DE69636232T2

DE69636232T2 - Wachstumsfaktor HTTER36

Info

Publication number: DE69636232T2
Application number: DE69636232T
Authority: DE
Inventors: R. Daniel Centreville SOPPET; Haodong Gaithersburg LI
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1996-03-26
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2016-03-27
Also published as: ES2264564T3; EP0891372A1; CA2248318A1; EP0891372A4; DE69636232D1; AU5527296A; EP0891372B1; WO1997035870A1; JP2000506371A

Description

Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, von solchen Polynucleotiden codierte Polypeptide, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide, ebenso wie die Produktion solcher Polynucleotide und Polypeptide. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wurde als ein mutmaßlicher menschlicher transformierender Wachstumfaktor identifiziert. Spezieller wurde das Polypeptid der vorliegenden Erfindung als ein mutmaßliches Mitglied der Super-Familie von transformierendem Wachstumfaktor-Beta identifiziert und wird hier nachstehend manchmal als "HTTER36" bezeichnet. Die Erfindung betrifft auch die Inhibierung der Wirkung solcher Polypeptide.
Diese Erfindung betrifft ein Polynucleotid und Polypeptidmoleküle, die strukturell und funktionell verwandt sind mit TGF-β. Die Peptidwachstumfaktoren-Familie von transformierendem Wachstumfaktor-beta umfaßt fünf Mitglieder, die als TGF-β1 bis TGF-β5 bezeichnet werden, die alle Homodimere von etwa 25 kd bilden. Die TGF-β-Familie gehört zu einer größeren, ausgedehnten Superfamilie von Peptidsignalmolekülen, die die Muellersche inhibierende Substanz (Cate, R. L. et al., Cell, 45:685–698 (1986)), Decapentaplegic (Padgett, R. W. et al., Nature, 325:81–84 (1987)), knochenmorphogene Faktoren (Wozney, J. M. et al., Science, 242:1528–1534 (1988)), vg1 (Weeks, D. L., und Melton, D. A., Cell, 51:861–867 (1987)), Activine (Vale, W. et al., Nature, 321:776–779 (1986)) und Inhibine (Mason, A. J., et al., Nature, 318:659–663 (1985)) umfaßt. Diese Faktoren sind in ihrer Gesamtstruktur dem TGF-β ähnlich, sind aber bei den Aminosäuren nur zu etwa 25% identisch mit den TGF-β-Proteinen und untereinander. Man glaubt, daß alle diese Moleküle wichtige Rollen bei der Modulation von Wachstum, Entwicklung und Differenzierung spielen. Das Protein der vorliegenden Erfindung, PGF, behält die sieben konservierten Cysteinreste in der C-terminalen, aktiven Domäne von TGF-β.
TGF-β wurde ursprünglich als ein Faktor beschrieben, der normale Rattennierenfibroblasten in weichem Agar in der Gegenwart von epidermalem Wachstumfaktor zur Proliferation induzierte (Roberts, A. B. et al., PNAS USA, 78:5339–5343 (1981)). Anschließend wurde von TGF-β gezeigt, daß es eine Reihe von verschiedenen Effekten bei einer Vielzahl von Zellen ausübt. Zum Beispiel kann TGF-β die Differenzierung von gewissen Zellen mesodermalem Ursprungs inhibieren (Florini, J. R. et al., J. Biol. Chem., 261: 1659–16513 (1986)), induzierte die Differenzierung von anderen (Seyedine, S. M. et a., PNAS USA, 82:2267–2271 (1985)), und kann die Proliferation verschiedener Typen von Epithelzellen potent inhibieren (Tucker, R. F., Science, 226:705–707 (1984)). Diese letzte Aktivität hat zu der Spekulation geführt, daß eine wichtige physiologische Rolle für TGF-β die Aufrechterhaltung des unterdrückten Wachstumsstadiums bei vielen Typen von Zellen ist. Dementsprechend zeigen Zellen, die die Fähigkeit der Reaktion auf TGF-β verlieren, wahrscheinlicher unkontrolliertes Wachstum und bilden wahrscheinlicher Turmore. Tatsächlich fehlen gewissen Tumoren wie z.B. Retinoblastomen nachweisbare TGF-β-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche und sie reagieren nicht auf TGF-β, während ihre normalen Gegenstücke bei ihrem Wachstum eigene Oberflächenrezeptoren exprimieren und durch TGF-β potent inhibiert werden (Kim Chi, A. et al., Science, 240:196–198 (1988)).
Genauer gesagt stimuliert TGF-β1 das verankerungsunabhängige Wachstum von normalen Rattennierenfibroblasten (Robert et al., PNAS USA, 78:5339–5343 (1981)). Seitdem wurde gezeigt, daß es ein multifunktioneller Regulator von Zellwachstum und Differenzierung ist (Sporn et al., Science, 233:532–534 (1986)), der zu solch diversen Effekten in der Lage ist wie der Inhibierung des Wachstums von mehreren menschlichen Krebszelllinien (Roberts et al., PNAS-USA, 82:119–123 (1985)), von Mauskeratinocyten (Coffey et al., Cancer Res., 48:1596–1602 (1988)) und T- und B-Lymphocyten (Kehr) et al., J. Exp. Med., 163:1037–1050 (1986)). Er inhibiert auch die Proliferation von frühen hämatopoietischen Vorläuferzellen (Goey et al., J. Immunol., 143:877–880 (1989)), stimuliert die Induzierung der Differenzierung von mesenchymalen Zellen des Rattenmuskels und die anschließende Produktion von knorpelspezifischen Makromolekülen (Seyedine et al., J. Biol. Chem., 262:1946–1949 (1986)), verursacht die erhöhte Synthese und Sekretion von Kollagen (Ignotz et al., J. Biol. Chem., 261:4337–4345 (1986)), stimuliert die Knochenbildung (Noda et al., Endocrinology, 124:2991–2995 (1989)) und beschleunigt die Heilung von Schnittwunden (Mustoe et al., Science, 237:1333–1335 (1987)).
Darüber hinaus stimuliert TGF-β1 die Bildung von extrazellulären Matrixmolekülen in der Leber und Lunge. Wenn die Niveaus an TGF-β1 höher als normal sind, tritt die Bildung von Faser in der extrazellulären Matrix von Leber und Lunge auf, was tödlich sein kann. Hohe Spiegel von TGF-β1 treten bei Chemotherapie und Knochenmarktransplantat als versuchter Krebsbehandlung auf, z.B. bei Brustkrebs.
Ein zweites Protein mit der Bezeichnung TGF-β2 wurde von mehreren Quellen isoliert, einschließlich entmineralisiertem Knochen, einer menschlichen prostatischen Adenocarcinom-Zelllinie (Ikeda et al., Bio.Chem., 26:2406–2410 (1987)). TGF-β2 teilte mehrere funktionelle Ähnlichkeiten mit TGF-β1. Von diesen Proteinen ist nun bekannt, daß sie Mitglieder einer Familie von verwandten, Wachstum modulierenden Proteinen sind, einschließlich TGF-β3 (Ten-Dijke et al., PNAS, USA, 85:471–4719 (1988)), der Muellerschen inhibitorischen Substanz und der Inhibine. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wurde als ein wahrscheinliches Mitglied dieser Familie von verwandten, Wachstum modulierenden Proteine identifiziert.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden neue reife Polypeptide bereitgestellt. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind menschlichen Ursprungs.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, einschließlich mRNAs, cDNAs, genomischer DNAs.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, das ein reifes Polypeptid codiert, das von der menschlichen cDNA exprimiert wird, die in der ATCC-Hinterlegung No. 97349 enthalten ist.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren für die Produktion eines solchen Polypeptids mittels rekombinanter Techniken bereitgestellt, welche die Züchtung von rekombinanten prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen umfassen, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren für die Verwendung solcher Polypeptide bereitgestellt, oder der Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren, um das zelluläre Wachstum und die zelluläre Differenzierung zu stimulieren.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäuresonden bereitgestellt, die Nucleinsäuremoleküle ausreichender Länge für die spezifischen Hybridisierung mit den Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antikörper gegen solche Polypeptide bereitgestellt.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antagonisten solcher Polypeptide bereitgestellt, die verwendet werden können, um die Wirkung solcher Polypeptide zu inhibieren, zum Beispiel bei der Behandlung von Neoplasie von Zellen, deren Wachstum durch die Polypeptide der vorliegenden Erfindung stimuliert wird, und bei der Prävention der Bildung von extrazellulären Matrixmolekülen in der Leber und Lunge.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Tests für den Nachweis von Krankheiten bereitgestellt, die mit der Überexpression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und Mutationen bei den Nucleinsäuresequenzen zusammenhängen, die ein solches Polypeptid codieren.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verwendung solcher Polypeptide oder der Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren, für in vitro-Zwecke in Zusammenhang mit wissenschaftlicher Forschung, der Synthese von DNA und der Herstellung von DNA-Vektoren bereitgestellt.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten durch die Lehren hierin dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet offensichtlich sein. Die folgenden Abbildungen sind illustrativ für Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht als beschränkend für den Umfang der Erfindung gedacht, wie sie von den Ansprüchen umfaßt wird.
1 stellt die cDNA-Sequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz von HTTER36 dar. Es wird die Standard- Einbuchstabenabkürzung für Aminosäuren verwendet. Die vermutliche Signalsequenz wurde unterstrichen.
2 ist eine Darstellung von vergleichbarer Aminosäuresequenzhomologie zwischen HTTER36 (obere Zeile) und vermutlichem transformierendem Wachstumsfaktor-beta von Mus musculus, "GDF-3" (SEQ ID NO:9).
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure (Polynucleotid) bereitgestellt, die das reife Polypeptid codiert, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO:2) hat.
Das Polynucleotid dieser Erfindung wurde in der cDNA-Bibliothek eines menschlichen Hodentumors entdeckt. Es ist strukturell mit der TGFβ-Gensuperfamilie verwandt. Es enthält einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid von 364 Aminosäuren codiert, von denen die ersten 16 Aminosäuren vermutlich eine Leadersequenz sind, die nächsten 234 Aminosäuren eine Prosequenz sind und die letzten 114 Aminosäuren die aktive Region sind. HTTER36 zeigt auf der Ebene der Aminosäuren das höchste Ausmaß an Homologie mit GDF-3 mit 69% Identität und 80% Ähnlichkeit.
Die ersten 16 Aminosäuren stellen vermutlich einen Transmembranteil dar, von dem man annimmt, daß er notwendig ist, um das Polypeptid zu einer speziellen Zielregion zu leiten, damit es seine biologischen Funktionen ausüben kann, wie hier nachstehend beschrieben. Der Transmembranteil kann auch von dem Polypeptid abgespalten werden.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Polynucleotide bereitgestellt, die ein reifes Polypeptid codieren, das von der menschlichen cDNA exprimiert wird, die in der ATCC-Hinterlegung Nr. 97349 enthalten ist, die am 28. November 1995 bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt wurde. Das hinterlegte Material ist ein pBluescript SK(+)-Plasmid, das die HTTER36-cDNA voller Länge enthält, bei der Hinterlegung als "PF230" bezeichnet.
Die Hinterlegung wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke eines Patentierungsverfahrens vorgenommen. Der Stamm wird nach Erteilung des Patents unwiderruflich und ohne Einschränkungen oder Bedingungen der Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt. Für die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf des hinterlegten Materials kann eine Lizenz erforderlich sein und hiermit wird eine solche Lizenz nicht eingeräumt. Ein Bezug auf "Polynucleotide" in dieser Beschreibung umfaßt die DNA der vorstehend erwähnten Hinterlegung.
Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in der Form von RNA sein oder in der Form von DNA, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA umfaßt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und, wenn einzelsträngig, kann sie der codierende Strang oder der nicht-codierende (Antisense-) Strang sein. Die codierende Sequenz, die das reife Polypeptid codiert, kann identisch sein mit der codierenden Sequenz, die in 1 (SEQ ID NO:1) gezeigt ist, oder sie kann eine unterschiedliche codierende Sequenz sein, wobei die codierende Sequenz als Ergebnis der Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes das selbe reife Polypeptid codiert wie die DNA von 1 (SEQ 1D NO:1).
Das Polynucleotid, das das reife Polypeptid von 1 (SEQ ID NO:2) codiert, kann umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt: nur die codierende Sequenz für das reife Polypeptid; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und zusätzliche codierende Sequenzen wie eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Proproteinsequenz; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid (und gegebenenfalls zusätzliche codierende Sequenzen) und eine nicht codierende Sequenz wie Introns oder eine nicht codierende Sequenz 5' und/oder 3' von der codierenden Sequenz für das reife Polypeptid.
Somit umfaßt der Ausdruck "Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert" ein Polynucleotid, welches nur die codierende Sequenz für das Polypeptid umfaßt, ebenso wie ein Polynucleotid, welches zusätzliche codierende und/oder nicht codierende Sequenzen umfaßt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin Varianten der hier vorstehend beschriebenen Polynucleotide, welche Fragmente, Analoga und Derivate des Polypeptids codieren, welches die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO:2) hat. Die Variante des Polynucleotids kann eine natürlicherweise vorkommende allelische Variante des Polynucleotids oder eine nicht natürlicherweise vorkommende Variante des Polynucleotids sein.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die das selbe reife Polypeptid codieren, wie es in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt ist, ebenso wie Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten ein Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptids von 1 (SEQ ID NO:2) codieren. Solche Nucleotidvarianten umfassen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten.
Wie im Stand der Technik bekannt, ist eine allelische Variante eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotiden haben kann, welche die Funktion des codierten Polypeptids nicht substantiell ändert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Polynucleotide, bei denen die codierende Sequenz für das reife Polypeptid in demselben Leserahmen mit einer Polynucleotidsequenz fusioniert sein kann, die bei der Expression und Sekretion eines Polypeptids aus einer Wirtszelle hilft, zum Beispiel einer Leadersequenz, die als eine sekretorische Sequenz für die Steuerung des Transports eines Polypeptids aus einer Zelle funktioniert. Das Polypeptid, das eine Leadersequenz hat, ist ein Präprotein und die Leadersequenz kann durch die Wirtszelle abgespalten werden, um die reife Form des Polypeptids zu bilden. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, welches das reife Protein ist plus zusätzlicher 5'-Aminosäurereste. Ein reifes Protein, das eine Prosequenz hat, ist ein Proprotein und ist eine inaktive Form des Proteins. Wenn die Prosequenz abgespalten wird, verbleibt ein aktives reifes Protein. Somit kann zum Beispiel das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ein reifes Protein, oder ein Protein, das eine Prosequenz hat, oder ein Protein, das eine Prosequenz und eine Präsequenz (Leadersequenz) hat, codieren.
Bei den Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung kann auch die codierende Sequenz im Rahmen mit einer Markersequenz fusioniert sein, die die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zuläßt. Die Markersequenz kann ein hexa-Histidinschwanz sein, wie er in einem pQE-Vektor bereitgestellt wird, um die Reinigung des reifen Polypeptids bereitzustellen, das im Falle eines bakteriellen Wirts mit dem Marker fusioniert ist, oder die Markersequenz kann zum Beispiel ein Hämagglutinin(HA)-Schwanz sein, wenn ein Säugerwirt verwendet wird, z.B. COS-7-Zellen. Der HA-Schwanz entspricht einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutininprotein abgeleitet ist (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)).
Der Ausdruck "Gen" bedeutet das Segment von DNA, das in die Produktion von Polypeptidketten involviert ist; es umfaßt Regionen, die der codierenden Region vorausgehen oder folgen (Leader und Trailer), ebenso wie intervenierende Sequenzen (Introns) zwischen einzelnen codierenden Segmenten (Exons).
Fragmente des Gens voller Länge für HTTER36 können auch als eine Hybridisierungssonde für eine cDNA-Bibliothek verwendet werden, um das Gen voller Länge zu isolieren und um andere Gene zu isolieren, die mit dem Gen eine hohe Sequenzähnlichkeit oder eine ähnliche biologische Aktivität haben. Sonden dieser Art haben vorzugsweise mindestens 15 Basen, mehr bevorzugt mindestens 30 Basen und können sogar noch mehr bevorzugt zum Beispiel mindestens 50 Basen oder mehr enthalten. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen cDNA-Clon, der einem Transkript voller Länge entspricht, und einen genomischen Clon oder genomische Clone zu identifizieren, die das komplette HTTER36-Gen enthalten, einschließlich regulatorischer und Promotorregionen, Exons und Introns. Ein Beispiel für eine Durchmusterung umfaßt die Isolierung der codierenden Region des Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz für die Synthese einer Oligonucleotidsonde. Markierte Oligonucleotide, die eine Sequenz haben, die komplementär ist zu der des Gens der vorliegenden Erfindung, werden verwendet, um eine Bibliothek von menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu durchmustern, um zu bestimmen, mit welchen Mitgliedern der Bibliothek die Sonde hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Polynucleotide, die mit den hier vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, wenn zwischen den Sequenzen mindestens 90% und mehr bevorzugt mindestens 95% Identität besteht. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hier vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "stringente Bedingungen", daß die Hybridisierung nur dann eintritt, wenn zwischen den Sequenzen mindestens 95% und mehr bevorzugt mindestens 97% Identität besteht. Die Polynucleotide, die bei einer bevorzugten Ausführungsform mit den hier vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren, codieren Polypeptide, die im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid behalten, das von der cDNA von 1 (SEQ ID NO:1) codiert wird.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die mindestens 90% und mehr bevorzugt mindestens 95% Identität mit dem Polynucleotid haben, das das Polypeptid von SEQ ID NO:2 codiert, und Polynucleotide, die dazu komplementär sind, und die Polypeptide, die von solchen Polynucleotiden codiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO:2) hat, ebenso wie Fragmente, Analoga und Derivate von einem solchen Polypeptid.
Wenn sie das Polypeptid von 1 (SEQ ID NO:2) betreffen, bedeuten die Ausdrücke "Fragment", "Derivat" und "Analogon" ein Polypeptid, das im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität innehat wie ein solches Polypeptid. Somit umfaßt ein Analogon ein Proprotein, das durch Abspaltung des Proproteinteils, wodurch ein aktives reifes Polypeptid produziert wird, aktiviert werden kann.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid, vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid, sein.
Das Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptids von 1 (SEQ ID NO:2) kann (i) eines sein, bei dem ein oder mehrere der Aminosäurereste durch einen konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einen konservierten Aminosäurerest) substituiert sind und ein solcher substituierter Aminosäurerest kann einer sein, der durch den genetischen Code codiert wird oder auch nicht, oder (ii) eines, bei dem ein oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe umfassen, oder (iii) eines, bei dem das reife Polypeptid fusioniert ist mit einer anderen Verbindung wie einer Verbindung zur Erhöhung der Halbwertszeit des Polypeptids (zum Beispiel Polyethylenglycol), oder (iv) eines, bei dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, wie eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die für die Reinigung des reifen Polypeptids oder einer Proproteinsequenz verwendet wird. Es ist anzunehmen, daß solche Fragmente, Derivate und Analoga nach den Lehren hierin im Kenntnisstand des Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet sind.
Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und werden vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt,
Der Ausdruck "isoliert" bedeutet, daß das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung (d.h. seiner natürlichen Umgebung, wenn es natürlicherweise vorkommt) entfernt wurde. Zum Beispiel ist ein natürlicherweise vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert, aber dasselbe Polynucleotid oder Polypeptid, das von einem Teil oder dem gesamten coexistierenden Material in dem natürlichen System getrennt wurde, ist isoliert. Solche Polynucleotide könnten Teil eines Vektors und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide könnten Teil einer Zusammensetzung sein und dennoch isoliert sein, weil ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil ihrer natürlichen Umgebung sind.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen das Polypeptid von SEQ ID NO:2 (insbesondere das reife Polypeptid) ebenso wie Polypeptide, die mindestens 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt mindestens 90% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO:2 haben und noch mehr bevorzugt mindestens 95% Ähnlichkeit ( noch mehr bevorzugt mindestens 95% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO:2 haben.
Wie im Stand der Technik bekannt ist, wird "Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden bestimmt durch den Vergleich der Aminosäuresequenz und ihrer konservierten Aminosäuresubstitutionen von einem Polypeptid mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids.
Fragmente oder Teile der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können für die Produktion der entsprechenden Polypeptide voller Länge mittels Peptidsynthese verwendet werden; daher können die Fragmente als Zwischenstufen bei der Produktion der Polypeptide voller Länge verwendet werden. Die Fragmente oder Teile der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können für die Synthese der Polynucleotide voller Länge der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die mit den Vektoren der vorliegenden Erfindung gentechnisch verändert wurden, und die Produktion der Polypeptide der Erfindung mit rekombinanten Techniken.
Die Wirtszellen werden mit den Vektoren dieser Erfindung gentechnisch verändert (transduziert oder transformiert oder transfiziert), welche zum Beispiel ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können. Der Vektor kann zum Beispiel in der Form eines Plasmids, eines viralen Partikels, eines Phagen usw. sein. Die veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet werden, die gegebenenfalls modifiziert sind, um Promotoren zu aktivieren, Transformanten zu selektieren oder die Gene der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren. Die Züchtungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und dergleichen sind diejenigen, die auch zuvor bei den zur Expression selektierten Wirtszellen verwendet wurden, wie dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt ist.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können für die Produktion der Polypeptide mit rekombinanten Techniken verwendet werden. So kann zum Beispiel das Polynucleotid in jedem einer Vielzahl von Expressionsvektoren für die Expression eines Polypeptids enthalten sein. Solche Vektoren umfassen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z.B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefeplasmide; Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitet sind, virale DNA wie Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudorabies. Jeder Vektor kann jedoch nur insofern verwendet werden, als er in dem Wirt replizierbar und lebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann mittels einer Reihe von Verfahren in den Vektor inseriert werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) inseriert. Es ist anzunehmen, daß solche Verfahren und andere im Kenntnisstand des Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet sind.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist funktionell mit (einer) geeigneten Expressionskontrollsequenz(en) (Promotor) verknüpft, um die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele solcher Promotoren können erwähnt werden: der LTR- oder SV40-Promotor, der E. coli-lac oder -trp-Promotor, der P_L-Promotor des Phagen lambda und andere Promotoren, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomenbindungsstelle für die Translationsinitiation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen für die Amplifikation der Expression enthalten.
Außerdem enthält der Expressionsvektor vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Markergene wie Dihydrofolatreduktase oder Neomycinresistenz für die eukaryontische Zellkultur oder wie Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz bei E. coli, um eine phänotypische Eigenschaft für die Selektion von transformierten Wirtszellen bereitzustellen.
Der Vektor, der die entsprechende DNA-Sequenz, wie hier vorstehend beschrieben, ebenso wie einen geeigneten Promotor oder eine geeignete Kontrollsequenz enthält, kann verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um dem Wirt die Expression des Proteins zu ermöglichen.
Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte können erwähnt werden:
Bakterienzellen wie E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spodogtera Sf9; tierische Zellen wie CHO, COS oder Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen usw. Wir gehen davon aus, daß die Auswahl eines geeigneten Wirts aufgrund der Lehren hierin im Kenntnisstand des Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet ist.
Genauer gesagt umfaßt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte, die eine oder mehrere der Sequenzen umfassen, die vorstehend ausführlich beschrieben wurden. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung in Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung inseriert wurde. Bei einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfaßt das Konstrukt weiterhin regulatorische Sequenzen, einschließlich zum Beispiel eines Promotors, der mit der Sequenz funktionell verknüpft ist. Dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet ist eine große Anzahl an geeigneten Vektoren und Promotoren bekannt und sie ist kommerziell erhältlich. Die folgenden Vektoren werden beispielsweise bereitgestellt; bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, Phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); eukaryontisch: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Es kann jedoch jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, solange sie in dem Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
Die Promotorregionen können unter Verwendung von CAT(Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbarem Marker von jedem gewünschten Gen selektiert werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Besondere, genannte bakterielle Promotoren umfassen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, P_L, und trp. Eukaryontische Promotoren umfassen sehr frühen CMV, HSV-Thymidinkinase, frühen und späten SV40, LTRs von Retrovirus und Metallothionein-I der Maus. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors ist im Kenntnisstand des Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet.
Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie eine Säugerzelle sein, oder eine niedrigere eukaryontische Zelle wie eine Hefezelle, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie eine Bakterienzelle sein. Die Einbringung des Konstrukts in die Wirtszellen kann mittels der Calciumphosphat-Transfektion, der DEAE-Dextran vermittelten Transfektion oder der Elektroporation (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)) bewirkt werden.
Die Konstrukte in den Wirtszellen können in herkömmlicher Weise verwendet werden, um die Genprodukte zu produzieren, die von der rekombinanten Sequenz codiert werden. Alternativ können die Polypeptide der Erfindung mit herkömmlichen Peptidsynthesegeräten synthetisch produziert werden.
Die reifen Proteine können unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen exprimiert werden. Unter Verwendung von RNAs, die von den DNA-Konstrukren der vorliegende Erfindung abgeleitet sind, können auch zellfreie Translationssysteme für die Produktion solcher Proteine verwendet werden. Geeignete Clonierungs- und Expressionvektoren für die Verwendung bei prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden beschrieben von Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
Die Transkription der DNA, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, durch höhere Eukaryonten wird durch die Inserierung einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-wirkenden Elemente von DNA, üblicherweise etwa zwischen 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiel umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs bp 100 bis 270, einen frühen Promotor-Enhancer des Cytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
Im Allgemeinen werden rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker umfassen, die eine Transformation der Wirtszelle erlauben, z.B. das Ampicillinresistenzgen von E. coli und das TRP1-Gen von S. cerevisiae, und einen Promotor, der aus einem Gen mit hoher Expression abgeleitet ist, um die Transkription einer Struktursequenz stromabwärts zu steuern. Solche Promotoren können von Operons abgeleitet sein, die glycolytische Enzyme wie 3-Phosphoglyceratkinase (PGK)-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine unter anderen codieren. Die heterologe Struktursequenz wird in geeigneter Phase mit den Translationsinitiations- und Translationsterminationssequenzen zusammengebaut und vorzugsweise einer Leadersequenz, die in der Lage ist, die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium zu steuern. Gegebenfalls kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, einschließlich eines N-terminalen Identifikationspeptids, das erwünschte Charakteristika einbringt, z.B. Stabilisierung oder die einfache Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Nützliche Expressionsvektoren für die Verwendung bei Bakterien werden durch Inserierung einer Struktur-DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und Translationsterminationssignalen in funktioneller Lesephase mit einem funktionellen Promotor konstruiert. Der Vektor wird einen oder mehrere phänotypische selektierbare Marker und einen Replikationsursprung enthalten, um die Erhaltung des Vektors sicherzustellen und, wenn gewünscht, die Amplifikation in dem Wirt bereitzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl wahlweise auch andere verwendet werden können.
Als ein repräsentatives, aber nicht einschränkendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren für die Verwendung in Bakterien einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung enthalten, die von kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind, die genetische Elemente des wohlbekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Solche kommerziellen Vektoren umfassen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese "Rückgrat"-Abschnitte von pBR322 werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und dem Wachstum des Wirtsstamms bis zu einer geeigneten Zelldichte wird der ausgewählte Promotor mit geeigneten Mitteln induziert (z.B. Temperaturveränderung oder eine chemische Induktion) und die Zellen werden für einen zusätzlichen Zeitraum gezüchtet.
Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen und der resultierende Rohextrakt wird für die weitere Reinigung aufbewahrt.
Mikrobielle Zellen, die bei der Expression von Proteinen verwendet werden, können mit allen geeigneten Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich Gefrier-Auftau-Zyklen, Ultraschall, mechanischen Aufbrechens oder der Verwendung von Zellen lysierenden Mitteln, wobei solche Verfahren dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind.
Verschiedene Säugerzellkultursysteme können auch für die Expression eines rekombinanten Proteins verwendet werden. Beispiele für Säugerexpressionssysteme umfassen die COS-7-Linien von Affennierenfibroblasten, beschrieben von Gluzman, Cell, 23:175 (1981), und andere Zelllinien, die in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, zum Beispiel die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säugerexpressionsvektoren werden einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer umfassen und auch alle notwendigen Ribosomenbindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleiß-Donor- und Spleiß-Akzeptorstellen, Transkriptionsterminationssequenzen und 5' flankierende, nichttranskribierte Sequenzen. DNA-Sequenzen, die von den SV40-Spleiß- und Polyadenylierungsstellen abgeleitet sind, können zur Bereitstellung der erforderlichen, nicht-transkribierten, genetischen Elemente verwendet werden.
Die Polypeptide können mit Verfahren wie einschließlich der Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, der Säureextraktion, der Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, der Phosphocellulosechromatographie, der hydrophoben Chromatographie, der Affinitätschromatographie, der Hydoxylapatitchromatographie und der Leutinchromatographie aus rekombinanten Zellkulturen gewonnen und gereinigt werden. Wenn erforderlich können Proteinrückfaltungsschritte bei der Fertigstellung der Konfiguration des reifen Proteins verwendet werden. Letztlich kann die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) für die letzten Reinigungsschritte verwendet werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein auf natürlichem Weg gereinigtes Produkt sein oder ein Produkt von chemischen Syntheseverfahren oder mittels rekombinanter Techniken von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt produziert sein (zum Beispiel durch Bakterien, Hefe, höhere Pflanzen, Insekten und Säugerzellen in Kultur). In Abhängigkeit von dem bei dem rekombinanten Produktionsverfahren verwendeten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert sein oder sie können nicht glycosyliert sein. Die Polypeptide der Erfindung können auch am Anfang einen Methioninaminosäurerest umfassen.
Die Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung können als Forschungsreagenzien und als Materialien für die Entdeckung von Behandlungen und Diagnostica von Krankheiten des Menschen verwendet werden.
Die Spezifität von HTTER36 für Zielzellen kann als ein Mechanismus für die Zerstörung der Zielzelle verwendet werden. Zum Beispiel können HTTER36 oder lösliche Formen davon (mit einer Vielzahl von Verfahren) mit toxischen Molekülen verknüpft werden: zum Beispiel einem Radiopharmazeutikum, das Zielzellen inaktiviert. Diese Wachstumsfaktor-Toxin-Fusionen töten die Zielzelle (und in gewissen Fällen benachbarte Zellen durch eine Reihe von "Umgebungs"-Wirkungen). Ein kürzliches Beispiel für solche Toxin-Fusionsgene wurde veröffentlicht von Mesri, et al., J. Biol. Chem. 268:4853–62 (1993). HTTER36 und lösliche Fragmente davon und verwandte Moleküle können auch in Liposomen verkapselt sein und können mit Antikörpern verknüpft sein, die tumor- oder zellspezifische Antigene erkennen und daran binden und damit Mittel für das „zielgerichtetes Finden" von Zellen bereitstellen.
Auf dieselbe Weise können HTTER36 und lösliche Fragmente davon als antineoplastische Verbindungen verwendet werden, da Mitglieder dieser Familie bei transformierten Zellen anti-proliferative Wirkungen zeigen. Für die in vivo-Verwendung können die vorliegenden Polypeptide auf eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Injektion, Infusion, topisch, parenteral, usw. Die Verabreichung kann in jedem physiologisch verträglichen Träger sein, einschließlich phosphatgepufferter Salzlösung, Salzlösung, sterilisiertem Wasser usw.
Eine wichtige Behandlung unter Einschluß von HTTER36 und löslichen Fragmenten davon betrifft die Wundheilung. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können bei der Behandlung einer Vielzahl von Wunden verwendet werden, einschließlich im Wesentlichen aller kutanen Wunden, Wunden der Augenhornhaut und der Verletzungen der mit einem Epithel versehenen hohlen Organe des Körpers. Für die Behandlung geeignete Wunden umfassen diejenigen, die von einem Trauma wie Verbrennungen, Abschürfungen und Schnitten ebenso wie von chirurgischen Verfahren wie chirurgischen Schnitten und Hautverpflanzungen herrühren. Andere Zustände, die für die Behandlung mit dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen chronische Zustände wie chronische Geschwüre, diabetische Geschwüre und andere, nicht heilende (trophische) Zustände.
HTTER36 und lösliche Fragmente davon können für die Anwendung an dem betroffenen Bereich in physiologisch verträgliche Träger eingebracht werden. Die Natur der Träger kann weit variieren und wird von dem geplanten Ort der Anwendung abhängen. Für die Anwendung an der Haut wird üblicherweise eine Creme oder Salbe bevorzugt; geeignete Basen umfassen Lanolin, Silvadene (Marion) (insbesondere bei der Behandlung von Verbrennungen) Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Conn.) und dergleichen. Wenn erwünscht, wird es möglich sein, Zubereitungen, die HTTER36 enthalten, in Bandagen und andere Wundverbände einzubringen, um die Wunde dem Polypeptid kontinuierlich auszusetzen. Auch die Anwendung von Aerosolen kann Verwendung finden.
Die Konzentration von HTTER36 in der Zubereitung für die Behandlung ist nicht kritisch, sollte aber ausreichend sein, um die Proliferation von Epithelzellen zu induzieren. Die Zubereitungen können topisch auf dem betroffenen Gebiet aufgebracht werden, typischerweise als Augentropfen beim Auge oder als Cremen, Salben oder Lotions bei der Haut. Im Falle der Augen ist eine häufige Behandlung erwünscht, üblicherweise ist die Anwendung in Intervallen von 4 Stunden oder darunter. Bei der Haut ist es erwünscht, während der Heilung die Behandlungszubereitung kontinuierlich auf der betroffenen Fläche zu erhalten, mit Anwendungen der Behandlungszubereitung zwei- bis viermal am Tag, oder häufiger.
Die verwendete Menge an dem vorliegenden Polypeptid wird in Abhängigkeit vom Weg der Verabreichung, der Verwendung von anderen aktiven Verbindungen und dergleichen variieren und wird im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 &g bis 100 &g sein. Das vorliegende Polypeptid kann mit einem physiologisch verträglichen Träger wie Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung oder dergleichen angewendet werden. Die Menge an verwendeter Verbindung wird empirisch bestimmt, in Abhängigkeit von der Reaktion von Zellen in vitro und der Reaktion von Versuchstieren auf die vorliegenden Polypeptide oder Formulierungen, die die vorliegenden Polypeptide enthalten.
HTTER36 und die löslichen Fragmente davon können verwendet werden, um das Verankerungs-abhängige Wachstum von normalen Rattennierenfibroblasten zu stimulieren.
HTTER36 und die löslichen Fragmente davon können als multi-funktioneller Regulator des Wachstums und der Differenzierung von Zellen verwendet werden, da sie zu so verschiedenen Effekten in der Lage sind wie der Inhibierung des Wachstums von mehreren menschlichen Krebszelllinien und von T- und B-Lymphocyten.
HTTER36 und die löslichen Fragmente davon können auch für die Inhibierung der Proliferation von frühen hämatopoietischen Vorläuferzellen verwendet werden, sie stimulieren die Induktion der Differenzierung von mesenchymalen Zellen des Rattenmuskels und sie stimulieren die Produktion von knorpelspezifischen Makromolekülen, wobei sie eine erhöhte Synthese und Sekretion von Kollagen verursachen.
HTTER36 und die löslichen Fragmente davon können auch für die Stimulation der Knochenbildung verwendet werden.
Diese Erfindung beschreibt ein Verfahren für die Durchmusterung von Verbindungen für die Identifizierung von antagonistischen Verbindungen für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung. Als ein Beispiel wird eine Zubereitung einer Säugerzelle oder einer Membran, die einen HTTER36-Rezeptor exprimiert, mit einer potentiellen Verbindung inkubiert und die Fähigkeit der Verbindung zur Erzeugung eines sekundären Signals von dem Rezeptor wird gemessen, um zu bestimmen, ob sie ein wirksamer Antagonist ist. Solche Systeme eines zweiten Botenstoffs umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, cAMP-Guanylatcyclase, Ionenkanäle oder Phosphoinositidhydrolyse. Wirksame Antagonisten werden auch mit dem vorstehenden Verfahren bestimmt, wobei eine antagonistische Verbindung nachgewiesen wird, die an den Rezeptor bindet, die aber nicht eine Antwort eines zweiten Botenstoffs hervorruft, um damit den Rezeptor von HTTER36 zu blockieren.
Ein anderer Test für die Identifikation von potentiellen Antagonisten, die spezifisch sind für die Rezeptoren für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist ein Kompetitionstest, der die Isolierung von Plasmamembranen umfaßt, die einen Rezeptor für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung überexprimieren, zum Beispiel menschliche A431-Karzinomzellen. Eine seriell verdünnte Testprobe in einem Medium (das Volumen ist etwa 10 Mikroliter), das 10 nM ¹²⁵I-HTTER36 enthält, wird zu fünf Mikrogramm der Plasmamembran in der Gegenwart der potentiellen antagonistischen Verbindung zugegeben und 4 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Reaktionsgemische werden verdünnt und direkt durch einen Millipore-Filter gegeben. Die Filter werden dann rasch gewaschen und die gebundenen Radioaktivität wird in einem Gammazähler gemessen. Die Menge an gebundenem HTTER36 wird dann gemessen. Es wird auch ein Kontrolltest bei Abwesenheit der Verbindung durchgeführt, um zu bestimmen, ob der Antagonist die Menge an gebundenem HTTER36 reduziert.
Potentielle antagonistische Verbindungen umfassen einen Antikörper.
Die Antagonisten können zur Behandlung von Neoplasia verwendet werden, zum Beispiel Krebs und Tumore, bei Zellen, deren Wachstum durch die Polypeptide der vorliegenden Erfindung stimuliert wird.
Die Antagonisten können auch zur Verhinderung der Stimulierung der Bildung von extrazellulären Matrixmolekülen in der Leber und Lunge verwendet werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder die antagonistischen Verbindungen können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger verwendet werden. Solche Zubereitungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids oder der Verbindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Ein solcher Träger umfaßt, ist aber nicht beschränkt darauf, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung sollte mit dem Verabreichungsweg übereinstimmen.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder einen Kit bereit, umfassend einen oder mehrere Behältnisse, gefüllt mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen der Arzneimittel der Erfindung. Diesem Behältnis/diesen Behältnissen kann ein Hinweis in der Form beigelegt sein, wie sie eine Regierungsbehörde vorschreibt, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von pharmazeutischen oder biologischen Produkten reguliert, wobei der Hinweis die Zustimmung der Behörde für die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf für die Anwendung beim Menschen wiedergibt. Außerdem können die Polypeptide oder Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit anderen therapeutischen Verbindungen angewendet werden.
Die Arzneimittel können in einer passenden Weise verabreicht werden, wie dem oralen, topischen, intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, intranasalen oder intradermalen Weg. Die Arzneimittel werden in einer Menge verabreicht, die für die Behandlung und/oder Prophylaxe der speziellen Indikation wirksam ist. Im Allgemeinen werden sie in einer Menge von mindestens etwa 10 &g/kg Körpergewicht und in den meisten Fällen werden sie in einer Menge von nicht mehr als etwa 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. In den meisten Fällen ist die Dosierung von etwa 10 &g/kg bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht pro Tag unter Berücksichtigung des Verabreichungswegs, der Symptome usw.
Die Polypeptide und die Antagonisten, die Polypeptide sind, können gemäß der vorliegenden Erfindung auch durch die Expression solcher Polypeptide in vivo verwendet werden, was oft als „Gentherapie" bezeichnet wird.
So können zum Beispiel Zellen von einem Patienten mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA), die ex vivo ein Polypeptid codieren, verändert werden, wobei diese veränderten Zellen dann einem Patienten bereitgestellt werden, der mit einem solchen Polypeptid behandelt werden soll. Solche Verfahren sind im Stand der Technik wohl bekannt und nach den Lehren hierin offensichtlich. Zum Beispiel können Zellen unter Verwendung eines retroviralen Plasmidvektors verändert werden, der RNA enthält, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
In ähnlicher Weise können Zellen in vivo für die Expression eines Polypeptids in vivo mittels zum Beispiel Verfahren verändert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel wird eine Verpackungszelle mit einem retroviralen Plasmidvektor transduziert, der RNA enthält, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, so daß die Verpackungszelle nun infektiöse virale Partikel produziert, die das Gen von Interesse enthalten. Diese Produktionszellen können einem Patienten verabreicht werden, um in vivo Zellen zu verändern und um das Polypeptid in vivo zu exprimieren. Diese und andere Verfahren für die Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch solche Verfahren sollten dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet nach den Lehren der vorliegenden Erfindung offensichtlich sein.
Retroviren, von denen die vorstehend erwähnten retroviralen Plasmidvektoren abgeleitet sein können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Moloney-Leukämievirus der Maus, Milznekrosevirus, Retroviren wie Rous-Sarkomvirus, Harvey-Sarkomvirus, Vogelleukosisvirus, Gibbonaffe-Leukämievirus, menschliches Immunschwächevirus, Adenovirus, Myeloproliferatives Sarkomvirus und Brustkrebsvirus. Bei einer Ausführungsform ist der retrovirale Plasmidvektor abgeleitet vom Moloney-Leukämievirus der Maus.
Der Vektor umfaßt einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die retrovirale LTR; den SV40-Promotor; und den menschlichen Cytomegalicvirus (CMV)-Promotor, beschrieben in Miller, et al., Biotechnigues, Bd. 7, Nr. 9, 980–990 (1989), oder jeden anderen Promotor (z.B. zelluläre Promotoren wie eukaryontische zelluläre Promotoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, dem Histon-, pol III- und β-Actin-Promotor). Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, adenovirale Promotoren, Thymidinkinase (TK)-Promotoren und B19-Parvoviruspromotoren. Die Auswahl eines geeigneten Promotors wird dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet nach den hierin enthaltenen Lehren offensichtlich sein.
Die Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, ist unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, adenovirale Promotoren wie den adenoviralen späten Hauptpromotor; oder heterologe Promotoren wie den Cytomegalicvirus (CMV)-Promotor; den Promotor des respiratorischen Syncytialvirus (RSV); induzierbare Promotoren wie den MMT-Promotor, den Metallothioneinpromotor; Hitzeschockpromotoren; den Albuminpromotor; den ApoAI-Promotor; Promotoren des menschlichen Globins; virale Thymidinkinasepromotoren wie den Herpes Simplex-Thymidinkinasepromotor; retrovirale LTRs (einschließlich der hier vorstehend beschriebenen modifizierten retroviralen LTRs); den β-Actin-Promotor; und menschliche Wachstumshormonpromotoren. Der Promotor kann auch der native Promotor sein, der das Gen kontrolliert, das das Polypeptid codiert.
Der retrovirale Plasmidvektor wird für die Transduktion der Verpackungszelllinien verwendet, um Produktionszelllinien zu bilden. Beispiele für Verpackungszelllinien, die transfiziert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die PE501-, PA317-,_2-,_-AM-, PA12-, T19-14X-, VT-19-17-H2-, _CRE-,_CRIP-, GP+E-86-, GP+envAm12- und DAN-Zelllinien, wie beschrieben in Miller, Human Gene Therapy, Bd. 1, S. 5–14 (1990), was durch Bezugnahme hier vollständig eingeschlossen wird. Der Vektor kann die Verpackungszellen mit jedem Mittel transduzieren, das im Stand der Technik bekannt ist. Solche Mittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und die CaPO₄-Präzipitation. Bei einer Alternative, kann der retrovirale Plasmidvektor in einem Liposom verkapselt sein oder an ein Lipid gekoppelt sein, und dann dem Wirt verabreicht werden.
Die Produktionszelllinie erzeugt infektiöse retrovirale Vektorpartikel, die die Nucleinsäuresequenz(en) enthalten, die die Polypeptide codiert/codieren. Solche retroviralen Vektorpartikel können dann verwendet werden, um eukaryontische Zellen zu transduzieren, entweder in vitro oder in vivo. Die transduzierten eukaryontische Zellen werden die Nucleinsäuresequenz(en) exprimieren, die die Polypeptide codiert/codieren. Eukaryontische Zellen, die transduziert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, embryonale Stammzellen, embryonale Karzinomzellen ebenso wie hämatopoietische Stammzellen, Hepatocyten, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und bronchiale Endothelzellen.
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung des Gens der vorliegenden Erfindung als Diagnostikum. Der Nachweis einer mutierten Form des Gens der vorliegenden Erfindung wird die Diagnose einer Krankheit oder die Veranlagung zu einer Krankheiten ermöglichen, die das Ergebnis einer Unterexpression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist, zum Beispiel eine unzulängliche Wundheilung und unzulängliche neurologische Funktionen.
Individuen, die im menschlichen Gen der vorliegenden Erfindung Mutationen haben, können auf der Ebene der DNA durch eine Vielzahl von Techniken entdeckt werden. Nucleinsäuren für die Diagnose können von den Zellen eines Patienten gewonnen werden, wie von Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie und Autopsiematerial. Die genomische DNA kann direkt für den Nachweis verwendet werden oder sie kann unter Verwendung der PCR (Saiki et al., Nature, 324:163–166 (1986) vor der Analyse enzymatisch amplifiziert werden. Für denselben Zweck kann auch RNA oder cDNA verwendet werden. Als ein Beispiel können für die Identifikation und Analyse von Mutationen PCR-Primer verwendet werden, die komplementär zu den Nucleinsäuren sind, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codieren. Zum Beispiel können Deletionen und Insertionen durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich mit dem normalen Genotyp nachgewiesen werden. Punktmutationen können durch Hybridisierung von amplifizierter DNA mit radiomarkierter RNA oder alternativ mit radiomarkierten Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert werden. Perfekt passende Sequenzen können von fehlgepaarten Duplexmolekülen durch RNase A-Verdau oder unterschiedliche Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Sequenzunterschiede zwischen dem Referenzgen und Genen, die Mutationen haben, können mittels des Verfahrens der direkter DNA-Sequenzierung offenbart werden. Außerdem können clonierte DNA-Segmente als Sonden verwendet werden, um spezifische DNA-Segmente nachzuweisen. Die Empfindlichkeit diese Verfahrens wird durch die Kombination mit der PCR beträchtlich erhöht. Zum Beispiel wird ein Sequenzierungsprimer mit einem doppelsträngigen PCR-Produkt oder einem einzelsträngigen Matrizenmolekül verwendet, das mittels einer modifizierten PCR erzeugt wurde. Die Sequenzbestimmung wird mit herkömmlichen Verfahren mit radiomarkierten Nucleotiden oder mit automatisierten Sequenzierungsverfahren mit Fluoreszenzmarkierung durchgeführt.
Die genetische Testung, basierend auf Unterschieden bei der DNA-Sequenz, kann durch den Nachweis von Veränderungen der Mobilität von DNA-Fragmenten bei der Elektrophorese in Gelen mit oder ohne denaturierende Mittel durchgeführt werden. Kleine Sequenzdeletionen und -Insertionen können durch hochauflösende Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente von verschiedenen Sequenzen können auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden, in denen die Mobilitäten von verschiedenen DNA-Fragmenten an verschiedenen Positionen im Gel retardiert sind, gemäß ihren spezifischen oder partiellen Schmelztemperaturen (vgl. z.B. Myers et al., 230:1242 (1985)).
Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch mittels des Nuclease-Schutztests wie des RNase- und S1-Schutztests, oder der chemischen Spaltverfahren offenbart werden (vgl. Cotton et al., PNAS, USA, 85:4397–4401 (1985)).
Somit kann der Nachweis von spezifischen DNA-Sequenzen mit Verfahren wie der Hybridisierung, dem Rnase-Schutz, der chemischen Spaltung, der direkten DNA-Sequenzierung oder der Verwendung von Restriktionsenzymen (d.h. Restriktionsfragmentelängenpolymorphismus (RFLP)) und dem Southern-Bloverfahren von genomischer DNA erfolgen.
Zusätzlich zu der mehr herkömmlichen Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch in situ-Analyse nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch diagnostische Tests zum Nachweis von veränderten Spiegeln des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Geweben, da eine Überexpression der Proteine im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben die Anwesenheit von gewissen Krankheitszuständen wie Neoplasia, Hautkrankheiten, Augenkrankheiten und Entzündung nachweisen kann. Tests, die zum Nachweis von Spiegeln des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in einer Probe verwendet werden, die einem Wirt entnommen wurde, sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt und umfassen Radioimmuntests, Kompetitionsbindungstests, die Western-Blot-Analyse und vorzugsweise einen ELISA-Test. Ein ELISA-Test umfaßt anfänglich die Herstellung eines Antikörpers, der spezifisch ist für ein Antigen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise eines monoclonalen Antikörpers. Außerdem wird gegen den monoclonalen Antikörper ein Reporterantikörper hergestellt. An den Reporterantikörper wird ein nachweisbares Reagenz wie Radioaktivität, Fluoreszenz oder in diesem Beispiel ein Meerrettichperoxidase-Enzym gebunden. Einem Wirt wird jetzt ein Probe entnommen und auf einem festen Träger inkubiert, z.B. einem Polystyrolgefäß, das die Proteine in der Probe bindet. Dann werden durch Inkubation mit einem unspezifischen Protein wie Rinderserumalbumin alle freien Proteinbindungsstellen auf dem Gefäß gesättigt. Als nächstes wird der monoclonale Antikörper in dem Gefäß inkubiert und während dieser Zeit binden die monoclonalen Antikörper an alle Polypeptide der vorliegenden Erfindung, die an das Polystyrolgefäß gebunden sind. Alle nicht gebundenen monoclonalen Antikörper werden mit Puffer abgewaschen. Der Reporterantikörper, der an Meerrettichperoxidase gebunden ist, wird nun in das Gefäß gegeben, was in der Bindung des Reporterantikörpers an den monoclonalen Antikörper resultiert, der an die Polypeptide der vorliegenden Erfindung gebunden ist. Nicht gebundener Reporterantikörper wird dann ausgewaschen. Dann werden Peroxidasesubstrate zu dem Gefäß zugegeben und die Menge an Farbe, die sich in einem gegebenen Zeitraum entwickelt, ist ein Maß für die Menge an Protein, die in einem gegebenen Volumen der Patientenprobe anwesend ist, im Vergleich mit einer Standardkurve.
Für die Bestimmung der Spiegel des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in einer Probe, die von einem Wirt entnommen wurde, kann auch ein Kompetitionstest angewendet werden. Ein solcher Test umfaßt die Isolierung von Plasmamembranen, die den Rezeptor für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung überexprimieren. Eine Testprobe, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthält, die markiert wurden, wird dann zu den Plasmamembranen zugegeben und dann für einen vorgegebenen Zeitraum inkubiert. Zu dem Reaktionsgemisch wird ebenfalls eine Probe zugegeben, die von einem Wirt stammt, von dem man annimmt, daß er das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält. Die Reaktionsgemische werden dann durch einen Filter gegeben, der schnell gewaschen wird und dann wird die gebundene Radioaktivität gemessen, um das Maß an Kompetition um die Rezeptoren zu bestimmen und damit die Menge an Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in der Probe.
Antikörper, die für HTTER36 spezifisch sind, können für die Krebsdiagnose und -therapie verwendet werden, da viele Arten von Krebszellen während des Prozesses der Neoplasia und Hyperplasia verschiedene Mitglieder dieser Superfamilie hochregulieren. Diese Antikörper binden und inaktivieren HTTER36. Monoclonale Antikörper gegen HTTER36 (und/oder seine Familienmitglieder) sind in klinischer Verwendung bei der Diagnose und Therapie von gewissen Störungen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) hyperplastischen und neoplastischen Wachstumsabnormalitäten. Die Hochregulierung der Wachstumsfaktorexpression durch neoplastische Gewebe bildet die Grundlage für eine Vielzahl von Serumtests, die das Anwachsen von Wachstumsfaktor im Blut von betroffenen Patienten nachweisen. Diese Tests werden typischerweise nicht nur in diagnostischen Ansätzen, sondern auch prognostischen Ansätzen verwendet (um die Anwesenheit von okkulten Tumorzellen nach Chirurgie, Chemotherapie usw. nachzuweisen).
Außerdem können maligne Zellen, die den HTTER36-Rezeptor exprimieren, unter Verwendung von markiertem HTTER36 in einem Rezeptorbindungstest nachgewiesen werden, oder unter Verwendung von Antikörpern gegen den HTTER36-Rezeptor selbst. Zellen können gemäß der Anwesenheit und Dichte von Rezeptoren für HTTER36 unterschieden werden, womit ein Mittel für die Vorhersage der Zugänglichkeit solcher Zellen für die biologischen Aktivitäten von HTTER36 bereitgestellt wird.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch für die Identifikation im Chromosom von Wert. Die Sequenz ist spezifisch auf einen speziellen Locus auf einem einzigen menschlichen Chromosom gerichtet und kann damit hybridisieren. Darüber hinaus besteht zur Zeit Bedarf an der Identifikation von speziellen Loci auf dem Chromosom. Auf der Basis von aktuellen Sequenzdaten (Wiederholungspolymorphismus) sind zur Zeit wenige Chromosomenmarkierungsreagenzien für die Markierung von chromosomalen Loci verfügbar. Die Kartierung von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation dieser Sequenzen mit Genen, die mit Krankheit assoziiert sind.
Kurz gesagt können die Sequenzen durch die Herstellung von PCR-Primern (vorzugsweise 15–25 bp) von der cDNA auf Chromosomen kartiert werden. Die Computeranalyse der nicht translatierten 3'-Region des Gens wird verwendet, um rasch Primer zu selektieren, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA überspannen, wodurch das Amplifikationsverfahren kompliziert wird. Diese Primer werden dann für die PCR-Durchmusterung von somatischen Zellhybriden verwendet, die einzelne menschliche Chromosomen enthalten. Nur die Hybride, die das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht, werden ein amplifiziertes Fragment ergeben.
Die PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist ein schnelles Verfahren für die Zuordnung einer speziellen DNA zu einem speziellen Chromosom. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung mit denselben Oligonucleotidprimern kann auf analoge Weise mit Reihen von Fragmenten von spezifischen Chromosomen oder Pools von großen genomischen Clonen eine Sublokalisierung erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die in ähnlicher Weise verwendet werden können, um eine Kartierung auf seinem Chromosom zu erreichen, umfassen die in situ-Hybridisierung, die Vordurchmusterung mit markierten, im Durchfluß sortierten Chromosomen und die Vorauswahl mittels Hybridisierung, um Chromosomenspezifische cDNA-Bibliotheken zu konstruieren.
Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung(FISH) eines cDNA-Clons mit einem Ausstrich von Chromosomen in der Metaphase kann verwendet werden, um in einem Schritt eine präzise chromosomale Lage bereitzustellen. Diese Technik kann mit cDNA durchgeführt werden, die so kurz ist wie 50 oder 60 bp. Für einen Überblick über diese Technik vgl. Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Nachdem eine Sequenz einem präzisen chromosomalen Locus zugeordnet wurde, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den Daten der genetischen Karte korreliert werden. Solche Daten werden zum Beispiel in McKusick, Mendelian Inheritance in Man (on line verfügbar von der John Hopkins University Welch Medical Library) gefunden. Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die derselben chromosomalen Region zugeordnet wurden, werden mittels Kopplungsanalyse (gemeinsame Vererbung von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
Als Nächstes ist es erforderlich, die Unterschiede in der cDNA oder der genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn eine Mutation bei einigen oder allen betroffenen Individuen beobachtet wird, aber nicht bei den normalen Individuen, dann ist die Mutation wahrscheinlich das auslösende Agens der Krankheit.
Mit der gegenwärtigen Auflösung der physikalischen Kartierungs- und der genetischen Kartierungstechniken könnte eine cDNA, die präzise einer chromosomalen Region zugeordnet wird, die mit der Krankheit in Verbindung steht, eines von zwischen 50 und 500 potentiell verursachenden Genen sein (Dies setzt eine Kartierungsauflösung von 1 Megabase und ein Gen pro 20 kb voraus).
Die Polypeptide, ihre Fragmente oder anderen Derivate oder ihre Analoga, oder die Zellen, die sie exprimieren, können als Immunogen zur Produktion von Antikörpern dagegen verwendet werden. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch chimäre, einzelkettige und humanisierte Antikörper ebenso wie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbibliothek. Verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, können für die Produktion solcher Antikörper und Fragmente verwendet werden.
Antikörper, die gegen die Polypeptide erzeugt werden, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier oder durch Verabreichung der Polypeptide an ein Tier erhalten werden, wobei das Tier vorzugsweise nicht menschlich ist. Der so erhaltene Antikörper wird dann an die Polypeptide selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment der Polypeptide codiert, für die Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die die gesamtem nativen Polypeptide binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um das Polypeptid aus Gewebe zu isolieren, das dieses Polypeptid exprimiert.
Für die Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann jede Technik verwendet werden, die Antikörper, die mittels kontinuierlicher Zelllinienkultur produziert werden, bereitstellt. Beispiele umfassen die Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256:495–497), die Triomtechnik, die Hybridomtechnik mit menschlichen B-Zellen (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Produktion von menschlichen monoclonalen Antikörpern (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96).
Techniken, die für die Produktion von einzelkettigen Antikörpern (US-Patent 4,946,778) beschrieben werden, können an die Produktion von einzelkettigen Antikörpern gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung adaptiert werden. Es können auch transgene Mäuse für die Expression von humanisierten Antikörpern gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele des Weiteren beschrieben; es sollte jedoch verstanden werden, daß die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist. Alle Teile oder Mengen sind auf das Gewicht bezogen, außer es ist anders angegeben.
Um das Verständnis für die folgenden Beispiele zu erleichtern, werden gewisse, häufig vorkommende Verfahren und/oder Ausdrücke beschrieben. "Plasmide" werden mit einem kleingeschriebenen p bezeichnet, dem große Buchstaben und/oder Zahlen vorausgehen oder folgen. Die Ausgangsplamide hierin sind entweder kommerziell verfügbar, auf uneingeschränkter Basis öffentlich zugänglich oder können aus zugänglichen Plasmiden mit publizierten Verfahren konstruiert werden. Außerdem sind den beschriebenen Plasmiden gleichwertige Plasmide im Stand der Technik bekannt und werden dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet offensichtlich sein.
Der "Verdau" von DNA betrifft die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, welches nur bei gewissen Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen Restriktionsenzyme, die hier verwendet werden, sind kommerziell verfügbar und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und andere Erfordernisse wurden verwendet, wie es dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt ist. Für analytische Zwecke werden typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Zum Zwecke der Isolierung von DNA-Fragmenten für die Konstruktion von Plasmiden, werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete Puffer- und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller spezifiziert. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C werden normalerweise verwendet, können aber gemäß den Vorschriften des Lieferanten variieren. Nach dem Verdau wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterworfen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung eines 8-prozentigen Polyacrylamidgels durchgeführt, wie es von Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) beschrieben ist.
"Oligonucleotide" betriffen entweder ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert sein können. Solche synthetischen Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und werden daher ohne die Hinzufügung eines Phosphats durch ATP in der Gegenwart einer Kinase nicht mit einem anderen Oligonucleotid ligieren. Ein synthetisches Oligonucleotid wird mit einem Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert wurde.
"Ligierung" bedeutet den Prozeß der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T., et al., Id., S. 146). Außer anders beschrieben, kann die Ligierung unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 μg von etwa äquimolaren Mengen an zu ligierenden DNA-Fragmenten durchgeführt werden.
Außer anders angegeben, wurde die Transformation wie bei dem von Graham, F. und Van der Eb, A., Virology, 52:456–457 (1973) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Beispiel 1
Bakterielle Expression und Reinigung von reifem HTTER36
Die DNA-Sequenzen, die HTTER36, ATCC # 97349, codiert, wurde anfänglich unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'-Sequenzen des prozessierten HTTER36-Proteins und den Vektorsequenzen 3' vom HTTER36-Gen entsprachen. Zusätzliche Nucleotide, die HTTER36 entsprachen, wurden zu den 5'- bzw. 3'-Sequenzen zugefügt. Der 5'-Oligonucleotidprimer hat die Sequenz
5' GAAAGGATCCGCAGCCATCCCTGTCCCCAAACTTTCTTGT 3' (SEQ ID NO:3) und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymstelle (fett), gefolgt von 18 Nucleotiden der HTTER36 codierenden Sequenz, beginnend mit Nucleotid 791 von 1 (SEQ ID NO:1). Die 3'-Sequenz 5' TCCTTCTATTCAAGCTTCTGACATCCTACCCACACCCACA 3' (SEQ ID NO:4) enthält komplementäre Sequenzen zu einer HindIII-Stelle und wird gefolgt von 15 Nucleotiden von HTTER36, beginnend mit Nucleotid 1121, und einem Stop-Codon. Die Restriktionsenzymstellen entsprechen den Restriktionsenzymstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-9 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA, 91311). pQE-9 codiert eine Antibiotica-Resistenz (Amp.), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen IPTG-regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomenbindungsstelle (RBS), eine 6-His-Markierung und Restriktionsenzymstellen. pQE-9 wurde dann mit BamHI und HindIII verdaut. Die amplifizierten Sequenzen wurden in pQE-9 ligiert und wurden im Rahmen mit der Sequenz inseriert, die die Histidin-Markierung und die RBS codiert. Das Ligierungsgemisch wurde dann für die Transformation des E. coli-Stamms DH5 alpha (Gibco BRL) gemäß dem von Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989), beschriebenen Verfahren verwendet. Transformanten wurden entsprechend ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die die gewünschten Konstrukte enthielten, wurde über Nacht (O/N) in Flüssigkultur in LB-Medium gezüchtet, das mit Amp (100 μg/ml) und Kan (25 μg/ml) ergänzt wurde. Die O/N-Kultur wurde verwendet, um eine große Kultur mit einem Verhältnis 1:100 bis 1:250 zu inokulieren. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte bei 600 (O.D.^6oo) von zwischen 0,4 und 0,6 gezüchtet. Dann wurde IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI-Repressors, Freilegung des P/O, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen wurden noch einmal 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden dann mittels Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wurde in dem chaotropien Mittel 6molar Guanidin-HCI gelöst. Nach der Klärung wurde solubilisiertes HTTER36 aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Nickel-Chelat-Säule unter Bedingungen gereinigt, die die feste Bindung von Proteinen zulassen, die die 6-His-Markierung enthalten (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177–184 (1984)). HTTER36 (85% rein) wurde mit 6 molarem Guanidin-HCl, pH 5,0 von der Säule eluiert und zum Zweck der Renaturierung auf 3 molar Guanidin-HCl, 100 mM Natriumphosphat, 10 molar Glutathion (reduziert) und 2 molar Glutathion (oxidiert) eingestellt. Nach 12 Stunden Inkubation in dieser Lösung wurde das Protein gegen 10 molar Natriumphosphat dialysiert.
Beispiel 2
Clonierung und Expression von HTTER36 unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssytems
Die DNA-Sequenz, die das HTTER36-Protein, ATCC # 97349, codiert, wird unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen.
Die verwendeten Primer sind:
5' CAGGGATCCGCCATCATGCTTCGTTTCTTGCCAGA 3' (SEQ ID NO:5) und enthält die unterstrichene BamHI-Stelle, ein effizientes Signal für die Translationsinitiation in eukaryontischen Zellen, ein Startcodon (fett) und 17 bps der HTTER36 codierenden Sequenz. Der 3'-Primer hat die Sequenz 5' CTTCGGTACCCATTTCTGACATCCTACCCACAC 3' (SEQ ID NO:6) und enthält die unterstrichene Asp718-Stelle und 23 Nucleotide komplementär zum 3'-Ende der HTTER36-Sequenz, beginnend bei Nucleotid 1126.
Die amplifizierten Sequenzen werden von einem 1%-igen Agarosegel unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits („Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) isoliert. Das Fragment wird dann mit den Endonucleasen BamHI und Asp718 verdaut und dann wieder auf einem 1%-igen Agarosegel gereinigt. Diese Fragment wird als F2 bezeichnet.
Für die Expression des HTTER36-Proteins unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssytems (für einen Überblick vgl.: Summers, M.D. und Smith, G.E. 1987, A Manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555) wird der Vektor pA2 verwendet (Modifikation des pVL941-Vektors, nachstehend diskutiert). Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des Autographa californica -kernpolyeder Virus (AcMNPV), gefolgt von den Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen. Die Polyadenylierungsstelle des Affenvirus (SV)40 wird für die effiziente Polyadenylierung verwendet. Für eine leichte Selektion von rekombinantem Virus wird das beta-Galactosidasegen von E. coli in derselben Richtung wie der Polyhedrin-Promotor inseriert, gefolgt vom Polyadenylierungssignal des Polyhedringens. Die Polyhedrinsequenzen werden auf beiden Seiten von viralen Sequenzen für die zellvermittelte homologe Rekombination von co-transfizierter viraler Wildtyp-DNa flankiert. Viele andere Baculovirus-Vektoren könnten verwendet werden, wie pAc373, pRG1, pVL941 und pAcIM1 (Luckow, V.A. und Summers, M.D., Virology, 170:31–39).
Das Plasmid wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Asp718 verdaut und dann mit Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, unter Verwendung von Kalbsdarm-Phosphatase dephosphoryliert. Die DNA wird dann von einem 1%-igen Agarosegel unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits („Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) isoliert. Diese Vektor-DNA wird als V2 bezeichnet.
Das Fragment F2 und das dephosphorylierte Plasmid V2 werden mit T4 DNA-Ligase ligiert. Dann werden E.coli HB101-Zellen transformiert und unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und Asp718 die Bakterien identifiziert, die das Plasmid (pBacHTTER36) mit dem HTTER36-Gen enthalten. Die Sequenz des clonierten Fragments wird mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
5 μg des Plasmids pBacHTTER36 werden unter Verwendung des Lipofectionsverfahrens (Felgner et al. Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 84:7413–7417 (1987) mit 1,0 μg von kommerziell erhältlichem linearisiertem Baculovirus cotransfiziert („BaculoGold^TM-Baculovirus-DNA", Pharmingen, San Diego, CA.) 1 μg BaculoGold^TM-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBacHTTER36 werden in einer sterilen Mulde einer Mikrotiterplatte gemischt, die 50 μl serumfreies Grace-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) enthält. Danach werden 10 μl Lipofectin plus 90 μl Grace-Medium zugegeben, gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird das Transfektionsgemisch tropfenweise zu der Sf9-Insektenzelle (ATCC CRL 1711) zugegeben, die in einer Gewebekulturplatte von 35 mm mit 1 ml Grace-Medium ohne Serum ausgesät ist. Die Platte wird hin und her geschüttelt, um die neu zugegebene Lösung zu mischen. Die Platte wird dann 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wird die Transfektionslösung von der Platte entfernt und es wird 1 ml Grace-Insektenmedium zugegeben, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt ist. Die Platte wird in den Inkubator zurückgestellt und die Züchtung vier Tage bei 27°C fortgesetzt.
Nach 4 Tagen wird der Überstand gesammelt und ein Plaque-Test ähnlich dem von Summers und Smith (vorstehend) beschriebenen durchgeführt. Als eine Modifikation wird ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) verwendet, was die leichte Isolierung von blau gefärbten Plaques zuläßt. (Eine detaillierte Beschreibung eines „Plaque-Tests" kann auch in dem Benutzerhandbuch für Insektenzellkultur und Baculovirologie, Seite 9–10, gefunden werden, das von Life Technologies Inc., Gaithersburg, verteilt wird.
Vier Tage nach der seriellen Verdünnung wird zu den Zellen das Virus zugegeben und blau gefärbte Plaques werden mit der Spitze einer Eppendorf-Pipette aufgenommen. Der Agar, der die rekombinanten Viren enthält, wird dann in einem Eppendorf-Röhrchen resuspendiert, das 200 μl Grace-Medium enthält. Der Agar wird durch eine kurze Zentrifugation entfernt und der Überstand, der das rekombinante Baculovirus enthält, wird verwendet, um Sf9-Zellen zu infizieren, die in Gefäßen von 35 mm ausgesät sind. Vier Tage später werden die Überstände dieser Kulturgefäße geerntet und dann bei 4°C aufbewahrt.
Sf9-Zellen werden in Grace-Medium gezüchtet, das mit 10% hitzeinaktiviertem FBS ergänzt ist. Die Zellen werden mit dem rekombinanten Baculovirus V-HTTER36 mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 2 infiziert. Sechs Stunden später wird das Medium entfernt und durch SF900 11-Medium minus Methionin und Cystein (Life Technologies Inc., Gaithersburg) ersetzt. 42 Stunden später werden 5 μCi ³⁵S-Methionin und 5 μCi ³⁵S-Cystein (Amersham) zugegeben. Die Zellen werden weitere 16 Stunden inkubiert, bevor sie mittels Zentrifugation geerntet werden, und die markierten Proteine werden durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht.
Beispiel 3
Expression von rekombinantem HTTER36 in CHO-Zellen
Der Vektor pC1 wird für die Expression des HTTER36-Proteins verwendet. Das Plasmid pC1 ist ein Derivat des Plamids pSV2-dhfr [ATCC Zugangsnummer No. 37146]. Beide Plasmide enthalten das dhfr-Gen der Maus unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors. Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters oder andere Zellen, denen die Dihydrofolat-Aktivität fehlt und die mit diesem Plasmid transfiziert sind, können durch Züchten der Zellen in einem selektiven Medium (alpha-minus-MEM, Life Technologies) selektiert werden, das mit dem chemotherapeutischen Mittel Methotrexat ergänzt ist. Die Amplifikation der DHFR-Gene in Zellen, die gegen Methotrexat (MTX) resistent sind, wurde gut dokumentiert (vgl. z.B. Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R., und Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357–1370, Hamlin, J.L. und Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107–143, Page, M.J. und Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology Bd. 9:64–68). Zellen, die in wachsenden Konzentration von MTX wachsen, entwickeln Resistenz gegen den Wirkstoff durch die Überproduktion des Zielenzyms DHFR als Ergebnis der Amplifikation des DHFR-Gens. Wenn ein zweites Gen mit dem dhfr-Gen verknüpft ist, wird es üblicherweise co-amplifiziert und überexprimiert. Es ist Stand der Technik, Zelllinien zu entwickeln, die mehr als 1.000 Kopien der Gene enthalten. Anschließend, wenn das Methotrexat entzogen wird, enthalten die Zelllinien das amplifizierte Gen in das Chromosom/die Chromosomen integriert.
Das Plasmid pN346 enthält für die Expression des Gens von Interesse einen starken Promotor der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rouse-Sarkomvirus (Cullen, et al., Molecular and Cellular Biology, März 1985, 438–447) plus einem Fragment, das aus dem Enhancer des sehr frühen Gens des menschlichen Cytomegalicvirus (CMV) (Boshart et al., Cell 41:521–530, 1985) isolierte wurde. Stromabwärts von dem Promotor sind die folgenden einzelnen Restriktionsenzymspaltstellen, die die Integration der Gene erlauben; BamHI, PvuII und NruI. Hinter diesen Clonierungsstellen enthält das Plasmid Translations-Stoppcodons in allen drei Leserahmen, gefolgt vom 3'-Intron und der Polyadenylierungsstelle des Präproinsulingens der Ratte. Andere sehr effiziente Promotoren können auch für die Expression verwendet werden, z.B. der menschliche β-Actin-Promotor, der frühe oder späte Promotor von SV40 oder die langen terminalen Wiederholungen von anderen Retroviren, z.B. HIV und HTLVI. Für die Polyadenylierung der mRNA können auch andere Signale, z.B. von den menschlichen Wachstumshormon- oder Globingenen, verwendet werden.
Stabile Zelllinien, die ein Gen von Interesse in das Chromosom integriert tragen, können auch nach co-Transfektion mit einem selektierbaren Marker wie gpt, G418 oder Hygomycin selektiert werden. Es ist von Vorteil, am Anfang mehr als einen selektierbaren Marker zu verwenden, z.B. G418 plus Methotrexat.
Das Plasmid pN346 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und dann unter Verwendung von Kalbsdarm-Phosphatase mit Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, dephosphoryliert. Der Vektor wurde dann von einem 1%-igen Agarosegel isoliert.
Die DNA-Sequenz, die HTTER36 codiert, ATCC # 97349, wurde unter Verwendung der PCR-Oligonucleotidprimer amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen:
Der 5'-Primer hat die Sequenz 5' ACAGCGGATCCAGCCACCATGCTTCGTTTCTTGCCA 3' (SEQ ID NO:7) und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymstelle (fett), gefolgt von einem effizienten Signal für die Translation (Kozak, M., vorstehend) plus den ersten 18 Nucleotiden des Gens (das Initiationscodon für die Translation „ATG" ist unterstrichen).
Der 3'-Primer hat die Sequenz 5' TCCTTCGGATCCCATTTCTGACATCCTACCCACACCCACA 3' (SEQ ID NO:8) und enthält die Spaltstelle für die Restriktionsendonuclease BamHI und 29 Nucleotide komplementär zu der translatierten und nicht translatierten 3'-Sequenz des Gens.
Die amplifizierten Fragmente wurde von einem 1%-igen Agarosegel isoliert, wie vorstehend beschrieben, und dann mit der Endonuclease BgIII verdaut und dann wieder auf einem 1%-igen Agarosegel gereinigt.
Das isolierte Fragment und der dephosphorylierte Vektor wurden dann mit T4 DNA-Ligase ligiert. E. coli HB101-Zellen wurden dann transformiert und Bakterien, die das Plasmid pN346 in der korrekten Orientierung inseriert hatten unter Verwendung des Restriktionsenzyms BamHI identifiziert. Die Sequenz des inserierten Gens wurde mit DNA-Sequenzierung bestätigt.
Transfektion von DHO-dhfr-Zellen
Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, denen ein aktives DHFR-Enzym fehlt, wurden für die Transfektion verwendet. Unter Verwendung des Lipofectinverfahrens (Felgner et al., vorstehend) wurden 0,5 μg des Expressionsplasmids N346 mit 0,5 μg des Plamids pSVneo co-transfiziert. Das Plamid pSV2-neo enthält einen dominanten selektierbaren Marker, das Gen neo von Tn5, das ein Enzym codiert, das gegen eine Gruppe von Antibiotika einschließlich G418 Resistenz verleiht. Die Zellen wurden in alpha-minus-MEM ausgesät, das mit 1 mg/ml G418 ergänzt war. Nach 2 Tagen wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und in Hybridom-Clonierungsplatten (Greiner, Deutschland) ausgesät und 10–14 Tage gezüchtet. Nach diesem Zeitraum wurden einzelne Clone mit Trypsin behandelt und dann unter Verwendung verschiedener Konzentrationen an Methotrexat (25, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM) in Petri-Schalen mit 6 Mulden ausgesät. Clone, die bei den höchsten Konzentrationen an Methotrexat noch wuchsen, wurden dann auf neue Platten mit 6 Mulden übertragen, die noch höhere Konzentrationen an Methotrexat enthielten (500 nM; 1 μM, 2μM, 5 μM). Dasselbe Verfahren wurde wiederholt, bis die Clone bei einer Konzentration von 100 μM wuchsen.
Die Expression des gewünschten Genprodukts wurde mittels der Western-Blot-Analyse und SDS-PAGE analysiert.
Beispiel 4
Expression über Gentherapie
Mittels Hautbiopsie werden von einer Person Fibroblasten gewonnen. Das resultierende Gewebe wird in ein Gewebekulturmedium gegeben und in kleine Stücke aufgeteilt. Kleine Fetzen des Gewebes wurde auf eine nasse Oberfläche eines Gewebekulturkolbens gegeben, es werden etwa zehn Stücke in jeden Kolben platziert. Der Kolben wird umgedreht, dicht verschlossen und über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird er Kolben umgedreht und die Gewebefetzen bleiben am Boden des Kolbens angeheftet und frisches Medium (z.B. Ham-F12-Medium mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin) wird zugegeben. Dies wird dann etwa eine Woche bei 37°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird frisches Medium zugegeben und anschließend immer nach mehreren Tagen gewechselt. Nach zwei zusätzlichen Wochen Züchtung bildet sich eine Einzelschicht von Fibroblasten. Die Einzelschicht wird mit Trypsin behandelt und in größere Kolben überführt.
PMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219–25 (1988)), flankiert von den langen terminalen Wiederholungen des Moloney-Sarkomvirus der Maus, wird mit EcoRI und HindIII verdaut und anschließend mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt. Der lineare Vektor wird auf einem Agarosegel fraktioniert und unter Verwendung von Glaskügelchen gereinigt.
Die cDNA, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die den Sequenzen am 5'- bzw. 3'-Ende entsprechen. Der 5'-Primer enthält eine EcoRI-Stelle und der 3'-Primer umfaßt weiterhin eine HindIII-Stelle. Gleiche Mengen an linearem Rückgrat des Moloney-Sarkomvirus der Maus und amplifizierten EcoRI-Fragmenten und HindIII-Fragmenten wurden in Gegenwart vom T4-DNA-Ligase zusammengegeben. Das resultierende Gemisch wird unter für die Ligierung der beiden Fragmente geeigneten Bedingungen gehalten. Das Ligierungsgemisch wird zur Transformation von HB101-Bakterien verwendet, die dann auf Agar enthaltend Kanamycin, ausplattiert werden, um zu bestimmen, daß der Vektor das Gen von Interesse korrekt inseriert hatte.
Die amphotrophen Verpackungszellen pA317 oder GP+am12 werden in Gewebekultur in Dulbecco-modifiziertem-Eagles-Medium (DMEM) mit 10% Kälberserum (CS), Penicillin und Streptomycin bis zur konfluenten Dichte gezüchtet. Der MS-Vektor, der das Gen enthält, wird dann zu dem Medium zugegeben und die Verpackungszellen werden mit dem Vektor transduziert. Die Verpackungszellen produzieren jetzt infektiöse virale Partikel, die das Gen enthalten (die Verpackungszellen werden nun als Produktionszellen bezeichnet).
Zu den transduzierten Produktionszellen wird frisches Medium zugegeben und anschließend wird das Medium von einer Platte von 10 cm mit konfluenten Produktionszellen geerntet. Das verbrauchte Medium, das die infektiösen viralen Partikel enthält, wird durch ein Millipore-Filter filtriert, um abgelöste Produktionszellen zu entfernen und dieses Medium wird dann verwendet, um Fibroblastenzellen zu infizieren. Von einer sub-konfluenten Platte von Fibroblasten wird das Medium entfernt und rasch ersetzt durch das Medium von den Produktionszellen. Dieses Medium wird entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Wenn der Titer an Virus hoch ist, dann werden praktisch alle Fibroblasten infiziert und es ist keine Selektion erforderlich. Wenn der Titer sehr niedrig ist, ist es notwendig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektierbaren Marker wie neo oder his hat.
Die veränderten Fibroblasten werden dann in den Wirt injiziert, entweder allein oder nachdem sie auf Cytodex 3-Mikroträgerkügelchen bis zur Konfluenz gezüchtet wurden. Die Fibroblasten produzieren jetzt das Proteinprodukt.
Angesichts der vorstehenden Lehren sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich und deshalb kann die Erfindung im Unfang der beigefügten Ansprüche anders ausgeführt werden, als speziell beschrieben.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Polynucleotiden, die zumindest die reife Form des Polypeptids codieren, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 hat; (b) Polynucleotiden, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 haben, welche zumindest die reife Form des Polypeptids codiert; (c) Polynucleotiden, die das Polypeptid codieren, welches die Aminosäuresequenz zumindest der reifen Form des Polypeptids hat, das von der in ATCC 97349 enthaltenen cDNA codiert wird; (d) Polynucleotiden, welche die codierende Sequenz der cDNA haben, welche in ATCC 97349 enthalten ist, wobei sie mindestens die reife Form des Polypeptids codiert; (e) Polynucleotiden die zu mindestens 90% identisch sind mit einem Polynucleotid nach einem der Punkte (a) bis (d) und welche ein Polypeptid codieren, das in der Lage ist, zelluläre Differenzierung zu stimulieren; und (f) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das in der Lage ist, zelluläre Differenzierung zu stimulieren, welches zu mindestens 90% identisch ist mit einem Polypeptid, das durch ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche (a) bis (d) codiert wird; oder der komplementäre Strang eines solchen Polynucleotids.
Polynucleotid nach Anspruch 1, welches DNA ist.
DNA nach Anspruch 2, welche genomische DNA ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1, welche RNA ist.
Vektor, welcher das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Vektor nach Anspruch 5, wobei das Polynucleotid funktionell verknüpft ist mit Expressions-Kontrollsequenzen, welche die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben.
Wirtszelle, gentechnisch verändert mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das durch das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, umfassend die Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 7 und die Gewinnung des Polypeptids, welches durch das Polynucleotid codiert wird, aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von Zellen, welche in der Lage sind, ein Polypeptid zu exprimieren, das durch das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, umfassend die gentechnische Veränderung von Zellen mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6.
Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, welche durch ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, hat, oder gemäß dem Verfahren nach Anspruch 8 erhältlich ist.
Antikörper, welcher spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 10 bindet.
Antagonis/Inhibitor des Polypeptids nach Anspruch 10, welcher ein spezifischer Antikörper ist.
Arzneimittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Polypeptid nach Anspruch 10 oder DNA, welche das Polypeptid codiert und in der Lage ist, es in vivo zu exprimieren, oder den Antagonisten/Inhibitor nach Anspruch 12 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglicher Träger.
Diagnosemittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verwendung des Antagonisten/Inhibitors nach Anspruch 12 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Neoplasie oder zur Verhinderung der Bildung von extrazellulären Matrixrmolekülen in der Leber oder Lunge.
Diagnoseverfahren, umfassend die Analyse der Anwesenheit des Polypeptids nach Anspruch 10 in einer Probe, welche aus dem Wirt gewonnen wird.