DE69702720T2

DE69702720T2 - Peniophora phytase

Info

Publication number: DE69702720T2
Application number: DE69702720T
Authority: DE
Inventors: Lisbeth Bech; Jens Breinholt; Crone Fuglsang; Flensted Lassen; Anders Ohmann; Rahbek Stergaard
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2001-04-05
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: CN1195846C; DE69702720D1; PT948606E; ES2150795T3; JP3504672B2; WO1998028408A1; CA2265471A1; ATE195140T1; EP0948606B1; CN1240477A; EP0948606A1; AU5309698A; CN1234070A; JP2000512856A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, welches Phytase- Aktivität aufweist, die entsprechenden klonierten DNA-Sequenzen, ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids und dessen Verwendung für eine Reihe industrieller Anwendungen, insbesondere in Tierfutter.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Phytinsäure oder myo-Inosit-1,2,3,4,5,6-hexakisdihydrogenphosphat (oder kurz myo-Inosithexakisphosphat) ist die primäre Quelle für Inosit und die primäre Speicherform von Phosphat in Pflanzensamen. In der Tat wird sie natürlicherweise bei der Reifung von Samen und Getreidekörnern gebildet. In den Samen von Hülsenfrüchten macht sie etwa 70% des Phosphatgehalts aus und ist mit den Proteinkörpern als Phytin, ein gemischtes Kalium-, Magnesium- und Calciumsalz von Inosit, strukturell integriert. Samen, Getreidekörner und Hülsenfrüchte sind wichtige Komponenten von Nahrungsmittel- und Futterpräparaten, insbesondere von Tierfutterpräparaten. Cerealien und Hülsenfrüchte gewinnen jedoch auch in menschlicher Nahrung zunehmend an Bedeutung.
Die Phosphatgruppierungen von Phytinsäure chelieren zweiwertige und dreiwertige Kationen wie Metallionen, unter anderem die für die Ernährung wichtigen Ionen von Calcium, Eisen, Zink und Magnesium sowie die Spurenmineralien Mangan, Kupfer und Molybdän.
Außerdem hinaus bindet die Phytinsäure auch bis zu einem gewissen Grad Proteine durch elektrostatische Wechselwirkung. Bei einem pH-Wert unterhalb des isoelektrischen Punkts, pI, des Proteins bindet das positiv geladene Protein direkt an Phytat. Bei einem pH-Wert oberhalb des pI bindet das negativ geladene Protein über Metallionen an Phytat.
Phytinsäure und deren Salze, Phytate, werden oft nicht metabolisiert, da sie von dem Magen-Darm-System nicht absorbierbar sind, d. h., weder deren Phosphor noch die chelierten Metallionen noch die gebundenen Proteine stehen für die Ernährung zur Verfügung.
Nachdem Phosphor ein essentielles Element für das Wachstum aller Organismen ist, müssen dementsprechend Nahrungsmittel- und Futterpräparate mit anorganischem Phosphat ergänzt werden. Ziemlich oft müssen auch die für die Ernährung essentiellen Ionen wie Eisen und Calcium ergänzt werden. Im übrigen nimmt der Nährwert einer gegebenen Nahrung aufgrund der Bindung von Proteinen durch Phytinsäure ab. Dementsprechend wird Phytinsäure oft als ein Anti- Ernährungsfaktor bezeichnet.
Nachdem Phytinsäure nicht metabolisiert wird, passiert darüber hinaus der Phytat- Phosphor den Magen-Darm-Trakt solcher Lebewesen und wird mit dem Kot ausgeschieden, was eine unerwünschte Phosphatverschmutzung der Umwelt bewirkt, die beispielsweise zur Eutrophierung von Wasser in der Umwelt und zu extensivem Algenwuchs führt.
Phytinsäure oder Phytate, welche Begriffe, soweit nicht anders angegeben, im vorliegenden Kontext synonym oder beliebig verwendet werden, sind durch Phytasen abbaubar.
In den meisten derjenigen Pflanzensamen, welche Phytinsäure enthalten, werden auch endogene Phytase-Enzyme gefunden. Diese Enzyme werden bei der Keimung des Samens gebildet und dienen zur Freisetzung von Phosphat und, als Endprodukt, von freiem myo-Inosit zur Verwertung während des Pflanzenwachstums.
Als Nahrung aufgenommen, werden die Nahrungsmittel- oder Futterkomponenten-Phytate in der Theorie durch die endogenen Pflanzen-Phytasen des betreffenden Samens, durch Phytasen, die aus der mikrobiellen Flora im Darm stammen, und durch Phytasen der Darmschleimhaut hydrolysierbar. In der Praxis ist jedoch das Hydrolysevermögen der endogenen Pflanzen-Phytasen und der Darmschleim haut-Phytasen, falls vorhanden, weit davon entfernt, ausreichend zu sein, um die Bioverfligbarkeit der gebundenen oder Grundbestandteile darstellenden Komponenten der Phytate signifkant zu erhöhen. Wenn der Prozeß der Vorbereitung des Nahrungsmittels oder des Futters jedoch eine Keimung, Fermentierung oder ein Einweichen beinhaltet, könnte die endogene Phytase in einem größeren Ausmaß zum Abbau von Phytat beitragen.
Bei Wiederkäuern oder Lebewesen mit mehreren Mägen, wie z. B. Pferde und Rinder, beherbergt das Magen-Darm-System Mikroorganismen, die zum Abbau von Phytinsäure imstande sind. Dies ist jedoch bei Lebewesen mit einem Magen, wie z. B. Menschen, Geflügel und Schweine, nicht der Fall. Deshalb sind die oben dargelegten Probleme hauptsächlich für solche Lebewesen mit einem Magen von Bedeutung.
Die Produktion von Phytasen durch sowohl Pflanzen als auch Mikroorganismen wurde berichtet. Von den Mikroorganismen sind sowohl Phytase-produzierende Bakterien als auch Phytase-produzierende Pilze bekannt.
Beispielsweise ist aus dem Pflanzenreich eine Weizenkleie-Phytase bekannt (Thomlinson et al., Biochemistry, 1 (1962), 166-171). Eine alkalische Phytase aus Lilienpollen wurden von Barrientos et al., Plant. Physiol., 106 (1994), 1489-1495, beschrieben.
Bei den Bakterien wurden Phytasen beschrieben, die von Bacillus subtilis (Paver und Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151: 1102-1108) und Pseudomonas (Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23: 1207-1220) stammen. Darüber hinaus wurde eine Phytase aus E coli von Greiner et al. (Arch. Biochem. Biophys., 303, 107-113, 1993) gereinigt und charakterisiert. Dieses Enzym ist jedoch wahrscheinlich eine saure Phosphatase.
Phytase-produzierende Hefen werden ebenfalls beschrieben, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae (Nayini et al., 1984, Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie 17: 24-26). Dieses Enzym ist jedoch wahrscheinlich eine myo-Inosit- Monophosphatase (Wodzinski et al., Adv. Appl. Microbiol., 42, 263-303). AU-A- 24840195 beschreibt die Klonierung und Expression einer Phytase der Hefe Schwanniomyces occidentalis.
Es gibt mehrere Beschreibungen von Phytase-produzierenden filamentösen Pilzen, die jedoch lediglich dem Pilzstamm der Ascomycoten (Ascomycetes) angehören. Insbesondere gibt es mehrere Verweise auf Phytase-produzierende Ascomyceten der Gattung Aspergillus, wie z. B. Aspergillus terreus (Yamada et al., 1986, Agric. Biol. Chem. 322: 1275-1282). Die Klonierung und Expression des Phytase- Gens aus Aspergillus niger Var. awamori wurde ebenfalls beschrieben (Piddington et al., 1993, Gene 133: 55-62). EP 0 420 358 beschreibt die Klonierung und Expression einer Phytase aus Aspergillus ficuum (niger). EP 0 684 313 beschreibt die Klonierung und Expression von Phytasen der Ascomyceten Myceliophthora thermophila und Aspergillus terreus.

NOMENKLATUR UND POSITIONSSPEZIFITÄT VON PHYTASEN

Im vorliegenden Kontext ist eine Phytase ein Enzym, welches die Hydrolyse von Phytat (myo-Inosithexakisphosphat) zu (1) myo-Inosit und/oder (2) Mono-, Di-, Tri-, Tetra- und/oder Pentaphosphaten davon und (3) anorganischem Phosphat katalysiert. Im folgenden werden die obigen Verbindungen manchmal kurz als IP6, I, IP1, IP2, IP3, IP4, IP5 bzw. P bezeichnet. Dies bedeutet, daß durch die Wirkung einer Phytase IP6 zu P + einer oder mehrerer der Komponenten IP5, IP4, IP3, IP2, IP1 und I abgebaut wird. Alternativ wird myo-Inosit, das insgesamt n Phosphat-gruppen trägt, die mit den Positionen p, q, r ... verknüpft sind, als Ins(p,q,r, ...)Pn bezeichnet. Aus Gründen der Bequemlichkeit wird Ins(1,2,3,4,5,6)P&sub6; (Phytinsäure) als PA abgekürzt.
Gemäß der Enzym-Nomenklatur-Datenbank ExPASy (eine Sammelstelle für Information bezüglich der Nomenklatur von Enzymen, die primär auf den Empfehlungen des Nomenclature Comittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) basiert, die jeden Typ eines charakterisierten Enzyms beschreiben, für das eine EC (Enzyme Commission)-Nummer vergeben wurde) sind zwei verschiedene Typen von Phytasen bekannt: eine sogenannte 3- Phytase (myo-Inosithexaphosphat-3-phosphohydrolase, EC 3.1.3.8) und eine sogenannte 6-Phytase (myo-Inosithexaphosphat-6-phosphohydrolase, EC 3.1.3.26). Die 3-Phytase hydrolysiert zuerst die Esterbindung an der 3-Position, wohingegen die 6-Phytase zuerst die Esterbindung an der 6-Position hydrolysiert.

Inositphosphat-Nomenklatur

Bei Betrachtung der primären Hydrolyseprodukte einer Phytase, die auf Phytinsäure einwirkt, sind einige der resultierenden Ester Diastereomere und einige Enantiomere. Im allgemeinen ist es leichter, zwischen Diastereomeren zu unterscheiden, da sie unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufweisen, wohingegen es wesentlich schwieriger ist, zwischen Enantiomeren zu unterscheiden, die Spiegelbilder voneinander darstellen.
So sind Ins(1,2,4,5,6)P&sub5; (3-Phosphat entfernt) und Ins(1,2,3,4,5)P&sub5; (6-Phosphat entfernt) Diastereomere und leicht zu unterscheiden, wohingegen Ins(1,2,4,5,6)P&sub5; (3-Phosphat entfernt) und Ins(2,3,4,5,6)P&sub5; (1-Phosphat entfernt) Enantiomere sind. Dasselbe trifft für das Paar Ins(1,2,3,4,5)P&sub5; (6-Phosphat entfernt) und Ins(1,2,3,5,6)P&sub5; (4-Phosphat entfernt) zu. Dementsprechend kann man von den 6 Pentaphosphat-Estern, die aus dem ersten Schritt der Phytase-katalysierten Hydrolyse von Phytinsäure resultieren, nur leicht zwischen denjenigen Estern unterscheiden, bei denen das 2-, 3-, 5- und 6-Phosphat entfernt wurde, d. h., man hat nur vier Diastereomere, wobei jeder der verbleibenden zwei Ester ein Enantiomer jeweils einer dieser Verbindungen ist (4- und 6- sind Enantiomere, ebenso 1- und 3-).

Anwendung der Regel der niedrigsten Stellungsziffer

Es sollte hier angemerkt werden, daß bei der Verwendung der Notationen Ins(2,3,4,5,6)P&sub5; und Ins(1,2,3,5,6)P&sub5; eine Erleichterung der früheren Empfehlungen hinsichtlich der Atome von myo-Inosit zur Anwendung kam. Diese Erleichterung der Regel der niedrigsten Stellungsziffer wird vom Nomenclature Comittee of the International Union of Biochemistry (Biochem. J. (1989) 258, 1-2) empfohlen, wann immer Autoren strukturelle Beziehungen hervorvorheben wollen.
Bei dieser Regel der niedrigsten Stellungsziffer wird die L- und D-Nomenklatur empfohlen: Inositphosphat, Phosphatester von myo-Inosit, wird/werden gewöhnlich als 1D- (oder 1L-)-Ins(r,s,t,u,w,x)Pn bezeichnet, wobei n die Anzahl der Phosphatgruppen angibt und die Stellungsziffern r, s, t, u, w und x deren Positionen. Die Positionen sind gemäß dem oben zitierten Nomenclature Comittee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB) (und den Referenzen hierin) numeriert und 1D oder 1L wird so verwendet, daß sich ein Substituent mit der niedrigsten möglichen Stellungsziffer oder Zahl ("Regel der niedrigsten Stellungsziffer") ergibt.

Phytase-Spezifität

Wie oben festgestellt, werden Phytasen nach ihrer Spezifität im ersten Hydrolyseschritt unterteilt, nämlich danach, welche Phosphatestergruppe zuerst hydrolysiert wird.
In Hinblick auf die Spezifität bekannter Phytasen wird von Pflanzen-Phytasen im allgemeinen als 6-Phytasen gesprochen. Jedoch soll die Phytase aus Lilienpollen eine 5-Phytase sein. Die von Mikroorganismen stammenden Phytasen sollen hauptsächlich 3-Phytasen sein. Beispielsweise bezieht sich die oben erwähnte ExPASy-Datenbank bezüglich 3-Phytasen auf vier Phytasen aus Aspergillus awamori (Stamm ALK 0243) und Aspergillus niger (Stamm NRLL 3135) (Gene 133: 55-62 (1993) und Gene 127: 87-94 (1993)).
Bei nunmehriger Verwendung der D-/L-Notation (wobei sich die D- und L- Konfiguration auf die 1-Position bezieht) hydrolysiert die Weizenkleie-Phytase zuerst die Phosphatestergruppe in der L-6-Position (= D-4), wohingegen die 3- Phytasen zuerst die Phosphatestergruppe in der Position D-3 (= L-1) hydrolysieren.
Die Spezifität kann auf mehreren Wegen, beispielsweise mittels HPLC oder mittels NMR-Spektroskopie, überprüft werden. Diese Verfahren erlauben jedoch nicht unmittelbar die Unterscheidung zwischen einer Hydrolyse von beispielsweise den Phosphatestergruppen in den Positionen D-6 und L-6, da die Produkte der Hydrolyse, D-Ins(1,2,3,4,5)P&sub5; und L-Ins(1,2,3,4,5)P&sub5; Enantiomere (Spiegelbilder) sind und deshalb identische NMR-Spektren aufweisen.
Mit anderen Worten, im vorliegenden Kontext bedeutet eine 6-Phytase entweder eine L-6- oder eine D-6-Phytase oder beides, d. h., eine Phytase ist eine L-6- Phytase, eine D-6-Phytase oder eine ((D-6-)+(L-6-))-Phytase (die beide Aktivitäten aufweist). Die letztere wird auch manchmal als D/L-6-Phytase bezeichnet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung alternativer Phytasen, insbesondere mit überlegenen Eigenschaften, wie z. B. erhöhte Wärmestabilität oder schnellere Freisetzung von Phosphat aus Phytat, welche in kommerziell geeigneten Mengen hergestellt werden können.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, daß ein Enzym, welches Phytase-Aktivität aufweist, aus einem Pilzstamm der Ordnung Stereales, insbesondere der Familie Peniophoraceae, insbesondere aus der Gattung Peniophora, konkreter dem Stamm Peniophora lycii, erhalten werden kann, und waren erfolgreich bei der Klonierung einer DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert. Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind im Sequenzverzeichnis als SEQ-ID-NR. 1 bzw. 2 aufgeführt.
Wie im folgenden experimentellen Abschnitt weiter ausgeführt, stellte sich überraschenderweise heraus, daß diese neue Phytase eine schnellere anfängliche Freisetzung von Phosphor aus Phytinsäure, insbesondere im Vergleich mit einer bekannten Phytase (Aspergillus niger-Phytase, Phytase Novo®), aufweist. Dies zeigte sich in einem anwendungsbezogenen Mais-Assay bei pH 3,5 und pH 5,5 ebenso wie bei NMR-Studien.
Darüber hinaus stellte sich heraus, daß die Phytase der Erfindung ein auf interessante Weise abweichendes Abbauprofil aufweist. Bei pH 3,5 gehört sie zu einer neuen Klasse von Phytasen, die eine hohe Anfangsaffinität für sowohl die 6- als auch die 3-Position von Phytinsäure aufweisen, mit anderen Worten, sie ist weder eine 3-Phytase noch eine 6-Phytase, sondern weniger positionsspezifisch als bis her für irgendeine bekannte Phytase berichtet. Bei pH 5,5 sollte sie jedoch als eine 6-Phytase klassifiziert werden.
Die spezifische Aktivität der Peniophora lycii-Phytase befindet sich auch auf einem sehr hohen Niveau, nämlich mehr als 200, vorzugsweise mehr als 400, insbesondere mehr als 600, vor allem mehr als 800, am meisten bevorzugt etwa 1000 FYT/mg, siehe diesbezüglich Beispiel 4a. Dies ist recht unerwartet, zumindest für Pilz-Phytasen (die bekannte Aspergillus-Phytase weist eine spezifische Aktivität von nur etwa 180 FYT/mg auf).
Die Ordnung der Sterealen gehört zur Pilzklasse der Hymenomyceten und dem Pilzstamm der Basidiomycoten. Bekannte Phytase-produzierende Pilze gehören zum Stamm der Ascomycoten.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Polypeptid mit Phytase-Aktivität, das die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 oder die Sequenz der Aminosäure-Nrn. 31 bis 439 davon aufweist oder eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70% homolog zu einer dieser Sequenzen ist.
In weiteren Aspekten stellt die Erfindung klonierte DNA-Sequenzen, die für die obigen Polypeptide kodieren, sowie Vektoren und Wirtszellen, umfassend diese klonierten DNA-Sequenzen, bereit.
In einem noch weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Phytase zur Freisetzung von anorganischem Phosphat aus Phytinsäure sowie einige speziellere Anwendungen und Zusammensetzungen, insbesondere Nahrungsmittel- und Futterpräparate und Zusätze, welche die Phytase der Erfindung umfassen.
Im allgemeinen sollen hier verwendete Bezeichnungen und Ausdrücke wie im Stand der Technik üblich interpretiert werden. In Zweifelsfällen könnten jedoch die Definitionen der vorliegenden Beschreibung von Nutzen sein.

ALLGEMEINE DEFINITIONEN

Mit dem Begriff "ein isoliertes Polypeptid/Enzym, das Phytase-Aktivität besitzt/aufweist" oder "eine isolierte Phytase" ist ein beliebiges Peptid oder Protein mit Phytase-Aktivität (siehe unten) gemeint, welches im wesentlichen frei von anderen Nicht-Phytase-Polypeptiden ist, z. B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, bevorzugter etwa 60% rein, noch bevorzugter etwa 80% rein, besonders bevorzugt etwa 90% rein und sogar am meisten bevorzugt etwa 95% rein, wie mittels SDS-PAGE bestimmt. Manchmal wird ein solches Polypeptid alternativ als "gereinigte" Phytase bezeichnet.
Die Definition eines "isolierten Polypeptids" umfaßt auch fusionierte Polypeptide oder spaltbare Fusionspolypeptide, bei denen ein weiteres Polypeptid mit dem N- Terminus oder dem C-Terminus des Polypeptids oder Fragments davon fusioniert ist. Ein fusioniertes Polypeptid wird erzeugt durch Fusionierung einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils davon), die für ein weiteres Polypeptid kodiert, mit einer Nukleinsäuresequenz (oder einem Teil davon) der vorliegenden Erfindung.
Techniken zur Herstellung von Fusionspolypeptiden sind im Stand der Technik bekannt und umfassen die Ligierung der kodierenden Sequenzen, welche für die Polypeptide kodieren, so daß sie sich im Leserahmen befinden und die Expression des fusionierten Polypeptids unter der Kontrolle des/derselben Promotors/en und desselben Terminators steht.
Der Begriff "Polypeptid oder Enzym, das Phytase-Aktivität aufweist" oder "Phytase" soll jedes Enzym umfassen, welches in der Lage ist, die Freisetzung von anorganischem Phosphat oder Phosphor aus verschiedenen myo- Inositphosphaten zu bewirken. Beispiele solcher myo-Inositphosphate (Phytase- Substrate) sind Phytinsäure und ein beliebiges Salz davon, z. B. Natriumphytat oder Kaliumphytat oder gemischte Salze. Ein beliebiges Stereoisomer der Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder Pentaphosphate von myo-Inosit könnte ebenfalls als Phytase- Substrat dienen.
Gemäß der obigen Definition kann die Phytase-Aktivität mit Hilfe eines beliebigen Assays, in dem eines dieser Substrate verwendet wird, bestimmt werden. Im vorliegenden Kontext wird (soweit nicht anders angegeben) die Phytase-Aktivität in der FYT-Einheit bestimmt, wobei 1 FYT diejenige Menge an Enzym ist, welche 1 uMol anorganisches Orthophosphat pro Minute unter den folgenden Bedingungen freisetzt: pH 5,5; Temperatur 37ºC; Substrat: Natriumphytat (C&sub6;H&sub6;O&sub2;&sub4;P&sub6;Na&sub1;&sub2;) in einer Konzentration von 0,0050 Mol/l. Geeignete Phytase- Assays werden im experimentellen Teil beschrieben.
"Polypeptid-Homologie" oder "Aminosäure-Homologie" wird als Grad der Identität zwischen zwei Sequenzen bestimmt. Die Homologie kann geeigneterweise mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Computerprogrammen bestimmt werden, wie z. B. GAP, das in dem GCG Version 8 Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B., und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453) zur Verfügung steht. Anwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den Polypeptidsequenzvergleich: GAP-Erstellungslimit von 5,0 und GAP-Extensionslimit von 0,3.
Im vorliegenden Kontext bedeutet eine "6-Phytase" eine Phytase, welche zuerst die 6-Position in Phytinsäure hydrolysiert oder eine Präferenz für diese Positionen aufweist (der Plural wird verwendet, weil dieser Begriff zwei Positionen umfaßt). Insbesondere ist mehr als 50% des Hydrolyseprodukts des ersten Schritts Ins(1,2,3,4,5)P&sub5; und/oder Ins(1,2,3,5,6)P&sub5;. Vorzugsweise umfassen diese beiden Verbindungen mindestens 60%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 80%, besonders mindestens 90% und am meisten bevorzugt mehr als 95%, des Produkts des ersten Hydrolyseschritts von PA.
Die anderen Spezifitätsbegriffe, wie z. B. "3-Phytase", "(3+6)-Phytase", "6D- Phytase" und "6L-Phytase" sind entsprechend zu interpretieren, einschließlich derselben bevorzugten Ausführungsformen.
Die Begriffe "ein für Phytase kodierender Teil einer DNA-Sequenz, kloniert in ein Plasmid, das in einem hinterlegten E. coli-Stamm vorliegt" und "ein für Phytase kodierender Teil der entsprechenden DNA-Sequenz, die in dem Sequenz verzeichnis aufgeführt ist" werden derzeit als identisch betrachtet und können dementsprechend austauschbar verwendet werden.
In erster Linie bedeutet der Begriff "für Phytase kodierender Teil", der in Verbindung mit einer DNA-Sequenz verwendet wird, denjenigen Bereich der DNA- Sequenz, welcher in eine Polypeptidsequenz mit Phytase-Aktivität translatiert wird. Oft ist dies der Bereich zwischen einem ersten "ATG"-Startcodon ("AUG"- Codon in mRNA) und einem Stopcodon ("TAA", "TAG" oder "TGA"), das als erstes folgt.
Das wie oben beschrieben translatierte Polypeptid umfaßt jedoch oft zusätzlich zu einer reifen Sequenz, die Phytase-Aktivität aufweist, eine N-terminale Signalsequenz und/oder eine Propeptidsequenz. Im allgemeinen steuert die Signalsequenz die Sekretion des Polypeptids und das Propeptid steuert die Faltung des Polypeptids. Hinsichtlich weiterer Informationen siehe Egnell, P., et al., Molecular Microbiol. 6(9): 1115-19 (1992) oder Stryer, L., "Biochemistry" W. H., Freeman and Company/New York, ISBN 0-7167-1920-7. Deshalb soll der Begriff "für Phytase kodierender Teil" auch diejenige DNA-Sequenz umfassen, welche dem reifen Teil des translatierten Polypeptids entspricht oder jedem solcher reifen Teile, falls mehrere davon existieren.
Ferner soll jedes Fragment einer solchen Sequenz, welches für ein Polypeptid- Fragment kodiert, das immer noch etwas Phytase-Aktivität behält, in dieser Definition eingeschlossen sein.
Eine klonierte DNA-Sequenz oder alternativ "ein DNA-Konstrukt", "ein DNA- Segment" oder "eine isolierte DNA-Sequenz" bezieht sich auf eine DNA- Sequenz, die nach in der Gentechnik eingesetzten Standardklonierungsverfahren kloniert werden kann, um das DNA-Segment von seiner natürlichen Position an eine andere Stelle zu bringen, wo es repliziert werden wird. Der Begriff bezieht sich gewöhnlich auf eine Nukleinsäuresequenz, welche im wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuresequenzen ist, z. B. zu mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, bevorzugter etwa 60% rein, noch bevorzugter etwa 80% rein, besonders bevorzugt etwa 90% rein und sogar am meisten bevor zugt etwa 95% rein, wie mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt. Die Klonierungsverfahren können das Ausschneiden und die Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragments, welches die für das Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz umfaßt, die Insertion des Fragments in ein Vektormolekül und die Inkorporation des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, wo mehrfache Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden, umfassen. Die Nukleinsäuresequenz kann genomische DNA, cDNA, RNA, halbsynthetischen, synthetischen Ursprungs oder irgendwelche Kombinationen davon sein.
Der Grad der Identität oder "Homologie" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen kann mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Computerprogrammen bestimmt werden, wie z. B. GAP, das in dem GCG-Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B., und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453) zur Verfügung steht. Anwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA- Sequenzvergleich: GAP-Erstellungslimit von 5,0 und GAP-Extensionslimit von 0,3.
Geeignete Versuchsbedingungen zur Feststellung, ob eine gegebene DNA- oder RNA-Sequenz mit einer spezifizierten Nukleotid- oder Oligonukleotid-Sonde "hybridisiert", beinhalten das Vortränken des Filters, welcher die DNA- Fragmente oder RNA enthält, um die Hybridisierung in 5 · SSC (Natriumchlorid/-Natriumcitrat) (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York) 10 Minuten lang zu überprüfen, und die Vorhybridisierung des Filters in einer Lösung von 5 · SSC, 5 · Denhardts Lösung (Sambrook et al., 1989), 0,5% SDS und 100 ug/ml denaturierter beschallter Lachssperma-DNA (Sambrook et aL, 1989), gefolgt von Hybridisierung in der gleichen Lösung, die eine Konzentration von 10 ng/ml einer statistisch geprimten (Feinberg, A. P., und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13), ³²P-dCTP-markierten (spezifische Aktivität > 1 · 10&sup9; CpM/ug) Sonde enthält, für 12 h bei etwa 45ºC.
Der Filter wird dann zweimal 30 Minuten lang in 2 · SSC, 0,5% SDS, bei mindestens 55ºC (niedrige Stringenz), bei mindestens 60ºC (mittlere Stringenz), bei mindestens 65ºC (mittlere/hohe Stringenz), bei mindestens 70ºC (hohe Stringenz) oder bei mindestens 75ºC (sehr hohe Stringenz) gewaschen.
Moleküle, mit denen die Oligonukleotid-Sonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden mit Hilfe eines Röntgenfilms nachgewiesen.
Es wurde festgestellt, daß es möglich ist, theoretisch vorauszusagen, ob zwei gegebene DNA-Sequenzen unter bestimmten spezifizierten Bedingungen hybridisieren werden oder nicht.
Dementsprechend kann als Alternative zu dem oben beschriebenen experimentellen Verfahren die Feststellung, ob eine analoge DNA-Sequenz mit der oben beschriebenen Nukleotid-Sonde hybridisieren wird oder nicht, auf einer theoretischen Berechnung der Tm (Schmelztemperatur) basieren, bei der zwei heterologe DNA-Sequenzen mit bekannten Sequenzen unter spezifizierten Bedingungen (z. B. hinsichtlich der Kationenkonzentration und Temperatur) hybridisieren werden.
Zur Bestimmung der Schmelztemperatur für heterologe DNA-Sequenzen (Tm(Hetero)) ist es erforderlich, zuerst die Schmelztemperatur (Tm(Homo)) für homologe DNA-Sequenzen zu bestimmen.
Die Schmelztemperatur (Tm(Homo)) von zwei vollständig komplementären DNA-Strängen (Homoduplexbildung) kann mit Hilfe der folgenden Formel
Tm(Homo) = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% Form) - 500/L
("Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995) bestimmt werden, worin
"M" die molare Kationenkonzentration in Waschpuffer angibt,
"%GC" % Guanin (G) und Cytosin (C) der Gesamtzahl an Basen in der DNA- Sequenz,
"% Form" % Formamid in dem Waschpuffer und
"L" die Länge der DNA-Sequenz angibt.
Die mit der obigen Formel bestimmte Tm ist die Tm einer Homoduplexbildung (Tm(Homo)) zwischen zwei vollständig komplementären DNA-Sequenzen. Um den Tm-Wert an denjenigen von zwei heterologen DNA-Sequenzen anzupassen, wird angenommen, daß ein Unterschied von 1% in der Nukleotidsequenz zwischen den beiden heterologen Sequenzen einer Herabsetzung der Tm um 1ºC gleichkommt ("Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995). Deshalb wird die Tm(Hetero) für die Heteroduplexbildung gefunden, indem der prozentuale Homologieunterschied zwischen der fraglichen analogen Sequenz und der oben beschriebenen Nukleotid-Sonde von der Tm(Homo) subtrahiert wird. Der zu subtrahierende DNA-Homologie-Prozentsatz wird wie hier beschrieben berechnet (siehe oben).
Der Begriff "Vektor" soll solche Begriffe/Objekte wie "Nukleinsäure- Konstrukte", "DNA-Konstrukte", "Expressionsvektoren" oder "rekombinante Vektoren" umfassen.
Das Nukleinsäure-Konstrukt umfaßt eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer oder mehreren Kontrollsequenz(en), die zur Steuerung der Expression der kodierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind, in der Lage ist/sind.
"Nukleinsäure-Konstrukt" ist hier definiert als ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, welches aus einem natürlich vorkommenden Gen isoliert ist oder welches modifiziert wurde, um Nukleinsäuresegmente zu enthalten, welche kombiniert und in einer Weise nebeneinandergestellt sind, wie sie sonst in der Natur nicht vorkommen würde.
Der Begriff "Nukleinsäure-Konstrukt" kann mit dem Begriff "Expressionskassette" synonym sein, wenn das Nukleinsäure-Konstrukt alle Kontrollsequenzen enthält, welche zur Expression einer kodierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung erforderlich sind.
Der Begriff "kodierende Sequenz", wie hier definiert, umfaßt in erster Linie eine Sequenz, welche in mRNA transkribiert und in ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle der oben genannten Kontrollsequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden im allgemeinen bestimmt durch ein Translations-Startcodon ATG am 5'-Terminus und ein Translations-Stopcodon am 3'-Terminus. Eine kodierende Sequenz kann einschließen, ist jedoch nicht beschränkt auf, DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen.
Der Begriff "Kontrollsequenzen" ist hier so definiert, daß alle Komponenten eingeschlossen sind, welche zur Expression der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz erforderlich oder vorteilhaft sind. Jede Kontrollsequenz kann der für das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz nativ oder fremd sein. Solche Kontrollsequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine Leader- Sequenz, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promoter, eine Signalsequenz und einen Transkriptionsterminator. Als Minimum umfassen die Kontrollsequenzen einen Promoter und transkriptionale und translationale Stopsignale. Die Kontrollsequenzen können mit Linkem versehen sein, um spezifische Restriktionsstellen einzuführen, welche die Ligierung der Kontrollsequenzen mit dem kodierenden Bereich der Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, zu erleichtern.
In dem Expiessionsvektor sollte die DNA-Sequenz, welche für die Phytase kodiert, funktionsfähig mit einer geeigneten Promoter- und Terminatorsequenz verknüpft sein. Der Promoter kann jede DNA-Sequenz sein, welche transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Genen stammen, die für Proteine kodieren, welche für die Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind. Die zur Ligierung der für die Phytase, den Promoter und den Terminator kodierenden DNA-Sequenzen und zu deren Einführung in geeignete Vektoren eingesetzten Verfahren sind Fachleuten wohlbekannt (vgl. z. B. Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).
Der rekombinante Expressionsvektor kann jeder Vektor sein (z. B. ein Plasmid oder Virus), der günstig rekombinanten DNA-Verfahren unterworfen werden kann und die Expression der Nukleinsäuresequenz veranlassen kann.
Es kann mehr als eine Kopie einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, in die Wirtszelle inseriert werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren. Eine stabile Amplifizierung der Nukleinsäuresequenz kann erzielt werden durch Integration von mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz in das Wirtszellgenom unter Einsatz von Verfahren, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, und Selektion hinsichtlich Transformanten.
Die zur Ligierung der oben beschriebenen Elemente eingesetzten Verfahren, um die rekombinanten Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung zu konstruieren, sind einem Fachmann wohlbekannt (siehe z. B. Sambrook et at, 1989, supra).
Eine "Wirtszelle" oder "rekombinante Wirtszelle" umfaßt jeden Abkömmling einer Stammzelle, welcher aufgrund von Mutationen, die während der Replikation eintreten, mit der Stammzelle nicht identisch ist.
Die Zelle wird vorzugsweise mit einem Vektor transformiert, der eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung umfaßt, gefolgt von Integration des Vektors in das Wirtschromosom.
"Transformation" bedeutet die Einführung eines Vektors, der eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung umfaßt, in eine Wirtszelle, so daß der Vektor in das Chromosom integriert oder als selbstreplizierender extrachromosomaler Vektor aufrechterhalten wird. Integration wird im allgemeinen als Vorteil betrachtet, da die Nukleinsäuresequenz mit größerer Wahrscheinlichkeit stabil in der Zelle aufrechterhalten wird. Die Integration des Vektors in das Wirtschromosom kann durch homologe oder nicht-homologe Rekombination wie oben beschrieben erfolgen.
Die Wirtszelle kann ein einzelliger Mikroorganismus, z. B. ein Prokaryote, oder ein nicht-einzelliger Mikroorganismus, z. B. ein Eukaryote, sein. Beispiele einer eukaryotischen Zelle sind eine Säugerzelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Pilzzelle. Geeignete Säugerzellen schließen Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), HeLa-Zellen, Babyhamsternieren (BHK)-Zellen, COS- Zellen oder eine beliebige Anzahl anderer unsterblicher Zeillinien ein, die beispielsweise von der American Type Culture Collection erhältlich sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pilzzelle. "Pilze" wie hier verwendet, schließt die Stämme Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota (wie definiert von Hawksworth et al., in, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8. Auflage, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) sowie die Oomycota (wie in Hawksworth et al., 1995, supra, Seite 171, zitiert) und alle mitosporischen Pilze (Hawksworth et al., 1995, supra) ein. Es wird auch auf Jülich, 1981, Higher Taxa of Basidiomycetes, und Hansen & Knudsen (Hrsg.), Nordic Macromycetes, Bd. 2 (1992) und 3 (1997) verwiesen.
Pilzzellen können durch einen Prozeß transformiert werden, welcher Protoplastenbildung, Transformation der Protoplasten und Regeneration der Zellwand in an sich bekannter Weise beinhaltet.
Bevorzugte Wirtszellen sind ein Stamm von Fusarium, Trichoderma oder Aspergillus, insbesondere ein Stamm von Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Fusarium cerealis, Fusarium sp. mit den kennzeichnenden Merkmalen von Fusarium ATCC 20334, wie näher in PCT/US/95/07743 beschrieben, Trichoderma harzianum oder Trichoderma reesei, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

In der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung wird auf die Zeichnungen verwiesen, in denen
Fig. 1 eine pH-Aktivitätskurve der Peniophora-Phytase darstellt (5 mM Phytat, 30 Min. bei 37ºC)
Fig. 2 eine pH-Stabilitätskurve davon (Vorinkubation 1 h 40ºC) darstellt,
Fig. 3 eine Temperatur-Aktivitätskurve davon (0,1 M Natriumacetat, 5 mM Phytat, pH 5,5, 30 Min.) darstellt,
Fig. 4 eine Temperatur-Stabilitätskurve davon (Vorinkubätion 60 Min. in 0,1 M Na-Acetat, pH 5,5) darstellt,
Fig. 5 eine Differentialscanningkalorimetrie (DSK)-Kurve davon (0,1 M Na-Acetat, pH 5,5; Td = 59,6ºC) darstellt,
Fig. 6-7 NMR-Spektren, übereinandergelegte Diagramme (bis zu 24 h), die das Produktprofil einer Aspergillus niger-Phytase bzw. der Peniophora- Phytase zeigen, darstellen,
Fig. 8-9 NMR-Spektren wie oben, jedoch übereinandergelegte Diagramme bis zu 4,5 h, darstellen,
Fig. 10a-c NMR-Profile, die nach 20 Minuten (bei pH 5,5), 24 Stunden (bei pH 5,5) bzw. nach 20 Minuten (bei pH 3,5) beobachtet wurden, darstellen,
Fig. 11 Kurven, welche die Konzentration von Ins(1,2)P&sub2; bzw. Ins(2)P gegen die Zeit zeigen, darstellen und
Fig. 12-13 Kurven, welche die Freisetzung von anorganischem Phosphat aus Mais gegen die Zeit bei pH 5,5 bzw. pH 3,5 zeigen, darstellen.

HINTERLEGUNGEN

Der isolierte Stamm von Peniophora lycii, aus dem die Phytase der Erfindung erhalten wurde, wurde gemäß dem Budapester Vertrag hinsichtlich der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke eines Patenterteilungsverfahrens bei dem Centraalbureau voor Schimmelcultures, P. O. Box 273, 3740 Baarn, Niederlande, (CBS), wie folgt hinterlegt:
Hinterlegungsdatum: 4. Dezember 1996
Ref. des Hinterlegers: NN 006113
CBS-Nr.: Peniophora lycii CBS Nr. 686.96
Darüber hinaus wurde das Expressionsplasmid (Shuttle-Vektor) pYES 2.0, umfassend die vollständigen cDNA-Sequenzen, welche für diese Phrase der Erfindung kodieren, in einen Stamm von Escherichia coli transformiert, welcher gemäß dem Budapester Vertrag hinsichtlich der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke eines Patenterteilungsverfahrens bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, (DSM), wie folgt hinterlegt wurde:
Hinterlegungsdatum: 2. Dezember 1996
Ref. des Hinterlegers: NN 049282
DSM-Nr.: Escherichia coli DSM Nr. 11312

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Homologie bekannter Phytasen zu der Phytase mit der Aminosäuresequenz SEQ-ID-NR. 2 und der DNA-Sequenz der SEQ-ID-NR. 1 ist wie folgt:
Homologie (auf Aminosäure- bzw. DNA-Ebene) zu den Phrasen von:
"-" zeigt an, daß keine echte Übereinstimmung zwischen den Phytasen von P. lycii und E. coli vorliegt.
Dementsprechend ist die Peniophora-Phytase von den bekannten Phytasen ziemlich verschieden, wobei die am engsten verwandte Phytase die Phytase aus Myceliophthora thermophila (EP 0684313) ist.
Wie detaillierter im folgenden experimentellen Teil beschrieben, besitzt die Peniophora-Phytase bei Expression in Aspergillus eine N-terminale Aminosäuresequenz von Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn (Aminosäuren Nr. 31-37 in SEQ-ID-NR. 2). Dementsprechend wird gegenwärtig angenommen, daß die Sequenz der Aminosäuren Nr. 31-439 von SEQ-ID-NR. 2 die Sequenz einer reifen Phytase ist.
Alle Aminosäurehomologien der vorliegenden Anmeldung betragen mindestens 70%. Vorzugsweise beträgt der Grad der Homologie mindestens 80%, bevorzugter mindestens 90%, noch bevorzugter mindestens 95%, insbesondere mindestens 97%.
Das Phytase-Polypeptid ist aus Peniophora lycii CBS 686.96 erhältlich und weist eines oder mehrere der folgenden Merkmale auf
(i) ein pH-Optimum von 3-6
(ii) ein Temperaturoptimum von 30-65ºC
(iii) Stabilität für mindestens 1 h bei pH 3-9 und 40ºC
(iv) mehr als 75% Restaktivität nach einstündiger Vorinkubation bei Temperaturen von 0-50ºC
(v) ein Molekulargewicht der deglycosylierten Form von 43-53 kD
(vi) mindestens 20% Restaktivität nach 60 Minuten Vorinkubation bei 70ºC
(vii) eine Entfaltungstemperatur, wie mittels DSK bestimmt, von 50-65ºC.
Einige alternative oder bevorzugtere Bereiche sind nachfolgend aufgelistet:
(i) ein pH-Optimum von vorzugsweise 3,5-5,5, noch bevorzugter 3,7-5,2, am meisten bevorzugt 3,8-5,0
(ii) ein Temperaturoptimum von vorzugsweise 35-62ºC, bevorzugter um etwa 37-58ºC, möglicherweise um 50ºC
(iii) vorzugsweise eine Stabilität von mindestens 1 h bei 40ºC bei pH 3-6, bevorzugter bei pH 3-5
(iv) vorzugsweise mindestens 80% Restaktivität nach einstündiger Inkubation bei Temperaturen von 0-50ºC bei pH 5,5, bevorzugter mindestens 90% Restaktivität nach einstündiger Inkubation bei Temperaturen von 0-50ºC bei pH 5,5;
(v) das Molekulargewicht der deglycosylierten Form des Polypeptids gemäß SEQ-ID-NR. 2 wird als 48 kD berechnet. Ein Polypeptid kann enzymatisch oder chemisch deglycosyliert und das Molekulargewicht beispielsweise mittels Massenspektroskopie oder auf einem SDS-PAGE-Gel bestimmt werden. Die chemische Deglycosylierung ist beschrieben in "Carbohydrate analysis - a practical approach" von M. F. Chaplin & J. F. Kennedy (Hrsg.), IRL Press, Oxford, 1986, siehe insbesondere Kapitel V. Für die enzymatische Deglycosylierung wird dem vom Enzymhersteller angegebenen Verfahren gefolgt. Alternativ wird ein scheinbares Molekulargewicht Mr von etwa 67 kD bezüglich der Wanderung von Molekulargewichtsmarkern in SDS-PAGE bestimmt. Dieser Wert von etwa 67 kD wird erhalten, wenn das Enzym in Aspergillus exprimiert wird (siehe die folgenden Beispiele).
(vi) vorzugsweise mindestens 30%, bevorzugter mindestens 40%, am meisten bevorzugt mindestens 50% Restaktivität nach 60 Minuten Vorinkubation bei 70ºC, pH 5,5; oder vorzugsweise mindestens 30%, bevorzugter mindestens 40%, am meisten bevorzugt mindestens 50% Restaktivität nach einstündiger Vorinkubation bei Temperaturen von 60-80ºC bei pH 5,5
(vii) vorzugsweise eine Entfaltungstemperatur, wie mittels DSK bestimmt, von 55-62ºC, bevorzugter von 58-62ºC, noch bevorzugter von etwa 60ºC.
Alternativ sind die folgenden Merkmale für das Polypeptid charakteristisch: ein pH-Optimum im Bereich 3-7, gemessen bei 37ºC; bevorzugter ein pH-Optimum im Bereich von 4-6, gemessen bei 37ºC; und noch bevorzugter ein pH-Optimum im Bereich von 4,5-5, 5, gemessen bei 37ºC; und/oder mindestens 65% restliche Phytase-Aktivität nach 20 Minuten Inkubation bei 70ºC, bezogen auf die Aktivität bei 26ºC gemessen; noch bevorzugter mindestens 75% restliche Phytase- Aktivität nach 20 Minuten Inkubation bei 70ºC, bezogen auf die Aktivität bei 26º C gemessen; und noch bevorzugter mindestens 80% restliche Phytase-Aktivität nach 20 Minuten Inkubation bei 70ºC, bezogen auf die Aktivität bei 26ºC gemessen.
Derzeit wird davon ausgegangen, daß Polypeptide der Erfindung auch erhältlich sind aus einem beliebigen Stamm der Klasse Hymenomycetes, vorzugsweise der Ordnung Stereales, noch bevorzugter aus Stämmen der Gattung Peniophora, und noch bevorzugter aus einem beliebigen Stamm von Peniophora lycii.
Vorzugsweise ist das Polypeptid der Erfindung nach Denaturierung zu erneuter Auffaltung imstande, um mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, bevorzugter mindestens 30%, noch bevorzugter mindestens 40% und am meisten bevorzugt mindestens 50%, seiner Phytase-Aktivität zurückzugewinnen.
Eine Vorgehensweise zum Screenen hinsichtlich solcher Pilz-Polypeptide ist wie folgt: Der fragliche Mikroorganismus wird auf Phytat-Replikationsplatten (siehe Beispiel 1 "Identifizierung positiver Kolonien") ausplattiert und beispielsweise bei 30 oder 37ºC inkubiert. Phytase-positive Kolonien werden isoliert, in Schüttelkolben kultiviert und der Überstand entnommen. Die Phytase-Aktivität des Überstands wird vor und nach einer thermischen Behandlung von beispielsweise 20 Minuten bei 70ºC nach dem Verfahren von Beispiel 1 ("Test von A. oryzae- Transformanten") einem Assay unterworfen. Diejenigen Proben, welche nach Inkubation von beispielsweise 20 Minuten bei 70ºC immer noch Phytase-positiv sind, sind entweder thermostabil oder zu erneuter Auffaltung in der Lage, um einen erheblichen Teil ihrer Phytase-Aktivität zurückzugewinnen. Die wirklich thermostabilen können nach den Verfahren von Beispiel 5 oder 6 ausgeschlossen werden, d. h., Nachweis der Restaktivität nach Inkubation bei einer Reihe von Temperaturen im relevanten Bereich, um festzustellen, ob die Restaktivität abfällt und sich mit steigender Temperatur wieder erhöht.
Dieses Verfahren ist analog auf andere Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien, anwendbar, indem Basismedien und Temperaturen, die den Bedürfnissen der fraglichen Organismen entsprechen, eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein isoliertes Polypeptid, das Phytase-Aktivität zeigt, welches beim Einsatz das PA-Substrat (das vollständig phosphorylierte) sehr schnell zum Verschwinden bringt, insbesondere innerhalb von 5 h, vorzugsweise innerhalb von 4 h, bevorzugter innerhalb von 3 h, insbesondere innerhalb von 2 h, besonders innerhalb von 1 h und ganz besonders innerhalb einer halben Stunde (es wird auf Beispiel 5 hierin verwiesen);
ein isoliertes Polypeptid, das Phytase-Aktivität aufweist und anorganisches Phosphat schneller aus Phytinsäure freisetzt, insbesondere bei pH 3,5 (es wird auf Beispiel 6 hierin verwiesen); und
die Verwendung irgendeines dieser vier Typen von Phytasen, insbesondere beim Backen, bei der Teigherstellung, der Herstellung von Inosit oder Derivaten davon, in Nahrungsmitteln oder Futter, insbesondere in Tierfutter oder Tierfutterzusätzen.
Anspruch 2 betrifft Nukleotidsequenzen der Phytasen der Erfindung, insbesondere DNA-Sequenzen.
Für eine Definition von "Hybridisierung" sei auf den Abschnitt mit der Überschrift "Allgemeine Definition" verwiesen, welcher auch einige bevorzugte Hybridisierungsbedingungen auflistet.
Der Grad der Identität oder Homologie zwischen zwei Nukleotidsequenzen kann wie im Abschnitt der allgemeinen Definitionen beschrieben festgestellt werden. Bezüglich des Homologieteils in Merkmal (d) von Anspruch 2 beträgt der Homologiegrad mindestens 70%, vorzugsweise mindestens etwa 80%, bevorzugter mindestens etwa 90%, noch bevorzugter mindestens etwa 95% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 97%. Insbesondere basiert der Homologiegrad auf einem Vergleich mit den gesamten aufgeführten Sequenzen oder deren komple mentärem Strang oder beliebigen der Untersequenzen davon, die einer "reifen" Phytase entsprechen.
Die Hybridisierungsbedingungen sind mittlere/hohe Stringenz.
Die DNA-Sequenz der Erfindung kann auch nach irgendeinem allgemeinen Verfahren kloniert werden, welches beinhaltet
- Klonierung, in geeignete Vektoren, einer cDNA-Bank aus einem beliebigen Organismus, von dem die Produktion der Phytase von Interesse erwartet wird,
- Transformation geeigneter Hefe-Wirtszellen mit den Vektoren,
- Kultivierung der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um irgendein interessantes Enzym, welches von einem Klon in der cDNA-Bank kodiert wird, zu exprimieren,
- Screening hinsichtlich positiver Klone durch Bestimmung etwaiger Phytase-Aktivität des von solchen Klonen produzierten Enzyms, und
- Isolierung der für das Enzym kodierenden DNA aus solchen Klonen.
Ein allgemeines Isolierungsverfahren wurde in WO 93/11249 und WO 94/14953 offenbart. Eine detaillierte Beschreibung der Screening-Verfahren wird im experimentellen Teil gegeben.
Die Erfindung betrifft auch allgemein die Verwendung des Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1-3 zur Freisetzung (oder Katalysierung der Freisetzung von) anorganischem Phosphat aus Phytat oder Phytinsäure. Eine alternative Formulierung könnte sein: zur Überführung von Phytat in anorganisches Phosphat und (myo-Inosit und/oder Mono-, Di-, Tri-, Tetra-, Pentaphosphatester davon). Vom Umfang dieses Anspruchs umfaßt wird jedes Verfahren, worin die Phytase der Erfindung ihre Phytase-Aktivität wie zuvor definiert ausübt.
Konkretere erfindungsgemäße Verwendungen liegen in Präparaten von menschlichen Nahrungsmitteln oder Tierfutter oder in Additiven für solche Präparate, worin die Phytase unter anderem dient zur
(i) Verringerung des Phytat-Niveaus von Kot,
(ii) Verbesserung der Verdaulichkeit, Förderung des Wachstums, oder Verbesserung der Nahrungsmittel- und Futterverwertung oder deren Umwandlungseffizienz u. a. dadurch, daß Proteine, welche sonst durch Phytat gebunden worden wären, zur Verfügung gestellt werden,
(iii) Verhinderung von Fehlernährung oder Erkrankungen wie Anämie, die durch einen Mangel an essentiellen Ionen und Phosphat verursacht werden, d. h., Verbesserung der Bioverfügbarkeit von Mineralien oder Erhöhung ihrer Absorption, Beseitigung des Bedürfnisses für den Zusatz ergänzenden Phosphats und ergänzender Ionen etc.
Insbesondere können die Phytasen der Erfindung auch in Hühnerfutter eingesetzt werden, um die Eierschalenqualität zu verbessern (Verringerung von Verlusten aufgrund von Bruch), vgl. z. B. The Merck Veterinary Manual (7. Auflage, Merck & Co., Inc., Rahway, N. J., USA, 1991; S. 1268); Jeroch et al., Bodenkultur, Bd. 45, Nr. 4, S. 361-368 (1994); Poultry Science, Bd. 75, Nr. 1, S. 62-68 (1996); Canadian Journal of Animal Science, Bd. 75, Nr. 3, S. 439-444 (1995); Poultry Science, Bd. 74, Nr. 5, S. 784-787 (1995) und Poultry Science, Bd. 73, Nr. 10, S. 1590-1596 (1994).
Ein "Futter" bzw. ein "Nahrungsmittel" bedeutet jede natürliche oder synthetische Diät, Nahrung oder dgl. oder alle Komponenten solcher Nahrung, die geeignet oder dafür bestimmt sind, von einem Tier bzw. einem Menschen gegessen, aufgenommen, verdaut zu werden.
Die Phytase kann ihre Wirkung in vitro oder in vivo ausüben, d. h., vor der Aufnahme bzw. im Magen des Individuums. Es ist auch eine kombinierte Wirkung möglich.
Eine Phytase-Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfaßt immer mindestens eine Phytase der Erfindung.
Im allgemeinen sind Phytase-Zusammensetzungen flüssig oder trocken.
Flüssige Zusammensetzungen brauchen nicht mehr als das Phytase-Enzym, vorzugsweise in hochgereinigter Form, zu enthalten. Gewöhnlich ist jedoch ein Stabilisator wie Glycerin, Sorbit oder Monopropylenglycol ebenfalls zugesetzt. Die flüssige Zusammensetzung kann auch andere Additive umfassen, wie z. B. Salze, Zucker, Konservierungsmittel, pH-Einstellungsmittel, Proteine, Phytat (ein Phytat-Substrat). Typische flüssige Zusammensetzungen sind wäßrige oder auf Öl basierende Aufschlämmungen. Die flüssigen Zusammensetzungen können einem Nahrungsmittel oder Futter nach einer fakultativen Pelletierung zugegeben werden.
Trockene Zusammensetzungen können sprühgetrocknete Zusammensetzungen sein, in welchem Fall die Zusammensetzung nicht mehr als das Enzym in trockener Form zu enthalten braucht. Gewöhnlich sind trockene Zusammensetzungen jedoch sogenannte Granulate, welche unschwer mit z. B. Nahrungsmittel- oder Futterkomponenten gemischt werden können oder, bevorzugter, eine Komponente einer Vormischung bilden. Die Teilchengröße der Enzym-Granulate ist vorzugsweise mit derjenigen der anderen Komponenten der Mischung kompatibel. Dies bietet ein sicheres und bequemes Mittel, Enzyme in beispielsweise Tierfutter zu inkorporieren.
Agglomerationsgranulate werden hergestellt unter Anwendung einer Agglomerationstechnik in einem Mischer mit hoher Scherkraft (z. B. Lödige), währenddessen ein Füllmaterial und das Enzym zusammen agglomeriert werden, um Granula zu bilden. Absorptionsgranulate werden hergestellt, indem man Kernen eines Trägermaterials die Absorption oder Beschichtung durch das Enzym ermöglicht.
Typische Füllmaterialien sind Salze wie Dinatriumsulfat. Andere Füllmaterialien sind Kaolin, Talkum, Magnesiumaluminiumsilicat und Cellulosefasern. Gegebenenfalls sind auch Bindemittel wie Dextrine in Agglomerationsgranulaten eingeschlossen.
Typische Trägermaterialien sind Stärke, z. B. in der Form von Cassava, Mais, Kartoffel, Reis und Weizen. Salze können ebenfalls eingesetzt werden.
Gegebenenfalls werden die Granulate mit einer Beschichtungsmischung beschichtet. Eine solche Mischung umfaßt Beschichtungsmittel, vorzugsweise hydrophobe Beschichtungsmittel, wie z. B. hydriertes Palmöl und Rindertalg, und erwünschtenfalls andere Additive wie Calciumcarbonat oder Kaolin.
Darüber hinaus können Phytase-Zusammensetzungen andere Substituenten, wie z. B. Färbemittel, Aromaverbindungen, Stabilisatoren, Vitamine, Mineralien, andere Futter- oder Nahrungsmittel-verbessernde Enzyme etc. enthalten. Dies gilt insbesondere für die sogenannten Vormischungen.
Ein "Nahrungsmittel- oder Futter-Additiv" ist eine im wesentlichen reine Verbindung oder eine Multikomponenten-Zusammensetzung, die für den Zusatz zu Nahrungsmittel oder Futter geeignet oder dazu bestimmt ist. Insbesondere ist es eine Substanz, welche mit ihrer beabsichtigten Verwendung eine Komponente eines Nahrungsmittel- oder Futterprodukts wird oder irgendwelche Charakteristiken eines Nahrungsmittel- oder Futterprodukts beeinflußt. Es ist zusammengesetzt wie oben für Phytase-Zusammensetzungen angegeben. Ein typisches Additiv umfaßt gewöhnlich eine oder mehrere Verbindung(en), wie z. B. Vitamine, Mineralien oder Futter-verbessernde Enzyme und geeignete Träger und/oder Exzipienten.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Phytase- Zusammensetzungen der Erfindung zusätzlich eine wirksame Menge eines oder mehrerer Futter-verbessernder Enzyme, insbesondere Futter-verbessernder Enzyme, die aus der Gruppe, bestehend aus α-Galactosidasen, β-Galactosidasen, insbesondere Lactasen, anderen Phytasen, β-Glucanasen, insbesondere Endo-β-1,4- glucanasen und Endo-β-1,3(4)-glucanasen, Cellulasen, Xylosidasen, Galactanasen, insbesondere Arabinogalactan-endo-1,4-β-galactosidasen und Arabinogalactan-endo-1,3-β-galactosidasen, Endoglucanasen, insbesondere Endo-1,2-β- glucanase, Endo-1,3-α-glucanase und Endo-1,3-β-glucanase, Pectin-abbauenden Enzymen, insbesondere Pectinasen, Pectinesterasen, Pectinlyasen, Polygalacturonasen, Arabinanasen, Rhamnogalacturonasen, Rhamnogalacturonanacetylesterasen, Rhamnogalacturonan-α-rhamnosidase, Pectatlyasen und α- Galacturonisidasen, Mannanasen, β-Mannosidasen, Mannanacetylesterasen, Xylanacetylesterasen, Proteasen, Xylanasen, Arabinoxylanasen und Iipolytischen Enzymen wie Lipasen, Phospholipasen und Cutinasen, ausgewählt sind.
Das Tierfutter-Additiv der Erfindung wird dem Tier mit einem Magen vor oder gleichzeitig mit der Nahrung zugegeben. Vorzugsweise wird das Tierfutter- Additiv der Erfindung dem Tier mit einem Magen gleichzeitig mit der Nahrung zugegeben. In einer bevorzugteren Ausführungsform wird das Tierfutter-Additiv der Nahrung in Form eines Granulats oder einer stabilisierten Flüssigkeit zugesetzt.
Eine wirksame Menge an Phytase in Nahrungsmittel oder Futter beträgt etwa 10- 20.000; vorzugsweise etwa 10 bis 15.000, bevorzugter etwa 10 bis 10.000, insbesondere etwa 100 bis 5.000, besonders etwa 100 bis etwa 2.000 FYT/kg Futter oder Nahrungsmittel.
Beispiele anderer spezieller Verwendungen der Phytase der Erfindung sind bei der Sojabohnenverarbeitung und bei der Herstellung von Inosit oder Derivaten davon.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verringerung von Phytat-Niveaus in Tierkot, wobei dem Tier ein Futter, das eine wirksame Menge der Phytase der Erfindung umfaßt, gefüttert wird. Wie zu Beginn der vorliegenden Anmeldung festgestellt, besteht eine wichtige Wirkung davon in der Verringung der Phosphatverschmutzung der Umwelt.
Ebenfalls vom Umfang der Erfindung umfaßt ist die Verwendung einer Phytase der Erfindung bei der Herstellung von Nahrungsmittel- oder Futterpräparaten oder -zusätzen, d. h., die Phytase übt ihre Phytase-Aktivität nur während der Herstellung aus und ist im Nahrungsmittel- oder Futter-Endprodukt nicht aktiv. Dieser Aspekt ist beispielsweise bei der Teigherstellung und beim Backen wichtig.
Die Erfindung betrifft auch im wesentlichen reine biologische Kulturen der hinterlegten Mikroorganismen und Stämme, welche als Teil ihrer genetischen Ausstattung eine DNA-Sequenz umfassen, die für eine Phytase der Erfindung kodiert.
Von der Definition einer im wesentlichen reinen biologischen Kultur umfaßt ist jede Mutante der genannten Stämme, welche das Vermögen zur Kodierung von Phytase behalten hat.
Die Erfindung wird detaillierter in den folgenden Beispielen beschrieben, welche den Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.

BEISPIELE

Materialien und Methoden

Medien:

Phytat-Replikationsplatten:
Zugabe zu 200 ml geschmolzenen SC-Agars
20 ml 20%ige Galactose
800 ul 5%iges Threonin
25 ml Lösung A
25 ml Lösung B
200 ul Spurenelementlösung (DSM-Katalog 141)
Lösung A:
6 g CaCl&sub2;, 2 H&sub2;O
8 g MgCl&sub2;, 6 H&sub2;O
Zugabe von ddH&sub2;O auf 1 l
pH = 6,5
Lösung B:
35,12 g Na-Phytat
Zugabe von H&sub2;O auf 1 l
pH = 6,5
Medium A:
Hefe-Stickstoffbase w/o Aminosäuren (Difco 0919) 7,5 g/l
Succinsäure (Merck 822260) 11,3 g/l
NaOH (Merck 6498) 6,8 g/l
Casaminosäure w/o Vitamin (Difco 0288) 5,6 g/l
Tryptophan (Merck 8374) 0,1 g/l
Threonin 1,0 g/l
Na-Phytat (35,12 g/l, pH 6,5) 125 mll
Galactose 20,0 g/l
Spurenmetall (DSM 141) 1,0 ml/l
auf 1 l mit H&sub2;O aufgefüllt
Spurenmetallösung:
Nitrilotriessigsäure 1,50 g
MgSO&sub4;, 7 H&sub2;O 3,00 g
MnSO&sub4;, 2 H&sub2;O 0,50 g
NaCl 1,00 g
FeSO&sub4;, 7 WO 0,10 g
CoSO&sub4;, 7 WO 0,18 g
CaCl&sub2;, 2 H&sub2;O 0,10 g
ZnSO&sub4;, 7 WO 0,18 g
CuSO&sub4;, 5 H&sub2;O 0,01 g
Kal (SO&sub4;)&sub2;, 12 H&sub2;O 0,02 g
H&sub3;BO&sub3; 0,01 g
Na&sub2;MoO&sub4;, 2 H&sub2;O 0,01 g
NiCl&sub2;, 6 H&sub2;O 0,025 g
Na&sub2;Se&sub3;O, 5 H&sub2;O 0,30 g
Destilliertes Wasser 1 l
pH 7,0
Zuerst wird Nitrilotriessigsäure aufgelöst und der pH-Wert mit KOH auf 6,5 eingestellt, dann werden Mineralien zugesetzt. pH-Endwert 7,0 (mit KOH).
Medium B:
Ähnlich wie Medium A, mit der Ausnahme, daß Glucose anstelle von Galactose als C-Quelle zugesetzt wird.
YPD:
10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H&sub2;O auf 900 ml. Autoklavierung, Zusatz von 100 ml 20%iger Glucose (steril filtriert).
YPM:
10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H&sub2;O auf 900 ml. Autoklavierung, Zusatz von 100 ml 20%igen Maltodextrins (steril filtriert).
10 · Basissalz:
75 g Hefe-Stickstoffbase, 113 g Succinsäure, 68 g NaOH, H&sub2;O auf 1000 ml, steril filtriert.
SC-URA:
100 ml 10 · Basissalz, 28 ml 20%ige Casaminosäuren ohne Vitamine, 10 ml 1%iges Tryptophan, H&sub2;O auf 900 ml, Autoklavierung, Zusatz von 3,6 ml 5%igen Threonins und 100 ml 20%iger Glucose oder 20%iger Galactose.
SC Agar:
SC-URA, Zusatz von 20 g/l Agar.
SC-Agar-Variante:
20 g Agar, 20 ml 10 · Basissalz, H&sub2;O auf 900 ml, autoklaviert.

Allgemeine molekularbiologische Verfahren

Soweit nicht anders angegeben, wurden die DNA-Manipulationen und Transformationen unter Anwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt (Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M., et al. (Hrsg.) "Cur rent protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., und Cutting, S. M. (Hrsg.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Enzyme für DNA-Manipulationen, wie z. B. Restriktionsendonukleasen, Ligasen etc., von New England Biolabs, Inc. bezogen. Die Enzyme wurden gemäß den Angaben der Hersteller eingesetzt.

BEISPIEL 1

Klonierung und Expression einer Phytase aus Peniophora lycii CBS Nr. 686.96

Hinterlegte Organismen:

Peniophora lycii CBS Nr. 686.96 umfaßt die für Phytase kodierende DNA- Sequenz der Erfindung.
Escherichia coli DSM Nr. 11312, enthaltend das Plasmid, welches die vollständige cDNA-Sequenz, die für die Phytase der Erfindung kodiert, in dem Shuttle- Vektor pYES 2.0 umfaßt.

Andere Stämme:

Hefestamm: Der eingesetzte Saccharomyces cerevisiae-Stamm war W3124 (van den Hazel, H. B.; Kielland-Brandt, M. C.; Winther, J. R., in Eur. J. Biochem., 207, 277-283, 1992; (MATa; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prcl: :HIS3; prbl::LEU2; cir+).
E. coli-Stamm: DH10B (Life Technologies)

Plasmide:

Der Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 ist ein Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in EP 238 023). Die Konstruktion von pHD414 ist in WO 93/11249 näher beschrieben.
pYES 2.0 (Invitrogen)
pA2phy2 (siehe Beispiel 1)

Expressionsklonierung in Hefe

Die Expressionsklonierung in Hefe erfolgte wie von H. Dalboege et al. (H. Dalboege et al., Mol. Gen. Genet (1994) 243: 253-260; WO 93/11249; WO 94/14953) beschrieben, hier als Referenz mit eingeschlossen. Alle einzelnen Schritte der Extraktion von Gesamt-RNA, cDNA-Synthese, Behandlung mit Mungobohnennuklease, Versehen mit glatten Enden mittels T4-DNA-Polymerase und Erstellung von Banken erfolgten gemäß den oben genannten Referenzen.

Fermentationsprozedur von Peniophora lycii CBS Nr. 686.96 für die mRNA- Isolierung:

Peniophora lycii CBS 686.96 wurde von einer Platte mit ausgewachsenem Myzel in einen Schüttelkolben überimpft, der 100 ml Medium B (Soja 30 g/l, Maltodextrin 15 g/l, Bactopepton 5 g/l, Pluronic 0,2 g/l) enthielt. Die Kultur wurde stationär 15 Tage lang bei 26ºC inkubiert. Die resultierende Kulturlösung wurde durch Miratuch filtriert und das Myzel in flüssigem Stickstoff eingefroren.
mRNA wurde aus Myzel von dieser Kultur isoliert wie (in H. Dalboege et al. Mol. Gen. Genet (1994) 243: 253-260; WO 93/11249; WO 94/14953) beschrieben. Die Extraktion von Gesamt-RNA geschah mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt von Ultrazentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen, und die Isolierung von Poly(A)+RNA erfolgte durch Oligo(dT)-Cellulose-Affinitätschromatographie unter Anwendung der in WO 94/14953 beschriebenen Verfahren.

cDNA-Synthese:

Doppelsträngige cDNA wurde aus 5 mg Poly(A)&spplus;-RNA nach dem RNase H- Verfahren (Gubler und Hoffman (1983), Gene 25 : 263-269, Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) synthetisiert. Die Poly(A)&spplus;-RNA (5 ug in 5 ul DEPC- behandeltem Wasser) wurde 8 Minuten lang auf 70ºC in einem vorsilikonisierten, RNase-freien Eppendorf-Röhrchen erwärmt, auf Eis abgeschreckt und in einem Endvolumen von 50 ul mit Reverse-Transkriptase-Puffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, Bethesda Research Laboratories), enthaltend 1 mM dATP, dGTP und dTTP und 0,5 mM 5-Methyl-dCTP (Pharmacia), 40 Einheiten Human-Placenta-Ribonukleaseinhibitor (RNasin, Promega), 1,45 ug Oligo(dT)&sub1;&sub8;-Not I-Primer (Pharmacia) und 1000 Einheiten SuperScript II-RNase H-Reverse Transkriptase (Bethesda Research Laboratories) kombiniert. cDNA des ersten Strangs wurde durch Inkubation der Reaktionsmischung für 1 h bei 45º C synthetisiert. Nach der Synthese wurde die mRNA:cDNA-Hybrid-Mischung durch eine MicroSpin S-400 HR-Schleudersäule (Pharmacia) nach den Anweisungen des Herstellers gelitriert.
Nach der Gelfiltration wurden die Hybride in 250 ul Puffer für den zweiten Strang (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,16 mM bNAD+), enthaltend 200 ul eines jeden dNTP, 60 Einheiten E. coli-DNA Polymerase I (Pharmacia), 5,25 Einheiten RNase H (Promega) und 15 Einheiten E. coli-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim), verdünnt. Die Synthese der cDNA des zweiten Strangs erfolgte durch zweistündige Inkubation des Reaktionsröhrchens bei 16ºC und weiteren 15 Minuten bei 25ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM, gefolgt von Phenol- und Chloroformextraktionen.

Mungobohnennuklease-Behandlung:

Die doppelsträngige cDNA wurde durch Zugabe von 2 Vol. an 96%igem EtOH, 0,2 Vol. 10 M NH&sub4;Ac, 12 h lang bei -20ºC gefällt, durch Zentrifugation gewonnen, in 70%igem EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 ul Mungobohnennuklease-Puffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO&sub4;, 0,35 mM DTT, 2 % Glycerin), enthaltend 25 Einheiten Mungobohnennuklease (Pharmacia) resuspendiert. Die einzelsträngige Haarnadel-DNA wurde gespalten durch Inkubation der Reaktion bei 30ºC für 30 Minuten, gefolgt von der Zugabe von 70 ul 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Fällung mit 2 Vol. an 96%igem EtOH und 0,1 Vol. 3 M NaAc, pH 5,2, auf Eis für 30 Minuten.

Versehen mit Glatten Enden mittels T4-DNA-Polymerase:

Die doppelsträngigen cDNAs wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 30 ml T4-DNA-Polymerase-Puffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT), enthaltend 0,5 mM eines jeden dNTP und 5 Einheiten T4- DNA-Polymerase (New England Biolabs), durch Inkubation der Reaktionsmischung für 1 h bei 16ºC mit glatten Enden versehen. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM, gefolgt von Phenol- und Chloroformextraktionen und Fällung für 12 h bei -20ºC durch Zugabe von 2 Vol. an 96%igem EtOH und 0,1 Vol. 3 M NaAc, pH 5,2.

Adapter-Ligierung, Not I-Verdauung und Größenselektion:

Nach der Auffühllreaktion wurden die cDNAs durch Zentrifugation gewonnen, in 70%igem EtOH gewaschen und getrocknet. Das cDNA-Pellet wurde in 25 ul Ligierungspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP), enthaltend 2,5 ug nicht-palindromische BstXI-Adaptoren (Invitrogen) und 30 Einheiten T4-Ligase (Promega), resuspendiert und 12 h lang bei 16ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch 20-minütiges Erwärmen auf 65ºC und anschließendes Abkühlen für 5 Minuten auf Eis gestoppt. Die mit Adaptern versehene cDNA wurde durch Zugabe von 20 ul Wasser, 5 ul 10 · Not I-Restriktionsenzym- Puffer (New England Biolabs) und 50 Einheiten Not I (New England Biolabs), gefolgt von Inkubation für 2,5 h bei 37ºC, mit dem Restriktionsenzym Not I verdaut. Die Reaktion wurde gestoppt durch Erwärmung auf 65ºC für 10 Minuten. Die cDNAs wurden durch Gelelektrophorese auf einem 0,8%igen SeaPlaque GTG-Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur (FMC) in 1 · TBE größenfraktioniert, um unligierte Adapter und kleine cDNAs abzutrennen. Die cDNA wurde mit einem Ausschluß bei 0,7 kb größenselektioniert und durch Verwendung von b-Agarase (New England Biolabs) nach den Anweisungen des Herstel lers aus dem Gel gewonnen und durch Zugabe von 2 Vol. an 96%igem EtOH und 0,1 Vol. 3 M NaAc, pH 5,2, 12 h lang bei -20ºC gefällt.

Erstellung von Banken:

Die gerichtete, größenselektionierte cDNA wurde durch Zentrifugation gewonnen, in 70%igem EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 ul 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, resuspendiert. Die cDNAs wurden mittels Gelfiltration durch eine MicroSpin S-300 HR-Schleudersäule (Pharmacia) nach den Anweisungen des Herstellers entsalzt. Drei Testligierungen wurde in 10 ul Ligierungspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7, 8, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP), enthaltend 5 ul doppelsträngiger cDNA (Reaktionsröhrchen #1 und #2), 15 Einheiten T4-Ligase (Promega) und 30 ng (Röhrchen #1), 40 ng (Röhrchen #2) und 40 ng (Röhrchen #3, die Vektorhintergrund-Kontrolle) an mit BstXI-NotI-gespaltenem pYES 2,0- Vektor, durchgeführt. Die Ligierungsreaktionen erfolgten durch Inkubation bei 16ºC für 12 h, Erwärmung auf 70ºC für 20 Minuten und Zugabe von 10 ul Wasser zu jedem Röhrchen. 1 ul jeder Ligierungsmischung wurde in 40 ul elektrokompetente E. coli-DH10B-Zellen (Bethesda Research Laboratories) wie beschrieben (Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) mittels Elektroporation eingeführt. Unter Anwendung der optimalen Bedingungen wurde eine Bank in E. coli, bestehend aus Pools, erstellt. Jeder Pool wurde durch Ausbreiten transformierter E. coli auf LB+Ampicillin-Agarplatten gebildet, was nach einer Inkubation für 24 h bei 37ºC 15.000-30.000 Kolonien/Platte ergab. 20 ml LB+-Ampicillin wurden der Platte zugesetzt und die Zellen darin suspendiert. Die Zellsuspension wurde 1 h lang bei 37ºC in einem 50-ml-Röhrchen geschüttelt. Plasmid-DNA wurde nach den Anweisungen des Herstellers mit Hilfe eines QIAGEN-Plasmid-Kits aus den Zellen isoliert und bei -20ºC aufbewahrt.
1-ul-Aliquots gereinigter Plasmid-DNA (100 ng/ml) aus individuellen Pools wurden mittels Elektroporation (Becker und Guarante (1991), Methods Enzymol. 194: 182-187) in S. cerevisiae W3124 transformiert und die Transformanten wurden auf SC-Agar mit 2% Glucose ausplattiert und bei 30ºC inkubiert.

Identifizierung positiver Kolonien:

Nach 3-5 Tagen Wachstum wurden die Agarplatten auf einen Satz der Phytat- Replikationsplatten replikaplattiert und 3-5 Tage lang bei 30ºC inkubiert. 1%ige LSB-Agarose, enthaltend 0,2 M CaCl&sub2;, wird über die Platten gegossen und nach 1-4 Tagen werden die Phytase-positiven Kolonien als Kolonien identifiziert, die von einer Klärungszone umgeben sind.
Zellen aus Enzympositiven Kolonien wurden zur Einzelkolonie-Isolierung auf Agar ausgebreitet und eine Enzym-produzierende Einzelkolonie wurde für jede der identifizierten Phytase-produzierenden Kolonien ausgewählt.

Isolierung eines cDNA-Gens zur Expression in Aspergillus:

Mit einer Phytase-produzierenden Hefekolonie wurden 20 ml YPD-Lösung in einem 50-ml-Glasreagensröhrchen angeimpft. Das Röhrchen wurde 2 Tage lang bei 30ºC geschüttelt. Die Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 3000 UpM geerntet.
DNA wurde gemäß WO 94/14953 isoliert und in 50 ml Wasser gelöst. Die DNA wurde nach Standardverfahren in E. coli transformiert. Plasmid-DNA wurde aus E. coli unter Anwendung von Standardverfahren isoliert und durch Restriktionsenzym-Analyse analysiert.
Das cDNA-Insert wurde mit Hilfe der Restriktionsenzyme Hind III und Xba I ausgeschnitten und in den Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 ligiert, was das Plasmid pA2phy2 ergab.
Das cDNA-Insert von Qiagen-gereinigter Plasmid-DNA von pA2phy2 (Qiagen, USA) wurde mit dem Taq-Desoxyterminalzyklus-Sequenzierungskit (Perkin Eimer, USA) und synthetischen Oligonukleotid-Primern unter Verwendung eines Applied Biosystems ABI PRISMTM 377-DNA-Sequenzierers nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert.

Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger

Protoplasten werden hergestellt wie in WO 95/02043, S. 16, Zeile 21 - Seite 17, Zeile 12, beschrieben, welche hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
100 ul Protoplasten-Suspension werden mit 5-25 ug der geeigneten DNA in 10 ul STC (1, 2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl&sub2;) gemischt. Die Protoplasten werden mit p3SR2 (ein Plasmid, welches ein amdS-Gen aus A. nidu/ans trägt) (Tove Christensen et al. Bio/Technology, S. 1419-1422, Bd. 6, Dez. 1988) gemischt. Die Mischung wird 25 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen. 0,2 ml mit 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl&sub2; und 10 mM Tris- HCl, pH 7,5, werden zugegeben und sorgfältig gemischt (zweimal) und schließlich werden 0,85 ml derselben Lösung zugegeben und sorgfältig gemischt. Die Mischung wird 25 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen, 15 Minuten lang mit 2500 g zentrifugiert und das Pellet in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51-56), enthaltend 1,0 M Sucrose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl, um das Hintergrundwachstum zu inhibieren, ausgebreitet. Nach Inkubation für 4-7 Tage bei 37ºC werden Sporen gepickt und für Einzelkolonien ausgebreitet. Diese Prozedur wird wiederholt und Sporen einer Einzelkolonie nach der zweiten Reisolierung werden als eine definierte Transformante aufbewahrt.

Test von A. oryzae-Transformanten

Jeder der A. oryzae-Transformanten wird in 10 ml YPM (vgl. unten) überimpft und vermehrt. Nach 2-5 Tagen Inkubation bei 30ºC wird der Überstand entfernt.
Die Phytase-Aktivität wird festgestellt, indem 20 ul Überstand in Löcher von 4 mm Durchmesser, die in 1% LSB-Agarose-Plätten, enthaltend 0,1 M Natriumacetat, pH 4,5, und 0,1% Inosithexaphosphorsäure, ausgestanzt wurden, eingebracht werden. Die Platten werden über Nacht bei 37ºC belassen. Ein Puffer, bestehend aus 0,1 M CaCl&sub2; und 0,2 M Natriumacetat, pH 4,5, wird über die Platten gegossen und die Platten werden 1 h lang bei Raumtemperatur belassen. Phytase-Aktivität wird dann als klare Zone identifiziert.

Fed-batch-Fermentation:

Die Fed-batch-Fermentation wurde in einem Medium durchgeführt, das Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff als Stickstoffquelle und Hefeextrakt umfaßte. Die Fed-batch-Fermentation wurde durchgeführt durch Überimpfen einer Schüttelkolbenkultur der betreffenden A. oryzae-Wirtszellen in ein Medium, das 3,5% der Kohlenstoffquelle und 0,5% der Stickstoffquelle umfaßte. Nach 24 h Kultivierung bei pH 7,0 und 34ºC wurde die kontinuierliche Zufuhr weiterer Kohlenstoff und Stickstoffquellen initiiert. Die Kohlenstoffquelle wurde als limitierender Faktor verwendet und es wurde sichergestellt, daß Sauerstoff im Überschuß vorhanden war. Die Fed-batch-Kultivierung wurde 4 Tage lang fortgesetzt.

Isolierung der in SEQ-ID-NR. 1 dargestellten DNA-Sequenz:

Der für Phytase kodierende Teil der in SEQ-ID-NR. 1 dargestellten DNA- Sequenz, welche für die Phytase der Erfindung kodiert, kann aus dem hinterlegten Organismus Escherichia coli DSM 11312 durch Extraktion von Plasmid-DNA nach im Stand der Technik bekannten Verfahren (Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) erhalten werden.
Klonierung und Expression erfolgte durch Anwendung der Expressionsklonierung in einer Hefe-Technik wie oben beschrieben.
mRNA wurde aus Peniophora lycii, CBS Nr. 686.96, wie oben beschrieben gezüchtet, isoliert.
Myzelien wurden nach 15 Tagen Wachstum geerntet, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC aufbewahrt. Eine Bank aus Peniophora lycii, CBS Nr. 686.96, bestehend aus etwa 9 · 10&sup5; individuellen Klonen, wurde in E. coli wie beschrieben mit einem Vektorhintergrund von 1% erstellt. Plasmid-DNA aus einigen der Pools wurde in Hefe transformiert und 50-100 Platten, enthaltend 250-400 Hefekolonien, wurden aus jedem Pool erhalten.
Phytase-positive Kolonien wurden identifiziert und wie oben beschrieben isoliert und damit 20 ml YPD-Lösung in einem 50-ml-Glasreagenzröhrchen angeimpft. Das Röhrchen wurde 2 Tage lang bei 30ºC geschüttelt. Die Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 3000 UpM geerntet. DNA wurde gemäß WO 94/14953 isoliert und in 50 ul Wasser gelöst. Die DNA wurde nach Standardverfahren in E. coli transformiert. Plasmid-DNA wurde aus E. coli nach Standardverfahren isoliert und die DNA-Sequenz der cDNA, welche für die Phytase kodiert, mit dem Taq-Desoxyterminalzyklus-Sequenzierungskit (Perkin Eimer, USA) und synthetischen Oligonukleotid-Primern unter Verwendung eines Applied Biosystems ABI PRISMTM 377 DNA-Sequenzierers nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Die DNA-Sequenz der für die Phytase kodierenden cDNA ist in SEQ-ID-NR. 1 dargestellt und die entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ-ID-NR. 2 dargestellt. In SEQ-ID-NR. 1 definieren die DNA- Nukleotide von Nr. 1 bis Nr. 1320 einen für Phytase kodierenden Bereich.
Der Teil der DNA-Sequenz in SEQ-ID-NR. 1, welcher für den reifen Teil der Phytase kodiert, ist Position 91 bis 1320, was der Aminosäureposition 31-439 in SEQ-ID-NR. 2 entspricht.
Die cDNA ist erhältlich aus dem Plasmid in DSM 11312.
Gesamt-DNA wurde aus einer Hefekolonie isoliert und Plasmid-DNA wurde durch Transformation von E coli wie oben beschrieben gewonnen. Zur Expression der Phytase in Aspergillus wurde die DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, auf Gel größenfraktioniert und ein Fragment, das dem Phytase-Gen entsprach, wurde gereinigt. Das Gen wurde anschließend mit pHD414 ligiert, mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, was das Plasmid pA2phy2 ergab.
Nach Amplifizierung der DNA in E. coli wurde das Plasmid in Aspergillus oryzae wie oben beschrieben transformiert.

Test von A. oryzae-Transformanten

Jeder der Transformanten wurde wie oben beschrieben auf Enzymaktivität getestet. Einige der Transformanten besaßen eine Phytase-Aktivität, welche signifi kant größer als der Aspergillus oryzae-Hintergrund war. Dies demonstriert eine effiziente Expression der Phytase in Aspergillus oryzae.

BEISPIEL 2

Reinigung und Charakterisierung der in Aspergillus oryzae exprimierten Phytase aus Peniophora lycii

Die Peniophora lycii-Phytase wurde in Aspergillus oryzae IFO 4177 exprimiert und davon sekretiert.
Filterhilfe wurde der Kulturlösung zugegeben, welche durch ein Filtrationstuch filtriert wurde. Diese Lösung wurde weiter durch eine Seitz-Tiefenfilterplatte filtriert, was eine klare Lösung ergab. Das Filtrat wurde durch Ultrafiltration mittels Polyethersulfon-Membranen mit einem Ausschluß von 3 kD, gefolgt von Diafiltration mit destilliertem Wasser, konzentriert, um die Leitfähigkeit zu verringern. Der pH-Wert des konzentrierten Enzyms wurde auf pH 7,5 eingestellt. Die Leitfähigkeit des konzentrierten Enzyms betrug 1,2 mS/cm.
Die Phytase wurde auf eine Q-Sepharose-FF-Säule aufgebracht, die in 20 mM Tris/CH&sub3;COOH, pH 7,5, äquilibriert worden war, und das Enzym wurde mit einem ansteigenden linearen NaCl-Gradienten (0 → 0,5 M) eluiert. Die Phytase- Aktivität eluierte als einzelner Peak. Dieser Peak wurde gepoolt und (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bis zu einer Endkonzentration von 1,5 M zugegeben. Eine Phenyl-Toyopearl- 650S-Säule wurde in 1,5 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 mM Succinsäure/NaOH, pH 6,0, äquilibriert und die Phytase wurde auf diese Säule aufgebracht und mit einem abfallenden linearen ((NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Gradienten (1,5 → 0 M) eluiert. Phytase-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und der Puffer wurde auf einer Sephadex G25-Säule gegen 20 mM Tris/CH&sub3;COOH, pH 7,5, ausgetauscht. Das G25-Filtrat wurde auf eine Q-Sepharose-FF-Säule aufgebracht, die in 20 mM Tris/CH&sub3;COOH, pH 7,5, äquilibriert worden war. Nach ausgiebigem Waschen der Säule mit dem Äquilibrierungspuffer wurde die Phytase mit einem ansteigenden linearen NaCl- Gradienten (0 → 0,5 M) eluiert. Die Phytase-Aktivität wurde vereinigt und der Puffer mittels Dialyse gegen 20 mM Tris/CH&sub3;COOH, pH 7,5, ausgetauscht. Die dialysierte Phytase wurde auf eine SOURCE 30Q-Säule aufgebracht, die in 20 mM Tris/CH&sub3;COOH, pH 7,5, äquilibriert worden war. Nach sorgfältigem Waschen der Säule mit dem Äquilibrierungspuffer wurde eine Phytase mit einem ansteigenden linearen NaCl-Gradienten (0 → 0,3 M) eluiert. Fraktionen von der SOURCE 30Q-Säule wurden mittels SDS-PAGE analysiert und reine Phytase- Fraktionen vereinigt.
Die Peniophora-Phytase wandert in dem Gel als eine Bande mit Mr = 67 kD. Eine N-terminale Aminosäuresequenzierung der 67 kD-Komponente wurde nach SDS- PAGE und Elektroblotting auf eine PVDF-Membrane durchgeführt. Die folgende N-terminale Aminosäuresequenz konnte abgeleitet werden:
Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn-
Die Sequenz entspricht den Aminosäureresten 31-37 in der von der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz.
Dementsprechend wird eine reife Aminosäuresequenz der Phytase bei Expression in Aspergillus als Nr. 31-439 von SEQ-ID-NR. 2 angenommen.

BEISPIEL 3

Charakterisierung der Phytase von Peniophora lycii, wie sie im Überstand der rohen Fermentationslösung vorhanden ist

Die folgende Charakterisierung wurde mit dem Überstand der rohen Kulturlösung durchgeführt.

Phytase-Aktivitäts-Assay:

Für jede Phytase-Probe werden zwei Aliquots von 20 ul zu 100 ul Phytinsäure (5 mM Natriumphytat in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 5,5) zugegeben.
Zum Zeitpunkt T = 0 Min. werden 100 ul Fe-Reagens (1,1 g FeSO&sub4;, 7 H&sub2;O in 15 ml Ammoniummolybdat-Lösung (2,5 g (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;, 4 H&sub2;O und 8 ml H&sub2;SO&sub4;, mit Wasser auf 250 ml verdünnt)) der Referenzprobe zugegeben. Die Referenz mischung wird 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Intensität der blauen Farbe wird spektralphotometrisch bei 750 nm gemessen.
Die Enzymprobe wird 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Bei T = 30 Minuten werden 100 ul Fe-Reagens zugegeben. Die Proben werden 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und spektralphotometrisch bei 750 nm gemessen. Der Unterschied zwischen der Enzymprobe und der Referenzprobe zeigt die Menge des freigesetzten Phosphats, bezogen auf eine Eichkurve von Phosphat, an.

Temperaturstabilität

Die Stabilität von Phytase wurde gemessen durch Vorinkubation der Enzymproben für 20 Minuten bei den in der folgenden Tabelle angegebenen Temperaturen, gefolgt von Abkühlen der Proben auf Raumtemperatur vor der Messung der Restaktivität.
Die erhaltenen Resultate sind ebenfalls in der folgenden Tabelle dargestellt, nämlich relativ zu der Restaktivität nach einer Inkubation von 20 Minuten bei 26ºC.

ph-Optimum

Das pH-Profil wurde ebenfalls mit dem Überstand der rohen Kulturlösung und unter Anwendung des oben beschriebenen Phytase-Aktivitäts-Assays bestimmt. Die 5 mM Phytinsäure-Lösung wurde in den folgenden Puffern hergestellt: pH 3,0 (0,1 M Glycin/HCl), pH 4,0 (0,1 M Natriumacetat), pH 5,0 (Natriumacetat), pH 5, 5 (Natriumacetat), pH 6,0 (50 mM MES), pH 7,0 (0,1 M Tris-HCl), pH 8,0 (0,1 M Tris-HCl), pH 9,0 (0,1 M Glycin/NaOH).
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle in relativen Werten dargestellt, wobei der Index 100 die Aktivität bei pH 5,0 angibt.

BEISPIEL 4

Charakterisierung der gereinigten Phytase aus Peniophora lycii

Die Phytase von Peniophora lycii wurde in Aspergillus exprimiert und wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt.
Die Phytase-Aktivität wurde mit Hilfe des folgenden Assays gemessen: 10 ul verdünnte Enzymproben (verdünnt in 0,1 M Natriumacetat, 0,01% Tween 20, pH 5,5) wurden zu 250 ul 5 mM Natriumphytat (Sigma) in 0,1 M Natriumacetat, 0,01 % Tween 20, pH 5,5 (pH-Wert nach Auflösen des Natriumphytats eingestellt; das Substrat wurde vorgewärmt) zugegeben und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 250 ul 10%iger TCA und freies Phosphat wurde durch Zugabe von 500 ul 7,3 g FeSO&sub4; in 100 ml Molybdat- Reagens (2,5 g (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;.4H&sub2;O in 8 ml H&sub2;SO&sub4;, auf 250 ml verdünnt) gemessen. Die Extinktion bei 750 nm wurde mit 200-ul-Proben in 96-Mulden- Mikrotiterplatten gemessen. Substrat- und Enzym-Blindproben waren eingeschlossen. Eine Phosphat-Standardkurve war ebenfalls eingeschlossen (0-2 mM Phosphat). 1 FYT entspricht derjenigen Menge an Enzym, welche 1 uMol Phosphat/Min. unter den angegebenen Bedingungen freisetzt.
Temperaturprofile wurden erhalten, indem der Assay bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt wurde (Vorwärmung des Substrats).
Die Temperaturstabilität wurde untersucht durch Vorinkubation der Phytasen in 0,1 M Natriumphosphat, pH 5,5, bei verschiedenen Temperaturen bevor die Restaktivität gemessen wurde.
Die pH-Stabilität wurde gemessen durch Inkubation des Enzyms bei pH 3 (25 mM Glycin-HCl), pH 4-5 (25 mM Natriumacetat), pH 6 (25 mM MES), pH 7-9 (25 mM Tris-HCl) für 1 h bei 40ºC bevor die Restaktivität gemessen wurde.
Die pH-Profile wurden erhalten, indem der Assay bei den verschiedenen pH- Werten unter Verwendung derselben Puffersysteme durchgeführt wurde (50 mM, der pH-Wert wurde bei Auflösung des Substrats erneut eingestellt).
Die Ergebnisse der obigen Studien von pH-Profil, pH-Stabilität, Temperaturprofil und Temperaturstabilität sind in Fig. 1, 2, 3 bzw. 4 dargestellt.
Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß die Phytase von Peniophora lycii eine annehmbare Aktivität bei pH 3-6 besitzt (d. h., mehr als 40% der maximalen Aktivität). Bei pH 3,5-5, 5 wird mehr als 60% der maximalen Aktivität gefunden, bei pH 3,8-5,0 mehr als 90%. Der optimale pH-Wert scheint im Bereich von pH 4-5 zu liegen.
Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß die Phytase von Peniophora lycii für 1 h bei 40ºC in dem gesamten pH-Spektrum von 3-9 sehr stabil ist (d. h., mehr als 80% der maximalen Aktivität bewahrt).
Bezüglich des Temperaturprofils ist aus Fig. 3 ersichtlich, daß die Peniophora lycii-Phytase eine annehmbare Aktivität bei Temperaturen von 30-65ºC besitzt (d. h., mehr als 60% der maximalen Aktivität), wohingegen bei Temperaturen von 35-62ºC die Aktivität mehr als 70% der maximalen Aktivität beträgt, und die optimale Temperatur könnte in der Nähe von 50ºC liegen.
Schließlich, bezüglich der in Fig. 4 dargestellten Temperaturstabilitätsergebnisse, ist die Phytase der Erfindung bei Temperaturen von 0 bis etwa 50ºC sehr stabil (d. h., mehr als 90% Restaktivität). Ein gewisser Abfall der Restaktivität ist nach Vorinkubation bei Temperaturen oberhalb von 50ºC zu beobachten. Auf jeden Fall verbleibt bei 60-80ºC immer noch etwa 50-60% der Restaktivität.
Es wird angenommen, daß diese Tatsache darauf zurückzuführen ist, daß das Enzym überraschenderweise in der Lage ist, sich nach seiner thermischen Denaturierung erneut aufzufalten. Das Ausmaß der erneuten Auffaltung wird von den genauen Bedingungen (pH, Enzymkonzentration) abhängen.
Fig. 5 zeigt das Ergebnis der Differentialscanningkalorimetrie (DSK)-Messungen bei der Peniophora-Phytase.
Bei der DSK wird die aufgewendete Wärme, um eine konstante Temperaturerhöhung in der Probenzelle aufrechtzuerhalten, relativ zu einer Referenzzelle gemessen. Eine konstante Erwärmungsrate wird aufrechterhalten (z. B. 90ºC/h). Ein endothermer Prozeß (wärmeverbrauchender Prozeß, z. B. die Entfaltung eines Enzyms/Proteins) wird beobachtet als Zunahme der Wärme, welche der Zelle zugeführt wird, um die konstante Temperaturerhöhung aufrechtzuerhalten.
Die DSK wurde unter Verwendung des MC2-Apparats von MicroCal durchgeführt. Zellen wurden 20 Minuten lang bei 20ºC äquilibriert, bevor mit einer Scan- Rate von 90º/h bis 90ºC gescannt wurde. Proben von etwa 2,5 mg/ml Peniophora-Phytase in 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5, wurden aufgetragen.
Die Temperaturstabilitätsstudien wurden durch DSK bestätigt, da aus Fig. 5 ersichtlich ist, daß die Peniophora-Phytase eine Denaturierungs- oder "Schmelz"- Temperatur von etwa 60ºC bei pH 5,5 aufweist.

BEISPIEL 4a

Bestimmung der spezifischen Aktivität der Peniophora-Phytase

Die spezifische Aktivität wird mit einer hochgereinigten Probe der Phytase bestimmt (die Reinheit wurde zuvor auf einem SDS-Polyacrylamidgel überprüft, welches die Anwesenheit von nur einer Komponente anzeigte).
Die Proteinkonzentration in der Phytase-Probe wurde mittels Aminosäureanalyse wie folgt bestimmt: Ein Aliquot der Phytase-Probe wurde in 6 N HCl, 0,1% Phenol, 16 h lang bei 110ºC in einem evakuierten Glasröhrchen hydrolysiert. Die resultierenden Aminosäuren wurden mit Hilfe eines Applied Biosystems 420A- Aminosäureanalysesystems, das gemäß den Anweisungen der Hersteller betrieben wurde, quantitativ bestimmt. Aus den Mengen der Aminosäuren kann die Gesamtmasse - und somit auch die Konzentration - an Protein in dem hydrolysierten Aliquot berechnet werden.
Die Aktivität wird in den Einheiten von FYT bestimmt. Eine FYT entspricht derjenigen Menge an Enzym, welche 1 uMol anorganisches Phosphat pro Minute bei pH 5,5, 37ºC, aus Phytat (5 mM Phytat) freisetzt; der Assay wird z. B. in Beispiel 4 beschrieben.
Die spezifische Aktivität wird zu 987 FYT/mg Enzymprotein berechnet.

BEISPIEL 5

Zeitaufgelöstes Produktprofil der Phytase-katalysierten Hydrolyse von Phytinsäure mittels ¹H-NMR-Spektroskopie

Die Hydrolyse von Phytinsäure (PA), welche durch die Peniophora-Phytase und durch eine im Handel erhältliche Aspergillus niger-Phytase (Phytase Novo®) katalysiert wurde, wurde durch ein ¹H-NMR-Profil der Produktmischung im Verlauf von 24 h untersucht (27 mM Phytat, 1 FYT/ml, pH 5,5 und 3,5, und 27ºC).
Im folgenden bezeichnet (Ins(p,q,r,..)Pn myo-Inosit, welches insgesamt n Phosphatgruppen trägt, die mit den Positionen p, q, r, ... verknüpft sind. Aus Gründen der Bequemlichkeit wird Ins(1,2,3,4,5,6)P&sub6; (Phytinsäure) als PA abgekürzt. Man vergleiche bitte jedoch den Abschnitt "Nomenklatur und Positionsspezifität von Phytasen" im allgemeinen Teil dieser Anmeldung.
Die Technik liefert spezifische Informationen über erste Angriffspunkte des Enzyms auf dem PA-Molekül sowie Informationen über die Identität des Endprodukts. Andererseits liefern die sich entwickelnden Peak-Muster, welche die Zusammensetzung der Zwischenproduktmischungen reflektieren, eine qualitative Messung, einen Fingerabdruck, geeignet zur Identifizierung von Ähnlichkeiten und Unterschieden zwischen individuellen Enzymen.
NMR ist, wie die meisten anderen analytischen Verfahren, in der Lage, zwischen Stereoisomeren unterscheiden, welche keine Spiegelbilder sind (Diastereomere), jedoch nicht zwischen einem Satz von Isomeren, welche Spiegelbilder sind (Enantiomere), da sie identische NMR-Spektren aufweisen.
Somit weist Ins(1,2,4,5,6)P&sub5; (3-Phosphat entfernt) ein NMR-Spektrum auf, welches sich von Ins(1,2,3,4,5)P&sub5; (6-Phosphat entfernt) unterscheidet, da die Isomere Diastereomere sind.
Jedoch sind die NMR-Spektren von Ins(1,2,4,5,6)P&sub5; und Ins(2,3,4,5,6)P&sub5; (1- Phosphat entfernt) identisch, da die Isomere Enantiomere sind. Dasselbe gilt für das Paar Ins(1,2,3,4,5)P&sub5; und Ins(1,2,3,5,6)P&sub5; (4-Phosphat entfernt).
Somit ist es nicht möglich, mittels NMR zwischen einer 3- und einer 1-Phytase zu unterscheiden, und es ist nicht möglich, zwischen einer 6- und einer 4-Phytase zu unterscheiden (oder einer L-6- und einer D-6-Phytase bei Anwendung der Regel der geringsten Stellungsziffer).
Durch die Beschreibung von 3- und 6-Phytasen in der Literatur voreingenommen, verwendeten wir die Begriffe 3- und 6-Phytasen für unsere Enzyme, wir wissen jedoch tatsächlich nicht, ob wir nicht stattdessen eine 1- und eine 4-Phytase haben, obwohl dies unwahrscheinlich ist.

Experimentelles

Die NMR-Spektren wurden bei 300 K (27ºC) mit einem Bruker DRX400- Instrument aufgezeichnet, das mit einem selektiven inversen 5-mm-Sondenkopf ausgestattet war. 16 Scans, denen 4 Blind-Scans vorangingen, wurden angesammelt, wobei eine Abtastbreite von 2003 H&sub2; (5 ppm), von 8-K-Datenpunkten abgedeckt, verwendet wurde. Eine Abschwächung der restlichen HOD-Resonanz wurde mit einer Vorsättigungsperiode von 3 Sekunden erzielt. Die Spektren wurden auf das HOD-Signal (δ 4,70) bezogen.
PA-Proben für die NMR-Analyse wurden wie folgt hergestellt: PA (100 mg, Phytinsäure-Dikaliumsalz, Sigma P-5681) wurde in entionisiertem Wasser (4,0 ml) gelöst und der pH-Wert durch Zugabe von wäßriger NaOH (4 N) auf 5,5 oder 3,5 eingestellt. Entionisiertes Wasser wurde zugegeben (auf 5 ml) und 1-ml- Portionen, jeweils 20 mg Phytinsäure entsprechend, wurden in Gefäße mit Schraubkappen überführt und das Lösungsmittel verdampft (Vakuumzentrifuge). Die trockenen Proben wurden in Deuteriumoxid (2 ml, Merck, 99,5% D) gelöst und erneut bis zur Trockne eingedampft (bis zur Verwendung bei -18ºC gelagert).
Für die NMR-Analyse wurde eine 20-mg-Phytinsäureprobe in Deuteriumoxid (1,0 ml, Merck, 99,95% D) gelöst. Die Lösung wurde in ein NMR-Röhrchen überführt und das ¹H-NMR-Spektrum aufgezeichnet. Enzymlösung (1 FTU, geeignet mit Deuteriumoxid verdünnt bzw. darin gelöst) wurde zugesetzt, gefolgt von sorgfältigem Mischen (1 Minute). ¹H-NMR-Spektren wurden unmittelbar nach Zugabe von Enzym (t = 0) aufgezeichnet, dann nach 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 165, 180, 195, 210 Minuten (= 3,5 h), 4,5, 5,5, 6,5, 7,5, 8,5, 9,5, 11,5, 13,5, 15,5, 17,5, 19,5, 21,5 und 23,5 h. Der pH-Wert in dem NMR- Röhrchen wurde gemessen. Weitere Spektren wurden nach 48 und 120 h (5 Tagen) erhalten, wobei eine Portion Substrat (PA, 6 mg) zugesetzt wurde, um festzustellen, ob das Enzym seine katalytische Aktivität behielt.
Mit Hilfe einer 2D-NMR-Analyse von Inositphosphat-Mischungen, die durch partielle Verdauung von PA erhalten worden waren, in Verbindung mit veröffentlichten NMR-Daten (Scholz, P., Bergmann, G., und Mayr, G. W.: Methods in Inositide Research (Hrsg. Irvin, R. F.), S. 65-82, Raven Press, Ltd., New York (1990)), wurden charakteristische ¹H-NMR-Signale identifiziert, die Ins(1,2,3,4,5,6)P&sub6; (PA), Ins(1,2,4,5,6)P&sub5;, Ins(1,2,3,4,5)P&sub5;, Ins(1,2,5,6)P&sub4;, Ins(1,2,6)P&sub3;, Ins(1,2)P&sub2; und Ins(2)P zuzuordnen waren, und erlaubten eine relative Quantifizierung dieser Spezies im Verlauf der Reaktion.
Übereinandergelegte Diagramme von Produktprofilen für die Aspergillus-Phytase und die Peniophora-Phytase, die 24 h Reaktionszeit bei pH 5,5 abdecken, sind in Fig. 6 bzw. Fig. 7 dargestellt.
Das Signal bei δ 3,25 (t) repräsentiert H-5 in Ins(1,2)P&sub2;, wohingegen das Signal bei δ 3,18 (t) H-5 in Ins(2)P repräsentiert. Ins(1,2)P&sub2; beginnt nach etwa 4 h Reaktionszeit mit der Aspergillus-Phytase und nach etwa 1 h Reaktionszeit mit der Peniophora-Phytase zu akkumulieren. Ins(2)P wird nach etwa 10 h Reaktion mit der Aspergillus-Phytase und nach etwa 3 h Reaktion mit der Peniophora-Phytase beobachtet. Nach 24 h Reaktion ist die Menge oder das Niveau an Ins(1,2)P&sub2; für beide Phytasen sehr niedrig, wohingegen die Menge Dir Ins(2)P für beide Phytasen nach 24 h maximal ist.
Dementsprechend demonstrieren die nach 24 h Reaktionszeit beobachteten Profile, daß beide Phytasen PA zu Ins(2)P abbauen.
Für beide Enzyme umfaßte die Reaktionsmischung nach 24 h neben Ins(2)P kleinere Mengen an Ins(1,2)P&sub2;. Verlängerte Reaktionszeiten (mehrere Tage) führten zum Verschwinden des restlichen Ins(1,2)P&sub2;, die vollständig dephosphorylierte Spezies, Inosit (Ins), wurde jedoch überhaupt nicht beobachtet. Diese Beobachtung wird durch eine irreversible Hemmung/Denaturierung des Enzyms nicht erklärt, da die Enzyme ihre katalytischen Aktivitäten über längere Zeiträume behielten, wie demonstriert durch ihr Vermögen zur Verdauung von frischen Portionen von PA, die den NMR-Röhrchen zugesetzt wurden, nachdem sie 5 Tage lang bei Raumtemperatur gehalten worden waren.
In nunmehriger Bezugnahme auf Fig. 8 und 9, diese stellen die Profile, welche sich bei pH 5,5 während der ersten 4,5 h entwickeln, detaillierter dar. Aus Fig. 10 ist zu schließen, daß H-3 in Ins(1,2,4,5,6)P&sub5; (als A bezeichnet) ein Signal bei 6 3,66 (d) zeigt, H-6 in Ins(1,2,3,4,5)P&sub5;(B) ein Signal bei δ 3,87 (t) und H-3 in Ins(1,2,5,6)P&sub4; (C) ein Signal bei δ 3,56 (dd). Nun entspricht Verbindung A der Hydrolyse eines Phosphats in Position 3, B in Position 6 und C in Position 3 und 4.
Aus Fig. 8 ist ersichtlich, daß bei Verwendung der Aspergillus-Phytase Verbindung A als das primäre Hauptprodukt auftritt (t = 5 Min.), wohingegen Verbindung B nicht auftritt. Verbindung C tritt nach 20-25 Minuten auf.
Aus Fig. 9 (die Peniophora-Phytase) ist zu schließen, daß bei Verwendung der Peniophora-Phytase Verbindung B als das primäre Hauptprodukt erscheint (t = 5 Min.)
Die Signale bei δ 4,82 (dt, H-2), 4,38 (q, H-4/H-6), 4,13 (q, H-5) und 4,11 (dt, H1/H3) sind dem Substrat Phytinsäure, PA, zuzuordnen. Aus dem Vergleich von Fig. 8 und 9 ist ersichtlich, daß diese Peaks bei der Peniophora-Phytase schneller verschwinden als bei der Aspergillus-Phytase.
Diese Unterschiede werden in Fig. 10a betont, welche die Profile darstellt, die nach 20 Minuten bei pH 5,5 beobachtet werden, wobei die oben angegebenen diagnostischen Signale (A, B, C) gekennzeichnet sind.
Fig. 1 Ob zeigt das Endergebnis (unter diesen Bedingungen) der Hydrolyse von Phytinsäure bei pH 5,5 (d. h., entsprechend der oberen Linie von Fig. 6 und 7). Alle Signale, die bei dem oberen Peniophora-Ausführungsbeispiel gekennzeichnet sind, repräsentieren die Verbindung Ins(2)P, nämlich die Protonen davon, von rechts nach links: H-5, H1 und H3, H4 und H6 und schließlich H-2. Relative Intensität: 1 : 2 : 2 : 1. Die entsprechenden Signale werden in dem unteren Aspergillus- Ausführungsbeispiel gefunden. Dies bedeutet, daß das Endprodukt in beiden Ausführungsbeispielen Ins(2)P ist. Jedoch wird auch eine kleinere Menge an Ins(1,2)P&sub2; in beiden Ausführungsbeispielen gefunden, wobei die entsprechenden Peaks nur bei dem Aspergillus-Ausführungsbeispiel angezeigt sind.
Ausgeprägte Unterschiede werden beobachtet:
Aspergillus: Das erste Hauptprodukt wurde identifiziert als Ins(1,2,4,5,6)P&sub5; (A), gefolgt vom Auftreten von Ins(1,2,5,6)P&sub4; (C) und Ins(1,2,6)P&sub3; (D) (H-3 bei δ 3,49 (dd) nach 1 1/2 h), entsprechend der aufeinanderfolgenden Entfernung der Phosphatgruppen in den 3-, 4- und 5-Positionen. Die Konzentration an Ins(1,2)P&sub2; (E) baut sich langsam auf, beginnend bei 4 h, und nimmt sehr steil zwischen 12 und 14 h mit einer begleitenden schnellen Erhöhung des Ins(2)P (F)-Niveaus ab. Dies ist in Fig. 11 sichtbar gemacht, welche die zeitabhängige Konzentration an Ins(1,2)P&sub2; bzw. Ins(2)P, darstellt, bestimmt durch Messung der Fläche unter den Signalen, die H-5 in Ins(1,2)P&sub2; (δ 3,25 (t)) bzw. Ins(2)P (δ 3,18 (t)) entsprechen, bezogen auf die Fläche unter den Signalen, die den Substraten entsprechen (t = 0).
Peniophora: Bei pH 5,5 wird zuerst nur die 6-Position angegriffen. Ein charakteristisches Merkmal ist, daß im Vergleich zur Aspergillus-Phytase PA mit einer schnelleren Geschwindigkeit verdaut wird. Weitere charakteristische Merkmale sind, daß das Endprodukt Ins(2)P (F) sehr früh erscheint (3 h) und sich langsam aufbaut, im Gegensatz zu der sehr steilen Erhöhung des Ins(2)P-Niveaus gegen Ende der Reaktion, welche für die Aspergillus-Phytase beobachtet wird.
Fig. 10c ist ein ähnliches Diagramm wie Fig. 10a, jedoch bei pH 3,5. Überraschenderweise zeigt sich bei diesem pH-Wert, daß die Peniophora-Phytase eine hohe Anfangsaffinität für sowohl die 6- als auch die 3-Position von PA aufweist (es werden sowohl B als auch A beobachtet), wahrscheinlich mit einer leichten Präferenz für die 6-Position.
Die produzierten Daten erlauben u. a. die folgenden Schlußfolgerungen:
Die Aspergillus-Phytase greift sowohl bei pH 5,5 als auch pH 3,5 mit einem hohen Selektivitätsgrad PA in der 3-Position an, wohingegen die Peniophora- Phytase bei pH 5,5 mit einem hohen Selektivitätsgrad PA in der 6-Position angreift, bei pH 3,5 scheint sie jedoch die Phosphatgruppen an den 3- und 6- Positionen mit vergleichbaren Geschwindigkeiten zu hydrolysieren.
Bei pH 5,5 verdaut die Peniophora-Phytase PA im Vergleich zu der Aspergillus- Phytase mit einer schnelleren Geschwindigkeit.
Das Endprodukt ist unter den angewandten Bedingungen sowohl bei pH 3,5 als auch bei pH 5,5 Ins(2)P (F).
Die Gesamtreaktionsgeschwindigkeiten (PA → Ins(2)P) waren vergleichbar, etwa 20 h (Fig. 11; pH 5,5).
Dementsprechend erwies sich die Aspergillus-Phytase als eine im wesentlichen reine 3-Phytase, wohingegen die Peniophora-Phytase bei pH 5,5 eine im wesentlichen reine 6-Phytase und bei pH 3,5 eine Phytase von bisher unbekanntem Typ, nämlich eine 3+6-Phytase, zu sein scheint.

BEISPIEL 6

Vergleichender Assay, Freisetzung von anorganischem Phosphat aus Mais durch Aspergillus- und Peniophora-Phytase

Das vorliegende Beispiel präsentiert einen einfachen Assay für die Phytasekatalysierte Freisetzung von Phosphor aus Mais bei pH 3,5 und 5, 5. Es wurde hauptsächlich zwei Parametern - Geschwindigkeit und Niveau der P-Freisetzung - Aufmerksamkeit geschenkt.

Materialien und Methoden:

Mais wurde von der North Carolina State University (Probe Nr. R27) erhalten und in einer Mühle (Bühler Universal) bei Einstellung 6.8 gemahlen.
Eine Mais-Suspension (16,7% Gew./Gew.) wurde durch Einwiegen von 20 g gemahlenem Mais in eine 250-ml-Flasche mit blauem Deckel und Zugabe von 100 ml Puffer hergestellt.
Es wurde der folgende Puffer eingesetzt: pH 5,5 : 0,22 M Acetat-Puffer Der pH-Wert von 3,5 wurde mittels 8 N HCl/NaOH eingestellt.
Getestete Enzyme: Es wurden zwei Phytasen getestet: Eine im Handel erhältliche Phytase von Aspergillus niger (Phytase Novo®) und eine Peniophora-Phytase der Erfindung, gereinigt wie in Beispiel 3 und 4 beschrieben.
Dosierung: Alle Enzyme wurden mit 25 FYT/20 g Mais (entsprechend 1250 FYT/kg) eingesetzt.
Die Flaschen mit der Mais-Suspension wurden mit Deckel verschlossen und sofort in ein Wasserbad bei 37ºC gestellt und konstantem Rühren unterworfen. Der pH-Wert wurde in diesem Stadium und wiederum nach 24 h gemessen. Nach 30 Minuten Rühren wurde eine Probe von 5 ml gewonnen.
Dann wurden die Phytase-Enzyme in einer Dosierung von 25 FYT/20 g Mais zugesetzt.
Proben wurden dann 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 und 120 Min. nach der Zugabe der Phytasen genommen und der Gehalt an freigesetztem P wie folgt bestimmt:
Phytase-enthaltende Proben wurden 1+4 in Puffer verdünnt. Dann wurden die Proben 5 Minuten lang mit 3000 UpM zentrifugiert und 1,0 ml des Überstands gewonnen. 2,0 ml Puffer und 2,0 ml MoV-Stoplösung (vgl. den FYT-Assay von Beispiel 6) wurden zugegeben. Die Proben wurden bei 3-5ºC in einen Kühlschrank gestellt, bis alle Proben mit dem Spektralphotometer bei 415 nm gemessen werden konnten.
Der pH-Wert wurde zum Zeitpunkt 0 und nach 20 h gemessen.
Für die Bestimmungen wurde eine Phosphatstandard- oder Stammlösung von 50 mM vorbereitet verwendet. 0,5, 1,0, 1,5 und 2,0 ml Stammlösung werden mit Hilfe von Puffer auf ein Gesamtvolumen von 50 ml verdünnt. 3,0 ml einer jeden Lösung werden zu 2,0 ml MoV-Stoplösung zugegeben.
Es wurden zwei Experimente durchgeführt: bei pH 5,5 und bei pH 3,5. Die Analyseergebnisse sind in Fig. 12 und 13 (pH 5,5 bzw. 3,5) dargestellt. In diesen Figuren repräsentiert das Symbol " " das Kontrollexperiment, " " die Peniophora- Phytase und " " die Aspergillus-Phytase.

Resultate und Diskussion:

Fig. 12 (pH 5,5) zeigt, daß bei diesem pH-Wert die Peniophora-Phytase P aus Mais im Vergleich zu der Aspergillus-Phytase mit signifikant erhöhter Geschwindigkeit freisetzt.
Aus Fig. 13 (pH 3,5) ist klar ersichtlich, daß bei diesem pH-Wert die Peniophora- Phytase bei der Freisetzung von Phosphor aus gemahlenem Mais im Vergleich zu der Aspergillus-Phytase viel schneller ist (0-120 Min.).
Die Passagezeit durch das Verdauungssystem von beispielsweise (Brat)hühnchen ist normalerweise in der Größenordnung von 30 Minuten bis 2 h, so daß der beobachtete Unterschied, bei welchem pH-Wert auch immer, sicherlich von Bedeutung ist. Nichtsdestoweniger ist der pH-Wert von 3,5 in dieser Hinsicht relevanter als der pH-Wert 5,5.
Dies impliziert, daß das Peniophora-Enzym als P-Freisetzungsmittel in dem Verdauungssystem von beispielsweise (Brat)hühnchen überraschenderweise effizienter ist als die bekannte Aspergillus-Phytase.

SEQUENZVERZEICHNIS

SEQ-ID-NR. 1 zeigt eine klonierte DNA-Sequenz der Erfindung, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Enzym kodiert, welches Phytase-Aktivität aufweist.

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1320 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Peniophora lycii
(B) STAMM: CBS 686.96
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1320
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 1:
SEQ-ID-NR. 2 zeigt die Aminosäuresequenz einer Phytase der Erfindung.

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 439 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 2:

Claims

1. Isoliertes Polypeptid, welches Phytase-Aktivität aufweist und

(i) die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 oder die Sequenz der Aminosäure-Nrn. 31 bis 439 davon; oder

(ii) eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70% homolog zu einer der Sequenzen von (i) ist, umfaßt; oder

das Polypeptid kodiert wird von

(iii) der DNA-Sequenz von SEQ-ID-Nr. 1 oder der DNA-Sequenz der Nukleotid-Nrn. 91-1317 davon; oder

(iv) der DNA-Sequenz, die in das in Escherichia coli DSM 11312 vorliegende Plasmid pYES 2.0 kloniert wurde; oder

(v) einer DNA-Sequenz, die zu mindestens 70% homolog zu einer der Sequenzen von (iii) oder (iv) ist.

2. Klonierte DNA-Seqenz, kodierend für ein Polypeptid, das Phytase-Aktivität aufweist, und umfassend eine DNA-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) der DNA-Sequenz von SEQ-ID-NR. 1;

(b) der DNA-Sequenz, die in das in Escherichia coli DSM 11312 vorliegende Plasmid pYES 2.0 kloniert wurde;

(c) den Nukleotid-Nrn. 91-1317 einer der Sequenzen von (a) oder (b); oder

(d) einer DNA-Sequenz, die zu mindestens 70% homolog zu einer der Sequenzen von (a), (b) oder (c) ist; oder

(e) einer DNA-Sequenz, die zur Hybridisierung mit den DNA- Sequenzen von (a), (b) oder (c) unter Bedingungen von mittlerer/hoher Stringenz in der Lage ist; oder

(f) einer DNA-Sequenz, welche für ein Polypeptid kodiert, das die in SEQ-ID-NR. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder die Sequenz der Aminosäure-Nrn: 31 bis 439 davon umfaßt.

3. Vektor, umfassend die klonierte DNA-Sequenz nach Anspruch 2.

4. Wirtszelle, umfassend die klonierte DNA-Sequenz nach Anspruch 2 oder den Vektor nach Anspruch 3.

5. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das Phytase-Aktivität aufweist, welches Verfahren die Kultivierung der Zelle nach Anspruch 4 unter Bedingungen, welche die Produktion des Polypeptids gestatten, und die Gewinnung des Polypeptids aus der Kulturbouillon umfaßt.

6. Verfahren zur Herstellung eines Futters oder Nahrungsmittels, worin mindestens ein Polypeptid nach Anspruch 1 den Nahrungsmittel- oder Futterkomponenten zugesetzt wird.

7. Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 1.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, welche ein Futter, ein Nahrungsmittel oder ein Additiv für Futter oder Nahrungsmittel ist.

9. Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 1 zur Freisetzung von anorganischem Phosphat aus Phytinsäure.