DE69428214T2

DE69428214T2 - Transformierender wachstumsfaktor alpha h1

Info

Publication number: DE69428214T2
Application number: DE69428214T
Authority: DE
Inventors: Mark D. Adams; Rebecca Fuldner; Paul S. Meissner
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-03-08
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2014-05-13
Also published as: EP1063293A2; EP0759067A1; PT759067E; EP1063293A3; DE69428214D1; JPH09509846A; WO1995024466A1; EP0759067B1; DK0759067T3; EP0759067A4; AU681406B2; ZA943465B; ATE205254T1; US5633147A; KR970701776A; CA2184583A1; ES2161246T3; CN1087344C; CN1143386A; AU6835094A

Description

Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, von solchen Polynucleotiden codierte Polypeptide, die Verwendung von solchen Polynucleotiden und Polypeptiden, ebenso wie die Produktion solcher Polynucleotide und Polypeptide. Insbesondere ist das Polypeptid der vorliegenden Erfindung menschlicher transformierender Wachstumsfaktor alpha H1 (TGFα-H1). Die Erfindung betrifft auch die Hemmung der Wirkung solcher Polypeptide.
TGFα-H1 ist ein neues Mitglied der Familie der epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF). Die EGF-Wachstumsfaktoren-Supergen-Familie umfaßt eine große Zahl von medizinisch wichtigen Wachstumsfaktoren einschließlich der Unterfamilie der Alpha- Transformierenden Wachstumsfaktoren (TGFα).
Die EGF-Familie von Wachstumsfaktoren umfaßt Amphiregulin, Cripto, Heregulin und Heparin-bindenden EGF zusätzlich zu TGF-alpha. Das erst kürzlich entdeckte Mitglied dieser Familie ist Betacellulin, das aus konditioniertem Medium von Maus-Pankreas-beta- Tumorzellen gereinigt wurde (Sasada, et al., B. B. R. C. 190: 1173-9 (1993)). Es wurde gefunden, daß dieses Gen in Nieren- und Lebergewebe exprimiert wurde ebenso wie in verschiedenen Tumorzelllinien.
Gereinigtes und strukturell und funktionell charakterisiertes Amphiregulin wird im U.S.-Patent Nr. 5,115,096, erteilt am 19. Mai 1992, offenbart. Amphiregulin ist ein bifunktioneller, das Zellwachstum regulierender Faktor, der eine starke, inhibitorische Wirkung auf die DNA-Synthese in neoplastischen Zellen hat, aber auch das Wachstum gewisser normaler Zellen fördert. Das Amphiregulingen ist cloniert worden und wurde verwendet, um Plasmide zu konstruieren, die die Expression von bioaktivem Amphiregulin in transformierten E. coli-Zellen steuern.
TGFα hat pleitrope biologische Wirkungen. Die Produktion von bestimmten Mitgliedern der TGFα-Familie ist bei bestimmten Krankheitszuständen wie Krebs, Hauterkrankungen, Augenerkrankungen und an der Stelle einer Entzündung oder der Wundheilung erhöht. Mitglieder der TGFα-Familie und ihre verwandten Rezeptoren wurden über mehrere Jahre intensiv untersucht und umfassende Übersichtsartikel wurden kürzlich veröffentlicht (Prigent und Lemoine, Progreß in Growth Factor Research 4: 1-24 (1992); Schultz et al., J. Cell. Biochem 45: 346-352 (1991); Derynck, R., Mol. Reprod. and Dev. 27: 3-9 (1990)).
TGFα wird beim normalen Erwachsenen in einer breiten Vielzahl von Geweben exprimiert, einschließlich Haut, Gehirn, gastrointestinaler Schleimhaut, Brustgewebe (einschließlich jungfräulicher, schwangerer und laktierender Brust), aktivierten Makrophagen, Keratinocyten, und TGFα besitzt auch angiogene Aktivitäten (Kudlow, J. E., und Bjorge, J. D., Seminars in Cancer Biology, 1: 293-302 (1990)).
Zusätzlich zu ihrer Beteiligung bei der Regulierung der zellulären Proliferation bei verschiedenen Krankheiten sind die TGFα-Wachstumsfaktoren wichtig bei der Embryogenese und bei der Erhaltung der normalen Physiologie von Erwachsenen. Diese Wachstumsfaktoren beeinflussen eine Anzahl verschiedener Prozesse; es gibt Befunde, die nahe legen, daß TGFα bei mehreren Aspekten der Embryogenese involviert ist, da es in nicht befruchteten Oocyten exprimiert wird, bei Embryos vor der Implantation und in der maternalen Decidua, wo es bei der Implantation oder der Entwicklung der Placenta eine Rolle spielen kann. Transgene Mäuse ("Knockout"-Mäuse), denen ein funktionelles TGFα-Gen fehlt, haben eine abnormale Hautarchitektur, welliges Haar, lockige Barthaare und sie entwickeln häufig Hornhautentzündungen, und diese Beobachtungen legen nahe, daß TGFα eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Hautarchitektur und bei der Regulierung der Haarentwicklung spielen (Mann et al., Cell 73: 249-261 (1993)). Viele Mitglieder der Familie der alphatransformierenden Wachstumsfaktoren sind autokrine und/oder parakrine Wachstumsfaktoren für Krebszellen von vielen Geweben wie Brust (TGFα), Dickdarm (Cripto) und Pankreas (Betacellulin). Betacellulin ist ein starkes Mitogen für retinale Pigmentepithelzellen und vaskuläre glatte Muskelzellen (Shing et al., Science, 259: 1604-1607 (1993)); und Amphiregulin (AR) besitzt entweder Wachstum-stimulierende oder -hemmende Eigenschaften in Abhängigkeit von der Zielzelle, die getestet wird und der Konzentration des auf die Zelle aufgebrachten AR (Shoyab et al., Science 243: 1074-1076 (1989)). Zum Beispiel stimuliert AR die Proliferation menschlicher Vorhautfibroblasten, hemmt jedoch das Wachstum der A431-Zelllinie.
Darüber hinaus sind TGFα-Wachstumsfaktoren mit den folgenden Krankheitszuständen in Verbindung: a) Tumoren; kürzliche Untersuchungen haben gezeigt, daß die Verabreichung von Mitteln, die Antagonisten zur TGFα- (und/oder der Mitglieder der Familie) Aktivität in Mäusen sind, eine Regression des Tumors verursachen (Cook et al., Cancer Research, 52: 3224-3227 (1992)); b) Hauterkrankungen, zum Beispiel Psoriasis (Cook et al., Cancer Research, 52: 3224-3227 (1992)); und c) Wundheilung (Schultz et al., J. Cell. Biochem 45: 346-352 (1991)).
Menschlicher Typ-alpha-transformierender Wachstumsfaktor (TGFα) ist ein kleines, mitogenes Protein von 6 Kda, das 50 Aminosäuren enthält und 3 Disulfidbindungen. TGFα interagiert mit dem EGF-Rezeptor und aktiviert seine intrinsische Proteinkinase. Die Rolle von TGFα in der normalen Physiologie wurde von Kudlow, J. E. und Bjorge. J. D., Cancer Biology, 1: 293-302 (1990) beschrieben. Die Expression von TGFα ist am vorherrschendsten und reichlichsten in transformierten Zellen und Tumoren, ist aber auch mit relativ niedrigen oder mäßigen Speigeln in bestimmten normalen, erwachsenen Geweben nachweisbar (Gehirn, Keratinocyten, Epithelzellen, aktivierten Makrophagen, Hypophyse). Die Expression von TGFα ist auch in Embryos in der Entwicklung zu spezifischen Zeiten und in spezifischen Geweben nachweisbar, am bemerkenswertetsten im Gehirn, den Nieren und der Leber in der Entwicklung.
Von fast allen Mitgliedern dieser Familie, die bis heute gereinigt und cloniert wurden, wurde gefunden, daß sie sechs konservierte Cysteinreste enthalten, die Disulfidbindungen bilden, um drei Peptidloops zu erzeugen, und daher eine ähnliche Sekundärstruktur besitzen. Zusätzlich werden alle dieser Wachstumsfaktoren als ein viel größerer, Membran-gebundener, glycosylierter Vorläufer synthetisiert. TGFα-H 1 enthält alle sechs dieser konservierten Cysteinreste.
Diese Familie von Wachstumsfaktoren interagiert mit der EGF-Rezeptor-Familie, die auch c-erb-2 und c-erb-3 umfaßt, deren Liganden nicht identifiziert wurden (Prigent und Lemoine, Prog. in Growth Factor Res., 4: 1-24 (1992)). Die Beteiligung dieser Rezeptoren bei der menschlichen Neoplasie wurde ausführlich untersucht und es wurde gefunden, daß die Überexpression dieser Rezeptoren einhergeht mit einer schlechten Prognose für einige Formen von Krebs (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992)). Es wurde auch gefunden, daß einige Tumorzellen signifikant erhöhte Spiegel von TGFα und/oder anderen Mitgliedern dieser Familie synthetisieren.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues, reifes Polypeptid bereitgestellt, das ein menschlicher transformierender Wachstumsfaktor alpha H1 (TGFα-H1) ist, ebenso wie Fragmente, Analoga und Derivate davon.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Polynucleotide (DNA oder RNA) bereitgestellt, die solche Polypeptide codieren.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt, das ein lösliches Fragment von TGFα-H1 ist, d. h. TGFα-H1 ohne den Transmembranteil.
Gemäß einem noch anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Produktion solcher Polypeptide mittels rekombinanter Verfahren bereitgestellt.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide oder Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren, zur Herstellung von Zusammensetzungen für diagnostische und therapeutische Zwecke bereitgestellt, zum Beispiel zur Stimulierung der Wundheilung, zur Wiederherstellung der normalen neurologischen Funktion nach einem Trauma oder AIDS-Demenz, zur Behandlung von Augenerkrankungen, zur Zielrichtung und Abtötung gewisser Zellen, zur Behandlung von Nieren- und Lebererkrankungen und um die Entwicklung der Haarfollikeln zu fördern.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper gegen TGFα-H1 oder ein lösliches Fragment davon bereitgestellt.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten dem Durchschnittsfachmann von den Lehren hierin offensichtlich sein.
Die folgenden Abbildungen sind nur zur Illustration spezifischer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gedacht und sind in keiner Weise als Beschränkungen gedacht.
Fig. 1. zeigt die vorhergesagte Aminosäure-Translation des offenen Leserahmens der TGFα-H1-cDNA. Die Nummerierung startet bei Position 7 wegen des synthetischen BamHI- Linkers an den Positionen 1-6 (nicht gezeigt), der verwendet wurde, um das Gen zu clonieren. Das endständige Stop-Codon an Position 406 wird ebenfalls gezeigt. Die gezeigte Sequenz codiert 132 Aminosäuren. Durch Vergleich mit den anderen Mitgliedern der TGFα- Genfamilie kann geschlossen werden, daß nur die 50 Aminosäuren, die unterstrichen sind, erforderlich sind für die Produktion eines löslichen, biologisch aktiven Wachstumsfaktors (vgl. Fig. 3).
Fig. 2 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz der TGFα-H1-cDNA mit 3 286 Nucleotiden. Der synthetische BamHI-Linker an Position 1 und der synthetische XhoI-Linker an Position 3 286 sind fett dargestellt. Der offene Leserahmen, der das TGFα-H1-Protein codiert, ist unterstrichen, gefolgt von dem endständigen Stop-Codon (fett dargestellt). In dem langen nicht-translatierten 3'-Bereich werden Unsicherheiten in der Sequenz unter Verwendung der IUPAC Standard-Codes dargestellt.
Fig. 3 zeigt die Ausrichtung von TGFα-H1 mit anderen Mitgliedern der TGFα- Genfamilie. Sterne zeigen die Positionen der sechs kritischen, konservierten Cysteinreste, die für die biologische Aktivität dieser Familie von Wachstumsfaktormolekülen erforderlich sind. Die 50 Aminosäurereste von TGFα, die unterstrichen sind, sind diejenigen Reste, von denen gezeigt wurde, daß sie für die Aktivität des löslichen Faktors erforderlich sind. (Amphi=Amphiregulin)
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse und zeigt das RNA- Expressionsmuster des Polypeptids der vorliegenden Erfindung.
Das Polynucleotid dieser Erfindung wurde in cDNA-Bibliotheken entdeckt, die aus humanem Gehirn und fötalem Gewebe abgeleitet waren. Es ist strukturell verwandt mit der TGFα-Genfamilie. Es enthält einen offenen Leserahmen, der ein reifes Polypeptid von 132 Aminosäuren codiert, das eine signifikante Homologie zu einer Anzahl von Mitgliedern der TGFα-Genfamilie aufweist; diese Mitglieder umfassen TGFα selbst, ebenso wie andere Mitglieder wie Amphiregulin und Cripto. Darüber hinaus sind die sechs Cysteinreste, die in allen Mitgliedern in einem charakteristischen Motiv auftreten, in TGFα-H1 konserviert.
In Fig. 1 sind die 50 Aminosäuren, die unterstrichen sind, das lösliche Fragment von TGFα-H1, d. h. ohne den Transmembranteil. Wie TGFα wird die lösliche Form von TGFα-H1 von einem größeren Aminosäure-Glycoprotein-Vorläufer, der in die Membran integriert ist, mittels proteolytischer Spaltung freigesetzt. Derynck, R., Mol. Repro. And Dev., 27 : 3-9 (1990). (Derynck, Mol. Reprod. Devel., 27 : 3-9 (1990)).
Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in der Form von RNA oder in der Form von DNA sein, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA umfaßt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und wenn sie einzelsträngig ist, kann sie der codierende Strang oder der nicht-codierende (Antisense) Strang sein. Die codierende Sequenz, die das reife Polypeptid codiert, kann identisch sein zu der in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenz oder zu der des hinterlegten Clons, oder sie kann eine unterschiedliche codierende Sequenz sein, welche codierende Sequenz, aufgrund der Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes, das gleiche, reife Polypeptid codiert wie die DNA von Fig. 1 oder die hinterlegte cDNA.
Das Polynucleotid, das das reife Polypeptid von Fig. 1 oder ein lösliches Fragment davon codiert, kann umfassen: nur die codierende Sequenz für das reife Polypeptid oder eine lösliche Form davon; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid oder eine lösliche Form davon und eine zusätzliche codierende Sequenz wie eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Proprotein-Sequenz; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid oder eine lösliche Form davon (und gegebenfalls eine zusätzliche codierende Sequenz) oder eine nichtcodierende Sequenz, wie Introns oder eine nicht-codierende Sequenz 5' und/oder 3' der codierende Sequenz für das reife Polypeptid.
Daher umfaßt der Ausdruck "Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert" ein Polynucleotid, das nur codierende Sequenz für das Polypeptid umfaßt ebenso wie ein Polynucleotid, das zusätzliche codierende und/oder nicht-codierende Sequenzen umfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polynucleotide, die zumindest 95% Sequenzidentität mit einem vorstehend definierten Polynucleotid haben. Somit betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin Varianten der hier vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente, Analoga und Derivate des Polypeptids codieren, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von Fig. 1 hat, oder eine lösliche Form davon. Die Variante des Polynucleotids kann eine natürlich vorkommende allelische Variante des Polynucleotids sein oder eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotids.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Polynucleotide, die das gleiche reife Polypeptid oder eine lösliche Form davon codieren, wie in Fig. 1 gezeigt.
Wie hier vorstehend angezeigt, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz haben, die eine natürlich vorkommende allelische Variante der in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenz ist.
Wie im Fachgebiet bekannt ist eine allelische Variante eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotiden hat, was die Funktion des codierten Polypeptids nicht substantiell ändert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls Polynucleotide, bei denen die codierende Sequenz für das reife Polypeptid im gleichen Leserahmen an eine Polynucleotidsequenz fusioniert sein kann, die bei der Expression und Sezernierung des Polypeptids von einer Wirtszelle helfen kann, zum Beispiel eine Leader-Sequenz, die als eine sekretorische Sequenz zur Kontrolle des Transports eines Polypeptids aus der Zelle fungiert. Das Polypeptid, das eine Leader-Sequenz hat, ist ein Prä-Protein und die Leader-Sequenz kann durch die Wirtszelle abgespalten werden, um die reife Form des Polypeptids zu bilden. Die Polynucleotide können auch ein Pro-Protein codieren, was das reife Protein plus zusätzliche 5'Aminosäurereste ist. Ein reifes Protein, das eine Pro-Sequenz hat, ist ein Pro-Prötein und ist eine inaktive Form des Proteins. Sobald die Pro-Sequenz abgespalten wird, bleibt ein aktives, reifes Protein übrig.
So kann zum Beispiel das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ein reifes Protein codieren, oder ein Protein, das eine Pro-Sequenz hat, oder ein Protein, das sowohl eine Pro- Sequenz als auch eine Pre-Sequenz hat (Leader-Sequenz).
Bei den Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung kann auch die codierende Sequenz im Rahmen fusioniert sein mit einer Markersequenz, was die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ermöglicht. Die Markersequenz kann ein Hexa- Histidin-Tag sein, das von einem pQE-9-Vektor zur Verfügung gestellt wird, um die Reinigung des reifen Polypeptids, das mit dem Marker fusioniert ist, im Falle eines bakteriellen Wirts zu ermöglichen, oder die Markersequenz kann zum Beispiel ein Hemagglutinin (HA)-Tag sein, wenn ein Säugetierwirt, z. B. COS-7-Zellen, verwendet wird. Das HA-Tag entspricht einem Epitop, das vom Influenza-Hemagglutinin-Protein (Wilson, L, et al., Cell, 37: 767 (1984))abgeleitet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hier vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "stringente Bedingungen", daß eine Hybridisierung nur eintritt, wenn zwischen den Sequenzen mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% Identität ist. Die Polynucleotide, die mit den hier vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren, codieren in einer bevorzugten Ausführungsform Polypeptide, die im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität erhalten wie das reife Polypeptid, das von der cDNA von Fig. 1 oder der hinterlegten cDNA codiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein TGFα-H1-Polypeptid, das von einem Polynucleotid gemäß der Erfindung codiert wird.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein, vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid.
Das Polypeptid gemäß der Erfindung kann einen oder zwei Aminosäurereste umfassen, die eine Substituentengruppe aufweisen, oder es kann ein Polypeptid sein, in dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie eine Verbindung zur Erhöhung der Halbwertszeit des Polypeptids (zum Beispiel Polyethylenglycol), oder es kann ein Polypeptid sein, in dem zusätzliche Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, wie eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Polypeptids verwendet wird, oder eine Pro-Protein-Sequenz.
Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in isolierter Form bereitgestellt und sind vorzugsweise zur Homogenität gereinigt.
Der Ausdruck "isoliert" bedeutet, daß das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt ist (d. h. die natürliche Umgebung, wenn es in der Natur vorkommt). Zum Beispiel ist natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert, aber das gleiche Polynucleotid oder DNA oder Polypeptid, das von einigem oder dem gesamten, in dem natürlichen System coexistierenden Material getrennt ist, ist isoliert. Ein solches Polynucleotid könnte Teil eines Vektors sein und/oder ein solches Polynucleotid oder Polypeptid könnte Teil einer Zusammensetzung sein und dennoch isoliert sein, dadurch, daß ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil seiner natürlichen Umgebung ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die gentechnisch mit Vektoren der Erfindung verändert sind, und die Produktion von Polypeptiden der Erfindung mittels rekombinanter Verfahren.
Wirtszellen werden mit den Vektoren dieser Erfindung gentechnisch verändert (transduziert oder transformiert oder transfiziert), welche zum Beispiel ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können. Der Vektor kann zum Beispiel in der Form eines Plasmids, eines Viruspartikels, eines Phagen usw. sein. Die veränderte Wirtszelle kann in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet werden, die in geeigneter Weise modifiziert sind für aktivierende Promotoren, selektionierende Transformanten oder zur Amplifikation des TGFα- H1-Gens. Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und dergleichen sind die, die zuvor bei der Wirtszelle für die Expression verwendet wurden und werden dem Durchschnittsfachmann geläufig sein.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Produktion eines Polypeptids mittels rekombinanter Verfahren verwendet werden. So kann zum Beispiel die Polynucleotidsequenz in einem beliebigen einer Vielzahl von Expressionsvehikeln vorhanden sein, insbesondere Vektoren oder Plasmide zur Expression eines Polypeptids. Solche Vektoren umfassen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z. B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Hefeplasmide; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA, viraler DNA wie Vaccinia, Adenovirus, Hühnerpestvirus und Pseudorabiesvirus abgeleitet sind. Es kann jedoch jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, so lange sie in dem Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
Die geeignete DNA-Sequenz kann mittels einer Vielzahl an Verfahren in den Vektor inseriert werden. Im allgemeinen wird die DNA-Sequenz in eine geeignete Restriktions- Endonuclease-Stelle mittels Verfahren; die im Fachgebiet bekannt sind, inseriert. Solche Verfahren und andere werden so gesehen, daß sie im Können des Durchschnittfachmanns liegen.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist operativ verknüpft mit einer geeigneten Expressionskontrollsequenz (en) (Promotor), um die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele für solche Promotoren können erwähnt werden: der LTR- oder der SV40-Promotor, der E. coli-lac- oder -trp-Promotor, der Phage Lambda-PL-Promotor und andere Promotoren, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomenbindungsstelle zur Initiation der Translation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Erhöhung der Expression enthalten.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein Gen, das ein phänotypisches Merkmal zur Selektion von transformierten Wirtszellen verleiht, wie Dihydrofolatreduktase oder Neomycinresistenz für die eukaryontische Zellkultur oder wie Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz in E. coli.
Der Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz, wie hier vorstehend beschrieben, enthält ebenso wie ein geeigneter Promotor oder eine Kontrollsequenz können verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, so daß der Wirt das Protein exprimieren kann. Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte können erwähnt werden: Bakterienzellen wie E. coli, Salmonella typhimurium; Streptomyceten; Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila und Sf9; tierische Zellen wie CHO, COS oder Bowes Melanoma; Pflanzenzellen usw. Die Auswahl eines geeigneten Wirts wird nach den Lehren hier so gesehen, daß sie im Können des Durchschnittfachmanns liegt.
Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte, die eine oder mehrere der vorstehend ausführlich beschriebenen Sequenzen enthalten. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, wie ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung inseriert wurde, in Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfaßt das Konstrukt weiterhin regulatorische Sequenzen, zum Beispiel einschließlich eines Promotors, der operativ mit der Sequenz verknüpft ist. Eine große Zahl an geeigneten Vektoren und Promotoren sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt und sind kommerziell verfügbar. Die folgenden Vektoren sind als Beispiele dargestellt: Bakteriell: pQE70, PQE60, PQE-9 (Qiagen), Pbs, Phagescript, PsiX174, Pbluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontisch: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Es kann jedoch jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, so lange sie in dem Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
Promotorbereiche können von jedem gewünschten Gen unter Verwendung des CAT (Chloramphenicoltransferase)-Vektors oder anderer Vektoren mit Selektionsmarkern selektioniert werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Besonders erwähnte bakterielle Promotoren umfassen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL und trp. Eukaryontische Promotoren umfassen den unmittelbar frühen CMV, HSV-Thymidinkinase, früher und später SV40, LTRs von Retroviren und Maus-Metallothionein-I. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors ist innerhalb des Wissens eines Durchschnittfachmanns.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die das vorstehend beschriebene Konstrukt enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle sein, wie eine Säugerzelle, oder eine niedrigere eukaryontische Zelle sein, wie eine Hefezelle, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle sein, wie eine Bakterienzelle. Die Einbringung des Konstrukts in die Wirtszelle kann mittels der Calciumphosphat-Transfektion, der DEAE-Dextran vermittelten Transfektion oder der Elektroporation (Davis, L., Dibner, M., Battey, L, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)) erreicht werden.
Die Konstrukte in den Wirtszellen können in einer herkömmlichen Weise verwendet werden, um das Genprodukt zu produzieren, das die rekombinante Sequenz codiert. In einer anderen Ausführungsform können die Polypeptide der vorliegenden Erimdung synthetisch mittels herkömmlicher Peptidsynthesegeräte produziert werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert werden. Auch zellfreie Translationssysteme können zur Produktion solcher Proteine verwendet werden, unter Verwendung von RNAs, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung bei prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden beschrieben von Sambrook. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), dessen Offenbarung durch Bezugnahme hiermit eingeschlossen wird.
Die Transkription einer DNA, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, durch höhere Eukaryonten wird durch die Insertion einer Verstärkersequenz in den Vektor erhöht. Verstärker sind cis-agierende DNA-Elemente, gewöhnlich etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor einwirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiele umfassen den SV40 Verstärker an der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100 bis 270), einen frühen Cytomegaloviruspromotor-Verstärker, einen Polyoma-Verstärker an der späten Seite des Replikationsursprungs, und Adenovirus-Verstärker.
Im allgemeinen werden die Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker umfassen, die die Transformation der Wirtszelle zulassen, z. B. das Ampicillinresistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-TRP1-Gen, und einen Promotor, der von einem hoch exprimierten Gen abgeleitet ist, um die Transkription eines stromabwärts gelegenen Strukturgens zu steuern. Solche Promotoren können von Operons abgeleitet werden, die glycolytische Enzyme wie 3-Phosphoglyceratkinase (PGK); α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine, unter anderen, codieren. Die heterologe Struktursequenz wird in geeigneter Phase mit den Translationsinitiations- und -terminationssequenzen zusammengebracht und vorzugsweise mit einer Leader-Sequenz, die in der Lage ist, die Sezernierung des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium zu steuern. Gegebenfalls kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, das ein N-terminales Identifikationspeptid enthält, das erwünschte Charakteristika verleiht, z. B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung von exprimiertem, rekombinantem Produkt.
Expressionsvektoren von Nutzen für bakterielle Anwendung werden konstruiert durch Insertion einer strukturellen DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und Translationsterminationssignalen in arbeitsfähiger Lesephase mit einem funktionellen Promotor. Der Vektor wird einen oder mehrere phänotypische Selektionsmarker und einen Replikationsursprung umfassen, um die Erhaltung des Vektors sicherzustellen und um die Amplifikation innerhalb des Wirts bereitzustellen, wenn erwünscht. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl wahlweise auch andere verwendet werden können.
Als ein repräsentatives, aber nicht beschränkendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren für bakterielle Anwendung einen Selektionsmarker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, die abgeleitet sind von kommerziell erhältlichen Plasmiden, die die genetische Elemente des wohl bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) enthalten. Solche kommerziellen Vektoren umfassen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals; Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322 "Grundgerüst"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und dem Wachsen des Wirtsstamms zu einer geeigneten Zelldichte wird die Unterdrückung des ausgewählten Promotor durch geeignete Maßnahmen aufgehoben (z. B. Temperaturveränderung oder chemische Induktion) und die Zellen werden für einen zusätzlichen Zeitraum kultiviert.
Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen und der resultierende Rohextrakt wird für die weitere Reinigung aufbewahrt.
Mikrobielle Zellen, die für die Expression von Proteinen verwendet werden, können mittels jeden herkömmlichen Verfahrens aufgebrochen werden, einschließlich wiederholter Gefrier-Auftau-Schritte, Ultraschall, mechanischem Aufbrechen oder der Verwendung von Zellen lysierenden Mitteln.
Verschiedene Säugetierzellkultursysteme können ebenfalls für die Expression von rekombinanten Proteinen verwendet werden. Beispiele für Säugetierexpressionssysteme umfassen die COS-7-Linien von Affennierenfibroblasten, die von Gluzman, Cell, 23: 175 (1981) beschrieben wurden, und andere Zelllinien, die in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, zum Beispiel die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säugetierexpressionsvektoren werden einen Replikationsursprung umfassen, einen geeigneten Promotor und Verstärker und auch etwa erforderliche Ribosomenbindungsstellen, Polyadenylierungsstelle, Donor- und Acceptorstellen zum Spleißen, Transkriptionsterminationssequenzen und 5'-flankierende nicht-transkribierte Sequenzen. DNA-Sequenzen, die vom viralen SV-40-Genom abgeleitet sind, zum Beispiel SV40- Ursprungs-, früher Promotor-, Verstärker-, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die erforderlichen nicht transkribierten genetischen Elemente zu erhalten.
TGFα-H1 oder seine lösliche Form wird aus rekombinanten Zellkulturen mittels bisher dafür verwendeter Verfahren gewonnen und gereinigt, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauscherchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie (d. h. unter Verwendung von DNA oder Nucleotiden auf einem festen Träger), Hydroxylapatitchromatographie und Lectinchromatographie. Vorzugsweise liegen während der Reinigung niedrige Konzentrationen (etwa 0,1-5 mM) an Calcium vor (Price, et al., J. Biol. Chem., 244: 917 (1969)). Proteinrückfaltungsschritte können, wenn erforderlich, bei der Komplettierung der Konfiguration des reifen Proteins verwendet werden. Letztlich kann Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) bei den letzten Reinigungsschritten verwendet werden.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein natürlich gereinigtes Produkt sein, oder ein Produkt chemischer Syntheseverfahren, oder mittels rekombinanter Verfahren von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt (zum Beispiel von Bakterien-, Hefe-, höheren Pflanzen-, Insekten- und Säugetierzellen in Kultur) produziert werden. In Abhängigkeit von dem Wirt, der bei einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendet wird, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit Säugetier- oder eukaryontischen Kohlenhydraten glycosyliert sein oder sie können nicht glycosyliert sein. Die Polypeptide der Erfindung können auch einen anfänglichen Methioninaminosäurerest umfassen.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zur Charakterisierung von Rezeptoren in der EGFR-Familie von EGF-Rezeptoren verwendet werden. Diese Familie umfaßt zur Zeit EGFR1-, EGFR2-, EGFR3- und EGFR4-Rezeptoren. Der EGFR2-Rezeptor wird auch als erb-2 bezeichnet und dieses Molekül ist von Nutzen bei einer Reihe von diagnostischen und therapeutischen Indikationen (Prigent, S. A., und Lemoine, N. R., Prog. in Growth Factor Res., 4: 1-24 (1992)). Das TGFα-H1-Polypeptid ist wahrscheinlich ein Ligand für einen oder mehrere dieser Rezeptoren ebenso wie für bisher nicht identifizierte neue Rezeptoren vom EGF-Typ. Die Verwendung des TGFα-H1-Polypeptids kann bei der Identifikation, Charakterisierung und Clonierung solcher Rezeptoren helfen.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Wiederherstellung und Verstärkung von neurologischen Funktionen verwendet werden, die als ein Ergebnis von Trauma oder anderer schädlicher Pathologien vermindert sind (wie AIDS-Demenz, senile Demenz usw.). Es wurde gefunden, daß TGFα und seine Homologen der am meisten vorhandene Ligand für den EGF/TGFα-Rezeptor in den meisten Teilen des Gehirns ist (Kaser, et al., Brain Res Mol Brain Res: 16: 316-322 (1992)). Es scheint eine breit gestreute Verbreitung von TGFα in verschiedenen Bereichen des Gehirns zu geben, im Gegensatz zu EGF, das nur in kleineren, klarer abgegrenzten Gebieten anwesend ist, was nahe legt, daß TGF-alpha eine physiologische Rolle in Hirngewebe spielen könnte. Diese zahlreichen Rezeptorstellen für TGFα im Gehirn legen nahe, daß TGF einen wichtigen Nutzen bei der Förderung der normalen Gehirnzelldifferenzierung und -funktion hat. Dem entsprechend kann die Verabreichung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in Fällen, bei denen die neurologische Funktion verringert ist, das Gehirn stimulieren und die richtigen physiologischen Funktionen erhöhen.
TGFα-H1 oder seine lösliche Form können auch für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Augenerkrankungen, zum Beispiel Hornhautentzündung, verwendet werden. Eine Reihe von Experimenten haben gezeigt, daß die Mitglieder der TGFα-Genfamilie bei solchen Erkrankungen eine Rolle spielen. Eine kürzliche Veröffentlichung faßt einige der Ergebnisse zusammen, die sich auf die Rolle beziehen, die diese Wachstumsfaktoren bei Augenkrankheiten spielen (Mann et al Cell 73: 249-261 (1993)). Neuere Ergebnisse haben gezeigt, daß eine Reihe von Mäusen, denen das TGFα-Gen fehlt, auf Grund des Eindringens von Leukocyten und anderen Zellen in die Substantia Propria der Augen eine Hornhautentzündung zeigten.
Zusätzlich kann die Spezifität der TGFα-Wachstumsfaktoren für ihre Zielzellen als ein Mechanismus ausgenutzt werden, um die Zielzelle zu zerstören. Zum Beispiel kann in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung TGFα-H1 oder seine löslichen Formen an ein toxisches Molekül gekoppelt sein (mittels einer Vielzahl von Verfahren): zum Beispiel Radiopharmazeutika, die die Zielzellen inaktivieren. Diese Wachstumsfaktor-Toxin- Fusionen töten die Zielzelle (und in gewissen Fällen benachbarte Zellen mittels einer Anzahl von "bystander"-Effekten). Ein neueres Beispiel solcher Toxin-Fusionsgene ist veröffentlicht von Mesri, et al., J. Biol. Chem. 268: 4853-62 (1993).
Auf die gleiche Weise kann TGFα-H1 für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die es als eine anti-neoplastische Verbindung enthalten. Eine solche erfindungsgemäße pharmazeutischen Zusammensetzung kann zur Verabreichung in einer Vielzahl von Wegen geplant werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Injektion, Infusion, topisch, parenteral usw. Die Verabreichung kann in jedem physiologisch akzeptablen Träger sein, einschließlich Phosphat-gepufferter Salzlösung, Salzlösung, sterilisiertes Wasser usw. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch TGFα-H1 und verwandte Moleküle umfassen, die in Liposomen verkapselt sind oder mit Antikörpern konjugiert, die Tumor- oder Zell-spezifische Antigene erkenne und an sie binden und damit Mittel für die "Zielrichtung" von Zellen bereitstellen.
Das TGFα-H1-Polypeptidfragment kann auch für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung gewisser Nierenerkrankungen verwendet werden, da gefunden wurde, daß es eine Expression dieser Wachstumsfaktoren in der Niere gegeben hat. Deshalb können diese Faktoren für die ordnungsgemäße physiologische Erhaltung dieses Organs erforderlich sein. Das Polypeptid dieser Erfindung kann auch für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die Bezug haben zur Leberregeneration/Leberdysfunktion, da TGFα und seine Homologe und der Hepatocyten- Wachstumsfaktor die Hepatocytenregeneration nach teilweiser Hepatektomie und nach akuter Leberzellnekrose anstoßen (Masuhara, M. et al., Hepatology 16: 1241-1249 (1992)).
Eine wichtige Verwendung von TGFα-H1 betrifft die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Wundheilung. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung einer großen Vielzahl von Wunden verwendet werden, im wesentlichen alle Hautwunden, Hornhautwunden und Verletzungen der mit Epithel ausgekleideten, hohlen Organe des Körpers. Zur Behandlung geeignete Wunden umfassen diejenigen, die von Traumen wie Verbrennungen, Abschürfungen und Schnitten resultieren, ebenso wie von chirurgischen Verfahren, wie chirurgischen Schnitten und Hautverpflanzung. Andere Zustände, die geeignet sind zur Behandlung mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung, umfassen chronische Zustände, wie chronische Geschwüre, Diabetesgeschwüre und andere, nicht heilende (trophische) Zustände.
In den pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung kann TGFα-H1 oder sein lösliches Fragment zur Anwendung auf die betroffenen Flächen in physiologisch akzeptable Träger eingebracht sein. Die Natur der Träger kann breit streuen und wird von dem geplanten Anwendungsort abhängen. Zur Anwendung bei der Haut wird üblicherweise eine Creme- oder Salbenbasis bevorzugt, geeignete Basen umfassen Lanolin, Silvadene (Marion) (insbesondere für die Behandlung von Verbrennungen), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Conn.), und dergleichen. Wenn erwünscht, wird es möglich sein, TGFα-H1 enthaltende Zusammensetzungen in Verbandmaterial und andere Wundabdeckungen einzubringen, um eine kontinuierliche Zufuhr des Peptids zu der Wunde zu gewährleisten. Auch Aerosolverabreichungen können Anwendung finden.
Die Konzentration von TGFα-H1 in der pharmazeutischen Zusammensetzung ist nicht kritisch, sollte aber ausreichend sein, um die Epithelzellproliferation zu induzieren. Die Zusammensetzungen sollen für die topische Anwendung auf die betroffene Fläche geeignet sein, z. B. typischerweise Augentropfen zur Verabreichung am Auge oder Cremes, Salben oder Lotions zur Verabreichung auf die Haut. Im Falle der Augen ist die pharmazeutische Zusammensetzung für häufige Anwendung geplant, was bedeutet, daß sie in Zeiträumen von 4 Stunden oder weniger verabreicht wird. Bei der Haut ist es wünschenswert, die Behandlungszusammensetzung während der Heilung kontinuierlich an dem betroffenen Gebiet zu halten, mit Verabreichungen der Behandlungszusammensetzung zwischen zwei bis vier mal am Tag, oder öfter.
Die verabreichte Menge des betreffenden Polypeptids in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung wird mit der Verabreichungsart variieren, der Anwendung anderer aktiver Verbindungen und dergleichen, und wird sich im allgemeinen im Bereich von etwa 1 ug bis zu 100 ug bewegen. Das betreffende Polypeptid kann in der pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem physiologisch verträglichen Träger verabreicht werden, wie Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung oder dergleichen. Die Menge der verabreichten Verbindung wird empirisch bestimmt, basierend auf dem Ansprechen der Zellen in vitro und dem Ansprechen von Versuchstieren auf die betreffenden Polypeptide oder Formulierungen, die die betreffenden Polypeptide enthalten.
TGFα-H1 oder sein lösliches Fragment können zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Anwendung bei der Modulation der Angiogenese, der Knochenresorption, der Immunantwort und der synaptischen und neuronalen Wirkungsfunktionen verwendet werden. TGFα-H1 kann auch zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Anwendung bei der Modulation der Arachidonsäurekaskade verwendet werden.
TGFα-H1 oder sein lösliches Fragment können auch zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für Anwendungen verwendet werden, die sich auf die terminale Differenzierung beziehen. Viele TGFα-Faktoren und ihre Homologe induzieren die terminale Differenzierung in ihren Zielzellen. Diese Eigenschaft kann in vivo ausgenutzt werden, indem man den Faktor verabreicht und den Tod der Zielzelle induziert. Diese Anwendungsart wird in Betracht gezogen bei Krankheitszuständen, die einhergehen mit der Hyperproliferation von medizinisch unerwünschten Zelltypen wie bei Krebs und anderen proliferativen Krankheitszuständen (z. B. Entzündung, Psoriasis usw.). Zusätzlich zur in vivo- Verabreichung gibt es eine Reihe von Situationen, bei denen eine in vitro-Verabreichung gerechtfertigt sein kann. Zum Beispiel kann Knochenmark in vitro von unerwünschten Zellpopulationen gereinigt werden durch Behandlung der Zellen mit Wachstumsfaktoren und/oder Derivaten davon.
Anwendungen von pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung betreffen auch Alopecia, Haarausfall und andere Hautzustände, die die follikulare Entwicklung des Haars beeinflussen. Mehrere Befunde belegen den Einfluß von TGFα-Wachstumsfaktoren auf solche Zustände. Wie vorstehend beschrieben zeigen "Knockout"-Mäuse, die so konstruiert sind, daß sie eine Null-Mutation im TGFα-Gen haben, Abnormalitäten in Bezug auf Quantität und Qualität der Haarsynthese. Zusätzlich haben Kartierungsstudien in Mäusen gezeigt, daß einige Mutationen, die das Haarwachstum beeinflussen, auf dem TGFα-Gen-Lokus liegen (Mann et al., Cell 73: 249-261 (1993)). Topische oder systemische Verabreichungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung, die TGFα-H1 oder Derivate davon enthalten, können zur Behandlung einiger Formen von Alopecia und Haarausfall verwendet werden und diese Ansprüche liegen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung.
Gewisse Krankheitszustände können teilweise oder vollständig gelindert werden durch die systemische, klinische Verabreichung von TGFα-H1-Wachstumsfaktor. Insbesondere kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur Verabreichung in der Form der Gentherapie (vgl. nachstehend) geplant werden; oder durch die Verabreichung von Peptiden oder Proteinen, die von rekombinanten Konstrukten von TGFα-H1-DNA synthetisiert wurden oder durch chemische Peptidsynthese (Woo et al., Protein Engineering 3: 29-37 (1989)).
Gentherapie ist die Expression des Polypeptids der Erfindung in vivo.
Somit kann die pharmazeutische Zusammensetzung zum Beispiel Zellen, wie Knochenmarkszellen, umfassen, die mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA) gentechnisch verändert sind, das das Polypeptid ex vivo codiert. Die veränderten Zellen werden dann an einen Patienten verabreicht, der mit dem Polypeptid behandelt werden soll. Solche Verfahren sind im Stand der Technik wohl bekannt. Zum Beispiel können die Zellen mittels Verfahren verändert werden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, durch Verwendung eines retroviralen Partikels, der RNA enthält, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
In ähnlicher Weise kann die pharmazeutische Zusammensetzung geplant werden, um Zellen in vivo zu verändern zur Expression des Polypeptids in vivo, zum Beispiel mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Wie im Stand der Technik bekannt ist, kann eine Produktionszelle zur Produktion eines retroviralen Partikels, der RNA enthält, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einem Patienten verabreicht werden, um Zellen in vivo zu verändern und zur Expression des Polypeptids in vivo.
Diese und andere Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung mittels solcher Verfahren sollte dem Durchschnittsfachmann von den Lehren der vorliegenden Erfindung offensichtlich sein. Zum Beispiel kann das Expressionsvehikel zur Veränderung von Zellen ein anderes sein als ein retroviraler Partikel, zum Beispiel ein Adenovirus, das nach Kombination mit einem geeigneten Transportvehikel verwendet werden kann, um Zellen in vivo zur verändern.
In einer anderen Ausführungsform kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung für ein Verfahren der Gentherapie geplant werden, bei der die Verabreichung des Polypeptids durch Injektion von nackter oder verkapselter (z. B. Liposomen usw.) TGFα-H1- DNA erreicht werden kann.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger angewendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Proteins und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Vehikel. Ein solcher Träger umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung sollte mit dem Verabreichungsweg zusammenpassen.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder Kit bereit, der einen oder mehrere Behältnisse umfaßt, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung gefüllt sind. Zusammen mit solchen Behältnissen kann eine Information in einer Form vorliegen, die von einer Regierungsstelle vorgeschrieben wird, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von pharmazeutischen oder biologischen Produkten regelt, wobei die Information die Zulassung der Stelle für die Herstellung, Verwendung und den Verkauf für die menschliche Anwendung wiedergibt. Zusätzlich kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit anderen therapeutischen Verbindungen verwendet werden.
Die wirksamste Konzentration zur Induktion oder Hemmung der Proliferation von Zielzellpopulationen, die gegenüber TGFα-H1 sensitiv sind, kann durch Zugabe verschiedener Mengen von TGFα-H1 zu den Zellen und Messung ihrer Antworten bestimmt werden.
Zusätzlich können pharmakologische Verbindungen, die die Produktion von TGFα-H1 erhöhen oder vermindern, bewertet werden, indem man die Synthese von TGFα-H1- Messenger oder -Protein durch die Zellen mißt, die mit dem Mittel von Interesse behandelt wurden.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls von Wert für die Chromosomenidentifikation. Die Sequenz ist spezifisch zielgerichtet auf einen speziellen Ort auf einem individuellen menschlichen Chromosom und kann damit hybridisieren. Darüber hinaus gibt es gegenwärtig Bedarf an der Identifikation von speziellen Stellen auf dem Chromosom. Gegenwärtig sind wenige Markierungsreagentien für das Chromosom, die auf aktuellen Sequenzdaten (Wiederholungspolymorphismen) basieren, für die Markierung von Stellen auf dem Chromosom verfügbar. Die Kartierung von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelierung dieser Sequenzen mit Genen, die mit Krankheit assoziiert sind.
Kurz gesagt können Sequenzen auf Chromosomen durch die Herstellung von PCR- Primern (vorzugsweise 15-25 bp) von der cDNA kartiert werden. Eine Computeranalyse der cDNA wird verwendet, um rasch Primer auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA überspannen, die damit den Amplifikationsprozess komplizieren würden. Diese Primer werden dann zur Durchmusterung von somatischen Zellhybriden, die individuelle menschliche Chromosomen enthalten, mittels PCR verwendet. Nur die Hybride, die das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht, werden ein amplifiziertes Fragment ergeben.
Die PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist ein schnelles Verfahren zur Zuordnung einer speziellen DNA zu einem speziellen Chromosom. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung mit den gleichen Oligonucleotidprimern kann eine Sublokalsierung mit einer Gruppe von Fragmenten von spezifischen Chromosomen oder mit Pools von großen genomischen Clonen in analoger Weise erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die in ähnlicher Weise verwendet werden können, um das Chromosom zu kartieren, umfassen die in situ-Hybridisierung, die Vordurchmusterung mit markierten, durchfluß-sortierten Chromosomen und die Vorauswahl mittels Hybridisierung, um Chromosomen-spezifische cDNA-Bibliotheken zu konstruieren.
In situ Fluoreszenz- Hybridisierung (FISH) eines cDNA-Clons mit einem Metaphasen- Chromosomenausstrich kann verwendet werden, um eine präzise chromosomale Lage in einem Schritt zu erhalten. Diese Verfahren kann mit cDNA verwendet werden, die nur eine Länge von 500 bis 600 Basen hat; Clone, die größer sind als 2000 bp, haben jedoch eine höhere Wahrscheinlichkeit, mit ausreichender Signalintensität für den einfachen Nachweis an eine einzige chromosomale Stelle zu binden. FISH erfordert die Verwendung des Clons, von dem der EST abgeleitet war, und je länger, desto besser. Zum Beispiel sind 2000 bp gut, 4000 sind besser und mehr als 4000 sind wahrscheinlich nicht notwendig, um in vernünftigem Zeitdurchschnitt gute Ergebnisse zu erhalten. Für eine Übersicht über dieses Verfahren vgl. Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques. Pergamon Press, New York (1988).
Nachdem eine Sequenz einmal mit einer präzisen chromosomalen Lage kariert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den Daten der genetischen Kartierung korreliert werden. Solche Daten werden zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man gefunden (verfügbar on line durch John Hopkins University Welch Medical Library). Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die zu dem selben chromosomalen Bereich kartiert wurden, wird dann durch "Linkage"-Analyse identifiziert (gleichzeitige Vererbung von physikalisch benachbarten Genen).
Als nächstes ist es erforderlich, die Unterschiede in der cDNA oder den genomischen Sequenzen zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn eine Mutation bei einigen oder allen der betroffenen Individuen beobachtet wird, aber bei keinem normalen Individuum, dann ist es wahrscheinlich, daß die Mutation das verursachende Mittel der Krankheit ist.
Mit der gegenwärtigen Auflösung bei den Verfahren der physikalischen Kartierung und der genetischen Kartierung könnte eine cDNA, die präzise in einem chromosomalen Bereich lokalisiert ist, der mit der Krankheit assoziiert ist, eines der zwischen 50 und 500 potentiell verursachenden Gene sein. (Unter der Voraussetzung einer Kartierungsauflösung von 1 Megabase und einem Gen pro 20 kb).
Der Vergleich der betroffenen und nicht betroffenen Individuen umfaßt im allgemeinen zunächst, nach strukturellen Veränderungen in den Chromosomen, wie Deletionen oder Translokationen, zu suchen, die bei Chromosomenausstrichen sichtbar sind oder unter Verwendung der PCR, die auf der cDNA-Sequenz basiert, nachweisbar. Letztlich ist eine vollständige Sequenzierung der Gene von mehreren Individuen erforderlich, um das Vorliegen einer Mutation zu bestätigen und um Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Antisensemolekülen, die spezifisch mit Transkripten der Polynucleotide der Erfindung hybridisieren, zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Tumoren. Diese Verwendung basiert auf der Hemmung von TGFα-H1 in vivo durch Verwendung der Antisensetechnik. Die Antisensetechnik kann zur Kontrolle der Genexpression durch Tripelhelix-Bildung oder Antisense-DNA oder -RNA verwendet werden, wobei beide Verfahren auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA beruhen. Zum Beispiel wird der 5'-codierende Bereich der Polynucleotidsequenz, der das reife Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu planen. Ein DNA-Oligonucleotid wird so geplant, daß es koplementär ist zu einem Bereich des Gens, der in die Transkription involviert ist (Tripelhelix - vgl. Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991); um damit die Transkription und die Produktion von TGFα-H1 zu verhindern. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo an die mRNA und blockiert die Translation eines mRNA-Moleküls in TGFα-H1 (Antisense - Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). In einer anderen Ausführungsform können die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide umfassen, so geplant werden, daß sie mittels Verfahren im Stand der Technik die Oligonucleotide so an die Zellen liefern, daß die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von TGFα-H1 auf die vorstehend beschriebene Weise zu hemmen.
Antisense-Konstrukte von TGFα-H1 können daher für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die bei der Anti-Tumor-Therapie von Nutzen sind, da eine kürzliche Studie gezeigt hat, daß die Hemmung der Sezernierung oder Produktion von TGFα (oder seiner Homologen) durch Tumorzellen in Mäusen eine Regression des Tumors verursacht. Solche Inhibitoren können Antisense-Oligonucleotide sein, monoclonale Antikörper usw. Antisense-Oligonucleotide verhindern die Produktion von Wachstumsfaktor durch die Zelle, wohingegen Antikörper an Oberflächen-gebundenen oder sezernierten Wachstumsfaktor binden und ihn neutralisieren.
Die Polypeptide, ihre Fragmente oder arideren Derivate, oder ihre Analoga, oder Zellen, die sie exprimieren, können als ein Immunogen zur Produktion von entsprechenden Antikörpern verwendet werden. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch chimäre, einzelkettige oder humanisierte Antikörper, ebenso wie Fab-Fragmente oder die Produkte einer Fab- Expressionsbibliothek. Verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, können für die Produktion solcher Antikörper und Fragmente verwendet werden.
Antikörper, die, gegen das Polypeptid erzeugt werden, das einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entspricht oder seinem in vivo-Rezeptor, können durch direkte Injektion des Polypeptids in ein Tier oder durch Verabreichung des Polypeptids an ein Tier, vorzugsweise ein nicht menschliches, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper wird dann an das Polypeptid selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment des Polypeptids codiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die an das ganze native Polypeptid binden. Solche Antikörper können zur Isolierung des Polypeptids aus dem Gewebe verwendet werden, das dieses Polypeptid exprimiert.
Zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann jedes Verfahren verwendet werden, das Antikörper bereitstellt, die von einer kontinuierlichen Zeillinienkultur produziert werden. Beispiele umfassen die Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), das Trioma-Verfahren, die menschliche B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik, um menschliche monoclonale Antikörper zu produzieren (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., s 77-96).
Verfahren, die für die Produktion einzelkettiger Antikörper (U.S. Patent 4,946,778) beschrieben sind, können adaptiert werden, um einzelkettige Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu produzieren. Antikörper, die spezifisch sind für TGFα, können zur Herstellung von diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die von Nutzen sind bei der Krebsdiagnose und - therapie, denn viele Arten von Krebszellen regeln verschiedene Mitglieder der TGFα-Familie während des Pozesses der Neoplasie oder Hyperplasie hoch. Diese Antikörper binden an TGFα-H1 und inaktivieren es. Monoclonale Antikörper gegen TGFα (und/oder seine Familienmitglieder) sind in klinischer Verwendung für sowohl die Diagnose als auch die Therapie von gewissen Krankheitszuständen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) hyperplastische und neoplastische Wachstumsunregelmäßigkeiten. Eine Hochregulierung der Wachstumsfaktor-Expression durch neoplastisches Gewebe bildet die Basis für eine Anzahl an Serumtests, die das Anwachsen an Wachstumsfaktoren im Blut von betroffenen Patienten nachweisen. Diese Test werden typischerweise nicht nur in diagnostischen Ansätzen angewendet, sondern werden auch in prognostischen Ansätzen angewendet (um die Anwesenheit von okkulten Tumorzellen nach Operation, Chemotherapie usw. nachzuweisen).
Zusätzlich können maligne Zellen, die den TGFα-H1-Rezeptor exprimieren, durch Verwendung von markiertem TGFα-H 1 oder mit TGFα-H 1 verwandten Molekülen in einem Rezeptorbindungstest nachgewiesen werden, oder durch die Verwendung von Antikörpern gegen den TGFα-H1-Rezeptor selbst. Die Zellen können unterschieden werden in Übereinstimmung mit der Anwesenheit und Dichte von Rezeptoren für TGFα-H1, und stellen somit ein Mittel bereit, die Empfänglichkeit solcher Zellen gegenüber den biologischen Aktivitäten von TGFα-H1 vorherzusagen.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin beschrieben mit Bezug auf die folgenden Beispiele; es ist jedoch so zu verstehen daß die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist. Alle Teile oder Mengen, außer anders spezifiziert, sind Gewicht.
Um das Verständnis für die folgenden Beispiele zu erleichtern, werden gewisse, häufig vorkommende Verfahren und/oder Ausdrücke beschrieben.
"Plasmide" werden durch ein kleines p bezeichnet, dem große Buchstaben und/oder Zahlen vorausgehen und/oder folgen. Die Ausgangsplasmide hier sind entweder kommerziell verfügbar, ohne Einschränkungen allgemein erhältlich oder können aus verfügbaren Plasmiden gemäß publizierter Verfahren konstruiert werden. Zusätzlich sind zu den beschriebenen gleichwertige Plasmide im Stand der Technik bekannt, und für den Durchschnittsfachmann offensichtlich.
"Verdau" von DNA betrifft die katalytische Spaltung der DNA mit Restriktionsenzymen, die nur bei gewissen Sequenzen in der DNA wirken. Die verschiedenen, hier verwendeten Restriktionsenzyme sind kommerziell verfügbar und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Bedingungen wurden so verwendet, wie es dem Durchschnittsfachmann bekannt ist. Für analytische Zwecke wird üblicherweise 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment zusammen mit 2 Einheiten Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Für den Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten für die Konstruktion von Plasmiden werden üblicherweise 5 bis 50 ug DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller angegeben. Üblicherweise werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC verwendet, können sich aber gemäß den Vorschriften des Herstellers ändern. Nach dem Verdau wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisiert, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung eines 8 %igen Polyacrylamidgel durchgeführt, wie, von Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) beschrieben.
"Oligonucleotide" betrifft entweder ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert werden können. Solche synthetischen Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und werden deshalb ohne Zugabe eines Phosphats mit einem ATP in der Gegenwart einer Kinase nicht an ein anderes Oligonucleotid ligieren. Ein synthetisches Oligonucleotid wird mit einem Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert wurde.
"Ligierung" bezieht sich auf ein Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T., et al., Id., S. 146). Außer anders angegeben, wird die Ligierung erreicht unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug von etwa äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente.
Außer anders angegeben, wurde die Transformation durchgeführt wie bei dem Verfahren von Graham F. und Van der Eb, A., Virol., 52: 456-457 (1973) beschrieben.

Beispiel 1

Bakterielle Expression und Reinigung von TGFα-H1

Der offene Leserahmen von TGFα-H1 kann von dem auf Bluescript basierenden Vektor, in den er inseriert ist, entfernt werden und in eine neue Art von Clonierungsvektor gebracht werden, der pQE9 genannt wird (siehe nachstehend). Dieser Vektor kann BamHI- HindIII-Fragmente akzeptieren. Ein BamHI-HindIII-kompatibles Restriktionsfragment kann von TGFα-H1 durch Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern erzeugt werden, die dem 5'- und 3'- Ende der DNA-Sequenz entsprechen, um Insertionsfragmente zu synthetisieren. Der 5'-Oligonucleotidprimer hat die Sequenz
5'-ATTCTAGTTGGATCCGATGGACTACAATATCGACCA-3', enthält eine BamHI-Restriktionsstelle (unterstrichen), gefolgt von 21 Nucleotiden von TGFα-H1 codierender Sequenz; die 3'-Sequenz 5'-CTCCCTCAAAGGAAGCTTTTAAGAGC-3' enthält komplementäre Sequenzen zu einer natürlich vorkommenden HindIII-Stelle (unterstrichen) innerhalb des 3'-nicht translatierten Bereichs des TGFα-H1-Gens. Die BamHI- und Hindill-Stellen sind kompatibel mit den BamHI- und Hindill-Stellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pEQ9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Ave, Chatsworth CA 91311). Der Plasmidvektor codiert antibiotische Resistenz (Ampr), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen IPTG-regulierbaren Promotor/Operator (P/O), eine Ribosomenbindungsstelle (RBS), einen 6-Histidin-Tag (6-His) und Restriktionsenzym-Clonierungsstellen. Das Ligierungsgemisch wurde dann verwendet, um den E. coli-Stamm M15/rep4 (erhältlich von Qiagen unter dem Handelsnamen m15/rep4) zu transformieren. M15/rep4 enthält vielfache Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch Kanamycin- Resistenz (Kanr) verleiht. Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB- Platten zu wachsen, die sowohl Amp als Kan enthielten. Die Clone, die die erwünschten Konstrukte enthielten, wurden über Nacht (O/N) in Flüssigkultur in jeweils mit Amp (100 ug/ml) und Kan (25 ug/ml) ergänzten LB-Medien wachsen gelassen. Die ON-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur mit einem Verhältnis von 1 : 100 bis 1 : 250 zu inokulieren. Die Zellen werden bis zu einer optischen Dichte von 0,4 bis 0,6 bei 600 (O. D.&sup6;&sup0;&sup0;) wachsen gelassen. IPTG ("Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") wurde dann mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI- Repressors, was den P/O freisetzt und zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen wurden noch einmal 3-4 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wurde in dem chaotropischen Mittel 6 molar Guanidin- HCl solubilisiert. Nach Klärung wurde das solubilisierte TGFα-H1aus dieser Lösung mittels Chromatographie auf einer Nickel-Chelat-Säule unter Bedingungen gereinigt, die die feste Bindung von Proteinen erlauben, die den 6-His-Tag enthalten. (Hochuli, E. et al., Genetic Engineering, Principle & Methods, 12: 87-98 Plenum Press, New York (1990)). TGFα-H1 (95% rein) wurde mit 6 molarem Guanidin-HCl, pH 5,0, von der Säule eluiert und zum Zwecke der Renaturierung auf 3 molar Guanidin-HCl, 100 mM Natriumphosphat, 10 mM Glutathion (reduziert) und 2 mM Glutathion (oxidiert) eingestellt. Nach 12 Stunden Inkubation in dieser Lösung wurde das Protein gegen 50 mM Natriumphosphat dialysiert.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION
(i) ANMELDER: MEISSNER, ET AL.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Transformierender Wachstumsfaktor Alpha -H1
(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 5
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCI, STEWART & OLSTEIN
(B) STRASSE: 6 BECKER FARM ROAD
(C) STADT: ROSELAND
(D) STAAT: NEW JERSEY
(E) LAND: USA
(F) ZIP: 07068
(v) COMPUTERLESBARE FORM
(A) ART DES MEDIUMS: 3,5 INCH DISKETTE
(B) COMPUTER: IBM PS/2
(C) BETRIEBSSYSTEM: MS-DOS
(D) SOFTWARE: WORD PERFECT 5,1
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: PCT US94/05476
(B) ANMELDEDATUM: 12. Mai 1994
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORHERGEHENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(viii) ANWALT/AGENTENINFORMATION
(A) NAME: MULLINS, J. G.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33,073
(C) ZEICHEN/AKTENNUMMER: 325800-98
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEPHON: 201-994-1700
(B) TELEFAX: 201-994-1744
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK
(A) LÄNGE: 400 BASENPAARE
(B) TYP: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGART: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK
(A) LÄNGE: 132 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGART:
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PROTEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:
(3) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK
(A) LÄNGE: 3288 BASENPAARE
(B) TYP: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGART: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:
(3) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK
(A) LÄNGE; 36 BASENPAARE
(B) TYP: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGART: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligonucleotid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4:
ATTCTAGTTG GATCGGATGG ACTACAATAT CGACCA 36
(3) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK
(A) LÄNGE: 26 BASENPAARE
(B) TYP: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGART: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligonucleotid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 5:
CTCCCTCAAA GGAAGCTTTT AAGAGC 26

Claims

1. Polynucleotid, das humanen transformierenden Wachstumsfaktor alpha-H1 (TGFα- H1) codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) Polynucleotide, codierend zumindest die reife Form des TGFct-H1 Polypeptids, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von Fig. 1 aufweist;

(b) Polynucleotide, die die in Fig. 1 gezeigte codierende Sequenz aufweisen, die zumindest die reife Form von TGFα-H1 codiert;

(c) Polynucleotide, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid gemäß (a) oder (b) hybridisiert; und

(d) Polynucleotide, die zumindest 95% Sequenzidentität mit einem Polynucleotid gemäß (a) oder (b) aufweisen;

oder der komplementäre Strang eines solchen Polynucleotids.

2. Polynucleotid nach Anspruch 1, das ein lösliches Fragment von TGFα-H1 codiert.

3. Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, das DNA ist.

4. Polynucleotid nach Anspruch 3, das genomische DNA ist.

5. Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, das RNA ist.

6. Vektor, enthaltend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Vektor nach Anspruch 6, in dem das Polynucleotid funktionell verbunden ist mit Expressionskontrollsequenzen, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben.

8. Wirtszelle, die genetisch modifiziert ist mit dem Vektor nach Anspruch 6 oder 7.

9. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das von dem Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert wird, umfassend Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 8 und Gewinnen des Polypeptids, das von dem Polynucleotid codiert wird, aus der Kultur.

10. Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, ein Polypeptid zu exprimieren, das von dem Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert wird, umfassend genetisches Modifizieren von Zellen mit dem Vektor nach Anspruch 6 oder 7.

11. Polypeptid, das codiert wird von einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das erhältlich ist durch ein Verfahren nach Anspruch 9.

12. Antikörper gegen das Polypeptid nach Anspruch 11.

13. Arzneimittel umfassend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, Antisensemoleküle, die mit Transkripten solcher Polynucleotide spezifisch hybridisieren, Polynucleotide, die solche Antisensemoleküle codieren, das Polypeptid nach Anspruch 11 oder eine DNA, die das Polypeptid codiert und in der Lage ist, es in vivo zu exprimieren, und/ oder den Antikörper nach Anspruch 12 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

14. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ein Polypeptid nach Anspruch 11 und/oder einen Antikörper nach Anspruch 12.

15. Verwendung eines Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Polypeptids nach Anspruch 11 oder einer DNA, die das Polypeptid codiert und in der Lage ist, es in vivo zu exprimieren, zur Herstellung eines Arzneimittels zur 6 Wiederherstellung oder Förderung neurologischer Funktionen, die vermindert sind als Folge eines Traumas oder anderer schädlicher Krankheitsbilder.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das schädliche Krankheitsbild AIDS-Demenz oder senile Demenz ist.

17. Verwendung eines Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Polypeptids nach Anspruch 11 oder einer DNA, die das Polypeptid codiert und in der Lage ist, es in vivo zu exprimieren, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Augenkrankheiten, Nierenkrankheiten oder Leberdysfunktionen oder zur Stimulierung von Wundheilung, Behandlung von Alopecia oder Haarausfall.

18. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 12 oder von Antisensemolekülen, die mit Transkripten eines Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 spezifisch hybridisieren, oder von Polynucleotiden, die solche Antisensemoleküle codieren, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren.