JP2001314187A - ベロ毒素遺伝子の検出方法 - Google Patents
ベロ毒素遺伝子の検出方法Info
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- JP2001314187A JP2001314187A JP2000089568A JP2000089568A JP2001314187A JP 2001314187 A JP2001314187 A JP 2001314187A JP 2000089568 A JP2000089568 A JP 2000089568A JP 2000089568 A JP2000089568 A JP 2000089568A JP 2001314187 A JP2001314187 A JP 2001314187A
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 迅速でかつ選択的にベロ毒素産生性大腸菌を
同定検出するための方法を提供する。 【解決手段】ベロ毒素1型(以下、VT1)の遺伝子
(以下、VT1遺伝子)を特異的に増幅するプライマー
及び/又はベロ毒素2型(以下、VT2)の遺伝子(以
下、VT2遺伝子)を特異的に増幅するプライマーを用
いて、マイクロチップキャピラリ電気泳動法で検出する
ことを特徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法
同定検出するための方法を提供する。 【解決手段】ベロ毒素1型(以下、VT1)の遺伝子
(以下、VT1遺伝子)を特異的に増幅するプライマー
及び/又はベロ毒素2型(以下、VT2)の遺伝子(以
下、VT2遺伝子)を特異的に増幅するプライマーを用
いて、マイクロチップキャピラリ電気泳動法で検出する
ことを特徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明はベロ毒素遺伝子の検
出方法に関する。
出方法に関する。
【0002】
【従来の技術】ベロ毒素産生性大腸菌は、出血性大腸炎
に代表される食中毒症、溶血性***症候群等の重篤な
疾患の原因菌であることが認められ、近年、これらの菌
の迅速な検出が臨床検査分野で重要視されている。
に代表される食中毒症、溶血性***症候群等の重篤な
疾患の原因菌であることが認められ、近年、これらの菌
の迅速な検出が臨床検査分野で重要視されている。
【0003】従来、ベロ毒素産生性大腸菌の検査は、患
者の便、感染源として疑われる食品、飲料水等から採取
された検体を直接培養後、一次確認培養試験、二次確認
培養試験、抗血清による凝集反応試験といった煩雑な操
作により行われてきた。
者の便、感染源として疑われる食品、飲料水等から採取
された検体を直接培養後、一次確認培養試験、二次確認
培養試験、抗血清による凝集反応試験といった煩雑な操
作により行われてきた。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】ところが、培養にはそ
れぞれ18〜24時間を要するため、この検査は3〜4
日もの長時間がかかるという問題点があった。また、血
清型と起病性が必ずしも一致しないため、血清型の同定
のみで起因菌の判定を行うことは困難であった。
れぞれ18〜24時間を要するため、この検査は3〜4
日もの長時間がかかるという問題点があった。また、血
清型と起病性が必ずしも一致しないため、血清型の同定
のみで起因菌の判定を行うことは困難であった。
【0005】本発明はかかる状況に鑑みなされたもの
で、迅速でかつ選択的にベロ毒素産生性大腸菌を同定検
出するための方法を提供しようとするものである。
で、迅速でかつ選択的にベロ毒素産生性大腸菌を同定検
出するための方法を提供しようとするものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ベロ毒素産生
性大腸菌の産生するVT1遺伝子又はVT2遺伝子に選
択的に結合するオリゴヌクレオチドを作製し、これらの
オリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅したヌクレ
オチド断片をマイクロキャピラリ電気泳動法で検出する
ことにより、ベロ毒素産生性大腸菌の病原因子であるV
T1及びVT2のどちらか一方のみ又は両方を産生する
菌を迅速でかつ選択的に検出できることを見い出し、本
発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ベロ毒素産生
性大腸菌の産生するVT1遺伝子又はVT2遺伝子に選
択的に結合するオリゴヌクレオチドを作製し、これらの
オリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅したヌクレ
オチド断片をマイクロキャピラリ電気泳動法で検出する
ことにより、ベロ毒素産生性大腸菌の病原因子であるV
T1及びVT2のどちらか一方のみ又は両方を産生する
菌を迅速でかつ選択的に検出できることを見い出し、本
発明を完成するに至った。
【0007】すなわち、本発明は、 (1)ベロ毒素1型(以下、VT1)の遺伝子(以下、
VT1遺伝子)を特異的に増幅するプライマー及び/又
はベロ毒素2型(以下、VT2)の遺伝子(以下、VT
2遺伝子)を特異的に増幅するプライマーを用いて、マ
イクロチップキャピラリ電気泳動法で検出することを特
徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法、 (2)電気泳動用の分離用媒体として高分子ゲルを用い
ることを特徴とする上記(1)記載のベロ毒素遺伝子の
検出方法、 (3)高分子ゲルが非交差型高分子ゲルであることを特
徴とする上記(2)記載のベロ毒素遺伝子の検出方法、 (4)非交差型高分子ゲルが直鎖状ポリアクリルアミ
ド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖状ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロキシプロ
ピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直鎖状ポリ
エチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオキサイド
のいずれかである上記(3)記載のベロ毒素遺伝子の検
出方法、 (5)マイクロチップキャピラリ電気泳動法が互いに連
結する試料導入用流路と試料分離用流路とを有するマイ
クロチップを用いることを特徴とする上記(1)〜
(4)のいずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法、 (6)VT1遺伝子を特異的に増幅するプライマーが、
下記の配列番号1〜2に示される塩基配列又は該塩基配
列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した15
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで
ある上記(1)〜(5)のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法、 配列番号1: AACAGCGGTTACATTGTCTGG ……(a) 配列番号2: AACCGTAACATCGCTCTTGC ……(b) (7)VT2遺伝子を特異的に増幅するプライマーが、
下記の配列番号3〜4に示される塩基配列又は該塩基配
列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した15
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで
ある上記(1)〜(6)のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法、及び 配列番号3: ACCAGAGATGCATCCAGAGC ……(c) 配列番号4: GGCGTCATCGTATACACAGG ……(d) (8)次の(I)〜(IV)から選ばれる少なくとも1組
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、増幅
させたヌクレオチド断片を用いる上記(1)〜(7)の
いずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法 (I)上記配列番号1に示される塩基配列(a)のうち
の少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号2に示され
る塩基配列(b)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (II)上記配列番号1に示される塩基配列(a)に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した15塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、及び上記
配列番号2に示される塩基配列(b)に相補的な塩基配
列のうちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチド (III)上記配列番号3に示される塩基配列(c)のう
ちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号4に示され
る塩基配列(d)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (IV)上記配列番号3に示される塩基配列(c)に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した15塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及び上記配
列番号4に示される塩基配列(d)に相補的な塩基配列
のうちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列
を含有するオリゴヌクレオチド に関する。
VT1遺伝子)を特異的に増幅するプライマー及び/又
はベロ毒素2型(以下、VT2)の遺伝子(以下、VT
2遺伝子)を特異的に増幅するプライマーを用いて、マ
イクロチップキャピラリ電気泳動法で検出することを特
徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法、 (2)電気泳動用の分離用媒体として高分子ゲルを用い
ることを特徴とする上記(1)記載のベロ毒素遺伝子の
検出方法、 (3)高分子ゲルが非交差型高分子ゲルであることを特
徴とする上記(2)記載のベロ毒素遺伝子の検出方法、 (4)非交差型高分子ゲルが直鎖状ポリアクリルアミ
ド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖状ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロキシプロ
ピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直鎖状ポリ
エチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオキサイド
のいずれかである上記(3)記載のベロ毒素遺伝子の検
出方法、 (5)マイクロチップキャピラリ電気泳動法が互いに連
結する試料導入用流路と試料分離用流路とを有するマイ
クロチップを用いることを特徴とする上記(1)〜
(4)のいずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法、 (6)VT1遺伝子を特異的に増幅するプライマーが、
下記の配列番号1〜2に示される塩基配列又は該塩基配
列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した15
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで
ある上記(1)〜(5)のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法、 配列番号1: AACAGCGGTTACATTGTCTGG ……(a) 配列番号2: AACCGTAACATCGCTCTTGC ……(b) (7)VT2遺伝子を特異的に増幅するプライマーが、
下記の配列番号3〜4に示される塩基配列又は該塩基配
列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した15
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで
ある上記(1)〜(6)のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法、及び 配列番号3: ACCAGAGATGCATCCAGAGC ……(c) 配列番号4: GGCGTCATCGTATACACAGG ……(d) (8)次の(I)〜(IV)から選ばれる少なくとも1組
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、増幅
させたヌクレオチド断片を用いる上記(1)〜(7)の
いずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法 (I)上記配列番号1に示される塩基配列(a)のうち
の少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号2に示され
る塩基配列(b)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (II)上記配列番号1に示される塩基配列(a)に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した15塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、及び上記
配列番号2に示される塩基配列(b)に相補的な塩基配
列のうちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチド (III)上記配列番号3に示される塩基配列(c)のう
ちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号4に示され
る塩基配列(d)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (IV)上記配列番号3に示される塩基配列(c)に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した15塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及び上記配
列番号4に示される塩基配列(d)に相補的な塩基配列
のうちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列
を含有するオリゴヌクレオチド に関する。
【0008】
【発明の実施の形態】本発明のプライマーであるオリゴ
ヌクレオチドに用いられる下記の配列番号1〜4に示さ
れる塩基配列(a)〜(d)は、VT1又はVT2を選
択的に検出するためのプライマーを得るために、まず、
VT1又はVT2の遺伝子配列の中から増幅領域とし
て、サイズが100〜200bp、両増幅領域のサイズ
差が20〜100bpであることを目安とした特徴的配
列を選び出し、その上流域と下流域に位置する約20個
を選択したものである。VT1遺伝子の特徴的配列とし
ては、375〜548番目に位置する、配列番号1に示
される塩基配列(a)で始まり、配列番号2で示される
塩基配列(b)に相補的な配列で終わる塩基配列を対の
片方とする174bpの遺伝子配列を選択した。VT2
遺伝子の特徴的配列としては、517〜644番目に位
置する、配列番号3に示される塩基配列(c)で始ま
り、配列番号4で示される塩基配列(d)に相補的な配
列で終わる塩基配列を対の片方とする128bpの遺伝
子配列を選択した。 配列番号1: AACAGCGGTTACATTGTCTGG ……(a) 配列番号2: AACCGTAACATCGCTCTTGC ……(b) 配列番号3: ACCAGAGATGCATCCAGAGC ……(c) 配列番号4: GGCGTCATCGTATACACAGG ……(d)
ヌクレオチドに用いられる下記の配列番号1〜4に示さ
れる塩基配列(a)〜(d)は、VT1又はVT2を選
択的に検出するためのプライマーを得るために、まず、
VT1又はVT2の遺伝子配列の中から増幅領域とし
て、サイズが100〜200bp、両増幅領域のサイズ
差が20〜100bpであることを目安とした特徴的配
列を選び出し、その上流域と下流域に位置する約20個
を選択したものである。VT1遺伝子の特徴的配列とし
ては、375〜548番目に位置する、配列番号1に示
される塩基配列(a)で始まり、配列番号2で示される
塩基配列(b)に相補的な配列で終わる塩基配列を対の
片方とする174bpの遺伝子配列を選択した。VT2
遺伝子の特徴的配列としては、517〜644番目に位
置する、配列番号3に示される塩基配列(c)で始ま
り、配列番号4で示される塩基配列(d)に相補的な配
列で終わる塩基配列を対の片方とする128bpの遺伝
子配列を選択した。 配列番号1: AACAGCGGTTACATTGTCTGG ……(a) 配列番号2: AACCGTAACATCGCTCTTGC ……(b) 配列番号3: ACCAGAGATGCATCCAGAGC ……(c) 配列番号4: GGCGTCATCGTATACACAGG ……(d)
【0009】本発明の、プライマーとして用いるオリゴ
ヌクレオチドは、選択性、検出感度及び再現性の観点か
ら、15塩基以上の長さであることが必要で、18塩基
以上が好ましく、上記配列番号1〜4の塩基配列(a)
〜(d)又はその塩基配列(a)〜(d)に相補的配列
をそのままの長さで用いることがより好ましい。プライ
マーとして用いるオリゴヌクレオチドは、化学合成等に
より合成したものでも天然の遺伝子から抽出したもので
もどちらでも良い。また、プライマーは、検出用に蛍光
標識等の標識がしてあっても良いし、標識していなくて
も良い。
ヌクレオチドは、選択性、検出感度及び再現性の観点か
ら、15塩基以上の長さであることが必要で、18塩基
以上が好ましく、上記配列番号1〜4の塩基配列(a)
〜(d)又はその塩基配列(a)〜(d)に相補的配列
をそのままの長さで用いることがより好ましい。プライ
マーとして用いるオリゴヌクレオチドは、化学合成等に
より合成したものでも天然の遺伝子から抽出したもので
もどちらでも良い。また、プライマーは、検出用に蛍光
標識等の標識がしてあっても良いし、標識していなくて
も良い。
【0010】上記のオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用いることにより、ベロ毒素遺伝子に選択的なヌク
レオチド断片を増幅できる。すなわち、次の(I)及び
/又は(II)に示されるオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして使用することにより、VT1遺伝子に特異的な
ヌクレオチド断片を増幅でき、次の(III)及び/又は
(IV)に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て使用することにより、VT2遺伝子に特異的なヌクレ
オチド断片を増幅できる。また、(I)及び/又は(I
I)、並びに(III)及び/又は(IV)に示されるオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、
VT1遺伝子に特異的なヌクレオチド断片とVT2遺伝
子に特異的なヌクレオチド断片を同時に増幅できる。 (I)上記配列番号1に示される塩基配列(a)のうち
の少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号2に示され
る塩基配列(b)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (II)上記配列番号1に示される塩基配列(a)に相補
的な塩基配列(a)’のうちの少なくとも連続した15
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、
及び上記配列番号2に示される塩基配列(b)に相補的
な塩基配列(b)’のうちの少なくとも連続した15塩
基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (III)上記配列番号3に示される塩基配列(c)のう
ちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号4に示され
る塩基配列(d)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (IV)上記配列番号3に示される塩基配列(c)に相補
的な塩基配列(c)’のうちの少なくとも連続した15
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及
び上記配列番号4に示される塩基配列(d)に相補的な
塩基配列(d)’のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド
して用いることにより、ベロ毒素遺伝子に選択的なヌク
レオチド断片を増幅できる。すなわち、次の(I)及び
/又は(II)に示されるオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして使用することにより、VT1遺伝子に特異的な
ヌクレオチド断片を増幅でき、次の(III)及び/又は
(IV)に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て使用することにより、VT2遺伝子に特異的なヌクレ
オチド断片を増幅できる。また、(I)及び/又は(I
I)、並びに(III)及び/又は(IV)に示されるオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、
VT1遺伝子に特異的なヌクレオチド断片とVT2遺伝
子に特異的なヌクレオチド断片を同時に増幅できる。 (I)上記配列番号1に示される塩基配列(a)のうち
の少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号2に示され
る塩基配列(b)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (II)上記配列番号1に示される塩基配列(a)に相補
的な塩基配列(a)’のうちの少なくとも連続した15
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、
及び上記配列番号2に示される塩基配列(b)に相補的
な塩基配列(b)’のうちの少なくとも連続した15塩
基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (III)上記配列番号3に示される塩基配列(c)のう
ちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号4に示され
る塩基配列(d)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (IV)上記配列番号3に示される塩基配列(c)に相補
的な塩基配列(c)’のうちの少なくとも連続した15
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及
び上記配列番号4に示される塩基配列(d)に相補的な
塩基配列(d)’のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド
【0011】プライマーの組合せを例示すると、VT1
遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプ
ライマーとしては次の(1)〜(3)、VT2遺伝子に
特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプライマー
しては次の(4)〜(6)、VT1遺伝子に特異的なヌ
クレオチド断片とVT2遺伝子に特異的なヌクレオチド
断片を同時に増幅するためのプライマーしては次の
(7)〜(15)等の組合せが挙げられる。 (1)(a)及び(b) (2)(a)’及び(b)’ (3)(a)、(a)’(b)及び(b)’ (4)(c)及び(d) (5)(c)’及び(d)’ (6)(c)、(c)’、(d)及び(d)’ (7)(a)、(b)、(c)及び(d) (8)(a)、(b)、(c)’及び(d)’ (9)(a)’、(b)’、(c)及び(d) (10)(a)’、(b)’、(c)’及び(d)’ (11)(a)、(a)’、(b)、(b)’、(c)
及び(d) (12)(a)、(a)’、(b)、(b)’、
(c)’及び(d)’ (13)(a)、(b)、(c)、(c)’、(d)及
び(d)’ (14)(a)’、(b)’、(c)、(c)’、
(d)及び(d)’ (15)(a)、(a)’、(b)、(b)’、
(c)、(c)’、(d)及び(d)’
遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプ
ライマーとしては次の(1)〜(3)、VT2遺伝子に
特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプライマー
しては次の(4)〜(6)、VT1遺伝子に特異的なヌ
クレオチド断片とVT2遺伝子に特異的なヌクレオチド
断片を同時に増幅するためのプライマーしては次の
(7)〜(15)等の組合せが挙げられる。 (1)(a)及び(b) (2)(a)’及び(b)’ (3)(a)、(a)’(b)及び(b)’ (4)(c)及び(d) (5)(c)’及び(d)’ (6)(c)、(c)’、(d)及び(d)’ (7)(a)、(b)、(c)及び(d) (8)(a)、(b)、(c)’及び(d)’ (9)(a)’、(b)’、(c)及び(d) (10)(a)’、(b)’、(c)’及び(d)’ (11)(a)、(a)’、(b)、(b)’、(c)
及び(d) (12)(a)、(a)’、(b)、(b)’、
(c)’及び(d)’ (13)(a)、(b)、(c)、(c)’、(d)及
び(d)’ (14)(a)’、(b)’、(c)、(c)’、
(d)及び(d)’ (15)(a)、(a)’、(b)、(b)’、
(c)、(c)’、(d)及び(d)’
【0012】本発明のオリゴヌクレオチドをプライマー
として用いる遺伝子の増幅方法は、PCR法等の常法に
より行うことができる。
として用いる遺伝子の増幅方法は、PCR法等の常法に
より行うことができる。
【0013】PCR法等により増幅されたヌクレオチド
断片を含む反応液をマイクロチップキャピラリ電気泳動
にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片の存在、
及びその長さを迅速に確認することができる。マイクロ
チップキャピラリ電気泳動にかける試料は、VT1遺伝
子に特異的なヌクレオチド断片、及びVT2遺伝子に特
異的なヌクレオチド断片のいずれか片方を増幅した反応
液、両者の混合液、VT1遺伝子に特異的なヌクレオチ
ド断片、及びVT2遺伝子に特異的なヌクレオチド断片
を同時に増幅した反応液のいずれであってもかまわな
い。その結果から検体中にプライマーに特異的な配列を
持ったヌクレオチド、すなわちVT1遺伝子及び/又は
VT2遺伝子が存在しているか否かが判定できる。この
判定は、検体中のVT1及びVT2のどちらか一方のみ
又は両方を産生するベロ毒素産生性大腸菌の有無を示す
ものとなる。
断片を含む反応液をマイクロチップキャピラリ電気泳動
にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片の存在、
及びその長さを迅速に確認することができる。マイクロ
チップキャピラリ電気泳動にかける試料は、VT1遺伝
子に特異的なヌクレオチド断片、及びVT2遺伝子に特
異的なヌクレオチド断片のいずれか片方を増幅した反応
液、両者の混合液、VT1遺伝子に特異的なヌクレオチ
ド断片、及びVT2遺伝子に特異的なヌクレオチド断片
を同時に増幅した反応液のいずれであってもかまわな
い。その結果から検体中にプライマーに特異的な配列を
持ったヌクレオチド、すなわちVT1遺伝子及び/又は
VT2遺伝子が存在しているか否かが判定できる。この
判定は、検体中のVT1及びVT2のどちらか一方のみ
又は両方を産生するベロ毒素産生性大腸菌の有無を示す
ものとなる。
【0014】マイクロチップキャピラリ電気泳動用の分
離用媒体としては、分析対象の物質が分離できれば特に
限定はなく、緩衝液、高分子ゲル等を用いることができ
るが、分離性の観点からは高分子ゲルが好ましく、中で
も非交差型高分子ゲルがより好ましく、直鎖状ポリアク
リルアミド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖
状ヒドロキシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロ
キシプロピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直
鎖状ポリエチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオ
キサイドのいずれかがさらに好ましい。これらの高分子
ゲルを用いる場合、緩衝液を用いて適当な濃度、pHに
調整されていることが好ましい。分離用媒体のpH(高
分子ゲルを用いる場合は緩衝液で調整後のpH)は6〜
10が好ましく、7〜9がより好ましい。緩衝液で調整
後の高分子ゲルの濃度は0.02〜2%(重量/容量)
が好ましく、0.04〜1%(重量/容量)がより好ま
しく、0.1〜0.5%(重量/容量)がさらに好まし
い。
離用媒体としては、分析対象の物質が分離できれば特に
限定はなく、緩衝液、高分子ゲル等を用いることができ
るが、分離性の観点からは高分子ゲルが好ましく、中で
も非交差型高分子ゲルがより好ましく、直鎖状ポリアク
リルアミド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖
状ヒドロキシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロ
キシプロピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直
鎖状ポリエチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオ
キサイドのいずれかがさらに好ましい。これらの高分子
ゲルを用いる場合、緩衝液を用いて適当な濃度、pHに
調整されていることが好ましい。分離用媒体のpH(高
分子ゲルを用いる場合は緩衝液で調整後のpH)は6〜
10が好ましく、7〜9がより好ましい。緩衝液で調整
後の高分子ゲルの濃度は0.02〜2%(重量/容量)
が好ましく、0.04〜1%(重量/容量)がより好ま
しく、0.1〜0.5%(重量/容量)がさらに好まし
い。
【0015】マイクロチップキャピラリ電気泳動に用い
られるマイクロチップとしては、少なくとも試料分離用
流路を有することが必要であるが、分離性の観点から
は、互いに連結する試料導入用流路と試料分離用流路と
を有していることが好ましい。試料分離用流路及び試料
導入用流路は、溝として形成されるが、溝のサイズは分
析対象の物質が分離できれば特に限定はなく任意に設計
できるが、取り扱い性、成形性、電気泳動装置の小型化
の観点から、幅は10〜2000μmが好ましく、20
〜1000μmがより好ましく、30μm〜500μm
がさらに好ましい。深さは5〜1000μmが好まし
く、5〜500μmがより好ましく、10μm〜100
μmがさらに好ましい。長さは5mm〜150mm程度
が好ましく、より好ましくは10mm〜100mm、さ
らに好ましくは15〜50mmである。
られるマイクロチップとしては、少なくとも試料分離用
流路を有することが必要であるが、分離性の観点から
は、互いに連結する試料導入用流路と試料分離用流路と
を有していることが好ましい。試料分離用流路及び試料
導入用流路は、溝として形成されるが、溝のサイズは分
析対象の物質が分離できれば特に限定はなく任意に設計
できるが、取り扱い性、成形性、電気泳動装置の小型化
の観点から、幅は10〜2000μmが好ましく、20
〜1000μmがより好ましく、30μm〜500μm
がさらに好ましい。深さは5〜1000μmが好まし
く、5〜500μmがより好ましく、10μm〜100
μmがさらに好ましい。長さは5mm〜150mm程度
が好ましく、より好ましくは10mm〜100mm、さ
らに好ましくは15〜50mmである。
【0016】マイクロチップキャピラリ電気泳動に用い
られるマイクロチップのサイズは、片手で取り扱い易い
ように10mm角〜150mm角程度の大きさが好まし
く、15mm角〜100mm角がより好ましく、電気泳
動装置小型化の観点からは20mm角〜70mm角がさ
らに好ましい。また、マイクロチップの厚さは、成形
性、取り扱い性の観点から0.2mm〜5mm程度が好
ましく、1mm〜2mmがより好ましい。
られるマイクロチップのサイズは、片手で取り扱い易い
ように10mm角〜150mm角程度の大きさが好まし
く、15mm角〜100mm角がより好ましく、電気泳
動装置小型化の観点からは20mm角〜70mm角がさ
らに好ましい。また、マイクロチップの厚さは、成形
性、取り扱い性の観点から0.2mm〜5mm程度が好
ましく、1mm〜2mmがより好ましい。
【0017】マイクロチップキャピラリ電気泳動に用い
られるマイクロチップの素材は、UV吸収や蛍光などに
より検出することを考慮し透明又は半透明の材料である
ことが必要であるが、特に限定されるものではない。再
現性向上の観点からは、注型可能なガラス、熱硬化性樹
脂、熱可塑性樹脂等の型で成形可能なものが好ましい。
絶縁性や成形の自由度から樹脂材料であることがより好
ましい。また、樹脂材料は、弾力性があるために接触面
積が面圧により確保でき、ガラス基材のものより有利な
電気条件となり好ましい。特に熱可塑性樹脂材料は生産
性の面からも有効であり、ポリメチルメタクリレート、
ポリアクリレート等のアクリル系樹脂、ポリスチレン、
スチレンコポリマ等のスチレン系樹脂、ポリカーボネー
ト、ナイロン6、ナイロン66、ポリエチレンテレフタ
レートなどが好ましい。中でも、透明性及び蛍光特性の
面で、アクリル系樹脂とスチレン系樹脂がより好まし
く、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンがさらに
好ましい。また、本発明の電気泳動用チップは生産性が
高く化学的検体を扱うために、使い捨て製品として使用
されることも考えられ、このような観点からは生分解性
プラスチックであることが好ましい。生分解性プラスチ
ックとしては、例えば、マタービー(ノバモント社
(伊)製商品名)等の澱粉を利用したポリマ、セルグリ
ーンP−CA(ダイセル化学工業株式会社製商品名)、
ルナーレZT(日本触媒化学工業株式会社製商品名)等
のセルロースエステル系ポリマ、ビオノーレ(昭和高分
子社製商品名)等の脂肪族ポリエステル系ポリマ、エコ
プレ(カーギル社(米)製商品名)等のポリ乳酸系ポリ
マ、ポリヒドロキシブチレート/バリレート等の微生物
ポリエステルなどが挙げられる。
られるマイクロチップの素材は、UV吸収や蛍光などに
より検出することを考慮し透明又は半透明の材料である
ことが必要であるが、特に限定されるものではない。再
現性向上の観点からは、注型可能なガラス、熱硬化性樹
脂、熱可塑性樹脂等の型で成形可能なものが好ましい。
絶縁性や成形の自由度から樹脂材料であることがより好
ましい。また、樹脂材料は、弾力性があるために接触面
積が面圧により確保でき、ガラス基材のものより有利な
電気条件となり好ましい。特に熱可塑性樹脂材料は生産
性の面からも有効であり、ポリメチルメタクリレート、
ポリアクリレート等のアクリル系樹脂、ポリスチレン、
スチレンコポリマ等のスチレン系樹脂、ポリカーボネー
ト、ナイロン6、ナイロン66、ポリエチレンテレフタ
レートなどが好ましい。中でも、透明性及び蛍光特性の
面で、アクリル系樹脂とスチレン系樹脂がより好まし
く、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンがさらに
好ましい。また、本発明の電気泳動用チップは生産性が
高く化学的検体を扱うために、使い捨て製品として使用
されることも考えられ、このような観点からは生分解性
プラスチックであることが好ましい。生分解性プラスチ
ックとしては、例えば、マタービー(ノバモント社
(伊)製商品名)等の澱粉を利用したポリマ、セルグリ
ーンP−CA(ダイセル化学工業株式会社製商品名)、
ルナーレZT(日本触媒化学工業株式会社製商品名)等
のセルロースエステル系ポリマ、ビオノーレ(昭和高分
子社製商品名)等の脂肪族ポリエステル系ポリマ、エコ
プレ(カーギル社(米)製商品名)等のポリ乳酸系ポリ
マ、ポリヒドロキシブチレート/バリレート等の微生物
ポリエステルなどが挙げられる。
【0018】マイクロチップキャピラリ電気泳動に用い
られる電気泳動用装置は、分析対象物質を含む試料の導
入流路または分離流路の両端に電位差を与えて分析対象
物質を電気泳動させるために電極又は電気回路に電圧を
印加するための手段、分析対象物質に光を照射するため
の手段、分析対象物質からの検出光を測定するための手
段、電気泳動用チップを位置決めする手段とを備えるも
のである。マイクロチップキャピラリ電気泳動の条件
は、分析対象の物質が分離できれば特に限定はなく任意
に設計できるが、分離性の観点から、電圧が50〜20
00V/cmが好ましく、80〜1000V/cmがよ
り好ましく、100〜500V/cmがさらに好まし
い。また、泳動距離は、分離性及び迅速性の観点から、
1〜100mmが好ましく、2〜50mmがより好まし
い。
られる電気泳動用装置は、分析対象物質を含む試料の導
入流路または分離流路の両端に電位差を与えて分析対象
物質を電気泳動させるために電極又は電気回路に電圧を
印加するための手段、分析対象物質に光を照射するため
の手段、分析対象物質からの検出光を測定するための手
段、電気泳動用チップを位置決めする手段とを備えるも
のである。マイクロチップキャピラリ電気泳動の条件
は、分析対象の物質が分離できれば特に限定はなく任意
に設計できるが、分離性の観点から、電圧が50〜20
00V/cmが好ましく、80〜1000V/cmがよ
り好ましく、100〜500V/cmがさらに好まし
い。また、泳動距離は、分離性及び迅速性の観点から、
1〜100mmが好ましく、2〜50mmがより好まし
い。
【0019】
【実施例】次に、実施例により本発明を説明するが、本
発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0020】実施例1 ベロ毒素産生性大腸菌株DNA試料の調製 ベロ毒素産生性大腸菌O−157の臨床分離株3種(V
T1産生株、VT−2産生株、VT−1及びVT−2産
生株)を、それぞれLBブロス液体培地を用いて37℃
で18時間培養した後、108個の菌を含む量の培養液
を取り12000rpmで5分間遠心分離してペレット
に菌体を回収した。菌体からのDNA抽出は、核酸抽出
剤SepaGeneセパジーン(三光純薬株式会社製商
品名)を用いて、次のとおり行った。上記ペレットに試
薬I(トリス塩酸緩衝液)100μLを加えて混和し、
10分間放置後、試薬II(チオシアン酸グアニジン)1
00μLを加えて緩やかに混和した後、さらに試薬III
(クロロホルムを含む変性蛋白吸着剤)700μL試薬
IV(酢酸ナトリウム溶液)400μLを加えて乳濁化す
るまで10秒間激しく振とうして、12000rpm、
5分間遠心分離して、核酸を含む上清を分取し、試薬V
(核酸沈殿促進剤の酢酸緩衝液)を上清の1/10量加
え、さらにその総量と同量のイソプロピルアルコールを
加えて転倒混和し、−20℃で1時間静置した後、12
000rpm、15分間遠心分離して、上清を除去し、
70%エタノールを1mL加えて軽く転倒混和した後、
12000rpm、15分間遠心分離後、上清を除去
し、得られた核酸を乾燥し、TE緩衝液(10mMトリ
ス−塩酸緩衝液(pH7.4)、0.1mMETDA)
に溶解し、260nmの吸光度により50μg/mLの
DNA試料を調製した。
T1産生株、VT−2産生株、VT−1及びVT−2産
生株)を、それぞれLBブロス液体培地を用いて37℃
で18時間培養した後、108個の菌を含む量の培養液
を取り12000rpmで5分間遠心分離してペレット
に菌体を回収した。菌体からのDNA抽出は、核酸抽出
剤SepaGeneセパジーン(三光純薬株式会社製商
品名)を用いて、次のとおり行った。上記ペレットに試
薬I(トリス塩酸緩衝液)100μLを加えて混和し、
10分間放置後、試薬II(チオシアン酸グアニジン)1
00μLを加えて緩やかに混和した後、さらに試薬III
(クロロホルムを含む変性蛋白吸着剤)700μL試薬
IV(酢酸ナトリウム溶液)400μLを加えて乳濁化す
るまで10秒間激しく振とうして、12000rpm、
5分間遠心分離して、核酸を含む上清を分取し、試薬V
(核酸沈殿促進剤の酢酸緩衝液)を上清の1/10量加
え、さらにその総量と同量のイソプロピルアルコールを
加えて転倒混和し、−20℃で1時間静置した後、12
000rpm、15分間遠心分離して、上清を除去し、
70%エタノールを1mL加えて軽く転倒混和した後、
12000rpm、15分間遠心分離後、上清を除去
し、得られた核酸を乾燥し、TE緩衝液(10mMトリ
ス−塩酸緩衝液(pH7.4)、0.1mMETDA)
に溶解し、260nmの吸光度により50μg/mLの
DNA試料を調製した。
【0021】PCR法によるDNA断片の増幅 上記で得られたベロ毒素産生性大腸菌O−157の臨床
分離株3種のDNA試料50ngをそれぞれ(上記抽出
DNA溶液1μL)、1.5mM塩化マグネシウム、5
0mM塩化カリウム、0.001%(重量/容量)、2
%(重量/容量)DMSO、0.2mMdNTPs、
1.25unitTaqDNAポリメラーゼ(Perk
in−Eler社製)を含む10mMトリス−塩酸緩衝
液(pH8.3)に溶解し、さらに上記配列番号1に示
される塩基配列(a)のオリゴヌクレオチド、上記配列
番号2に示される塩基配列(b)のオリゴヌクレオチ
ド、上記配列番号3に示される塩基配列(c)のオリゴ
ヌクレオチド、及び上記配列番号4に示される塩基配列
(d)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて
各々0.2μM溶解した反応液50μLをPCR用サー
マルサイクラー(アステック社製 PROGRAM TEMP CONTRO
L SYSTEM PC-700)で94℃で1分、56℃で1分、7
2℃で1分の反応を20回くり返し、PCR反応を行
い、ベロ毒素産生性大腸菌O−157の臨床分離株3種
のDNA断片(VT1gene、VT2gene、VT
1/VT2gene)を増幅した。
分離株3種のDNA試料50ngをそれぞれ(上記抽出
DNA溶液1μL)、1.5mM塩化マグネシウム、5
0mM塩化カリウム、0.001%(重量/容量)、2
%(重量/容量)DMSO、0.2mMdNTPs、
1.25unitTaqDNAポリメラーゼ(Perk
in−Eler社製)を含む10mMトリス−塩酸緩衝
液(pH8.3)に溶解し、さらに上記配列番号1に示
される塩基配列(a)のオリゴヌクレオチド、上記配列
番号2に示される塩基配列(b)のオリゴヌクレオチ
ド、上記配列番号3に示される塩基配列(c)のオリゴ
ヌクレオチド、及び上記配列番号4に示される塩基配列
(d)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて
各々0.2μM溶解した反応液50μLをPCR用サー
マルサイクラー(アステック社製 PROGRAM TEMP CONTRO
L SYSTEM PC-700)で94℃で1分、56℃で1分、7
2℃で1分の反応を20回くり返し、PCR反応を行
い、ベロ毒素産生性大腸菌O−157の臨床分離株3種
のDNA断片(VT1gene、VT2gene、VT
1/VT2gene)を増幅した。
【0022】マイクロチップ電気泳動法によるDNA断片
の検出 外形寸法20mm×70mm×1mm厚のPMMA(ポ
リメチルメタクリレート)樹脂(三菱レーヨン株式会社
製アクリペットVH)製の100μm幅、40μm深で
長さ45mmと6mmの2本の溝を有するマイクロチッ
プを用いた。2本の溝は長い溝の10mm位置と短い溝
の中点で直交し、短い溝が試料導入用流路、長い溝が試
料分離用流路として使われる。それぞれの溝の両端に
は、分離用媒体や検体試料が注入しやすいように試料導
入口と試料排出口が設けられている。分離用媒体として
2.5mg/Lエチジウムブロマイドを溶解した0.4
%(重量/容量)ヒドロキシプロピルメチルセルロース
(Aldrich社製、平均分子量120,000を、TBE緩
衝液(pH8.2)(44.5mM TRIS(2−ア
ミノー2−ヒドロキシメチルー1,3−プロパンジオー
ル)、44.5mMホウ酸、1mMETDA)に溶解)
を用いた。まず、水流ポンプにより吸引して分離用媒体
を試料導入用流路及び試料分離用流路に充填した。次に
上記のPCR産物から調製したDNA試料3μL(分離
用媒体で5倍希釈)を試料導入口に添加し、試料導入用
流路の両端に65V(108V/cm)の電圧を印加し
顕微鏡下に試料が溝交差部まで移動したのを確認後、試
料分離用流路の両端に650V(145V/cm)の電
圧を印加して試料分離用流路での電気泳動を行った。泳
動距離(溝交差部からの距離)2.5mm、5mm、1
cm、及び、3cmの位置で光学検出を行った。これら
検出位置までの泳動時間はそれぞれ10秒、15秒、3
0秒、1分30秒であった。なお、光学検出は、水銀ラ
ンプ、ダイクロイックミラー(励起光510〜550n
m、蛍光検出590nm以上)、及び対物レンズを有す
る落射型蛍光顕微鏡(オリンパス光学工業株式会社製)
と光電子倍増管(Photon Technology
International社製)を組み合わせた検出
系で行った。検出結果を図1及び図2に示す。図1は、
ベロ毒素産生性大腸菌O−157の臨床分離株3種の増
幅DNA断片(VT1gene、VT2gene、及び
VT1/VT2gene)をそれぞれ泳動距離1cmで
検出した結果を示し、図2はベロ毒素産生性大腸菌O−
157のVT1及びVT2産生株の増幅DNA断片(V
T1/VT2gene)を泳動距離2.5mm、5m
m、1cm、及び、3cmで検出した結果を示す。図1
及び図2から、ベロ毒素産生性大腸菌O−157のVT
1産生株の増幅DNA断片(VT1gene)、及びV
T2産生株の増幅DNA断片(VT2gene)ではそ
れぞれ別の位置に1本のピーク、VT1及びVT2産生
株の増幅DNA断片(VT1/VT2gene)では2
本のピークが確認された。また、PCR反応に供するベ
ロ毒素産生性大腸菌O−157の臨床分離株のDNA試
料の量を50ngから減らして検出限界を求めた結果、
最少DNA試料500pgからのPCR産物でマイクロ
チップ電気泳動による増幅DNA断片のピークが確認で
きた。
の検出 外形寸法20mm×70mm×1mm厚のPMMA(ポ
リメチルメタクリレート)樹脂(三菱レーヨン株式会社
製アクリペットVH)製の100μm幅、40μm深で
長さ45mmと6mmの2本の溝を有するマイクロチッ
プを用いた。2本の溝は長い溝の10mm位置と短い溝
の中点で直交し、短い溝が試料導入用流路、長い溝が試
料分離用流路として使われる。それぞれの溝の両端に
は、分離用媒体や検体試料が注入しやすいように試料導
入口と試料排出口が設けられている。分離用媒体として
2.5mg/Lエチジウムブロマイドを溶解した0.4
%(重量/容量)ヒドロキシプロピルメチルセルロース
(Aldrich社製、平均分子量120,000を、TBE緩
衝液(pH8.2)(44.5mM TRIS(2−ア
ミノー2−ヒドロキシメチルー1,3−プロパンジオー
ル)、44.5mMホウ酸、1mMETDA)に溶解)
を用いた。まず、水流ポンプにより吸引して分離用媒体
を試料導入用流路及び試料分離用流路に充填した。次に
上記のPCR産物から調製したDNA試料3μL(分離
用媒体で5倍希釈)を試料導入口に添加し、試料導入用
流路の両端に65V(108V/cm)の電圧を印加し
顕微鏡下に試料が溝交差部まで移動したのを確認後、試
料分離用流路の両端に650V(145V/cm)の電
圧を印加して試料分離用流路での電気泳動を行った。泳
動距離(溝交差部からの距離)2.5mm、5mm、1
cm、及び、3cmの位置で光学検出を行った。これら
検出位置までの泳動時間はそれぞれ10秒、15秒、3
0秒、1分30秒であった。なお、光学検出は、水銀ラ
ンプ、ダイクロイックミラー(励起光510〜550n
m、蛍光検出590nm以上)、及び対物レンズを有す
る落射型蛍光顕微鏡(オリンパス光学工業株式会社製)
と光電子倍増管(Photon Technology
International社製)を組み合わせた検出
系で行った。検出結果を図1及び図2に示す。図1は、
ベロ毒素産生性大腸菌O−157の臨床分離株3種の増
幅DNA断片(VT1gene、VT2gene、及び
VT1/VT2gene)をそれぞれ泳動距離1cmで
検出した結果を示し、図2はベロ毒素産生性大腸菌O−
157のVT1及びVT2産生株の増幅DNA断片(V
T1/VT2gene)を泳動距離2.5mm、5m
m、1cm、及び、3cmで検出した結果を示す。図1
及び図2から、ベロ毒素産生性大腸菌O−157のVT
1産生株の増幅DNA断片(VT1gene)、及びV
T2産生株の増幅DNA断片(VT2gene)ではそ
れぞれ別の位置に1本のピーク、VT1及びVT2産生
株の増幅DNA断片(VT1/VT2gene)では2
本のピークが確認された。また、PCR反応に供するベ
ロ毒素産生性大腸菌O−157の臨床分離株のDNA試
料の量を50ngから減らして検出限界を求めた結果、
最少DNA試料500pgからのPCR産物でマイクロ
チップ電気泳動による増幅DNA断片のピークが確認で
きた。
【0023】実施例2 実施例1で調製した増幅DNA断片のうち、ベロ毒素産
生性大腸菌O−157のVT1産生株の増幅DNA断片
(VT1gene)、及びVT2産生株の増幅DNA断
片の2種を用いて、50bp間隔ラダーDNA(100
μL/mL、GIBCO BRL社製)を加えて実施例
1同様にしてマイクロチップ電気泳動を行ない、泳動距
離3.0cmの位置で光学検出した(図3)。その結
果、ベロ毒素産生性大腸菌O−157のVT1産生株の
増幅DNA断片(VT1gene)では、150bpラ
ダーDNAと200bpラダーDNAの間の174bp
に相当する位置にピークが確認され(図3(a))、V
T2産生株の増幅DNA断片(VT2gene)では、
100bpラダーDNAと150bpラダーDNAの間
の128bpに相当する位置にピークが確認された(図
3(b))。
生性大腸菌O−157のVT1産生株の増幅DNA断片
(VT1gene)、及びVT2産生株の増幅DNA断
片の2種を用いて、50bp間隔ラダーDNA(100
μL/mL、GIBCO BRL社製)を加えて実施例
1同様にしてマイクロチップ電気泳動を行ない、泳動距
離3.0cmの位置で光学検出した(図3)。その結
果、ベロ毒素産生性大腸菌O−157のVT1産生株の
増幅DNA断片(VT1gene)では、150bpラ
ダーDNAと200bpラダーDNAの間の174bp
に相当する位置にピークが確認され(図3(a))、V
T2産生株の増幅DNA断片(VT2gene)では、
100bpラダーDNAと150bpラダーDNAの間
の128bpに相当する位置にピークが確認された(図
3(b))。
【0024】これらの結果から、上記配列番号1に示さ
れる塩基配列(a)又は該塩基配列(a)に相補的な塩
基配列のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列番号2に
示される塩基配列(b)又は該塩基配列(b)に相補的
な塩基配列のオリゴヌクレオチド、をプライマーとして
使用することにより、VT1遺伝子に特異的な174b
pのDNA断片を増幅させることができ、上記配列番号
3に示される塩基配列(c)又は該塩基配列(c)に相
補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列
番号4に示される塩基配列(d)又は該塩基配列(d)
に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド、をプライマ
ーとして使用することにより、VT2遺伝子に特異的な
128bpのDNA断片を増幅させることができ、マイ
クロチップ電気泳動法により極短時間で検体中にこれら
のベロ毒素遺伝子が存在するか否かが検出できることが
わかった。
れる塩基配列(a)又は該塩基配列(a)に相補的な塩
基配列のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列番号2に
示される塩基配列(b)又は該塩基配列(b)に相補的
な塩基配列のオリゴヌクレオチド、をプライマーとして
使用することにより、VT1遺伝子に特異的な174b
pのDNA断片を増幅させることができ、上記配列番号
3に示される塩基配列(c)又は該塩基配列(c)に相
補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列
番号4に示される塩基配列(d)又は該塩基配列(d)
に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド、をプライマ
ーとして使用することにより、VT2遺伝子に特異的な
128bpのDNA断片を増幅させることができ、マイ
クロチップ電気泳動法により極短時間で検体中にこれら
のベロ毒素遺伝子が存在するか否かが検出できることが
わかった。
【0025】
【発明の効果】本発明によれば、検体の培養といった煩
雑な操作をすることなく、実施例に示したように増幅後
10秒という極短時間で特異的に検体中のVT1遺伝子
及び/又はVT2遺伝子を検出でき、ベロ毒素産生性大
腸菌の有無を確認できるので、迅速かつ選択的な検出手
段としてその工業的価値は大である。
雑な操作をすることなく、実施例に示したように増幅後
10秒という極短時間で特異的に検体中のVT1遺伝子
及び/又はVT2遺伝子を検出でき、ベロ毒素産生性大
腸菌の有無を確認できるので、迅速かつ選択的な検出手
段としてその工業的価値は大である。
【図1】実施例1のベロ毒素産生性大腸菌O−157の
臨床分離株3種の増幅DNA断片の泳動距離1cmにお
けるマイクロチップ電気泳動検出結果。
臨床分離株3種の増幅DNA断片の泳動距離1cmにお
けるマイクロチップ電気泳動検出結果。
【図2】実施例1のベロ毒素産生性大腸菌O−157の
VT1及びVT2産生株の増幅DNA断片の泳動距離
2.5mm、5mm、1cm、及び、3cmにおけるマ
イクロチップ電気泳動検出結果。
VT1及びVT2産生株の増幅DNA断片の泳動距離
2.5mm、5mm、1cm、及び、3cmにおけるマ
イクロチップ電気泳動検出結果。
【図3】(a)実施例2のベロ毒素産生性大腸菌O−1
57のVT1産生株の増幅DNA断片と50bp間隔ラ
ダーDNAのマイクロチップ電気泳動検出結果。 (b)実施例2のベロ毒素産生性大腸菌O−157のV
T2産生株の増幅DNA断片と50bp間隔ラダーDN
Aのマイクロチップ電気泳動検出結果。
57のVT1産生株の増幅DNA断片と50bp間隔ラ
ダーDNAのマイクロチップ電気泳動検出結果。 (b)実施例2のベロ毒素産生性大腸菌O−157のV
T2産生株の増幅DNA断片と50bp間隔ラダーDN
Aのマイクロチップ電気泳動検出結果。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成12年10月19日(2000.10.
19)
19)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0025
【補正方法】変更
【補正内容】
【0025】
【発明の効果】本発明によれば、検体の培養といった煩
雑な操作をすることなく、実施例に示したように増幅後
10秒という極短時間で特異的に検体中のVT1遺伝子
及び/又はVT2遺伝子を検出でき、ベロ毒素産生性大
腸菌の有無を確認できるので、迅速かつ選択的な検出手
段としてその工業的価値は大である。
雑な操作をすることなく、実施例に示したように増幅後
10秒という極短時間で特異的に検体中のVT1遺伝子
及び/又はVT2遺伝子を検出でき、ベロ毒素産生性大
腸菌の有無を確認できるので、迅速かつ選択的な検出手
段としてその工業的価値は大である。
【配列表】
<110> 日立化成工業株式会社
<120> ベロ毒素遺伝子検出のためのオリゴヌクレオチド
及びそれを用いたベロ毒素遺伝子の検出方法 <130> 12300371 <160> 4 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli O157:H7 <400> 1 aacagcggtt acattgtctg g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli O157:H7 <400> 2 aaccgtaaca tcgctcttgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli O157:H7 <400> 3 accagagatg catccagagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli O157:H7 <400> 4 ggcgtcatcg tatacacagg 20
及びそれを用いたベロ毒素遺伝子の検出方法 <130> 12300371 <160> 4 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli O157:H7 <400> 1 aacagcggtt acattgtctg g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli O157:H7 <400> 2 aaccgtaaca tcgctcttgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli O157:H7 <400> 3 accagagatg catccagagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli O157:H7 <400> 4 ggcgtcatcg tatacacagg 20
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) (C12Q 1/04 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:19) G01N 27/26 315K 325E (72)発明者 荒川 秀俊 東京都品川区旗の台1−5−8 昭和大学 薬学部内 (72)発明者 柏崎 宏幸 東京都品川区旗の台1−5−8 昭和大学 薬学部内 (72)発明者 渡辺 一之 東京都品川区旗の台1−5−8 昭和大学 薬学部内 (72)発明者 前田 昌子 東京都品川区旗の台1−5−8 昭和大学 薬学部内 Fターム(参考) 4B024 AA11 AA19 CA01 CA20 HA11 4B029 AA07 AA23 BB02 BB20 CC01 FA15 4B063 QA01 QQ06 QQ43 QR32 QR41 QR62 QS16 QS25 QS39 QX01
Claims (8)
- 【請求項1】ベロ毒素1型(以下、VT1)の遺伝子
(以下、VT1遺伝子)を特異的に増幅するプライマー
及び/又はベロ毒素2型(以下、VT2)の遺伝子(以
下、VT2遺伝子)を特異的に増幅するプライマーを用
いて、マイクロチップキャピラリ電気泳動法で検出する
ことを特徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法。 - 【請求項2】電気泳動用の分離用媒体として高分子ゲル
を用いることを特徴とする請求項1記載のベロ毒素遺伝
子の検出方法。 - 【請求項3】高分子ゲルが非交差型高分子ゲルであるこ
とを特徴とする請求項2記載のベロ毒素遺伝子の検出方
法。 - 【請求項4】非交差型高分子ゲルが直鎖状ポリアクリル
アミド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖状ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロキシ
プロピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直鎖状
ポリエチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオキサ
イドのいずれかである請求項3記載のベロ毒素遺伝子の
検出方法。 - 【請求項5】マイクロチップキャピラリ電気泳動法が互
いに連結する試料導入用流路と試料分離用流路とを有す
るマイクロチップを用いることを特徴とする請求項1〜
4のいずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法。 - 【請求項6】VT1遺伝子を特異的に増幅するプライマ
ーが、下記の配列番号1〜2に示される塩基配列又は該
塩基配列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続し
た15塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオ
チドである請求項1〜5のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法。 配列番号1: AACAGCGGTTACATTGTCTGG ……(a) 配列番号2: AACCGTAACATCGCTCTTGC ……(b) - 【請求項7】VT2遺伝子を特異的に増幅するプライマ
ーが、下記の配列番号3〜4に示される塩基配列又は該
塩基配列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続し
た15塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオ
チドである請求項1〜6のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法。 配列番号3: ACCAGAGATGCATCCAGAGC ……(c) 配列番号4: GGCGTCATCGTATACACAGG ……(d) - 【請求項8】次の(I)〜(IV)から選ばれる少なくと
も1組のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用
し、増幅させたヌクレオチド断片を用いる請求項1〜7
のいずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法。 (I)上記配列番号1に示される塩基配列(a)のうち
の少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号2に示され
る塩基配列(b)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (II)上記配列番号1に示される塩基配列(a)に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した15塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、及び上記
配列番号2に示される塩基配列(b)に相補的な塩基配
列のうちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチド (III)上記配列番号3に示される塩基配列(c)のう
ちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号4に示され
る塩基配列(d)のうちの少なくとも連続した15塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド (IV)上記配列番号3に示される塩基配列(c)に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した15塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及び上記配
列番号4に示される塩基配列(d)に相補的な塩基配列
のうちの少なくとも連続した15塩基よりなる塩基配列
を含有するオリゴヌクレオチド
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000089568A JP2001314187A (ja) | 2000-03-02 | 2000-03-28 | ベロ毒素遺伝子の検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000061858 | 2000-03-02 | ||
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JP2000089568A JP2001314187A (ja) | 2000-03-02 | 2000-03-28 | ベロ毒素遺伝子の検出方法 |
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---|---|
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Family
ID=26586925
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---|---|---|---|
JP2000089568A Pending JP2001314187A (ja) | 2000-03-02 | 2000-03-28 | ベロ毒素遺伝子の検出方法 |
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Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2001314187A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015114150A (ja) * | 2013-12-10 | 2015-06-22 | 株式会社島津製作所 | 電気泳動分離方法 |
CN104777211A (zh) * | 2015-03-26 | 2015-07-15 | 浙江医学高等专科学校 | 一种检测α-眼镜蛇神经毒素的方法 |
JP6992385B2 (ja) | 2017-10-02 | 2022-01-13 | 株式会社島津製作所 | 電気泳動用分離媒体、電気泳動用試薬キット、及び電気泳動方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03113358A (ja) * | 1989-09-28 | 1991-05-14 | Shimadzu Corp | キャピラリー電気泳動法 |
JPH078280A (ja) * | 1993-06-15 | 1995-01-13 | Shimadzu Corp | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
JPH10132783A (ja) * | 1996-10-31 | 1998-05-22 | Shimadzu Corp | マイクロチップ電気泳動方法及び装置 |
-
2000
- 2000-03-28 JP JP2000089568A patent/JP2001314187A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP6992385B2 (ja) | 2017-10-02 | 2022-01-13 | 株式会社島津製作所 | 電気泳動用分離媒体、電気泳動用試薬キット、及び電気泳動方法 |
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