JP2001314187A - ベロ毒素遺伝子の検出方法 - Google Patents
ベロ毒素遺伝子の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 迅速でかつ選択的にベロ毒素産生性大腸菌を
同定検出するための方法を提供する。 【解決手段】ベロ毒素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝子
（以下、ＶＴ１遺伝子）を特異的に増幅するプライマー
及び／又はベロ毒素２型（以下、ＶＴ２）の遺伝子（以
下、ＶＴ２遺伝子）を特異的に増幅するプライマーを用
いて、マイクロチップキャピラリ電気泳動法で検出する
ことを特徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法
同定検出するための方法を提供する。 【解決手段】ベロ毒素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝子
（以下、ＶＴ１遺伝子）を特異的に増幅するプライマー
及び／又はベロ毒素２型（以下、ＶＴ２）の遺伝子（以
下、ＶＴ２遺伝子）を特異的に増幅するプライマーを用
いて、マイクロチップキャピラリ電気泳動法で検出する
ことを特徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はベロ毒素遺伝子の検
出方法に関する。
出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ベロ毒素産生性大腸菌は、出血性大腸炎
に代表される食中毒症、溶血性***症候群等の重篤な
疾患の原因菌であることが認められ、近年、これらの菌
の迅速な検出が臨床検査分野で重要視されている。
に代表される食中毒症、溶血性***症候群等の重篤な
疾患の原因菌であることが認められ、近年、これらの菌
の迅速な検出が臨床検査分野で重要視されている。
【０００３】従来、ベロ毒素産生性大腸菌の検査は、患
者の便、感染源として疑われる食品、飲料水等から採取
された検体を直接培養後、一次確認培養試験、二次確認
培養試験、抗血清による凝集反応試験といった煩雑な操
作により行われてきた。
者の便、感染源として疑われる食品、飲料水等から採取
された検体を直接培養後、一次確認培養試験、二次確認
培養試験、抗血清による凝集反応試験といった煩雑な操
作により行われてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところが、培養にはそ
れぞれ１８〜２４時間を要するため、この検査は３〜４
日もの長時間がかかるという問題点があった。また、血
清型と起病性が必ずしも一致しないため、血清型の同定
のみで起因菌の判定を行うことは困難であった。
れぞれ１８〜２４時間を要するため、この検査は３〜４
日もの長時間がかかるという問題点があった。また、血
清型と起病性が必ずしも一致しないため、血清型の同定
のみで起因菌の判定を行うことは困難であった。
【０００５】本発明はかかる状況に鑑みなされたもの
で、迅速でかつ選択的にベロ毒素産生性大腸菌を同定検
出するための方法を提供しようとするものである。
で、迅速でかつ選択的にベロ毒素産生性大腸菌を同定検
出するための方法を提供しようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ベロ毒素産生
性大腸菌の産生するＶＴ１遺伝子又はＶＴ２遺伝子に選
択的に結合するオリゴヌクレオチドを作製し、これらの
オリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅したヌクレ
オチド断片をマイクロキャピラリ電気泳動法で検出する
ことにより、ベロ毒素産生性大腸菌の病原因子であるＶ
Ｔ１及びＶＴ２のどちらか一方のみ又は両方を産生する
菌を迅速でかつ選択的に検出できることを見い出し、本
発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ベロ毒素産生
性大腸菌の産生するＶＴ１遺伝子又はＶＴ２遺伝子に選
択的に結合するオリゴヌクレオチドを作製し、これらの
オリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅したヌクレ
オチド断片をマイクロキャピラリ電気泳動法で検出する
ことにより、ベロ毒素産生性大腸菌の病原因子であるＶ
Ｔ１及びＶＴ２のどちらか一方のみ又は両方を産生する
菌を迅速でかつ選択的に検出できることを見い出し、本
発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、 （１）ベロ毒素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝子（以下、
ＶＴ１遺伝子）を特異的に増幅するプライマー及び／又
はベロ毒素２型（以下、ＶＴ２）の遺伝子（以下、ＶＴ
２遺伝子）を特異的に増幅するプライマーを用いて、マ
イクロチップキャピラリ電気泳動法で検出することを特
徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法、 （２）電気泳動用の分離用媒体として高分子ゲルを用い
ることを特徴とする上記（１）記載のベロ毒素遺伝子の
検出方法、 （３）高分子ゲルが非交差型高分子ゲルであることを特
徴とする上記（２）記載のベロ毒素遺伝子の検出方法、 （４）非交差型高分子ゲルが直鎖状ポリアクリルアミ
ド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖状ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロキシプロ
ピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直鎖状ポリ
エチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオキサイド
のいずれかである上記（３）記載のベロ毒素遺伝子の検
出方法、 （５）マイクロチップキャピラリ電気泳動法が互いに連
結する試料導入用流路と試料分離用流路とを有するマイ
クロチップを用いることを特徴とする上記（１）〜
（４）のいずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法、 （６）ＶＴ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーが、
下記の配列番号１〜２に示される塩基配列又は該塩基配
列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した１５
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで
ある上記（１）〜（５）のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法、 配列番号１： ＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧ ……（ａ） 配列番号２： ＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＧＣ ……（ｂ） （７）ＶＴ２遺伝子を特異的に増幅するプライマーが、
下記の配列番号３〜４に示される塩基配列又は該塩基配
列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した１５
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで
ある上記（１）〜（６）のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法、及び 配列番号３： ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ ……（ｃ） 配列番号４： ＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧ ……（ｄ） （８）次の（Ｉ）〜（IV）から選ばれる少なくとも１組
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、増幅
させたヌクレオチド断片を用いる上記（１）〜（７）の
いずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法 （Ｉ）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のうち
の少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号２に示され
る塩基配列（ｂ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （II）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した１５塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、及び上記
配列番号２に示される塩基配列（ｂ）に相補的な塩基配
列のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチド （III）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のう
ちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号４に示され
る塩基配列（ｄ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （IV）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した１５塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及び上記配
列番号４に示される塩基配列（ｄ）に相補的な塩基配列
のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列
を含有するオリゴヌクレオチド に関する。
ＶＴ１遺伝子）を特異的に増幅するプライマー及び／又
はベロ毒素２型（以下、ＶＴ２）の遺伝子（以下、ＶＴ
２遺伝子）を特異的に増幅するプライマーを用いて、マ
イクロチップキャピラリ電気泳動法で検出することを特
徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法、 （２）電気泳動用の分離用媒体として高分子ゲルを用い
ることを特徴とする上記（１）記載のベロ毒素遺伝子の
検出方法、 （３）高分子ゲルが非交差型高分子ゲルであることを特
徴とする上記（２）記載のベロ毒素遺伝子の検出方法、 （４）非交差型高分子ゲルが直鎖状ポリアクリルアミ
ド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖状ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロキシプロ
ピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直鎖状ポリ
エチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオキサイド
のいずれかである上記（３）記載のベロ毒素遺伝子の検
出方法、 （５）マイクロチップキャピラリ電気泳動法が互いに連
結する試料導入用流路と試料分離用流路とを有するマイ
クロチップを用いることを特徴とする上記（１）〜
（４）のいずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法、 （６）ＶＴ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーが、
下記の配列番号１〜２に示される塩基配列又は該塩基配
列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した１５
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで
ある上記（１）〜（５）のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法、 配列番号１： ＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧ ……（ａ） 配列番号２： ＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＧＣ ……（ｂ） （７）ＶＴ２遺伝子を特異的に増幅するプライマーが、
下記の配列番号３〜４に示される塩基配列又は該塩基配
列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した１５
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで
ある上記（１）〜（６）のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法、及び 配列番号３： ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ ……（ｃ） 配列番号４： ＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧ ……（ｄ） （８）次の（Ｉ）〜（IV）から選ばれる少なくとも１組
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、増幅
させたヌクレオチド断片を用いる上記（１）〜（７）の
いずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法 （Ｉ）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のうち
の少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号２に示され
る塩基配列（ｂ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （II）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した１５塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、及び上記
配列番号２に示される塩基配列（ｂ）に相補的な塩基配
列のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチド （III）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のう
ちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号４に示され
る塩基配列（ｄ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （IV）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した１５塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及び上記配
列番号４に示される塩基配列（ｄ）に相補的な塩基配列
のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列
を含有するオリゴヌクレオチド に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のプライマーであるオリゴ
ヌクレオチドに用いられる下記の配列番号１〜４に示さ
れる塩基配列（ａ）〜（ｄ）は、ＶＴ１又はＶＴ２を選
択的に検出するためのプライマーを得るために、まず、
ＶＴ１又はＶＴ２の遺伝子配列の中から増幅領域とし
て、サイズが１００〜２００ｂｐ、両増幅領域のサイズ
差が２０〜１００ｂｐであることを目安とした特徴的配
列を選び出し、その上流域と下流域に位置する約２０個
を選択したものである。ＶＴ１遺伝子の特徴的配列とし
ては、３７５〜５４８番目に位置する、配列番号１に示
される塩基配列（ａ）で始まり、配列番号２で示される
塩基配列（ｂ）に相補的な配列で終わる塩基配列を対の
片方とする１７４ｂｐの遺伝子配列を選択した。ＶＴ２
遺伝子の特徴的配列としては、５１７〜６４４番目に位
置する、配列番号３に示される塩基配列（ｃ）で始ま
り、配列番号４で示される塩基配列（ｄ）に相補的な配
列で終わる塩基配列を対の片方とする１２８ｂｐの遺伝
子配列を選択した。 配列番号１： ＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧ ……（ａ） 配列番号２： ＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＧＣ ……（ｂ） 配列番号３： ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ ……（ｃ） 配列番号４： ＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧ ……（ｄ）
ヌクレオチドに用いられる下記の配列番号１〜４に示さ
れる塩基配列（ａ）〜（ｄ）は、ＶＴ１又はＶＴ２を選
択的に検出するためのプライマーを得るために、まず、
ＶＴ１又はＶＴ２の遺伝子配列の中から増幅領域とし
て、サイズが１００〜２００ｂｐ、両増幅領域のサイズ
差が２０〜１００ｂｐであることを目安とした特徴的配
列を選び出し、その上流域と下流域に位置する約２０個
を選択したものである。ＶＴ１遺伝子の特徴的配列とし
ては、３７５〜５４８番目に位置する、配列番号１に示
される塩基配列（ａ）で始まり、配列番号２で示される
塩基配列（ｂ）に相補的な配列で終わる塩基配列を対の
片方とする１７４ｂｐの遺伝子配列を選択した。ＶＴ２
遺伝子の特徴的配列としては、５１７〜６４４番目に位
置する、配列番号３に示される塩基配列（ｃ）で始ま
り、配列番号４で示される塩基配列（ｄ）に相補的な配
列で終わる塩基配列を対の片方とする１２８ｂｐの遺伝
子配列を選択した。 配列番号１： ＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧ ……（ａ） 配列番号２： ＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＧＣ ……（ｂ） 配列番号３： ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ ……（ｃ） 配列番号４： ＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧ ……（ｄ）
【０００９】本発明の、プライマーとして用いるオリゴ
ヌクレオチドは、選択性、検出感度及び再現性の観点か
ら、１５塩基以上の長さであることが必要で、１８塩基
以上が好ましく、上記配列番号１〜４の塩基配列（ａ）
〜（ｄ）又はその塩基配列（ａ）〜（ｄ）に相補的配列
をそのままの長さで用いることがより好ましい。プライ
マーとして用いるオリゴヌクレオチドは、化学合成等に
より合成したものでも天然の遺伝子から抽出したもので
もどちらでも良い。また、プライマーは、検出用に蛍光
標識等の標識がしてあっても良いし、標識していなくて
も良い。
ヌクレオチドは、選択性、検出感度及び再現性の観点か
ら、１５塩基以上の長さであることが必要で、１８塩基
以上が好ましく、上記配列番号１〜４の塩基配列（ａ）
〜（ｄ）又はその塩基配列（ａ）〜（ｄ）に相補的配列
をそのままの長さで用いることがより好ましい。プライ
マーとして用いるオリゴヌクレオチドは、化学合成等に
より合成したものでも天然の遺伝子から抽出したもので
もどちらでも良い。また、プライマーは、検出用に蛍光
標識等の標識がしてあっても良いし、標識していなくて
も良い。
【００１０】上記のオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用いることにより、ベロ毒素遺伝子に選択的なヌク
レオチド断片を増幅できる。すなわち、次の（Ｉ）及び
／又は（II）に示されるオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして使用することにより、ＶＴ１遺伝子に特異的な
ヌクレオチド断片を増幅でき、次の（III）及び／又は
（IV）に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て使用することにより、ＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレ
オチド断片を増幅できる。また、（Ｉ）及び／又は（I
I）、並びに（III）及び／又は（IV）に示されるオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、
ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチド断片とＶＴ２遺伝
子に特異的なヌクレオチド断片を同時に増幅できる。 （Ｉ）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のうち
の少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号２に示され
る塩基配列（ｂ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （II）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）に相補
的な塩基配列（ａ）’のうちの少なくとも連続した１５
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、
及び上記配列番号２に示される塩基配列（ｂ）に相補的
な塩基配列（ｂ）’のうちの少なくとも連続した１５塩
基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （III）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のう
ちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号４に示され
る塩基配列（ｄ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （IV）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）に相補
的な塩基配列（ｃ）’のうちの少なくとも連続した１５
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及
び上記配列番号４に示される塩基配列（ｄ）に相補的な
塩基配列（ｄ）’のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド
して用いることにより、ベロ毒素遺伝子に選択的なヌク
レオチド断片を増幅できる。すなわち、次の（Ｉ）及び
／又は（II）に示されるオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして使用することにより、ＶＴ１遺伝子に特異的な
ヌクレオチド断片を増幅でき、次の（III）及び／又は
（IV）に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て使用することにより、ＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレ
オチド断片を増幅できる。また、（Ｉ）及び／又は（I
I）、並びに（III）及び／又は（IV）に示されるオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、
ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチド断片とＶＴ２遺伝
子に特異的なヌクレオチド断片を同時に増幅できる。 （Ｉ）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のうち
の少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号２に示され
る塩基配列（ｂ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （II）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）に相補
的な塩基配列（ａ）’のうちの少なくとも連続した１５
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、
及び上記配列番号２に示される塩基配列（ｂ）に相補的
な塩基配列（ｂ）’のうちの少なくとも連続した１５塩
基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （III）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のう
ちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号４に示され
る塩基配列（ｄ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （IV）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）に相補
的な塩基配列（ｃ）’のうちの少なくとも連続した１５
塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及
び上記配列番号４に示される塩基配列（ｄ）に相補的な
塩基配列（ｄ）’のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド
【００１１】プライマーの組合せを例示すると、ＶＴ１
遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプ
ライマーとしては次の（１）〜（３）、ＶＴ２遺伝子に
特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプライマー
しては次の（４）〜（６）、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌ
クレオチド断片とＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド
断片を同時に増幅するためのプライマーしては次の
（７）〜（１５）等の組合せが挙げられる。 （１）（ａ）及び（ｂ） （２）（ａ）’及び（ｂ）’ （３）（ａ）、（ａ）’（ｂ）及び（ｂ）’ （４）（ｃ）及び（ｄ） （５）（ｃ）’及び（ｄ）’ （６）（ｃ）、（ｃ）’、（ｄ）及び（ｄ）’ （７）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ） （８）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）’及び（ｄ）’ （９）（ａ）’、（ｂ）’、（ｃ）及び（ｄ） （１０）（ａ）’、（ｂ）’、（ｃ）’及び（ｄ）’ （１１）（ａ）、（ａ）’、（ｂ）、（ｂ）’、（ｃ）
及び（ｄ） （１２）（ａ）、（ａ）’、（ｂ）、（ｂ）’、
（ｃ）’及び（ｄ）’ （１３）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｃ）’、（ｄ）及
び（ｄ）’ （１４）（ａ）’、（ｂ）’、（ｃ）、（ｃ）’、
（ｄ）及び（ｄ）’ （１５）（ａ）、（ａ）’、（ｂ）、（ｂ）’、
（ｃ）、（ｃ）’、（ｄ）及び（ｄ）’
遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプ
ライマーとしては次の（１）〜（３）、ＶＴ２遺伝子に
特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプライマー
しては次の（４）〜（６）、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌ
クレオチド断片とＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド
断片を同時に増幅するためのプライマーしては次の
（７）〜（１５）等の組合せが挙げられる。 （１）（ａ）及び（ｂ） （２）（ａ）’及び（ｂ）’ （３）（ａ）、（ａ）’（ｂ）及び（ｂ）’ （４）（ｃ）及び（ｄ） （５）（ｃ）’及び（ｄ）’ （６）（ｃ）、（ｃ）’、（ｄ）及び（ｄ）’ （７）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ） （８）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）’及び（ｄ）’ （９）（ａ）’、（ｂ）’、（ｃ）及び（ｄ） （１０）（ａ）’、（ｂ）’、（ｃ）’及び（ｄ）’ （１１）（ａ）、（ａ）’、（ｂ）、（ｂ）’、（ｃ）
及び（ｄ） （１２）（ａ）、（ａ）’、（ｂ）、（ｂ）’、
（ｃ）’及び（ｄ）’ （１３）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｃ）’、（ｄ）及
び（ｄ）’ （１４）（ａ）’、（ｂ）’、（ｃ）、（ｃ）’、
（ｄ）及び（ｄ）’ （１５）（ａ）、（ａ）’、（ｂ）、（ｂ）’、
（ｃ）、（ｃ）’、（ｄ）及び（ｄ）’
【００１２】本発明のオリゴヌクレオチドをプライマー
として用いる遺伝子の増幅方法は、ＰＣＲ法等の常法に
より行うことができる。
として用いる遺伝子の増幅方法は、ＰＣＲ法等の常法に
より行うことができる。
【００１３】ＰＣＲ法等により増幅されたヌクレオチド
断片を含む反応液をマイクロチップキャピラリ電気泳動
にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片の存在、
及びその長さを迅速に確認することができる。マイクロ
チップキャピラリ電気泳動にかける試料は、ＶＴ１遺伝
子に特異的なヌクレオチド断片、及びＶＴ２遺伝子に特
異的なヌクレオチド断片のいずれか片方を増幅した反応
液、両者の混合液、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチ
ド断片、及びＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド断片
を同時に増幅した反応液のいずれであってもかまわな
い。その結果から検体中にプライマーに特異的な配列を
持ったヌクレオチド、すなわちＶＴ１遺伝子及び／又は
ＶＴ２遺伝子が存在しているか否かが判定できる。この
判定は、検体中のＶＴ１及びＶＴ２のどちらか一方のみ
又は両方を産生するベロ毒素産生性大腸菌の有無を示す
ものとなる。
断片を含む反応液をマイクロチップキャピラリ電気泳動
にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片の存在、
及びその長さを迅速に確認することができる。マイクロ
チップキャピラリ電気泳動にかける試料は、ＶＴ１遺伝
子に特異的なヌクレオチド断片、及びＶＴ２遺伝子に特
異的なヌクレオチド断片のいずれか片方を増幅した反応
液、両者の混合液、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチ
ド断片、及びＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド断片
を同時に増幅した反応液のいずれであってもかまわな
い。その結果から検体中にプライマーに特異的な配列を
持ったヌクレオチド、すなわちＶＴ１遺伝子及び／又は
ＶＴ２遺伝子が存在しているか否かが判定できる。この
判定は、検体中のＶＴ１及びＶＴ２のどちらか一方のみ
又は両方を産生するベロ毒素産生性大腸菌の有無を示す
ものとなる。
【００１４】マイクロチップキャピラリ電気泳動用の分
離用媒体としては、分析対象の物質が分離できれば特に
限定はなく、緩衝液、高分子ゲル等を用いることができ
るが、分離性の観点からは高分子ゲルが好ましく、中で
も非交差型高分子ゲルがより好ましく、直鎖状ポリアク
リルアミド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖
状ヒドロキシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロ
キシプロピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直
鎖状ポリエチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオ
キサイドのいずれかがさらに好ましい。これらの高分子
ゲルを用いる場合、緩衝液を用いて適当な濃度、ｐＨに
調整されていることが好ましい。分離用媒体のｐＨ（高
分子ゲルを用いる場合は緩衝液で調整後のｐＨ）は６〜
１０が好ましく、７〜９がより好ましい。緩衝液で調整
後の高分子ゲルの濃度は０．０２〜２％（重量／容量）
が好ましく、０．０４〜１％（重量／容量）がより好ま
しく、０．１〜０．５％（重量／容量）がさらに好まし
い。
離用媒体としては、分析対象の物質が分離できれば特に
限定はなく、緩衝液、高分子ゲル等を用いることができ
るが、分離性の観点からは高分子ゲルが好ましく、中で
も非交差型高分子ゲルがより好ましく、直鎖状ポリアク
リルアミド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖
状ヒドロキシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロ
キシプロピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直
鎖状ポリエチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオ
キサイドのいずれかがさらに好ましい。これらの高分子
ゲルを用いる場合、緩衝液を用いて適当な濃度、ｐＨに
調整されていることが好ましい。分離用媒体のｐＨ（高
分子ゲルを用いる場合は緩衝液で調整後のｐＨ）は６〜
１０が好ましく、７〜９がより好ましい。緩衝液で調整
後の高分子ゲルの濃度は０．０２〜２％（重量／容量）
が好ましく、０．０４〜１％（重量／容量）がより好ま
しく、０．１〜０．５％（重量／容量）がさらに好まし
い。
【００１５】マイクロチップキャピラリ電気泳動に用い
られるマイクロチップとしては、少なくとも試料分離用
流路を有することが必要であるが、分離性の観点から
は、互いに連結する試料導入用流路と試料分離用流路と
を有していることが好ましい。試料分離用流路及び試料
導入用流路は、溝として形成されるが、溝のサイズは分
析対象の物質が分離できれば特に限定はなく任意に設計
できるが、取り扱い性、成形性、電気泳動装置の小型化
の観点から、幅は１０〜２０００μｍが好ましく、２０
〜１０００μｍがより好ましく、３０μｍ〜５００μｍ
がさらに好ましい。深さは５〜１０００μｍが好まし
く、５〜５００μｍがより好ましく、１０μｍ〜１００
μｍがさらに好ましい。長さは５ｍｍ〜１５０ｍｍ程度
が好ましく、より好ましくは１０ｍｍ〜１００ｍｍ、さ
らに好ましくは１５〜５０ｍｍである。
られるマイクロチップとしては、少なくとも試料分離用
流路を有することが必要であるが、分離性の観点から
は、互いに連結する試料導入用流路と試料分離用流路と
を有していることが好ましい。試料分離用流路及び試料
導入用流路は、溝として形成されるが、溝のサイズは分
析対象の物質が分離できれば特に限定はなく任意に設計
できるが、取り扱い性、成形性、電気泳動装置の小型化
の観点から、幅は１０〜２０００μｍが好ましく、２０
〜１０００μｍがより好ましく、３０μｍ〜５００μｍ
がさらに好ましい。深さは５〜１０００μｍが好まし
く、５〜５００μｍがより好ましく、１０μｍ〜１００
μｍがさらに好ましい。長さは５ｍｍ〜１５０ｍｍ程度
が好ましく、より好ましくは１０ｍｍ〜１００ｍｍ、さ
らに好ましくは１５〜５０ｍｍである。
【００１６】マイクロチップキャピラリ電気泳動に用い
られるマイクロチップのサイズは、片手で取り扱い易い
ように１０ｍｍ角〜１５０ｍｍ角程度の大きさが好まし
く、１５ｍｍ角〜１００ｍｍ角がより好ましく、電気泳
動装置小型化の観点からは２０ｍｍ角〜７０ｍｍ角がさ
らに好ましい。また、マイクロチップの厚さは、成形
性、取り扱い性の観点から０．２ｍｍ〜５ｍｍ程度が好
ましく、１ｍｍ〜２ｍｍがより好ましい。
られるマイクロチップのサイズは、片手で取り扱い易い
ように１０ｍｍ角〜１５０ｍｍ角程度の大きさが好まし
く、１５ｍｍ角〜１００ｍｍ角がより好ましく、電気泳
動装置小型化の観点からは２０ｍｍ角〜７０ｍｍ角がさ
らに好ましい。また、マイクロチップの厚さは、成形
性、取り扱い性の観点から０．２ｍｍ〜５ｍｍ程度が好
ましく、１ｍｍ〜２ｍｍがより好ましい。
【００１７】マイクロチップキャピラリ電気泳動に用い
られるマイクロチップの素材は、ＵＶ吸収や蛍光などに
より検出することを考慮し透明又は半透明の材料である
ことが必要であるが、特に限定されるものではない。再
現性向上の観点からは、注型可能なガラス、熱硬化性樹
脂、熱可塑性樹脂等の型で成形可能なものが好ましい。
絶縁性や成形の自由度から樹脂材料であることがより好
ましい。また、樹脂材料は、弾力性があるために接触面
積が面圧により確保でき、ガラス基材のものより有利な
電気条件となり好ましい。特に熱可塑性樹脂材料は生産
性の面からも有効であり、ポリメチルメタクリレート、
ポリアクリレート等のアクリル系樹脂、ポリスチレン、
スチレンコポリマ等のスチレン系樹脂、ポリカーボネー
ト、ナイロン６、ナイロン６６、ポリエチレンテレフタ
レートなどが好ましい。中でも、透明性及び蛍光特性の
面で、アクリル系樹脂とスチレン系樹脂がより好まし
く、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンがさらに
好ましい。また、本発明の電気泳動用チップは生産性が
高く化学的検体を扱うために、使い捨て製品として使用
されることも考えられ、このような観点からは生分解性
プラスチックであることが好ましい。生分解性プラスチ
ックとしては、例えば、マタービー（ノバモント社
（伊）製商品名）等の澱粉を利用したポリマ、セルグリ
ーンＰ−ＣＡ（ダイセル化学工業株式会社製商品名）、
ルナーレＺＴ（日本触媒化学工業株式会社製商品名）等
のセルロースエステル系ポリマ、ビオノーレ（昭和高分
子社製商品名）等の脂肪族ポリエステル系ポリマ、エコ
プレ（カーギル社（米）製商品名）等のポリ乳酸系ポリ
マ、ポリヒドロキシブチレート／バリレート等の微生物
ポリエステルなどが挙げられる。
られるマイクロチップの素材は、ＵＶ吸収や蛍光などに
より検出することを考慮し透明又は半透明の材料である
ことが必要であるが、特に限定されるものではない。再
現性向上の観点からは、注型可能なガラス、熱硬化性樹
脂、熱可塑性樹脂等の型で成形可能なものが好ましい。
絶縁性や成形の自由度から樹脂材料であることがより好
ましい。また、樹脂材料は、弾力性があるために接触面
積が面圧により確保でき、ガラス基材のものより有利な
電気条件となり好ましい。特に熱可塑性樹脂材料は生産
性の面からも有効であり、ポリメチルメタクリレート、
ポリアクリレート等のアクリル系樹脂、ポリスチレン、
スチレンコポリマ等のスチレン系樹脂、ポリカーボネー
ト、ナイロン６、ナイロン６６、ポリエチレンテレフタ
レートなどが好ましい。中でも、透明性及び蛍光特性の
面で、アクリル系樹脂とスチレン系樹脂がより好まし
く、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンがさらに
好ましい。また、本発明の電気泳動用チップは生産性が
高く化学的検体を扱うために、使い捨て製品として使用
されることも考えられ、このような観点からは生分解性
プラスチックであることが好ましい。生分解性プラスチ
ックとしては、例えば、マタービー（ノバモント社
（伊）製商品名）等の澱粉を利用したポリマ、セルグリ
ーンＰ−ＣＡ（ダイセル化学工業株式会社製商品名）、
ルナーレＺＴ（日本触媒化学工業株式会社製商品名）等
のセルロースエステル系ポリマ、ビオノーレ（昭和高分
子社製商品名）等の脂肪族ポリエステル系ポリマ、エコ
プレ（カーギル社（米）製商品名）等のポリ乳酸系ポリ
マ、ポリヒドロキシブチレート／バリレート等の微生物
ポリエステルなどが挙げられる。
【００１８】マイクロチップキャピラリ電気泳動に用い
られる電気泳動用装置は、分析対象物質を含む試料の導
入流路または分離流路の両端に電位差を与えて分析対象
物質を電気泳動させるために電極又は電気回路に電圧を
印加するための手段、分析対象物質に光を照射するため
の手段、分析対象物質からの検出光を測定するための手
段、電気泳動用チップを位置決めする手段とを備えるも
のである。マイクロチップキャピラリ電気泳動の条件
は、分析対象の物質が分離できれば特に限定はなく任意
に設計できるが、分離性の観点から、電圧が５０〜２０
００Ｖ／ｃｍが好ましく、８０〜１０００Ｖ／ｃｍがよ
り好ましく、１００〜５００Ｖ／ｃｍがさらに好まし
い。また、泳動距離は、分離性及び迅速性の観点から、
１〜１００ｍｍが好ましく、２〜５０ｍｍがより好まし
い。
られる電気泳動用装置は、分析対象物質を含む試料の導
入流路または分離流路の両端に電位差を与えて分析対象
物質を電気泳動させるために電極又は電気回路に電圧を
印加するための手段、分析対象物質に光を照射するため
の手段、分析対象物質からの検出光を測定するための手
段、電気泳動用チップを位置決めする手段とを備えるも
のである。マイクロチップキャピラリ電気泳動の条件
は、分析対象の物質が分離できれば特に限定はなく任意
に設計できるが、分離性の観点から、電圧が５０〜２０
００Ｖ／ｃｍが好ましく、８０〜１０００Ｖ／ｃｍがよ
り好ましく、１００〜５００Ｖ／ｃｍがさらに好まし
い。また、泳動距離は、分離性及び迅速性の観点から、
１〜１００ｍｍが好ましく、２〜５０ｍｍがより好まし
い。
【００１９】
【実施例】次に、実施例により本発明を説明するが、本
発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２０】実施例１ ベロ毒素産生性大腸菌株ＤＮＡ試料の調製 ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株３種（Ｖ
Ｔ１産生株、ＶＴ−２産生株、ＶＴ−１及びＶＴ−２産
生株）を、それぞれＬＢブロス液体培地を用いて３７℃
で１８時間培養した後、１０8個の菌を含む量の培養液
を取り１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレット
に菌体を回収した。菌体からのＤＮＡ抽出は、核酸抽出
剤ＳｅｐａＧｅｎｅセパジーン（三光純薬株式会社製商
品名）を用いて、次のとおり行った。上記ペレットに試
薬Ｉ（トリス塩酸緩衝液）１００μＬを加えて混和し、
１０分間放置後、試薬II（チオシアン酸グアニジン）１
００μＬを加えて緩やかに混和した後、さらに試薬III
（クロロホルムを含む変性蛋白吸着剤）７００μＬ試薬
IV（酢酸ナトリウム溶液）４００μＬを加えて乳濁化す
るまで１０秒間激しく振とうして、１２０００ｒｐｍ、
５分間遠心分離して、核酸を含む上清を分取し、試薬Ｖ
（核酸沈殿促進剤の酢酸緩衝液）を上清の１／１０量加
え、さらにその総量と同量のイソプロピルアルコールを
加えて転倒混和し、−２０℃で１時間静置した後、１２
０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して、上清を除去し、
７０％エタノールを１ｍＬ加えて軽く転倒混和した後、
１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離後、上清を除去
し、得られた核酸を乾燥し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭＥＴＤＡ）
に溶解し、２６０ｎｍの吸光度により５０μｇ／ｍＬの
ＤＮＡ試料を調製した。
Ｔ１産生株、ＶＴ−２産生株、ＶＴ−１及びＶＴ−２産
生株）を、それぞれＬＢブロス液体培地を用いて３７℃
で１８時間培養した後、１０8個の菌を含む量の培養液
を取り１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレット
に菌体を回収した。菌体からのＤＮＡ抽出は、核酸抽出
剤ＳｅｐａＧｅｎｅセパジーン（三光純薬株式会社製商
品名）を用いて、次のとおり行った。上記ペレットに試
薬Ｉ（トリス塩酸緩衝液）１００μＬを加えて混和し、
１０分間放置後、試薬II（チオシアン酸グアニジン）１
００μＬを加えて緩やかに混和した後、さらに試薬III
（クロロホルムを含む変性蛋白吸着剤）７００μＬ試薬
IV（酢酸ナトリウム溶液）４００μＬを加えて乳濁化す
るまで１０秒間激しく振とうして、１２０００ｒｐｍ、
５分間遠心分離して、核酸を含む上清を分取し、試薬Ｖ
（核酸沈殿促進剤の酢酸緩衝液）を上清の１／１０量加
え、さらにその総量と同量のイソプロピルアルコールを
加えて転倒混和し、−２０℃で１時間静置した後、１２
０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して、上清を除去し、
７０％エタノールを１ｍＬ加えて軽く転倒混和した後、
１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離後、上清を除去
し、得られた核酸を乾燥し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭＥＴＤＡ）
に溶解し、２６０ｎｍの吸光度により５０μｇ／ｍＬの
ＤＮＡ試料を調製した。
【００２１】ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅 上記で得られたベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床
分離株３種のＤＮＡ試料５０ｎｇをそれぞれ（上記抽出
ＤＮＡ溶液１μＬ）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、５
０ｍＭ塩化カリウム、０．００１％（重量／容量）、２
％（重量／容量）ＤＭＳＯ、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、
１．２５ｕｎｉｔＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｅｒ社製）を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．３）に溶解し、さらに上記配列番号１に示
される塩基配列（ａ）のオリゴヌクレオチド、上記配列
番号２に示される塩基配列（ｂ）のオリゴヌクレオチ
ド、上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のオリゴ
ヌクレオチド、及び上記配列番号４に示される塩基配列
（ｄ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて
各々０．２μＭ溶解した反応液５０μＬをＰＣＲ用サー
マルサイクラー（アステック社製 PROGRAM TEMP CONTRO
L SYSTEM PC-700）で９４℃で１分、５６℃で１分、７
２℃で１分の反応を２０回くり返し、ＰＣＲ反応を行
い、ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株３種
のＤＮＡ断片（ＶＴ１ｇｅｎｅ、ＶＴ２ｇｅｎｅ、ＶＴ
１／ＶＴ２ｇｅｎｅ）を増幅した。
分離株３種のＤＮＡ試料５０ｎｇをそれぞれ（上記抽出
ＤＮＡ溶液１μＬ）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、５
０ｍＭ塩化カリウム、０．００１％（重量／容量）、２
％（重量／容量）ＤＭＳＯ、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、
１．２５ｕｎｉｔＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｅｒ社製）を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．３）に溶解し、さらに上記配列番号１に示
される塩基配列（ａ）のオリゴヌクレオチド、上記配列
番号２に示される塩基配列（ｂ）のオリゴヌクレオチ
ド、上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のオリゴ
ヌクレオチド、及び上記配列番号４に示される塩基配列
（ｄ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて
各々０．２μＭ溶解した反応液５０μＬをＰＣＲ用サー
マルサイクラー（アステック社製 PROGRAM TEMP CONTRO
L SYSTEM PC-700）で９４℃で１分、５６℃で１分、７
２℃で１分の反応を２０回くり返し、ＰＣＲ反応を行
い、ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株３種
のＤＮＡ断片（ＶＴ１ｇｅｎｅ、ＶＴ２ｇｅｎｅ、ＶＴ
１／ＶＴ２ｇｅｎｅ）を増幅した。
【００２２】マイクロチップ電気泳動法によるDNA断片
の検出 外形寸法２０ｍｍ×７０ｍｍ×１ｍｍ厚のＰＭＭＡ（ポ
リメチルメタクリレート）樹脂（三菱レーヨン株式会社
製アクリペットＶＨ）製の１００μｍ幅、４０μｍ深で
長さ４５ｍｍと６ｍｍの２本の溝を有するマイクロチッ
プを用いた。２本の溝は長い溝の１０ｍｍ位置と短い溝
の中点で直交し、短い溝が試料導入用流路、長い溝が試
料分離用流路として使われる。それぞれの溝の両端に
は、分離用媒体や検体試料が注入しやすいように試料導
入口と試料排出口が設けられている。分離用媒体として
２．５ｍｇ／Ｌエチジウムブロマイドを溶解した０．４
％（重量／容量）ヒドロキシプロピルメチルセルロース
（Aldrich社製、平均分子量１２０，０００を、ＴＢＥ緩
衝液（ｐＨ８．２）（４４．５ｍＭ ＴＲＩＳ（２−ア
ミノー２−ヒドロキシメチルー１，３−プロパンジオー
ル）、４４．５ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＴＤＡ）に溶解）
を用いた。まず、水流ポンプにより吸引して分離用媒体
を試料導入用流路及び試料分離用流路に充填した。次に
上記のＰＣＲ産物から調製したＤＮＡ試料３μＬ（分離
用媒体で５倍希釈）を試料導入口に添加し、試料導入用
流路の両端に６５Ｖ（１０８Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加し
顕微鏡下に試料が溝交差部まで移動したのを確認後、試
料分離用流路の両端に６５０Ｖ（１４５Ｖ／ｃｍ）の電
圧を印加して試料分離用流路での電気泳動を行った。泳
動距離（溝交差部からの距離）２．５ｍｍ、５ｍｍ、１
ｃｍ、及び、３ｃｍの位置で光学検出を行った。これら
検出位置までの泳動時間はそれぞれ１０秒、１５秒、３
０秒、１分３０秒であった。なお、光学検出は、水銀ラ
ンプ、ダイクロイックミラー（励起光５１０〜５５０ｎ
ｍ、蛍光検出５９０ｎｍ以上）、及び対物レンズを有す
る落射型蛍光顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製）
と光電子倍増管（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を組み合わせた検出
系で行った。検出結果を図１及び図２に示す。図１は、
ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株３種の増
幅ＤＮＡ断片（ＶＴ１ｇｅｎｅ、ＶＴ２ｇｅｎｅ、及び
ＶＴ１／ＶＴ２ｇｅｎｅ）をそれぞれ泳動距離１ｃｍで
検出した結果を示し、図２はベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−
１５７のＶＴ１及びＶＴ２産生株の増幅ＤＮＡ断片（Ｖ
Ｔ１／ＶＴ２ｇｅｎｅ）を泳動距離２．５ｍｍ、５ｍ
ｍ、１ｃｍ、及び、３ｃｍで検出した結果を示す。図１
及び図２から、ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７のＶＴ
１産生株の増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ１ｇｅｎｅ）、及びＶ
Ｔ２産生株の増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ２ｇｅｎｅ）ではそ
れぞれ別の位置に１本のピーク、ＶＴ１及びＶＴ２産生
株の増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ１／ＶＴ２ｇｅｎｅ）では２
本のピークが確認された。また、ＰＣＲ反応に供するベ
ロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株のＤＮＡ試
料の量を５０ｎｇから減らして検出限界を求めた結果、
最少ＤＮＡ試料５００ｐｇからのＰＣＲ産物でマイクロ
チップ電気泳動による増幅ＤＮＡ断片のピークが確認で
きた。
の検出 外形寸法２０ｍｍ×７０ｍｍ×１ｍｍ厚のＰＭＭＡ（ポ
リメチルメタクリレート）樹脂（三菱レーヨン株式会社
製アクリペットＶＨ）製の１００μｍ幅、４０μｍ深で
長さ４５ｍｍと６ｍｍの２本の溝を有するマイクロチッ
プを用いた。２本の溝は長い溝の１０ｍｍ位置と短い溝
の中点で直交し、短い溝が試料導入用流路、長い溝が試
料分離用流路として使われる。それぞれの溝の両端に
は、分離用媒体や検体試料が注入しやすいように試料導
入口と試料排出口が設けられている。分離用媒体として
２．５ｍｇ／Ｌエチジウムブロマイドを溶解した０．４
％（重量／容量）ヒドロキシプロピルメチルセルロース
（Aldrich社製、平均分子量１２０，０００を、ＴＢＥ緩
衝液（ｐＨ８．２）（４４．５ｍＭ ＴＲＩＳ（２−ア
ミノー２−ヒドロキシメチルー１，３−プロパンジオー
ル）、４４．５ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＴＤＡ）に溶解）
を用いた。まず、水流ポンプにより吸引して分離用媒体
を試料導入用流路及び試料分離用流路に充填した。次に
上記のＰＣＲ産物から調製したＤＮＡ試料３μＬ（分離
用媒体で５倍希釈）を試料導入口に添加し、試料導入用
流路の両端に６５Ｖ（１０８Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加し
顕微鏡下に試料が溝交差部まで移動したのを確認後、試
料分離用流路の両端に６５０Ｖ（１４５Ｖ／ｃｍ）の電
圧を印加して試料分離用流路での電気泳動を行った。泳
動距離（溝交差部からの距離）２．５ｍｍ、５ｍｍ、１
ｃｍ、及び、３ｃｍの位置で光学検出を行った。これら
検出位置までの泳動時間はそれぞれ１０秒、１５秒、３
０秒、１分３０秒であった。なお、光学検出は、水銀ラ
ンプ、ダイクロイックミラー（励起光５１０〜５５０ｎ
ｍ、蛍光検出５９０ｎｍ以上）、及び対物レンズを有す
る落射型蛍光顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製）
と光電子倍増管（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を組み合わせた検出
系で行った。検出結果を図１及び図２に示す。図１は、
ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株３種の増
幅ＤＮＡ断片（ＶＴ１ｇｅｎｅ、ＶＴ２ｇｅｎｅ、及び
ＶＴ１／ＶＴ２ｇｅｎｅ）をそれぞれ泳動距離１ｃｍで
検出した結果を示し、図２はベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−
１５７のＶＴ１及びＶＴ２産生株の増幅ＤＮＡ断片（Ｖ
Ｔ１／ＶＴ２ｇｅｎｅ）を泳動距離２．５ｍｍ、５ｍ
ｍ、１ｃｍ、及び、３ｃｍで検出した結果を示す。図１
及び図２から、ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７のＶＴ
１産生株の増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ１ｇｅｎｅ）、及びＶ
Ｔ２産生株の増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ２ｇｅｎｅ）ではそ
れぞれ別の位置に１本のピーク、ＶＴ１及びＶＴ２産生
株の増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ１／ＶＴ２ｇｅｎｅ）では２
本のピークが確認された。また、ＰＣＲ反応に供するベ
ロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株のＤＮＡ試
料の量を５０ｎｇから減らして検出限界を求めた結果、
最少ＤＮＡ試料５００ｐｇからのＰＣＲ産物でマイクロ
チップ電気泳動による増幅ＤＮＡ断片のピークが確認で
きた。
【００２３】実施例２ 実施例１で調製した増幅ＤＮＡ断片のうち、ベロ毒素産
生性大腸菌Ｏ−１５７のＶＴ１産生株の増幅ＤＮＡ断片
（ＶＴ１ｇｅｎｅ）、及びＶＴ２産生株の増幅ＤＮＡ断
片の２種を用いて、５０ｂｐ間隔ラダーＤＮＡ（１００
μＬ／ｍＬ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を加えて実施例
１同様にしてマイクロチップ電気泳動を行ない、泳動距
離３．０ｃｍの位置で光学検出した（図３）。その結
果、ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７のＶＴ１産生株の
増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ１ｇｅｎｅ）では、１５０ｂｐラ
ダーＤＮＡと２００ｂｐラダーＤＮＡの間の１７４ｂｐ
に相当する位置にピークが確認され（図３（ａ））、Ｖ
Ｔ２産生株の増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ２ｇｅｎｅ）では、
１００ｂｐラダーＤＮＡと１５０ｂｐラダーＤＮＡの間
の１２８ｂｐに相当する位置にピークが確認された（図
３（ｂ））。
生性大腸菌Ｏ−１５７のＶＴ１産生株の増幅ＤＮＡ断片
（ＶＴ１ｇｅｎｅ）、及びＶＴ２産生株の増幅ＤＮＡ断
片の２種を用いて、５０ｂｐ間隔ラダーＤＮＡ（１００
μＬ／ｍＬ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を加えて実施例
１同様にしてマイクロチップ電気泳動を行ない、泳動距
離３．０ｃｍの位置で光学検出した（図３）。その結
果、ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７のＶＴ１産生株の
増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ１ｇｅｎｅ）では、１５０ｂｐラ
ダーＤＮＡと２００ｂｐラダーＤＮＡの間の１７４ｂｐ
に相当する位置にピークが確認され（図３（ａ））、Ｖ
Ｔ２産生株の増幅ＤＮＡ断片（ＶＴ２ｇｅｎｅ）では、
１００ｂｐラダーＤＮＡと１５０ｂｐラダーＤＮＡの間
の１２８ｂｐに相当する位置にピークが確認された（図
３（ｂ））。
【００２４】これらの結果から、上記配列番号１に示さ
れる塩基配列（ａ）又は該塩基配列（ａ）に相補的な塩
基配列のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列番号２に
示される塩基配列（ｂ）又は該塩基配列（ｂ）に相補的
な塩基配列のオリゴヌクレオチド、をプライマーとして
使用することにより、ＶＴ１遺伝子に特異的な１７４ｂ
ｐのＤＮＡ断片を増幅させることができ、上記配列番号
３に示される塩基配列（ｃ）又は該塩基配列（ｃ）に相
補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列
番号４に示される塩基配列（ｄ）又は該塩基配列（ｄ）
に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド、をプライマ
ーとして使用することにより、ＶＴ２遺伝子に特異的な
１２８ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させることができ、マイ
クロチップ電気泳動法により極短時間で検体中にこれら
のベロ毒素遺伝子が存在するか否かが検出できることが
わかった。
れる塩基配列（ａ）又は該塩基配列（ａ）に相補的な塩
基配列のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列番号２に
示される塩基配列（ｂ）又は該塩基配列（ｂ）に相補的
な塩基配列のオリゴヌクレオチド、をプライマーとして
使用することにより、ＶＴ１遺伝子に特異的な１７４ｂ
ｐのＤＮＡ断片を増幅させることができ、上記配列番号
３に示される塩基配列（ｃ）又は該塩基配列（ｃ）に相
補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列
番号４に示される塩基配列（ｄ）又は該塩基配列（ｄ）
に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド、をプライマ
ーとして使用することにより、ＶＴ２遺伝子に特異的な
１２８ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させることができ、マイ
クロチップ電気泳動法により極短時間で検体中にこれら
のベロ毒素遺伝子が存在するか否かが検出できることが
わかった。
【００２５】
【発明の効果】本発明によれば、検体の培養といった煩
雑な操作をすることなく、実施例に示したように増幅後
１０秒という極短時間で特異的に検体中のＶＴ１遺伝子
及び／又はＶＴ２遺伝子を検出でき、ベロ毒素産生性大
腸菌の有無を確認できるので、迅速かつ選択的な検出手
段としてその工業的価値は大である。
雑な操作をすることなく、実施例に示したように増幅後
１０秒という極短時間で特異的に検体中のＶＴ１遺伝子
及び／又はＶＴ２遺伝子を検出でき、ベロ毒素産生性大
腸菌の有無を確認できるので、迅速かつ選択的な検出手
段としてその工業的価値は大である。
【図１】実施例１のベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の
臨床分離株３種の増幅ＤＮＡ断片の泳動距離１ｃｍにお
けるマイクロチップ電気泳動検出結果。
臨床分離株３種の増幅ＤＮＡ断片の泳動距離１ｃｍにお
けるマイクロチップ電気泳動検出結果。
【図２】実施例１のベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の
ＶＴ１及びＶＴ２産生株の増幅ＤＮＡ断片の泳動距離
２．５ｍｍ、５ｍｍ、１ｃｍ、及び、３ｃｍにおけるマ
イクロチップ電気泳動検出結果。
ＶＴ１及びＶＴ２産生株の増幅ＤＮＡ断片の泳動距離
２．５ｍｍ、５ｍｍ、１ｃｍ、及び、３ｃｍにおけるマ
イクロチップ電気泳動検出結果。
【図３】（ａ）実施例２のベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１
５７のＶＴ１産生株の増幅ＤＮＡ断片と５０ｂｐ間隔ラ
ダーＤＮＡのマイクロチップ電気泳動検出結果。 （ｂ）実施例２のベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７のＶ
Ｔ２産生株の増幅ＤＮＡ断片と５０ｂｐ間隔ラダーＤＮ
Ａのマイクロチップ電気泳動検出結果。
５７のＶＴ１産生株の増幅ＤＮＡ断片と５０ｂｐ間隔ラ
ダーＤＮＡのマイクロチップ電気泳動検出結果。 （ｂ）実施例２のベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７のＶ
Ｔ２産生株の増幅ＤＮＡ断片と５０ｂｐ間隔ラダーＤＮ
Ａのマイクロチップ電気泳動検出結果。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１０月１９日（２０００．１０．
１９）
１９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】
【発明の効果】本発明によれば、検体の培養といった煩
雑な操作をすることなく、実施例に示したように増幅後
１０秒という極短時間で特異的に検体中のＶＴ１遺伝子
及び／又はＶＴ２遺伝子を検出でき、ベロ毒素産生性大
腸菌の有無を確認できるので、迅速かつ選択的な検出手
段としてその工業的価値は大である。
雑な操作をすることなく、実施例に示したように増幅後
１０秒という極短時間で特異的に検体中のＶＴ１遺伝子
及び／又はＶＴ２遺伝子を検出でき、ベロ毒素産生性大
腸菌の有無を確認できるので、迅速かつ選択的な検出手
段としてその工業的価値は大である。
【配列表】
<110> 日立化成工業株式会社
<120> ベロ毒素遺伝子検出のためのオリゴヌクレオチド
及びそれを用いたベロ毒素遺伝子の検出方法 <130> １２３００３７１ <160> ４ <210> １ <211> ２１ <212> ＤＮＡ <213> Escherichia coli O157:H7 <400> １ aacagcggtt acattgtctg g 21 <210> ２ <211> ２０ <212> ＤＮＡ <213> Escherichia coli O157:H7 <400> ２ aaccgtaaca tcgctcttgc 20 <210> ３ <211> ２０ <212> ＤＮＡ <213> Escherichia coli O157:H7 <400> ３ accagagatg catccagagc 20 <210> ４ <211> ２０ <212> ＤＮＡ <213> Escherichia coli O157:H7 <400> ４ ggcgtcatcg tatacacagg 20
及びそれを用いたベロ毒素遺伝子の検出方法 <130> １２３００３７１ <160> ４ <210> １ <211> ２１ <212> ＤＮＡ <213> Escherichia coli O157:H7 <400> １ aacagcggtt acattgtctg g 21 <210> ２ <211> ２０ <212> ＤＮＡ <213> Escherichia coli O157:H7 <400> ２ aaccgtaaca tcgctcttgc 20 <210> ３ <211> ２０ <212> ＤＮＡ <213> Escherichia coli O157:H7 <400> ３ accagagatg catccagagc 20 <210> ４ <211> ２０ <212> ＤＮＡ <213> Escherichia coli O157:H7 <400> ４ ggcgtcatcg tatacacagg 20
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｋ ３２５Ｅ (72)発明者 荒川 秀俊 東京都品川区旗の台１−５−８ 昭和大学 薬学部内 (72)発明者 柏崎 宏幸 東京都品川区旗の台１−５−８ 昭和大学 薬学部内 (72)発明者 渡辺 一之 東京都品川区旗の台１−５−８ 昭和大学 薬学部内 (72)発明者 前田 昌子 東京都品川区旗の台１−５−８ 昭和大学 薬学部内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA20 HA11 4B029 AA07 AA23 BB02 BB20 CC01 FA15 4B063 QA01 QQ06 QQ43 QR32 QR41 QR62 QS16 QS25 QS39 QX01
Claims (8)
- 【請求項１】ベロ毒素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝子
（以下、ＶＴ１遺伝子）を特異的に増幅するプライマー
及び／又はベロ毒素２型（以下、ＶＴ２）の遺伝子（以
下、ＶＴ２遺伝子）を特異的に増幅するプライマーを用
いて、マイクロチップキャピラリ電気泳動法で検出する
ことを特徴とするベロ毒素遺伝子の検出方法。 - 【請求項２】電気泳動用の分離用媒体として高分子ゲル
を用いることを特徴とする請求項１記載のベロ毒素遺伝
子の検出方法。 - 【請求項３】高分子ゲルが非交差型高分子ゲルであるこ
とを特徴とする請求項２記載のベロ毒素遺伝子の検出方
法。 - 【請求項４】非交差型高分子ゲルが直鎖状ポリアクリル
アミド、直鎖状ヒドロキシエチルセルロース、直鎖状ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、直鎖状ヒドロキシ
プロピルセルロース、直鎖状メチルセルロース、直鎖状
ポリエチレングリコール及び直鎖状ポリエチレンオキサ
イドのいずれかである請求項３記載のベロ毒素遺伝子の
検出方法。 - 【請求項５】マイクロチップキャピラリ電気泳動法が互
いに連結する試料導入用流路と試料分離用流路とを有す
るマイクロチップを用いることを特徴とする請求項１〜
４のいずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法。 - 【請求項６】ＶＴ１遺伝子を特異的に増幅するプライマ
ーが、下記の配列番号１〜２に示される塩基配列又は該
塩基配列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続し
た１５塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオ
チドである請求項１〜５のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法。 配列番号１： ＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧ ……（ａ） 配列番号２： ＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＧＣ ……（ｂ） - 【請求項７】ＶＴ２遺伝子を特異的に増幅するプライマ
ーが、下記の配列番号３〜４に示される塩基配列又は該
塩基配列に相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続し
た１５塩基よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオ
チドである請求項１〜６のいずれかに記載のベロ毒素遺
伝子の検出方法。 配列番号３： ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ ……（ｃ） 配列番号４： ＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧ ……（ｄ） - 【請求項８】次の（Ｉ）〜（IV）から選ばれる少なくと
も１組のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用
し、増幅させたヌクレオチド断片を用いる請求項１〜７
のいずれかに記載のベロ毒素遺伝子の検出方法。 （Ｉ）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のうち
の少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含有
するオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号２に示され
る塩基配列（ｂ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （II）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した１５塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、及び上記
配列番号２に示される塩基配列（ｂ）に相補的な塩基配
列のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチド （III）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のう
ちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列を含
有するオリゴヌクレオチド及び上記配列番号４に示され
る塩基配列（ｄ）のうちの少なくとも連続した１５塩基
よりなる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド （IV）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）に相補
的な塩基配列のうちの少なくとも連続した１５塩基より
なる塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド及び上記配
列番号４に示される塩基配列（ｄ）に相補的な塩基配列
のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列
を含有するオリゴヌクレオチド
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000089568A JP2001314187A (ja) | 2000-03-02 | 2000-03-28 | ベロ毒素遺伝子の検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000061858 | 2000-03-02 | ||
| JP2000-61858 | 2000-03-02 | ||
| JP2000089568A JP2001314187A (ja) | 2000-03-02 | 2000-03-28 | ベロ毒素遺伝子の検出方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001314187A true JP2001314187A (ja) | 2001-11-13 |
Family
ID=26586925
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|---|---|---|---|
| JP2000089568A Pending JP2001314187A (ja) | 2000-03-02 | 2000-03-28 | ベロ毒素遺伝子の検出方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001314187A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015114150A (ja) * | 2013-12-10 | 2015-06-22 | 株式会社島津製作所 | 電気泳動分離方法 |
| CN104777211A (zh) * | 2015-03-26 | 2015-07-15 | 浙江医学高等专科学校 | 一种检测α-眼镜蛇神经毒素的方法 |
| JP6992385B2 (ja) | 2017-10-02 | 2022-01-13 | 株式会社島津製作所 | 電気泳動用分離媒体、電気泳動用試薬キット、及び電気泳動方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03113358A (ja) * | 1989-09-28 | 1991-05-14 | Shimadzu Corp | キャピラリー電気泳動法 |
| JPH078280A (ja) * | 1993-06-15 | 1995-01-13 | Shimadzu Corp | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| JPH10132783A (ja) * | 1996-10-31 | 1998-05-22 | Shimadzu Corp | マイクロチップ電気泳動方法及び装置 |
-
2000
- 2000-03-28 JP JP2000089568A patent/JP2001314187A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03113358A (ja) * | 1989-09-28 | 1991-05-14 | Shimadzu Corp | キャピラリー電気泳動法 |
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
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| CN104777211A (zh) * | 2015-03-26 | 2015-07-15 | 浙江医学高等专科学校 | 一种检测α-眼镜蛇神经毒素的方法 |
| JP6992385B2 (ja) | 2017-10-02 | 2022-01-13 | 株式会社島津製作所 | 電気泳動用分離媒体、電気泳動用試薬キット、及び電気泳動方法 |
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