeigneten Finger- und Heelregionen ausgewählt worden sind, kann der Fachmann dann eine synthetische DNA produzieren, die diese Regionen codiert. Zum Beispiel, wenn eine Vielzahl von DNA-Molekülen, die verschiedene Linkersequenzen codieren, in eine Ligierungsreaktion eingeschlossen sind, die DNA-Moleküle enthält, die Finger- und Heelsequenzen codieren, kann der Fachmann durch verständige Auswahl von geeigneten Restriktionsstellen und Reaktionsbedingungen eine Genbank von DNA-Konstrukten produzieren, in der jedes der DNA-Konstrukte Finger- und Heelregionen codiert, aber durch verschiedene Linkersequenzen verbunden sind. Die resultierenden DNAs werden dann in ein passendes Expressionsvehikel ligiert, d.h. ein Plasmid, das in der Herstellung einer Phagendisplay-Genbank nützlich ist, in eine Wirtszelle transfiziert und die Polypeptide, die durch die synthetischen DNAs codiert werden, exprimiert, um einen Pool von Kandidatenproteinen herzustellen. Der Pool von Kandidatenproteinen kann danach durchmustert werden, um spezifische Proteine zu identifizieren, die die erwünschte Bindungsaffinität und/oder Selektivität für einen vorselektierten Rezeptor haben.
  • Das Screenen kann durch Passieren einer Lösung, die die Kandidatenproteine umfasst, durch eine chromatographische Säule, die einen Oberflächen-immobilisierten Rezeptor enthält, durchgeführt werden. Dann werden Proteine mit der erwünschten Bindungsspezifität zum Beispiel durch einen Salzgradienten und/oder einen Konzentrationsgradienten des Matrizen-TGF-β-Superfamilie-Mitglieds eluiert. Nucleotidsequenzen, die solche Proteine codieren, können danach isoliert und charakterisiert werden. Sobald die geeigneten Nucleotidsequenzen identifiziert worden sind, können die führenden Proteine danach entweder durch konventionelle rekombinante DNA- oder Peptidsynthese-Methodiken in Mengen produziert werden, die ausreichen, um zu testen, ob das bestimmte Konstrukt die Aktivität des Matrizen-TGF-β-Superfamilie-Mitglieds nachahmt.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass, welcher Ansatz auch immer genommen wird, um die DNA-Moleküle, die die Konstrukte der Erfindung codieren, zu produzieren, die Tertiärstruktur der bevorzugten Proteine danach moduliert werden kann, um die Bindung und/oder biologische Aktivität zum Beispiel durch eine Kombination von Nucleotid-Mutagenese-Methodiken, die durch die hierin beschriebenen Prinzipien unterstützt werden, und Phagendisplay-Methodiken zu optimieren. Dementsprechend kann ein Fachmann große Zahlen von solchen Proteinen produzieren und gleichzeitig testen.
  • (a) Gen- und Proteinsynthese
  • Die Vorgänge zum Manipulieren, Amplifizieren und Rekombinieren von DNA, die Aminosäuresequenzen von Interesse codiert, sind im Allgemeinen auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden daher hierin nicht im Detail beschrieben. Verfahren zum Identifizieren und Isolieren von Genen, die Mitglieder der TGF-β-Superfamilie codieren, sind auch gut verstanden und sind im Patent und anderer Literatur beschrieben.
  • Kurz, die Konstruktion von DNAs, die die hierin offenbarten biosynthetischen Konstrukte codieren, wird unter Verwendung von bekannten Techniken durchgeführt, die die Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen, die sequenzspezifische Schnitte in der DNA machen, um stumpfe Enden oder kohäsive Enden zu produzieren, DNA-Ligasen, Techniken, die eine enzymatische Zugabe von klebrigen Enden zu der stumpf-endenden DNA ermöglichen, Konstruktion von synthetischen DNAs durch die Anordnung von Oligonucleotiden von kurzer oder mittlerer Länge, cDNA-Synthesetechniken, Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Techniken für die Amplifizierung von geeigneten Nucleinsäuresequenzen aus Genbanken und synthetische Sonden für das Isolieren von Genen von Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie und ihrer verwandten Rezeptoren involvieren. Verschiedene Promotorsequenzen von Bakterien, Säugern oder Insekten, um ein paar zu nennen, und andere regulatorische DNA-Sequenzen, die zum Erzielen der Expression verwendet werden, und verschiedene Typen von Wirtszellen sind auch bekannt und verfügbar. Konventionelle Transfektionstechniken und ebenso konventionelle Techniken für das Clonieren und Subclonieren von DNA sind Fachleuten bekannt. Verschiedene Typen von Vektoren wie Plasmide und Viren, einschließlich tierischen Viren und Bakteriophagen, können verwendet werden. Die Vektoren können verschiedene Markergene ausnutzen, die einer erfolgreich transfizierten Zelle eine nachweisbare phänotypische Eigenschaft verleihen, die verwendet werden kann, um zu identifizieren, welcher einer Familie von Clonen die rekombinante DNA des Vektors erfolgreich inkorporiert hat.
  • Ein Verfahren zum Erhalten der DNA, die die hierin beschriebenen biosynthetischen Konstrukte codiert, ist durch das Anordnen von synthetischen Oligonucleotiden, die in einem konventionellen, automatisierten Oligonucleotid-Synthesegerät produziert wurden, gefolgt von einer Ligierung mit geeigneten Ligasen. Zum Beispiel können überlappende komplementäre DNA-Fragmente unter Verwendung der Phosphoramiditchemie synthetisiert werden, wobei die Endsegmente unphosphoryliert gelassen werden, um eine Polymerisation während der Ligierung zu verhindern. Ein Ende der synthetischen DNA wird mit einem „klebrigen Ende", das mit der Stelle der Wirkung einer bestimmten Restriktionsendonuclease korrespondiert, belassen, und das andere Ende wird mit einem Ende belassen, das der Stelle der Wirkung einer anderen Restriktionsendonuclease entspricht. Die komplementären DNA-Fragmente werden zusammen ligiert, um ein synthetisches DNA-Konstrukt zu produzieren.
  • Alternativ können Nucleinsäurestränge, die die Finger-1-, Finger-2- und Heelregionen codieren, aus Genbanken von Nucleinsäuren isoliert werden, zum Beispiel durch Kolonie-Hybridisierungsverfahren wie jene, die in Sambrook et al. Hrsg. (1989) "Molecular Cloning", Coldspring Harbor Laborstories Press, NY, beschrieben sind, und/oder durch PCR-Amplifikations-Methodiken wie jene, die in Innis et al. (1990) "PCR Protocols, A guide to methods and applications", Academic Press, offenbart sind. Die Nucleinsäuren, die die Finger- und Heelregionen codieren, werden dann verbunden, um eine synthetische DNA zu produzieren, die das biosynthetische Einzelketten-Morphon-Konstrukt von Interesse codiert.
  • Es wird dennoch anerkannt, dass eine Genbank von DNA-Konstrukten, die eine Vielzahl davon codieren, gleichzeitig durch rekombinante Standard-DNA-Methodiken wie die eine, die oben beschrieben ist, produziert werden können. Zum Beispiel kann der Fachmann durch die Verwendung von Kassettenmutagenese oder Oligonucleotid-gelenkter Mutagenese zum Beispiel eine Reihe von DNA-Konstrukten produzieren, wobei jedes derselben verschiedene DNA-Sequenzen innerhalb einer vordefinierten Lokalisation, z.B. innerhalb einer DNA-Kassette, die eine Linkersequenz codiert, enthält. Die resultierende Genbank von DNA-Konstrukten kann danach zum Beispiel in einem Phagen oder einer Virusdisplay-Genbank oder einer eukaryontischen Zelllinie (z.B. CHO-Zelllinie) exprimiert werden; und alle Proteinkonstrukte, die an einen spezifischen Rezeptor binden, können durch Affinitätsreinigung z.B. unter Verwendung einer chromatographischen Säule, umfassend einen Oberflächen-immobilisierten Rezeptor, isoliert werden. Sobald Moleküle, die den vorselektierten Rezeptor binden, isoliert worden sind, können ihre Bindungs- und agonistischen Eigenschaften unter Verwendung von empirischen Verfeinerungstechniken moduliert werden.
  • Verfahren für die Mutagenese von Proteinen und Nucleinsäuren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und gut beschrieben. Siehe z.B. Sambrook et al., (1990) Molecular Cloning: A Laborstory Manual., 2. Aufl. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laborstory Press). Nützliche Verfahren schließen die PCR (Überlappungsextension, siehe z.B. PCR Primer (Dieffenbach und Dveksler, Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1995, S. 603-611)); die Kassettenmutagenese und einzelsträngige Mutagenese nach dem Verfahren von Kunkel ein. Es wird von einem Fachmann anerkannt werden, dass jedes geeignete Verfahren der Mutagenese angewendet werden kann, und das Mutagenese-Verfahren nicht als ein Material-Aspekt der Erfindung angesehen wird. Die Nucleotid-Codons, die in der Lage sind, Aminosäuren, einschließlich Arginin (Arg), Glutaminsäure (Glu) und Asparginsäure (Asp) zu codieren, sind auch auf dem Fachgebiet wohlbekannt und beschrieben. Siehe zum Beispiel Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, N.Y., N.Y.). Standardcodons, die Arginin, Glutaminsäure und Asparginsäure codieren, sind: Arg: CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG; Glu: GAA, GAG; und Asp: GAU, GAC. Mutante Konstrukte der Erfindung können leicht durch Ausrichten der Nucleinsäuresequenzen oder Domänen, die ausgetauscht werden sollen, und Identifizieren von kompatiblen Spleißstellen und/oder Konstruieren von geeigneten Kreuzungssequenzen unter Verwendung einer PCR-Überlappungsverlängerung konstruiert werden.
  • (b) Proteinexpression
  • Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung betrifft die Proteinexpression und -produktion, besonders von kommerziell signifikanten Mengen an Protein. Wie hierin offenbart, können mutante Proteine mit bestimmten bevorzugten Eigenschaften wie verstärkten/verbesserten Rückfaltungseigenschaften ausgestattet werden. Darüber hinaus können chimere Proteine mit verstärkten Proteinen mit einer verstärkten/verbesserten Rückfaltungseigenschaft gestaltet werden, um in bakteriellen Zellen exprimiert zu werden, die in Säugerzellen nicht korrekt exprimiert werden könnten. Es wird in Betracht gezogen, dass solch eine verstärkte Rückfaltung die Gewinnung und kommerzielle Produktion von TGF-β-Superfamilie-Proteinen verbessern wird. Es wird jetzt auch anerkannt, dass Säugerzellen fehlgefaltete Proteine identifizieren können und zelluläre Vorgänge haben, die es solchen Proteinen erlauben, wiederverwertet und dann korrekt rückgefaltet zu werden. Solche Proteine werden jedoch verworfen, wenn sie schlussendlich nicht, korrekt rückzufalten können. Je weniger Zeit eine Zelle damit verbringt, schwache Rückfalter-Proteine wiederzuverwerten, desto mehr Zeit ist daher verfügbar, um verwendbare rückgefaltete Proteine zu produzieren. Siehe zum Beispiel Trombetta et al., 8 Curr. Opin. Struct. Biol. 587-92 (1998).
  • Wenn ein einzelnes DNA-Konstrukt von Interesse synthetisiert worden ist, kann es in einen Expressionsvektor integriert und für die Proteinexpression in eine geeignete Wirtszelle transfiziert werden. Nützliche prokaryontische Wirtszellen schließen E. coli und B. Subtilis ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Nützliche eukaryontische Wirtszellen schließen Hefezellen, Insektenzellen, Myelomzellen, 3T3-Fibroblastenzellen, Affennieren- oder COS-Zellen, chinesische Hamsterovar-(CHO)-Zellen, Nerz-Lungenepithelzellen, menschliche Vorhaut-Fibroblastenzellen, menschliche Glioblastomzellen und Teratokarzinomzellen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Alternativ können synthetische Gene in einem zellfreien System wie dem Kaninchen-Reticulocytenlysat-System exprimiert werden.
  • Der Vektor kann zusätzlich verschiedene Sequenzen einschließen, um eine korrekte Expression des rekombinanten Proteins zu fördern, einschließlich transkriptionelle Promotor- und Terminierungssequenzen, Enhancersequenzen, bevorzugte Ribosomenbindungsstellen-Sequenzen, bevorzugte mRNA-Leadersequenzen, bevorzugte Proteinprozessierungssequenzen, bevorzugte Signalsequenzen für die Proteinsekretion und dergleichen. Die DNA-Sequenz, die das Gen von Interesse codiert, kann auch manipuliert werden, um potenziell inhibierende Sequenzen zu entfernen oder um eine unerwünschte Sekundärstruktur-Bildung zu minimieren. Die modifizierten Proteine der vorliegenden Erfindung können auch als Fusionsproteine exprimiert werden. Nachdem es translatiert wurde, kann das Protein aus den Zellen selbst oder aus dem Kulturmedium gereinigt und dann an einer spezifischen Protease-Stelle gespalten werden, wenn es erwünscht wird.
  • Zum Beispiel, wenn das Gen in E. coli exprimiert werden soll, wird es in einen geeigneten Expressionsvektor cloniert. Dies kann durch Positionieren des manipulierten Gens stromabwärts einer Promotorsequenz wie Trp oder Tac und/oder eines Gens, das ein Führungspeptid wie das Fragment B von Protein A (FB) codiert, erreicht werden. Während der Expression akkumulieren die resultierenden Fusionsproteine in refraktilen Körpern im Cytoplasma der Zellen und können nach dem Aufbrechen der Zellen durch French Press oder Ultraschall geerntet werden. Die isolierten refraktilen Körper werden dann solubilisiert und die exprimierten Proteine rückgefaltet, wie hierin gelehrt.
  • Wenn erwünscht, kann die Expression der manipulierten Gene in eukaryontischen Zellen erreicht werden. Dies erfordert Zellen und Zelllinien, die leicht zu transfizieren sind und zum stabilen Bewahren der fremden DNA mit einer nicht umgebauten Sequenz in der Lage sind, und die die nötigen zellulären Komponenten für eine wirksame Transkription, Translation, post-translationale Modifikation und Sekretion des Proteins haben. Zusätzlich ist auch ein passender Vektor nötig, der das Gen von Interesse trägt. Die DNA-Vektorgestaltung für die Transfektion in Säugerzellen sollte geeignete Sequenzen einschließen, um die Expression des Gens von Interesse, wie hierin beschrieben, zu fördern, einschließlich eines geeigneten Transkriptionsstarts, -Endes und von Enhancersequenzen sowie Sequenzen, die die Translationswirksamkeit verstärken, wie die Kozak-Konsensussequenz. Bevorzugte DNA-Vektoren schließen auch ein Markergen und Mittel zum Amplifizieren der Kopienzahl des Gens von Interesse ein. Ein detaillierter Überblick über den Stand der Technik der Produktion von fremden Proteinen in Säugerzellen, einschließlich nützlicher Zellen, Proteinexpressions-fördernder Sequenzen, Markergenen und Gen-Amplifizierungsverfahren wird in Bendig (1988) Genetic Engineering 7: 91-127, offenbart.
  • Die am besten charakterisierten Transkriptionspromotoren, die für das Exprimieren eines fremden Gens in einer bestimmten Säugerzelle nützlich sind, sind der frühe SV40-Promotor, der Adenovirus-Promotor (AdMLP), der Maus-Metallothionein-I-Promotor (mMT-I), die lange terminale Wiederholung vom Rous Sarkoma-Virus (RSV) (LTR), die lange terminale Wiederholung vom Maus-Brusttumorvirus (MMTV-LTR) und der menschliche intermedäre-frühe Cytomegalievirus-Hauptpromotor (hCMV). Die DNA-Sequenzen für alle diese Promotoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind kommerziell erhältlich.
  • Die Verwendung eines selektierbaren DHFR-Gens in einer dhfr–-Zelllinie ist ein gut charakterisiertes Verfahren, das in der Amplifizierung von Genen in Säuger-Zellsystemen nützlich ist. Kurz, das DHFR-Gen wird auf dem Vektor, der das Gen von Interesse trägt, bereitgestellt, und die Zugabe von steigenden Konzentrationen des cytotoxischen Arzneistoffs Methotrexat, der durch DHFR metabolisiert wird, führt zur Amplifizierung der DHFR-Gen-Kopienzahl sowie jener des assoziierten Gens von Interesse. DHFR ist auf dem Fachgebiet als ein selektierbares, amplifizierbares Markergen in transfizierten chinesischen Hamsterovar-Zelllinien (CHO-Zellen) besonders gut charakterisiert. Andere nützliche amplifizierbare Markergene schließen die Adenosin-Deaminase (ADA)- und Glutamin-Synthetase (GS)-Gene ein.
  • Die Wahl der Zellen/Zelllinien ist auch wichtig und hängt vom Bedarf des Untersuchers ab. COS-Zellen liefern hohe Spiegel einer transienten Genexpression, was ein nützliches Mittel für ein schnelles Screenen der biosynthetischen Konstrukte der Erfindung bereitstellt. COS-Zellen werden typischerweise mit einem Affenvirus 40 (SV40)-Vektor, der das Gen von Interesse trägt, transfiziert. Die transfizierten COS-Zellen sterben schlussendlich, wodurch sie die Langzeitproduktion des erwünschten Proteinprodukts verhindern. Die transiente Expression erfordert jedoch nicht den zeitaufwändigen Vorgang, der für die Entwicklung einer stabilen Zelllinie erfordert wird, und liefert daher eine nützliche Technik für das Testen von vorläufigen Konstrukten auf eine Bindungsaktivität.
  • Ein besonderer Vorteil der Verfahren und der biosynthetischen, rekombinanten oder chemosynthetischen Proteine der vorliegenden Erfindung ist, dass sie für die Verwendung in Hefe- und bakteriellen Zellsystemen wie E. coli und anderen Systemen gut passend sind, wo eine Überexpression in der Bildung von Einschlusskörpern resultiert, aus denen die Proteine re-solubilisiert und in vitro rückgefaltet werden müssen. Obwohl TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteinmutanten in Säugerzellen gemacht werden können, scheinen manche gestalteten Proteinkonstrukte und Mutanten in Säugerzellen instabil zu sein und können zum derzeitigen Stand der Technik nur durch Verwenden von bakteriellen Zellen und Rückfalten der Mutanten in vitro gemacht werden. Detaillierte Beschreibungen der Proteine, die in der Anwendung dieser Erfindung nützlich sind, einschließlich wie sie gemacht, verwendet und auf eine osteogene Aktivität getestet werden, sind in zahlreichen Veröffentlichungen offenbart, einschließlich US-Patente Nr. 5,266,683 und 5,011,691 , sowie in jeder der Veröffentlichungen, die hierin zitiert sind.
  • Kurz, die mutanten Formen der vorliegenden Erfindung können in Bakterien und Hefe unter Verwendung von wohlbekannten Standardverfahren exprimiert und produziert werden. Reife Volllängen-Formen oder kürzere Sequenzen, die nur die C-terminale sieben-Cysteine-Domäne definieren, können für die Wirtszelle bereitgestellt werden. Es kann bevorzugt werden, die N-terminalen Sequenzen zu modifizieren, um die bakterielle Expression zu optimieren. Zum Beispiel ist die bevorzugte Form des natürlichen OP-1 für die bakterielle Expression die Sequenz, die die reife, aktive Sequenz (Reste 293-431 der SEQ ID NO: 39) oder ein Fragment davon codiert, das die C-terminale sieben-Cysteine-Domäne (z.B. Reste 330-431 der SEQ ID NO: 39) codiert. Ein Methionin kann an Position 293 eingebracht werden, das den natürlichen Serinrest ersetzt, oder es kann diesem Serinrest vorangehen. Alternativ kann ein Methionin irgendwo innerhalb der ersten 36 Reste der natürlichen Sequenz (Reste 293-329) eingebracht werden. Die DNA-Sequenz kann weiterhin an ihrem N-Terminus modifiziert werden, um die Reinigung zu verbessern, zum Beispiel durch Zugeben eines „Hexa-His"-Schwanzes, um die Reinigung auf einer IMAC-Säule zu unterstützen; oder durch Verwenden einer FB-Leadersequenz, die die Reinigung auf einer IgG/Säule ermöglicht. Diese und andere Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut beschrieben und wohlbekannt. Andere bakterielle Spezies und/oder Proteine können analoge Modifikationen erfordern oder von ihnen profitieren, um den Ertrag des davon erhaltenen mutanten BMPs zu optimieren. Solche Modifikationen liegen klar innerhalb des Fachwissens und werden nicht als materielle Aspekte der Erfindung angesehen.
  • Die synthetischen Nucleinsäuren werden vorzugsweise in einen Vektor inseriert, der für die Überexpression in der Wirtszelle der Wahl geeignet ist. Jeder Expressionsvektor kann verwendet werden, so lange er zum Leiten der Expression eines heterologen Proteins wie eines BMP in der Wirtszelle der Wahl in der Lage ist. Nützliche Vektoren schließen Plasmide, Phagemide, Minichromosomen und YACs ein, um ein paar zu nennen. Andere Vektorsysteme sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und charakterisiert. Der Vektor schließt typischerweise ein Replikon, eine oder mehrere selektierbare Markergensequenz(en) und Mittel für das Bewahren einer hohen Kopienzahl des Vektors in der Wirtszelle ein. Wohlbekannte selektierbare Markergene schließen Antibiotika wie Ampicillin, Tetracyclin und dergleichen sowie eine Resistenz gegen Schwermetalle ein. Nützliche selektierbare Markergene für die Verwendung in Hefezellen schließen das URA3-, LEU2-, HIS3- oder TRP1-Gen für die Verwendung mit einem auxotrophen mutanten Hefewirt ein. Zusätzlich schließt der Vektor auch eine geeignete Promotorsequenz für das Exprimieren des Gens von Interesse ein, und das, wie erwünscht, induzierbar sein kann oder nicht, sowie nützliche Transkriptions- und Translations-Startstellen, Terminatoren und andere Sequenzen, die die Transkription und Translation des Gens von Interesse maximieren können. Gut charakterisierte Promotoren, die in bakteriellen Zellen besonders nützlich sind, schließen die lac-, tac-, trp- und tpp-Promotoren ein, um ein paar zu nennen. Promotoren, die in Hefe nützlich sind, schließen zum Beispiel den ADHI-, ADHII- oder PHO5-Promotor ein.
  • (c) Rückfaltungs-Erwägungen
  • Proteine, die zum Beispiel durch E. coli produziert werden, werden zuerst aus Einschlusskörpern isoliert und dann unter Verwendung eines Denaturierungsmittels oder eines chaotropen Mittels wie Guanidin-HCl oder Harnstoff vorzugsweise im Bereich von etwa 4-9 M und bei einer erhöhten Temperatur (z.B 25-37° C) und/oder einem basischen pH-Wert (8-10) solubilisiert. Alternativ können die Proteine durch Ansäuern z.B. mit Essigsäure oder Trifluoressigsäure im Allgemeinen bei einem pH-Wert im Bereich von 1-4 solubilisiert werden. Vorzugsweise wird ein Reduktionsmittel wie β-Mercaptoethanol oder Dithiothreit (DTT) zusammen mit dem Solubilisierungsmittel verwendet. Das solubilisierte heterologe Protein kann weiter von solubilisierenden Chaotropen durch Dialyse und/oder durch bekannte chromatographische Verfahren wie zum Beispiel Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC) gereinigt werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine solubilisierte Mutante wie folgt rückgefaltet werden. Das gelöste Protein wird in einem Rückfaltungsmedium, typischerweise einem Tris-gepufferten Medium, das einen pH-Wert im Bereich von etwa pH 5,0-10,0, vorzugsweise im Bereich von etwa pH 6-9 hat, und einem, das ein Detergens und/oder ein chaotropes Mittel einschließt, verdünnt. Nützliche kommerziell erhältliche Detergenzien können ionisch, nicht-ionisch oder zwitterionisch sein, wie NP40 (Nonidet 40), CHAPS (wie 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansufat, Digitonin, Desoxycholat oder N-Octylglucosid. Nützliche chaotrope Mittel schließen Guanidin, Harnstoff oder Arginin ein. Vorzugsweise ist das chaotrope Mittel in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,1-10M, vorzugsweise im Bereich von etwa 0,5-4M vorhanden. Wenn das Detergens CHAPS ist, umfasst es vorzugsweise etwa 0,5-5% der Lösung, mehr bevorzugt etwa 1-3% der Lösung. Vorzugsweise schließt die Lösung auch ein geeignetes Redox-System wie die oxidierten und reduzierten Formen von Glutathion, DTT, β-Mercaptoethanol, β-Mercaptomethanol, Cystein oder Cystamin ein, um ein paar zu nennen. Vorzugsweise sind die Redoxsysteme in Verhältnissen von Reduktionsmittel zu Oxidationsmittel im Bereich von etwa 1:1 bis etwa 5:1 vorhanden. Wenn das Glutathion-Redoxsystem verwendet wird, ist das Verhältnis von reduziertem Glutathion zu oxidiertem Glutathion vorzugsweise im Bereich von etwa 0,5 bis 5; bevorzugter 1 zu 1; und am bevorzugtesten 2 zu 1 der reduzierten Form zu der oxidierten Form. Vorzugsweise enthält der Puffer auch ein Salz, typischerweise NaCl, das im Bereich von etwa 0,25M-2,5M, vorzugsweise im Bereich von etwa 0,5-1,5M, am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 1M vorhanden ist. Ein Fachmann wird erkennen, dass die obigen Bedingungen und Medien unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimentieren optimiert werden können.
  • Vorzugsweise liegt die Proteinkonzentration für eine Rückfaltungsreaktion im Bereich von etwa 0,001-1,0 mg/ml, bevorzugter liegt sie im Bereich von etwa 0,05-0,25 mg/ml, am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 0,075-0,125 mg/ml. Wie durch den Fachmann anerkannt werden wird, tendieren höhere Konzentrationen dazu, mehr Aggregate zu produzieren. Wo Heterodimere produziert werden sollen (zum Beispiel ein OP-1/BMP-2- oder BMP-2/BMP-6-Heterodimer), werden die individuellen Proteine dem Rückfaltungspuffer in gleichen Mengen bereitgestellt.
  • Typischerweise findet die Rückfaltungsreaktion bei einem Temperaturbereich von etwa 4°C bis etwa 25°C statt. Mehr bevorzugt wird die Rückfaltungsreaktion bei 4°C durchgeführt und bis zum Abschluss laufen gelassen. Die Rückfaltung ist typischerweise abhängig vom Protein in etwa ein bis sieben Tagen, im Allgemeinen innerhalb von 16-72 Stunden oder 24-48 Stunden, abgeschlossen. Wie von dem Fachmann anerkannt werden wird, können die Raten der Rückfaltung von Protein zu Protein variieren, und längere oder kürzere Rückfaltungszeiten werden in Betracht gezogen und liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Wie hierin verwendet, ist ein „gutes Rückfalter"-Protein eines, wo nach einer Faltungsreaktion im Vergleich zum Gesamtprotein in der Rückfaltungsreaktion mindestens ungefähr 10% des Proteins, bevorzugter mindestens ungefähr 20% und noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 25% und am meisten bevorzugt mehr als 25% rückgefaltet ist, gemessen durch einen beliebigen der Rückfaltungstests, die hierin beschrieben sind, und ohne eine weitere Reinigung zu benötigen. Zum Beispiel schließen natürliche BMPs, die auf dem Fachgebiet als „gute Rückfalter"-Proteine angesehen werden, BMP-2, CDMP-1, CDMP-2 und CDMP-3 ein. BMP-3 faltet auch ziemlich gut rück. Im Gegensatz dazu ergibt ein „schwaches Rückfalter"-Protein weniger als 1% eines optimal gefalteten Proteins. Wenn die Eigenschaften optimal kombiniert werden, wie hierin offenbart, können bestimmte Ausführungsformen mehr als ungefähr 25% Protein in einem optimal rückgefalteten Zustand ergeben,
  • 2. Zusammenfassung der Tests zum Screenen, Binden und Testen der biologischen Aktivität
  • Unabhängig davon, welche Proteinexpressions-, Ernte- und Faltungs-Methodiken verwendet werden, können bestimmte mutante Proteine vorzugsweise an einen vorselektierten Rezeptor binden und können jetzt unter Verwendung von Standard-Methodiken identifiziert werden, d.h. Liganden/Rezeptor-Bindungstests, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt und gründlich dokumentiert sind. Siehe zum Beispiel: Legerski et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 183: 672-679; Frakar et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm 80: 849-857; Chio et al. (1990) Nature 343: 266-269; Dahlman et al. (1988) Biochem 27: 1813-1817; Strader et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13572-13578; und D'Dowd et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992.
  • Typischerweise wird in einem Liganden/Rezeptor-Bindungstest das natürliche oder Eltern-TGF-β-Superfamilie-Mitglied von Interesse, das eine bekannte, quantifizierbare Affinität für einen vorselektierten Rezeptor hat, mit einer nachweisbaren Einheit, zum Beispiel einer radioaktiven Markierung, einer chromogenen Markierung oder einer fluorogenen Markierung markiert. Aliquots des gereinigten Rezeptors, der Rezeptorbindungsdomäne-Fragmente oder Zellen, die den Rezeptor von Interesse auf ihrer Oberfläche exprimieren, werden mit dem markierten TGF-β-Superfamilie-Mitglied in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen des nicht-markierten mutanten Proteins inkubiert. Die relative Bindungsaffinität einer Kandidatenmutante kann durch Quantifizieren der Fähigkeit der Mutante, die Bindung des markierten TGF-β-Superfamilie-Mitglieds mit dem Rezeptor zu hemmen, gemessen werden. Beim Durchführen des Tests werden fixierte Konzentrationen des Rezeptors und des TGF-β-Superfamilie-Mitglieds in der Anwesenheit und Abwesenheit einer unmarkierten Chimere inkubiert. Die Empfindlichkeit kann durch Vorinkubieren des Rezeptors mit der Mutante vor dem Zufügen des markierten Matrizen-TGF-β-Superfamilie-Mitglieds erhöht werden. Nachdem der markierte Konkurrent zugefügt worden ist, wird eine ausreichende Zeit für eine adäquate Konkurrentenbindung erlaubt, und dann werden die freien und gebundenen markierten Superfamilie-Mitglieder von einander getrennt und das eine oder das andere gemessen.
  • Markierungen, die in der Anwendung der Screening-Vorgehensweisen nützlich sind, schließen radioaktive Markierungen ein, d.h. 125I, 131I, 111In oder 77Br, chromogene Markierungen, spektroskopische Markierungen wie jene, die in Haughland (1994) "Handbook of Fluorescent and Research Chemicals 5. Aufl." durch Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, offenbart sind, oder konjugierte Enzyme, die hohe Umsatzraten haben, d.h. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase, die in Kombination mit chemiluminiszenten oder fluorogenen Substraten verwendet werden.
  • Die biologische Aktivität, nämlich die agonistischen oder antagonistischen Eigenschaften der resultierenden mutanten Konstrukte können in der Folge unter Verwendung von konventionellen in vivo- und in vitro-Tests charakterisiert werden, die entwickelt worden sind, um die biologische Aktivität jedes TGF-β-Superfamilie-Mitglieds zu messen. Es wird jedoch anerkannt, dass der Typ des verwendeten Tests vom TGF-β-Superfamilie-Mitglied abhängen wird, auf dem die Mutante basiert. Zum Beispiel können mutante Konstrukte, die auf dem natürlichen OP-1-Protein basieren, unter Verwendung von einem beliebigen der biologischen Tests getestet werden, die bis jetzt für das Messen der OP-1-Aktivität entwickelt worden sind, siehe zum Beispiel die Erläuterungen, die nachstehend dargelegt sind.
  • Optimal rückgefaltete dimere Proteine können leicht unter Verwendung einer Reihe von wohlbekannten und gut charakterisierten Tests getestet werden. Insbesondere können einer oder mehrere von drei Tests, die alle auf dem Fachgebiet wohlbekannt und gut beschrieben und nachstehend weiter beschrieben sind, zum Nutzen verwendet werden.
  • Nützliche Rückfaltungstests schließen eines oder mehrere der Folgenden ein. Zuerst kann das Vorliegen von Dimeren visuell entweder durch Standard-SDS-PAGE in der Abwesenheit eines reduzierenden Mittels wie DTT oder durch HPLC (z.B. C18-Umkehrphasen-HPLC) nachgewiesen werden. Dimere Proteine, die hierin beschrieben werden, haben ein offensichtliches Molekulargewicht im Bereich von etwa 28-36 kDa im Vergleich zu monomeren Untereinheiten, die ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 14-18 kDa haben. Das dimere Protein kann auf einem Elektrophoresegel leicht durch Vergleich mit kommerziell erhältlichen Molekulargewichts-Standards visualisiert werden. Das dimere Protein eluiert auch von einer C18-RP-HPLC (45-50% Acetonitril: 0,1%TFA) nach etwa 19 Minuten (das von Säugern produzierte hOP-1 eluiert nach 18,95 Minuten). Ein zweiter Test bewertet das Vorliegen eines Dimers durch seine Fähigkeit, an Hydroxyapatit zu binden. Ein optimal gefaltetes Dimer bindet an eine Hydroxyapatit-Säule gut in pH 7, 10 mM Phosphat, 6M Harnstoff und 0,1-0,2M NaCl (das Dimer eluiert bei 0,25 M NaCl) im Vergleich zum Monomer, das bei jenen Konzentrationen nicht wesentlich bindet (das Monomer eluiert bei 0,1M NaCl). Ein dritter Test bewertet das Vorliegen eines Dimers durch die Resistenz des Proteins gegen einen Trypsin- oder Pepsinverdau. Die gefaltete dimere Spezies ist im Wesentlichen resistent gegen beide Enzyme, insbesondere Trypsin, das nur einen kleinen Teil des N-Terminus des reifen Proteins abspaltet, was eine biologisch aktive dimere Spezies, die nur geringfügig kleiner als das unbehandelte Dimer ist (jedes Monomer ist nach der Trypsin-Spaltung 22 Aminosäuren kleiner), belässt. Im Gegensatz dazu werden die Monomere und fehlgefalteten Dimere im Wesentlichen abgebaut. Im Test wird das Protein einem Enzymverdau unter Verwendung von Standardbedingungen, z.B. Verdau in einem Standardpuffer wie 50 mM Tris-Puffer, pH 8, enthaltend 4 M Harnstoff, 100 mM NaCl, 0,3% Tween-80 und 20 mM Methylamin, ausgesetzt. Der Verdau wird bei 37°C für eine Größenordnung von 16 Stunden erfolgen gelassen und das Produkt durch irgendwelche geeigneten Mittel, vorzugsweise SDS-PAGE, visualisiert.
  • Die biologische Aktivität der rückgefalteten mutanten Proteine, zum Beispiel der BMPs, kann leicht durch irgendeines einer Reihe von Mitteln bewertet werden, wie nachstehend beschrieben. Zum Beispiel kann die Fähigkeit des Proteins, eine endochondrale Knochenbildung zu induzieren, unter Verwendung des gut charakterisierten subcutanen Ratten-Knochentests, der nachstehend im Detail beschrieben ist, bewertet werden. In dem Test wird die Knochenbildung durch Histologie sowie durch alkalische Phosphatase und/oder Osteocalcin-Produktion gemessen. Zusätzlich induzieren osteogene Proteine, die eine hohe spezifische Knochenbildungsaktivität haben, wie OP-1, BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-6 auch eine alkalische Phosphatase-Aktivität in einem auf Ratten-Osteoblasten oder Osteosarkomzellen basierenden in vitro-Test. Solche Tests sind auf dem Fachgebiet gut beschrieben und sind hierin nachstehend detailliert beschrieben. Siehe zum Beispiel Sabokdar et al. (1994) Bone and Mineral 27:57-67; Knutsen et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 194:1352-1358; und Maliakal et al. (1994) Growth Factors 1:227-234). Im Gegensatz dazu induzieren osteogene Proteine, die eine niedrige spezifische Knochenbildungsaktivität haben, wie zum Beispiel CDMP-1 und CDMP-2, keine alkalische Phosphatase-Aktivität in dem Zell-basierenden Osteoblasten-Test. Der Test liefert so ein einfaches Verfahren zum Bewerten der biologischen Aktivität von BMP-Mutanten. Zum Beispiel sind CDMP-1, CDMP-2 und CDMP-3 alle kompetent, eine Knochenbildung zu induzieren, allerdings mit einer niedrigeren spezifischen Aktivität als BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 oder OP-1. Im Gegensatz dazu können BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und OP-1 alle eine Gelenksknorpel-Bildung induzieren, allerdings mit einer niedrigeren spezifischen Aktivität als CDMP-1, CDMP-2 oder CDMP-3. Dementsprechend wird erwartet, dass eine CDMP-Mutante, die hierin gestaltet und beschrieben wird als eine Mutante, die kompetent ist, in dem Zell-basierenden Test eine alkalische Phosphatase-Aktivität zu induzieren, im Ratten-Tierbiotest eine höhere spezifische Knochenbildungsaktivität zeigt. In ähnlicher Weise ist eine OP-1-Mutante, die hierin gestaltet und beschrieben wird, dass sie einen Austausch enthält der in einer korrespondierenden Position eines CDMP-1-, CDMP-2- oder CDMP-3-Proteins vorhanden ist, kompetent, im Ratten-Test Knochen zu induzieren, aber nicht im Zell-basierenden Test eine alkalische Phosphatase-Aktivität zu induzieren, und daher wird erwartet, dass sie eine höhere spezifische Gelenksknorpel-induzierende Aktivität in einem in vivo-Gelenksknorpel-Test hat. Wie hierin nachstehend beschrieben, verwendet ein geeigneter in vitro-Test für die CDMP-Aktivität embryonale Maus-Knochenvorläufer- oder Karzinomzellen wie ATDC5-Zellen. Siehe Beispiel 6, nachstehend.
  • Die TGFβ-Aktivität kann leicht durch die Fähigkeit des Proteins, das epitheliale Zellwachstum zu hemmen, bewertet werden. Ein nützlicher, gut charakterisierter in vitro-Test wendet Nerz-Lungenzellen oder Melanomzellen an. Siehe Beispiel 7. Andere Tests für andere Mitglieder der TGF-β-Superfamilie sind in der Literatur gut beschrieben und können ohne unzumutbares Experimentieren durchgeführt werden.
  • 3. Formulierung und Bioaktivität
  • Die resultierenden mutanten Proteine können an ein Individuum als Teil einer Therapie geliefert werden, um in vivo-Ereignisse wie die Bindungsinteraktion zwischen einem TGF-β-Superfamilie-Mitglied und einem oder mehreren seiner verwandten Rezeptoren, aber nicht darauf beschränkt, zu verstärken, zu hemmen oder anderweitig zu modulieren. Die Konstrukte können in ein Arzneimittel, wie nachstehend beschrieben, formuliert werden und können in morphogen wirksamen Mengen durch jedes geeignete Mittel, vorzugsweise direkt oder systemisch, z.B. parenteral oder oral verabreicht werden. Die resultierenden DNA-Konstrukte, die bevorzugte mutante Proteine codieren, können zu gentherapeutischen Zwecken auch direkt an einen Empfänger verabreicht werden; solche DNAs können mit oder ohne Träger-Komponenten oder mit oder ohne Matrix-Komponenten verabreicht werden. Alternativ können Zellen, die mit solchen DNA-Konstrukten transferiert wurden, in einen Empfänger implantiert werden. Solche Materialien und Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
  • Wo irgendeines der hier offenbarten Konstrukte direkt (z.B. lokal wie durch Injektion an eine erwünschte Gewebestelle) oder parenteral wie durch intravenöse, subcutane, intramuskuläre, intraorbitale, ophtalmische, intraventrikuläre, intracraniale, intracapsuläre, intraspinale, intracisternale, intraperitoneale, buccale, rektale, vaginale, intranasale oder durch Aerosol-Verabreichung geliefert werden soll, umfasst die therapeutische Zusammensetzung vorzugsweise einen Teil einer wässrigen Lösung. Die Lösung ist vorzugsweise physiologisch verträglich, sodass zusätzlich zu der Abgabe des erwünschten Konstrukts an den Patienten die Lösung den Elektrolyt- und Volumen-Haushalt des Patienten nicht anderweitig negativ beeinflusst. Das wässrige Medium für das therapeutische Molekül kann daher zum Beispiel normale physiologische Kochsalzlösung (0,9% NaCl, 0,15M), pH 7-7,4 oder andere pharmazeutisch verträgliche Salze davon umfassen.
  • Nützliche Lösungen für eine orale oder parenterale Verabreichung können durch jedes der Verfahren, die auf dem pharmazeutischen Fachgebiet wohlbekannt sind, beschrieben zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A., Hrsg.), Mack Pub., 1990, hergestellt werden. Präparate können zum Beispiel Polyalkylenglycole wie Polyethylenglycol, Öle von pflanzlichen Ursprung, hydrierte Naphthalene und dergleichen einschließen. Präparate für die direkte Verabreichung können insbesondere Glycerin und andere Zusammensetzungen von hoher Viskosität einschließen. Biologisch verträgliche, vorzugsweise bioresorbierbare Polymere, einschließlich zum Beispiel Hyaluronsäure, Kollagen, Tricalciumphosphat, Polybutyrat, Polylactid, Polyglycolid und Lactid/Glycolid-Copolymere, können nützliche Arzneiträger sein, um die Freisetzung des Morphogens in vivo zu kontrollieren.
  • Andere potenziell nützliche parenterale Abgabesysteme für diese therapeutischen Moleküle schließen Ethylenvinylacetat-Copolymerpartikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen ein. Präparate für die Inhalationsverabreichung können als Arzneiträger zum Beispiel Lactose enthalten oder können wässrige Lösungen, enthaltend zum Beispiel Polyoxyethylen-9-Laurylether, Glycocholat und Desoxycholat, oder ölige Lösungen für die Verabreichung in der Form von Nasentropfen oder als ein Gel, um intranasal angewendet zu werden, sein.
  • Schließlich können die therapeutischen Moleküle alleine oder in Kombination mit anderen Molekülen, von denen bekannt ist, dass sie die Gewebemorphogenese beeinflussen, d.h. Molekülen, die zur Gewebereparatur und Regenerierung und/oder zum Hemmen einer Entzündung in der Lage sind, verabreicht werden. Beispiele von nützlichen Cofaktoren für das Stimulieren des Knochengewebewachstums in Osteoporose-Individuen schließen zum Beispiel Vitamin D3, Calcitonin, Prostaglandine, Nebenschilddrüsenhormon, Dexamethason, Östrogen und IGF-I oder IGF-II ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Nützliche Cofaktoren für die Nervengewebereparatur und -regeneration können Nerven-Wachstumsfaktoren einschließen. Andere nützliche Cofaktoren schließen Symptom-lindernde Cofaktoren, einschließlich Antiseptika, Antibiotika, antivirale und antifungale Mittel und Analgetika und Anästhetika, ein.
  • Die therapeutischen Moleküle können weiter durch Zusammenmischen mit pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen Arzneiträgern und Trägerstoffen in Arzneimittel formuliert werden. Wie vorstehend bemerkt, können solche Zusammensetzungen für eine parenterale Verabreichung insbesondere in der Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen; für eine orale Verabreichung insbesondere in der Form von Tabletten oder Kapseln; oder intranasal insbesondere in der Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen hergestellt werden. Wo eine Adhäsion an eine Gewebeoberfläche erwünscht ist, kann die Zusammensetzung das biosynthetische Konstrukt dispergiert in einer Fibrinogen-Thrombin-Zusammensetzung oder einem anderen biologischen Adhäsionsmittel einschließen, wie es zum Beispiel in PCT US91/09275 offenbar ist. Die Zusammensetzung kann dann aufgepinselt, gesprüht oder anderweitig auf die erwünschte Gewebeoberfläche aufgetragen werden.
  • Die Zusammensetzungen können für die parenterale oder orale Verabreichung an Menschen oder andere Säuger in therapeutisch wirksamen Mengen formuliert werden, z.B. Mengen, die geeignete Konzentrationen des Morphons an ein Zielgewebe für eine ausreichende Zeit liefern, um die erwünschte Wirkung zu induzieren.
  • Wo das therapeutische Molekül einen Teil einer Gewebe- oder Organ-Konservierungslösung umfasst, kann jede kommerziell erhältliche Konservierungslösung zum Nutzen verwendet werden. Zum Beispiel schließen nützliche Lösungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, die Collins-Lösung, Wisconsin-Lösung, Belzer-Lösung, Eurocollins-Lösung und Ringer-Lactatlösung ein. Eine detaillierte Beschreibung der Konservierungslösungen und von nützlichen Komponenten kann zum Beispiel im U.S.-Patent Nr. 5,002,965 gefunden werden.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass manche der Proteinkonstrukte, zum Beispiel jene, die auf Mitgliedern der Vg/dpp-Subgruppe basieren, auch hohe Spiegel der Aktivität in vivo zeigen werden, wenn sie mit einer Matrix kombiniert werden. Siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 5,266,683 . Die derzeit bevorzugten Matrices sind von xenogener, allogener oder autogener Natur. Es wird jedoch in Betracht gezogen, dass synthetische Materialien, umfassend Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polybuttersäure, Derivate und Copolymere davon, auch verwendet werden können, um geeignete Matrices herzustellen. Bevorzugte synthetische und natürlich-abgeleitete Matrixmaterialien, ihre Herstellung, Verfahren zum Formulieren derselben mit den morphogenen Proteinen der Erfindung und Verfahren der Verabreichung sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden daher hierin nicht im Detail diskutiert. Siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5,266,683 . Es wird weiterhin in Betracht gezogen, dass die Bindung an, Adhärenz an oder Assoziation mit eine(r) Matrix oder die (der) Metalloberfläche eines prothetischen Instruments eine Eigenschaft ist, die unter Verwendung der Materialien und Verfahren, die hierin offenbart sind, verändert werden kann. Zum Beispiel können Instrumente, umfassend eine Matrix und ein osteoaktives Konstrukt der vorliegenden Erfindung, die verstärkte Matrixadhärierende Eigenschaften haben, als ein Langsamfreisetzungs-Instrument verwendet werden. Der Fachmann wird die Variation und Manipulationen erkennen, die jetzt im Licht der Lehren hierin möglich sind.
  • Wie durch einen Fachmann anerkannt werden wird, wird die Konzentration der Verbindungen, die in einer therapeutischen Zusammensetzung beschrieben sind, abhängig von einer Reihe von Faktoren, einschließlich der morphogen wirksamen Menge, die verabreicht werden soll, der chemischen Charakteristika (z.B. der Hydrophobizität) der angewendeten Verbindungen und des Verabreichungswegs, variieren. Die bevorzugte Dosierung des zu verabreichenden Arzneistoffs ist wahrscheinlich auch von solchen Variablen wie dem Typ und Ausmaß einer Krankheit, dem Gewebeverlust oder -defekt, dem allgemeinen Gesundheitsstatus des bestimmten Patienten, der relativen biologischen Wirksamkeit der ausgewählten Verbindung, der Formulierung der Verbindung, dem Vorliegen und den Typen von Arzneiträgern in dem Präparat und dem Weg der Verabreichung abhängig. In allgemeinen Worten können die therapeutischen Moleküle dieser Erfindung an ein Individuum bereitgestellt werden, wo die typischen Dosen von etwa 10 ng/kg bis etwa 1 g/kg Körpergewicht pro Tag reichen; mit einem bevorzugten Dosisbereich, der von etwa 0,1 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht ist.
  • II. SPEZIFISCHE, MODIFIZIERTE PROTEINMUTANTEN
  • Einige allgemeine Typen von Konstrukten wurden hergestellt und bewertet, um die TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteinfaltung mit Manipulationen der f2-Subdomäne zu verbessern. Wie hierin bezeichnet, beginnt die f2-Subdomänenregion nach dem doppelten Cys (siehe Tabelle 2, Reste 1-31). Die Basis/Ansatzregion der f2-Subdomäne besteht aus den Resten 1-10 und 22-31.
  • Im Allgemeinen schließen die Typen von Konstrukten, die durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden, Mutanten ein, in denen: (1) der C-terminale Rest (im Allgemeinen Rest Nummer 35) mit Arg, Ser, Leu, Ala oder Ile ersetzt ist; (2) die Zahl der hydrophilen Reste in der f2-Region erhöht ist; (3) die Zahl der sauren Reste in der Basisregion der f2-Subdomäne erhöht ist, typischerweise durch Verwenden von Glu oder Asp als einen Austausch für einen basischen oder Amidrest an mindestens einer der Positionen 4, 6, 9, 25, 26 und 30; (4) die Zahl der eine Hydroxylgruppe tragenden polaren Reste erhöht ist, typischerweise durch Ersetzen von mindestens einem basischen Rest oder einem eine Amidgruppe tragenden hydrophilen Rest in der Basisregion (Positionen 4, 6, 9, 25, 26 und 30) mit Ser oder Thr; (5) die gesamte oder ein Teil der f2-Region auf einen guten Rückfalter wie BMP-2 oder CDMP-2 gebracht wird; oder (6) Teil(e) der f2-Domäne mit einem Teil (Teilen) einer f2-Subdomäne eines guten Falters ausgetauscht werden. Der Fachmann wird anerkennen, dass diese spezifischen Reste nicht limitierend sind und als beispielhafte Reste bereitgestellt werden.
  • Die Lehren der vorliegenden Erfindung können auch mit den Modifikationen kombiniert werden, die in zusammen anhängigen Anmeldungen beschrieben sind [Anw. Registrierungsnr. STD-075 und Registrierungsnr. STK-077, hiermit am gleichen Datum angemeldet].
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Eigenschaften von natürlichen BMPs oder von anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie von Proteinen, einschließlich der Heterodimere und Homodimere davon, durch Modifizieren der f2-Subdomäne eines natürlichen Proteins verändert, um eine oder mehrere biologische Eigenschaft(en) eines BMP- oder TGF-β-Superfamilie-Mitglieds zu ändern. Als ein Ergebnis dieser Entdeckung ist es möglich, TGF-β-Superfamilie-Proteine zu gestalten, die (1) rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, die unter Verwendung von Polypeptid- oder Nucleotid-Synthesegeräten synthetisiert werden, exprimiert werden; (2) veränderte Faltungseigenschaften haben; (3) unter neutralen pH-Werten, einschließlich aber nicht beschränkt auf physiologisch verträgliche Bedingungen, eine veränderte Solubilität haben; (4) veränderte isoelektrische Punkte haben; (5) eine veränderte Stabilität haben; (6) eine veränderte Gewebe- oder Rezeptorspezifität haben; (7) eine umgestaltete, veränderte biologische Aktivität haben; und/oder (8) veränderte Bindungs- oder Adhärenzeigenschaften gegenüber festen Oberflächen wie biologisch verträglichen Matrices oder Metallen, aber nicht darauf beschränkt, haben. Daher kann die vorliegende Erfindung Mechanismen zum Gestalten von Schnellfreisetzungs-, Langsamfreisetzungs- und/oder zeitlich festgelegte Freisetzungs-Präparaten, die ein bevorzugtes Proteinkonstrukt enthalten, bereitstellen. Andere Vorteile und Eigenschaften werden aus den nachstehenden Lehren ersichtlicht werden. Darüber hinaus können unter Ausnutzen der hierin offenbarten Entdeckungen modifizierte Proteine, die veränderte Oberflächenbindungs/Oberflächen-Adhärenz-Eigenschaften haben, gestaltet und ausgewählt werden. Die Oberflächen von bestimmter Signifikanz schließen feste Oberflächen, die natürlich vorkommend sein können, wie Knochen; oder poröse partikuläre Materialien wie Kollagen oder andere biologisch verträgliche Matrices; oder die gefertigten Oberflächen von prothetischen Implantaten, einschließlich Metalle, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Wie hierin in Betracht gezogen, kann nahezu jede Oberfläche auf eine unterschiedliche Bindung von Konstrukten getestet werden. Daher umspannt die vorliegende Erfindung eine Vielfalt von funktionellen Molekülen, die Änderungen in ihren Oberflächenbindungs/Oberflächen-Adhärenz-Eigenschaften haben, wodurch sie solche Konstrukte nützlich für veränderte in vivo-Anwendungen, einschließlich, Langsamfreisetzungs-, Schnellfreisetzungs- und/oder festesetzte Zeit-Freisetzungs-Präparate, machen.
  • Der Fachmann wird anerkennen, dass das Kombinieren von irgendeiner oder mehreren der oben rezitierten Eigenschaften spezifische Möglichkeiten bereitstellt, um die Verwendungen von maßgeschneiderten Proteinen (und der DNAs, die dieselben codieren) zu manipulieren. Zum Beispiel kann die Eigenschaft einer veränderten Stabilität ausgenutzt werden, um den Durchsatz eines Proteins in vivo zu manipulieren. Darüber hinaus gibt es im Fall von Proteinen, die auch Eigenschaften wie eine veränderte Rückfaltung und/oder Funktion haben, wahrscheinlich eine Querverbindung zwischen Faltung, Funktion und Stabilität. Siehe zum Beispiel Lipscomb et al., 7 Protein Sci. 765-73 (1998); und Nikolova et al., 95 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14675-80 (1998). Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung können Stabilitäts-Änderungen routinemäßig unter Verwendung von wohlbekannten Techniken des Circulardichroismus, von anderen Anzeichen der Stabilität als eine Funktion der Denaturierungsmittel-Konzentration oder Temperatur überwacht werden. Man kann auch eine Routine-Scanningkalorimetrie verwenden. In ähnlicher Weise gibt es wahrscheinlich eine Querverbindung zwischen jeder der vorhergehenden Eigenschaften und der Eigenschaft der Solubilität. Im Fall der Solubilität ist es möglich, diese Eigenschaft zu manipulieren, sodass ein Proteinkonstrukt unter physiologisch vertraglichen Bedingungen entweder mehr oder weniger löslich ist und es folglich leicht diffundiert beziehungsweise lokalisiert bleibt, wenn es in vivo verabreicht wird.
  • Zusätzlich zu den vorher erwähnten Verwendungen der Proteinkonstrukte mit veränderten Eigenschaften können jene mit einer veränderten Stabilität auch zum praktischen Nutzen für Haltbarkeit-, Lagerungs- und/oder Lieferungserwägungen verwendet werden. Darüber hinaus kann auf einem verwandten Gebiet eine veränderte Stabilität die Dosierungserwägungen auch direkt beeinflussen, wodurch zum Beispiel die Kosten einer Behandlung reduziert werden.
  • Eine besonders signifikante Klasse von Konstrukten sind jene, die eine veränderte Bindung an solubilisierte Trägerstoffe oder Arzneiträger aufweisen. Als ein nicht-limitierendes Beispiel erlaubt ein verändertes BMP, das eine verstärkte Bindung an einen solubilisierten Trägerstoff wie Hyaluronsäure aufweist, dem Fachmann, ein injizierbares Präparat ohne Verlust oder Verdünnung des BMP durch entweder Diffusion oder Körperflüssigkeiten an eine defekte Stelle zu verabreichen. Daher wird die Lokalisierung maximiert. Der Fachmann wird die Variationen anerkennen, die durch die vorliegenden Lehren ermöglicht wurden. In ähnlicher Weise kann eine andere Klasse von Konstrukten ausgenutzt werden, die eine veränderte Bindung an Körper/Gewebekomponenten haben. Als ein nicht-limitierendes Beispiel kann ein verändertes BMP, das eine verminderte Bindung an einen in-situ-Inhibitor hat, verwendet werden, um die Reparatur von bestimmten Geweben in vivo zu verstärken. Es ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt, dass zum Beispiel ein Knorpelgewebe mit bestimmten Proteinen assoziiert ist, die in Körperflüssigkeiten und/oder im Knorpel per se gefunden werden, die die Aktivität der nativen BMPs hemmen können. Chimere Konstrukte mit veränderten Bindungseigenschaften können jedoch die Wirkungen dieser in-situ-Inhibitoren überwinden, wodurch die Reparatur verstärkt wird usw. Der Fachmann wird die Variationen anerkennen, die durch die vorliegenden Lehren ermöglicht wurden.
  • Mutanten von OP-1, einem TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Protein, können jede der folgenden sein, einschließlich konservative Varianten davon, wobei die Zahl auf die Restposition der Mutation hinweist, gefolgt vom ersetzten Aminosäurerest (Einzelbuchstaben-Code), gefolgt von einem Pfeil und dem Einzelbuchstaben-Code des austauschenden Rests.
  • Figure 00740001
  • In der Nomenklatur, die die SEQ ID NO: 39 umschließt, ist die OP-1-Mutante eine der folgenden:
    Figure 00740002
  • Mutanten von anderen TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteinen können auch Austausche enthalten, die mindestens an einer der Positionen 4, 6, 9, 25, 26, 30 in einem schwachen Rückfalter-Protein auftreten, einschließlich Varianten und Chimeren davon, darunter jedes von: BMP-5
    Figure 00750001
  • Zusätzlich kann jede dieser Mutanten auch einen Austausch des C-terminalen Rests gegen einen von: Arginin, Serin, Leucin, Isoleucin oder Alanin einschließen.
  • Austausche können auch an mindestens einer der folgenden Positionen 4, 6, 9, 24, 25, 29 in jedem der anderen TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine (SEQ ID NOs: 29-33) oder NODAL (SEQ ID NO: 25); an mindestens einer der folgenden Positionen 4, 6, 9, 25, 26, 30 in UNIVIN (SEQ ID NO: 34); und an mindestens einer der folgenden Positionen 4, 6, 9, 26, 27 und 31 in BMP-9 (SEQ ID NO: 7) und Dorsalin (SEQ ID NO: 11) erfolgen.
  • Die TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Mutanten werden durch rekombinante, chemosynthetische oder biosynthetische Mittel kreiert, die das Verwenden von Nucleinsäuremolekülen einschließen, einschließlich DNA-, RNA- und PNA (Peptid-Nucleinsäure)-Moleküle, die eines der ausgetauschten TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine der Erfindung sowie natürliche oder modifizierte Aminosäuren codieren. Der Austausch kann in Form des Ersetzens eines nicht-sauren Rests mit einem sauren Rest wie Glutaminsäure oder Asparginsäure an einer oder mehreren dieser Positionen erfolgen. Alternativ kann der Austausch auch das Ersetzen einer Aminosäure mit Serin oder Threonin an einer oder mehreren dieser Positionen in der Peptidsequenz einschließen. Austausche können auch das Ersetzen des C-terminalen Rests mit Arginin umfassen. Dies kann durch Austauschen des Nucleotids im Triplett gemacht werden, um eines der folgenden zu kreieren: AGA, AGG, CGG, CGC, CGA oder CGU. Eine TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Mutante kann irgendeine oder jede Kombination der obigen Austausche enthalten.
  • Die 4A und 4B sind schematische Zeichnungen von verschiedenen Mutanten und ihrer Rückfaltungs- und biologischen Aktivitätseigenschaften. In der Figur repräsentiert die dicke durchgehende Linie OP-1 (Reste 330-431 der SEQ ID NO: 39), die dünne durchgehende Linie repräsentiert CDMP-2/GDF-6 (SEQ ID NO: 84) oder GDF-5 (SEQ ID NO: 83) und die unterbrochene Linie repräsentiert BMP-2 (SEQ ID NO: 49). Mutante Konstrukte sind in der 4A dargestellt, und individuelle Sequenz-Mutanten sind in 4B dargestellt. In der Figur werden die individuellen Rest-Änderungen durch den austauschenden Rest in der Figur angezeigt. Die Rest-Nummerierung ist, wie oben beschrieben, zählend vom ersten Rest nach dem Cystein-Doppel in Finger-2. Zum Beispiel ist die Mutante H2233 OP-1(25R>E 26N>D 30R>E 35H>R). In ähnlicher Weise hat die Mutante H2447 alle Änderungen in H2233 und hat zusätzlich 1A>V 4Q>E 6N>S. Die Mutante H2433 ist OP-1(4Q>K 35H>R), und die Mutante H2456 ist OP-1(4Q>E 6N>S 25R>E 26N>D 30R>E 35H>R).
  • Tabelle 2 liefert die Finger-2-Subdomäne-Sequenzen von verschiedenen osteogenen Proteinen und mutanten Varianten-Konstrukten davon, beginnend mit dem ersten Rest nach dem Cystein-Doppel, und die den natürlichen Sequenzen, wie nachstehend beschrieben, entsprechen. In der Tabelle sind die Reste, die sich von OP-1 unterscheiden, unterstrichen. Ein chimeres Konstrukt ist H2421: Reste 1-20 von GDF-5 (SEQ ID NO: 15) und Reste 21-34 von OP-1 (SEQ ID NO: 39). Ein anderes Konstrukt ist H2406: Res. 1-10 von CDMP, (CMP-2) (SEQ ID NO: 10) und Res. 11-34 von OP-1 (SEQ ID NO: 39). Ein anderes Konstrukt ist H2410: Res. 1-35 von BMP-2 (SEQ ID NO: 2). Ein anderes Konstrukt ist H2418: Res. 1-7 sowie Res. 25-35 von GDF-6 (SEQ ID NO: 16) und Res. 8-24 von OP-1 (SEQ ID NO: 39). Alle anderen Konstrukte entsprechen in der Sequenz OP-1 (SEQ ID NO: 39) mit einer oder mehreren individuellen Aminosäureänderung(en), angezeigt durch die fettgedruckten Reste, die einer oder mehreren der Positionen 1, 4, 6, 7, 25, 26, 30, 31, 35 in der Tabelle und den Resten 397, 400, 402, 403, 421, 422, 426 und 431 in SEQ ID NO: 39 entsprechen.
  • Figure 00770001
  • Für jede hierin aufgelistete Mutante wurde die Rückfaltung unter Verwendung von mindestens einem der hierin beschriebenen Parameter gemessen (siehe z.B. Beispiel 4). Alle zitierten Werte wurden gegen einen bekannten guten Rückfalter, z.B. CDMP-2 oder BMP-2, gemessen, der ungefähr mindestens 25% Dimer bei einer Rückfaltung ohne zusätzliche Reinigung ergibt. Die Werte sind in Tabelle 3 (nachstehend) und in 4 wie folgt dargestellt: (+++) = > 25%; (++) = 5-25%; (+) = 1-5%; (+/–) = < 1%, wobei natürliches CDMP-2 und BMP-2 je einen +++ Rückfaltungswert haben. Die Aktivität wurde im auf Osteosarkomzellen basierenden Test gemessen, der auch ein Maß für die Knochen-induzierende Aktivität ist. Das heißt, OP-1 und BMP-2 können in diesem Zell-basierenden Test eine alkalische Phosphatase-Aktivität induzieren, aber CDMP-2 und CDMP-1 können dies nicht. Trotzdem sind alle vier Proteine kompetent, die vollständige Kaskade von morphogenen Ereignissen zu induzieren, die im subcutanen Rattentest in einer endochondralen Knochenbildung resultieren (Beispiel 8). Im Zell-basierenden Test von Beispiel 5 ist die gemessene Aktivität die alkalische Phosphatase-Aktivität, festgestellt durch die optische Dichte bei 405 nm. Der gezeigte hOP-1 Wert ist vom Säugerzellen-produzierten Protein. „N/A" bedeutet „nicht getestet". Die Figur-Werte sind wie folgt: (+++) = > 1,2; (++) 0,8-1,2; (+) = 0,4-0,8; (+/–) = < 0,4, wobei das natürliche hOP-1 einen +++ biologischen Aktivitätswert hat. TABELLE 3
    Mutante Faltung ROS Bemerkungen
    WtOP1 +/– N/A OP-1 ist ein schwacher Rückfalter
    BMP-2 CDMP-2 GDF-5 +++ +++ +++ +++ +/– +/– natürliche gute Rückfalter
    H2177 + N/A OP-1 mit 13 GDF-5-abstammenden Resten faltet rück
    H2406 H2421 +/– +/– N/A N/A CDMP-2 mit 11 OP-1-abstammenden Resten versagt GDF-5 mit 6 OP-1-Resten versagt
    H2247 H2464 H2467 + + + +++ N/A N/A verbesserte Faltung mit C-terminalem Austausch von H
    H2234 H2233 H2457 +½ ++ ++½ N/A +++ +++ bessere Faltung mit zusätzlichen E-, D-Austauschen
    H2443 H2418 H2447 H2456 H2460 +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++½ ++½ beste Rückfaltung, wenn stromaufwärts auch N durch S oder T ausgetauscht wird
    H2475 ++ +++ dieselben Austausche in BMP-5 verbessern auch Rückfaltung
  • Wie in den 4A und 4B gezeigt, erhöht das Ersetzen des C-terminalen Rests von OP-1 die Rückfaltung des Proteins. Chimere Mutanten, die die Heel- und Finger-1-Subdomänen eines guten Rückfalters austauschen aber einen OP-1 Finger-2 bewahren, verbessern die Rückfaltungseigenschaften des Proteins nicht wesentlich (siehe z.B. H2360, H2362, H2331, H2383). Das Austauschen einer Finger-2-Subdomäne eines guten Rückfalter verbessert jedoch die Rückfaltung. Mutante Morphogene wie H2410, H2389 und H2471 sind besonders anschauliche Beispiele, wie Morphogen-Domänen rekombiniert werden können, um variante Formen von Morphogenen zu produzieren, die neue oder veränderte Eigenschaften oder Aktivitäten haben. Zum Beispiel bewahrt im Zell-basierenden Test (H2418) das Ersetzten von nur der Basis von Finger-2 mit jener eines guten Rückfalters (wie CDMP-2) und Bewahren der Spitzenregion von OP-1 (Positionen 10-20) die Bindungsspezifität von OP-1 zusätzlich zum Verbessern der Rückfaltung.
  • Zusätzliche Modifikationen wurden durch Mutieren von individuellen Codons erhalten, um individuelle Aminosäuren zu ändern. Das Minimieren der Änderungen in der Finger-2-Basisregion auf einen, zwei oder drei saure Rest-Austausche war gleich gut im Verbessern der Rückfaltung und Bewahrung der OP-1-Bindungsspezifität (siehe z.B. H2447 und H2443 in 4B und H2456 in den Tabellen 2 und 3). Schließlich verbesserte das Austauschen eines eine Hydroxylgruppe tragenden Rests mit einem positiv geladenen oder eine Amidgruppe tragenden Rest auch die Rückfaltung (H2456). Das Ersetzen in H2456 von Gln4 von OP-1 mit dem Glu an Position 4 von BMP-2 verbesserte auch die Rückfaltung. Zusätzlich scheinen die positive Ladung oder Prolin, die/das dem Cystein-Doppel vorangeht, nicht signifikant zu den Rückfaltungseigenschaften des Proteins in vitro beizutragen, da das Ändern der Sequenz „KP", die dem „CC"-Doppel vorangeht, zu „NS" eine geringe oder keine signifikante Wirkung hatte.
  • Zusätzliche Beispiele von Morphogenmodifikationen sind in Tabelle 2 gezeigt. Im Gegensatz zu OP-1 sind manche Mitglieder der TGF-β-Superfamilie wie BMP-2, CDMP-2 und DGF-5 gute Rückfalter und haben eine angeborene Fähigkeit, in einem Standard-Proteinrückfaltungsprotokoll rückzufalten. Verschiedene Mutanten der osteogenen Subgruppe der TGF-β-Superfamilie-Mitglied-Proteine wurden konstruiert, um zu bestimmen, welche Aminosäurereste geändert werden können, um die Rückfaltungsfähigkeit eines schwachen Rückfalterproteins zu verbessern. Zum Beispiel wurde OP-1 in seiner Finger-2-Subdomäne so modifiziert, dass es 13 Aminosäuren enthielt, die an den entsprechenden Positionen in GDF-5 gefunden werden. Das resultierende mutante variante Protein von OP-1 zeigte eine verbesserte Rückfaltungsfähigkeit gegenüber dem Wildtyp-OP-1-Protein (siehe H2177 in den Tabellen 2 und 3). Ebenso wurde die Rückfaltungsfähigkeit des Wildtyp-MBP-5 in einer mutanten Variante verbessert, in der bestimmte Aminosäurereste der Finger-2-Subdomäne mit Glutaminsäure, Asparginsäure, Arginin und Alanin ersetzt wurden (siehe H2475 in den Tabellen 2 und 3). Im Gegensatz dazu wurde die Rückfaltungsfähigkeit verringert, wenn CDMP-2 modifiziert wurde, so dass es 11 Aminosäuren von der OP1 Finger-2-Subdomäne enthielt (siehe H2406 in den Tabellen 2 und 3), oder wenn GDF-5 modifiziert wurde, dass es 6 Aminosäuren der OP-1 Finger-2-Subdomäne enthielt (siehe H2421 in den Tabellen 2 und 3). Die Änderungen in der CDMP-2-Mutante H2406 und der GDF-5-Mutante H2421 in der Tabelle 2 bilden im Prinzip eine Region der Finger-2-Subdomäne von OP-1 wieder (siehe Regionen der Finger-2-Aminosäuresequenzen von H2406 und H2421 in Tabelle 2).
  • Basierend auf den Beobachtungen von Wildtypproteinen und mutanten Varianten davon wurden selektivere Aminosäurerestaustausche in der Finger-2-Subdomäne von OP-1 gemacht und auf ihre Wirkung auf die Rückfaltung bewertet. Solch eine selektive Finger-2-Subdomäne-Mutagenese des osteogenen OP-1-Proteins wird durch die Daten in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 2 zeigt die Aminosäuresequenzen der Finger-2-Subdomäne von verschiedenen osteogenen Proteinen und mutanten Varianten davon. In Tabelle 2 unterscheiden sich alle Aminosäurereste, die unterstrichen sind, vom korrespondierenden Rest im Wildtyp-OP-1. Die Reste, die in Tabelle 2 nicht unterstrichen sind, entsprechen den natürlichen Aminosäureresten, die im Wildtyp-OP-1 gefunden werden. Das Austauschen des C-terminalen Histidins von OP-1 mit einem Arginin (R, wie in natürlichen guten osteogenen Rückfalter-Proteinen wie CDMP-2, GDF-5 und BMP-2 gefunden) verstärkte die Rückfaltungsfähigkeit (siehe mutante Konstrukte H2247, H2464 und H2467 in den Tabellen 2 und 3). Das Vermehren der negativ geladenen Reste in der C-terminalen Finger-2-Subdomänenregion von OP-1 zum Beispiel durch Austauschen von Glutaminsäure (E) oder Asparginsäure (D), wie sie in osteogenen guten Rückfalter-Proteinen gefunden werden, verstärkte die Rückfaltungsfähigkeit (siehe zum Beispiel H2234, H2233 und H2457 in den Tabellen 2 und 3). Die besten Rückfalter haben mehr negative Ladungen in der C-terminalen Finger-2-Subdomäne und auch einen relativ hohen Gesamtgehalt von geladenen Resten. Eine weitere Verbesserung in der Rückfaltungsfähigkeit wurde auch durch Steigern der Zahl der eine Hydroxylgruppe tragenden polaren Reste in der Finger-2-Subdomäne von OP-1 erreicht. Zum Beispiel verstärkte zusätzlich zu den oben erwähnten Austauschen das Austauschen der eine Hydroxylgruppe tragenden polaren Aminosäurereste Serin (S) oder Threonin (T) gegen das am weitesten stromaufwärts gelegene Aspargin (N) in der Finger-2-Subdomäne die Rückfaltung (siehe H2443, H2418, H2447, H2456 und H2460 in den Tabellen 2 und 3).
  • Mutanten mit einer guten ROS-Aktivität wie H2247, H2233, H2457 und H2475 enthalten das ursprüngliche Peptid Leu-Asn-Ala (Reste 5, 6, 7). Andere OP-1-Mutanten, die etwas besser falten, enthalten das modifizierte Peptid Leu-Ser-Ala, wie es in BMP-2, H2456 und H2460 gefunden wird, aber diese Proteine sind im ROS-Test etwas weniger aktiv. Siehe Tabelle 3. Daher leistet das Aspargin im Leu-Asn-Ala-Peptid einen positiven Beitrag im ROS-Test.
  • Als ein zusätzlicher Repräsentant der OP-1-verwandten BMPs wurde die BMP-5-Mutante H2475 (die mit 88% Identität in der 7-Cysteine-Domäne in der Sequenz sehr ähnlich zu OP-1 ist) exprimiert. In seiner nicht modizifierten Form faltete BMP-5 genau wie OP-1 nicht rück. Nachdem dieselben Änderungen in den Finger-2 eingebracht wurden, die eine Rückfaltung von OP-1 ermöglichten, wurde ein brauchbarer Rückfaltungsertrag erhalten. 3B zeigt die BMP-5 Nucleotidsequenz und ihre Änderungen für die Rückfaltung. Im Fall von BMP-5 war die anfängliche Änderung am C-Terminus, Histidin zu Arginin, nicht ausreichend für eine Rückfaltung. Daher wurden drei saure Reste in der Nähe eingebracht, die sich als günstig für eine Rückfaltung von OP-1 erwiesen hatten. Dies wurde durch Spleißen von BMP-5 mit der C-terminalen Sequenz von OP-1 gemacht, die auch die zusätzliche Serin-zu-Alanin-Änderung einbrachte. Dieses Konstrukt wurde in einem ROS-Test getestet und hatte eine Aktivität, die gleich wie oder besser als die erfolgreichen OP-1-Varianten wie H2471 (mutantes OP-1 mit CDMP-2 Finger-2) war. CDMP-2, das als Kontrolle getestet wurde, zeigte keine Aktivität.
  • Diese modifizierten Protein-Mutanten sind löslicher als ihre nicht modifizierten Gegenstücke. Zum Beispiel zeigte die Mutante H2223, die mutantes H2233 (siehe Tabelle 2) ohne die Prodomäne ist und die in CHO-Zellen etabliert wird, einen überraschenden Anstieg in der Solubilität im Vergleich zum reifen Wildtyp-OP-1. H2223 ist eine OP-1-Mutante mit vier Aminosäureaustauschen, 25R>E 26N>D 30R>E 35H>R, gezählt vom ersten Rest ab den doppelten Cysteinen. Die mutanten und Wildtyp-Morphogene wurden lyophilisiert und danach in PBS bei pH 7,4 oder pH 7,0 solubilisiert. Nach 40 Stunden bei Zimmertemperatur wurden die Proben abzentrifugiert, um jegliches ungelöste Protein zu sammeln, und der resultierende Überstand wurde einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen. Ein signifikanter Teil der lyophilisierten H2223-Mutante wurde im PBS-Puffer solubilisiert, wohingegen das Wildtyp-OP-1 bei neutralem pH nahezu unlöslich war. Das Einbringen von geladenen Resten, um mutante TGF-β-Superfamilie-Proteine zu kreieren, scheint die Solubilität jener Proteine zu verbessern. Man kann weiterhin erwarten, dass diese erhöhte Solubilität die erhöhte Aktivität im ROS-Test im Vergleich zum Wildtyp-OP-1 bedingen könnte.
  • Wo geladene Reste in ihrer Polarität umgekehrt wurden, beeinflusste es den isoelektrischen Punkt des Proteins, obwohl seine Aktivität in einem ROS-Test nicht verändert worden sein musste. Die Mutanten H2456, H2457 und H2460 wurden rückgefaltet, gereinigt und auf einem isoelektrischen Fokussierungsgel analysiert. Diese Mutanten unterschieden sich nur durch eine oder zwei geladene Aminosäure(n) (nahe beim Cystein 4 und Cystein 5 gelegen, wo sich Heel und Finger-2 treffen). H2460, das einen saueren Rest weniger hat als H2456, fokussierte in einem basischeren Bereich als H2456. Ebenso fokussierte H2457, das einen basischen Rest weniger hat als H2456, in einem saureren Bereich als H2456. Das Einbringen der Glutaminsäure anstelle von Arginin und das Einbringen von Asparginsäure anstelle von Aspargin resultierten in einer Verschiebung des isoelektrischen Punkts zum sauren pH. Dies kann in einer verbesserten oder veränderten Solubilität resultieren, die als eine Kompensierung für das Fehlen der Glycosylierung in einem bakteriell produzierten Protein erwünscht sein kann.
  • Solche Ladungsmodifizierungen können auch in der Reinigung von Heterodimeren hilfreich sein. Wenn die zwei Untereinheiten in den Heterodimeren verschiedene Bindungsaffinitäten aufgrund ihrer Nettoladung haben, können die drei Spezies, die aus einem gemischten Rückfaltungsexperiment resultieren (d.h. Homodimere von jeder Untereinheit und das Heterodimer) auf einer Säule leicht von einander getrennt werden.
  • Die Anwendung der Erfindung wird aus den folgenden Beispielen noch vollständiger verstanden werden, die hierin nur zur Illustration dargelegt werden und nicht in irgendeiner Weise als die Erfindung einschränkend ausgelegt werden sollten.
  • III. BEISPIELE
  • BEISPIEL 1. Synthese eines beispielhaften mutanten Proteins der vorliegenden Erfindung: eine BMP-Mutante
  • 3A zeigt die Nucleotid- und entsprechende Aminosäuresequenz für die C-terminale sieben-Cysteine-Domäne von OP-1. Die Kenntnis dieser Sequenzen ermöglicht die Identifizierung von nützlichen Restriktionsstellen für das Manipulieren in Mutationen durch zum Beispiel Kassettenmutagenese oder das wohlbekannte Verfahren von Kunkel (Mutagenese durch Primerverlängerung unter Verwendung von m13-abgeleiteten einzelsträngigen Matrizen) oder durch die wohlbekannten PCR-Verfahren, einschließlich der Überlappungsverlängerung. Eine beispielhafte Mutante von OP-1 ist H2460 mit 4 Aminosäureänderungen in der Finger-2-Subdomäne und einer Aminosäureänderung in der letzten C-terminalen Aminosäure, konstruiert wie nachstehend beschrieben. Es wird vom Fachmann verstanden, dass das beschriebene Mutageneseprotokoll nur beispielhaft ist, und dass andere Mittel für das Kreieren der Konstrukte der Erfindung auf dem Fachgebiet wohlbekannt und gut beschrieben sind.
  • Vier Aminosäureänderungen wurden in die OP-1-Finger-2-Subdomänensequenz durch Polymeraseketten reaktions-Standard reaktionen unter Verwendung der Überlappungsverlängerungstechnik eingebracht, was in der OP-1-Mutante H2460 resultierte. Die vier Änderungen in der Finger-2-Region waren N6>S, R25>E, N26>D und R30>E. Diese Mutante enthielt auch eine weiter Änderung, H35>R, des C-terminalen Rests. Die Matrize für diese Reaktionen war die reife Domäne eines Wildtyp-OP-1-cDNA-Clons, der in einen E. coli-Expressionsvektor inseriert worden war, der mit einem ATG-Startcodon am Beginn der reifen Region gestaltet worden ist. Das ATG war durch PCR unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotids der folgenden Sequenz: ATG TCC ACG GGG AGC AAA CAG (SEQ ID NO: 36), codierend MSTGSKQ (SEQ ID NO: 37), als Vorwärtsprimer eingebracht worden. Die PCR-Reaktion wurde in Kombination mit einem geeigneten Rückwärtsprimer durchgeführt, der komplementär zu der 3'-codierenden Region der cDNA ist.
  • Um die Finger-2-Mutante H2460 zu konstruieren, wurde ein PCR-Fragment, das den modifizierten Finger-2 codiert, in einer PCR-Standardreaktion unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen PCR-Kits und Befolgen der Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden als Primer hergestellt.
  • Um die N6>S-Änderung zu erhalten, wurde ein Vorwärtsprimer (Primer #1) der Sequenz GCG CCC ACG CAG CTC AGC OCT ATC TCC GTC CTC (SEQ ID NO: 70) verwendet, der die Aminosäuresequenz APTQLSAISVL (SEQ ID NO: 71). codiert.
  • Für die Änderungen nahe des C-Terminus wurde ein Rückwärtsprimer, der 43 Nucleotide lang ist (Primer #2), verwendet, der die R25>E und N26>D und R30>E und C-terminalen H35>R Änderungen einbrachte. Dieser Primer #2 hatte die Sequenz:
    CTA TCT GCA GCC ACA AGC TTC GAC CAC CAT GTC TTC GTA TTT C (SEQ ID NO: 72), die das Komplement der codierenden Sequenz G AAA TAC GAA GAC ATG GTG GTC GAA OCT TGT GGC TGC AGA TAG (SEQ ID NO: 73) ist, die die Aminosäuren KYEDMVVEACGCR stop (SEQ ID NO: 74) codiert.
  • Das Fragment mit den Finger-2- und C-Terminus-Mutationen wurde dann mit einem anderen PCR-Fragment kombiniert, das den stromaufwärts liegenden Teil des reifen OP-1 mit N-Terminus, Finger-1- und Heel-Subdomänen codiert. Das letztere PCR-Fragment, das den N-Terminus, die Finger-1- und Heel-Subdomänen codiert, wurde wieder unter Verwendung eines OP-1-Expressionsvektors für E. coli als Matrize konstruiert. Der Vektor enthielt ein OP-1-cDNA-Fragment, das das reife OP-1-Protein angeheftet an einen T7-Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle für die Expression unter der Kontrolle entweder eines T7-Promotors in einem geeigneten Wirt oder unter der Kontrolle eines trp-Promotors codiert. In diesem T7-Expressionsvektor, Pet 3d (Novagen Inc., Madison, WI) ist die Sequenz zwischen dem T7-Promotor an der XbaI-Stelle und dem ATG-Codon des reifen OP-1 wie folgt: TCTAGAATAATTTTGTTTAACCTTTAAGAAGGAGATATACG ATG (SEQ ID NO: 75).
  • Diese zweite PCR-Reaktion wurde mit einem Vorwärtsprimer (Primer #3), TAA TAC GAC TCA CTA TAG G (SEQ ID NO: 76), der in der T7-Promotorregion primt, und einem Rückwärtsprimer (Primer #4), der mit dem Primer #1 überlappt und die Nucleotidsequenz OCT GAG CTG CGT GGG CGC (SEQ ID NO: 77) hat, die das Komplement zu der codierenden Sequenz GCG CCC ACG CAG CTC AGC (SEQ ID NO: 78), codierend APTQLS (SEQ ID NO: 79), ist, geprimt.
  • In einer dritten PCR-Reaktion, der tatsächlichen Überlappungsextensions-Reaktion, wurden Teile der obigen zwei PCR-Fragmente kombiniert und durch PCR amplifiziert, was in einem einzelnen Fragment resultiert, das die vollständige reife OP-1-Region enthält. Für diese Reaktion wurde der Primer #3 als Vorwärtsprimer verwendet, und ein neuer Primer (#5) wurde als ein Rückwärtsprimer mit der folgenden Sequenz GG ATC CTA TCT GCA GCC ACA AGC (SEQ ID NO: 80) verwendet, der das Komplement ist zu der codierenden Sequenz OCT TGT GGC TGC AGA TAG GAT CC (SEQ ID NO: 81), die ACGCR stop (SEQ ID NO: 82). codiert. Dieser Primer fügt auch eine praktische 3'-BamHI-Stelle für das Inserieren des Gens in den Expressionsvektor hinzu.
  • Das resultierende Fragment, das das vollständige mutante Gen trägt, das aus der Überlappungsextensions-PCR resultiert, wurde in einen kommerziellen Clonierungsvektor cloniert, der für das Clonieren von PCR-Fragmenten gestaltet ist, wie pCR2.1-topo-TA (Invitrogen Inc., Carlsbad CA). Das clonierte PCR-Fragment wurde durch Restriktionsverdau mit XbaI und BamHI gewonnen und in die XbaI- und BamHI-Stellen eines kommerziell erhältlichen T7-Expressionsvektors wie Pet3d (Novagen Inc., Madison WI) inseriert.
  • BEISPIEL 2. E. coli-Expression eines beispielhaften mutanten Proteins der vorliegenden Erfindung: Expression einer BMP-Mutante
  • Transformierte Zellen wurden in SPYE 2YT-Standardmedien, 1:1-Verhältnis (siehe zum Beispiel Sambrook et al.) bei 37°C unter Standard-Kulturbedingungen gezüchtet. Die heterologe Protein-Überexpression produzierte typischerweise innerhalb von 8-48 Stunden Einschlusskörper. Die Einschlusskörper wurden wie folgt isoliert und solubilisiert. Ein Liter Kulturflüssigkeit wurde zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Die Zellen im resultierenden Pellet wurden dann in 60 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0 (TE-Puffer) + 100 μg/ml Lysozym resuspendiert und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann auf Eis gekühlt und mit Ultraschall behandelt, um die Zellen zu lysieren. Die Zell-Lyse wurde durch mikroskopische Untersuchung abgesichert. Das Volumen des Lysats wurde mit TE-Puffer auf ungefähr 300 ml angepasst, dann zentrifugiert, um ein Einschlusskörper-Pellet zu erhalten. Das Pellet wurde durch 2-4 aufeinanderfolgende Resuspensionen in TE-Puffer und Zentrifugieren gewaschen. Das gewaschene Einschlusskörper-Pellet wurde durch Denaturierung und Reduktion in 40 ml 100 mM Tris, 10 mM EDTA, 6M GuHCl (Guanidiniumhydrochlorid), 250 mM DTT, pH 8,8, solubilisiert. Die Proteine wurden dann unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen C2- oder C8-Standardpatrone (SPICE cartridges, 400 mg, Analtech, Inc.) vorgereinigt. Die Proteinlösungen wurden mit 2% TFA (Trifluoressigsäure) angesäuert, auf die Patrone aufgetragen, mit 0,1% TFA/10% Acetonitril gewaschen und mit 0,1% TFA/70% Acetonitril eluiert. Das eluierte Material wurde dann getrocknet oder verdünnt und durch C4-RP-HPLC fraktioniert.
  • BEISPIEL 3. Rückfalten eines beispielhaften mutanten Proteins der vorliegenden Erfindung: ein mutantes BMP-Dimer
  • Die Proteine, die wie vorstehend hergestellt wurden, wurden vor der Rückfaltung abgetrocknet oder direkt in den Rückfaltungspuffer verdünnt. Der verwendete bevorzugte Rückfaltungspuffer war: 100 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 2% CHAPS, 5 mM GSH (reduziertes Glutathion), 2,5 mM GSSG (oxidiertes Glutathion), pH 8,5. Die Rückfaltungen (12,5-200 μg Protein/ml) wurden bei 4°C für 24-90 Stunden durchgeführt, typischerweise 36-48 Stunden, obwohl erwartet wird, dass länger als dies (bis zu Wochen) in manchen Mutanten eine gute Rückfaltung liefert, gefolgt von einer Dialyse gegen 0,1% TFA, dann 0,01% TFA, 50% Ethanol. Aliquots des dialysierten Materials wurden dann in Vorbereitung auf die verschiedenen Tests abgetrocknet.
  • BEISPIEL 4. Reinigung und Testen eines rückgefalteten beispielhaften mutanten Dimers der vorliegenden Erfindung: ein mutantes BMP-Dimer
  • 4A. SDS-PAGE, RP-HPLC –
  • Die Proben wurden getrocknet und in Laemmli-Gelprobenpuffer resuspendiert und dann in einem 15% SDS-Polyacrylamidgel eine Elektrophorese durchgeführt. Alle Tests schlossen Molekulargewichts-Standards und/oder durch Säugerzellen produziertes, gereinigtes OP-1 zum Vergleich ein. Die Analyse der OP-1-Dimere wurde in der Abwesenheit von zugesetzten Reduktionsmitteln durchgeführt, während die OP-1-Monomere durch die Zugabe von 100 mM DTT zu den Gelproben produziert wurden. Ein gefaltetes Dimer hat ein offensichtliches Molekulargewicht im Bereich von etwa 30-36 kDa, während monomere Spezies ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 14-16 kDa haben.
  • Alternativ wurden die Proben auf einer kommerziell erhältlichen RP-HPLC wie folgt einer Chromatographie unterzogen. Die Proben wurden getrocknet und in 0,1% TFA/30% Acetonitril resuspendiert. Das Protein wurde dann auf eine C18-Säule in 0,1% TFA, 30% Acetonitril aufgetragen und unter Verwendung eines 30-60% Acetonitril-Gradienten in 0,1% TFA fraktioniert. Korrekt gefaltete Dimere eluieren als ein diskreter Gipfel bei 45-50% Acetonitril; Monomere eluieren bei 50-60% Acetonitril.
  • 4B. Hydroxyapatit-Chromatographie –
  • Die Proben wurden auf eine Hydroxyapatit-Säule in 10 mM Phosphat, 6 M Harnstoff, pH 7,0 (Säulenpuffer), geladen. Ungebundenes Material wurde durch Waschen mit Säulenpuffer entfernt, gefolgt von einer Flution des Monomers mit Säulenpuffer + 100 mM NaCl. Dimere wurden mit Säulenpuffer + 250 mM NaCl eluiert.
  • 4C. Trypsin-Verdau –
  • Die Trypsin-Verdaue wurde in einem Verdaupuffer von 50 mM Tris, 4 M Harnstoff, 100 mM NaCl, 0,3% Tween 80, 20 mM Methylamin, pH 8,0, durchgeführt. Das Verhältnis des Enzyms zum Substrat war 1:50 (Gewicht zu Gewicht). Nach der Inkubation bei 37°C für 16 Stunden wurden 15 μl des Verdau-Gemisches mit 5 μl 4X Gelprobenpuffer ohne DTT kombiniert und durch SDS-PAGE analysiert. Gereinigtes Säuger-OP-1 und unverdautes BMP-Dimer wurden zum Vergleich eingeschlossen. Unter diesen Bedingungen werden korrekt gefaltete Dimere gespalten, wobei eine Spezies mit etwas schnellerer Migration als ungespaltene Standards produziert wird, während Monomere und fehl-gefaltete Dimere vollständig verdaut werden und im gefärbten Gel nicht als Banden erscheinen.
  • BEISPIEL 5. Testen der veränderten Eigenschaften eines mutanten Proteins der vorliegenden Erfindung: Zell-basierender in vitro-Biotest auf eine osteogene Aktivität
  • Dieses Beispiel zeigt die Bioaktivität von bestimmten osteogenen mutanten Proteinen der Erfindung. Native osteogene Proteine, die eine hohe spezifische Knochen-bildende Aktivität haben, können in Ratten-Osteoblasten, einschließlich Ratten-Osteosarkomzellen und Ratten-Schädeldach-Zellen, eine alkalische Phosphatase-Aktivität induzieren. Im Test wurden die Ratten-Osteosarkom- oder Schädeldach-Zellen auf eine Platte mit mehreren Vertiefungen (z.B. eine Platte mit 48 Vertiefungen) in einer Konzentration von 50 000 Osteoblasten pro Vertiefung in αMEM (modifiziertes Eagle-Medium, Gibco, Inc. Long Island), enthaltend 10% FBS (fötales bovines Serum), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin, plattiert. Die Zellen wurden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert, wonach das Wachstumsmedium mit αMEM, enthaltend 1% FBS, ersetzt wurde, und die Zellen für weitere 24 Stunden inkubiert wurden, sodass die Zellen zum Zeitpunkt des Versuchs in Serum-reduziertem Wachstumsmedium waren. Die kultivierten Zellen wurden dann in drei Gruppen unterteilt: (1) Vertiefungen, die verschiedene Konzentrationen eines biosynthetischen osteogenen Proteins erhielten; (2) eine Positiv-Kontrolle wie Säuger-exprimiertes hOP-1; und eine Negativ-Kontrolle (kein Protein oder TGF-β). Die getesteten Proteinkonzentrationen lagen im Bereich von 50-500 ng/ml. Die Zellen wurden für 72 Stunden inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurde die Zellschicht mit 0,5 ml 1% TritonX-100 extrahiert. Der resultierende Zellextrakt wurde zentrifugiert, 100 μl des Extrakts wurden zu 90 μl PNPP (Paranitrosophenylphosphat)/Glycerin-Gemisch zugefügt und für 30 Minuten in einem 37°C-Wasserbad inkubiert, und die Reaktion wurde mit 100 μl 0,2N NaOH gestoppt. Die Proben wurden dann durch ein Plattenlesegerät (z.B. Dynatech MR700) laufen gelassen, und die Absorption wurde bei 400 nm unter Verwendung von p-Nitrophenol als ein Standard gemessen, um das Vorliegen und die Menge der alkalischen Phosphatase-Aktivität zu bestimmen. Die Proteinkonzentrationen wurden durch Standardmittel, z.B. das Biorad-Verfahren, UV-Scannen oder RP-HPLC-Bereich bei 214 nm bestimmt. Die alkalische Phosphatase-Aktivität wurde in Einheiten/μg Protein berechnet, wobei 1 Einheit 1 nmol freigesetztem p-Nitrophenol/30 Minuten bei 37°C entspricht.
  • Natürliches hOP-1 und BMP-2 stellen ungefähr 1,0-1,4 Einheiten zu zwischen 100-200 ng/ml her.
  • BEISPIEL 6. Testen der veränderten Eigenschaften eines mutanten Proteins der vorliegenden Erfindung: Zell-basierender in vitro-Biotest der CDMP-Aktivität
  • Dieses Beispiel zeigt die Bioaktivität von bestimmten osteogenen Mutanten der Erfindung. Natürliche CDMPs versagen, in Ratten-Osteosarkomzellen, wie in Beispiel 5 verwendet, eine alkalische Phosphatase-Aktivität zu induzieren, aber sie induzieren in der Maus-Teratokarzinom-Zelllinie ATDC-5, einer Knorpel- Vorläuferzelllinie (Atsumi, et al., 1990, Cell Differentiation and Development 30: 109), eine alkalische Phosphatase-Aktivität. Es wird beschrieben, dass rückgefaltete mutante Konstrukte, die im Ratten-Osteosarkomzell-Test negativ aber im ATDC-5-Test positiv sind, eine CDMP-ähnliche Aktivität erworben haben. Im ATDC-5-Test wurden die Zellen in einer Dichte von 4 × 104 in serumfreiem Basalmedium (BM: Ham's F-12/DMEM [1:1] mit ITSTM + Kulturergänzungen [Collaborative Biomedical Products, Redford, MA], alpha-Ketoglutarat (1 × 10–4 M), Cerulopiasmin (0,25 E/ml), Cholesterol (5 μg/ml), Phosphatidylethanolamin (2 μg/ml), alpha-Tocopherolsäuresuccinat (9 × 10–7 M), reduziertem Glutathion (10 μg/ml), Taurin (1,25 μg/ml), Triiodthyronin (1,6 × 10–9 M), Hydrocortison (1 × 10–9) Nebenschilddrüsenhormon (5 × 10–10 M), β-Glycerophosphat (10 mM) und L-Ascorbinsäure 2-sulphat (50 μg/ml)) plattiert. CDMP oder das mutante Protein (0-300 ng/ml) wurde am nächsten Tag zugefügt und das Kulturmedium, einschließlich CDMP oder das mutante Protein, jeden zweiten Tag ersetzt. Die alkalische Phosphatase-Aktivität wurde in bestrahlten Zellhomogenaten nach 4, 6 und/oder 12 Tagen der Behandlung bestimmt. Nach einem ausgiebigen Waschen mit PBS wurden die Zellschichten in 500 μl PBS, enthaltend 0,05% Triton-X100 ultraschallbehandelt. 50-100 μl Aliquots wurden auf Enzymaktivität im Testpuffer (0,1 M Natriumbarbital-Puffer, pH 9,3) und p-Nitrophenylphosphat als Substrat getestet. Die Absorption wurde bei 400 nm gemessen und die Aktivität zum Proteingehalt, der durch den Bradford-Proteintest (bovines Serumalbumin-Standard) gemessen wurde, normalisiert.
  • Natives CDMP-1 und CDMP-2 stellten ungefähr 2-3 Einheiten der Aktivität am Tag 10 bei 100 ng/ml her. Der natürliche OP-1-Standard stellte ungefähr 6-7 Einheiten der Aktivität am Tag 10 bei 100 ng/ml her.
  • BEISPIEL 7. Testen der veränderten Eigenschaften eines mutanten Proteins der vorliegenden Erfindung: Zell-basierender in vitro-Biotest der TGF-β-ähnlichen Aktivität
  • Dieses Beispiel zeigt die Bioaktivität von bestimmten TGF-β-basierenden mutanten Proteinen der Erfindung. Native TGF-β-Proteine können die epitheliale Zellproliferation inhibieren. Zahlreiche Zellinhibitions-Tests sind auf dem Fachgebiet gut beschrieben. Siehe zum Beispiel Brown et al. (1987) J. Immunol. 139:2977, beschreibend einen kolorimetrischen Test unter Verwendung von menschlichen Melanom A375-Fibroblastenzellen, und hierin nachstehend beschrieben. Ein anderer Test verwendet Epithelzellen, z.B. epitheliale Nerz-Lungenzellen, und proliferative Wirkungen werden durch 3H-Thymidin-Aufnahme bestimmt.
  • Kurz, im Test wird die biosynthetische TGF-β-Mutante seriell in einer Gewebeplatte mit vielen Vertiefungen, enthalten RPMI-1640-Medium (Gibco) und 5% fötales Kälberserum, verdünnt. Die Kontrollvertiefungen erhalten nur Medium. Die Melanomzellen werden dann zur Vertiefung zugefügt (1,5 × 104). Die Platten werden dann bei 37°C für etwa 72 Stunden in 5% CO2 inkubiert und die Zellmonolayer einmal gewaschen, fixiert und mit Kristallviolett für 15 Minuten gefärbt. Ungebundener Farbstoff wird ausgewaschen, und die gefärbten Zellen werden dann mit 33% Essigsäure lysiert, um den Farbstoff (beschränkt auf die Zellkerne) freizusetzen, und die OD wird bei 590 nm mit einem kommerziell erhältlichen Standard-Photometer gemessen, um die Aktivität der Testmoleküle zu berechnen. Die Intensität der Färbung in jeder Vertiefung steht in direktem Verhältnis zur Zahl der Kerne. Dementsprechend wird erwartet, dass die aktiven TGF-β-Moleküle sich leichter als inaktive Verbindungen oder die Negativ-Kontroll-Vertiefung färben.
  • In einem anderen Test werden Nerz-Lungenzellen verwendet. Diese Zellen wachsen und proliferieren unter Standard-Kulturbedingungen, aber arretieren nach einem Ausgesetztsein gegenüber TGF-β, bestimmt durch 3H-Thymidin-Aufnahme unter Verwendung von Kulturzellen einer epithelialen Nerzlungen-Zelllinie (ATCC Nr. CCL 64, Rockville, MD). Kurz, die Zellen werden in EMEM, ergänzt mit 10% FBS, 200 Einheiten/ml Penicillin und 200 μg/ml Streptomycin, zur Konfluenz gezüchtet. Diese Zellen werden zu einer Zelldichte von etwa 200 000 Zellen pro Vertiefung kultiviert. Bei Konfluenz wird das Medium mit 0,5 ml EMEM, enthaltend 1% FBS und Penicillin/Streptomycin, ersetzt und die Kultur für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Kandidaten-Proteine werden dann zu jeder Vertiefung zugefügt und die Zellen für 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde 1,0 μCi 3H-Thymidin in 10 μl zu jeder Vertiefung zugefügt, und die Zellen wurden für vier Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wird dann von jeder Vertiefung entfernt, und die Zellen werden einmal mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, und die DNA wird durch Zugabe von 0,5 ml 10% TCA zu jeder Vertiefung präzipitiert und für 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Zellen werden dreimal mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen, mit 0,5 ml 0,4 M NaOH lysiert, und das Lysat von jeder Vertiefung wird dann in ein Szintillationsröhrchen transferiert und die Radioaktivität unter Verwendung eines Szintillationszählers (Smith-Kline Beckman) aufgezeichnet. Biologisch aktive Moleküle werden die Zellproliferation hemmen, was in einer geringeren Thymidinaufnahme und weniger Zählimpulse im Vergleich zu inaktiven Proteinen und/oder der Negativkontroll-Vertiefung (kein zugefügter Wachstumsfaktor) resultiert.
  • BEISPIEL 8. Testen der veränderten Eigenschaften eines mutanten Proteins der vorliegenden Erfindung; In vivo-Biotest der osteogenen Aktivität (endochondrale Knochenbildung und in Beziehung stehende Eigenschaften)
  • Der auf dem Fachgebiet anerkannte Biotest für die Knocheninduktion, wie durch Sampath und Reddi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:6591-6595) und US-Pat. Nr. 4,968,590 , 5,266,683 beschrieben, kann verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Instruments oder Präparats zu etablieren. Kurz, der Test besteht aus dem Einbringen von Testproben in subcutane Stellen in Empfängerratten unter Äther-Anästhesie. Ein vertikaler Einschnitt (1 cm) in die Haut über der Thoraxregion wird unter sterilen Bedingungen gemacht, und durch stumpfe Dissektion wird eine Tasche hergestellt. In bestimmten werden zu der erwünschten Menge des osteogenen Proteins (10 ng-10 μg) unter Verwendung von Standard-Vorgehensweisen wie Lyophilisierung ungefähr 25 mg Matrixmaterial zugefügt und tief in die Tasche implantiert, und der Einschnitt wird mit einer metallischen Hautklammer verschlossen. Die heterotrope Stelle ermöglicht die Untersuchung der Knocheninduktion ohne die möglichen Unklarheiten, die aus der Verwendung von orthotopischen Stellen resultieren. Die Implantate können auch intramuskulär bereitgestellt werden, was die Instrumente in engeren Kontakt mit zugänglichen Vorläuferzellen platziert. Typischerweise werden intramuskuläre Implantate im Skelettmuskel von beiden Beinen gemacht.
  • Die sequenziellen zellulären Reaktionen, die an der heterotropischen Stelle auftreten, sind komplex. Die Kaskade mit mehreren Schritten der endochondralen Knochenbildung schließt ein: Bindung von Fibrin und Fibronectin an die implantierte Matrix, Chemotaxis der Zellen, Proliferation von Fibroblasten, Differenzierung zu Chondroblasten, Knorpelbildung, Gefäßinvasion, Knochenbildung, Umgestaltung und Knochenmark-Differenzierung.
  • Erfolgreiche Implantate zeigen ein kontrolliertes Fortschreiten durch die Stadien der Protein-induzierten endochondralen Knochenentwicklung, einschließlich: (1) transiente Infiltration durch polymorphonucleäre Leukocyten am Tag 1; (2) mesenchymale Zellmigration und Proliferation an den Tagen zwei und drei; (3) Chondrocyten-Auftreten an den Tagen fünf und sechs; (4) Knorpelmatrix-Bildung am Tag sieben; (5) Knorpel-Verkalkung am Tag acht; (6) Gefäßinvasion, Auftreten von Osteoblasten und Bildung von neuem Knochen an den Tagen neun und zehn; (7) Auftreten einer osteoblastischen und Knochen-Umgestaltung an den Tagen zwölf bis achtzehn; und (8) hämatopoietische Knochenmark-Differenzierung im Ossiculum am Tag einundzwanzig.
  • Eine histologische Schnittdarstellung und Färbung wird bevorzugt, um das Ausmaß der Osteogenese in den Implantaten zu bestimmen. Die Färbung mit Toluidinblau oder Hämatoxylin/Eosin zeigt deutlich die endgültige Entwicklung des endochondralen Knochens. Zwölf-Tage-Biotests sind ausreichend, um zu bestimmen, ob eine Knochen-induzierende Aktivität mit der Testprobe assoziiert ist.
  • Zusätzlich können die alkalische Phosphatase-Aktivität und/oder der Gesamt-Calciumgehalt als biochemische Marker für die Osteogenese verwendet werden. Die alkalische Phosphatase-Enzymaktivität kann spektrometrisch nach einer Homogenisierung des ausgeschnittenen Testmaterials bestimmt werden. Die Aktivität gipfelt nach 9-10 Tagen in vivo und sinkt danach langsam. Die Proben, die durch Histologie keine Knochenentwicklung zeigen, sollten unter diesen Testbedingungen keine alkalische Phosphatase-Aktivität haben. Der Test ist nützlich für die Quantifizierung und das Erhalten einer Schätzung der Knochenbildung sehr schnell, nachdem die Testproben von der Ratte entfernt werden. Die Ergebnisse, gemessen durch den alkalische Phosphatase-Aktivitätsspiegel und die histologische Bewertung, können als „Knochen-bildende Einheiten" dargestellt werden. Eine Knochen-bildende Einheit repräsentiert die Menge an Protein, die für eine halbmaximale Knochenbildungs-Aktivität am Tag 12 benötigt wird. Zusätzlich können Dosiskurven für die Knochen-induzierende Aktivität in vivo an jedem Schritt eines Reinigungsschemas durch Testen von verschiedenen Konzentrationen des Proteins konstruiert werden. Dementsprechend kann der Fachmann repräsentative Dosiskurven unter Verwendung von nur Routineexperimentieren konstruieren.
  • Der Gesamt-Calciumgehalt kann nach einer Homogenisierung in zum Beispiel kaltem 0,15M NaCl, 3 mM NaHCO3, pH 9,0, und Messen des Calciumgehalts der sauren löslichen Fraktion des Sediments bestimmt werden.
  • BEISPIEL 9: Beispielhafte modifizierte Morphogen-Mutanten, die veränderte Eigenschaften haben: Domänen-Tauschen
  • 4 ist eine schematische Zeichnung von verschiedenen biosynthetischen Mutanten und ihrer Rückfaltungs- und biologischen Eigenschaften. Die dicke durchgehende Linie repräsentiert OP-1, eine dünne durchgehende Linie repräsentiert CDMP-2/GDF-6 oder GDF-5, und eine unterbrochene Linie repräsentiert BMP-2. Mutante Konstrukte werden in 4A dargestellt, und individuelle Sequenzmutanten werden in 4B dargestellt. Individuelle Reständerungen sind in der Figur durch den austauschenden Rest angezeigt. Die Rest-Nummerierung zählt, wie vorstehend beschrieben, vom ersten Rest nach dem Cystein-Doppel im Finger-2. Zum Beispiel ist die Mutante H2233 OP1 (25R>E 26N>D 30R>E 35H>R). In ähnlicher Weise hat die Mutante H2447 all die Änderungen in H2233 und hat zusätzlich 1A>V 4Q>E 6N>S. Die Mutante H2433 ist OP-1(4Q>K 35H>R), und die Mutante H2456 ist OP-1(4Q>E 6N>S 25R>E 26N>D 30R>E 35H>R).
  • Wie hierin gelehrt, versorgt die vorliegende Erfindung den Fachmann mit dem Know-how, um maßgeschneiderte mutante Proteine und DNAs, die dieselben codieren, zu fertigen. Weiterhin werden hierin die Mittel gelehrt und beispielhaft dargestellt, um mutante Proteine zu gestalten, die (eine) bestimmte erwünschte Eigenschaft(en) haben, die sie geeignet für spezifische in vivo-Anwendungen machen (siehe zu mindestens Abschnitte I.B., II., und III. Beispiele 1-4, 8 und 11 für beispielhafte Ausführungsformen der vorangehenden mutanten Proteine). Zum Beispiel können mutante Proteine, die veränderte Solubilitätseigenschaften haben, in vivo verwendet werden, um morphogen wirksame Mengen, die an einen Empfänger geliefert werden, zu manipulieren. Das heißt, eine erhöhte Solubilität kann in einer erhöhten Verfügbarkeit resultieren; eine verminderte Solubilität kann in einer verminderten Verfügbarkeit resultieren. Daher können solche systemisch verabreichten mutanten Proteine unmittelbar verfügbar sein/sofortige morphogene Wirkungen haben, wohingegen lokal verabreichte mutante Proteine langsamer verfügbar sein/verlängerte morphogene Wirkungen haben können. Der Fachmann wird in Anbetracht der vorliegenden Tatsachen und Umstände abschätzen, wenn erhöhte versus verminderte Solubilitätseigenschaften bevorzugt werden. Die Optimierung von solchen Parametern erfordert Routine-Experimentieren und Fachwissen.
  • In ähnlicher Weise können mutante Proteine, die veränderte Stabilitätseigenschaften haben, in vivo verwendet werden, um morphogen wirksame Mengen, die an einen Empfänger geliefert werden, zu manipulieren. Das heißt, eine erhöhte Stabilität kann in einer erhöhten Halbwertszeit resultieren, weil der Umsatz in vivo geringer ist; eine verminderte Stabilität kann in einer verminderten Halbwertszeit und Verfügbarkeit resultieren, weil der Umsatz in vivo höher ist. Daher können solche systemisch verabreichten mutanten Proteine entweder unmittelbar verfügbar sein/sofortige morphogene Wirkungen haben, die eine Massen-Typ-Dosierung erreichen, oder können in vivo für verlängerte Zeiträume verfügbar sein/verlängerte morphogene Wirkungen haben, die eine Dosierung vom anhaltenden Freisetzungs-Typ erreichen. Der Fachmann wird in Anbetracht der vorliegenden Tatsachen und Umstände erkennen, wenn erhöhte versus verminderte Stabilitätseigenschaften bevorzugt werden. Die Optimierung solcher Parameter erfordert Routine-Experimentieren und Fachwissen.
  • Zusätzlich können mutante Proteine, die eine Kombination von veränderten Eigenschaften wie Solubilitäts- und Stabilitätseigenschaften, aber nicht darauf beschränkt, aufweisen, in vivo verwendet werden, um morphogen wirksame Mengen, die an einen Empfänger geliefert werden, zu manipulieren. Das heißt, durch Gestalten eines mutanten Proteins mit einer Kombination von spezifisch veränderten Eigenschaften können morphogen wirksame Mengen in einer zeitlich abgestimmten Weise verabreicht werden; Dosierungen können sowohl im Bezug auf Menge als auch Dauer reguliert werden; Behandlungspläne können in niedrigen Dosen systemisch oder lokal begonnen werden, gefolgt von einem Übergang zu hohen Dosen oder umgekehrt; um nur ein paar Beispiele zu nennen. Der Fachmann wird in Anbetracht der vorliegenden Tatsachen und Umstände erkennen, wenn niedrige versus hohe morphogen wirksame Mengen geeignet sind. Die Optimierung solcher Parameter erfordert Routine-Experimentieren und Fachwissen.
  • Darüber hinaus sind mutante Proteine, die eine oder mehrere veränderte Eigenschaft(en) haben, nützlich, um angeborene Mängel in der Entwicklung zu überwinden. Mutante Proteine, die eine oder mehrere veränderte Eigenschaft(en) haben, können gestaltet werden, um einen angeborenen Defekt im natürlichen morphogenen Signalgebungssystem eines Wirts zu umgehen. Als ein nicht-limitierendes Beispiel kann ein mutantes Protein der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um einen Defekt in einem natürlichen Rezeptor in einem Zielgewebe, einen Defekt in einem intrazellulären Signalgebungs-Signalweg und/oder einen Defekt in anderen Ereignissen zu umgehen, die auf die Eigenschaften einer (von) Subdomäne(n) angewiesen sind, die mit der Erkennung einer Einheit per se assoziiert sind, im Gegensatz zu den Eigenschaften, die mit der funktionellen/biologischen Aktivität assoziiert sind, die in (einer) anderen Subdomäne(n) verkörpert werden. Der Fachmann wird in Anbetracht der vorliegenden Tatsachen und Umstände erkennen, wenn solche mutante Proteine geeignet sind. Die Optimierung erfordert Routine-Experimentieren und Durchschnittsfachwissen.
  • Beispiel 10. Bestimmen der Bindungsaktivität eines auf OP-1 basierenden mutanten
  • Konstrukts
  • Zellen, die einen OP-1-Rezeptor auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, werden in 35 mm-Schalen ausplattiert und für 48 Stunden in DMEM (Duibecco-modifiziertes Eagle-Medium) plus 10% fötales Kälberserum inkubiert. Gereinigtes OP-1 oder ein OP-1-Analog wird mit Na125I durch Chloramin-T-Oxidation, das vorzugsweise eine spezifische Aktivität von etwa 50-100 mCi/mg hat, im Wesentlichen durch Befolgen des Protokolls von Frolik et al. (1984) J. Biol. Chem. 595: 10995-11000, iodiert. Markiertes OP-1 oder ein OP-1-Analog wird dann unter Verwendung einer Standard-Vorgehensweise, z.B. durch chromatographische Auftrennung gereinigt. Die ausplattierten Zellen werden dann zweimal mit physiologisch-gepufferter Salzlösung in der Anwesenheit von 0,1% BSA gewaschen und bei 22°C in der Anwesenheit von BSA, Puffer und markiertem OP-1 (1 ng) und verschiedener Konzentrationen (z.B. 0-10 mg/ml) eines unmarkierten Konkurrenten, z.B. eines unmarkierten OP-1 oder einer auf OP-1 basierenden Mutante, inkubiert. Nach der Bindung werden die Zellen dreimal mit kalten Puffer gewaschen, in 0,5 ml 0,5 N NaOH solubilisiert, aus der Schale entfernt, und die Radioaktivität wird durch Gamma- oder Szintillationszähler bestimmt. Die Daten werden dann als Prozent Hemmung ausgedrückt, wobei 100% Hemmung der spezifischen Bindung der Unterschied zwischen der Bindung in der Abwesenheit des Konkurrenten und der Bindung in der Anwesenheit eines 100-fach molaren Überschusses eines unmarkierten Konkurrenten ist. Die Bindungsparameter werden vorzugsweise unter Verwendung eines Computerprogramms wie LIGAND (Munsun et al. (1980) Anal. Biochem. 107: 220-259) bestimmt. Nach Durchführen des Tests wird in Betracht gezogen, dass die auf OP-1 basierende Mutante eine spezifische Bindungsaktivität für den OP-1-Rezeptor haben kann. Nach Bestätigung der Bindungsaktivität kann die Mutante danach auf andere Anzeichen von biologischer Aktivität getestet werden.
  • Beispiel 11. Andere Anzeichen von biologischen Aktivitäten eines auf OP-1 basierenden mutanten Konstrukts
  • Die biologische Aktivität des resultierenden auf OP-1 basierenden mutanten Konstrukts kann unter Verwendung irgendeines der in vivo- und in vitro-Standardtests bestimmt werden, die typischerweise für das Bewerten der natürlichen OP-1-Aktivität verwendet werden. Eine Vielfalt von zusätzlichen beispielhaften Tests wird nachstehend im Detail dargelegt.
  • A. Vorläuferzell-Stimulierung
  • Das folgende Beispiel ist gestaltet, um die Fähigkeit von auf OP-1 basierenden Mutanten zu zeigen, die Proliferation von mesenchymalen Vorläuferzellen zu stimulieren. Nützliche naive Stammzellen schließen pluripotente Stammzellen, die aus Knochenmark oder Nabelschnurblut unter Verwendung von konventionellen Methodiken isoliert werden können (siehe zum Beispiel Faradji et al. (1988) Vax Sang. 55 (3): 133-138 oder Bronxmeyer et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 3828-2832), sowie naive Stammzellen, die aus Blut erhalten werden, ein. Alternativ können embryonale Zellen (z.B. aus einer kultivierten mesodermalen Zelllinie) verwendet werden.
  • Ein anderes Verfahren zum Erhalten von Vorläuferzellen und zum Bestimmen der Fähigkeit von auf OP-1 basierenden Mutanten, die Zellproliferation zu stimulieren, ist, Vorläuferzellen aus einer in vivo-Quelle einzufangen. Zum Beispiel kann ein biologisch verträgliches Matrixmaterial, das in der Lage ist, den Einstrom von wandernden Vorläuferzellen zu erlauben, lange genug an einer in vivo-Stellen implantiert werden, um den Einstrom von wandernden Vorläuferzellen zu erlauben. Zum Beispiel kann eine Knochen-abstammende Guanidin-extrahierte Matrix, die formuliert ist, wie zum Beispiel in Sampath et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6591-6595, oder dem U.S.-Patent Nr. 4,975,526 , offenbart, im Wesentlichen unter Befolgen des Verfahrens von Sampath et al. in eine subcutane Stelle einer Ratte implantiert werden. Nach drei Tagen wird das Implantat entfernt, und die Vorläuferzellen, die mit der Matrix assoziiert sind, werden dispergiert und kultiviert.
  • Die Vorläuferzellen, wie immer sie erhalten wurden, werden dann in vitro mit der auf OP-1 basierenden Mutante unter Zellkultur-Standardbedingungen wie jenen, die hierin nachstehend beschrieben sind, inkubiert. In der Abwesenheit von externen Stimuli proliferieren die Vorläuferzellen alleine in Kultur nicht oder nur minimal. Es wird jedoch in Betracht gezogen, dass die Vorläuferzellen, die in der Anwesenheit einer biologisch aktiven OP-1-Mutante wie OP-1 kultiviert werden, proliferieren werden. Das Zellwachstum kann visuell oder spektrophotometrisch unter Verwendung von Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, bestimmt werden.
  • B. Morphogen-induzierte Zelldifferenzierung
  • Eine Vielfalt von Tests kann verwendet werden, um eine auf OP-1 basierende zelluläre Differenzierung zu bestimmen.
  • 1. Embryonale mesenchymale Differenzierung
  • Wie mit dem natürlichen OP-1 wird in Betracht gezogen, dass auf OP-1 basierende Mutanten verwendet werden können, um eine Zelldifferenzierung zu induzieren. Die Fähigkeit, eine Zelldifferenzierung zu induzieren, kann durch Kultivieren von frühen mesenchymalen Zellen in der Anwesenheit des mutanten Proteins und dann Untersuchen der Histologie der kultivierten Zellen durch Färben mit Toluidinblau unter Verwendung von Standard-Zellkultur- und Zellfärbungs-Methodiken, die auf dem Fachgebiet gut beschrieben sind, gezeigt werden. Zum Beispiel ist es bekannt, dass mesenchymale Rattenzellen, die dazu bestimmt sind, Unterkieferknochen zu werden, wenn sie im Stadium 11 von den übergeschichteten epithelialen Zellen getrennt und in vitro unter Gewebekultur-Standardbedingungen, z.B. in einem chemisch-definierten, serumfreien Medium, enthaltend zum Beispiel 67% DMEM (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium), 22% F-12-Medium, 10 mM Hepes pH 7, 2 mM Glutamin, 50 mg/ml Transferring, 25 mg/ml Insulin, Spurenelemente, 2 mg/ml bovines Serumalbumin, gekoppelt an Ölsäure, mit HAT (0,1 mM Hypoxanthin, 10 mM Aminopterin, 12 mM Thymidin), kultiviert werden, nicht fortfahren werden, sich zu differenzieren. Wenn jedoch dieselben Zellen für einen zusätzlichen Tag im Kontakt mit dem überschichteten Endoderm belassen werden, zu welcher Zeit sie Stadium 12-Zellen werden, werden sie fortfahren, sich alleine in vitro zu differenzieren, um Chondrocyten zu bilden. Eine weitere Differenzierung in Osteoblasten und schlussendlich Unterkieferknochen erfordert eine geeignete lokale Umgebung, z.B. eine vaskularisierte Umgebung.
  • Es wird erwartet, dass wie mit natürlichem OP-1 die mesenchymalen Stadium 11-Zellen, die in vitro in der Anwesenheit einer OP-1-Mutante, z.B. 10-100 ng/ml, kultiviert werden, fortfahren werden, sich in vitro zu differenzieren, um Chondrocyten zu bilden, genau wie sie fortfahren, sich in vitro zu differenzieren, wenn sie mit den Zellprodukten, die von den überschichteten endodermalen Zellen geerntet werden, kultiviert werden. Dieses Experiment kann mit verschiedenen mesenchymalen Zellen durchgeführt werden, um die Zelldifferenzierungsfähigkeit zu zeigen.
  • 2. Alkalische Phosphatase-Induktion von Osteoblasten.
  • Als ein anderes Beispiel einer Morphogen-induzierten Zelldifferenzierung kann die Fähigkeit von OP-1-Mutanten, eine Osteoblasten-Differenzierung zu induzieren, in vitro unter Verwendung von primären Osteoblasten-Kulturen oder Osteoblasten-ähnlichen Zelllinien und Testen auf eine Vielfalt von Knochenzell-Markern, die spezifische Marker für den differenzierten Osteoblasten-Phänotyp sind, z.B. alkalische Phosphatase-Aktivität, Nebenschilddrüsenhormon-vermittelte cyclische AMP (cAMP)-Produktion, Osteocalcin-Synthese und verstärkte Mineralisierungsraten, gezeigt werden.
  • Kultivierte Osteoblasten in serumfreiem Medium werden mit einem Bereich von OP-1-Mutante-Konzentrationen, zum Beispiel 0,1, 1,0, 10,0, 40,0 oder 80,0 ng OP-1-Mutante/ml Medium; oder mit einem ähnlichen Konzentrationsbereich von natürlichem OP-1 oder TGF-β inkubiert. Nach einer 72 Stunden-Inkubation wird die Zellschicht mit 0,5 ml 1% Triton X-100 extrahiert. Der resultierende Zellextrakt wird zentrifugiert, und 100 μl des Extrakts werden zu 90 μl eines Paranitroso phenylphosphat (PNPP)/Glycerin-Gemischs zugefügt und für 30 Minuten in einem 37°C-Wasserbad inkubiert, und die Reaktion wird mit 100 μl 0,2N NaOH gestoppt. Die Proben werden dann durch ein Plattenlesegerät (z.B. Dynatech MR700 Plattenlesegerät, und die Absorption unter Verwendung von p-Nitrophenol als Standard bei 400 nm gemessen) laufen gelassen, um das Vorliegen und die Menge der alkalischen Phosphatase-Aktivität zu bestimmen. Die Proteinkonzentrationen werden durch das BioRad-Verfahren bestimmt. Die alkalische Phosphatase-Aktivität wird in Einheiten/μg Protein berechnet, wobei 1 Einheit = 1 nmol freigesetztes p-Nitrophenol/30 Minuten bei 37°C.
  • Die OP-1-Mutante stimuliert wie natürliches OP-1 alleine die Produktion von alkalischer Phosphatase in Osteoblasten, wodurch das Wachstum und die Expression des Osteoblasten-differenzierten Phänotyps gefördert werden.
  • Die Langzeitwirkung der OP-1-Mutante auf die Produktion der alkalischen Phosphatase durch Ratten-Osteoblasten kann auch wie folgt gezeigt werden.
  • Ratten-Osteoblasten werden in Platten mit mehreren Vertiefungen vorbereitet und kultiviert, wie oben beschrieben. In diesem Beispiel werden sechs Gruppen von Platten mit 24 Vertiefungen mit 50 000 Ratten-Osteoblasten pro Vertiefung ausplattiert. Die Vertiefungen in jeder Platte, die, wie vorstehend beschrieben, vorbereitet wurden, werden dann in drei Gruppen geteilt: (1) jene, die zum Beispiel 1 ng der OP-1-Mutante pro ml Medium erhalten; (2) jene, die 40 ng der OP-1-Mutante pro ml Medium erhalten; und (3) jene, die 80 ng der OP-1-Mutante pro ml Medium erhalten. Jede Platte wird dann für unterschiedliche Zeiträume inkubiert: 0 Stunden (Kontrollzeit), 24 Stunden, 48 Stunden, 96 Stunden, 120 Stunden und 144 Stunden. Nach jedem Inkubationszeitraum wird die Zellschicht mit 0,5 ml 1% Triton X-100 extrahiert. Der resultierende Zellextrakt wird zentrifugiert und die alkalische Phosphatase-Aktivität unter Verwendung von Paranitroso-phenylphosphat (PNPP) wie vorstehend bestimmt. Die OP-1-Mutante wird wie natürliche OP-1 die Produktion von alkalischer Phosphatase in Osteoblasten in einer dosisabhängigen Weise stimulieren, sodass steigende Dosen der OP-1-Mutante den Spiegel der alkalischen Phosphatase-Produktion weiter steigern werden. Darüber hinaus wird in Betracht gezogen, dass die OP-1-Mutante-stimulierten erhöhten Spiegel der alkalischen Phosphatase in den behandelten Osteoblasten für einen ausgedehnten Zeitraum anhalten werden.
  • 3. Induktion von PTH-vermitteltem cAMP.
  • Dieses Experiment ist gestaltet, um die Wirkung einer OP-1-Mutante auf die Nebenschilddrüsenhormon-vermittelte cAMP-Produktion in Ratten-Osteoblasten in vitro zu testen. Kurz, Ratten-Osteoblasten werden in einer Platte mit mehreren Vertiefungen vorbereitet und kultiviert, wie vorstehend beschrieben. Die kultivierten Zellen werden dann in vier Gruppen geteilt: (1) Vertiefungen, die zum Beispiel 1,0, 10,0 und 40,0 ng der OP-1-Mutante/ml Medium erhalten; (2) Vertiefungen, die zum Beispiel natürliches OP-1 in ähnlichen Konzentrationsbereichen erhalten; (3) Vertiefungen, die zum Beispiel TGF-β in ähnlichen Konzentrationsbereichen erhalten; und (4) eine Kontrollgruppe, die keine Wachstumsfaktoren erhält. Die Platte wird dann für weitere 72 Stunden inkubiert. Am Ende der 72 Stunden werden die Zellen mit Medium, enthaltend 0,5% bovines Serumalbumin (BSA) und 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin, für 20 Minuten behandelt, gefolgt von der Zugabe von menschlichem rekombinantem Nebenschilddrüsenhormon (hPTH, Sigma, St. Louis) in einer Konzentration von 200 ng/ml in die Hälfte der Vertiefungen für 10 Minuten. Die Zellschicht wird dann aus jeder Vertiefung mit 0,5 ml 1% Triton X-100 extrahiert. Die CAMP-Spiegel werden dann unter Verwendung eines Radioimmuntest-Kits (z.B. Amersham, Arlington Heights, Illinois) bestimmt. Die OP-1-Mutante alleine wird wie OP-1 einen Anstieg in der PTH-vermittelten cAMP-Antwort stimulieren, wodurch das Wachstum und die Expression des Osteoblasten-differenzierten Phänotyps gefördert werden.
  • 4. Induktion der Osteocalcin-Produktion.
  • Osteocalcin ist ein Knochen-spezifisches Protein, das durch Osteoblasten synthetisiert wird und eine integrale Rolle in der Rate der Knochenmineralisierung in vivo spielt. Zirkulierende Spiegel von Osteocalcin im Serum werden als ein Marker für die Osteoblasten-Aktivität und Knochenbildung in vivo verwendet. Die Induktion der Osteocalcin-Synthese in Osteoblasten-angereicherten Kulturen kann verwendet werden, um die Wirksamkeit einer OP-1-Mutante in vitro zu zeigen.
  • Ratten-Osteoblasten werden wie vorstehend in einer Platte mit mehreren Vertiefungen vorbereitet und kultiviert. In diesem Experiment wird das Medium mit 10% FBS ergänzt, und am Tag 2 werden die Zellen mit frischem Medium, ergänzt mit 10 mM frischem β-Glycerophosphat (Sigma, Inc.) gefüttert. Beginnend am Tag 5 und zweimal wöchentlich danach werden die Zellen mit einem vollständigen Mineralisierungsmedium, enthaltend alle der obigen Komponenten plus frisches L(+)-Ascorbat in einer Endkonzentration von 50 mg/ml Medium gefüttert. Die OP-1-Mutante wird dann direkt zu den Vertiefungen zugegeben, z.B. in 50% Acetonitril (oder 50% Ethanol), enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) zu nicht mehr als 5 ml Mutante/ml Medium. Kontrollvertiefungen erhalten nur Lösungsmittelvehikel. Die Zellen werden dann wieder gefüttert, und die konditionierte Mediumprobe wird 1:1 in einem Radioimmuntest-Standardpuffer, enthaltend Standard-Proteaseinhibitoren, verdünnt und bis zum Testen auf Osteocalcin bei –20°C gelagert. Die Osteocalcin-Synthese wird durch einen Standard-Radioimmuntest unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Osteocalcin-spezifischen Antikörpers gemessen.
  • Die Mineralisierung wird auf Langzeitkulturen (13 Tage) unter Verwendung einer modifizierten von Kossa-Färbungstechnik auf fixierten Zellschichten bestimmt: Die Zellen werden in frischem 4% Paraformaldehyd bei 23°C für 10 min fixiert, gefolgt von Spülen mit kaltem 0,9% NaCl. Die fixierten Zellen werden dann auf endogene alkalische Phosphatase bei pH 9,5 für 10 min unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Sigma, Inc.) gefärbt. Violett gefärbte Zellen werden dann mit Methanol dehydriert und luftgetrocknet. Nach 30 min Inkubation in 3% AgNO3 im Dunkeln werden die H2O-gespülten Proben für 30 sec einem 254 nm-UV-Licht ausgesetzt, um die schwarz-silber-gefärbten Phosphatknötchen zu entwickeln. Individuelle mineralisierte Foci (mindestens 20 mm groß) werden unter einem Stereomikroskop gezählt und als Knötchen/Kultur ausgedrückt.
  • Die OP-1-Mutante wird wie das natürliche OP-1 die Osteocalcin-Synthese in Osteoblasten-Kulturen stimulieren. Darüber hinaus wird die verstärkte Osteocalcin-Synthese als Antwort auf die OP-1-Mutante in einer dosisabhängigen Weise stattfinden, wodurch nach 13 Tagen der Inkubation ein signifikanter Anstieg über den Grundwert gezeigt wird. Die verstärkte Osteocalcin-Synthese kann auch durch Nachweisen der erhöhten Osteocalcin-mRNA-Botschaft (20-facher Anstieg) unter Verwendung einer Ratten-Osteocalcin-spezifischen Sonde bestätigt werden. Zusätzlich korreliert der Anstieg in der Osteocalcin-Synthese mit einer erhöhten Mineralisierung ein Osteoblasten-Langzeitkulturen, bestimmt durch das Auftreten von Mineralknötchen. Es wird auch in Betracht gezogen, dass die OP-1-Mutante wie natürliches OP-1 die anfängliche Mineralisierungsrate im Vergleich zu unbehandelten Kulturen signifikant erhöhen wird.
  • 5. Morphogen-induzierte CAM-Expression.
  • Native Mitglieder der vg/dpp-Subgruppe induzieren eine CAM-Expression, insbesondere die N-CAM-Expression, als Teil ihrer Induktion der Morphogenese (siehe gleichzeitig anhängiges USSN 922,813). CAMs sind morphoregulatorische Moleküle, die in allen Geweben als ein wesentlicher Schritt in der Gewebeentwicklung identifiziert werden. N-CAMs, die mindestens 3 Isoformen (N-CAM-180, N-CAM-140 und N-CAM-120, wobei „180", „140" und „120" die offensichtlichen Molekulargewichte der Isoformen, gemessen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, anzeigen) umfassen, werden zu mindest transient in entstehenden Geweben und permanent im Nervengewebe exprimiert. Sowohl die N-CAM-180 als auch die N-CAM-140-Isoformen werden sowohl in sich entwickelndem als auch in erwachsenem Gewebe exprimiert. Die N-CAM-120-Isoform wird nur in erwachsenem Gewebe gefunden. Ein anderes neurales CAM ist L1.
  • Die Fähigkeit von auf OP-1 basierenden Mutanten, eine CAM-Expression zu stimulieren, kann unter Verwendung des folgenden Protokolls unter Verwendung von NG108-15-Zellen gezeigt werden. NG108-15 ist eine transformierte Hybrid-Zelllinie (Neuroblastom × Gliom, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD), die ein Morphologie-Charakteristikum von transformierten embryonalen Neuronen zeigt. Wie im Beispiel D nachstehend beschrieben, zeigen unbehandelte NG108-15-Zellen eine fibroblastische oder minimal differenzierte Morphologie und exprimieren nur die 180- und 140-Isoformen von N-CAM, die normalerweise mit einer sich entwickelnden Zelle assoziiert sind. Nach der Behandlung mit Mitgliedern der vg/dpp-Subgruppe zeigen diese Zellen eine Morphologie, die für erwachsene Neuronen charakteristisch ist, und exprimieren verstärkte Spiegel aller drei N-CAM-Isoformen.
  • In diesem Beispiel werden die NG108-15-Zellen für 4 Tage in der Anwesenheit von steigenden Konzentrationen entweder des OP-1-Morphons oder von natürlichem OP-1 unter Verwendung von Standard-Kulturvorgehensweisen kultiviert und Standard-Western Blots an Ganzzell-Extrakten durchgeführt. N-Cam-Isoformen werden mit einem Antikörper nachgewiesen, der mit allen drei Isoformen kreuzreagiert, mAb H28.123, erhalten von Sigma Chemical Co., St. Louis, wobei die unterschiedlichen Isoformen durch ihre verschiedenen Mobilitäten auf einem Elektrophoresegel unterscheidbar sind. Kontroll-NG108-15-Zellen (unbehandelt) exprimieren sowohl die 140 kDa- als auch die 180 kDa-Isoformen, aber nicht die 120 kDa, bestimmt durch Western Blot-Analyse unter Verwendung von bis zu 100 mg Protein. Die Behandlung von NG108-15-Zellen mit einer OP-1-Mutante resultiert wie OP-1 in einem dosisabhängigen Anstieg der Expression der 180 kDa- und 140 kDa-Isoformen sowie der Induktion der induzierten 120 kDa-Isoform. Zusätzlich wird in Betracht gezogen, dass die OP-1-Mutante- wie die natürliche OP-1-induzierte CAM-Expression mit einer Zellaggregation korrelieren kann, bestimmt durch Histologie.
  • C. Re-Differenzierung des transformierten Phänotyps
  • Die OP-1-Mutante induziert wie natürliches OP-1 auch die Re-Differenzierung von transformierten Zellen zu einer Morphologie, die für nicht transformierte Zellen charakteristisch ist. Die Beispiele, die nachstehend geliefert werden, stellen die Morphogen-induzierte Re-Differenzierung einer transformierten menschlichen Zelllinie von neuronalem Ursprung (NG108-15); sowie von Maus-Neuroblastomzellen (N1E-115) und menschlichen embryonalen Karzinomzellen in eine Morphologie, die für nicht transformierte Zellen charakteristisch ist, detailliert dar.
  • Wie vorstehend beschrieben, ist NG108-15 eine transformierte Hybridzelllinie, die durch Fusionieren von Neuroblastom- x Gliomzellen (erhalten von ATCC, Rockville, MD) produziert wird und eine Morphologie zeigt, die für transformierte embryonale Neuronen charakteristisch ist, z.B. die eine fibroblastische Morphologie haben. Genau haben die Zellen polygonale Zellkörper, kurze, stachelartige Fortsätze und treten wenig mit benachbarten Zellen in Kontakt. Die Inkubation von NG108-15-Zellen, die in einem chemisch definierten serumfreien Medium mit 0,1 bis 300 ng/ml OP-1-Mutante oder natürlichem OP-1 für vier Stunden kultiviert wurden, induziert eine geordnete, dosisabhängige Änderung in der Zellmorphologie.
  • Zum Beispiel werden NG108-15-Zellen auf Poly-L-Lysin-beschichteten Platten mit 6 Vertiefungen subkultiviert. Jede Vertiefung enthält 40-50000 Zellen in 2,5 ml chemisch definiertem Medium. Am dritten Tag werden 2,5 ml OP-1-Mutante oder natürliches OP-1 in 60% Ethanol, enthaltend 0,025% Trifluoressigsäure zu jeder Vertiefung zugefügt. Das Medium wird täglich mit neuen Aliquots des Morphogens gewechselt. Es wird in Betracht gezogen, dass die OP-1-Mutante wie OP-1 eine dosisabhängige Re-Differenzierung der transformierten Zellen, einschließlich einer Abrundung des Somas, eines Anstiegs in der Phasenhelligkeit, einer Verlängerung der kurzen Neuriten-Fortsätze und anderer signifikanter Änderungen in der zellulären Ultrastruktur, induziert. Nach einigen Tagen wird auch in Betracht gezogen, dass die behandelten Zellen beginnen, epitheloide Blätter zu bilden, die dann hochgradig gepackte, vielschichtige Aggregate werden, wie visuell bestimmt durch mikroskopische Untersuchung.
  • Darüber hinaus wird in Betracht gezogen, dass die Re-Differenzierung ohne jegliche assoziierte Änderungen in der DNA-Synthese, Zellteilung oder Zell-Lebensfähigkeit erfolgt, was es unwahrscheinlich macht, dass die morphologischen Änderungen sekundär zur Zelldifferenzierung oder einer toxischen Wirkung des Morphogens sind. Zusätzlich wird in Betracht gezogen, dass die Morphon-induzierte Re-Differenzierung die Zellteilung nicht inhibieren muss, wie bestimmt durch 3H-Thymidin-Aufnahme, im Gegensatz zu anderen Molekülen wie Butyrat, DMSO, Retinolsäure oder Forskolin, von denen in analogen Experimenten gezeigt worden ist, dass sie die Differenzierung von transformierten Zellen stimulieren. Die OP-1-Mutante bewahrt wie das natürliche OP-1 die Zellstabilität und Lebensfähigkeit nach dem Induzieren der Re-Differenzierung.
  • Das hierin beschriebene modifizierte Morphogen würde daher nützliche therapeutische Mittel für die Behandlung von Neoplasien und neoplastischen Läsionen des Nervensystems, insbesondere in der Behandlung von Neuroblastomen, einschließlich der Retinoblastome und Gliome, bereitstellen.
  • D. Bewahren des Phänotyps.
  • Die OP-1-Mutante kann wie natürliches OP-1 auch verwendet werden, um den differenzierten Phänotyp einer Zelle zu bewahren. Diese Anwendung ist besonders für das Induzieren der kontinuierlichen Expression des Phänotyps in alternden oder ruhenden Zellen nützlich.
  • 1. In vitro-Modell für das phänotypische Bewahren.
  • Die Fähigkeit des phänotypischen Bewahrens von Morphogenen wird leicht bestimmt. Eine Reihe von differenzierten Zellen wird nach mehreren Passagen in vitro unter Standard-Gewebekulturbedingungen, die auf dem Fachgebiet gut beschrieben sind (z.B. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, C. R. Freshney, Hrsg., Wiley, 1987), alternd oder ruhend. Wenn diese Zellen jedoch in vitro in Assoziation mit einem natürlichen Morphogen wie OP-1 kultiviert werden, werden die Zellen stimuliert, die Expression ihres Phänotyps durch mehrere Passagen zu bewahren. Zum Beispiel wird die alkalische Phosphatase-Aktivität von kultivierten Osteoblasten wie kultivierten Osteosarkomzellen und Schädeldachzellen nach mehreren Passagen in vitro signifikant reduziert. Wenn die Zellen jedoch in der Anwesenheit von OP-1 kultiviert werden, wird die alkalische Phosphatase-Aktivität über längere Zeiträume bewahrt. In ähnlicher Weise wird auch die phänotypische Expression von Myocyten in der Anwesenheit eines Morphogens bewahrt. Im Experiment werden die Osteoblasten kultiviert, wie oben beschrieben. Die Zellen werden in Gruppen unterteilt, mit variierenden Konzentrationen von entweder der OP-1-Mutante oder dem natürlichen OP-1 (z.B. 0-300 ng/ml) inkubiert und mehrere Male (z.B. 3-5 Mal) unter Verwendung einer Standard-Methodik passagiert. Die passagierten Zellen werden dann auf die alkalische Phosphatase-Aktivität als einen Hinweis auf die metabolische Funktion der differenzierten Zelle getestet, wie hierin beschrieben. Es wird in Betracht gezogen, dass Osteoblasten, die in der Abwesenheit der OP-1-Mutante kultiviert werden, wie bei der des natürlichen OP-1 eine reduzierte alkalische Phosphatase-Aktivität im Vergleich zu mit der OP-1-Mutante oder dem natürlichen OP-1 behandelten Zellen haben.
  • 2. In vivo-Modell für das phänotypische Bewahren.
  • Die Fähigkeit des phänotypischen Bewahrens kann auch in vivo unter Verwendung eines Standard-Rattenmodells für Osteoporose gezeigt werden. Weibliche Long Evans-Ratten (Charles River Laborstories, Wilmington, MA) werden Schein-operiert (Kontrolltiere) oder unter Verwendung von chirurgischen Standardtechniken ovarektomiert, um einen osteoporotischen Zustand zu produzieren, der aus der verminderten Östrogenproduktion resultiert. Nach der Operation, z.B. 200 Tage nach der Ovarektomie, wird den Ratten systemisch phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) oder Morphogen (z.B. eine OP-1-Mutante oder natürliches OP-1, 1-10 mg) für 21 Tage (z.B. durch tägliche Schwanzvenen-Injektion) verabreicht. Die Ratten werden dann getötet, und alkalische Phosphatase-Serumspiegel, Calcium-Serumspiegel und Osteocalcin-Serumspiegel werden unter Verwendung von Standardmethodiken bestimmt, wie hierin und oben beschrieben. Es wird in Betracht gezogen, das die mit der OP-1-Mutante behandelten Ratten wie die OP-1-behandelten Ratten erhöhte Spiegel von Osteocalcin und alkalischer Phosphatase-Aktivität zeigen können. Eine histomorphometrische Analyse des Tibia-Diaphyse-Knochens zeigt eine verbesserte Knochenmasse in mit der OP-1-Mutante behandelten Tieren im Vergleich zu unbehandelten ovarektomierten Ratten.
  • E. Proliferation von Vorläuferzell-Populationen.
  • Vorläuferzellen können stimuliert werden, um in vivo oder ex vivo zu proliferieren. Es wird in Betracht gezogen, dass Zellen in vivo durch Injizieren oder anderweitiges Liefern eines sterilen Präparats, enthaltend die OP-1-Mutante, in das Individuum stimuliert werden können. Zum Beispiel kann die hämatopoietische pluripotente Stammzelt-Population eines Individuums durch Injektion oder anderweitiges Verabreichen einer geeigneten Konzentration einer OP-1-Mutante an das Knochenmark des Individuums stimuliert werden, zu proliferieren.
  • Vorläuferzellen können ex vivo durch Inkontaktbringen von Vorläuferzellen der Population, die verstärkt werden soll, mit einer morphogen aktiven OP-1-Mutante unter sterilen Bedingungen in einer Konzentration und für einen Zeitraum, die/der ausreicht, um die Proliferation der Zellen zu stimulieren, stimuliert werden. Geeignete Konzentrationen und Stimulationszeiten können empirisch bestimmt werden, im Wesentlichen durch Befolgen der Vorgehensweise, die im Beispiel A vorstehend beschrieben ist. Die OP-1-Mutante-Konzentration von zwischen etwa 0,1-100 ng/ml und eine Stimulierungsdauer von etwa 10 Minuten bis etwa 72 Stunden oder allgemeiner etwa 24 Stunden sollte typischerweise ausreichen, um eine Zellpopulation von etwa 104 bis 106 Zellen zu stimulieren. Die stimulierten Zellen können dann an das Individuum zum Beispiel durch Injizieren der Zellen an eine geeignete in vivo-Stelle verabreicht werden. Geeignete biologisch verträgliche Vorläuferzellen können durch ein beliebiges Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt oder hierin vorstehend beschrieben sind, erhalten werden.
  • F. Regenerierung von geschädigtem oder erkranktem Gewebe.
  • OP-1-Mutanten können verwendet werden, um erkranktes oder geschädigtes Säugergewebe zu reparieren. Das Gewebe, das repariert werden soll, wird vorzugsweise zuerst bewertet und überschüssiges nekrotisches oder störendes Narbengewebe, wie benötigt, z.B. durch Abtragen oder durch chirurgische, chemische oder andere Verfahren, die auf dem medizinischen Fachgebiet bekannt sind, entfernt.
  • Die OP-1-Mutante kann dann direkt an die Gewebestelle als Teil einer sterilen, biologisch verträglichen Zusammensetzung entweder durch chirurgische Implantation oder Injektion verabreicht werden. Die Mutante kann auch systemisch wie durch orale oder parenterale Verabreichung geliefert werden. Alternativ kann eine sterile, biologisch verträgliche Zusammensetzung, enthaltend Vorläuferzellen, die durch eine morphogen aktive OP-1-Mutante stimuliert wurden, an die Gewebestelle verabreicht werden. Das vorliegende Gewebe an der Stelle, ob erkrankt oder geschädigt, liefert die geeignete Matrix, um die Proliferation und gewebespezifische Differenzierung der Vorläuferzellen zu ermöglichen. Zusätzlich liefert eine geschädigte oder erkrankte Gewebestelle, insbesondere eine, die durch chirurgische Mittel weiter verletzt worden ist, eine morphogen permissive Umgebung. Eine systemische Bereitstellung einer OP-1-Mutante kann für bestimmte Anwendungen ausreichend sein (z.B. in der Behandlung von Osteoporose und anderer Störungen des Knochen-Umgestaltungszyklus als ein Beispiel).
  • Unter manchen Umständen, besonders wo die Gewebeschädigung ausgedehnt ist, kann das Gewebe nicht zum Bereitstellen einer ausreichenden Matrix für den Zelleinstrom und die Proliferation in der Lage sein. Unter diesen Umständen kann es nötig sein, Vorläuferzellen, die durch die OP-1-Mutante stimuliert wurden, an die Gewebestelle in Assoziation mit einer geeigneten biologisch verträglichen, formulierten Matrix bereitzustellen, die durch eines der Mittel, die nachstehend beschrieben werden, hergestellt wurde. Die Matrix ist vorzugsweise in vivo biologisch abbaubar. Die Matrix kann auch gewebespezifisch sein und/oder kann poröse Partikel umfassen, die Dimensionen im Bereich von 70-850 mm, am meisten bevorzugt 150-420 mm haben.
  • Die OP-1-Mutante kann auch verwendet werden, um eine Immun/Entzündungsantwort-vermittelte Gewebeschädigung und Narbengewebe-Bildung nach einer Verletzung zu verhindern oder wesentlich zu hemmen. Die OP-1-Mutante kann an eine frisch verletzte Gewebestelle verabreicht werden, um an der Stelle eine Gewebemorphogenese zu induzieren, was die Aggregation von migrierenden Fibroblasten in nicht differenziertes Bindegewebe verhindert. Vorzugsweise kann die OP-1-Mutante als ein steriles pharmazeutisches Präparat, das innerhalb von fünf Stunden der Verletzung in die Gewebestelle injiziert wird, bereitgestellt werden. Wo eine Immun/Entzündungsantwort unvermeidbar oder als Teil zum Beispiel einer chirurgischen oder anderen aggressiven klinischen Therapie willkürlich induziert ist, kann die OP-1-Mutante vorzugsweise prophylaktisch, vor oder begleitend mit der Therapie an den Patienten verabreicht werden.
  • G. Morphogenese-Tests.
  • Nachstehend folgen einige Beispiele, die Protokolle für die Demonstration, dass die hierin offenbarten mutanten Proteine verwendet werden können, um eine Gewebemorphogenese zu induzieren, beschreiben. Als Beispiel ist das Folgende eine Beschreibung einer OP-1-Mutante-induzierten Gewebemorphogenese in Knochen-, Leber-, Nerven-, Dentin-, Zement- und Periodontal-Gewebe.
  • 1. OP-1-Mutante-induzierte Knochenmorphogenese.
  • Wie früher beschrieben, ist ein besonders nützliches Säugergewebe-Modellsystem zum Demonstrieren und Bewerten der morphogenen Aktivität eines Proteins das endochondrale Knochengewebe-Morphogenesemodell, das auf dem Fachgebiet bekannt und zum Beispiel im U.S. Patent Nr. 4,968,590 beschrieben und hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Fähigkeit, eine endochondrale Knochenbildung zu induzieren, schließt die Fähigkeit, eine Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen in Chondroblasten und Osteoblasten, die Fähigkeit, eine Knorpelmatrix-Bildung, Knorpel-Verkalkung und Knochen-Umgestaltung zu induzieren, und die Fähigkeit, die Bildung einer geeigneten vaskulären Bereitstellung und eine hämatopoietische Knochenmark-Differenzierung zu induzieren, ein.
  • Die lokale Umgebung, in der das morphogene Material platziert wird, ist wichtig für die Gewebemorphogenese. Wie hierin verwendet, wird verstanden, dass „eine lokale Umgebung" die strukturelle Gewebematrix und die Umgebung, die das Gewebe umgibt, einschließt. Zum Beispiel benötigen die Zellen, die durch Morphogene stimuliert werden, zusätzlich zum Benötigen eines geeigneten Verankerungssubstrats für ihre Proliferation Signale, um die Gewebespezifität ihrer Differenzierung zu lenken. Diese Signale variieren für die verschiedenen Gewebe und können Zelloberflächen-Marken einschließen. Zusätzlich erfordert die Vaskularisierung von neuem Gewebe eine lokale Umgebung, die die Vaskularisierung unterstützt.
  • Das Folgende legt verschiedene Vorgehensweisen für das Bewerten der morphogenen in vivo-Ausnutzung einer OP-1-Mutante und von eine OP-1-Mutante enthaltenden Zusammensetzungen dar. Die Zusammensetzungen können in einen Säuger injiziert oder chirurgisch implantiert werden, gefolgt von einer beliebigen einer Reihe von Vorgehensweisen, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Zum Beispiel können chirurgische Implantat-Biotests durchgeführt werden, die im Wesentlichen der Vorgehensweise von Sampath et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6591-6595 und U.S. Pat. Nr. 4,968,590 folgen.
  • Eine histologische Schnittdarstellung und Färbung wird bevorzugt, um das Ausmaß der Morphogenese in vivo, insbesondere der Gewebereparatur-Vorgehensweisen, zu bestimmen. Exzidierte Implantate werden in Bouins-Lösung fixiert, in Paraffin eingebettet und in 6-8 mm-Schnitte geschnitten. Die Färbung mit Toluidinblau oder Hämatoxylin/Eosin zeigt deutlich die schlussendliche Entwicklung des neuen Gewebes. Zwölf Tage-Implantate sind normalerweise ausreichend, um zu bestimmen, ob die Implantate neu induziertes Gewebe enthalten.
  • Erfolgreiche Implantate zeigen ein kontrolliertes Fortschreiten durch die Stadien der induzierten Gewebeentwicklung, was es einem ermöglicht, die gewebespezifischen Ereignisse, die auftreten, zu identifizieren und zu verfolgen. Zum Beispiel schließt die endochondrale Knochenbildung die Stadien ein: (1) Leukocyten am Tag eins; (2) mesenchymale Zellmigration und Proliferation an den Tagen zwei und drei; (3) Chondrocyten-Auftreten an den Tagen fünf und sechs; (4) Knorpelmatrix-Bildung am Tag sieben; (5) Knorpel-Verkalkung am Tag acht; (6) Gefäßinvasion, Auftreten von Osteoblasten und Bildung von neuem Knochen an den Tagen neun und zehn; (7) Auftreten von osteoklastischen Zellen und das Beginnen der Knochen-Umgestaltung und Auflösung der implantierten Matrix an den Tagen zwölf bis achtzehn; und (8) hämatopoietische Knochenmark-Differenzierung in den resultierenden Knöchelchen am Tag einundzwanzig.
  • Zusätzlich zur histologischen Bewertung können biologische Marker als Marker für die Gewebemorphogenese verwendet werden. Nützliche Marker schließen gewebespefizische Enzyme ein, deren Aktivität nach Homogenisieren des Implantats getestet werden kann (z.B. spektrophotometrisch). Diese Tests können für die Quantifizierung und für das schnelle Erhalten einer Schätzung der Gewebebildung nützlich sein, nachdem die Implantate vom Tier entfernt sind. Zum Beispiel kann die alkalische Phosphatase-Aktivität als ein Marker für die Osteogenese verwendet werden.
  • Das Inkorporieren einer systemisch bereitgestellten OP-1-Mutante kann unter Verwendung eines markierten Proteins (z.B. radioaktiv markiert) und Bestimmen ihrer Lokalisation im neuen Gewebe und/oder durch Überwachen ihres Verschwindens aus dem Kreislaufsystem unter Verwendung eines Standard-Markierungsprotokolls und Puls-Verfolgungsverfahrens verfolgt werden. Die OP-1-Mutante kann auch mit einer gewebespezifischen molekularen Markierung geliefert werden, deren Aufnahme überwacht und mit der Konzentration der bereitgestellten OP-1-Mutante korreliert werden kann. Als ein Beispiel resultiert die Ovar-Entfernung in weiblichen Ratten in einer reduzierten Knochen-alkalische Phosphatase-Aktivität und macht die Ratten anfällig für Osteoporose. Wenn jetzt die weiblichen Ratten mit der OP-1-Mutante beliefert werden, kann eine Reduktion in der systemischen Konzentration von Calcium gesehen werden, die mit dem Vorliegen der bereitgestellten OP-1-Mutante korreliert und von der erwartet wird, dass sie einer erhöhten alkalische Phosphatase-Aktivität entspricht.
  • 2. OP-1-Mutante-induzierte Leberregeneration.
  • Als ein anderes Beispiel wird ein Verfahren zum Induzieren der Morphogenese eines wesentlich verletzten Lebergewebes nach einer teilweisen Hepatektomie unter Ausnutzen einer OP-1-Mutante präsentiert. Variationen dieses allgemeinen Protokolls können verwendet werden, um die Morphogen-Aktivität einer OP-1-Mutante in anderen verschiedenen Geweben zu testen. Das allgemeine Verfahren involviert das Exzidieren eines im Wesentlichen nicht-regenerierenden Teils eines Gewebes und das Bereitstellen der OP-1-Mutante vorzugsweise als ein lösliches Arzneimittel an die exzidierten Gewebestelle, das Verschließen der Wunde und das Untersuchen der Stelle zu einem späteren Zeitpunkt. Wie Knochen hat die Leber ein Potenzial, nach einer Verletzung während des post-fötalen Lebens zu regenerieren.
  • Die OP-1-Mutante, z.B. 1 mg/ml in einer biologisch verträglichen Lösung, zum Beispiel eine gereinigte OP-1-Mutante, wird in 50% Ethanol oder einem verträglichen Lösungsmittel, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure oder eine verträgliche Säure, solubilisiert. Die injizierbare OP-1-Mutanten-Lösung wird z.B. durch Verdünnen eines Volumens OP-1-Morphon-Lösungsmittel-Säure-Stammlösung mit 9 Volumen 0,2% Ratten-Serumalbumin in sterilem PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) hergestellt.
  • In dem Experiment werden die wachsenden Ratten oder alternden Ratten (z.B. Long Evans, Charles River Laborstories, Wilmington, MA) durch Verwenden von Ketamin anästhesiert. Zwei der Leberlappen (links und rechts) werden ausgeschnitten (ungefähr 1/3 des Lappens), und die OP-1-Mutante wird lokal an mehreren Stellen entlang der geschnittenen Enden injiziert. Die Menge der OP-1-Mutante, die injiziert wird, kann z.B. 20-100 μg in 100-1000 μl PBS/RSA (phosphatgepufferte Salzlösung/Ratten-Serumalbumin)-Injektionspuffer sein. Placebo-Proben umfassen nur den Injektionspuffer. In den experimentellen Tests werden vorzugsweise fünf Ratten in jeder Gruppe verwendet. Die Wunde wird geschlossen, und den Ratten wird erlaubt, normales Futter zu fressen und Leitungswasser zu trinken.
  • Nach 12 Tagen werden die Ratten getötet, und die Leberregeneration wird visuell beobachtet, um die Wirkungen der OP-1-Mutante auf die Leberregeneration am wirksamsten zu bewerten. Es wird in Betracht gezogen, dass die mit der OP-1-Mutante injizierte Gruppe eine vollständige Lebergewebe-Regenerierung ohne verbleibendes Anzeichen eines Schnittes in der Leber zeigen wird. Im Gegensatz dazu zeigt die Kontrollgruppe, in die nur PBS injiziert wird, typischerweise nur eine minimale Regeneration, wobei der Einschnitt in der Probe bleibt.
  • 3. OP-1-Mutante-induzierte Regeneration von Dentin, Zement und periodontalem Ligament
  • Als noch ein anderes Beispiel kann auch die Fähigkeit der OP-1-Mutante, die Dentinogenese zu induzieren, gezeigt werden. Bis jetzt ist die nicht-vorhersagbare Reaktion des Zahnmarksgewebes auf eine Verletzung ein grundlegendes klinisches Problem in der Zahnmedizin. Langschwanzmakaken werden als Primatenmodelle ausgewählt, da vermutet wird, dass Affen bessere Hinweise auf die menschliche Dentalbiologie geben als Modelle, die auf niedrigeren Nicht-Primaten-Säugern basieren.
  • Unter Verwendung von chirurgischen Standardvorgehensweisen der Zahnmedizin werden kleine Gebiete (z.B. 2mm) von Zahnmark chirurgisch durch Entfernen des Zahnschmelzes und Dentins unmittelbar über dem Zahnmark (durch Bohren) von Probezähnen, Durchführten einer Teilamputation des coronalen Zahnmarkgewebes, Induzieren einer Homeostase, Anwenden der Zahnmarkbehandlung und Verschließen und Füllen der Höhle durch Standardvorgehensweisen offengelegt.
  • Die verwendeten Zahnmarkbehandlungen schließen ein: eine OP-1-Mutante, die in einer Trägermatrix dispergiert ist; die Trägermatrix alleine und keine Behandlung. Zwölf Zähne pro Tier (vier für jede Behandlung) werden vorbereitet, und zwei Tiere werden verwendet. Nach vier Wochen werden die Zähne extrahiert und histologisch für die Analyse der Dentinbildung verarbeitet und/oder gemahlen, um die Dentin-Mineralisierung zu analysieren. Die Wirkung der OP-1-Mutante auf die Osteodentin-Reparatur kann visuell durch Vergleichen mit den Kontrollproben beobachtet werden. Es wird in Betracht gezogen, dass die OP-1-Mutante wie natürliches OP-1 plus ein Trägermedium die Bildung von reparativen Osteodentin-Brücken, die auf chirurgisch offengelegtem gesundem Zahnmark quer verlaufen, induziert. Im Gegensatz dazu bildet Zahnmark, das mit der Trägermatrix alleine behandelt wird, kein reparatives Dentin.
  • 4. OP-1-Mutante-induzierte Nervengewebe-Reparatur
  • Als noch ein anderes Beispiel kann die Induktion der regenerativen Wirkungen auf die Reparatur des zentralen Nervensystems (ZNS) durch eine morphogenisch aktive OP-1-Mutante unter Verwendung eines Ratten-Hirnstamm-Modells gezeigt werden. Kurz, männliche Long Evans-Ratten werden anästhesiert und der Kopfbereich für die Operation vorbereitet. Das Schädeldach wird unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren offengelegt und ein Loch in Richtung Zentrum eines jeden Lappens unter Verwendung eines 0,035K Drahtes, der das Schädeldach gerade durchdringt, gebohrt. 25 ml-Lösungen, enthaltend entweder die OP-1-Mutante (25 mg), natürliches OP-1 (25 mg) oder PBS, werden dann in jedes der Löcher durch eine Hamilton-Spritze eingebracht. Die Lösungen werden in eine Tiefe von ungefähr 3 mm unter der Oberfläche in den/das darunterliegenden Cortex, Corpus callosum und Hippocampus verabreicht. Die Haut wird dann genäht, und dem Tier wird erlaubt, sich zu erholen.
  • Drei Tage nach der Chirurgie werden die Ratten durch Enthaupten getötet und ihre Gehirne für eine Schnittdarstellung verarbeitet. Eine Narbengewebe-Bildung wird durch Immunfluoreszenz-Färbung auf das fibrilläre saure Glia-Protein, einem Marker für die Glia-Vernarbung, bewertet, um den Grad der Narbenbildung qualitativ zu bestimmen. Es wird in Betracht gezogen, dass die OP-1-Mutante wie das natürliche OP-1 in reduzierten Spiegeln des fibrillären sauren Glia-Proteins in den Gewebeschnitten der Tiere, die mit der OP-1-Mutante behandelt wurden, resultieren kann, was ein Hinweis auf die Fähigkeit des Morphogens ist, die Glia-Narbenbildung zu hemmen, wodurch eine Nervenregeneration stimuliert wird.
  • Die Fähigkeit der OP-1-Mutante, das Axon-Wachstum des periphären Nervensystems über weite Entfernungen zu stimulieren, kann unter Verwendung des folgenden Modells gezeigt werden. Neuronen des periphären Nervensystems können nach einer Verletzung selbst neue Fortsätze sprießen, aber ohne Führung können diese Sprossen sich typischerweise nicht passend verbinden und sterben. Wo die Unterbrechung ausgedehnt ist, z.B. größer als 5 oder 10 mm, ist die Regeneration schwach oder nicht vorhanden. Frühere Experimente mit OP-1 zeigen, dass Morphogene das Axon-Wachstum des periphären Nervensystems über ausgedehnte Entfernungen stimulieren, was eine Reparatur und Regeneration der geschädigten periphären neuralen Signalwege ermöglicht.
  • In diesem Beispiel wird die OP-1-Mutante-Stimulierung der Nervenregeneration unter Verwendung des Ratten-Ischiasnerv-Modells gezeigt. Der Ratten-Ischiasnerv kann spontan über eine 5 mm-Distanz und gelegentlich über eine 10 mm-Distanz regenerieren, vorausgesetzt, dass die verletzten Enden in einen Kochsalzlösung-gefüllten Nervenführungs-Kanal inseriert werden. In diesem Experiment wird die Nervenregenerierung über mindestens eine 12 mm-Distanz getestet.
  • Erwachsene weibliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Laborstories, Inc.) mit einem Gewicht von 230-250 g werden mit intraperitonealen Injektionen von Natriumpentobarbital (35 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert. Eine Hautinzision wird parallel und unmittelbar posterior des Femurs vorgenommen. Man dringt in die avaskuläre intermuskuläre Ebene zwischen den äußeren breiten und den hinteren Oberschenkelmuskeln ein und folgt ihr zum losen fibroareolaren Gewebe, das den Ischiasnerv umgibt. Das lose Gewebe wird longitudinal geteilt, wodurch der Ischiasnerv in seinem gesamten Ausmaß freigelegt wird, ohne einen Teil zu devaskularisieren. Unter einem chirurgischen Mikroskop werden die Ischiasnerven mit Mikroscheren in der Mitte des Oberschenkels durchschnitten und mit einem OP-1-Morphon-Geltransplantat transplantiert, das die Nervenenden 12 mm voneinander separiert. Das Transplantatgebiet wird in ein Silikonröhrchen von 20 mm Länge mit einem inneren Durchmesser von 1,5 mm eingeschlossen, wobei das Innere derselben mit der mutanten Lösung gefüllt ist. Genau bestehen die zentralen 12 mm der Röhre aus einem OP-1-Morphon-Gel, das durch Mischen von 1 bis 5 mg einer im Wesentlichen reinen OP-1-Mutante, die mit ungefähr 100 ml MATRIGELTM (von Collaborative Research, Inc., Redford, MA) produziert wird, einem extrazellulären Matrixextrakt, der von einem Maus-Sarkomgewebe stammt und eine solubilisierte Gewebe-Basalmembran enthält, einschließlich Laminin, Typ IV-Kollagen, Heparinsulfat, Proteoglycan und Entactin, in phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt wird. Das Mutanten-gefüllte Röhrchen wird dann direkt in die defekte Stelle implantiert, was erlaubt, die Nervenenden an jedem Ende 4 mm zu inserieren. Jedes Ende wird gegen das mutante Gel abgegrenzt und wird im Silikonröhrchen durch drei Nähte aus einem kommerziell erhältlichen chirurgischen 10-0 Nylon durch das Epineurium, die schützende Faszikelhülle, befestigt.
  • Zusätzlich zu den OP-1-Mutante-Geltransplantaten werden vorzugsweise auch Kontrolltransplantate von leeren Silikonröhrchen, Silikonröhrchen, die nur mit Gel und „umgekehrten" Autotransplantaten gefüllt sind, wobei 12 mm durchschnittene Segmente des Ischiasnervs des Tiers vor dem Nähen 180° gedreht werden, transplantiert. Alle Experimente werden vorzugsweise in vierfacher Ausführung durchgeführt. Alle Wunden werden vorzugsweise durch Wundklammern verschlossen, die nach 10 Tagen entfernt werden. Ratten können an beiden Beinen transplantiert werden. Nach 3 Wochen werden die Tiere getötet und die transplantierten Segmente entfernt und sofort auf Trockeneis gefroren. Gefrorene Schnitte werden dann durch die ganze Transplantat-Stelle geschnitten und durch Immunfluoreszenz-Färbung unter Verwendung von Anti-Neurofilament-Antikörpern, die mit Fluorescein markiert sind (erhalten zum Beispiel von Sigma Chemical Co., St. Louis) auf eine Axon-Regeneration untersucht.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass die Regeneration des Ischiasnervs in allen Transplantatstellen über die gesamte 12 mm-Distanz erfolgen kann, wenn die Distanz mit dem OP-1-Mutante-Gel gefüllt ist. Im Gegensatz dazu zeigen leere Silikonröhrchen, Gel alleine und umgekehrte Autotransplantate keine Nervenregeneration.
  • IV. ALLGEMEINE BEMERKUNGEN
  • Es wird verstanden und anerkannt werden, dass jedes der vorangehenden Mittel zum Bewerten der Eigenschaften wie Faltung, Solubilität, Stabilität, Oberflächenbindung/Adhärenz, der biologischen Aktivität usw. unter Verwendung von anderen mutanten Konstrukten als den auf OP-1 basierenden Mutanten durchgeführt werden kann. Alles das benötigt wird, ist eine vergleichende Bewertung des natürlichen TGF-β-Superfamilie-Proteins und der Eigenschaften des mutanten Konstrukts. So kann zum Beispiel eine Mutante, die die bevorzugten Faltungseigenschaften des natürlichen Proteins X bewahrt, aber die die neuralen Gewebedifferenzierungs-Eigenschaften des natürlichen Proteins Y erworben hat, leicht unter den experimentellen Paradigmen und der hierin gelieferten Anleitung identifiziert werden. Der Fachmann wird ein bevorzugtes Konstrukt als eines erkennen, das alle erwünschten Eigenschaften optimal kombiniert hat, wobei optimal nicht notwendigerweise eine maximale Expression von einer bestimmten Eigenschaft bedeuten soll. Vielmehr soll optimal die Expression jeder erwünschten Eigenschaft bedeuten, so dass die kombinierte Expression für die Umstände und/oder Verwendungen, die durch den Fachmann erwogen werden, geeignet ist.
  • Dementsprechend liegen andere Ausführungsformen innerhalb der folgenden Ansprüche. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (18)

  1. OP-1-Mutante umfassend Aminosäurerestaustausche, wobei die Aminosäurerestaustausche sind: (a) ein Austausch von Arginin für Histidin an Rest 431 von OP-1 (SEQ ID NO: 39); und (b) ein Austausch von einem sauren Aminosäurerest für einen nicht-sauren Aminosäurerest an mindestens einem Rest der Reste 400, 421, 422 und 426 von OP-1 (SEQ ID NO: 39).
  2. OP-1-Mutante nach Anspruch 1, wobei der Austausch-Aminosäurerest Asparaginsäure oder Glutaminsäure ist.
  3. OP-1-Mutante nach Anspruch 1, wobei der nicht-saure Rest ein basischer Rest oder ein eine Amidgruppe tragender Rest ist.
  4. OP-1-Mutante nach Anspruch 1, wobei der Austausch-Aminosäurerest einen positiv geladenen oder einen eine Amidgruppe tragenden hydrophilen Rest ersetzt.
  5. OP-1-Mutante nach Anspruch 1, welche im Vergleich zu OP-1 ohne Austausch verbesserte in vitro-Rückfaltungseigenschaften in einem pH-Bereich von etwa 6.0-9.0 besitzt.
  6. Isolierte Nucleinsäure umfassend eine DNA-Sequenz, welche die OP-1-Mutante nach Anspruch 1 codiert.
  7. Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute an rückgefaltetem OP-1 auf mehr als 1%, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Austauschen von Arginin für Histidin an Rest 431 von OP-1 (SEQ ID NO: 39); und (b) Erhöhen der Anzahl der negativ geladenen Reste in der Finger-2-Subdomäne durch Austausch eines sauren Aminosäurerestes für einen nicht-sauren Aminosäurerest an mindestens einem Rest der Reste 400, 421, 422 und 426 von OP-1 (SEQ ID NO: 39).
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Anzahl der negativ geladenen Reste auf mindestens drei erhöht wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Anzahl der negativ geladenen Reste auf mindestens vier erhöht wird.
  10. Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute an rückgefaltetem OP-1 auf mehr als 1 %, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Austauschen von Arginin für Histidin an Rest 431 von OP-1 (SEQ ID NO: 39); und (b) Verringern der Anzahl der positiv geladenen Reste in der Finger-2-Subdomäne des Proteins durch Austausch eines sauren Aminosäurerestes für einen nicht-sauren Aminosäurerest an mindestens einem Rest der Reste 400, 421, 422 und 426 von OP-1 (SEQ ID NO: 39).
  11. Verfahren zur Faltung von OP-1, in vitro unter geeigneten Rückfaltungsbedingungen, um eine biologisch aktive dimere Spezies zu produzieren, wobei das OP-1 durch Produktion von weniger als etwa 1% rückgefalteter dimerer Spezies bei geeigneten Rückfaltungsbedingungen gekennzeichnet ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Austauschen von mindestens zwei Resten im OP-1, wobei die Austausch-Aminosäuren sind: (i) ein Austausch von Arginin für Hisitidin an Rest 431 von OP-1 (SEQ ID NO: 39); und (ii) ein Austausch von einem sauren Aminosäurerest für einen nicht-sauren Aminosäurerest an mindestens einem Rest der Reste 400, 421, 422 und 426 von OP-1 (SEQ ID NO: 39); und (b) Falten des OP-1 von Schritt (a) bei einem pH-Wert im Bereich von etwa pH 6-9, um eine biologisch aktive dimere Spezies zu produzieren.
  12. Verfahren nach Anspruch 11 umfassend den zusätzlichen Schritt der Solubilisierung des Austausches aufweisenden OP-1 vor Schritt (b) in der Anwesenheit eines Detergens.
  13. Verfahren zur Produktion von mehr als 1% rückgefaltetem OP-1, wobei das Verfahren ist: (a) Bereitstellen einer Nucleinsäure für eine Wirtszelle, welche eine Nucleotidsequenz umfasst, die eine OP-1-Mutante nach Anspruch 1 codiert; (b) Züchten der mit der Nucleinsäure von Schritt (a) transfizierten Wirtszelle bei Bedingungen, die eine Expression der Mutante ermöglichen; (c) Isolieren der OP-1-Mutante aus anderen zellulären und Kulturmedium-Bestandteilen; und (d) Rückfalten der OP-1-Mutante in vitro bei geeigneten Rückfaltungsbedingungen.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der nicht-saure Rest ein basischer Rest ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der saure Rest Glutaminsäure oder Asparaginsäure ist.
  16. OP-1-Mutante bestehend aus einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 68 oder SEQ ID NO: 69.
  17. Verwendung einer Mutante eines Mitglieds der TGF-β-Superfamilie nach Anspruch 1 oder 16 zur Verwendung in der Zubereitung eines Medikaments um Gewebemorphogenese zu induzieren.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Gewebe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Knochen, nicht-mineralisiertem Skelettgewebe, Zahngewebe, Bindegewebe, Gehirn, Leber und Nerv.
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