DE4313367C2 - Elektrophoresegerät - Google Patents
ElektrophoresegerätInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Elektrophoresegerät zum Trennen
und Messen einer Nukleinsäure, eines Proteins oder eines
Zuckers, das insbesondere zum Erfassen von DNS (Nukleinsäu
re) und ähnlicher Substanzen geeignet ist.
Ein Elektrophoresegerät, das Elektrophorese für molekularge
wichtsmäßige Trennung und zur Analyse von mit Fluoreszenz
stoffen markierten Proben nutzt, ist z. B. ein Bestimmungs
system für eine DNS-Basensequenz, das Fluoreszenzstoffe als
Markierungen verwendet, wobei die Bestimmung der Basense
quenz vom wohlbekannten Didesoxy-Sequenzerstellungsverfahren
abhängt, wie es von Sanger und seinem Kollegen erfunden wur
de, und die molekulargewichtsmäßige Trennung erfolgt durch
ein Elektrophoreseverfahren unter Verwendung von Polyacryl
amidgel. Normalerweise wird die Elektrophorese mit einem auf
einer zwischen zwei Glasplatten angeordneten Platte vorhan
denen Polyacrylamidgel ausgeführt. In den letzten Jahren
wurde ein Kapillar-Gelelektrophoreseverfahren entwickelt,
bei dem Gel in der Kapillare ausgebildet wird. Beim Kapil
lar-Gelelektrophoreseverfahren ist der Kapillardurchmesser
im allgemeinen sehr klein, und die Fläche pro Volumen des
Gels ist groß; dieses Merkmal erleichtert die Abfuhr Joule
scher Wärme und ermöglicht das Anlegen einer hohen Spannung
und damit das Erzielen sehr schneller Trennung.
Das erste Beispiel eines Kapillar-Gelelektrophoreseverfahrens
ist in Nucleic Acid Research, Bd. 18, S. 1415 bis 1419
(1990) beschrieben, das sehr schnelle und hochqualitative
Trennung von DNS-Fragmenten und Verwendung einer Kapillare
mit einem Innendurchmesser von 75 µm und einer Hochspannung
von 9 kV vorstellt, wie dies in Fig. 13 dargestellt ist.
Beim Detektor gemäß diesem Verfahren sind die Kapillarachse
und die Laserlichtachse in vertikaler Richtung um etwa 25°
verdreht, und das auf einen Durchmesser von 20 µm gebündelte
Laserlicht wird in der Mitte der Kapillare eingestrahlt.
Dann wird die sich ergebende Fluoreszenzstrahlung durch
Spektralanalyse mit einem Bandpaß-Interferenzfilter oder
einer ähnlichen Vorrichtung ermittelt. Fig. 13 ist eine ver
einfachte Darstellung dieses herkömmlichen Beispiels des
oben angegebenen Gerätes, um das Verständnis für dieses zu
erleichtern.
Ein zweites Beispiel aus dem Stand der Technik ist in Jour
nal of Chromatography, Bd. 516, S. 61-67 (1990) beschrie
ben. Dieses verwendet ein Kapillar-Gelelektrophoreseverfah
ren für die Bestimmung einer DNS-Basensequenz. Dieses Ver
fahren verwendet eine Kapillare mit einem Innendurchmesser
von 50 µm für molekulargewichtsmäßige Trennung von DNS-Fragmenten.
Das bei diesem Beispiel verwendete Meßinstrument ist
im wesentlichen dasjenige, wie es in Science, Bd. 242, S.
562-564 (1988) beschrieben ist. Zum Vereinfachen der in
Science vorgestellten Vorrichtung zeigt Fig. 14 eine mit
einer Laserstrahlquelle und einer Ummantelungsströmungspumpe
versehene Vorrichtung, wie beschrieben.
Zum Erfassen von DNS-Fragmenten wird die abgetrennte Flüs
sigkeit nach der molekulargewichtsmäßigen Trennung in eine
Quarzströmungskammer (Innenabmessung: 250 × 250 µm) einge
leitet, und es wird mit Hilfe einer Pumpe für Flüssigphasen
chromatographie dafür gesorgt, daß ein TRIS-Borat-Puffer mit
EDTA als Ummantelungslösung durchströmt, wobei die Pumpe den
Zustand für eine Ummantelungslösung schafft. Dann wird auf
einen Durchmesser von etwa 10 µm gebündeltes Laserlicht in
die beinahe durch die Mitte der Strömungskammer fließende,
abgetrennte Flüssigkeit eingestrahlt, wodurch die von den
DNS-Fragmenten herrührende Fluoreszenzstrahlung mit Hilfe
eines Spektralfilters gemessen wird.
Ein drittes Ausführungsbeispiel der Verwendung eines Wande
rungspfades zur Bestimmung einer Basensequenz ist in Nature,
Bd. 321, S. 674-679 (1986) und an anderen Stellen be
schrieben. Wie angegeben, wird jede Art der endständigen
Base von DNS-Fragmenten durch Fluoreszenzstoffe mit vier
verschiedenen Arten für die Wellenlängen maximaler Fluores
zenzemission markiert (Fluoreszin, 4-Chloro-7-Nitrobenzo-
2-oxa-1-Diazol (NBD) und Tetramethylrhodamin, Texasrot (Hand
delsbezeichnung von Molecular Probes, Inc.)). Ein Laser wird
dazu verwendet, die Fragmente anzuregen, die in der Rangord
nung ihrer Molekulargewichte wandern, und jede Fluoreszenz
strahlung wird durch vier Arten von Bandpaß-Interferenzfiltern
abgetrennt, um Fluoreszenzstrahlungserfassung und Ba
sensequenzbestimmung auszuführen.
Beim Kapillarelektrophoreseverfahren ist höhere Empfindlich
keit gefordert, um die Größe der Proben verringern zu kön
nen. Die Verarbeitungsmöglichkeiten sollen verbessert wer
den, und es soll eine größere Anzahl von Proben gleichzeitig
bearbeitet werden können. Bei der Fluoreszenzstrahlungsmes
sung bei Elektrophorese wird Hintergrundlicht zusätzlich zur
Fluoreszenzstrahlung eines jeweiligen Fluoreszenzstoffes
selbst emittiert, mit Streulicht und Fluoreszenzstrahlung
des Anregungslichts (Rayleigh-Streuung) durch das Gel, ge
streutem Licht vom Gelträger, d. h. von der Innen- und der
Außenwand der Kapillare, oder Fluoreszenzstrahlung von der
Kapillare selbst, was zu einem erhöhten Wert des Hinter
grundlichts und verringerter Meßempfindlichkeit führt. Eine
der Hauptschwierigkeiten zum Erzielen hochempfindlicher
Fluoreszenzstrahlungserfassung ist die Frage, wie solches
Hintergrundlicht ausgeschaltet werden kann.
Eine Verbesserung der Verarbeitungsfähigkeit erfordert ein
Erhöhen der Wanderungsgeschwindigkeit oder Erfassung durch
gleichzeitiges Wandern zweier oder noch mehr Proben durch
die Kapillare, die einen Wanderungspfad darstellt. Die Lö
sung dieses Problems ist sehr wichtig.
Das erste Beispiel aus dem Stand der Technik gewährleistet
eine höhere Empfindlichkeit der Fluoreszenzstrahlungserfas
sung durch zwei Maßnahmen:
- 1) Das Anregungslicht (Streulicht) wird durch das Bandpaß-Interferenzfilter abgeschnitten, wodurch die Fluoreszenzkom ponente abgetrennt und erfaßt wird; und
- 2) die Kapillarachse wird um 25° gegenüber einer Position rechtwinklig zur Ebene mit der Laserstrahlachse und der Fluoreszenzstrahlungs-Bündelungsachse verdreht.
Jedoch kann die erste Maßnahme wegen der einem Interferenz
filter eigenen Wirkung gestreutes Licht nicht auf einfache
Weise ganz ausschließen. Ferner kann vom Gel und dem Glas
rohr selbst eine schwache Fluoreszenzstrahlung ausgehen,
welche Art der Hintergrundbeleuchtung durch das Bandpaß-Interferenzfilter
nicht völlig beseitigt werden kann. Die
letztere Maßnahme ist eine wirkungsvolle Vorgehensweise, die
durch das Verdrehen der Kapillare den Anteil des gestreuten
Lichts verringert, der in die Fluoreszenzstrahlungs-Kondensorlinse
eintritt; jedoch weist die Kapillare kreisförmigen
Querschnitt mit kleinem Durchmesser auf, was zu starker In
tensität des Streulichts führt. Das Streulicht wird mehr
oder weniger in allen Richtungen abgestrahlt, und eine Ver
ringerung der Fluoreszenzstrahlung vom Gel und dem Glasrohr
kann durch Verdrehen der Kapillare nicht erzielt werden.
Diese Maßnahme ist ebenfalls nicht dazu in der Lage, Hinter
grundsignale ausreichend zu beseitigen. Aus der vorstehenden
Diskussion ist ersichtlich, daß der Stand der Technik Hin
tergrundbeleuchtung nicht ausreichend beseitigen kann, wo
durch hochempfindliche Fluoreszenzstrahlungsmessung nicht
möglich ist.
Diese Beispiele aus dem Stand der Technik verwenden nur eine
Kapillare, und gleichzeitige Verarbeitung für zwei oder mehr
Proben wird nicht beschrieben oder auch nur vorgeschlagen.
Es könnte daran gedacht werden, daß einfach zwei oder mehr
Vorrichtungen verwendet werden, wie sie in Fig. 13 darge
stellt sind. Dies erfordert jedoch zwei oder mehr Laserquel
len, Detektoren und optische Teile, und die gesamte Vorrich
tung wird sehr teuer; es handelt sich um keine realistische
Lösung für das Problem.
Es wäre auch möglich, zwei oder mehr Kapillaren anzuordnen,
die alle von einem einzigen Laserstrahl beleuchtet werden.
Wenn jedoch das Laserlicht auf die Kapillaren strahlt, wird
das Licht an der Grenze zum kreisförmigen Querschnitt der
Kapillare gebeugt und gestreut, und Licht, das durch die
Kapillaren läuft, wird über einen übermäßig großen Bereich
gestreut; daher ist dieses Konzept nicht realistisch. Anders
gesagt, bestehen keine Schwierigkeiten, wenn nur eine Kapil
lare vorhanden ist. Wenn zwei oder mehr Kapillaren konti
nuierlich beleuchtet werden, wird die Intensität des Lichts,
das in die nächste Kapillare strahlt, bei jedem Durchtritt
durch eine Kapillare extrem verringert, was zu einem Fehl
schlag bei der Erfassung der Fluoreszenzstrahlung führt.
Die obige Diskussion zeigt, daß viele Probleme der Beispiele
aus dem Stand der Technik auftreten, wenn zum Verbessern der
Verarbeitungskapazität versucht wird, eine Bearbeitung von
zwei oder mehr Proben gleichzeitig durchzuführen.
Das zweite Beispiel aus dem Stand der Technik ist ein Kapillar-Gelelektrophoreseverfahren,
das für wirkungsvolle Besei
tigung des durch die Kapillare und das Gel gestreuten Lichts
sorgt. Das Ende des Kapillargels wird als Probeneinlaß für
die Ummantelungsströmungskammer verwendet, und die Proben
flüssigkeit wird aus dem Kapillargel so herausgeführt, daß
die Fluoreszenz im Zustand einer Ummantelungsströmung gemes
sen wird. Dies beseitigt gestreutes Licht an der Grenze zur
Kapillare sowie Streulicht und Fluoreszenzstrahlung vom Gel.
Die Probenflüssigkeit strömt beinahe in der Mitte der Umman
telungsströmungskammer mit laminarer Strömung, ohne daß sie
die Innenseite der Ummantelungsströmungskammer berührt. Dies
sorgt für eine räumliche Trennung zwischen dem Streulicht
von der Ummantelungsströmungskammer und der Fluoreszenz
strahlung von der Probe, was hochempfindliche Messung der
Fluoreszenzstrahlungsintensität gewährleistet. Um die Umman
telungsströmung zu schaffen, ist es jedoch erforderlich,
eine TRIS-Borat-Pufferlösung als Ummantelungslösung dauernd
durch eine Pumpe für Flüssigphasenchromatographie mit vorge
gebener Strömungsgeschwindigkeit in die Ummantelungsströ
mungskammer zu pumpen. Dieses Verfahren hat Schwierigkeiten
wegen einer sehr teuren Ausrüstung und einer komplizierten
Struktur. Ferner ist die Ummantelungsströmungskammer kompli
ziert aufgebaut, mit einem großen Durchmesser des Einlasses
für die Ummantelungslösung und kleiner Größe für den Fluo
reszenzstrahlungsdetektor, bei dem es sich um einen Umman
telungsströmungsbereich handelt. Dies macht die Herstellung
der Ummantelungsströmungskammer schwierig und teuer. Beim
vorliegenden Beispiel aus dem Stand der Technik wird, wie
beim ersten Beispiel, nichts über gleichzeitige Verarbeitung
von zwei oder mehr Proben beschrieben oder vorgeschlagen.
Die Verwendung von zwei oder mehr Vorrichtungen, wie sie in
Fig. 14 dargestellt sind, erfordern größere Abmessungen des
Gerätes und höhere Kosten. Dies stellt keine realistische
Lösung des Problems dar.
Es ist auch möglich, zwei oder mehr Ummantelungsströmungs
kammern anzuordnen, wobei jede mit einer Kapillare versehen
ist und mit einem gesonderten Laserstrahl zu beleuchten ist.
Das Laserlicht strahlt nicht direkt auf die Kapillare, so
daß das Licht in diesem Fall weder gebeugt noch gestreut
wird. Da jedoch eine Ummantelungsströmungskammer für jede
Kapillare vorhanden ist, ist es schwierig, den Raum zwischen
den Kapillaren zu verringern, was zu erhöhter Größe der Um
mantelungsströmungskammer führt. Die Verwendung von zwei
oder mehr Ummantelungsströmungskammern erhöht die Kosten.
Ferner führt ein Beleuchten aller Probenflüssigkeiten, die
in zwei oder mehr Ummantelungsströmungskammern fließen, un
ter gleichen Bedingungen zu einem Fehlschlag hinsichtlich
eines Bündelns des Laserstrahls. Dies, weil die Trenntiefe
des Laserlichts mit der Bestrahlungsfleckgröße verknüpft
ist; verringerte Fleckgröße bedeutet kürzere Trenntiefe, je
doch ist der Raum zwischen den Bündeln der in die Ummante
lungsströmungskammer fließenden Probenflüssigkeiten größer.
Die obige Diskussion zeigt, daß viele Schwierigkeiten vor
handen sind, wenn die Beispiele aus dem Stand der Technik
auf die gleichzeitige Verarbeitung zweier oder mehrerer Pro
ben angewendet werden, um die Verarbeitungskapazitäten zu
erhöhen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Elektrophore
segerät anzugeben, das hochempfindliche und einfache Fluo
reszenzstrahlungsmessung oder Lichtabsorptionsmessung von
durch Elektrophorese getrennten Proben gewährleistet.
Erfindungsgemäße Lösungen dieser Aufgabe sind in den Ansprü
chen 1 und 2 angegeben; vorteilhafte Weiterbildungen ergeben
sich aus den Unteransprüchen.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung nach Anspruch 1
sind die Enden eines Paars oder mehrerer Paare von Kapillaren
mit den Gefäßen für die Kathodenelektrode bzw. die Anoden
elektrode verbunden, während die anderen Enden einander mit
einem vorgegebenen Spalt gegenüberstehen, wobei ihre Achsen
im wesentlichen zusammenfallen und sie einander in der opti
schen Zelle gegenüberstehen, ist die Ausbildung eines Wande
rungspfades möglich, der durch die optische Zelle geht. Da
der optischen Zelle Ummantelungslösung von außen zugeführt
wird, kann die vom Kapillarende des stromaufwärtigen Wande
rungspfades ausgehend wandernde Probe, d. h. die im Proben
trennbereich wandernde Probe, in einen Zustand einer Ummante
lungsströmung versetzt werden und dann in die Kapillaren ge
leitet werden. So können die Proben sowohl in den stromauf
wärtigen als auch in den stromabwärtigen Kapillaren dauernd
wandern, was eine Wanderung der Proben nur zum Spalt auf der
Achse zwischen der stromaufwärtigen und der stromabwärtigen
Kapillare sicherstellt. Dieser Spalt wird als Erfassungsab
schnitt verwendet, und das Einstrahlen im optischen Erfas
sungsabschnitt von der Lichtquelle kann in der Flüssigkeit
ohne Kapillare vorgenommen werden, was optische Erfassung von
Fluoreszenzstrahlung oder von Lichtabsorption ermöglicht.
Dies gewährleistet eine hochempfindliche Erfassung von Fluo
reszenzstrahlung oder Lichtabsorption, während das Auftreten
von Streulicht und von Fluoreszenzstrahlung durch Kapillaren
oder durch Kapillargel verhindert wird.
So werden zwei oder mehr Kapillaren unter Einhaltung eines
vorgegebenen Spaltes in einer optischen Zelle gehalten, wo
bei ihre Achsen im wesentlichen miteinander übereinstimmen.
Dadurch können stromaufwärtige Kapillaren, die Probentrenn
bereiche darstellen, und Spalte, die optische Erfassungsab
schnitte darstellen, leicht ausgebildet werden. Der Proben
wanderungspfad kann dadurch genau festgelegt werden, daß ein
Paar Kapillaren stromabwärts angeordnet wird, was sowohl die
Beleuchtung durch eine Lichtquelle gewährleistet und er
leichtert als auch den Empfang von Licht, wie von Fluores
zenzstrahlung gewährleistet und vereinfacht. Darüber hinaus
treten Ummantelungsflüssigkeit und die Proben nur durch das
Innere der Kapillare aus der optischen Zelle aus. Da die
Kapillare einen kleinen Durchmesser aufweist, ist es mög
lich, die Strömungsgeschwindigkeit der in die optische Zelle
eingeleiteten Ummantelungslösung zu erniedrigen, was einen
bedeutenden Beitrag zum Einsparen von Ummantelungslösung
darstellt. Die Strömungsgeschwindigkeit der Ummantelungslö
sung hängt vom Innendurchmesser der Kapillare, nicht von den
Abmessungen der optischen Zelle, ab. Dieses Merkmal besei
tigt das Erfordernis eines Erhöhens des Querschnitts des
Einlasses für die Ummantelungslösung, um die optische Zelle
so auszubilden, daß der Querschnitt des Strömungsbereichs
für die Ummantelungslösung verringert wird, wie im Fall
einer gewöhnlichen Ummantelungsströmungskammer. Es erlaubt
die Verwendung einer quaderförmigen optischen Zelle und da
mit eine einfache und wirtschaftliche Herstellung derselben.
So können zwei oder mehr optische Erfassungsabschnitte, die
durch zwei oder mehr Paare von Kapillaren gebildet werden,
in der optischen Zelle dicht beieinander angeordnet werden,
das die Größe des Systems wesentlich verringert.
Die optische Zelle und eine Leitung, die die Ummantelungs
strömung erzeugt, sind ausreichend; dies gewährleistet einen
einfachen und wirtschaftlichen Aufbau des Systems. Darüber
hinaus werden von den Kapillaren ausgehend wandernde Proben
für jede Kapillare in den Zustand der Ummantelungsströmung
versetzt, wenn sie durch den optischen Erfassungsabschnitt
laufen, und die Ummantelungsströmungen unterliegen alle den
selben Bedingungen. Ummantelungsströmungsbedingungen, wie
die Strömungsgeschwindigkeit, werden für jede Kapillare
gleich eingestellt, was die optische Erfassungsgenauigkeit
verbessert. Das Innere der optischen Zelle weist einen gro
ßen Querschnitt auf, da sie zwei oder mehr Paare von Kapil
laren enthält. Jedoch strömt die Ummantelungslösung aus den
Kapillaren an der stromabwärtigen Seite aus. Demgemäß ent
spricht der effektive Querschnitt für die Strömung der Um
mantelungslösung der Summe der Innendurchmesser der Kapilla
ren; er ist gegenüber dem Querschnitt der optischen Zelle
selbst sehr klein. Daher kann die Strömungsgeschwindigkeit
der Ummantelungslösung verringert werden, was einen Beitrag
zur Verringerung des Volumens derselben und zur Größe des
Systems leistet.
Zwei oder mehr Kapillaren sind so angeordnet, daß zwei oder
mehr optische Erfassungsabschnitte in einer geraden Linie in
einer optischen Zelle angeordnet sind, und Anregungslicht
wird entlang dieser geraden Linie eingestrahlt, so daß alle
optischen Erfassungsabschnitte gleichzeitig beleuchtet wer
den, was gleichzeitige Erfassung der Fluoreszenz durch die
zwei oder mehr optischen Erfassungsabschnitte gewährleistet.
Ferner sind zwei oder mehr optische Erfassungsabschnitt mit
einander über Flüssigkeit verbunden, so daß jeder Erfas
sungsabschnitt beleuchtet werden kann, ohne daß das Anre
gungslicht durch Streulicht von den Kapillaren beeinflußt
wird. Dieses Merkmal sorgt für wirkungsvolles Einleiten des
Streulichts in die Erfassungsabschnitte, was eine hochgenaue
Messung der Fluoreszenzstrahlung ermöglicht. Wenn eine zwei
dimensionale TV-Kamera als Lichterfassungsabschnitt verwen
det wird, können die Fluoreszenzbilder von zwei oder mehr
Erfassungsabschnitten gleichzeitig gemessen werden. Zwei
oder mehr Paare von Kapillaren sind in einer optischen Zelle
so angeordnet, daß zwei oder mehr optische Erfassungsab
schnitte in einer geraden Linie liegen, und die zwei oder
mehr Paare von Kapillaren können in dichten Kontakt zueinan
der gebracht werden. Diese Anordnung verringert nicht nur
die Größe und den Preis des Systems, sondern verkürzt auch
den Abstand zwischen den optischen Erfassungsabschnitten,
die an den Enden entlang der geraden Linie liegen. Ein ver
ringerter Abstand zwischen den optischen Erfassungsabschnit
ten an den Enden führt dazu, daß alle optischen Erfassungs
abschnitte im wesentlichen mit demselben Lichtstrahl be
leuchtet werden, selbst wenn das Anregungslicht durch eine
Linse oder dergleichen gebündelt wird. Wenn z. B. das Laser
licht brennweitenmäßig auf 100 µm gebündelt wird, beträgt
der Durchmesser des Laserlichts ungefähr 100 µm im Bereich
von 10 mm an der Vorderseite und der Hinterseite des Brenn
bereichs. Wenn Kapillaren mit einem Außendurchmesser von
200 µm und einem Innendurchmesser von 10 µm mit Abständen
von 400 µm angeordnet werden, können etwa 50 Kapillaren im
Bereich von etwa 10 mm zwischen der Vorder- und der Hinter
seite des Brennbereichs angeordnet werden, und sie können
mit einem Lichtstrahl mit im wesentlichen konstantem Durch
messer und konstanter Intensität beleuchtet werden. Dies er
laubt es, daß die optischen Erfassungsabschnitte mit gebün
deltem Anregungslicht beleuchtet werden können, was die
Fluoreszenzintensität erhöht, wodurch hochempfindliche Mes
sung der Probe gewährleistet wird.
Darüber hinaus wird einfache molekulargewichtsmäßige Tren
nung durch den aus dem Kapillargel bestehenden Probentren
nungsbereich gewährleistet. Es ist auch möglich, die strom
abwärtigen Kapillaren hohl auszubilden, was wirkungsvolles
Durchströmen der Ummantelungslösung erlaubt. Statt der Ka
pillaren kann stromabwärtig auch eine Einrichtung verwendet
werden, die auf entsprechende Weise arbeitet, z. B. eine
Platte mit Löchern oder Nuten mit einer Anzahl, die derjeni
gen der stromaufwärtigen Kapillaren entspricht. Die Elektri
zitätsflußrichtung im Spalt, d. h. im optischen Erfassungs
abschnitt kann dadurch festgelegt werden, daß die Ummante
lungslösung entsprechende Komponenten, wie die Pufferlösung,
in einer Kapillare aufweist, wodurch für Elektrophorese von
Proben gesorgt wird. Da die Pufferlösung entsprechende Zu
sammensetzung sowohl innerhalb als auch außerhalb der Kapil
laren aufweist, besteht ferner keine Möglichkeit, daß die
Pufferlösung innerhalb einer Kapillare in die optische Zelle
ausströmt, was zu einer Änderung der Zusammensetzung führen
würde. Daher geht die Probentrennfunktion während der Elek
trophorese nicht verloren. Wenn die Proben einsträngige DNS-Proben
sind, kann in der Ummantelungslösung ein Denaturie
rungsmittel vorhanden sein. In diesem Fall ist es möglich,
ein Rückbinden zu verhindern, wenn DNS-Proben im Spalt,
d. h. im optischen Erfassungsabschnitt, wandern; dies bedeu
tet erhöhte Meßgenauigkeit. Dieses Merkmal erniedrigt die
Möglichkeit, daß in der Kapillare vorhandenes Denaturie
rungsmittel in die optische Zelle ausleckt, und es verhin
dert, daß die Probentrennfunktion verlorengeht.
Zum Zuführen der Ummantelungslösung in die optische Zelle
wird das Ummantelungslösungsniveau im Ummantelungslösungs
behälter höher eingestellt als das Flüssigkeitsniveau im
stromabwärtigen Elektrodengefäß, und es wird dafür gesorgt,
daß die Ummantelungsflüssigkeit durch den Niveauunterschied
zwischen den zwei Flüssigkeiten gleichmäßig strömt. Dies be
seitigt das Erfordernis des Herstellens einer Strömung durch
eine mechanische Einrichtung, und es sorgt für einen einfa
chen und wirtschaftlichen Aufbau des Gerätes. Ferner besei
tigt dieses Merkmal pulsierende Strömung, wie sie auftreten
kann, wenn eine Pumpe verwendet wird, wodurch eine stabile
Ummantelungsströmung und höhere Meßgenauigkeit gewährleistet
werden. Die Strömungsgeschwindigkeit der Ummantelungslösung
kann leicht dadurch eingestellt werden, daß der Niveauunter
schied zwischen dem Niveau der Ummantelungsflüssigkeit in der
Ummantelungslösungsflasche und dem Flüssigkeitsniveau im
stromabwärtigen Elektrodengefäß verändert wird.
Darüber hinaus wird im optischen Erfassungsabschnitt entweder
die Fluoreszenzstrahlung oder die Lichtabsorption der Proben
gemessen. Die Spaltweite liegt nicht fest, jedoch beträgt sie
vorzugsweise 0,1 mm bis 3,0 mm. Im allgemeinen ermöglicht ei
ne kleinere Spaltweite einfachere Elektrophorese der Proben
im Spaltraum, so daß die Spaltweite grundsätzlich klein sein
sollte. Jedoch ist das Zusammenbauen des Gerätes schwieriger,
wenn die Spaltweite sehr klein ist; daher ist sie in der Pra
xis vorzugsweise 0,1 mm oder mehr. Jedoch kann sie auch auf
weniger eingestellt werden. Die Grenze wird durch die Breite
des Anregungsstrahls, wie eines Laserstrahls, im Spalt be
stimmt. Umgekehrt bewirkt eine größere Spaltweite eine leich
tere Aufweitung der Proben. Der Erfinder hat herausgefunden,
daß eine Spaltweite von 3 mm für ruhige Elektrophorese der
Proben sorgt. Das heißt, eine Spaltweite von 0,1 mm bis 3,0 mm
erlaubt ruhige und wirkungsvolle Elektrophorese der Proben.
Elektrophorese mit einem in einer optischen Zelle gehaltenen
Paar von Kapillaren sorgt dafür, daß Proben entlang einer Li
nie wandern, die die zwei Kapillaren miteinander verbindet,
ohne daß sie in Berührung mit der Innenfläche der optischen
Zelle kommen. Dies beseitigt die Möglichkeit, daß die Proben
an der Innenfläche der Zelle adsorbiert werden oder durch
Streulicht von der Innenseite der Zelle beeinflußt werden,
wodurch die Meßempfindlichkeit verbessert wird.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung nach Anspruch 2
enden die zwei oder mehr Kapillaren, deren andere Enden in
die Elektrodengefäße eingetaucht sind, in der optischen
Zelle, und Ummantelungslösung wird in dieselbe von außen her
eingeleitet. Dies sorgt dafür, daß in den Kapillaren wan
dernde Proben in der optischen Zelle im Zustand einer Umman
telungsströmung fließen. Unter Verwendung des Ummantelungs
strömungsbereichs als optischer Erfassungsabschnitt und bei
Ausbildung des Elektrophoresegerätes mit demselben Aufbau,
wie unter (1) angegeben, ist es auch möglich, getrennt Proben
zu erfassen, die in den Kapillaren wandern, wodurch dieselben
Ergebnisse wie beim Aufbau (1) eines Elektrophoresegeräts er
halten werden.
Andere Funktionen, wie sie in Verbindung mit dem obigen Aus
führungsbeispiel nach Anspruch 1 genannt wurden, sind beim
Ausführungsbeispiel nach Anspruch 2 dieselben.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden anhand
der Zeichnungen näher beschrieben.
Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das einen Elektrophoresebereich
und ein Laserbeleuchtungssystem bei einem Elektrophoresegerät
gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt;
Fig. 2 ist ein Blockdiagramm, das das Fluoreszenzstrahlungs-Meßsystem
beim Elektrophoresegerät gemäß einem zweiten Aus
führungsbeispiel der Erfindung zeigt;
Fig. 3 ist ein Blockdiagramm, das das Beleuchtungssystem und
das Meßsystem eines Elektrophoresegerätes gemäß einem dritten
Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt;
Fig. 4 ist ein Blockdiagramm, das den Bereich um Spalte in
einem Elektrophoresegerät gemäß einem vierten Ausführungsbei
spiel der Erfindung zeigt;
Fig. 5 ist ein Blockdiagramm, das den Elektrophoresebereich
eines Elektrophoresegerätes gemäß einem fünften Ausführungs
beispiel der Erfindung zeigt;
Fig. 6 ist eine perspektivische Ansicht einer mit zwei oder
mehr Nuten versehenen Platten gemäß einem sechsten Ausfüh
rungsbeispiel der Erfindung;
Fig. 7 zeigt eine Fluoreszenzzelle des Elektrophoresebe
reichs des Elektrophoresegeräts gemäß dem sechsten Ausfüh
rungsbeispiel der Erfindung;
Fig. 8 ist ein Blockdiagramm, das ein Elektrophoresegerät
gemäß einem siebten Ausführungsbeispiel der Erfindung veran
schaulicht;
Fig. 9 ist eine vergrößerte Schnittdarstellung einer Fluo
reszenzzelle gemäß dem siebten Ausführungsbeispiel der Er
findung;
Fig. 10 ist ein Blockdiagramm, das ein Elektrophoresegerät
gemäß einem achten Ausführungsbeispiel der Erfindung veran
schaulicht;
Fig. 11 ist ein Blockdiagramm, das ein Elektrophoresegerät
gemäß einem neunten Ausführungsbeispiel der Erfindung veran
schaulicht;
Fig. 12 ist eine vergrößerte Schnittdarstellung einer Fluo
reszenzzelle gemäß einem zehnten Ausführungsbeispiel der Er
findung;
Fig. 13 ist ein Blockdiagramm, das einen Fluoreszenzstrah
lungsdetektor eines bekannten Elektrophoresegeräts mit Ka
pillaren veranschaulicht; und
Fig. 14 ist ein Blockdiagramm, das einen Fluoreszenzstrah
lungsdetektor mit einer Ummantelungsströmungsküvette bei
einem bekannten Elektrophoresegerät mit Kapillaren veran
schaulicht.
Beim Ausführungsbeispiel werden mit Fluoreszenzstoffen mar
kierte DNS-Fragmente nach ihrem Molekulargewicht durch die
Elektrophorese getrennt und fluoreszenzmäßig erfaßt. Das
Folgende beschreibt den Fall der Verwendung von Fluoreszin-
Isothizyanat (FITC) zu Fluoreszenzmarkierung. Anstatt mit
Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente zu verwenden, ist
es auch möglich, nur teilweise in solcher Weise markierte
derartige Fragmente zu verwenden.
Zum Beispiel werden Proben durch eine DNS-Polymerasereaktion
unter Verwendung eines mit einem Fluoreszenzstoff markierten
Startermoleküls nach dem wohlbekannten, von Sanger und Kol
legen erfundenen Didesoxy-Sequenzerstellungsverfahren herge
stellt. Das heißt, daß ein mit FITC verbundenes Startermolekül
(markiertes Startermolekül) als Startermolekül verwendet
wird, und dieses einer einsträngigen Matrizen-DNS zugesetzt
und mit dieser erhitzt wird, wodurch das markierte Starter
molekül mit der einsträngigen DNS verbunden wird. Danach
werden dATP, dTTP, dCTP, dGTP und ddATP zugesetzt, um die
DNS-Polymerasereaktion zu bewirken. Der obige Ablauf sorgt
für DNS-Fragmente, die mit Fluoreszenzstoffen markiert sind
und verschiedene Längen mit der Endgruppe A aufweisen. Sol
che Fragmente werden als Proben verwendet.
Zunächst wird der Aufbau des Geräts beschrieben. Fig. 1
zeigt den Aufbau des Elektrophoresebereichs und des Laser
einstrahlungsbereichs des Elektrophoresegeräts des Ausfüh
rungsbeispiels. Fig. 2 zeigt den Aufbau des Fluoreszenzer
fassungssystems des Elektrophoresegeräts. Das Elektrophore
segerät ist für gleichzeitige Erfassung mindestens zweier
Proben dadurch ausgebildet, daß 20 Kapillaren vorhanden
sind, die als Probentrennbereich dienen. Der Probentrennbe
reich verwendet 20 Kapillaren 1a, 1b, 1c, 1d . . . 1t, die aus
Silicatglas hergestellt sind. Es wird davon ausgegangen, daß
es sich um ideale Silicatglaskapillaren mit einem Innen
durchmesser von 100 µm, einem Außendurchmesser von 375 µm
und einer Länge von 40 cm handelt. Es werden auch 20 Sili
catglaskapillaren mit 2a, 2b, 2c, 2d . . . 2t mit demselben
Außen-und Innendurchmesser mit einer Länge von 10 cm verwen
det. Für die Kapillaren 1a bis 1t wird ein Kapillargel mit
Polyacrylamidgel zubereitet, das Harnstoff als Denaturie
rungsmittel enthält. Zunächst wird das Innere der Kapillaren
ausgewaschen und einer Haftvermittlungsbearbeitung mit Silan
unterzogen. Dann wird eine Lösung aus N,N,N′,N′-Tetramethyl
ethylendiamin und Ammoniumpersulfat einem TRIS-Borat-Puffer
mit 3,84 Prozent entgastem Acrylamid, 0,16 Prozent N,N′-
Methylen-Bis-Acralamid, 7 M Harnstoff und 2 mM EDTA zuge
setzt und in die Kapillaren eingefüllt; dann wird das Acryl
amidgel durch Polymerisierung erhalten. Da die Kapillaren
mit dem Silan-Haftvermittler bearbeitet wurden, binden das
Acrylamidgel und die Kapillaren chemisch aneinander, was die
Möglichkeit ausschließt, daß das Gel während der Elektropho
rese aus den Kapillaren austritt.
Die Kapillaren 2a bis 2t werden so behandelt, daß ihre In
nenflächen positiv geladen sind. Zunächst wird eine 3-(2-
Aminoethylaminopropyl)-Trimethoxysilan-Lösung in die Kapil
laren gefüllt, um eine Reaktion hervorzurufen. Dann folgt
eine Wärmebehandlung bei 110°C, und unter anderem wird ein
Säurerest auf die Innenwände der Kapillaren übertragen, um
diese positiv zu laden. Dies ändert die Richtung des elek
troosmotischen Flusses vom negativen zum positiven Pol in
nerhalb jeder der Kapillaren 2a bis 2t. Die Wanderungsrich
tung (vom negativen zum positiven Pol) der Proben in den mit
dem Polyacrylamidgel aufgefüllten Kapillaren 1a bis 1t wird
an die Wanderungsrichtung (vom negativen zum positiven Pol)
von Proben in den Kapillaren 2 angepaßt, was Probenwanderung
sicherstellt. Die Enden der Kapillaren 1a bis 1t und der Ka
pillaren 2a bis 2t werden Kopf an Kopf in die optische Zelle
eingesetzt und mit einem vorgegebenen Spalt voneinander be
abstandet gehalten; dann werden die Proben optisch erfaßt.
In diesem Fall wird eine Fluoreszenzzelle zum Erfassen der
Proben durch Fluoreszenz verwendet. Das heißt, daß die Enden der
Kapillaren 1a bis 1t und der Kapillaren 2a bis 2t innerhalb
einer rechteckigen Fluoreszenzzelle 4 aus Silicat angeordnet
werden (Außenabmessungen: 36 mm breit, 4,5 mm tief und 3 mm
lang; Innenabmessungen: 30 mm breit, 2 mm tief und 3 mm
lang; wobei die Breite die Horizontalrichtung in der Zeich
nung (Richtung der Kapillaren 1a bis 1t), die Tiefe die
Richtung rechtwinklig zur Zeichenebene und die Länge die
Längsrichtung (Richtung der Probenwanderung von den Kapilla
ren 1 nach 2) in der Zeichnung bezeichnen). Sie sind so an
geordnet, daß die Kapillare 1a koaxial zur Kapillare 2a an
geordnet ist und diese einander mit einem Spalt 3a einer
Länge von 1 mm gegenüberstehen. Entsprechend sind die Kapil
laren 1b und 2b, 1c und 2c, 1d und 2d, . . ., 1t und 2t so an
geordnet, daß sie Spalte 3b, 3c, 3d . . . 3t bilden. Um die
Kapillaren in der optischen Zelle festzuhalten, wird in der
Regel ein Mehrkapillarhalter mit 20 vertikalen Löchern mit
Abständen von 0,6 mm verwendet, die in einem plattenförmigen
Block aus einem fluorhaltigen Polymer, z. B. Tetrafluor
ethylen-Polymer angebracht sind. Genauer gesagt, wird jede
der Kapillaren 1a bis 1t in jeweils eines der 20 Vertikal
löcher des Mehrkapillarhalters 5a eingesetzt. Dann wird jede
der Kapillaren 2a bis 2t in jeweils eines der 20 Vertikal
löcher des Mehrkapillarhalters 5b eingesetzt. Der Mehrkapil
larhalter 5a und der Mehrkapillarhalter 5b werden in dichter
Berührung mit der Oberseite und dem Boden der Fluoreszenz
zelle 4 befestigt, um sicherzustellen, daß die Kapillaren 1a
und 2a, 1b und 2b, 1c und 2c, 1d und 2d, . . ., 1t und 2t je
weils koaxial sind. Da die Spalte 3a bis 3t im vorliegenden
Fall als optischer Erfassungsabschnitt oder als Fluoreszenz
erfassungsabschnitt verwendet werden, erfolgt ferner eine
Einstellung der Länge der Kapillaren 1a bis 1t und 2a bis 2t
innerhalb der Quarzfluoreszenzzelle (optische Zelle zum Er
fassen von Fluoreszenz) 4 in solcher Weise, daß die Spalte
3a bis 36 entlang einer geraden Linie liegen. Die anderen
Enden der Kapillaren 1a bis 1t und 2a bis 2t werden in ein
Gefäß für eine Kathodenelektrode 6 und ein Gefäß für eine
Anodenelektrode 7 eingetaucht, die mit einer Pufferlösung
versorgt werden (TRIS-Borat-EDTA-Pufferlösung mit Harn
stoff). Das Innere der Fluoreszenzzelle 4 ist zum Füllen mit
einer Ummantelungslösung mit einem Ummantelungslösungseinlaß
8 versehen, damit Ummantelungslösung 11 aus einer Ummante
lungslösungsflasche 10 über ein Rohr 9 aus einem Tetrafluor
ethylen-Polymeren eingeleitet werden kann. Die Ummantelungs
lösung 11 verwendet eine TRIS-Borat-EDTA-Pufferlösung mit
Harnstoff mit derselben Zusammensetzung wie derjenigen der
Pufferlösung im Kapillargel der Kapillaren 1a bis 1t, wo
durch verhindert wird, daß die Komponenten des Kapillargels
in die Fluoreszenzzelle 4 auslecken.
Ferner fließt Ummantelungslösung durch die Kapillaren 2a bis
2t in das Gefäß für die Anodenelektrode 7, wenn die Fluores
zenzzelle 4 mit den Kapillaren 1a bis 1t und den Kapillaren
2a bis 2t mit Ummantelungslösung gefüllt wird und das Niveau
der Ummantelungslösung 11 in der Ummantelungslösungsflasche
höher eingestellt wird als dasjenige der Pufferlösung im
Gefäß für die Anodenelektrode 7. Unter dieser Bedingung wer
den die Fluoreszenzzelle 4 und die Kapillaren 2a und 2t mit
Ummantelungslösung, d. h. der Pufferlösung, gefüllt, und
auch die Kapillaren 1a bis 1t werden mit Kapillargel ge
füllt. Wenn eine Gleichspannung zwischen das Gefäß für die
Kathodenelektrode 6 und das Gefäß für die Anodenelektrode 7
mit Hilfe einer Hochspannungs-Gleichspannungsversorgung 12
gelegt wird, fließt ein Strom durch die Kapillare 1a, den
Spalt 3a und die Kapillare 2a, wodurch die Proben wandern
können. Wenn das Niveau der Ummantelungslösung 11 in der Um
mantelungslösungsflasche 10 höher eingestellt wird als das
jenige der Pufferlösung im Gefäß für die Anodenelektrode 7,
erzeugt die Strömung der Ummantelungslösung innerhalb der
Kapillaren 2a bis 2t eine Strömung über die oberen Enden
dieser Kapillaren hinaus, d. h. um die Spalte 3a bis 3t
herum. Proben, die von den Kapillaren 1a bis 1t ausgehend
wandern, laufen durch die Spalte 3a bis 3t entlang der Strö
mung über die Kapillaren 2a bis 2t unter Ummantelungsströ
mungsbedingungen und werden dann in jede Kapillare geleitet,
und es wird dafür gesorgt, daß sie zum Gefäß für die Anoden
elektrode 7 wandern.
Die Kapillaren 2a bis 2t werden so behandelt, daß ihre In
nenseiten positiv geladen sind, und die elektroosmotische
Strömung innerhalb der Kapillaren 2a bis 2t wird von den Ka
pillaren 1a bis 1t zum Gefäß für die Anodenelektrode 7 ge
leitet, was die Möglichkeit einer Rückwärtsströmung der Lö
sung in die Spalte ausschließt, und eine stabile Strömung
der Ummantelungslösung zum Gefäß für die Anodenelektrode 7
gewährleistet. Selbst wenn die Strömungsgeschwindigkeit der
Ummantelungslösung besonders niedrig ist, ist eine stabile
Strömung der Ummantelungslösung zum Gefäß für die Anoden
elektrode 7 gewährleistet.
Elektrophorese wird durch Anlegen von Gleichspannung zwi
schen das Gefäß für die Kathodenelektrode 6 und das Gefäß
für die Anodenelektrode 7 durch die Hochspannungs-Gleichspannungsversorgung
12 bewirkt. Der durch die Kapillare 1a
und die Kapillare 2a fließende Strom läuft hauptsächlich
durch den Spalt 3a; ähnlich laufen die Ströme durch die Ka
pillaren 1b und 2b, 1c und 2c, 1d und 2d, . . . 1t und 2t
hauptsächlich durch die Spalte 3b, 3c, 3d, . . . 3t. Ferner
strömen, wie oben ausgeführt, die von den Kapillaren 1a bis
1t ausgehend wandernden Proben entlang der Strömung über die
Kapillaren 2a bis 2t und durchlaufen beim Zustand der Strö
mung der Ummantelungslösung die Spalte 3a bis 3t; dann wer
den sie in die jeweiligen Kapillaren eingeleitet. Genauer
gesagt, wird dafür gesorgt, daß die durch die Kapillaren und
Spalte wandernden Proben so wandern, daß sie nicht mit den
Proben in Berührung kommen, die in den benachbarten Spalten
wandern. Dies erlaubt getrennte Fluoreszenzerfassung der in
jedem Spalt wandernden Probe. Darüber hinaus berühren die
Proben die Innenfläche der Fluoreszenzzelle 4 nicht, was die
Möglichkeit beseitigt, daß Proben an der Fluoreszenzzelle 4
absorbiert werden und was räumliche Entfernung durch Schlit
ze oder eine ähnliche Vorrichtung von Licht bewirkt, das an
der Fläche der Fluoreszenzzelle 4 streut. Dadurch ist hoch
empfindliche Fluoreszenzerfassung möglich.
Einleiten der mit Fluoreszenzstoffen markierten DNS-Fragmente
ist dadurch möglich, daß ein Ende der Kapillare 1a auf
der Kathodenseite in die Probenlösung eingetaucht wird und
eine Spannung von 6 kV für etwa 20 Sekunden zwischen die
Probenlösung und das Gefäß für die Anodenelektrode 7 gelegt
wird. Danach wird das Ende der Kapillare in die Ursprungs
stellung im Gefäß für die Kathodenelektrode 6 zurückgeführt.
Dieser Ablauf wird für jede der Kapillaren 1a bis 1t wieder
holt, um Proben in die Kapillargele der Kapillaren 1a bis 1t
einzuleiten. Es ist zu beachten, daß die Proben aufeinander
folgend, wie vorstehend beschrieben, in jede Kapillare ein
geleitet werden können, oder daß sie dadurch eingeleitet
werden können, daß jede der Kapillaren 1a bis 1t in die Pro
benlösung eingetaucht wird und gleichzeitig Spannung ange
legt wird. Molekulargewichtsmäßige Trennung durch Proben
elektrophorese erfolgt durch Anlegen der Spannung von 6 kV
zwischen das Gefäß für die Kathodenelektrode 6 und das Gefäß
für die Anodenelektrode 7. Die in jede der Kapillaren 1a bis
1t eingeleitete Probe wandert innerhalb der Kapillargele der
Kapillaren 1a bis 1t von der Kathode zur Anode, wobei mole
kulargewichtsmäßige Trennung erfolgt, und sie laufen dann
durch die Spalte 3a bis 3t. Proben, die durch die Spalte 3a
bis 3t laufen, werden durch einen Argonlaser mit einer Wel
lenlänge von 488 nm erfaßt, der den Fluoreszenzstoff FITC
anregt.
Die Achse des Laserlichts ist so eingestellt, daß das Laser
licht die entlang einer Linie ausgerichteten Spalte gleich
zeitig beleuchtet oder dies mit im wesentlichen denselben
Bedingungen vornimmt. Wenn das Laserlicht eingestrahlt wird,
kann Fluoreszenz erfaßt werden. Genauer gesagt, wird Laser
licht 21 mit einer Wellenlänge von 488 nm von einer Argon
laserquelle 20 durch eine Linse 22 gebündelt und so einge
strahlt, daß es die durch die Spalte 3a bis 3t mit Fluores
zenzstoff markierten DNS-Fragmente anregt. Es werden ein
Laser mit einem Strahldurchmesser von etwa 0,7 mm und eine
Linse 22 mit einer Brennweite von 100 mm verwendet, und der
Brennpunkt wird in die Mittelposition zwischen den Spalten
3a und 3t eingestellt. In diesem Fall beträgt die Fleckgröße
des Laserlichts im Brennpunkt etwa 150 µm, und die Fokal
distanz beträgt etwa 20 mm. Der Abstand zwischen den Spalten
3a und 3t entspricht dem Abstand von der Kapillare 1a zur
Kapillare 1t. Im Fall des vorliegenden Ausführungsbeispiels
ist dies 0,6 mm × 19, d. h. etwa 12 mm. Das heißt, daß das La
serlicht die 20 Positionen der Spalte 3a bis 3t im wesentli
chen mit derselben Fleckgröße beleuchtet, die im wesentli
chen mit der Größe des Kapillargels (100 µm) übereinstimmt.
Wie oben ausgeführt, kann die Fleckgröße des Laserlichts im
wesentlichen mit derjenigen des Kapillargels übereinstimmen.
Gleichförmige und wirkungsvolle Anregung der mit Fluores
zenzstoff markierten DNS-Fragmente, die durch die Spalte 3a
bis 3t wandern, ist dadurch möglich, daß die Lichtquelle und
das Linsensystem so ausgewählt werden, daß alle Spalte im
wesentlichen mit derselben Größe beleuchtet werden.
Die von den mit den Fluoreszenzstoffen markierten DNS-Fragmenten,
die durch die Spalte 3a bis 3t wandern, abgestrahlte
Fluoreszenz wird aus einer Position rechtwinklig zur Rich
tung der Laserstrahlung erfaßt. Dieser Aufbau wird durch
Fig. 2 veranschaulicht. Von Fluoreszenzstrahlung 30, wie sie
von den DNS-Fragmenten emittiert wird, wird die Hintergrund
strahlung, wie sie durch Streulicht entsteht, durch ein In
terferenzfilter 32 beseitigt, und durch eine Linse 33 wird
ein Bild auf einem zweidimensionalen Detektor 34, wie einer
CCD-Kamera, abgebildet. Gesteuert durch eine Steuerung 35,
erfaßt der zweidimensionale Detektor 34 das Fluoreszenzbild
der Spalte 3a bis 3t, und er erzeugt eine kontinuierliche
und gleichzeitige Erfassung der zeitlichen Änderung der
Fluoreszenzintensität für alle Spalte 3a bis 3t unter Ver
wendung eines Datenprozessors 36, eines Computers oder der
gleichen. Die Ergebnisse werden auf einem Monitor 37 darge
stellt und auf einem Drucker 38 ausgegeben oder durch einen
Speicher 39 gespeichert. Dieses Merkmal erlaubt gleichzeiti
ge und kontinuierliche Erfassung der Wanderungsmuster für
jede der Kapillaren 1a bis 1t, wie sie durch die molekular
gewichtsmäßige Trennung hervorgerufen werden. Es ist zu be
achten, daß beim vorliegenden Ausführungsbeispiel ein ein
dimensionaler Detektor, wie ein Photodiodenarray statt eines
zweidimensionalen Detektors, wie eine CCD-Kamera, verwendet
werden kann, da die Fluoreszenzbilder der Spalte eindimen
sional angeordnet sind. Für wirkungsvolle Erfassung der vom
FITC emittierten Fluoreszenzstrahlung verwendet das Inter
ferenzfilter 32 ein Bandpaß-Interferenzfilter, das Trans
mission im Wellenlängenband von 500 bis 540 nm zuläßt. Die
Vergrößerung der Linse 33 wird so gewählt, daß das Bild der
Spalte 3a bis 3t auf eine Photodetektorfläche des zweidimen
sionalen Detektors gebündelt wird. Da die Spalte beim Aus
führungsbeispiel im wesentlichen aus Pufferlösung bestehen,
wird das Laserlicht zwischen den Spalten übertragen, ohne
daß es von Streulicht durch die Kapillaren beeinflußt wird.
Dies erlaubt gleichzeitige, homogene und wirkungsvolle Be
leuchtung der durch die mindestens zwei Kapillaren wandern
den Proben. Dies erlaubt eine wesentliche Verringerung von
Hintergrundstrahlung, wie von Streulicht und von Fluoreszenz
von Kapillaren und Kapillargelen, was hochempfindliche Fluo
reszenzerfassung gewährleistet.
Die Wirkung des verringerten Hintergrundlichts ist die fol
gende: Im Vergleich zum Fall, bei dem die Fluoreszenzerfas
sung dadurch erfolgt, daß das Laserlicht durch die Kapillare
selbst erfolgt, deren Ummantelung beseitigt ist, ohne daß
ein Spalt gebildet wird, verringert Fluoreszenzerfassung im
Spalt, wie beim Ausführungsbeispiel, die erfaßte Intensität
der Hintergrundstrahlung auf etwa ein Zehntel oder weniger,
das es erlaubt, Proben mit niedriger Konzentration zu erfas
sen. Die Anordnung mit mindestens zwei Spalten in gerader
Linie ermöglicht gleichzeitige und einfache Beleuchtung al
ler Spalte durch das Laserlicht, was eine einfache Gerätean
ordnung erlaubt. Da mindestens zwei Paare von Kapillaren in
einer optischen Zelle festgehalten werden können, ist die
Verwendung einer einzigen optischen Zelle ausreichend, und
eine Leitung ist zum Zuführen der Ummantelungslösung ausrei
chend. Darüber hinaus findet Strömung der Ummantelungslösung
nur dicht bei den Spalten statt, und die Strömungsgeschwin
digkeiten sind für alle Spalte gleich, was zu größerer Re
produzierbarkeit unter den Spalten führt. Dieses Merkmal er
niedrigt Schwankungen zwischen Wanderungspfaden, und für
diesen Zweck reicht eine optische Zelle mit einfachem Aufbau
aus, wie beim Ausführungsbeispiel. Es ist nicht erforder
lich, eine optische Zelle mit kompliziertem Aufbau zu ver
wenden, wie bei einer herkömmlichen Kammer für Ummantelungs
flüssigkeit. Dieses Merkmal gewährleistet einen insgesamt
einfachen Geräteaufbau. Beim Ausführungsbeispiel ist der Ab
stand zwischen benachbarten Kapillaren auf 0,6 mm einge
stellt. Die Position der Probenwanderung kann dadurch fest
gelegt werden, daß ein Paar Kapillaren Kopf an Kopf mit
einem vorgegebenen Spalt gehalten werden, und mindestens
zwei Kapillaren (und Spalte) können an dicht beieinanderlie
genden Positionen angeordnet werden. Dies erlaubt eine Ver
ringerung der Größe der optischen Zelle. Außerdem ermöglicht
es dies, das Laserlicht zum Beleuchten des Spalts weiter ab
zusenken. Umgekehrt ermöglicht es dies, daß mehr Paare von
Kapillaren in derselben optischen Zelle gehalten werden kön
nen. Der Molekulargewicht-Trennbereich ist beim Ausführungs
beispiel derselbe Kapillargel-Trennbereich wie der herkömm
liche, wodurch hochempfindliche Erfassung gewährleistet ist,
ohne daß die Molekulargewicht-Trenneigenschaften leiden.
Beim Ausführungsbeispiel wird dafür gesorgt, daß Pufferlö
sung strömt, ohne daß eine mechanische Einrichtung, wie eine
Pumpe für Flüssigphasenchromatographie, verwendet wird. Dies
vereinfacht den Geräteaufbau und erniedrigt die Herstellko
sten. Es liegt keine pulsierende Strömung vor, wie sie beim
Verwenden einer Pumpe auftreten kann, was eine stabile Strö
mung der Ummantelungslösung und erniedrigte Schwankung der
Speisegeschwindigkeit sowie erniedrigte Schwankung der Fluo
reszenzintensität der in den Spalten strömenden Proben ge
währleistet, was zu genauer Erfassung führt. Die Strömungs
geschwindigkeit der Ummantelungslösung kann einfach dadurch
eingestellt werden, daß der Überstand zwischen dem Niveau
der Ummantelungslösung in der Ummantelungslösungsflasche und
dem Pufferlösungsniveau im Gefäß für die Anodenelektrode auf
der stromabwärtigen Seite für die Wanderung verstellt wird.
Diese Einstellung ist auch dadurch möglich, daß der Innen
durchmesser der Kapillare auf der stromabwärtigen Seite für
die Wanderung verändert wird. Es ist grundsätzlich möglich,
dafür zu sorgen, daß die Ummantelungslösung durch Verwenden
einer mechanischen Einrichtung, wie einer Pumpe für Flüssig
phasenchromatographie, strömt. In diesem Fall besteht der
Vorteil, daß die Strömungsgeschwindigkeit unmittelbar einge
stellt werden kann. Jedoch besteht eine Neigung dazu, daß
die Fluoreszenzintensität sich aufgrund der pulsierenden
Strömung durch die Pumpe ändert, so daß eine glättende Bear
beitung bei der Datenverarbeitung wesentlich wird.
Beim Ausführungsbeispiel durchläuft die Ummantelungslösung
in der optischen Zelle auf der stromabwärtigen Seite die Ka
pillaren 2a bis 2t und fließt aus der Zelle. Da die Kapilla
ren im allgemeinen einen kleinen Innendurchmesser aufweisen,
ist die Strömungsgeschwindigkeit in den Kapillaren im allge
meinen klein. Daher kann das Volumen der Ummantelungslösung
verringert werden, was zu verbesserter Handhabbarkeit führt.
Beim Ausführungsbeispiel erfolgt eine Bearbeitung, die ge
währleistet, daß das Innere der Kapillaren 2a bis 2t positiv
geladen ist, damit die Richtung der elektroosmotischen Strö
mung innerhalb der Kapillaren 2a bis 2t von den Kapillaren
1a bis 1t zum Gefäß für die Anodenelektrode 7 geht, und daß
keine Rückwärtsströmung von den Kapillaren 2a bis 2t in die
Spalte vorhanden ist. Dies gewährleistet eine stabile Strö
mung der Ummantelungslösung zum Gefäß für die Anodenelektro
de 7 selbst dann, wenn die Strömungsgeschwindigkeit der Um
mantelungslösung klein ist. Wenn die Strömungsgeschwindig
keit der Ummantelungslösung im Spalt erhöht ist, z. B. dann,
wenn der Innendurchmesser der Kapillaren 2a bis 2t groß ist,
verringert sich die Wirkung der elektroosmotischen Strömung;
infolgedessen ist eine Behandlung der Innenseite der Kapil
laren 2a bis 2t nicht immer erforderlich.
Beim Ausführungsbeispiel verwenden die Ummantelungslösung
und die Pufferlösung im Gefäß für die Kathodenelektrode und
im Gefäß für die Anodenelektrode die TRIS-Borat-EDTA-Pufferlösung
mit Harzstoff, um zu gewährleisten, daß dieselbe Zu
sammensetzung wie bei der Pufferlösung des Kapillargels vor
liegt. Dies verhindert es, daß die Komponenten des Kapillar
gels in die Fluoreszenzzelle 4 oder das Elektrodengefäß aus
lecken, und es führt zu fortgesetzter, stabiler Elektropho
rese mit hoher Trennkraft und Wiederverwendbarkeit des Ka
pillargels. Es ist auch möglich, eine Pufferlösung ohne
Harnstoff, d. h. ohne DNS-Denaturierungsmittel zu verwenden.
In diesem Fall kann Harnstoff innerhalb des Kapillargels im
Lauf der Zeit aus demselben in das Elektrodengefäß und die
Fluoreszenzzelle strömen. Dadurch verringert sich die Häu
figkeit der Wiederverwendung, jedoch ist Wanderung, wie im
Fall einer Pufferlösung mit Harnstoff, möglich.
Die verwendete Laserausrüstung und der verwendete Fluores
zenzstoff sind nicht auf einen Argonlaser und FITC be
schränkt; jeder Fluoreszenzstoff und jede geeignete Laser
ausrüstung können verwendet werden. Das Ausführungsbeispiel
wurde für die Erfassung von DNS-Fragmenten beschrieben, je
doch gilt das Prinzip auch für die Analyse von Proteinen,
Zucker und ähnlichen Substanzen. Beim Ausführungsbeispiel
wurden zwei Kapillaren mit demselben Innendurchmesser ver
wendet; eine Kombination verschiedener Innendurchmesser ist
ebenfalls möglich. Wenn z. B. der Innendurchmesser der Ka
pillare auf der stromabwärtigen Seite kleiner ist als derje
nige der Kapillare auf der stromaufwärtigen Seite, erhöht
sich die Konzentration der Probenlösung, wenn Proben, die
ausgehend vom Ende der stromaufwärtigen Kapillare wandern,
in die stromabwärtige Kapillare eingeleitet werden, was zu
hochempfindlicher Erfassung führt. Wenn der Innendurchmesser
der Kapillare auf der stromabwärtigen Seite größer als der
jenige auf der stromaufwärtigen Seite ist, können Proben,
die ausgehend von der stromaufwärtigen Kapillare wandern,
leichter und zuverlässiger in die stromabwärtige Kapillare
eingeleitet werden.
Da beim Ausführungsbeispiel Fluoreszenz von der Probe erfaßt
werden kann, ohne daß das Anregungslicht durch den Kapillar
bereich läuft, muß darüber hinaus die Kapillare nicht durch
sichtig sein. Genauer gesagt, muß die Kapillarummantelung
nicht beseitigt werden, was einfache Handhabbarkeit gewähr
leistet. Darüber hinaus erlaubt dies auch die Verwendung
einer Kapillare aus einem lichtundurchlässigen fluorhaltigen
Polymer, wie aus Tetrafluorethylen oder aus chloriertem Tri
fluorethylen. Eine Kapillare aus einem fluorhaltigen Polymer
zeigt geringes Anhaften von Proben, was das Erfordernis für
eine Behandlung, wie eine Oberflächenbehandlung, beseitigt.
Darüber hinaus wird sie nicht beschädigt, was zu ausgezeich
neter Handhabbarkeit führt. Ferner erlaubt die überragende
Beständigkeit gegen Chemikalien die Verwendung von Lösungs
mitteln in einem sehr großen Bereich von pH-Werten.
Beim Ausführungsbeispiel wurde der Fall von mindestens zwei
Paaren von Kapillaren erläutert. Wenn nur ein Paar von Ka
pillaren verwendet wird, sind Wanderung, Erfassung der Fluo
reszenz und Erfassung des Probentrennmusters auf dieselbe
Weise möglich. Es kann dann ein Photovervielfacher als opti
scher Detektor verwendet werden.
Im folgenden wird ein Verfahren zum Erfassen einer DNS-Sequenz
beschrieben, das das beim Ausführungsbeispiel 1 vorge
stellte Gerät verwendet.
Mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente werden durch
eine DNS-Polymerasereaktion unter Verwendung eines mit einem
Fluoreszenzstoff markierten Fördermoleküls gemäß dem wohlbe
kannten Didesoxy-Sequenzerstellungsverfahren, wie es von
Sanger und seinem Kollegen erfunden wurde, hergestellt. Es
wird ein mit FITC verbundenes Startermolekül (markiertes
Startermolekül) als Startermolekül verwendet. Zunächst wird
das markierte Startermolekül einer einsträngigen Matrizen-DNS
hinzugefügt, und es erfolgt Erwärmung (doppelsträngige
DNS), wodurch das markierte Startermolekül mit der einsträn
gigen DNS verbunden wird. Diese Reaktionslösung wird in vier
Teile aufgeteilt, die DNS-Polymerasereaktionen für A, C, G
bzw. T unterworfen werden. Das heißt, daß vier Arten von Desoxy
nukleotid-Triphosphaten (dATP, DTTP, dCTP und dGTP) und von
ddATP, die Endgruppen sind, der mit dem markierten Starter
molekül verbundenen einsträngigen DNS versetzt werden, um
eine DNS-Polymerasereaktion zu bewirken. Die obige Vorge
hensweise ergibt mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente
mit verschiedenen Längen mit der Endgruppe A. Ähnliche
Reaktionen werden für C, G und T ausgeführt. Die vier Arten
von Reaktionslösungen, die durch die obige Vorgehensweise
erhalten werden, werden in vier der Kapillaren 1a bis 1t
eingefüllt, z. B. die Kapillaren 1a, 1b, 1c bzw. 1d. Der
Einfüllablauf ist derselbe wie beim Ausführungsbeispiel 1.
Die Reaktionslösung A wird in die Kapillare 1a eingefüllt,
die Reaktionslösung C in 1b, die Reaktionslösung G in 1c und
die Reaktionslösung T in 1d. Danach wird eine Spannung von
etwa 6 kV angelegt, um Elektrophorese hervorzurufen. Unter
Verwendung von Argonlaserlicht als Anregungslicht wird die
zeitabhängige Fluoreszenzintensität in den Spalten 3a bis 3d
gemessen. Da DNS-Fragmente mit kleinerem Molekulargewicht
früher wandern, wird die Basissequenz dadurch bestimmt, daß
die Spaltstelle ermittelt wird, an der die Fluoreszenzsi
gnalspitze zeitabhängig auftrat.
Das beim Ausführungsbeispiel 1 veranschaulichte Gerät weist
Kapillaren auf, in die Proben eingefüllt werden können.
Das genannte Verfahren zum Bestimmen der DNS-Basissequenz
erlaubt gleichzeitige Erfassung der Basissequenz von fünf
Arten von DNS-Proben. Dies erlaubt die Erfassung der Basis
sequenz von mehr DNS-Proben durch Erhöhen der Anzahl von
Proben, die in der optischen Zelle gehalten werden. Beim
Ausführungsbeispiel wird eine Art von FITC als Fluoreszenz
stoff verwendet. Jedoch ist es möglich, die Fluoreszenz zu
erfassen, die von zwei oder mehr Fluoreszenzstoffen emit
tiert wird. In diesem Fall ist es z. B. möglich, den folgen
den Schritt einzusetzen, der weit bekannt ist:
- 1) Sätze einer optischen Detektoranordnung mit einem Inter ferenzfilter 32, einer Linse 33 und einem Detektor 34 werden mit einer der Anzahl der Fluoreszenzstoffe entsprechenden Anzahl bereitgestellt, und es wird dafür gesorgt, daß jeder Detektor Fluoreszenz in getrennten Wellenlängenbändern in Fig. 2 erfaßt; oder
- 2) ein Strahlteilerprisma wird nach der Linse 33 angeord net, um Licht in spektrale Komponenten aufzuteilen, und das Bild jeder Komponente wird auf einem zweidimensionalen De tektor, wie einer Kamera, abgebildet. Dann wird die Fluores zenzintensität für jeden Wanderungspfad und jede Wellenlänge gemessen, und die Fluoreszenzintensität für jeden Wande rungspfad und jeden Fluoreszenzstoff wird berechnet.
Wie vorstehend erörtert, kann die DNS-Basissequenz selbst
dann bestimmt werden, wenn das Gerät so aufgebaut ist, daß
es gleichzeitige Erfassung von zwei oder noch mehr Fluores
zenzstoffen ermöglicht. Das heißt, daß jede DNS einer Polymera
sereaktion unterzogen wird, wobei Startermoleküle verwendet
werden, die für jeden Typ der Endgruppenbase mit einem ande
ren Fluoreszenzstoff markiert sind. Dann werden die Reak
tionslösungen vermischt, und die Elektrophorese wird ausge
führt; dann wird die von den durch die Spalträume laufenden
DNS-Fragmenten emittierte Fluoreszenz erfaßt. Die Art der
Base kann dadurch festgestellt werden, daß der Fluoreszenz
stoff identifiziert wird, wodurch die Basissequenz bestimmt
wird.
Der Fluoreszenzstoff kann dadurch identifiziert werden, daß
die Fluoreszenz bei der Maximalemissionswellenlänge für vier
Fluoreszenzstoffe verglichen wird. In diesem Fall kann die
Basissequenz der DNS-Proben im Wanderungspfad mit einem Paar
Kapillaren bestimmt werden. Wenn zwei oder mehr Wanderungs
pfade vorhanden sind, wie in Fig. 1 dargestellt, kann die
Basissequenz von zwei oder mehr DNS-Proben gleichzeitig be
stimmt werden.
Die Ausführungsbeispiele 1 und 2 veranschaulichten ein Gerät,
das Proben durch Fluoreszenzerfassung bestimmt. Derselbe Ge
räteaufbau ist zur Bestimmung mit Hilfe der Intensität von
absorbiertem oder transmittiertem Licht möglich. Fig. 3 zeigt
einen Aufbau für ein Beleuchtungssystem und ein Erfassungssy
stem für ein Elektrophoresegerät zur Bestimmung durch Licht
absorption. Der Elektrophoresebereich weist dieselbe Kon
struktion wie in Fig. 1 beim Ausführungsbeispiel 1 auf. Das
Einleiten von Proben, z. B. von DNS-Fragmenten, die durch ein
Restriktionsenzym aufgeschlossen wurden, erfolgt mit demsel
ben Ablauf, wie er beim Ausführungsbeispiel 1 beschrieben
wurde. Elektrophorese mit molekulargewichtsmäßiger Trennung
erfolgt ebenfalls mit dem Ablauf gemäß dem Ausführungsbei
spiel 1. Für DNS-Fragmente, die durch die Spalte 3a bis 3t
laufen, wird Licht von einer Lichtquelle 50, wie einer Xenon
lampe und einer D2-Lampe, durch einen Monochromator 51 gelei
tet und dann durch eine Linse 52 so gesammelt, daß die Spalte
3a bis 3t beleuchtet werden. Die Wellenlänge des Beleuch
tungslichts wird normalerweise so eingestellt, daß es eine
Wellenlänge ist, die von der Probe absorbiert wird. Zum Beispiel
sind 260 nm für den Fall von DNS-Fragmenten geeignet. Licht,
das von den DNS-Fragmenten absorbiert wird, wird wieder durch
eine Linse 53 gesammelt und durch einen eindimensionalen Sen
sor 54, wie ein Photodiodenarray, erfaßt. Der Betrieb des
eindimensionalen Sensors 54 wird durch eine Steuerung 55 für
denselben gesteuert, und das Elektrophoresemuster wird durch
einen Datenprozessor 56 eines Computers oder dergleichen für
jeden Spalt gemessen.
Die Ergebnisse werden auf einem Monitor 57 dargestellt und
auf einem Drucker 58 ausgegeben oder in einem Speicher 59 ab
gespeichert. Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel ist der
Spalt zwischen den Kapillaren vorhanden. Jede Kapillare ist
als Molekulargewicht-Trennbereich vom Spalt als optischem
Detektor zum Messen der Lichtabsorption abgetrennt. Dieser
Aufbau erlaubt es, daß das Beleuchtungslicht durch die Um
mantelungslösung läuft, was zu minimalem Streulicht führt,
und er gewährleistet wirkungsvolle Bestrahlung der Proben,
ohne daß das Licht durch die Kapillaren oder durch Gel ge
streut werden, wodurch es zu hochempfindlicher Erfassung
durch Lichtabsorption kommt.
Es sei angenommen, daß "1" die Transmissionslichtintensität
ist (die numerische Apertur der Photodetektorlinse ist
"0,19", wenn die Probe nicht durchlaufen wird), wenn das
Licht in den Spalt eintritt wie beim vorliegenden Ausfüh
rungsbeispiel. Wenn das Licht wie beim Stand der Technik die
Kapillare durchstrahlt, wird die Transmissionslichtintensi
tät auf etwa 0,6 verringert. Da die Kapillare selbst und das
Gel, wie das Polyacrylamidgel, das als Medium für die mole
kulargewichtsmäßige Trennung durch Elektrophorese dient, als
Lichtstreuquellen wirken, wird das einfallende Licht durch
diese Körper gestreut, was zu verringerter Intensität durch
Strahlungslicht führt. Eine verringerte Intensität des
Durchstrahlungslichts hat ein um denselben Betrag verringer
tes S/R-Verhältnis zur Folge, was die Meßgenauigkeit beein
flußt. Beim Stand der Technik wird auch ein Teil des von der
Oberfläche der Kapillare gestreuten oder reflektierten
Lichts erfaßt. Solches Licht tritt direkt in den Detektor
ein, ohne daß es die Probe bestrahlt (ohne daß es von der
Probe absorbiert wird). Trotz des Vorhandenseins einer Probe
kommt es zu einer sehr kleinen Änderung der Lichtintensität,
wenn irgendwelche Lichtkomponenten absorbiert werden, was
die Messung erschwert; insbesondere ist hochgenaue Lichtab
sorptionsmessung schwierig. Beim vorliegenden Ausführungs
beispiel wird das durch den Monochromator 51 laufende Licht
durch die Linse auf den Spalt kollimiert und in diesen ein
gestrahlt. Dieselbe Messung ist auch möglich, wenn Licht mit
parallelen Lichtstrahlen ohne Lichtsammlung eingestrahlt
wird und nur die Intensität desjenigen Lichts gemessen wird,
das durch den Spalt lief.
Bei den Ausführungsbeispielen 1, 2 und 3 wird der Spalt
durch ein Paar Kapillaren gebildet, jedoch muß dies nicht
unbedingt der Fall sein. Zum Beispiel kann der Molekulargewicht-Trennbereich
aus Kapillaren bestehen, wie bei den Ausfüh
rungsbeispielen. Es kann aber auch ein Spalt zwischen den
Enden dieser Kapillaren und einer mit feinen Löchern verse
henen Platte gebildet sein. Fig. 4 zeigt die Konfiguration
für einen solchen Spalt. Wie im Fall des Ausführungsbei
spiels 1 werden 20 Kapillaren 1a bis 1t als Molekulargewicht-Trennbereich
vom Mehrkapillarhalter 5a gehalten, und
sie sind in der optischen Zelle 60 fixiert. Eine mit feinen
Löchern mit einem Innendurchmesser von 200 µm versehene
Platte 62 ist an der der optischen Zelle 60 gegenüberliegen
den Seite befestigt. Feine Löcher 61a bis 61t sind an Posi
tionen vorhanden, die jeweils den Kapillaren 1a bis 1t ent
sprechen, was zur Ausbildung der Spalte führt. Wenn die Um
mantelungslösung strömt, wird die von jeder Kapillare aus
gehend wandernde Probe jeweils in das entsprechende feine
Loch eingeleitet. Das Gefäß für die gesammelte Lösung 63
liegt unterhalb der Platte 62, um die durch die feinen Lö
cher tretende Lösung aufzufangen, und die Lösung wird dann
durch eine Leitung 64 zu einem Gefäß für eine Elektrode 65
geführt.
Elektrophorese wird auf dieselbe Weise wie beim Ausführungs
beispiel 1 dadurch ausgeführt, daß Spannung an das Gefäß für
die Elektrode 65 und ein anderes (nichtdargestelltes) Gefäß
für eine Elektrode gelegt wird.
Im Gegensatz zum Fall beim Ausführungsbeispiel 1 ist es mög
lich, eine Anordnung für Elektrophorese durch die Strömung
einer Ummantelungslösung nur unter Verwendung der stromauf
wärtigen Kapillaren, ohne Verwendung der stromabwärtigen,
zu entwerfen. Fig. 5 zeigt den Aufbau eines solchen Elektro
phoresegeräts. Wie im Fall des Ausführungsbeispiels 1 sind
die Enden von Kapillaren 1a bis 1t in einer optischen Zelle
4 angeordnet, und sie werden in dieser festgehalten. Die Ka
pillaren sind durch einen Mehrkapillarhalter 5a aus einem
plattenförmigen Block aus einem fluorhaltigen Polymer, wie
Tetrafluorethylen, der mit zwanzig Vertikallöchern mit Ab
ständen von 0,6 mm versehen ist, in der optischen Zelle be
festigt. Die Kapillaren 1a bis 1t sind jeweils in die zwan
zig Vertikallöcher des Mehrkapillarhalters 5a eingesetzt,
und derselbe ist in dichter Berührung mit der Oberseite der
Fluoreszenzzelle 4 befestigt. Der Boden der Fluoreszenzzelle
4 ist mit einer Abdichtungsplatte 70 und einer Leitung 71
aus einem Tetrafluorethylen-Polymer verbunden, das in das
Gefäß für die Anodenelektrode 7 eingetaucht ist, um die
Strömung der Ummantelungslösung und Elektrophorese zu erlau
ben. Die Fluoreszenzzelle 4 ist mit dem Einlaß 8 für die Um
mantelungslösung versehen, damit sie mit derselben gefüllt
werden kann, wozu diese Ummantelungslösung 11 aus der Umman
telungslösungsflasche 10 durch die Leitung 9 aus dem Tetra
fluorethylen-Polymer eingefüllt wird. Wenn das Niveau der
Ummantelungsflüssigkeitslösung in der Ummantelungslösungs
flasche 10 höher als das Niveau der Pufferlösung im Gefäß
für die Anodenelektrode 7 ist, kann eine Probenwanderung von
den Kapillaren 1a bis 1t, ausgehend durch diesen Überstand,
in der Ummantelungslösung aufrechterhalten werden, wobei die
Strömung zur Fluoreszenzzelle 4 erfolgt. Diese Lösung wird
schließlich in das Gefäß für die Anodenelektrode 7 geleitet.
Elektrophorese wird durch eine Gleichspannung ausgeführt,
die von einer Hochspannungs-Gleichspannungsversorgung 12 ge
liefert wird und zwischen das Gefäß für die Kathodenelektro
de 6 und das Gefäß für die Anodenelektrode 7 gelegt wird.
Direkt unterhalb der Kapillaren kommt eine Probe, die durch
eine der Kapillaren wandert, nicht in Berührung mit Proben,
die durch andere Kapillaren wandert, sondern sie wandern
durch die optische Zelle und erreichen schließlich das Gefäß
für die Anodenelektrode 7. Die Proben werden dadurch erfaßt,
daß Laserlicht 500 µm unter den Enden der Kapillaren in die
Fluoreszenzzelle 4 eingestrahlt wird und die Fluoreszenz
strahlung empfangen wird.
Das Photodetektorsystem ist auf dieselbe Weise aufgebaut wie
beim Ausführungsbeispiel 1. Die Vorgehensweise zum Ausbilden
der Ummantelungsströmung unterscheidet sich beim vorliegen
den Ausführungsbeispiel jedoch grundsätzlich von derjenigen
beim Ausführungsbeispiel 1. Beim vorliegenden Ausführungs
beispiel strömt die Ummantelungslösung mit laminarer Strö
mung durch die gesamte optische Zelle. Infolgedessen unter
scheidet sich die Strömungsgeschwindigkeit der Ummantelungs
lösung abhängig vom Ort innerhalb der optischen Zelle leicht
von Ort zu Ort, und auch die Probenwanderungspfade neigen zu
Schwankungen; derartige instabile Zustände treten auf. Hin
sichtlich der Empfindlichkeit und des Aufbaus des Gerätes
können jedoch beinahe dieselben Ergebnisse erhalten werden
wie beim Ausführungsbeispiel 1.
Das Ausführungsbeispiel 1 kann so abgewandelt werden, daß
der Spalt dadurch gebildet wird, daß eine Platte mit zwei
oder mehr Nuten statt der stromabwärtigen Kapillaren verwen
det wird. Fig. 6 ist eine Schrägansicht einer mit mehreren
Nuten versehenen Platte. Die Figur zeigt einen Fall, gemäß
dem vier Nuten vorhanden sind, die vier Kapillaren entspre
chen. Nuten 61a, 61b, 61c und 61d sind in einer Seite einer
Platte 80 ausgebildet, die an die Form des Inneren der Fluo
reszenzzelle 4 angepaßt ist. Die Form der Nuten entspricht
der Größe der Kapillaren für die molekulargewichtsmäßige
Trennung. Zum Beispiel ist eine Nut so ausgebildet, daß sie eine
Breite von 300 µm und eine Tiefe von 600 µm aufweist. Der
Abstand zwischen den Nuten ist 1 mm. Es ist zu beachten, daß
der Abstand und die Nut je nach Erfordernis verändert werden
können. Fig. 7 ist eine perspektivische Schnittdarstellung
der Fluoreszenzzelle 4 des Elektrophoresebereichs eines
Elektrophoresegeräts, das die oben genannte Platte verwen
det. Die Fluoreszenzzelle 84 weist Innenabmessungen mit
mm Breite, 3 mm Tiefe und 40 mm Länge auf. Es wird eine
Strömungszelle mit einer (Quarz-)Glasplatte mit einer Dicke
von 2 mm verwendet, wobei die Ober- und die Unterseite ge
öffnet sind. Die Figur zeigt auch, daß bei der Fluoreszenz
zelle der Glasbereich an der Vorderseite angeordnet ist. Die
Platte 80 ist in engem Kontakt in die Fluoreszenzzelle 84
eingesetzt, so daß vier Pfade mit den Nuten 81a, 81b, 81c
und 81d sowie dem Fluoreszenzzellenglas gebildet sind. Ka
pillaren 82a, 82b, 82c und 82d mit einem Innendurchmesser
von 100 µm und einem Außendurchmesser von 200 µm (Gel ist
mit derselben Vorgehensweise wie beim Ausführungsbeispiel 1
eingebracht) sind durch einen Mehrkapillarhalter 83 inner
halb der Fluoreszenzzelle 84 befestigt. Der Abstand zwischen
den Kapillaren ist 1 mm, in Übereinstimmung mit dem Abstand
zwischen den Nuten, und es erfolgt eine Ausrichtung, die
gewährleistet, daß die Kapillarachsen mit der Mittelachse
jeder Nut übereinstimmen. Diese Einstellung wird dadurch
vorgenommen, daß die Positionen der Löcher im Mehrkapillar
halter 83 eingestellt werden. Die Enden der Kapillaren 82a,
82b, 82c und 82d sind im Mehrkapillarhalter 83 angeordnet,
und die Einstellung erfolgt so, daß jedes Kapillarende etwa
1 mm vor der Platte 80 steht. Elektrophorese wird dadurch
ermöglicht, daß der Boden der Fluoreszenzzelle in Berührung
mit einer Pufferlösung im Gefäß für die Anodenelektrode 7
gebracht wird. Wie im Fall der Ausführungsbeispiele 4 oder
5, ist es auch möglich, eine Verbindung mit dem Gefäß für
die Elektrode über eine Leitung herzustellen. Die Fluores
zenzzelle 84 ist mit einem Einlaß 85 für Ummantelungslösung
versehen, um sie mit Ummantelungslösung 88 aus einer Umman
telungslösungsflasche 87 über eine Leitung 86 aus einem
Tetrafluorethylen-Polymer aufzufüllen.
Wenn das Niveau der Ummantelungslösung 88 in der Ummante
lungslösungsflasche 87 höher eingestellt wird als das Niveau
der Pufferlösung im Gefäß für die Anodenelektrode, kann eine
Probenwanderung aus den Kapillaren 81a bis 81t in der Umman
telungslösung durch den Überstand aufrechterhalten werden,
um eine Strömung zum Gefäß für die Anodenelektrode durch die
Nuten 81a, 81b, 81c und 81d zu erzielen. Zur Elektrophorese,
für die Lasereinstrahlung und die Fluoreszenzstrahlungser
fassung wird dieselbe Vorgehensweise verwendet, wie sie für
das Ausführungsbeispiel 1 beschrieben wurde, was zu wir
kungsvoller und gleichzeitiger Erfassung von Proben führt,
die jeweils durch zwei oder mehr Kapillaren getrennt werden.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird die stromabwärti
ge Seite durch die Platte mit den Nuten, nicht durch Kapil
laren gebildet. Dies erlaubt eine einfache Einstellung der
Enden der Nuten. Wenn die Platte aus Quarzglas besteht,
tritt keine Fluoreszenzstrahlung auf, selbst wenn Laserlicht
gegen die Platte hin streut, was einfachere Fluoreszenzer
fassung gewährleistet.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel werden mit Fluores
zenzstoffen markierte DNS-Fragmente molekulargewichtsmäßiger
Trennung durch Elektrophorese unterzogen, und sie werden
durch Fluoreszenzstrahlung erfaßt. Im folgenden wird der
Fall beschrieben, daß Fluoreszin und Fluoreszin-Isothio
zyanat (FITC) als markierende Fluoreszenzstoffe verwendet
werden.
Fig. 8 veranschaulicht den Aufbau eines Elektrophoresegerä
tes gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel. Dieses ver
wendet zwei Kapillaren, nämlich eine Silicatkapillare 101
mit einem Innendurchmesser von 100 µm, einem Außendurchmes
ser von 375 µm und einer Länge von 30 cm sowie eine Silicat
kapillare 102 mit demselben Innen- und Außendurchmesser und
einer Länge von 5 cm. Fünf Prozent Polyacrylamidgel mit
Harnstoff als Denaturierungsmittel ist in der Kapillare 101
vorhanden. Zunächst wird das Innere der Kapillare gereinigt,
und es wird ein Silan-Haftvermittler eingebracht. Dann wird
eine Lösung aus aus N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin und
Ammoniumpersulfat mit 4,75 Prozent entgastem Acrylamid, 0,25
Prozent N,N′-Methylen-Bis-Acrylamid, 7 M Harnstoff, 2 mM
EDTA und TRIS-Borat-Pufferlösung versetzt und in die Kapil
lare eingefüllt, um Polymerisierung zu bewirken, und es wird
ein Polyacrylamidgel hergestellt. Die Kapillare wird einer
Silan-Haftvermittlung unterzogen, so daß das Acrylamid und
die Kapillare chemisch aneinander haften und das Acrylamid
während der Elektrophorese nicht aus der Kapillare herausge
drückt wird. Die Kapillare 102 wird so bearbeitet, daß ihre
Innenwand positiv geladen ist. Zunächst wird eine Lösung von
3-(2-Aminoethylaminopropyl)-Trimethoxysilan in die Kapillare
eingefüllt, um eine Reaktion hervorzurufen, und es erfolgt
eine Wärmebehandlung bei 110°C. Ein Aminosäurerest wird in
die Innenwand der Kapillare eingeführt, wodurch die Innen
wand positiv geladen wird. Dies bewirkt, daß sich die Rich
tung des elektroosmotischen Flusses innerhalb der Kapillare
102 so ändert, daß sie von negativ nach positiv erfolgt. Die
Wanderungsrichtung einer Probe in der mit dem Polyacrylamid
gel aufgefüllten Kapillare 101 (von negativ nach positiv)
stimmt mit derjenigen für die Probe in der Kapillare 102
überein (von negativ nach positiv), was zu leichter Proben
wanderung führt.
Die Enden der Kapillaren 101 und 102 werden einander gegen
überstehend in der optischen Zelle gehalten, und die Proben
werden chemisch erfaßt. Um eine Probe durch Fluoreszenzstrah
lung zu erfassen, wird eine Fluoreszenzzelle als optische
Zelle verwendet. Die Enden der Kapillaren 101 und 102 werden
koaxial einander gegenüberstehend so gehalten, daß ein Spalt
103 von 0,1 mm Weite innerhalb der quaderförmigen Quarz-Fluo
reszenzzelle 101 (Außenweite 3 mm im Quadrat, Innenweite 1 mm
im Quadrat) gebildet ist, und der Raum im Spalt dient als De
tektionsbereich. Die anderen Enden der Kapillaren 101 und 102
sind jeweils in ein Gefäß für eine Kathodenelektrode 105 bzw.
ein Gefäß für eine Anodenelektrode 106 eingetaucht, die mit
Pufferlösung (TRIS-Borat-EDTA-Pufferlösung) gefüllt sind.
Glyzerol enthaltende Pufferlösung wird in die Quarzfluores
zenzzelle 104 eingefüllt, und der Spalt 103 wird mit Puffer
lösung aufgefüllt. Durch eine Hochspannungs-Gleichspannungs
versorgung 107 wird eine hohe Gleichspannung zwischen das Ge
fäß für die Kathodenelektrode 105 und das Gefäß für die An
odenelektrode 106 gelegt. Wenn die Spannung angelegt wird,
läuft ein Strom durch die Kapillare 102, den Spalt 103 und
die Kapillare 101. Da der Spalt 103 kurz ist, fließt in ihm
ein Strom entlang der Linie, die die Achsen der Kapillaren
102 und 103 verbindet. Daher läuft die wandernde Probe aus
der Kapillare 101 heraus und durchläuft den Spalt 103 ohne
starke Aufweitung, und dann fließt sie in die Kapillare 102.
Das heißt, daß die Probe wandert, ohne daß sie die Fluoreszenz
zelle 104 berührt. Pufferlösung mit Glyzerol wurde in die
Fluoreszenzzelle 104 und damit den Spalt 103 gefüllt; das Zu
setzen von Glyzerol soll dazu dienen, den Einfluß von Konvek
tion aufgrund erhöhter Viskosität der Pufferlösung zu verrin
gern,
und um die elektromagnetische Feldstärke zu erhöhen. Eine ge
steuerte Konvektion der Pufferlösung und erhöhte elektroma
gnetische Feldstärke verringert ein Aufweiten der Probe im
Spalt 103, was leichte Wanderung der Probe von der Kapillare
101 zur Kapillare 102 zuläßt.
Um diese Aufgabe zu lösen, wird beim Ausführungsbeispiel Gly
zerol verwendet. Andere Substanzen können verwendet werden,
wenn sie hohe Viskosität aufweisen und für Elektrophorese ge
eignet sind. Zum Beispiel können Polyethylenglykol, Saccharose usw.
verwendet werden. Wenn der Spalt 103 eng ist, kann normale
Pufferlösung ohne Glyzerol verwendet werden. Um mit Fluores
zenzstoffen markierte DNS-Fragmente als Proben einzuleiten,
wird ein Ende der Kapillare 101 auf der Kathodenseite zeit
weilig in die Probenlösung eingetaucht, und eine Spannung von
5 kV wird für etwa 20 Sekunden zwischen die Probenlösung und
das Gefäß für die Anodenelektrode 106 gelegt. Das Ende der
Kapillare 101 wird dann in das Gefäß für die Kathodenelek
trode 105 rückgeführt, und eine Gleichspannung von 10 kV wird
zwischen das Gefäß für die Kathodenelektrode 105 und das Ge
fäß für die Anodenelektrode 106 gelegt. Dann wandert die
Probe in der Kapillare 101 von der Kathode zur Anode, während
sie einer molekulargewichtsmäßigen Trennung unterliegt, und
sie läuft durch den Spalte 103.
Laserlicht 109 mit einer Wellenlänge von 488 nm von einer Ar
gonlaserquelle 108 wird durch eine Linse 110 auf etwa 20
gebündelt und auf die DNS-Fragmente gestrahlt, die durch den
Spalt 103 laufen. Von den DNS-Fragmenten abgegebene Fluores
zenzstrahlung 111 wird von einer Linse 112 rechtwinklig zur
Richtung gesammelt, in der das Laserlicht eingestrahlt wird.
Hintergrundsignale, wie solche von gestreutem Licht, werden
durch ein Interferenzfilter 113 beseitigt, und das Bild wird
durch einen Schlitz 115 über eine Linse 114 abgebildet. Das
durch den Schlitz 115 tretende Licht wird
durch einen Photovervielfacher 116 erfaßt und von einem Ver
stärker 117 verstärkt. Dann wird das Elektrophoresemuster
durch einen Datenprozessor 118 eines Computers oder derglei
chen verarbeitet, und die Ergebnisse werden auf einem Moni
tor 119 dargestellt und auf einem Drucker 120 ausgegeben
oder in einem Speicher 121 gespeichert.
Um wirkungsvolle Erfassung der vom FITC emittierten Fluores
zenzstrahlung zu gewährleisten, verwendet das Interferenz
filter 113 ein Bandpaß-Interferenzfilter, das Transmission
im Wellenlängenband von 500 bis 540 nm zuläßt. Die Linsen
systeme 112 und 114 sind so ausgebildet, daß sie zwei Bild
vergrößerungen erlauben. Die Öffnung des Schlitzes 115 ist
in Elektrophoreserichtung auf 50 µm und in Laserlichtrich
tung auf 100 µm eingestellt, und es erfolgt eine Einstel
lung, die gewährleistet, daß das Fluoreszenzstrahlungsbild
im Spalt 103 in der Mitte der Öffnung angeordnet ist. Da
Proben nur dicht beim Spalt 103 wandern, wird das Bild des
gestreuten Laserlichts an der Quarzfluoreszenzzelle 104
nicht in der Öffnung des Schlitzes 115 abgebildet und vom
Photovervielfacher 116 wegen des Aufbaus des optischen Sy
stems nicht erfaßt. Durch die Kapillare und das Gel werden
kein Streulicht und keine Fluoreszenzstrahlung erzeugt, was
zu wesentlich verringerter Hintergrundstrahlungsintensität
führt.
Fig. 9 ist eine vergrößerte Schnittdarstellung der Fluores
zenzzelle. Die Quarzfluoreszenzzelle 104 wird durch Mehr
kapillarhalter 123a und 123b festgehalten. Ein Auslecken von
Flüssigkeit wird durch Dichtungen 122a und 122b aus Silicon
gummi zwischen der Fluoreszenzzelle 104 und den Haltern 123a
und 123b verhindert. Die Kapillare 101 ist mit dem Mehrka
pillarhalter 123a über eine Muffe aus Tetrafluorethylen-Polymer
und eine Schraube 125a verbunden. Entsprechend ist
die Kapillare 102 durch eine Muffe 124a und eine Schraube
125a befestigt. Der Spalt zwischen der Kapillare 101 und der
Kapillare 102 kann dadurch frei eingestellt werden, daß die
Länge der Kapillare, ausgehend von der Muffe, festgelegt
wird. Beim Ausführungsbeispiel ist er 0,1 mm breit, wie oben
angegeben. Die Fluoreszenzzelle ist mit einem Lösungseinlaß
versehen, um Pufferlösung einzufüllen. Sie ist auch mit Ven
tilen 126a und 126b verbunden, die dazu verwendet werden, die
Fluoreszenzzelle 104 mit Pufferlösung zu füllen, nachdem die
Kapillaren angebracht sind. Die Lösungseinlässe, wie derje
nige für den Puffer, sind am Halter der Fluoreszenzzelle an
gebracht.
Um mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente unter Ver
wendung des Gerätes des vorliegenden Ausführungsbeispiels zu
erfassen, wurde ein Versuch ausgeführt. Mit Fluoreszenzstof
fen markierte DNS-Fragmente wurden durch eine DNS-Polymerasereaktion
ausgeführt, und zwar mit dem von Sanger und seinem
Kollegen erfundenen Didesoxy-Sequenzerstellungsverfahren un
ter Verwendung eines mit einem Fluoreszenzstoffmarkierten
Startermoleküls. Das Startermolekül wird mit Fluoresziniso
thiozyanat (FITC) verbunden (markiertes Startermolekül). Zu
nächst wird das markierte Startermolekül einer einsträngigen
DNS zugesetzt und erwärmt, wodurch das markierte Startermole
kül mit der einsträngigen DNS verbunden wird. Dann werden
dATP, dTTP, dCTP, dGTP und ddATP hinzugefügt, um für eine
DNS-Polymerasereaktion zu sorgen. Der obige Ablauf ergibt mit
den Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente mit verschie
denen Längen, mit der Endgruppe A.
Wie oben ausgeführt, kann das Molekulargewicht-Trennmuster
der DNS-Fragmente dadurch gemessen werden, daß die Proben in
die Kapillare eingeleitet werden und die Fluoreszenzstrah
lungsintensität im Spalt gemessen wird. Darüber hinaus wird
beim vorliegenden Ausführungsbeispiel die Hintergrundstrah
lungsintensität auf etwa ein Zehntel oder weniger im Ver
gleich zur Verwendung des herkömmlichen Verfahrens verrin
gert, bei dem Fluoreszenzerfassung ohne Ausbildung des
Spalts erfolgt, z. B. unter Verwendung von Kapillaren der
selben Form mit einer Länge von 35 cm mit einem Elektropho
reseweg von 30 cm, wobei die Schutzfilme der Kapillaren für
die Fluoreszenzerfassung abgeschält werden; durch die gerin
gere Hintergrundstrahlung können Proben mit geringerer Kon
zentration erfaßt werden.
Das Verfahren beim vorliegenden Ausführungsbeispiel erlaubt
hochempfindliche Erfassung von Proben unter Verwendung des
genannten Gels, ohne Verlust der Eigenschaften molekularge
wichtsbezogener Trennung. Darüber hinaus können die Proben
nur in einem vorgegebenen Bereich innerhalb der Fluoreszenz
zelle für Fluoreszenzerfassung wandern, ohne daß eine Pumpe
zum Hervorrufen der Strömung der Pufferlösung verwendet
wird; dadurch ist ein einfacher Geräteaufbau möglich.
Die verwendete Laserausrüstung und die verwendeten Fluores
zenzstoffe sind nicht auf einen Argonlaser bzw. FITC be
schränkt; jeder Fluoreszenzstoff und jede geeignete Laser
ausrüstung kann verwendet werden. Ferner erlaubt es das ak
tuelle Verfahren, zwei oder mehr Fluoreszenzstoffe gleich
zeitig zu erfassen. In diesem Fall werden Sätze optischer
Detektoranordnungen mit einer Linse 112, einem Interferenz
filter 113, einer Linse 114, einem Schlitz 115 und einem
Photovervielfacher 116 mit der Anzahl der Fluoreszenzstoffe
entsprechender Zahl angeordnet, und jede Detektoranordnung
wird so ausgebildet, daß sie die Fluoreszenzstrahlung in
einem besonderen Wellenlängenband erfaßt. Es ist auch mög
lich, die Fluoreszenzstrahlung in einen Spektrographen zu
leiten und einen Zeilensensor für Photoerfassung zu verwen
den.
Auch dieses Gerät kann dazu verwendet werden, die DNS-Basen
sequenz zu bestimmen. Das heißt, daß mit verschiedenen Fluores
zenzstoffen markierte Startermoleküle für jeweils einen Typ
der endständigen Base verwendet werden und Reaktionslösungen
vermischt werden, um Elektrophorese nach jeder DNS-Polymerasereaktion
auszuführen. Der Typ der Base kann dadurch fest
gestellt werden, daß die Fluoreszenzstrahlung der durch den
Spalt laufenden DNS-Fragmente erfaßt wird und dabei die Art
der Fluoreszenzstrahlung identifiziert wird, wodurch die
Basensequenz festgestellt werden kann. Um die Art des Fluo
reszenzstoffs zu identifizieren, ist es erforderlich, vier
Sätze von Detektoren bereitzustellen, um die Fluoreszenz
strahlung in vier Wellenlängenbändern zu messen, wie dies
zuvor unter Bezugnahme auf Fig. 8 beschrieben wurde.
Das vorliegende Ausführungsbeispiel wurde für die Erfassung
von DNS-Fragmenten beschrieben. Das Verfahren ist aber auch
auf die Analyse von z. B. Proteinen, Zucker und ähnlichen
Substanzen anwendbar. Ferner wurden beim Ausführungsbeispiel
zwei Kapillaren mit demselben Innendurchmesser verwendet. Es
ist jedoch auch möglich, eine Kombination von Kapillaren mit
verschiedenen Innendurchmessern zu verwenden. Wenn z. B. der
Innendurchmesser der Kapillare 102 kleiner ausgebildet wird
als derjenige der Kapillare 101, wird das Volumen verrin
gert, wenn Proben, die ausgehend von der Kapillare 101 wan
dern, in die Kapillare 102 eintreten. Dies führt zu höherer
Konzentration der Probenlösung, was hochempfindliche Erfas
sung gewährleistet. Wenn umgekehrt der Durchmesser der Ka
pillare 102 größer ausgebildet wird als derjenige der Kapil
lare 101 können die von der Kapillare 101 ausgehend wandern
den Proben einfacher und zuverlässiger in die Kapillare 102
eingeleitet werden.
Ferner erlaubt es das Verfahren beim vorliegenden Ausfüh
rungsbeispiel, Fluoreszenzstrahlung zu erfassen, ohne daß
Anregungslicht durch den Kapillarbereich läuft, so daß die
Kapillaren nicht durchsichtig sein müssen; es muß keine Ka
pillarummantelung entfernt werden, was zu einfacher Handha
bung führt. Dies erlaubt auch die Verwendung von Kapillaren
aus lichtundurchlässigen fluorhaltigen Polymeren, wie einem
Tetrafluorethylen-Polymer oder einem chlorhaltigen
Trifluorethylen-Polymer. Kapillaren aus einem fluorhaltigen Polymer
zeigen geringe Anhaftung für Proben, was das Erfordernis
einer Behandlung, wie einer Oberflächenbehandlung, besei
tigt. Darüber hinaus besteht keine Beschädigungsgefahr, was
ausgezeichnete Handhabbarkeit ergibt. Ferner erlaubt die
überragende Beständigkeit gegen Chemikalien die Verwendung
von Lösungsmittel über einen sehr großen Bereich von pH-Wer
ten.
Im folgenden wird ein Gerät mit vier parallel angeordneten
Kapillaren für gleichzeitige Fluoreszenzstrahlungserfassung
beschrieben. Fig. 10 zeigt den Aufbau des Fluoreszenzdetek
tors des Elektrophoresegeräts des aktuellen Ausführungsbei
spiels. Mit 127a, 127b, 127c und 127d sind in der Figur Si
licatglaskapillaren mit einem Innendurchmesser von 100 µm,
einem Außendurchmesser von 375 µm und einer Länge von 30 cm
bezeichnet. Ein (nichtdargestelltes) Ende der Kapillaren ist
wie bei dem in Fig. 8 dargestellten Fall in das Gefäß für
die Kathodenelektrode eingetaucht. Entsprechend weisen Sili
catglaskapillaren 128a, 128b, 128c und 128d entsprechenden
Innen- und Außendurchmesser auf, mit einer Länge von 5 cm,
von denen jeweils ein Ende in das Gefäß für die Anodenelek
trode eingetaucht ist.
Mit demselben Verfahren, wie es für das Ausführungsbeispiel
7 beschrieben wurde, werden 5 Prozent Polyacrylamidgel mit
Harnstoff als Denaturierungsmittel in den Kapillaren herge
stellt. Jede Kapillare wird einer Behandlung mit einem Si
lan-Haftvermittler unterzogen, damit das Acrylamid und die
Kapillare chemisch aneinander haften, wobei auch berücksich
tigt ist, daß das Acrylamid während der Elektrophorese nicht
aus der Kapillare auslaufen soll. Die Kapillaren 127a bis
127d und die Kapillaren 128a bis 128d tragen eine quaderför
mige Fluoreszenzzelle 130 und sind so angebracht, daß zwei
oder mehr Spalte 129a bis 129d als Detektionsbereiche gebil
det werden. Die Kapillaren werden durch Kapillarhalter 142
und 143 eines plattenförmigen Blocks aus einem fluorhaltigen
Polymer, wie Tetrafluorethylen, gehalten, der mit vier Verti
kallöchern im Abstand von 1 mm versehen ist. Jede Kapillare
ist in jeweils eines der vier Vertikallöcher eingesetzt, so
daß jeweils Kapillaren 127a und 128a, 127b und 128b, 127c und
128c sowie 127d und 128d jeweils koaxial sind.
Zur Fluoreszenzstrahlungserfassung wird eine Pufferlösung mit
Glyzerol in die Quarzfluoreszenzzelle 30 eingefüllt, wodurch
die Spalte 129a bis 129d mit Pufferlösung ausgefüllt werden.
Wenn in diesem Zustand Spannung angelegt wird, wandert die in
die Kapillare 127a eingeleitete Probe in den Spalt 129a und
dann zur Kapillare 128a. Proben, die in andere Kapillaren
eingeleitet werden, wandern auf dieselbe Weise. Das Glyzerol
in der Pufferlösung beschränkt die Konvektion derselben in
den Spalten, wie beim Fall des Ausführungsbeispiels 7, und es
gewährleistet zuverlässige und gleichmäßige Wanderung der
Proben von den Kapillaren 127a bis 127d zu den Kapillaren
128a bis 128d.
Die Fluoreszenzstrahlungserfassung der durch die Spalte 129a
bis 129d laufenden DNS-Fragmente wird wie folgt ausgeführt.
Zunächst wird Laserlicht 132 von einer Laserquelle 131 durch
eine Linse 133 so kollimiert, daß gleichzeitige Bestrahlung
zweier oder mehrerer Detektionsbereiche, d. h. der Spalte
129a bis 129d, möglich ist. Der Brennpunkt wird in die Posi
tion in der Mitte zwischen den Spalten 129b und 129c einge
stellt, und es erfolgt eine solche Justierung, daß der Maxi
maldurchmesser des Bestrahlungsflecks zwischen den Spalten
129a und 129d 100 µm ist. Wenn eine Linse 33 mit einer Brenn
weite von z. B. 150 mm verwendet wird, ist es möglich, die
Spalte 129a bis 129d mit im wesentlichen derselben Fleckgröße
zu beleuchten.
Fluoreszenzstrahlung, die von den durch jeden Spalt laufenden
DNS-Fragmenten emittiert wird, wird durch eine Linse 134
rechtwinklig zur Einstrahlungsrichtung des Laserlichts gesam
melt, und Hintergrundstrahlung, wie solche von Streulicht,
wird durch ein Abblockfilter 135 entfernt. Dann erfolgt Samm
lung durch eine Linse 136, und ein Bild wird auf einen Zei
lensensor 137, wie einer CCD-Kamera oder einem Photodioden
array, ausgebildet.
Nachdem Daten vom Ausgang des Zeilensensors 137 ausgegeben
worden sind, wird das Elektrophoresemuster und dergleichen
einer Datenverarbeitung durch einen Datenprozessor 138 eines
Computers oder einer ähnlichen Vorrichtung unterzogen, und
die Ergebnisse werden auf einem Monitor 139 dargestellt und
auf einem Drucker 140 ausgegeben oder in einem Speicher 141
abgespeichert.
Unter Verwendung eines Argonlasers als Lichtquelle und einer
FITC-Lösung als Probe wird kontinuierliche Elektrophorese im
Innern der Kapillaren 127a bis 127d ausgeführt. Wenn Fluores
zenzbilder der in den Räumen zwischen den Spalten, die Detek
tionsbereiche darstellen, wandernden Proben durch den Zeilen
sensor 137 erfaßt werden, wird intensive Fluoreszenzstrahlung
an den vier Positionen der Spalte 129a bis 129d erfaßt, d. h.
der Detektionsbereiche, die den Wanderungspfaden entsprechen,
wobei jeder von den anderen Detektionsbereichen unabhängig
ist. Dauernde und gleichzeitige Erfassung der in den Kapilla
ren wandernden Proben ist dadurch möglich, daß die Intensität
der Signale auf dem Zeilensensor an den den Wanderungspfaden
entsprechenden Positionen gemessen werden.
Das Verfahren beim vorliegenden Ausführungsbeispiel erlaubt
Fluoreszenzstrahlungserfassung von gleichzeitig wandernden
Proben durch zwei oder mehr Detektionsbereiche unter densel
ben Bedingungen. Es erlaubt auch eine Analyse über einen wei
ten Bereich, z. B. zur DNS-Basensequenzbestimmung oder zur
gleichzeitigen Bestimmung einer Mehrproben-DNS-Basensequenz,
eine Analyse des Seitenstrangs oder einer funktionellen Grup
pe unter Verwendung eines Fluoreszenzstoffs und eine detail
lierte Analyse von Proben, die durch Flüssigchromatographie
getrennt wurden. Ein einziger Fluoreszenzstrahlungs-Sammel
bereich mit einer Linse ist ausreichend; dieses Merkmal ge
währleistet verringerte Kosten und einfache Struktur.
Ferner sind beim Ausführungsbeispiel Paare von Kapillaren
entlang einer Reihe angeordnet, und Spalträume sind entlang
einer geraden Linie ausgerichtet, wobei Laserlicht entlang
den Spalten eingestrahlt wird, in denen keine Kapillare vor
handen ist. Daher wird das Laserlicht nicht durch Kapillaren
gestreut oder gebrochen, wodurch jeder Spalt mit im wesentli
chen derselben Strahlgröße beleuchtet werden kann. Dies er
laubt einen einfachen Aufbau des Geräts mit wirkungsvoller
Anregung der zwei oder mehr Proben und demgemäß empfindliche
Erfassung. Wenn eine ähnliche Fluoreszenzstrahlungserfassung
dadurch ausgeführt wird, daß zwei oder mehr Kapillaren ohne
Vorsehen eines Spalts angeordnet werden, wenn z. B. zwei oder
mehr Kapillaren ohne Ummantelung, ähnlich wie im herkömmli
chen Fall, angeordnet werden, wie in Fig. 13 dargestellt,
wird das Laserlicht entlang der Einstrahlungsachse desselben
jedesmal dann gestreut oder gebrochen, wenn es durch eine Ka
pillare läuft, und der Laserlichtdurchgang wird gebogen oder
der Laserstrahl spreizt auf, wodurch es nicht möglich ist,
Kapillaren mit denselben Bedingungen zu beleuchten; daher er
halten in der Reihe weiter hinten angeordnete Kapillaren
nicht ausreichend Anregungslaserlicht. In diesem Fall ist es
schwierig, zwei oder mehr Kapillaren anzuordnen. Beim Verfah
ren des vorliegenden Ausführungsbeispiels können dagegen auch
dann, wenn zwei oder mehr Kapillaren vorhanden sind, alle
darin wandernden Proben mit hoher Empfindlichkeit unter den
selben Bedingungen erfaßt werden. Dieses Merkmal erleichtert
gleichzeitige Erfassung vieler Proben.
Im folgenden wird ein Verfahren zur DNS-Basensequenzbestim
mung unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Gerätes be
schrieben.
Mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente werden durch
eine DNS-Polymerasereaktion unter Verwendung eines mit Fluo
reszenzstoffen markierten Startermoleküls gemäß dem wohlbe
kannten Diseoxy-Sequenzerstellungsverfahren hergestellt, wie
es von Sanger und seinem Kollegen erfunden wurde. Das Star
termolekül ist ein mit FITC verbundenes Startermolekül (mar
kiertes Startermolekül). Zunächst wird das markierte Starter
molekül einer einsträngigen DNS zugesetzt, woraufhin erwärmt
wird, wodurch sich das markierte Startermolekül mit der ein
strängigen DNS verbindet. Diese Reaktionslösung wird in vier
Teile unterteilt, die jeweils einer DNS-Polymerasereaktion
für A, C, G bzw. T unterzogen werden. Das heißt, daß vier Arten
von Desoxynukleotid-Triphosphat (dATP, dTTP, dCTP und dGTP)
und ddATP als Endgruppe der einsträngigen DNS zugesetzt wer
den, um die DNS-Polymerasereaktion zu bewirken. Diese Reakti
on sorgt für mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente
mit verschiedenen Längen mit der Endgruppe A. Dieselbe Reak
tion wird für C, G und T wiederholt.
Vier Reaktionslösungen A, C, G und T, wie sie mit dem obigen
Ablauf erhalten wurden, werden jeweils in die Kapillaren
127a bis 127d eingeleitet. Dieses Verfahren ist dasselbe,
wie es für das Ausführungsbeispiel 1 beschrieben wurde; die
Reaktionslösung A wird in die Kapillare 127a eingeleitet, C
in 127b, G in 127c und T in 127d. Dann wird eine Spannung
von etwa 10 kV angelegt, um Elektrophorese hervorzurufen.
Die zeitliche Änderung der Fluoreszenzstrahlung in den Spal
ten 129a bis 129d wird gemessen, wobei als Anregungslicht
quelle ein Argonlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm ver
wendet wird. Da die DNS-Fragmente in einer Reihenfolge wan
dern, die mit demjenigen mit dem kleinsten Molekulargewicht
beginnt, kann die Basensequenz dadurch analysiert werden,
daß die zeitliche Folge im Spalt analysiert wird, mit der
Spitzensignale in der Fluoreszenzstrahlung auftreten.
Auch beim vorliegenden Ausführungsbeispiel ist wie beim Aus
führungsbeispiel 7 die Intensität der erfaßten Hintergrund
strahlung verringert, und hochempfindliche Fluoreszenzstrah
lungserfassung ist gewährleistet. Darüber hinaus erlaubt ein
einfacher Geräteaufbau gleichzeitige Erfassung von zwei oder
noch mehr Proben.
Gleichzeitige Erfassung von DNS-Basensequenzen für viele Pro
ben ist möglich, wenn ein Gerät so aufgebaut wird, daß der
Fluoreszenzstoff für jede Base geändert wird, Lösungen A, C,
G und T gemischt werden und in eine vorgegebene Kapillare
eingefüllt werden und die Änderung der Fluoreszenzstrah
lungsintensität für jede Emissionswellenlänge der Fluores
zenzstrahlung von jedem Fluoreszenzstoff zeitabhängig für
jede der zwei oder mehr Kapillaren gemessen wird.
Die Ausführungsbeispiele 7 und 8 veranschaulichten ein Ge
rät, das Proben durch Messen der Fluoreszenzstrahlung er
faßt. Derselbe Geräteaufbau ist für eine Erfassung absor
bierten oder transmittierten Lichts möglich. Fig. 11 zeigt
einen Aufbau eines Elektrophoresegeräts für Messung durch
Lichtabsorption. Wanderungspfade verwenden zwei Silicanglas
kapillaren, nämlich eine Kapillare 151 mit einem Innendurchmesser
von 100 µm, einem Außendurchmesser von 200 µm und einer Län
ge von 30 cm sowie eine Kapillare 152 mit entsprechenden In
nen- und Außendurchmessern und einer Länge von 20 cm. Fünf
Prozent Polyacrylamidgel mit Harnstoff als Denaturierungs
mittel werden in den Kapillaren 151 und 152 hergestellt. Das
Verfahren zum Herstellen des Gels ist dasselbe wie beim Aus
führungsbeispiel 7; Acrylamidgel wird chemisch mit der Ka
pillare verbunden, die mit einem Silan-Haftvermittler verse
hen ist.
Die Enden der Kapillaren 151 und 152 werden in einer opti
schen Zelle 154 gehalten, und die Intensität von Transmis
sionslicht, die von der Probenabsorption abhängt, wird wie
im Fall des Ausführungsbeispiels 7 erfaßt. Die optische Zel
le 154 ist eine quaderförmige optische Zelle (außen 3 mm im
Quadrat, innen 1 mm im Quadrat) mit vier lichtdurchlässigen
Seiten. Wie beim Aufbau der Fig. 7 und 8 wird jeweils ein
Ende der Kapillaren 151 und 152 innerhalb der optischen Zel
le 154 in solcher Weise gehalten, daß die zwei Kapillaren
koaxial zueinander sind und ein Spalt 153 von 0,2 mm Weite
ausgebildet wird.
Der Spalt 153 wird als optischer Detektor verwendet. Die an
deren Enden der Kapillaren 151 und 152 sind in ein Gefäß für
eine Kathodenelektrode 105 bzw. ein Gefäß für eine Anoden
elektrode 106 eingetaucht, die mit Pufferlösung (TRIS-Borat-EDTA-Pufferlösung)
gefüllt sind. Eine hohe Gleichspannung
wird durch eine Hochspannungs-Gleichspannungsversorgung 107
zwischen das Gefäß für die Kathodenelektrode 105 und das Ge
fäß für die Anodenelektrode 106 gelegt. Das Anlegen der
Spannung ruft einen Strom durch die Kapillare 152, den Spalt
153 und die Kapillare 151 hervor, und die Proben wandern
durch die Kapillare 151, den Spalt 153 und die Kapillare 152.
Um z. B. DNS-Fragmente einzufüllen, die durch ein Restrikti
onsenzym aufgeschlossen wurden, wird das Ende der Kapillare
151 zeitweilig an der Kathodenseite in eine Probenlösung ein
getaucht, und eine Spannung von 5 kV wird für 10 Sekunden
zwischen die Probenlösung und das Gefäß für die Anodenelek
trode gelegt. Dann wird das Ende der Kapillare in das ur
sprüngliche Gefäß für die Kathodenelektrode zurückgeführt,
und eine Spannung von 10 kV wird zwischen das Gefäß für die
Kathodenelektrode und das Gefäß für die Anodenelektrode ge
legt. Es wird dafür gesorgt, daß die Probe in der Kapillare
151 von der Kathodenseite zur Anodenseite wandert, wobei sie
eine molekulargewichtsmäßige Trennung erfährt. Sie läuft dann
durch den Spalt 153 und wird in die Kapillare 152 eingelei
tet.
Für die durch den Spalt 153 laufenden DNS-Fragmente wird das
Licht von einer Lichtquelle 155, wie einer Xenonlampe oder
einer D2-Lampe, mittels einer Linse 157 kollimiert und durch
einen Monochromator 156 geleitet und in den Spalt 153 einge
strahlt. Die Wellenlänge des einzustrahlenden Lichts wird auf
die Absorptionswellenlänge der Probe eingestellt. Zum Beispiel wird
sie im Fall von DNS-Fragmenten auf 260 nm eingestellt. Das
nach Absorption durch die DNS-Fragmente vorhandene Transmis
sionslicht wird wieder durch eine Linse 158 gesammelt und
durch einen Photovervielfacher 159 erfaßt. Das Ausgangssignal
des Photovervielfachers 159 wird durch einen Verstärker 160
verstärkt, und das Elektrophoresemuster und dergleichen wird
einer Datenverarbeitung durch einen Datenprozessor 161 eines
Computers oder einer ähnlichen Vorrichtung unterzogen. Die
Ergebnisse werden auf einem Monitor
162 und einem Drucker 163 ausgegeben oder in einem Speicher
164 abgelegt.
Der mit Pufferlösung ausgefüllte Spalt ist beim vorliegenden
Ausführungsbeispiel zwischen den Kapillaren vorhanden, um
eine Trennung zwischen dem Kapillarbereich als Molekularge
wicht-Trennbereich und dem Spaltraum als optischem Detektor
zum Messen der Lichtabsorption vorzunehmen. Diese Anordnung
ermöglicht wirkungsvolle Bestrahlung der Probe, ohne daß das
Licht durch die Kapillaren gestreut wird, was hochgenaue Er
fassung durch Lichtabsorption gewährleistet.
Es sei angenommen, daß "1" die Transmissionslichtintensität
ist (die numerische Apertur der Photodetektorlinse ist
"0,19" bei fehlendem Durchlauf der Probe), wenn das Licht in
den Spalt, wie beim vorliegenden Ausführungsbeispiel, ein
tritt. Wenn das Licht, wie beim Stand der Technik, durch die
Kapillare tritt, wird die Transmissionslichtintensität auf
etwa 0,6 erniedrigt. Da die Kapillare selbst und das Gel,
wie das Polyacrylamidgel, das das Medium für molekularge
wichtsmäßige Trennung durch Elektrophorese ist, als Licht
streukörper wirken, wird das eintretende Licht durch diese
Körper gestreut, was zu verringerter Intensität des Trans
missionslichts führt. Eine verringerte Intensität des Trans
missionslichts bedeutet ein entsprechend verringertes S/R-Verhältnis
des optischen Detektors, was zu verringerter Meß
genauigkeit führt. Beim Stand der Technik wird auch ein Teil
des von der Oberfläche einer Kapillare gestreuten oder re
flektierten Lichts gemessen. Derartiges Licht tritt direkt
in den Detektor ein, ohne daß es die Probe beleuchtet (ohne
von der Probe absorbiert zu werden). Trotz des Vorhanden
seins einer solchen Probe ist es schwierig, eine kleine Än
derung der Lichtintensität zu erfassen, wenn eine zu erfas
sende Lichtkomponente vorliegt; d. h., daß eine hochgenaue
Messung der Lichtabsorption schwierig ist.
Da beim vorliegenden Ausführungsbeispiel das Licht durch den
Spaltraum, d. h. die Pufferlösung mit minimaler Lichtstreu
ung, tritt, wird das Licht nicht durch Streuung durch die
Kapillare selbst und das Gel beeinflußt, wie beim obigen
Fall. Dies gewährleistet wirkungsvolle Beleuchtung der Pro
ben und hochgenaue Messung durch Lichtabsorption.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird das durch den Mo
nochromator 156 laufende Licht durch eine Linse gesammelt
und in den Spalt eingestrahlt. Dieselbe Messung ist auch
möglich, wenn das Licht in Form paralleler Strahlen ohne
Lichtsammlung eingestrahlt wird und durch räumliche Trennung
nur die Intensität desjenigen Lichts gemessen wird, das
durch den Spalt lief.
Wie im Fall des Ausführungsbeispiels 8 ist auch gleichzeiti
ge Erfassung der Absorption von Proben mit zwei oder mehr
Paaren von Kapillaren möglich. In diesem Fall ist das Gerät
wie folgt aufgebaut: zwei oder mehr Paare von Kapillaren
sind innerhalb einer Fläche rechtwinklig zur Lichteinstrahl
achse angeordnet, und die Intensität des Lichts durch jeden
der zwei oder mehr Spalte wird durch einen zweidimensionalen
Sensor oder eine ähnliche Vorrichtung erfaßt.
Bei den Ausführungsbeispielen 7 bis 9 wird der Spalt aus
schließlich durch ein Paar Kapillaren gebildet. Der Molekulargewicht-Trennbereich
besteht bei diesen Ausführungsbei
spielen aus Kapillaren. Ein Spalt kann jedoch auch durch die
Enden von Kapillaren und durch eine mit feinen Löchern ver
sehene Platte gebildet werden.
Fig. 12 ist eine vergrößerte Darstellung des Querschnitts
einer Fluoreszenzzelle, bei der ein Spalt durch eine Kapil
lare und durch eine mit feinen Löchern versehene Platte ge
bildet wird.
Wie im Fall des Ausführungsbeispiels 1 sind eine mit Poly
acrylamidgel gefüllte Kapillare 171 und eine mit feinen Lö
chern 172 versehene Platte 173 (z. B. eine Platte aus Tetrafluorethylen-Polymer)
einander gegenüberstehend so angeord
net, daß die Achse der Kapillare 171 mit dem feinen Loch 172
fluchtet und ein Spalt 174 ausgebildet wird. Sie werden in
nerhalb einer Fluoreszenzzelle 175 gehalten. Es ist eine
quaderförmige Fluoreszenzzelle mit Außenabmessungen von 3 mm
im Quadrat und Innenabmessungen von 1 mm im Quadrat, wobei
die Ober- und die Unterseite geöffnet sind. Sie wird z. B.
durch einen oben liegenden Block 176 aus einem Tetrafluorethylen-Polymer
und durch eine unten liegende Platte 173 ge
halten, wodurch Pufferlösung in ihr enthalten sein kann. Der
Block 176 aus dem Tetrafluorethylen-Polymer ist mit einem
Loch versehen, das an die Außenabmessung der Kapillare 171
angepaßt ist. Die Kapillare 171 ist durch dieses Loch so ge
steckt, daß sie in ihm festgehalten wird, und die Länge 174
kann von 0,1 mm bis 1,0 mm eingestellt werden. Das andere
Ende der Kapillare 171 ist, wie im Fall des Ausführungsbei
spiels 1, in das Gefäß für die Kathodenelektrode einge
taucht. Eine Leitung 177 aus Tetrafluorethylen-Polymer ist
über einen Leitungshalter 178 mit dem Boden der Platte 173
verbunden, und sie führt zum Gefäß für die Anodenelektrode.
Auch die Platte 173 kann in Kontakt mit dem Gefäß für die
Anodenelektrode stehen.
Obwohl dies in Fig. 12 nicht dargestellt ist, ist innerhalb
der Fluoreszenzzelle 175 ein Einlaß für Pufferlösung vorhan
den wie im Fall von Fig. 9. Die Pufferlösung wird während
der Elektrophorese über ein Ventil zugeführt, um die Fluo
reszenzzelle 174, den Spalt 175 und die Leitung 177 aus dem
Tetrafluorethylen-Polymer aufzufüllen. Nachdem die Zufuhr
der Pufferlösung beendet wurde, wird dafür gesorgt, daß die
Probe wandert. Das Verfahren bei diesem Ausführungsbeispiel
sorgt, wie im Fall des Ausführungsbeispiels 7, für Fluores
zenzstrahlungserfassung mit minimaler Intensität der Hinter
grundbeleuchtung, was hochempfindliche Fluoreszenzstrah
lungserfassung ermöglicht.
Die Anordnung feiner Löcher in der Platte 173 in einer gera
den Linie erlaubt einen Aufbau einer Fluoreszenzzelle, die
dieselben Wirkungen zeigt wie diejenige des Ausführungsbei
spiels 8.
Das Verfahren bei diesem Ausführungsbeispiel gewährleistet
einfache Installation des Gerätes, da die Platte 173 auf
einer Seite verwendet wird.
Die Erfindung erlaubt den Aufbau eines Elektrophoresegerä
tes, das hochempfindliche Messung durch Fluoreszenzstrahlung
oder Lichtabsorption bei minimaler Beeinflussung durch Hin
tergrundlicht erlaubt, wenn optische Erfassung in einem Mo
lekulargewicht-Trennbereich, wie einem Kapillargel, ausge
führt wird. Sie erlaubt auch einen einfachen Aufbau eines
Fluoreszenzstrahlungs- oder Lichtabsorptionsdetektors, der
aus einem Elektrolyten besteht, ohne daß das Molekularge
wicht-Trennvermögen bei Gelelektrophorese verlorengeht, was
zu einem vereinfachten Geräteaufbau führt. Sie realisiert
auch ein Elektrophoresegerät für gleichzeitige Elektrophore
se von zwei oder noch mehr Proben und für deren gleichzeiti
ge Messung.
Claims (13)
1. Elektrophoresegerät, umfassend
eine optische Zelle (4), innerhalb der die Enden eines Paares von Kapillaren (1, 2) einander unter Bildung eines Spaltes (3) gegenüberstehen, durch den eine Probe von der ei nen in die andere Kapillare strömt,
eine Einrichtung (8-11) zum Einleiten einer die Probe im Bereich des Spaltes (3) ummantelnden Lösung in die optische Zelle (4), und
eine optische Einrichtung (20-22, 32-39) mit einer Lichtquelle (20) zum Bestrahlen der Probe im Bereich des Spaltes (3) und einer Detektoreinrichtung (34) zur Bestimmung von Eigenschaften der Probe.
eine optische Zelle (4), innerhalb der die Enden eines Paares von Kapillaren (1, 2) einander unter Bildung eines Spaltes (3) gegenüberstehen, durch den eine Probe von der ei nen in die andere Kapillare strömt,
eine Einrichtung (8-11) zum Einleiten einer die Probe im Bereich des Spaltes (3) ummantelnden Lösung in die optische Zelle (4), und
eine optische Einrichtung (20-22, 32-39) mit einer Lichtquelle (20) zum Bestrahlen der Probe im Bereich des Spaltes (3) und einer Detektoreinrichtung (34) zur Bestimmung von Eigenschaften der Probe.
2. Elektrophoresegerät, umfassend
eine optische Zelle (4), innerhalb der mindestens zwei Kapillaren (1a-1t) enden,
eine Einrichtung (8-11) zum Einleiten einer Lösung in die optische Zelle (4), um aus den Enden der Kapillaren (1a-1t) austretende Proben zu ummanteln, und
eine optische Einrichtung (20-22, 32-39) mit einer Lichtquelle (20) zum Bestrahlen der austretende Proben und einer Detektoreinrichtung (34) zur Bestimmung von Eigenschaf ten der Proben.
eine optische Zelle (4), innerhalb der mindestens zwei Kapillaren (1a-1t) enden,
eine Einrichtung (8-11) zum Einleiten einer Lösung in die optische Zelle (4), um aus den Enden der Kapillaren (1a-1t) austretende Proben zu ummanteln, und
eine optische Einrichtung (20-22, 32-39) mit einer Lichtquelle (20) zum Bestrahlen der austretende Proben und einer Detektoreinrichtung (34) zur Bestimmung von Eigenschaf ten der Proben.
3. Gerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine
gemeinsame Auslaßleitung (64; 71) aus der optischen Zelle (4)
vorgesehen ist.
4. Gerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jedem
Kapillaren-Ende (1a-1t) eine Auslaßöffnung (2a-2t; 61a-61t;
81a-81d) unter Bildung eines Spaltes (3a-3t) gegenübersteht.
5. Gerät nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die
Auslaßöffnungen von zweiten Kapillaren (2a-2t) oder Öffnungen
(61a-61t) in einer die optische Zelle (60) begrenzenden Plat
te (62) oder Nuten (81a-81d) in einer die optische Zelle be
grenzenden Platte (80) gebildet sind.
6. Gerät nach Anspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet,
daß der Abstand zwischen den einander zugewandten Kapillaren-Enden
0,1 bis 3 mm beträgt.
7. Gerät nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Enden der jeweils eine Probe in die opti
sche Zelle (4) einleitenden Kapillaren (1a-1t) längs des von
der Lichtquelle (20) emittierten Lichtstrahls ausgerichtet
sind und die Detektoreinrichtung (34) die Eigenschaften sämt
licher Proben bestimmt.
8. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß die bzw. jede die Probe in die optische Zelle
(4) einleitende Kapillare (1a-1t) mit Gel gefüllt ist.
9. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Ummantelungslösung die gleiche Zusammenset
zung hat wie die Lösung in der bzw. jeder die Probe in die
optische Zelle (4) einleitenden Kapillare (1a-1t).
10. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Ummantelungslösung ein Denaturiermittel für
die Probe(n) enthält.
11. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Zufuhr der Ummantelungslösung aus einem Ge
fäß (10) erfolgt, das auf einem höheren Niveau angeordnet ist
als das die Ummantelungslösung aus der optischen Zelle (4)
aufnehmende Gefäß (7).
12. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Detektoreinrichtung (34) die Fluoreszenz
strahlung, die von die Probe(n) markierenden Fluoreszenzstof
fen emittiert wird, oder die Lichtabsorption der Probe(n) er
faßt.
13. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich
die Probe von der einen Kapillare (1) zur anderen Kapillare
(2) durch Elektrophorese bewegt.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4106966A JP2974495B2 (ja) | 1992-04-24 | 1992-04-24 | 電気泳動装置及び電気泳動方法 |
JP24172792 | 1992-09-10 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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DE4313367A1 DE4313367A1 (de) | 1993-10-28 |
DE4313367C2 true DE4313367C2 (de) | 1997-08-14 |
Family
ID=26447059
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19934313367 Expired - Lifetime DE4313367C2 (de) | 1992-04-24 | 1993-04-23 | Elektrophoresegerät |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4313367C2 (de) |
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US5439578A (en) * | 1993-06-03 | 1995-08-08 | The Governors Of The University Of Alberta | Multiple capillary biochemical analyzer |
US5582705A (en) * | 1995-05-19 | 1996-12-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Multiplexed capillary electrophoresis system |
US5567294A (en) * | 1996-01-30 | 1996-10-22 | Board Of Governors, University Of Alberta | Multiple capillary biochemical analyzer with barrier member |
US6759662B1 (en) * | 1998-07-28 | 2004-07-06 | Ce Resources Pte. Ltd. | Optical detection system |
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- 1993-04-23 DE DE19934313367 patent/DE4313367C2/de not_active Expired - Lifetime
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DE19724014B4 (de) * | 1997-06-06 | 2006-11-09 | Heckmann, Klaus, Prof. Dr. | Verfahren und Einrichtung zum Bestimmen des Ladungsnullpunkts von elektrisch geladenen kolloidalen und/oder suspendierten Teilchen |
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Publication number | Publication date |
---|---|
DE4313367A1 (de) | 1993-10-28 |
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