DE4113393C2

DE4113393C2 - Testverfahren für wundheilungs- und angiogenesefördernde Substanzen

Info

Publication number: DE4113393C2
Application number: DE19914113393
Authority: DE
Inventors: Gesa Dr Anssar-Haedenkamp; Ulrich Dr Schiele; Guenter Dr Kuntz; Bettina Dr Andersen-Beckh
Original assignee: Individual
Current assignee: Nycomed Arzneimittel GmbH
Priority date: 1991-04-24
Filing date: 1991-04-24
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 2011-04-25
Also published as: DE4113393A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Testverfahren mit dessen Hilfe Substanzen, die die Wundheilung und Angiogenese fördern aus biologischen (physiologischen) Flüssig keiten isoliert werden können.

Es ist bekannt, daß ein auf bestimmte Art aufbereite ter Anteil von Blut, wie z. B. das Präparat ACTOVEGIN (eingetragenes Markenzeichen) (DE-A-10 76 888, Jaeger und Mittenzwei) die Wundheilung fördert. Die die Wundheilung fördernde Wirksubstanz selbst ist jedoch nicht bekannt. Aus dieser Situation ergibt sich die grundsätzliche Schwierigkeit, ein definiertes Präpa rat herzustellen.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Entwicklung ei nes Testverfahrens mit dessen Hilfe eine oder mehrere wundheilungs- bzw. angiogenesefördernde Substanz/en aus biologischen Flüssigkeiten (z. B. Blut, Lymphe, Urin, Molke usw.) isoliert und deren Struktur dann aufgeklärt werden kann.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch die kenn zeichnenden Merkmale der Ansprüche 1 und 2 gelöst.

"Die Wundheilung ist ein sehr komplexer Prozeß, der sich in drei Phasen unterteilen läßt
1. exsudative Phase
2. proliferative Phase
3. Narbenbildung.

Ein erster provisorischer Wundverschluß wird dadurch erreicht, daß das im Bereich der Wunde austretende Blut gerinnt. Danach dringen Granulozyten und Serum in das Wundgebiet ein (exsudative Phase). In der pro liferativen Phase sprossen Kapillaren und wandern Fibroblasten, Histiozyten und andere Zellen in das Gerinnsel ein (Bildung eines Granulationsgewebes). In der Phase der Narbenbildung schließlich bilden sich die Kapillaren zurück, und der Defekt wird mit faser reichem Bindegewebe ausgefüllt. Das letztlich vorhan dene Narbengewebe ist kapillar- und zellarm" (Thews, Mutschler, Vaupel: Anatomie, Physiologie, Pathophysiologie des Menschen; Wissenschaftliche Ver lagsgesellschaft mbH Stuttgart 1989, S. 38).

Diese Prozesse setzen eine sehr differenzierte zeit liche Regulation voraus, die zudem örtlich begrenzt und gerichtet ist. Bestimmte Zelltypen wandern in ei ner bestimmten Phase zu bestimmten Positionen in das Wundgebiet ein. Bestimmte Zelltypen vermehren sich in bestimmten Phasen in bestimmten Anordnungen. Zerstör tes Material im Wundbereich wird abgebaut. In einer bestimmten Phase wird eine neue extrazelluläre Matrix u. a. aus Kollagen aufgebaut.

Die Regulation dieser Prozesse erfolgt zumindest zum Teil durch für die verschiedenen Zellen spezifische Wachstumsfaktoren. Die Strukturen vieler solcher Wachstumsfaktoren wurden bereits aufgeklärt. Die Kon zentration dieser Faktoren muß also sowohl lokal als auch zeitlich reguliert sein.

Zur Förderung der Wundheilung sind solche Wachstums faktoren deshalb höchstens in Ausnahmefällen geeig net, da sie weder lokal noch zeitlich differenziert appliziert werden können.

Der naheliegende Ansatz wäre es, die Beeinflussung der Wundheilung an Versuchstieren zu untersuchen.

Diese Untersuchungen sind jedoch sehr aufwendig und lassen zudem keine relevanten Ergebnisse erwarten, da bei Tieren im gesunden Zustand die Bedingungen für die Wundheilung ohnehin optimal sind. Die Beeinflus sung einer gestörten Wundheilung müßte an kranken oder anders geschädigten Tieren untersucht werden, was praktisch schwer durchführbar ist.

Das gleiche gilt für die Angiogenese, die Teil der Wundheilung ist, aber auch als isoliertes Phänomen auftritt.

Auf Grund dieser Situation ergab sich die Schwierig keit einen theoretischen Ansatz für einen zur Erfas sung der Wundheilung relevanten Test zu finden.

Es ist bekannt, daß mit Zellkulturen der wachstums fördernde Effekt von Substanzen demonstriert werden kann. Hier gibt es eine große Zahl von Zelltypen und Wachstumsbedingungen (verschiedene Medien, verschiedene Zusätze, Zeit, Haftfläche, Einsatzmenge von Zellen, pH-Wert, usw.). Beispiele hierfür sind in der Fachliteratur bekannt, z. B. aus J. A. Eliason, J. P. Elliott, Invest. Ophtalmol. Visual Sci. 28 (1987), 1963-1969; P. Reynolds et al., J. Reprod. Fertil. 81 (1987) 233-240 oder C. L'Heveder et al., Int. J. Cosmet. Sci. 8 (1986) 81-92.

Auch an der Wundheilung ist eine Vielzahl von Zellen beteiligt. Die Lösung der gestellten Aufgabe wird erst durch die Einführung ganz spezieller Zellkulturbedingungen ermöglicht. Es werden solche Zelltypen eingesetzt, die sich im Wundbereich vermeh ren, wie Endothelzellen, Fibroblasten, Epithelzellen.

Durch Verwendung eines verarmten Mediums (hitzebehan delte Serumkomponente, suboptimale Konzentration an Wachstumsfaktoren, verringerte Mengen an Aminosäuren, Glucose usw., geringere Konzentration an Sauerstoff) wird eine pathologische Situation simuliert. Substan zen, die unter solchen Bedingungen die Zellvermehrung stimulieren, sind Kandidaten zur Entwicklung von wundheilungs- bzw. angiogenesefördernden Pharmaka.

Die Erfindung wird nun am Beispiel der Untersuchung des niedermolekularen Anteils von Blut ausführlich erläutert.

Endothelzellen werden im verarmten Medium in Kultur gehalten. Der Einfluß verschiedener Zusätze in stei gender Konzentration auf die Zellvermehrung ist in der Abb. 1 zusammengefaßt.

Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) zeigt dabei im an gewendeten Konzentrationsbereich keinen oder nur ei nen geringen wachstumsfördernden Effekt bei Endothelzellen. Der niedermolekulare Anteil von Blut allein zeigt bis zu sehr hohen Konzentrationen eben falls keine oder nur geringe Stimulation des Wachs tums. Wird der niedermolekulare Anteil von Blut je doch zusammen mit EGF eingesetzt, so zeigt sich eine ausgeprägte Stimulation des Wachstums. Dieser Effekt läßt sich mit EGF-Konzentrationen erzielen, die al lein keine oder höchstens geringe Stimulierung des Wachstums bewirken. Der niedermolekulare Anteil von Blut hat somit die bemerkenswerte und überraschende Eigenschaft, die Wirkung von EGF zu verstärken.

Im Hinblick auf die Anwendung zur Förderung der Wund heilung bzw. Angiogenese ist gerade diese Eigenschaft von außerordentlicher Bedeutung.

Wie bereits oben ausgeführt, verlaufen die einzelnen Prozesse der Wundheilung zeitlich und räumlich geord net. Je nach Phase der Wundheilung schwankt die Kon zentration eines Wachstumsfaktors in weiten Berei chen. Durch eine Verstärkung dieses streng regulier ten Prozesses ist eine Förderung der Wundheilung also möglich, die durch die Applikation des betref fenden Wachstumsfaktors selbst nicht erzielt werden könnte, wie im folgenden dargestellt wird: Dies wird bei der Rolle der Kapillareinsprossung im Wundheilungsprozeß besonders deutlich. In der proliferativen Phase sprossen Kapillaren in das Wund gebiet ein. Die Konzentration der betreffenden Wachstumsfaktoren muß also hoch sein. In der Phase der Narbenbildung erfolgt dagegen eine Rückbildung von Kapillaren. Die Konzentration der betreffenden Wachstumsfaktoren muß also niedrig sein.

Die Zugabe der entsprechenden Wachstumsfaktoren zur Beeinflussung der Wundheilung würde die Rückbildung der Kapillaren hemmen und den Heilungsprozeß in die ser Phase stören. Durch den verstärkenden Effekt des niedermolekularen Anteils von Blut wird dagegen die Regulation des Heilungsprozesses nicht gestört; die betreffenden Prozesse werden nur verstärkt.

Das angestrebte Ziel, d. h. ein Testsystem mit wel chem, unabhängig von individuellen Abweichungen, mit relativ begrenztem Aufwand, eine wundheilungs- bzw. angiogenesefördernde Wirkung reproduzierbar erfaßt werden kann, wird mit der Bestimmung des Wachstums der Endothelzellen unter den beschriebenen Bedingun gen erreicht.

Eine mögliche Ausführungsform dieses Tests ist im Beispiel dargestellt. Die Zusammenhänge werden durch die Abbildung veranschaulicht.

Beispiel

Die Isolierung von "capillary endothelial cells" (CEC) aus Meerschweinchenherzen erfolgte nach S. Nees et al., Eur. J. Cell Biol. 24; 287-297 (1981). Die Medien setzten sich wie folgt zusammen:

Sucrosemedium:
20% Sucrose (Merck, Darmstadt) in Medium 199 (Gibco) 37°C;

Kulturmedium:
Medium 199 (Gibco) mit 20% fötalem Kälberserum (FCS) (Flow Laboratories);

Enzymlösung:
0,1% Collagenase (Sigma, Deisenhofen) und 0,1% Trypsin (Biochrom, Berlin) in PBS-d (Biochrom), 37 °C;

PBS-d:
Phosphate-buffered-saline solution ("d" heißt "Ca²⁺- und Mg²⁺- deficient") pH-Wert 7,2

171 mM NaCl
3,35 mM KCl
8,1 mM Na₂HPO₄
1,8 mM KH₂PO₄

PBS:
Phosphate-buffered-saline solution, pH-Wert 7,2

137 mM NaCl
2,7 mM KCl
6,5 mM Na₂HPO₄
1,5 mM KH₂PO₄
0,7 mM CaCl₂
0,5 mM MgCl₂

Alle Lösungen sollten 100 IU/ml Penicillin, 10 µg/ml Streptomycin und 2,5 µg/ml Fungizon (alle von Biochrom) enthalten.

Ein aus einem Meerschweinchen (200-300 g) isolier tes Herz wird kanuliert und zuerst retrograd mit 20 ml Sucrosemedium, dann mit 10 ml Enzymlösung perfun diert. Abgelöste mikrovaskuläre Endothelzellen in der Enzymlösung überschichten das Sucrosemedium und las sen sich leicht ernten. Die Zellen aus vier Herzen werden vereinigt und dreimal mit je 50 ml Kulturmedium gewaschen (10 min, 250 g). Sie werden dann in zwei bis vier 35 mm-Petrischalen mit je 2 ml Kulturmedium ausgesät und im feuchten Brut schrank bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Das Medium wird nach 24 h erneuert, danach werden die Kulturen zweimal pro Woche mit frischem Medium gefüt tert.

Für die Durchführung des Tests wurden konfluente CEC- Primärkulturen zur Synchronisation drei Tage in Testmedium mit niedrigem Serumgehalt und bovinem Se rumalbumin (BSA) (Sigma) (zur Stabilisierung) kulti viert. Dieses Testmedium (nach Nees) bestand aus Medium 199 mit 0,5% hitzeinaktiviertem fötalem Käl berserum (FCS; Sigma) (56°C, 30 min), 1,7% BSA und Penicillin/Streptomycin/Fungizon (s. o.). Dieses Medium sichert die Anheftung und das Überleben der CEC bei geringer Aussaatdichte, erlaubt aber kaum Wachstum. Danach wurden die CEC in Einzelzellen dissoziiert mit 0,5 ml 0,1% Collagenase/0,1% Trypsin (s. o.), wodurch andere, in geringer Anzahl vorhandene Zelltypen - vermutlich makrovaskuläre Endothelzellen (S. Nees: persönliche Mitteilung) - nicht abgelöst werden. Nach der Zellzählung wurde die Zellsuspension in einer Konzentration von 1000 Zel len/well (Napf) mit 0,1 ml Testmedium pro well in Mikrotiterplatten mit 96 wells ausgesät.

Nach der Aussaat wurden 0,1 ml/well Testsubstanz in Testmedium zugefügt. Wegen der geringen Aussaatdichte benötigen die Zellen keine Erneuerung des Mediums während der folgenden drei Wochen Kultur. Der nieder molekulare Anteil von Kälberblut sowie Fraktionen da von dürfen maximal mit 1 mg/ml (bezogen auf Trocken gewicht) eingesetzt werden, höhere Konzentrationen wirken offenbar toxisch (möglicherweise wegen des ho hen Salzgehalts). EGF wurde in einer Konzentration von 1 ng/ml verwendet.

Das Wachstum der Kulturen wurde dann durch Zellzäh lung oder MTT-Test (T. Mosmann, J. Immunol. Meth. 65: 55 (1983), L. M. Green et al., J. Immunol. Meth. 70; 257 (1984)) analysiert. Der MTT-Test mißt die Aktivi tät von mitochondrialen Dehydrogenasen. Alternativ läßt sich der Saure-Phosphatase-Test nach Connolly et al. (Analyt. Biochem. 152; 136-140 (1986)) oder der Einbau von ³H-Thymidin verwenden.

Beim MTT-Test werden die wells mit je 200 µl PBS ge spült, dann 30 min bei 37°C mit - pro well - 10 µl MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra zolium bromide; Thiazolyl blue) (Sigma; 5 mg/ml PBS) und 100 µl PBS inkubiert. Nach dem Absaugen und Spü len mit je 200 µl PBS werden die blau angefärbten Zellen mit - pro well - 20 µl 6% SDS (Natrium dodecylsulfat, Sigma) in H₂O und 200 µl 0,04 N HCl in Isopropanol lysiert.

Die Extinktion des gut gemischten Lysats, die linear mit der Zelldichte korreliert, wurde in einem "Multiskan" (Pharmacia) bei einer Wellenllänge von 570 nm bestimmt. Zur Ermittlung des Stimulationsfaktors wurde die Extinktion bei 570 nm der jeweiligen Testsubstanz-Konzentration durch die Extinktion bei 570 nm der jeweiligen Kulturen divi diert, die nur Testmedium erhalten hatten.

Die Abbildung illustriert die Dosisabhängigkeit der Wirkung der Testsubstanzen

- niedermolekularer Anteil von Kälberblut
- Kontrollösung (Salze, Aminosäuren, Zucker, Metabolite entsprechend der Zusammensetzung des niedermolekularen Anteils von Kälberblut)
- EGF

auf die Proliferation kapillarer koronarer Endothelzellen (CEC).

Die Abbildung zeigt den Einfluß des niedermolekularen Anteils von Kälberblut auf das Wachstum koronarer kapillarer Endothelzellen.

Primäre kapillare Koronar-Endothelzellen (CEC) wurden in einer Dichte von 1000 Zellen/well in 96 well- Mikrotiterplatten ausgesät und drei Wochen mit 0,2 ml Testmedium kultiviert, das verschiedene Konzentratio nen folgender Testsubstanzen enthielt:

1. niedermolekularer Anteil von Kälberblut +1 ng/ml EGF
2. Kontrollösung +1 ng/ml EGF
3. EGF
4. niedermolekularer Anteil von Kälberblut
5. Kontrollösung

Danach wurde die Zelldichte mit dem MTT-Test be stimmt.

Die Abszisse bezeichnet die Konzentrationen der ein gesetzten Substanzen in µg/ml (niedermolekularer An teil von Kälberblut, Kontrollösung) bzw. pg/ml (EGF), die Ordinate den Wachstumsstimulationsfaktor, bezogen auf die Zelldichte im Testmedium ohne Testsubstanz. Jeder Meßpunkt stellt den Mittelwert aus 8 Bestimmun gen (wells) dar.

Dieser Test ist somit der Schlüssel zur Isolierung der Wirksubstanz(en) aus dem Substanzgemisch des nie dermolekularen Anteils von Blut. Mit Hilfe bekannter ter Anreicherungsverfahren wie Fällungen mit org. Lö sungsmitteln, Salzfällungen, Chromatographie an Molekularsieben und Ionenaustauschern, Affinitäts chromatographie, HPLC mit normalen und reversed Pha sen, lassen sich die Komponenten des nieder molekularen Anteils von Blut auftrennen und mit Hilfe des Tests läßt sich bestimmen, in welchen Fraktionen sich die aktive(n) Substanz(en) befindet(n). Auf diese Weise gelangt man schließlich zur reinen Wirk substanz, deren chemische Struktur dann aufgeklärt werden kann.

Als Pharmakon hat eine solche Wirksubstanz eine Be deutung, die weit über die des Substanzgemisches (niedermolekularer Anteil von biologischen Flüssig keiten wie z. B. Blut) hinausgeht. Mit den sich bei einer solchen Monosubstanz bietenden Untersuchungsmöglichkeiten können die optimale Dosie rung und die Bedingungen zur Aufrechterhaltung eines wirksamen Spiegels bestimmt werden. Der therapeuti sche Nutzen wird somit erhöht. Darüber hinaus kann der Wirkungsmechanismus besser studiert werden, was wiederum zu einer gezielteren Anwendung führt.

Mit dem beschriebenen Testsystem können selbstver ständlich entsprechende Wirksubstanzen auch aus ande rem biologischem Ausgangsmaterial isoliert werden.

Die gewerbliche Anwendung beschränkt sich nicht dar auf, ein Testverfahren zum Screening und zur Isolie rung von wundheilungs- und angiogenesefördernden Sub stanzen entwickelt zu haben. Das Testverfahren kann auch zur qualitativen und quantitativen Aktivitäts bestimmung im Rahmen der Qualitätskontrolle (Aus gangsmaterial, Zwischenprodukt, Endprodukt) von wundheilungs- bzw. angiogenesefördernden Präparaten eingesetzt werden. Dies gilt für Präparate mit be kanntem wie mit unbekanntem Wirkprinzip.

Claims

1. Biologisches Testverfahren zum Auffinden und Isolieren von wundheilungs- bzw. angiogenesefördernden Substanzen mittels qualitativen Nachweises und quantitativer Erfas sung dieser wundheilungs- bzw. angiogeneseför dernden Substanzen aus biologischen (physiologischen) Flüssigkeiten unter Verwendung im Wundbereich sich vermehrender Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Wachstumsfaktor in suboptimaler Konzentration eingesetzt wird.

2. Testverfahren zur Bestimmung und Quantifizierung der biologischen Aktivität von wundheilungs- bzw. angiogenesefördernden Substanzen, die gemäß dem Verfahren des Anspruchs 1 oder nach sonstigen Verfahren isoliert worden sind, unter Verwendung im Wundbereich sich vermehrender Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Wachstumsfaktor in suboptimaler Konzentration eingesetzt wird.

3. Testverfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Wachstumsfaktor vorzugs weise nur ein einziger, der von Fall zu Fall auch unterschiedlich sein kann, oder aber eine Kombi nation von zwei oder mehreren Wachstumsfakto ren verwendet wird.

4. Testverfahren nach Anspruch 3, wobei der Wachstumsfaktor epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) ist.

5. Testverfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die im Wundbereich sich vermehrenden Zellen in einer Kultur mit verarmtem Medium, wie z. B. erniedrigter Se rumgehalt, ohne Serumzusatz und/oder Verringe rung des Nährstoffangebots, gehalten werden.

6. Testverfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß nur der niedermolekulare Anteil der biologischen Flüssig keit verwendet wird.

7. Testverfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die nie dermolekularen Substanzen aus Blut gewonnen wer den, wie z. B. Humanblut, tierisches Blut (Rinder blut, Schweineblut, Pferdeblut usw.).

8. Testverfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß als im Wund bereich sich vermehrende Zellen Endothelzellen oder/und Fibroblasten oder/und Epithelzellen ver wendet werden.

9. Testverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn zeichnet, daß die Endothelzellen aus koronaren Kapillaren gewonnen werden.