DE69731302T2

DE69731302T2 - Verwendung von substanzen, die die östrogen wirkung fördern, zur behandlung von wunden

Info

Publication number: DE69731302T2
Application number: DE69731302T
Authority: DE
Inventors: William Mark High Peak FERGUSON; Sarah Gillian Attley Bridge ASHCROFT
Original assignee: Renovo Ltd
Current assignee: Renovo Ltd
Priority date: 1996-07-22
Filing date: 1997-07-22
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2017-07-23
Also published as: US20020042401A1; ATE279916T1; US20070185068A1; EP1506775A1; CA2632790A1; US6696433B2; US20040132701A1; EP0930876B2; WO1998003180A2; CA2261263C; JP2009051844A; JP2000515523A; EP1806131A2; DE69731302T3; DE69731302D1; AU734465B2; ES2229376T5; DK0930876T3; EP1806131A3; JP2008174566A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen, die die östrogene Wirkung fördern, zur Beschleunigung der Geschwindigkeit der Wundheilung.
Wundheilung bei Erwachsenen ist ein komplizierter Wiederherstellungsprozeß. Der Heilungsprozeß beginnt mit der Rekrutierung einer Vielfalt spezialisierter Zellen an die Stelle der Wunde und beinhaltet Ablagerung von extrazellulärer Matrix und Basalmembran, Angiogenese, selektive Proteaseaktivität und Reepithelisierung. Eine wichtige Komponente des Heilungsprozesses bei erwachsenen Säugern ist die Stimulierung von Fibroblasten, um die extrazelluläre Matrix zu erzeugen. Diese extrazelluläre Matrix macht eine Hauptkomponente des Bindegewebes aus, welches sich entwickelt, um die Wundfläche wiederherzustellen.
Das Bindegewebe, das sich während des Heilungsprozesses bildet, ist oftmals in der Beschaffenheit fibrös und nimmt gewöhnlich die Form einer Bindegewebsnarbe an (ein als Fibrose bekannter Prozeß).
Eine Narbe ist eine abnormale morphologische Struktur, resultierend aus einer vorherigen Verletzung oder Wunde (z. B. eine Inzision, eine Exzision oder ein Trauma). Narben bestehen aus einem Bindegewebe, welches vorwiegend eine Matrix aus den Kollagentypen 1 und 3 sowie Fibronectin ist. Die Narbe kann aus Kollagenfasern in einer abnormalen Organisation bestehen (wie gesehen in Narben der Haut), oder sie kann eine abnormale Ansammlung von Bindegewebe sein (wie gesehen in Narben des zentralen Nervensystems). Die meisten Narben bestehen aus abnormal organisiertem Kollagen und auch überschüssigem Kollagen. Beim Menschen können in der Haut Narben unter die Oberfläche abgesenkt oder über die Oberfläche der Haut erhöht sein. Hypertrophe Narben sind eine schlimmere Form normaler Narbenbildung, sind über die normale Oberfläche der Haut erhöht und enthalten überschüssiges Kollagen, angeordnet in einem abnormalen Muster. Ein Keloid ist eine weitere Form pathologischer Narbenbildung, welche nicht nur über die Oberfläche der Haut erhöht ist, sondern sich auch über die Grenzen der ursprünglichen Verletzung ausdehnt. In einem Keloid gibt es überschüssiges Bindegewebe, welches in einer abnormalen Weise vorwiegend in Wirbeln von Kollagengewebe organisiert ist. Es gibt genetische Prädispositionen zur Bildung von sowohl hypertrophen Narben als auch Keloiden. Sie sind besonders häufig bei afrikanisch-karibischen und mongoloiden Rassen.
Es gibt einen Bedarf, Medikamente bereitzustellen, die die Heilung von Wunden fördern. Zum Beispiel ist es in dem Fall akuter Wunden (wie beispielsweise durchbohrende Verletzungen, Brandwunden, Nervenschädigung oder sogar Wunden, resultierend aus elektiver chirurgischer Behandlung), chronischer Wunden (wie beispielsweise diabetisches, venöses und Dekubitusgeschwür) oder für allgemein in der Heilung beeinträchtigte Personen (zum Beispiel die älteren) oft wünschenswert, die Geschwindigkeit der Heilung zu vergrößern. In diesen Beispielen können die Wunden ernsthaft die Qualität des Lebens beeinflussen oder sogar zum Tod führen und daher muß die Geschwindigkeit der Heilung oft, so viel wie klinisch möglich ist, vergrößert werden. Wo die Geschwindigkeit der Wundheilung vergrößert ist, gibt es oftmals eine damit verbundene Vergrößerung der Narbenbildung, aber dies kann, verglichen mit der gewünschten Vergrößerung in der Geschwindigkeit der Heilung, von sekundärer Bedeutung sein.
Der Begriff „Wunde", wie hier verwendet, wird, ohne darauf begrenzt zu sein, beispielhaft auf Verletzungen an der Haut verwendet. Andere Typen von Wunde können mit Schädigung, Verletzung oder Trauma an einem inneren Gewebe oder Organ wie Lunge, Leber, Herz, Darm, Sehnen oder Leber verbunden sein.
Wenn auch die vorstehenden Überlegungen hauptsächlich auf Leiden, Erkrankungen oder Krankheiten des Menschen angewendet werden, wird anerkannt, daß die Wundheilung auch bei andern Lebewesen, insbesondere Hof- oder Haustieren (z. B. Pferde, Rindvieh, Hunde, Katzen usw.), problematisch sein kann.
Es hat verschiedene neue Entwicklungen auf den Gebieten der Wundheilung gegeben. Einige von diesen Entwicklungen drehen sich um die neue Einsicht, daß eine Gruppe von Cytokinen und Wachstumsfaktoren eng mit der Wiederherstellung von Geweben verbunden ist.
WO-A-92/1706 offenbart die Verwendung neutralisierender Mittel für Fibrose-fördernde Wachstumsfaktoren, die verwendet werden können, um die Narbenbildung während der Wundheilung zu hemmen. Zum Beispiel demonstriert WO-A-92/17206, daß Zusammensetzungen, welche spezifisch die Aktivität der Transforming Growth Factors (transformierende Wachstumsfaktoren) β1 und β2 und des Platelet Derived Growth Factor (aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor) hemmen, besonders vorteilhaft zur Verringerung der Narbenbildung sind.
WO-A-93/19769 offenbart die Verwendung nichtfibrotischer Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise der transformierenden Wachstumsfaktoren β3, von welchen überraschenderweise gefunden wurde, daß sie die Heilung einer Wunde fördern, ohne Fibrose auszulösen.
GB-A-2288118 offenbart die Verwendung spezifischer Antikörper, erzeugt gegen Wachstumsfaktoren, die die Heilung durch Potenzieren der Wirkungen der Wachstumsfaktoren verbessern.
Eine andere Entwicklung beinhaltet die Verwendung von Mannose-6-phosphat zur Verwendung bei der Behandlung fibrotischer Störungen, verbunden mit der Ansammlung extrazellulärer Matrix und mit erhöhten Niveaus der transformierenden Wachstumsfaktoren β1 oder β2 (GB-A-2265310). Es wird angenommen, daß Mannose-6-phosphat die Umwandlung latenter Formen dieser transformierenden Wachstumsfaktoren in ihre aktive Form beeinträchtigt.
Andere Zusammensetzungen, die die Wirksamkeit der Wachstumsfaktoren beeinflussen und die Wundheilung fördern, sind in WO-A-95/26203 offenbart.
Weiterhin offenbart Jaworski (Database Embase Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL Zugangs-Nr. 279680 Roczn. Akad. Marchhewskiego, 1973S), daß Östradiol eine Auswirkung auf die Heilung von Wunden der Harnblase beim Meerschweinchen hat.
Trotz dieser Fortschritte bleibt ein Bedarf, die Entwicklung von Medikamenten fortzusetzen, die verwendet werden können, um die Heilung von Wunden zu modulieren.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung, die die östrogene Wirkung fördert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Beschleunigung der Heilung von Hautwunden bereitgestellt.
Der Erfindung sind unsere Untersuchungen zugrunde gelegt worden, welche gezeigt haben, daß die Geschwindigkeit der Wundheilung in Form von Reepithelisierung, Ablagerung von extrazellulärer Matrix und Basalmembran mit dem Alter des Patienten abnimmt. Wir bemerkten auch, daß alte Frauen schneller heilen als alte Männer. Bei Frauen war dies mit einer vergrößerten Anzahl von Wundfibroblasten, Niveaus des transformierenden Wachstumsfaktors β1 (TGF-β1) und vergrößerter proteolytischer Aktivität, verglichen mit alten Männern, aber verringerter, verglichen mit jungen Männern und Frauen, verbunden. Es wurde ebenfalls bemerkt, daß es bei jungen Männern weniger Narbenbildung, verglichen mit der, gesehen bei jungen Frauen, gibt, was wir mit Unterschieden zwischen TGF-β1-Niveaus, beobachtet bei den beiden Geschlechtern, verbinden. Ein weiterer Unterschied zwischen den Geschlechtern war, daß die Heilung von Wunden bei Frauen im allgemeinen mit höheren Niveaus von Elastin und Angiogenese als bei Männern verbunden ist.
Diese Ergebnisse führten uns zu der Erkenntnis, daß Verbindungen gemäß der Erfindung einen Einfluß auf die Geschwindigkeit und Qualität (Ausmaß von Narbenbildung oder Fibrose) der Wundheilung haben und auch die Ablagerung von Fasergewebe bei fibrotischen Störungen beeinflussen. Diese Hypothese wurde untersucht und bestätigt, indem die Auswirkung der Hormone Replacement Therapy (Hormonersatztherapie) (HRT) auf die Geschwindigkeit und Qualität der Wundheilung bei Frauen nach der Menopause bewertet wurde. Frauen, die HRT aus Östrogen allein oder Östrogen und Progesteron nehmen, hatten bedeutend vergrößerte Geschwindigkeiten der Heilung von Hautwunden (in Form von Reepithelisierung und Ablagerung extrazellulärer Matrix), verglichen mit altersentsprechenden Frauen ohne Medikation. Die proteolytische Aktivität sowohl in normaler (unverletzter) Haut als auch in den Wunden der Frauen nach der Menopause auf HRT war gegenüber der einer Altersgruppe von 20–30 jährigen Frauen verringert. Diese Wirkungen waren auch mit der Umkehrung von mit dem Alter verbundenen Veränderungen bei dem transformierenden Wachstumsfaktor β1 oder den Interleukin-1-Profilen in normaler Haut verbunden.
Obwohl die Erfinder nicht wünschen, durch irgendeine Hypothese eingezwängt zu sein, nehmen sie an, daß es möglich ist, daß der Mechanismus, durch den die Verbindungen ihre Wundheilungswirkung ausüben, durch Modulieren der Aktivität der Moleküle geschieht, welche die Wundheilung regulieren, wie beispielsweise die Cytokine (z. B. TGF-β1, der Plättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor oder Interleukin 1), und dadurch die zelluläre Funktion (zum Beispiel die Funktion von Fibroblasten) beeinflussen. Zum Beispiel haben unsere in-vitro-Untersuchungen festgestellt, daß Östrogen die Fibroblast-TGF-β-Produktion vergrößert, was mit der Wirkung der Östrogene verbunden sein kann, eine Zunahme in der Geschwindigkeit der Wundheilung zu bewirken. Andere Verbindungen, welche das Geschlechtshormonsystem beeinflussen, modulieren die Fibroblastaktivität ebenfalls. Zum Beispiel hemmt Progesteron die Proliferation alter Fibroblasten, wohingegen Androgene ähnliche Wirkungen wie diejenigen der Östrogene haben.
Wir haben gefunden, daß Verbindungen gemäß der Erfindung auch Enzymprofile in einer Wunde oder einem Gewebe, befallen von einer fibrotischen Störung, modulieren. Insbesondere haben wir gefunden, daß die Enzymniveaus von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) (speziell MMP2 und MMP9) ebenso wie anderen lytischen Enzymen wie beispielsweise Elastasen durch Verbindungen wie beispielsweise Östrogen moduliert werden. Wir nehmen an, daß diese Modulierung ausreichend ist, um die Geschwindigkeit der Wundheilung zu beeinflussen oder Fibrose zu modulieren (und dadurch Narbenbildung oder fibrotische Störungen zu beeinflussen), und es ist möglich, daß diese Wirkungen einen komplementären, zusätzlichen oder sogar alternativen Mechanismus (zu dem im vorhergehenden Abschnitt diskutierten) darstellen, durch welchen die Verbindungen imstande sind, Wunden oder fibrotische Störungen zu behandeln.
Verschiedene Klassen von Verbindungen sind imstande, die östrogene Wirkung zu fördern. Zu derartigen Verbindungen gehören Hormone, Hormonrezeptor-Agonisten oder -Antagonisten, Mittel, welche die Freisetzung endogener Aktivatoren oder Inhibitoren von Hormonrezeptoren modulieren, Mittel, welche die Synthese eines Liganden von endogenen Hormonrezeptoren modulieren, Mittel, welche den Zerfall eines Liganden von endogenen Hormonrezeptoren modulieren, Mittel, welche die Expression oder Aktivität eines Hormonrezeptors modulieren, und Mittel, welche die Mechanismen verstärken, die an der Signalwandlung zwischen dem Rezeptor des Geschlechtshormonsystems und Effektorsystemen beteiligt sind.
Bevorzugte Verbindungen sind Hormone (oder biologisch aktive Derivate davon) sowie Agonisten und Antagonisten von Hormonrezeptoren. Es wird am meisten bevorzugt, daß die Verbindung ein Steroidgeschlechtshormon (wie beispielsweise Östrogen) oder ein Agonist oder Antagonist von Geschlechtssteroidhormonrezeptoren ist.
Wir haben festgestellt, daß Verbindungen, welche östrogene Wirkung fördern, imstande sind, die Geschwindigkeit zu beschleunigen, mit welcher eine Wunde heilt, obwohl dies auf Kosten der Schaffung verstärkter Narbenbildung oder Fibrose geschehen kann. Derartige Verbindungen sind offensichtlich besonders nützlich, wo die Geschwindigkeit der Wundheilung eine Priorität ist und die Qualität einer Narbe eine sekundäre Überlegung ist. So werden derartige Verbindungen für akute Wunden (wie beispielsweise durchbohrende Verletzungen, Brandwunden, Nervenschädigung, beschädigte Bänder oder Sehnen oder sogar Wunden, resultierend aus elektiver chirurgischer Behandlung) und chronische Wunden (wie beispielsweise diabetisches, venöses und Dekubitusgeschwür) verwendbar sein. Derartige Wunden können ernsthaft die Qualität des Lebens beeinflussen oder sogar zum Tod führen, und daher mag die Geschwindigkeit der Heilung vergrößert werden müssen, so viel wie klinisch möglich ist.
Die Verbindungen, die gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung am meisten wirksam sind, sind im allgemeinen diejenigen, die östrogene Wirkung an der Stelle der Wunde fördern. Es ist diese Förderung, die die Wundheilung beschleunigt.
Zu Beispielen von Verbindungen, welche verwendet werden können, um die östrogene Wirkung zu fördern, gehören Östrogene, Östrogenrezeptor-Agonisten (wie beispielsweise Ethinylöstradiol, Dienoöstrol, Mestranol, Östradiol, Östriol, konjugierte Östrogene, Piperazinöstronsulfat, Stilboöstrol, Fosfesteroltetranatrium, Polyestradiolphosphat, Tibolon), Inhibitoren von Östrogen- oder Östrogenrezeptor-Agonist-Zerfall, Phytoöstrogene oder sogar Modulatoren von luteinisierendem Hormon, follikelstimulierendem Hormon und Choriongonadotrophin.
Die bevorzugte Verbindung zur Verwendung gemäß der Erfindung ist ein Östrogenhormonrezeptor-Agonist. 17-β-Östradiol wird besonders bevorzugt.
Bevorzugte Behandlungsregimes, die durch die vorliegende Erfindung erwogen werden, sind nichtsystemische Behandlungen, da systemische Anwendung der Verbindungen unerwünschte Wirkungen, wie beispielsweise die Beeinflussung sekundärer Geschlechtsmerkmale, haben kann, wohingegen nichtsystemische Verabreichung (z. B. topische Anwendung auf die Haut) nur eine lokale Wirkung hat und daher keine derartigen unerwünschten Wirkungen hat. Jedoch gibt es Fälle (zum Beispiel ernste Verletzung oder wenn akute Therapie erforderlich ist), wo systemische Anwendungen nützlich sind.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können eine Anzahl verschiedener Formen annehmen, abhängig insbesondere von der Art und Weise, in welcher die Zusammensetzung verwendet werden soll. So kann zum Beispiel die Zusammensetzung in der Form einer Flüssigkeit, einer Salbe, einer Creme, eines Gels, eines Hydrogels, eines Pulvers oder eines Aerosols sein. Es wird erkannt, daß das Vehikel der Zusammensetzung der Erfindung eines sein sollte, welches von dem Patienten gut vertragen wird und Freisetzung des Wirkstoffs in die Wunde erlaubt. Ein derartiges Vehikel ist vorzugsweise biologisch abbaubar, biologisch spaltbar und/oder nichtentzündlich.
Wenn die Verbindung ein Steroid ist (wie beispielsweise ein Östrogen), kann das Vehikel ein Trägermolekül enthalten, welches die Wasserlöslichkeit der Verbindung verbessert. Ein geeigneter Träger ist 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, welches vorzugsweise in der Zusammensetzung in ungefähr äquimolaren Konzentrationen zu der des Steroids vorhanden ist.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann auf einer Anzahl von Wegen verwendet werden. So kann zum Beispiel eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung in und/oder um die Wunde eines Patienten herum aufgebracht werden, um die gewünschte Regulierung der Wundheilung bereitzustellen.
Wenn die Zusammensetzung direkt auf eine tatsächliche Wunde, ein Trauma oder eine Verletzung aufgebracht werden soll, dann ist das pharmazeutisch verträgliche Vehikel eines, welches nicht eine entzündliche Reaktion bewirkt oder für das Gewebe toxisch ist.
Es ist jedoch auch möglich, Zusammensetzungen gemäß der Erfindung als Prophylaktikum zu verwenden. Zum Beispiel kann es vor chirurgischer Behandlung (besonders elektiver chirurgischer Behandlung) wünschenswert sein, eine Verbindung bereitzustellen, welche zur Regulierung der Heilung der nachfolgend erzeugten chirurgischen Wunde das Geschlechtshormonsystem beeinflußt, um die Geschwindigkeit der Wundheilung zu vergrößern. In diesem Fall muß das Vehikel der Zusammensetzung eines sein, das imstande ist, die Verbindung an die Zielstelle zu liefern. Zum Beispiel kann das Vehikel zum Tragen der Verbindung durch die Keratinschicht der Haut geeignet sein müssen. Zu Beispielen geeigneter Vehikel für diesen Zweck gehören Dimethylsulfoxid und Essigsäure.
Die Zusammensetzung kann auf einem sterilen Verband oder Pflaster bereitgestellt werden, welche verwendet werden können, um eine zu behandelnde Wunde zu bedecken oder sogar zu verpacken. In dieser Hinsicht können herkömmliche Pflaster zur Hormonaustauschtherapie geeignet zur Behandlung von Wunden und/oder fibrotischen Störungen verwendet werden.
Eine weitere wichtige Anwendung der Zusammensetzung der Erfindung betrifft die Wundheilung im Auge. Zum Beispiel können Zusammensetzungen gemäß der Erfindung verwendet werden, um Narbenbildung zwischen der Sklera und der Retina bereitzustellen (ebenso wie um die Geschwindigkeit der Heilung zu vergrößern), wenn gewünscht wird, einen Riß in der letzteren zu reparieren. In diesem Fall kann die Zusammensetzung der Erfindung eine injizierbare Lösung sein. In diesem Fall kann die Zusammensetzung der Erfindung in der Form eines Augentropfens sein.
Es wird erkannt, daß die Menge der Verbindung, die in eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung eingebracht werden soll, und/oder die Menge der Verbindung, die auf die Wundstelle aufgebracht werden soll, von einer Anzahl von Faktoren wie beispielsweise der biologischen Wirkung und der Bioverfügbarkeit der Verbindung abhängt, welche dann wieder von der Art der Verabreichung und den physikochemischen Eigenschaften der Verbindung abhängt. Zu anderen Faktoren gehören:

A) Die Halbwertszeit der Verbindung in der Versuchsperson, die behandelt wird
B) Das spezifische Leiden, das behandelt werden soll
C) Ob schnelle Heilung oder verminderte Narbenbildung gewünscht wird
D) Das Alter der Versuchsperson
E) Das Geschlecht der Versuchsperson.

Die Häufigkeit der Verabreichung wird ebenfalls durch die vorstehend erwähnten Faktoren und besonders die Halbwertszeit der Verbindung innerhalb der Versuchsperson, die behandelt wird, beeinflußt.
Im allgemeinen sollte, wenn die Zusammensetzungen verwendet werden, um existierende Wunden zu behandeln, die Verbindung verabreicht werden, sobald wie die Wunde geschehen ist. Die Therapie mit der Zusammensetzung sollte andauern, bis die Wunde zur Zufriedenheit eines klinischen Arztes geheilt ist.
Zusammensetzungen, die die Geschwindigkeit der Wundheilung fördern, sollten auf eine Wunde so bald wie möglich, nachdem die Wunde erzeugt worden ist, aufgebracht werden. Für akute Wunden und Wunden von Versuchspersonen, die heilungskompotent sind (z. B. die Jungen), wird die Anwendung der Zusammensetzung idealerweise zu der Zeit der Verwundung, vorzugsweise innerhalb von Stunden der Verwundung und nicht länger als einige Tage nach der Verwundung, sein. Für chronische Wunden oder Wunden, die in der Heilung beeinträchtigt sind (z. B der Alten), sollte die Verabreichung so bald als möglich sein.
Wenn als Prophylaktikum verwendet (z. B. vor chirurgischer Behandlung), sollten die Zusammensetzungen verabreicht werden, so bald wie das Risiko oder eine Möglichkeit für eine schlechte Geschwindigkeit der Wundheilung erkannt worden ist (wie es bei älteren Versuchspersonen der Fall sein mag). Zum Beispiel kann eine 17-β-Östradiol enthaltende Creme oder Salbe auf eine Stelle auf der Haut des Patienten angewendet werden, wo elektive chirurgische Behandlung durchgeführt werden soll und nachfolgend eine erhöhte Geschwindigkeit der Wundheilung gewünscht wird. In diesem Fall kann die Zusammensetzung während der präoperativen Vorbereitung der Versuchsperson angewendet werden oder es kann sogar wünschenswert sein, die Zusammensetzung in den Stunden oder Tagen anzuwenden, die der chirurgischen Behandlung vorausgehen (abhängig von dem Gesundheitsstatus und dem Alter der Versuchsperson ebenso wie der Größe der zu erzeugenden Wunde).
Die Häufigkeit der Verabreichung wird von der biologischen Halbwertszeit der verwendeten Verbindung abhängen. Typischerweise sollte eine eine Verbindung enthaltende Creme oder Salbe derart an ein Zielgewebe verabreicht werden, daß die Konzentration der Verbindung an der Wundstelle oder dem von einer fibrotischen Störung befallenen Gewebe bei einem Niveau, geeignet, um eine therapeutische Wirkung zu haben, gehalten wird. Dies kann Verabreichung täglich oder sogar mehrere Male täglich erfordern. In dem Fall der Verwendung von 17-β-Östradiol für Wundheilung haben wir gefunden, daß Verabreichung der Verbindung (durch ein Pflaster, aufgebracht auf die Wunde) für 24 Stunden nach der Verwundung ausreichend ist, um die Geschwindigkeit zu verbessern, mit welcher die Wunde heilt.
Bekannte Verfahrensweisen wie beispielsweise diejenigen, die herkömmlicherweise durch die pharmazeutische Industrie (z. B. beim in-vivo-Experimentieren, bei klinischen Versuchen usw.) angewendet werden, können verwendet werden, um spezifische Formulierungen von Zusammensetzungen und genaue therapeutische Regimes (wie beispielsweise tägliche Dosen der Verbindungen und die Häufigkeit der Verabreichung) festzusetzen.
Im allgemeinen enthalten Zusammensetzungen gemäß der Erfindung 0,001 Gew.-% bis 4 Gew.-% der Verbindung, welche das Geschlechtshormonsystem beeinflußt. Nur um ein Beispiel zu geben, ist eine Zusammensetzung, enthaltend zwischen 0,005 Gew.-% und 1 Gew.-% von Östriol, Östradiol oder Ethinylöstradiol, für die Aufbringung auf eine existierende (d. h. „offene") Wunde geeignet.
Um ein weiteres Beispiel zu geben, kann eine Zusammensetzung, welche präoperativ als Prophylaktikum verwendet werden soll, zwischen 0,01 Gew.-% und 2 Gew.-% Östriol, Östradiol oder Ethinylöstradiol enthalten, um die gewünschte Wirkung auf die Wundheilung zu haben.
Eine bevorzugte Zusammensetzung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfaßt maximal 1% (z. B. zwischen 0,005% und 1%) 17-β-Östradiol.
Eine geeignete tägliche Dosis einer Verbindung hängt von den vorstehend diskutierten Faktoren ebenso wie der Größe der zu behandelnden Wunde ab. Typischerweise wird die Menge einer Verbindung, erforderlich für die Behandlung von Wunden oder fibrotischen Störungen, innerhalb des Bereiches von 1 ng bis 100 g der wirksamen Verbindung/24 Stunden sein, abhängig unter verschiedenen anderen Faktoren von der Größe der Wunde oder dem Ausmaß von Fibrose. Um ein Beispiel zu geben, sind 0,5–500 μg/24 h von 17-β-Östradiol eine geeignete Dosis zur Behandlung einer durch eine 4-mm-Stanzbiopsie der Haut erzeugten Wunde (um die Geschwindigkeit der Heilung zu vergrößern), stärker bevorzugt werden 10–100 μg/24 h von 17-β-Östradiol verwendet und am meisten bevorzugt werden 25 μg/24 h von 17-β-Östradiol verwendet.
Ein bevorzugtes Mittel der Verwendung von Protein- oder Peptidverbindungen, welche die östrogene Wirkung fördern, ist, die Verbindung mittels Gentherapie an die Wunde zu liefern. Gentherapie kann verwendet werden, um die Expression eines Enzyms, beteiligt an der Synthese von Steroidgeschlechtshormonen (z. B. Östrogenen), zu modulieren. Daher kann östrogene Wirkung durch Verwendung eines Zuführungssystems zur Verwendung in einer Gentherapietechnik gefördert werden, wobei das Zuführungssystem ein DNA-Molekül, codierend für ein Protein, umfaßt, welches direkt oder indirekt Wundheilung moduliert und/oder durch Beeinflussen des Geschlechtshormonsystems Fibrose oder Narbenbildung moduliert, wobei das DNA-Molekül imstande ist transkribiert zu werden, um zur Expression des Proteins zu führen.
Die Zuführungssysteme sind in hohem Maße geeignet, um anhaltende Niveaus eines Wirkstoffs an einer Wundstelle über einen längeren Zeitabschnitt zu erreichen, als für die meisten herkömmlichen Zuführungssysteme möglich ist. Protein kann kontinuierlich aus Zellen an der Wundstelle oder der Stelle von Fibrose exprimiert werden, die mit dem DNA-Molekül des vierten Aspekts der Erfindung transformiert worden sind. Daher können, auch wenn das Protein eine sehr kurze Halbwertszeit als Mittel in vivo hat, therapeutisch wirksame Mengen des Proteins kontinuierlich aus dem behandelten Gewebe exprimiert werden.
Weiterhin kann das Zuführungssystem der Erfindung verwendet werden, um das DNA-Molekül (und dadurch das Protein, welches ein wirksames therapeutisches Mittel ist) ohne die Notwendigkeit bereitzustellen, herkömmliche pharmazeutische Vehikel zu verwenden, wie beispielsweise diejenigen, die in Salben oder Cremes, die in Kontakt mit der Wunde gebracht werden, erforderlich sind. Dies ist besonders vorteilhaft, da es oftmals schwierig sein kann, ein befriedigendes Vehikel für eine Verbindung zur Verwendung in der Wundheilung bereitzustellen (für welches erforderlich ist, nicht entzündlich, biokompatibel, bioresorbierbar zu sein und den Wirkstoff (bei der Lagerung oder beim Gebrauch) nicht abbauen oder inaktivieren zu dürfen).
Das Zuführungssystem ist derart, daß das DNA-Molekül imstande ist, exprimiert zu werden (wenn das Zuführungssystem an einen Patienten verabreicht wird), um ein Protein zu erzeugen, welches direkt oder indirekt Aktivität für Wundheilung hat. „Direkt" bedeutet für uns, daß das Produkt der Genexpression per se die erforderliche Aktivität für Wundheilung hat. „Indirekt" bedeutet für uns, daß das Produkt der Genexpression mindestens eine weitere Reaktion eingeht oder vermittelt (z. B. als Enzym), um ein für Wundheilung wirksames Mittel bereitzustellen.
Das DNA-Molekül kann innerhalb eines geeigneten Vektors enthalten sein, um einen rekombinanten Vektor zu erzeugen. Der Vektor kann zum Beispiel ein Plasmid, Cosmid oder ein Phage sein. Derartige rekombinante Vektoren sind in den Zuführungssystemen der Erfindung in hohem Maße nützlich, um die Zellen mit dem DNA-Molekül zu transformieren.
Rekombinante Vektoren können auch andere funktionelle Elemente einschließen. Zum Beispiel können rekombinante Vektoren derart gestaltet werden, daß der Vektor autonom in dem Kern der Zelle repliziert. In diesem Fall können Elemente, welche die DNA-Replikation induzieren, in dem rekombinanten Vektor erforderlich sein. Alternativ kann der rekombinante Vektor derart gestaltet sein, daß der Vektor und das rekombinante DNA-Molekül in das Genom einer Zelle integrieren. In diesem Fall sind DNA-Sequenzen, welche gezielte Integration (z. B. durch homologe Rekombination) begünstigen, wünschenswert. Rekombinante Vektoren können auch DNA-Codierung für Gene haben, die in dem Klonierungsprozeß als selektierbare Marker verwendet werden können.
Der rekombinante Vektor kann außerdem weiterhin einen Promotor oder Regulator umfassen, um die Expression des Gens wie erforderlich zu steuern.
Das DNA-Molekül kann (aber nicht notwendigerweise) eines sein, welches in die DNA von Zellen der Versuchsperson, die behandelt wird, eingebaut wird. Undifferenzierte Zellen können stabil transformiert werden, was zu der Produktion genetisch modifizierter Tochterzellen führt (in welchem Fall Regulierung der Expression in der Versuchsperson erforderlich sein kann, z. B. mit spezifischen Transkriptionsfaktoren oder Genaktivatoren). Alternativ kann das Zuführungssystem gestaltet sein, um unstabile oder vorübergehende Transformation differenzierter Zellen in der Versuchsperson, die behandelt wird, zu begünstigen. Wenn dies der Fall ist, kann die Regulierung der Expression weniger wichtig sein, weil die Expression des DNA-Moleküls aufhört, wenn die transformierten Zellen sterben oder aufhören das Protein zu exprimieren (idealerweise, wenn die Wunde behandelt oder verhindert worden ist).
Das Zuführungssystem kann das DNA-Molekül für die Versuchsperson bereitstellen, ohne daß es in einen Vektor eingebaut ist. Zum Beispiel kann das DNA-Molekül innerhalb eines Liposoms oder Viruspartikels eingebaut sein. Alternativ kann das „nackte" DNA-Molekül durch ein geeignetes Mittel, z. B. direkte endozytotische Aufnahme, in die Zellen einer Versuchsperson insertiert werden.
Das DNA-Molekül kann in die Zellen einer Versuchsperson, die behandelt werden soll, durch Transfektion, Infektion, Mikroinjektion, Zellfusion, Protoplastfusion oder ballistische Bombardierung transferiert werden. Zum Beispiel kann der Transfer durch ballistische Transfektion mit beschichten Goldpartikeln, das DNA-Molekül enthaltende Liposome, virale Vektoren (z. B. Adenovirus) und Mittel zur Bereitstellung direkter DNA-Aufnahme (z. B. Endozytose) durch Aufbringung von Plasmid-DNA direkt auf die verwundete Fläche topisch oder durch Injektion geschehen.
Wenn auch die vorstehenden Überlegungen hauptsächlich auf Wunden des Menschen gerichtet sind, wird erkannt, daß Wundheilung bei anderen Lebewesen (insbesondere Haustiere wie beispielsweise Pferde, Hunde, Katzen usw.) ebenfalls problematisch sein kann. Die vorstehend diskutierten Verbindungen, Zusammensetzungen und Zuführungssysteme sind zur Verwendung bei der Heilung derartiger Lebewesen geeignet.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt mit Bezugnahme auf die folgenden nichtbegrenzenden Beispiele und begleitenden Zeichnungen weiter beschrieben, bei welchen:
1 photographische Aufnahmen gefärbter histologischer Schnitte von Wunden von Ratten in Beispiel 1 darstellt;
2 eine graphische Darstellung ist, die die Geschwindigkeit der Reepithelisierung am Tag 7 nach der Verwundung bei den Versuchspersonen von Beispiel 2 darstellt;
3 photographische Aufnahmen histologischer Schnitte von Wunden, gefärbt mit H&E, für Versuchspersonen von Beispiel 2 darstellt;
4 Immunfärbung für Wundproben in Beispiel 2 darstellt;
5 TGF-β1-mRNA-Niveaus am Tag 7 nach der Verwundung bei den Versuchspersonen von Beispiel 2 darstellt;
6 eine graphische Darstellung ist, die die Wirkung von Östrogen auf humane Fibroblastproliferation bei Fibroblast, erhalten von den Versuchspersonen von Beispiel 2, darstellt; und
7 eine graphische Darstellung ist, die die Wirkung von Östrogen und Progesteron auf die Narbenbildung, ausgewertet mikroskopisch in Beispiel 3, darstellt; und
8 eine graphische Darstellung ist, die die Wirkung von Östrogen und Progesteron auf die Narbenbildung, ausgewertet makroskopisch in Beispiel 3, darstellt.
BEISPIEL 1
Experimente wurden über die Auswirkung der Ovariektomie (und so die Entfernung von Östrogenen) auf die Wundheilung durchgeführt.
1.1 METHODEN
1.1.1 Vorbereitung von Ratten
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden in drei Gruppen (1A, 1B und 1C) von neun zusammen untergebracht, um synchronisierten Östrogenzyklusstand zu erlauben. Gruppe 1A wurde 18 Tage vor der Verwundung ovariektomiert (OVX), um zu erlauben, daß zirkulierende Geschlechtshormonniveaus eliminiert werden. Gruppe 1B (Kontrolle) war unbehandelt und Gruppe 1C hatte die gleiche operative Prozedur wie die OVX (Gruppe 1A), aber ohne die Entfernung der Ovarien, um sicherzustellen, daß die operative OVX-Prozedur keine Wirkung auf die Untersuchungen der Verwundung hatte (Blindversuch).
1.1.2 Behandlungen
17-β-Östradiol (Sigma) wurde als sterile 0,1%ige und 1%ige Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,1% bzw. 1% 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, zubereitet. 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin wird in den Zubereitungen als Trägermolekül verwendet, um die Wasserlöslichkeit von β-Östradiol zu vergrößern. PBS/Cyclodextrin wurde als Kontrolle des Vehikels verwendet.
Tieren aus den Gruppen 1A, 1B und 1C wurden 4 × 1 cm lange Inzisionswunden mit voller Dicke bei 4,5–5,5 cm und 7,5–8,5 cm unterhalb der Schädelbasis, 1 cm auf jeder Seite der Mittellinie, gegeben. Eine einzelne intradermale 100-μl-Injektion wurde dann an jeder von den vier Wundstellen gegeben. Jede von den Wunden (eine Gesamtmenge von 36 Wunden an 9 Ratten in jeder Gruppe) erhielt entweder 100 μl Östradiol (0,1% oder 1%), 100 μl der Vehikelkontrolle (0,1% oder 1% Cyclodextrin) oder wurde unmanipuliert gelassen (keine Injektion).
1.1.3 Tests am Tag 7 nach der Verwundung
Die Wunden wurden für 7 Tage heilen gelassen, wonach das verwundete Gewebe für histologische Analyse exzidiert wurde.
Paraffin-eingebettete 7-μm-Schnitte wurden mit H&E und Masson-Trichrome gefärbt. Die Geschwindigkeit der Reepithelisierung (am Tag 7 nach der Verwundung) und die Wundgrößen, wie durch Planimetrie bestimmt, wurden mit Bildanalyse unter Verwendung einer Kamera Olympus Vanox und eines PC-Bilderfassungssystems bestimmt. Die Kollagenmenge innerhalb der Wunde wurde durch zwei Beobachter, blind gemacht für die Identität des Probestücks, bestimmt.
1.2 ERGEBNISSE (7 Tage nach der Verwundung)
Die Wunden der unmanipulierten Blindprobengruppe (Gruppe 1C) und der Kontrollgruppe (Gruppe 1B) hatten reepithelisiert, waren zellulär und hatten neues Kollagen abgelegt. Wunden der unmanipulierten ovariektomierten Gruppe (OVX; Gruppe 1A) zeigten verzögerte Reepithelisierung, waren sehr weit und zellulär im Vergleich zu den Wunden der Blind-/Kontrollgruppe (1B und 1C) und hatten sehr wenig neues Kollagen abgelegt. Dies zeigte, daß OVX eine Verzögerung in der Geschwindigkeit der Wundheilung in 7 Tagen nach der Verwundung bewirkt (siehe Tabelle 1).
Cyclodextrin (Vehikelkontrollen) hatte in der höchsten Dosis von 1% eine nachteilige Wirkung auf die Wunden. In allen drei Gruppen waren die Wunden weit und zellulär mit wenig neuem Kollagen. Diese Auswirkungen waren mit 0,1% Cyclodextrin nicht merkbar, wo die Wunden ähnlich den Kontroll-PBS-Wunden waren, welche weniger Zellen hatten und etwas neues Kollagen abgelegt hatten.
Alle mit 1% β-Östradiol behandelten Wunden hatten reepithelisiert und neues Kollagen abgelegt. Wunden der OVX-Gruppe waren enger als die Wunden der Kontroll-/Blindgruppe, was anzeigt, daß sie eine erhöhte Geschwindigkeit der Wundheilung, verglichen mit PBS-behandelten und unmanipulierten Wunden der Kontrolle, hatten. Sie alle hatten eine Menge neues Kollagen, sehr wenige entzündliche Zellen und waren sehr eng. In den mit 0,1% β-Östradiol behandelten OVX-Wunden war eine einzige Anwendung von 0,1% β-Östradiol imstande, die nachteiligen Wirkungen von dem Cyclodextrin-Vehikel und OVX zu überwinden, wobei beschleunigte Wundheilung, verglichen mit Kontrollwunden, gezeigt wurde. Diese Ergebnisse korrelieren mit Werten menschlicher Wunden, welche eine Beschleunigung der Wundheilung zu frühen Zeitpunkten zeigen, wenn Frauen nach der Menopause Östrogen- und Progesteron-HRT nehmen.
Es gab Unterschiede zwischen den zwei Dosen von β-Östradiol, wobei die 0,1% β-Östradiol bessere Ergebnisse zeigten als die 1% β-Östradiol. Dies kann als Ergebnis der nachteiligen Wirkungen des Cyclodextrin-Vehikels geschehen, da es mit 1% in der 1%igen β-Östradiol-Lösung und mit 0,1% in der 0,1%igen β-Östradiol-Lösung vorhanden ist.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß eine optimale Dosis von β-Östradiol weniger als 1% ist (besonders wenn Cyclodextrin als Träger verwendet wird), und die Verwendung eines unterschiedlichen Vehikels, unterschiedlicher Dosen und unterschiedlicher Zeiten der Verabreichung kann zu einer noch größeren Beschleunigung der Wundheilung führen.
In 1 wurden die Schnitte mit Mallory-Trichrome gefärbt a = Wunde am Tag 7 bei einer intakten weiblichen Ratte (1B); b = Wunde am Tag 7 bei einer OVX-Ratte (1A) (man beachte verzögerte Reepithelisierung und verringerte Kollagenablagerung und eine signifikante Zunahme in der Wundbreite); c = Wunde am Tag 7 von einem intakten Weibchen, behandelt mit 5 mm Östrogen; d = Wunde am Tag 7 bei einer OVX-Ratte (man beachte verbesserte Wundheilung bei c und d mit großen Mengen von reifem Kollagen innerhalb einer engen Wunde und vollständige Reepithelisierung). Skalenstrich = 100 μm. TABELLE 1

Y: epithelisiert,
+: wenige/einige,
++++: Mengen

BEISPIEL 2
Die Auswirkung der Hormonersatztherapie (d. h. Östrogenzusatz) auf die Wundheilung bei Frauen nach der Menopause wurde untersucht, um zu demonstrieren, wie Verbindungen, die östrogene Wirkung fördern, imstande sind, die Wundheilung zu modulieren.
2.1 METHODEN
2.1.1 Patienten
Die Genehmigung für diese Untersuchung wurde durch das lokale Ethik-Komitee gegeben. Zwanzig Frauen mit definiertem Gesundheitsstatus nach der Menopause im Alter von 55 bis 65 Jahren wurden in zwei Gruppen aufgeteilt:

(i) Gruppe 2A umfaßte zehn Versuchspersonen, welche keine Medikation ausgenommen Hormone Replacement Therapy (Hormonersatztherapie) (HRT) nahmen (mittleres Alter 55,9 Jahre, SD 2,92; Östrogen-Pflaster und orale Progesteron-Kombination für mehr als 3 Monate).
(ii) Gruppe 2B umfaßte zehn Versuchspersonen, welche keine Medikation nahmen und niemals HRT genommen hatten (alte Gruppe: mittleres Alter 59,5 Jahre, SD 4,28).

Außerdem bildeten zehn junge Frauen mit definiertem Gesundheitsstatus im Alter von 20–39 Jahren (Gruppe 2C; mittleres Alter 29,8 Jahre, SD 5,03), die keine Medikation (einschließlich der oralen kontrazeptiven Pille) nahmen, eine dritte Gruppe für die Untersuchung.
Alle Versuchspersonen hatten normale Anamnesen und Untersuchungen. CXR, ECG, hämatologische, Lipid- und biochemische Profile. Die Versuchspersonen waren alle Nichtraucher, mit normalen Ernährungsgeschichten und Body-Mass-Indizes.
2.1.2 Biopsien
Nach eingeholter Zustimmung unterzogen sich Versuchspersonen aus jeder der Gruppen 2A, 2B und 2C nach lokaler Infiltration mit 1 ml 1%igem Lignocain zwei 4-mm-Stanzbiopsien aus dem inneren Oberarm (eine nicht der Sonne ausgesetzte Stelle). Jede Biopsie aus normaler Haut wurde halbiert und eine Hälfte in Optimal-Cutting-Temperature(optimale Schnitt-Temperatur)-Verbindung (Miles Inc. Elkhart, IN) eingebettet, über flüssigem Stickstoff gefroren und bei –70°C aufbewahrt und eine Hälfte in flüssigem Stickstoff schnellgefroren und bei –70°C aufbewahrt.
Die Wunden wurden 24 Stunden lang mit einem trockenen Multisorb-Mullverband (Smith & Nephew, UK) bedeckt und dann unbedeckt gelassen.
2.1.3 Rebiopsie
Fünf Versuchspersonen aus den Gruppen 2A, 2B und 2C unterzogen sich einer Reexzision der Wunden am Tag 7 nach der Verwundung und die anderen fünf Versuchspersonen am Tag 84 nach der Verwundung.
Der linke innere Oberarm wurde mit Isopropylalkohol gereinigt, nach Infiltration von 1%igem Lignocain wurden elliptische Exzisionen der Wunden gemacht, und zwei Nähte wurden verwendet, um den Spalt zu schließen. Jede Wunde wurde halbiert und wie vorstehend beschrieben (2.1.2) bearbeitet.
2.1.4 Untersuchung der Biopsien
Einige Biopsien wurden für molekulare Analyse verwendet. Mikrodissektion dieser Wunden wurde unternommen, um sicherzustellen, daß es keine Kontamination von normaler Haut gab.
2.1.4.1 Immunfärbung
7-μm-Kryoschnitte wurden hergestellt und unter Verwendung eines TGF-β1-Antikörpers (BDA19; R&D Systems, Oxfordshire) immungefärbt, um auf die Anwesenheit von TGF-β1 in der Wunde zu testen.
2.1.4.2 Bildanalyse und Narbenbewertung von Wunden
Die Geschwindigkeit der Reepithelisierung (nur am Tag 7 nach der Verwundung) wurde mit Bildanalyse unter Verwendung eines Joyce-Loebel-Mini-magiscan bestimmt. Das makroskopische Aussehen der mit Masson-Trichrome gefärbten heilenden menschlichen Wunden wurde unter Verwendung des folgenden Systems punktmäßig bewertet:

a) Farbe (verglichen mit der umgebenden Haut) 1 = Perfekt; 2 = Kleinere Ungleichheit; 3 = Offensichtliche Ungleichheit; 4 = Grobe Ungleichheit.
b) Kontur 1 = Normal; 2 = Tastbar; 3 = Hypertroph; 4 = Keloid.
c) Textur 1 = Gleich wie normale Haut; 2 = Überstehend/eingedrückt; 3 = Fest; 4 = Hart.

Das mikroskopische Aussehen der heilenden Wunden wurde unter Verwendung des folgenden Punktbewertungssystems punktmäßig bewertet:

a) Kollagenorientierung (gesonderte Bewertungen für obere-papilläre und tiefe-retikuläre dermale Niveaus der Wunde): 1 = Normales Korbgeflecht; 2 = Korbgeflecht > Parallele Fasern; 3 = Parallele > Fasern als Korbgeflecht; 4 = Parallele Fasern.
b) Faserstrangdichte (gesonderte Bewertungen für die obere-papilläre und tiefe-retikuläre Wunde): 1 = Alle Faserstränge normal; 2 = > 50% Faserstränge normal; 3 = < 50% Faserstränge normal; 4 = Alle Faserstränge abnormal (vergrößerte oder verminderte Dichte).
c) Netzrückenbildung: 1 = Normales Aussehen; 2 = Verringerte Zahlen; 3 = Keine.

2.1.5 Fibroblasten-Experimente in vitro
Fibroblasten wurden aus den Proben der ersten Biopsie der Gruppen 2A, 2B und 2C extrahiert und kultiviert, um die TGF-β-Expression aus den Zellen zu messen.
2.1.5.1 Zellkultur
Humane dermale Fibroblasten wurden aus den 4-mm-Stanzbiopsie-Prüfstücken von normaler Haut explantiert. Fibroblasten, die in der Untersuchung verwendet wurden, wurden bei 37°C in 95% Luft: 5% CO₂ bei 100% relativer Feuchtigkeit, in Phenolrot-freiem DMEM (Gibco), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, nichtessentielle Aminosäuren kultiviert und über Aktivkohle mit 10% FCS (Gibco, UK) gestrippt (um endogene Steroide zu entfernen).
2.1.5.2 Behandlung von Fibroblasten
Kultivierte Zellen mit Passage 3–5 wurden über Nacht in Platten mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in serumfreie Medien eingeimpft. Am folgenden Morgen wurden Östrogen oder Progesteron (löslich gemacht durch die Einbringung des Trägers Cyclodextrin; Sigma, Poole), mit Dosen im Bereich von 1 pM bis 1 mM, für 24 h zu dem Medium hinzugegeben. Alle Proben wurden dreifach bewertet. Das Medium wurden nach den 24 h Inkubation entfernt. 1 mg/ml von Aprotinin, Leupeptin und Pepstatin A wurde dann zu dem Medium hinzugegeben, welches sofort in einem TGF-β-Assay (siehe nachstehend) verwendet wurde. Kontrollen schlossen Cyclodextrin in der passenden Konzentration und serumfreies Medium allein ein.
2.1.5.3 Bewertung der Fibroblastproliferation
Die Zellen wurden dann mit [³H]-Thymidin in serumfreien Medium (0,5 μCi/Vertiefung) inkubiert, um die Wirkung von Östrogen oder Progesteron auf die Fibroblastproliferation zu bewerten. Nach 24 h wurde die Thymidinlösung abgesaugt und durch 10% TCA für 4 h bei 4°C ersetzt. Das TCA wurde für 18 h durch 250 μls 1 M NaOH-Lösung ersetzt. Zwei 100-μl-Aliquots aus jeder Vertiefung wurden in einem Szintillationszähler auf Radioaktivität vermessen. In parallelen Experimenten wurde die Wirkung von Hormonen/Kontrollen auf die Proteinsynthese durch die Zugabe von 20 μg/ml Cycloheximid (um die Proteintranslation zu hemmen) für 15 min vor dem 24-h-Inkubationszeitraum untersucht. Progesteron wurde als Referenzverbindung verwendet.
2.1.5.4 TGF-β-Assay
TGF-β-Niveaus in den Medien (2.1.5.2) wurden unter Verwendung eines Assays zur Hemmung des Nerzlungenwachstums bestimmt, wie von Danielpour et al. (J. Cell Physiol. 138p79–86) beschrieben ist. Kurz gesagt wurden Nerzlungenepithelzellen (MLECs) in DMEM und 10% FCS bei 37°C in 10% CO₂ gehalten. Subkonfluente Zellen wurden trypsinisiert, in 10% FCS resuspendiert, mit 500 g für 5 min pelletisiert, mit 10 ml Assay-Puffer (DMEM, 2% FCS, 10 mM HEPES pH 7,4, Penicillin 25 Einheiten/ml, Streptomycin 25 μg/ml) gewaschen, in Assay-Puffer resuspendiert und mit 10⁵ Zellen/Vertiefung in eine Costar-Platte mit 24 Vertiefungen eingeimpft. Nach 1 h wurden konditionierte Medien oder Kontrollmedien (mit variierenden Konzentrationen von Hormonen im Bereich von 1 pM–1 mM oder Cyclodextrin allein) hinzugegeben. 22 h später wurden die Zellen mit [³H]-Thymidin (0,5 μCi/Vertiefung) für 2 h bei 37°C gepulst, und es folgte die vorstehend beschriebene Verfahrensweise für die Extraktion und Messung der Radioaktivität (2.1.5.3). Eine Standardkurve wurde unter Verwendung von 10–1000 pg/ml TGF-β-Standard (R&D) erzeugt, aus welcher Inhibitionswerte in pg/ml umgewandelt werden konnten. Die Ergebnisse wurden als pg/ml TGF-β/10⁵ Zellen (relativ zu Kontrollwerten für jede individuelle Hormonkonzentration) dargestellt.
2.1.6 Quantitative RT-PCR
Quantitative RT-PCR wurde verwendet, um die Niveaus im stationären Zustand von TGF-β1-mRNA in der akuten Wunde und in 10⁵ Zellen aus den Fibroblast-in-vitro-Untersuchungen (2.1.5) zu bestimmen. Zelluläre RNA wurde unter Verwendung der Methode von Chomcynski und Sacchi (Anal. Biochem. 162 p156–159 (1987)) aus Prüfstücken isoliert. Die Reinheit der Extraktion wurde unter Verwendung des A_260/280-Verhältnisses spektrophotometrisch bewertet, welche in allen Fällen über 1,75 war. Es wurde an keinem Zeitpunkt eine signifikante Differenz im gesamten RNA-Gehalt/μg Feuchtgewicht-Gewebe zwischen den Individuen beobachtet. Quantitative RT-PCR wurde durchgeführt, wie von Tarnuzzer et al. (Biotechniques 20 p670–674 (1996)) beschrieben ist. Kurz gesagt wurde die Reverse-Transkriptase-Reaktion unter Verwendung von 8 abnehmenden Verdünnungen der Matrize mit 1 μg authentischer zellulärer RNA ausgeführt. β-Actin wurde als positive Kontrolle verwendet. PCR-Reaktionen wurden an der Reverse-Transkriptase-Reaktion ausgeführt. Elektrophorese wurde dann auf einem 25 ng/ml Ethidiumbromid enthaltenden 2%igen Agarose-Gel bei 100 V für 1 h unter Verwendung eines Electro-4-Tanks (Hybaid, Teddington, UK) ausgeführt und unter Verwendung eines Durchleuchtungsgeräts mit dualer Intensität (Genetic Research Instrumentation, Dunmow (UK)) mit einer Kamera Polaroid MP 4+ und dem Film 665 Polaroid Black and White photographiert. Photographische Bilder wurden unter Verwendung eines PC-Image-Software-Systems (Foster Finley, Newcastle, UK) auf einem Computer 486 DX2 Dan (Dan, UK) und einer CCD-Kamera (Swift, UK) erfaßt. Die Bandenintensitäten wurden durch Bildanalyse unter Verwendung von einem Macintosh-Computer und NLH-Software-Programm bestimmt. Bandenintensitätswerte wurden basierend auf den Molekulargewichten der Produkte normalisiert. Der log des Verhältnisses von Bandenintensitäten innerhalb jeder Bahn wurde gegen den log der Kopienzahl der pro Reaktion hinzugegebenen Matrize aufgetragen. Die Mengen der Zielbotschaften wurden bestimmt, wo das Verhältnis von Matrizen- und Zielbandenintensitäten gleich 1 war. Die Kopienzahlen wurden pro Gesamt-RNA (für Wundgewebe) ausgedrückt oder pro Zelle (für in-vitro-Untersuchungen) ausgedrückt. Die letzteren wurden unter der Annahme von 26 pg RNA/Zelle berechnet.
2.1.7 Statistische Analyse
Alle Werte werden als Mittelwert +/– SD dargestellt. Alle Werte folgen einer normalen Verteilung. Differenzen zwischen den Mittelwerten wurden durch den unabhängigen Student-T-Test wo geeignet und durch Ein-Faktor und multiple ANOVA (Varianzanalyse), ergänzt durch den Tukey-HSD-Test, ausgewertet. Unter allen Umständen wurde p < 0,05 als signifikant angesehen.
2.2 ERGEBNISSE
2.2.1 Die Auswirkungen von Alter und zirkulierenden Geschlechtssteroiden auf die Wiederherstellung von Wunden beim Menschen
2.2.1.1 Geschwindigkeit der Heilung: Reepithelisierung und Kollagenablagerung
Intrinsische Alterung (Gruppe 2B) war mit einer Verzögerung in der Geschwindigkeit der Wundheilung in Form von Reepithelisierung am Tag 7 nach der Verwundung (2) und verringerter Matrix-Kollagenablagerung an den Tagen 7 und 84 verbunden. Jedoch zeigte die HRT-Gruppe (2A) eine deutliche Beschleunigung der Geschwindigkeit der Reepithelisierung am Tag 7 ähnlich der in der jungen Gruppe (2C) beobachteten (2). Darüber hinaus hatte die HRT-Gruppe, verglichen mit der alten Gruppe, deutlich erhöhte Niveaus der Kollagenablagerung (welche sich den Niveaus, beobachtet in der jungen Gruppe, 2C, näherte) an den Tagen 7 und 84.
3 stellt histologische Schnitte von Wunden, gefärbt mit H&E, für a = 28 Jahre alt (Gruppe 2C), b = 57 Jahre alt (Gruppe 2B) und c = 58 Jahre alt auf HRT (Gruppe 2A) dar. Die H&E-Färbung zeigt Kollagenablagerung (CO) in den Wunden der Gruppen 2A und 2C (c und a). In b (Gruppe 2B) ist das Granulationsgewebe (G) unreif mit abwesender Färbung für Kollagen. Die Reepithelisierung ist in a (2C) und c (2A) vollständig, wobei Neo-Epidermis (E) die Wunde vollständig bedeckte (Pfeile zeigen die Basalschicht der Epidermis an). In b zeigt der Pfeil zu der wandernden Neo-Epidermis, welche nur an der Wundkante vorhanden ist. C = Koagulum. Skalenstrich = 100 μm.
2.2.1.2 Qualität der Heilung: Grad der mikroskopischen und makroskopischen Narbenbildung
Das makroskopische Aussehen von reifem Narbengewebe war bei den alten Versuchspersonen (Gruppen 2A und 2B) in Form von Farbe, Textur und Kontur, im Gegensatz zu hypertropher Narbenbildung bei den jungen Versuchspersonen (2C), signifikant überlegen (Punktbewertungen mit n = 5 für jede Gruppe: junge (2C) Mittelwert = 10 SD = 1; alte (2B) Mittelwert = 4 SD = 2; HRT (2A) Mittelwert = 10 SD = 2; p < 0,001). Die Narben der alten Gruppe (2B) waren durchweg blaß und flach, verglichen mit den pigmentierten evertierten Läsionen in der jungen Gruppe (2C). Zunehmendes Alter war ebenfalls ein signifikanter Faktor bei der Bestimmung der Qualität von mikroskopischer Wiederherstellung mit Restauration der dermalen Architektur in den Wunden der alten Gruppe (Punktbewertungen jung (2C) Mittelwert = 13 SD = 2; alt (2B) Mittelwert = 9 SD = 2; HRT (2A) Mittelwert = 13 SD = 2; p < 0,01). Bemerkenswerterweise hatten sich in den Wunden der alten Versuchspersonen Netzrücken regeneriert, große papilläre Blutgefäße wurden beobachtet und die Korbgeflechtsgewebeorganisation des Kollagens ähnelte der von normaler Dermis. In den Wunden der Jungen (2C) war die dermo-epidermale Verbindung flach, und dicht gepackte parallele Schichten von Kollagen waren überall in der Wunde vorhanden. HRT (2A) war mit ähnlichen ungünstigen Narbenbildungsprofilen, sowohl mikroskopisch als auch makroskopisch wie diejenigen von jungen Frauen, verbunden. Mikroskopisch war die dermo-epidermale Verbindung flach und die Dermis bestand aus parallelen Schichten von Narbengewebskollagen und Fibroblasten. Makroskopisch waren die Wunden ausnahmslos gehoben und pigmentiert.
2.2.1.3 TGF-β1-Immunfärbung und mRNA-Niveaus
TGF-β1-Niveaus der Wunde waren deutlich und übereinstimmend vermindert in der alten Gruppe (2B) am Tag 7 nach der Verwundung, verglichen mit sowohl der jungen Gruppe (2C) als auch der HRT-Gruppe (2A), wie in 4 veranschaulicht ist, in welcher eine Färbung für TGF-β1 für a = 22 Jahre alt (Gruppe 2C), b = 60 Jahre alt (Gruppe 2B) und c = 61 Jahre alt auf HRT (Gruppe 2A) gezeigt ist.
Die quantitativen RT-PCR-Werte zeigten an, daß intrinsische Alterung bei Frauen von Gruppe 2B mit niedrigen Niveaus von stationärer mRNA für TGF-β1 mit einem Mittelwert von 87 Kopien/pg Gesamt-RNA (SD von 6) am Tag 7 nach der Verwundung und einem Mittelwert von 116 Kopien/pg Gesamt-RNA (SD von 9) am Tag 84 verbunden war, wohingegen für die junge Gruppe (2C) die mittlere Kopienzahl/pg Gesamt-RNA 5656 (SD von 74) am Tag 7, abnehmend auf 140 Kopien/pg (SD von 9) am Tag 84 war. Für die HRT-Gruppe (2A) waren die mittleren Niveaus 6216 Kopien/pg (SD von 97) am Tag 7, abnehmend auf 140 Kopien/pg Gesamt-RNA (SD von 9) am Tag 84.
Die Unterschiede zwischen den mRNA-Niveaus am Tag 7 zwischen den verschiedenen Gruppen sind in 5 veranschaulicht. In 5 werden die mRNA von a = 22 Jahre alt (Gruppe 2C), b = 60 Jahre alt (Gruppe 2B) und c = 61 Jahre alt auf HRT (Gruppe 2A) gezeigt. Unterschiede in mRNA zwischen der alten Gruppe (2B) und der jungen (2C) oder der HRT-Gruppe (2A) waren in hohem Maße signifikant (p = 0,0006). So kehrt HRT die mit dem Alter zusammenhängende Abnahme in den lokalen stationären TGF-β1-mRNA-Niveaus, beobachtet während der frühen Wundheilung, um. Dies läßt darauf schließen, daß Verbindungen, welche das Geschlechtshormonsystem beeinflussen, das durch einen Mechanismus tun können, welcher Modulation der TGF-β-Expression beinhaltet.
2.2.1.4 Die Auswirkung von HRT auf die Makrophagenzahlen
Immunfärbung für einen Monozyt/Makrophagen-Marker ließ erkennen, daß HRT (2A) mit einer Zunahme der Makrophagenzahlen in den Wunden vom Tag 7 mit einem Mittelwert von 39 Zellen/Feldfläche (SD von 6) verbunden war. Dies war ähnlich im Grad zu den Zahlen von Makrophagen, die in den Wunden von jungen Frauen (2C) beobachtet wurden: Mittelwert von 35 Zellen/Feldfläche (SD von 4). Die Wunden der alten Gruppe (2B) hatten signifikant verringerte Zahlen von Makrophagen, verglichen mit den anderen zwei Gruppen mit einem Mittelwert von 12 Zellen/Feldfläche (SD von 4) (Ein-Faktor ANOVA F (2,14) = 14,3, p = 0,0007, Tukey-HSD-Bereich für 0,05-Niveau = 3,77). Die vergrößerte Makrophageninfiltration, die in den Wunden der HRT-Gruppe, verglichen mit der alten Gruppe, beobachtet wurde, kann bedeutende Konsequenzen für den Wundheilungsprozeß haben: zusätzlich zu ihrer Rolle in der Phagozytose erzeugen Makrophagen auch eine Vielfalt von Cytokinen, einschließlich TGF-β, was bei der Stimulierung von Zellmigration, Proliferation und Matrixerzeugung wichtig ist.
2.2.3 Auswirkungen von Östrogen auf die humane dermale Fibroblastproliferation und TGF-β1-Produktion
Um die Auswirkungen von Verbindungen, welche das Geschlechtshormonsystem beeinflussen, auf die Wundheilung weiter zu untersuchen, bestimmten wir die Auswirkungen von Östrogen und Progesteron gesondert auf Fibroblastproliferation und TGF-β-Produktion, Progesteron wurde als Referenzverbindung verwendet. Die mittlere Basislinien-Fibroblastproliferation nach 24 h (nur die Medien) war zwischen den drei Gruppen nicht signifikant verschieden.
Östrogen hemmte mit Dosen im Bereich von 1 pM bis 1 mM die Proliferation von Fibroblasten von sowohl jungen als auch alten Versuchspersonen (verglichen mit Cyclodextrinkontrollen) (6). Der Grad der Hemmung der Proliferation war für Fibroblasten von sowohl jungen als auch alten Frauen ähnlich.
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Hormonbehandlung nicht beeinflußt, wie durch den Trypanblau-Ausschlußtest bestimmt wurde. Präinkubation von Medien für 30 min mit einem neutralisierenden Antikörper zu TGF-β1 (10 μg/l; R&D-Systeme) vor der Zugabe zu den Zellen kehrte die Hormonwirkung nicht um, was anzeigt, daß die Hemmung von Proliferation unabhängig von TGF-β1 erfolgte.
Unter Verwendung des Nerzlungenzell-Assays (2.1.5.2) zeigten konditionierte Medien aus Basislinien-Kontroll-Fibroblastkulturen von jungen weiblichen Versuchspersonen (Gruppe 2C), behandelt nur mit serumfreien Medien (ohne Hormone oder Cyclodextrinträger) signifikant größere Hemmung der Proliferation von Nerzlungenepithelzellen (MLEC), verglichen mit Fibroblasten bei alten Frauen (Gruppen 2A oder 2B) (p < 0,05; Tabelle II). Präinkubation von Medien für 30 min mit einem neutralisierenden Antikörper zu TGF-β1 vor der Zugabe zu den MLECs kehrte die Hormonwirkung vollständig um, was anzeigt, daß die Hemmung der MLEC-Proliferation von TGF-β1 abhängig war.
Wenn Fibroblasten mit Östrogen oder Progesteron inkubiert wurden, induzierten konditionierte Medien Wachstumshemmung von MLECs abhängig von dem fraglichen Hormon und seiner Konzentration (relativ zu Kontrollen) (Tabelle II). Neutralisierender Antikörper zu TGF-β1 (mit 10 μg/ml; R&D) hob die Wirkungen der Hormone bei allen bewerteten Konzentrationen auf, wenn mit Proben für 30 min vor der Zugabe zu den Nerzlungenzellen präinkubiert wurde (Antikörper zu TGF-β2 und β3 hatten keine Wirkung). Antikörper bei dieser Konzentration, hinzugefügt zu Nerzlungenzellen (in Kontrollmedien), hatten keine Wirkung auf die Thymidinaufnahme, verglichen mit Kontrollmedien allein. Die Gesamt-TGF-β 1-Niveaus in den wärmeaktivierten konditionierten Medien waren nach 24 h Östrogenbehandlung bei allen getesteten Versuchspersonen vergrößert, mit einer maximalen Zunahme von TGF-β1 bei der mM-Östrogen-Dosis (verglichen mit Kontrollen), mit einer 4-fachen mittleren Zunahme in Niveaus für junge Zellen (2C) und einer 12-fachen Zunahme für Zellen von alten Versuchspersonen (2A und 2B) (Tabelle II). Progesteronbehandlung von Fibroblasten hatte keine signifikante Wirkung auf die TGF-β1-Produktion (verglichen mit Kontrollen) für junge Fibroblasten (Gruppe 2C), jedoch gab es eine signifikante 2-fache Zunahme in den Niveaus bei den nM- und μM-Dosen für die Fibroblasten von den alten Versuchspersonen (2A oder 2B). Es gab keine Zunahme an aktivem TGF-β1 nach entweder Östrogen- oder Progesteronbehandlung (d. h. nicht wärmeaktivierte Proben hatten keine Wirkung auf den Nerzlungenzell-Assay, verglichen mit der entsprechenden Kontrolle). Diese Werte lassen darauf schließen, daß Östrogen das Hauptgeschlechtssteroid ist, das an der dermalen Fibroblast-Produktion/Sekretion von TGF-β1 beteiligt ist, und daß der Mechanismus, durch welchen Verbindungen, die das Geschlechtshormonsystem beeinflussen, ihre Wirkung auf die Wundheilung ausüben, durch Modulation von TGF-β1-Niveaus geschehen kann.
TABELLE II
TGF-β1-Niveaus, sekretiert durch dermale Fibroblasten von jungen (2C) und alte Frauen (2A oder 2B), wie durch den Assay zur Hemmung des Nerzlungenzellwachstums bestimmt
Um zwischen transkriptioneller und post-transkriptioneller Steuerung von TGF-β1-Niveaus zu unterscheiden, bestimmten wir die stationären mRNA-Niveaus von Fibroblasten, behandelt mit variierenden Konzentrationen von Östrogen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den TGF-β1-mRNA-Niveaus zwischen der Kontrolle und behandelten Fibroblasten von allen Frauen (ungeachtet des Alters) gefunden (Tabelle III). Cycloheximid, hinzugegeben in Verbindung mit den Hormonen oder Medien allein, hatte keine Wirkung auf die beobachteten Gesamt-TGF-β1-Proteinniveaus, was anzeigt, daß Hemmen der Proteinsynthese keine Wirkung auf die erhöhten Niveaus von TGF-β1 in den Medien nach der Östrogenbehandlung hatte. Cycloheximid hatte keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit von Zellen bei der Dosis, die in der Untersuchung verwendet wurde. Die Werte lassen darauf schließen, daß die Zunahme in den Gesamt-Cytokin-Niveaus in den Medien sekundär zu der Östrogenbehandlung auf posttranslationale Ereignisse zurückzuführen war.
TABELLE III
Auswirkungen von Alter und Hormonbehandlung auf TGF-β1-mRNA-Niveaus dermaler Fibroblasten, wie bestimmt durch quantitative RT-PCR
BEISPIEL 3
Experimente wurden durchgeführt, um in einem klinischen Versuch unter Verwendung von Männern und Frauen die Wirkung topischer Östrogene auf die Wundheilung zu veranschaulichen.
3.1 METHODEN
3.1.1 Patienten
Die Genehmigung für diese Untersuchung wurde durch das lokale Ethik-Komitee gegeben. Vierzig Freiwillige mit definiertem Gesundheitsstatus wurden in vier Gruppen eingeteilt:

(i) Gruppe 3A umfaßte zehn Frauen mit dem mittleren Alter 76,3 Jahre (SD 5,6); die Östrogenzusätze erhielten (25 μg/24h Östradiol).
(ii) Gruppe 3B umfaßte zehn Frauen mit dem mittleren Alter 72,5 Jahre (SD 7,1); die Placebo anstatt Östrogen erhielten.
(iii) Gruppe 3C umfaßte zehn Männer mit dem mittleren Alter 69,6 Jahre (SD 3,6); die Östrogenzusätze erhielten.
(iv) Gruppe 3D umfaßte zehn Männer mit dem mittleren Alter 71,8 Jahre (SD 8,9); die Placebo anstatt Östrogen erhielten.

Alle Versuchspersonen hatten normale Anamnesen und Untersuchungen, CXR, ECG, hämatologische, Lipid- und biochemische Profile. Die Versuchspersonen waren alle Nichtraucher, mit normalen Ernährungsgeschichten und Body-Mass-Indizes.
3.1.2 Biopsien
Nach eingeholter Zustimmung unterzogen sich Versuchspersonen aus jeder der Gruppen 3A, 3B, 3C und 3D zwei 4-mm-Stanzbiopsien aus dem inneren Oberarm (eine nicht der Sonne ausgesetzte Stelle) nach lokaler Infiltration von 1 ml 1%igem Lignocain. Jede Biopsie aus normaler Haut wurde halbiert und eine Hälfte in Optimal-Cutting-Temperature(optimale Schnitt-Temperatur)-Verbindung (Miles Inc. Elkhart, IN) eingebettet, über flüssigem Stickstoff gefroren und bei –70°C aufbewahrt und eine Hälfte in flüssigem Stickstoff schnellgefroren und bei –70°C aufbewahrt.
Die Fläche für die Biopsie wurde mit einem Pflaster von 2 × 3 cm bedeckt (Placebo-Gruppen 3B und 3D oder aktives Östradiol 3A und 3C), durch welches die Biopsien gemacht wurden. Das Pflaster wurde mit einem trockenen Multisorb-Mullverband (Smith & Nephew, UK) bedeckt und beide wurden nach 24 h entfernt. Die aktiven Pflaster enthielten hinreichend Östradiol, derart, daß die Wundstellen 25 μg/24 h Östradiol ausgesetzt wurden.
3.1.3 Rebiopsie
Fünf Versuchspersonen aus den Gruppen 3A, 3B, 3C und 3D unterzogen sich einer Reexzision der Wunden am Tag 7 nach der Verwundung und die anderen fünf Versuchspersonen aus jeder Gruppe am Tag 84 nach der Verwundung.
Der linke innere Oberarm wurde mit Isopropylalkohol gereinigt, elliptische Exzisionen der Wunden wurden nach Infiltration von 1%igem Lignocain gemacht, und zwei Nähte wurden verwendet, um den Spalt zu schließen. Jede Wunde wurde halbiert und wie vorstehend beschrieben (3.1.2) bearbeitet.
3.1.4 Messungen von endogenen Hormonen
Die zirkulierenden Östrogenniveaus in den weiblichen Gruppen (3A und 3B) waren < 50 pmol/l mit Progesteron < 2 nmol/l sowohl bei anfänglicher Biopsie als auch bei Reexzision.
Für die männlichen Gruppen (3C und 3D) waren alle Progesteronniveaus < 2 nmol/l. Für Gruppe 3C: die Testosteronniveaus waren 15,9 nmol/l (SD 3,9), SHBG war 47,3 (SD 14,2) und die Östrogenniveaus waren 92 pmol/l (SD 16,6). Für Gruppe 3D: die Testosteronniveaus waren 13,0 nmol/l (SD 3,5), SHBG war 46,9 (SD 27,4) und die Östrogenniveaus waren 100 pmol/l (SD 14,7). Die Prolactinniveaus und PSA-Niveaus (3C und 3D) waren innerhalb normaler Grenzen.
3.1.5 Untersuchung von Biopsien
Einige Biopsien wurden für molekulare Analyse verwendet, und Mikrodissektion der Wunde wurde unternommen, um sicherzustellen, daß es keine Verunreinigung von normaler Haut gab.
3.1.5.1 Bildanalyse von Wunden
Paraffin-eingebettete 7-μm-Schnitte wurden mit H&E und Masson-Trichrome gefärbt. Die Geschwindigkeit der Reepithelisierung (am Tag 7 nach der Verwundung) und die Wundgrößen, wie bestimmt durch Planimetrie, wurden durch Bildanalyse unter Verwendung einer Kamera Olympus Vanox und eines PC-Bilderfassungsystems bestimmt. Die Kollagenmenge innerhalb der Wunde wurde durch zwei Beobachter, blind gemacht für die Identität des Probestücks, auf der folgenden Skala bestimmt + = minimale Mengen; ++ = weniger als normale Haut; +++ ähnlich normaler Haut; ++++ = größer als normale Haut.
3.1.5.2 Dimensionsanalyse-System
Die Wundsteifheit am Tag 80 wurde unter Verwendung des nicht-zerreißenden Dimensional Analysis System (Dimensionsanalyse-System) (Das) bestimmt. Frühere Untersuchungen haben Werte der Reißfestigkeit einer Wunde (letzter Druck beim Riß) mit Wundsteifheit unter Verwendung dieses Systems korreliert. Das System bringt eine multiaxiale Last (negativer Druck) auf die Wunde auf und mißt die Deformation aufgrund der Belastung von zwei reflektiven Zielen, plaziert an den Wundkanten, unter Verwendung einer Kamera mit hoher Auflösung und eines Videoprozessors. Druck wurde bis zu einem Maximum von 100 mm Hg angelegt und dann entspannt. Die Steifheit wurde zwischen 20 und 80 mm Hg gemessen.
3.1.5.3 Fibronectin-Zymographie
Proteasen, verantwortlich für Fibronectinabbau, wurden durch Zymographie unter Verwendung von Fibronectin enthaltenden Acrylamidgelen (12% Acrylamid und 0,33 mg/ml Fibronectin, Central Blood Products Ltd.) identifiziert. Gewebeproben wurden lyophilisiert und homogenisiert, wobei ein Mattglashomogenisierer, enthaltend 0,5 ml Puffer (100 mM Tris/HCl, 6 M Harnstoff, 15 mM CaCl₂, 0,25% Triton-X100, pH 7,4) verwendet wurde. Nach Zentrifugation mit 11000 U/min für 10 min bei 4°C wurden die Proben (20 μg Trockengewicht) für 30 min bei 37°C mit 2× Laemmli-Probenpuffer inkubiert und Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Laemmli, 1970) unterworfen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele zweimal mit 2,5% Triton-X100 für 1 h gewaschen, um SDS zu entfernen. Die Gele wurden kurz mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen und für 18 h bei 37°C in Entwicklungspuffer, enthaltend 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl und 5 mM CaCl₂, pH 7,4, inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Gele mit 0,5% Coomassie-Brilliantblau gefärbt und entfärbt. Flächen von Proteaseaktivität erschienen als klare Zonen gegen einen dunkelblauen Hintergrund. Duplikatgele wurden mit entweder der Zugabe von 10 mM Metalloprotease-Inhibitor, EDTA (BDH, Poole) oder 1,7 mM Serinprotease-Inhibitor, Aminoethylbenzolsulfonylfluorid (AEBSF; Sigma) inkubiert. Vorgefärbte Molekulargewichtsstandards mit breitem Bereich (Bio-rad) wurden als Molekulargewichtsmarker verwendet. Gesonderte Bahnen wurden mit 500 ng und 50 ng humaner neutrophiler Elastase (ICN) beladen.
3.1.5.4 SDS-PAGE und Immunoblotting
Proteinproben (20 μg Trockengewicht), extrahiert wie vorstehend beschrieben, wurden der Elektrophorese auf einem 12%-Acrylamidgel unterworfen. Parallele Fibronectin-Zymogramme wurden gleichzeitig durchgeführt. Für das Immunoblotting wurden Polypeptide auf Nitrocellulosepapier (0,45 μm Porengröße, Bio-Rad) durch Elektrophorese bei 20 V für 30 min (Bio-Rad Semi dry transfer blot apparatus (Blot-Apparatur mit halbtrockener Überführung)) in Transferpuffer (25 mM Tris/HCl, 192 mM Glycin, 10% Methanol, pH 8,3) überführt. Um nichtspezifische Bindung zu blockieren, wurden Immunoblots in 4% fettarmer Milch von Marvel in TBST (10 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Tween-20 pH 7,5) für 18 Stunden bei 4°C inkubiert. Die überführten Proteine wurden mit polyklonalem antihumanen neutrophilen Elastase-Antikörper (Calibiochem Co.), verdünnt 1 : 500 in TBST für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit Schütteln inkubiert und nachfolgend mit Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Sigma) mit 1 : 3000 Verdünnung in TBST mit 4% fettarmer Milch für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Antikörperbindung wurde unter Verwendung des ECL-Kits entsprechend den Instruktionen des Herstellers (Amersham Int.) sichtbar gemacht.
3.1.5.5 Elastasebestimmung
Gewebeproben (20 μg Trockengewicht) und humane neutrophile Elastase (0,01–0,3 μg/ml) wurden für bis zu 1 h bei 37°C in 200 μl 0,1 M Hepes-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,5 M NaCl, 10% Dimethylsulfoxid und 0,1 mM Elastasesubstrat (Methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-p-nitroanilid; Calbiochem Co.) inkubiert. Der Substratabbau wurde durch Messen der OD₄₁₀ (Dynatech MR50000) bestimmt. Eine Standardkurve für den Abbau wurde aus den Elastase-Werten hergestellt. Die Ergebnisse wurden als ng/ml Elastase-Aktivität/20 μg Trockengewicht ausgedrückt.
3.1.6 Statistische Analyse
Alle Werte sind normalisiert und unter Verwendung eines unabhängigen Student-t-Tests bewertet. P < 0,05 wird als signifikant angesehen.
3.2 ERGEBNISSE
3.2.1 Die Wirkung von Östrogen auf die Geschwindigkeit der Wundheilung
Östrogenbehandlung beschleunigte die Geschwindigkeit der Reepithelisierung bei sowohl weiblichen (3A) als auch männlichen Versuchspersonen (3C) relativ zu Placebo-Kontrollen (3B bzw. 3D) (siehe Tabelle IV). Die Ergebnisse waren wegen einer Diskrepanz zwischen den Geschlechtern in der Placebo-Gruppe (Männer reepithelisierten schneller als Frauen) nur in der weiblichen Gruppe signifikant (p > 0,005). Die Wundfläche am Tag 7 nach der Verwundung hatte sich mit Östrogenbehandlung in den beiden männlichen Gruppen 3C und 3D signifikant verringert (p < 0,05). Die Kollagenniveaus waren übereinstimmend sowohl am Tag 7 als auch am Tag 80 nach der Verwundung bei beiden mit Östrogen behandelten Geschlechtern (3A und 3C) verglichen mit Placebo (3B und 3D) vergrößert. Die Wundsteifheit wurde durch Östrogenbehandlung am Tag 80 nach der Verwundung nicht beeinflußt.
3.2.2 Die Wirkung von Östrogen auf die Elastase-Aktivität der Wunde
Gewebeextrakte aus akuten Wunden vom Tag 7 bauten alle Fibronectin ab, das eine Hauptbande bei ungefähr 30 kd zeigt, aber übereinstimmend weniger Abbau erfolgte in den Östrogen-behandelten Gruppen (3A und 3C). Die 30-kd-Fibronectin-spezifische Proteaseaktivität in allen Proben wurde durch Inkubation mit dem Serinprotease-Inhibitor, AEBSF, mit breitem Bereich, aber nicht mit dem Metalloprotease-Inhibitor, EDTA, aufgehoben, was darauf schließen läßt, daß die hauptsächliche Fibronectinabbau-Aktivität auf eine Serinprotease zurückzuführen war, welche mit handelsüblicher neutrophiler Elastase mitwanderte. Immunoblotting bestätigte, daß die 30-kd-Protease-Aktivität, die auf Fibronectin-Zymogrammen gesehen wird, Elastase war. Elastase-Aktivität war nur in Placebo-behandelten Gruppen (3B und 3D) vorhanden. Elastase-Aktivität wurde quantifiziert, indem ein Assay zum Abbau von synthetischem Elastase-Substrat verwendet wurde, welches zeigte, daß Östrogenbehandlung Elastase-Aktivität in Tag-7-Wunden verglichen mit Placebo (< 50 ng Elastase pro 20 μg Trockengewicht von Gewebe für die Placebogruppen übereinstimmend mit den Western-Blot-Werten) signifikant verringerte (Tabelle IV).
TABELLE IV Topisches Östrogen beschleunigt die Wundheilung bei älteren Männern und Frauen.
3.2.3 Die Auswirkung von Östrogen auf die Narbenbildung
Die 7 und 8 veranschaulichen die Auswirkung von Östrogen (e) auf die Narbenbildung (mikroskopisch bzw. makroskopisch), wie sie in 2.1.4.2 bestimmt wurde. Die Östrogenbehandlung war mit einer schlechteren Qualität der Wunde verbunden (welche mit den TGF-β-Niveaus korreliert werden kann).

Claims

Verwendung einer Verbindung, die die östrogene Wirkung fördert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Beschleunigung der Heilung von Hautwunden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ein Östrogen oder ein Östrogenrezeptor-Agonist, ausgewählt aus Ethinylöstradiol, Dienöstrol, Mestranol, Östradiol, Östriol, konjugierten Östrogenen, Piperazinöstronsulfat, Stilböstrol, Fosfesteroltetranatrium, Polyestradialphosphat, Tibolon oder einem Phytoestrogen, ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung 17-β-Östradiol ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine von: einem Inhibitor des Östrogenzerfalls, einem Inhibitor des Östrogenrezeptor-Agonist-Zerfalls; einem Modulator der Wirkung des luteinisierenden Hormons, des follikelstimulierenden Hormons oder des Choriongonadotrophins ist.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Wunde eine akute Wunde ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Wunde eine durchbohrende Verletzung, eine Brandwunde ist oder aus elektiver chirurgischer Behandlung resultiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei die Wunde eine chronische Wunde ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Wunde ein diabetisches, venöses oder Dekubitusgeschwür ist.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Verbindung ein Vorprodukt eines Östrogen-Geschlechtssteroidhormons ist.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch für nichtsystemische Anwendung.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch für die Herstellung eines Medikaments in der Form einer Flüssigkeit, einer Salbe, einer Creme, eines Gels, eines Hydrogels, eines Pulvers, eines Aerosols oder eines Implantats oder von Augentropfen.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Medikament 0,001 Gew.-% bis 4 Gew.-% der Verbindung enthält.