KR19990087793A - 러크-8로 표시된 싸이토킨 - Google Patents

Abstract

본 발명은 러크-8로 표시된 신규 싸이트킨에 관한 것이다. 러크-8은 티로신 키나아제 수용체의 상기 에프/엘크과의 일원인 헤크 및 엘크로 공지된 세포 표면 수용체와 결합한다.

정제된 러크-8 단백질은 본문에서 러크-8을 암호화하는 단리된 DNA, 러크-8 DNA를 포함하는 발현 벡터 및 발현 벡터를 변형시킨 숙주 세포와 함께 제공된다. 러크-8 의 생산방법은 러크-8 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 조건하에서 변형된 숙주 세포를 배양하며, 러크-8 을 회수하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 러크-8에 관한 항체를 포함한다.

Description

러크-8 로 표시된 싸이토킨

티로신 키나아제 수용체로써 알려진 단백질은 리간드 결합에 활성인 고유 키나아제 활성을 갖는다. 이러한 종류의 단백질은 촉매 영역(Hanks et al., Science, 242:42, 1988)내에서 보존된 구조적 동기에 의하여 특징지워지며, 촉매 영역에 대한 N-말단부위의 구조적 특징을 기본으로 하는 과(科)로 다시 세분될 수 있다.

단리된 첫번째 구성원의 이름을 따서 명명된 수용체의 에프과(Hirai et al. Science 238:1717, 1987)는 티로신 키나아제 수용체의 가장 큰 아과(亞科)이다. 이러한 과의 일원중에는 닭 첵4(cek4)(Sajjadi et al. New Biol. 3:769, 1991) 및 첵5(Pasquale, E.B., Cell Regulation 2:523, 1991); 쥐과동물의 멕4(mek4)(Sajjadi et al., supra), 브스크(bsk)(Zhou et al., J. Neurosci. Res., 37:129, 1994), 누크(nuk)(Henkemeyer et al., Oncogene 9:1001, 1994) 및 섹(sek)(Gilardi-Hebenstreit et al., Oncogene 7:2499, 1992); 쥐 엘크(rat elk)(Letwin et al., Oncogene 3:621, 1998;Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991), 에에크(eek)(Chan et al., Oncogene 6:1057, 1991), 에크-1(ehk-1) 및 에크-2(Maisonpierre et al., Oncogene 8:3277, 1993); 및 인간의 헤크(hek)(Boyd et al., J. Biol. Chem., 267:3262, 1992; Wicks et al., PNAS USA, 89:1611, 1992), 헤크2(Bohme et al., Oncogene 8:2857, 1993), 엑크(Lindberg et al. Mol. Cell. Biol. 10:6316, 1990) 및 엘크(erk)(Chan et al., supra)가 있다.

이러한 아과의 단백질은 그들의 세포질 영역 뿐만 아니라, 그들의 세포외 영역과도 관련이 있으며, 41 내지 68%가 동일하다. 흥미롭게도, 이들 여러가지 수용체의 조직 분포는 다양하다. 많은 에프-관련 티로신 키나아제 수용체는 일차적으로 뇌에서 발현되기 때문에, 이들 수용체 및 그들의 리간드는 뉴우런의 성장, 분화 및 생존과 관련이 있을 수 있다고 생각되어 왔다.

티로신 키나아제 수용체로 동정되어졌던 리간드들은 수용체들을 발현하는 세포의 성장, 분화 및 생존에 영향을 미치는 여러가지 단백질 군이다. 일정한 리간드들은 하나 이상의 에프과의 수용체와 결합한다는 것이 발견되었다. 후술하는 헤크 및 엘크의 리간드가 그 예이다.

존재할 수 있는 헤크 및 엘크용 부가적인 리간드의 동정은 이들 수용체들을 통한 신호에 의하여 조절된 세포 가공의 성질을 조사함에 있어서 유용함을 증명할 것이다. 만약 이들 수용체를 통하여 매개된 특이 생리학적 신호의 증가 또는 억제를 원한다면, 그러한 신호를 형질 도입하는 역할을 할 수 있는 단백질 각각을 동정하는 것이 유익하다. 더우기, 인터루킨-1 수용체 길항체(antigonist) 단백질(Eisenberg et al., Nature 343:341, 1990; Hannum et al., Nature 343:336, 1990; and Carter et al., Nature 344:633, 1990)을 포함하여 일정한 단백질들은 신호 형질 전환의 초기화 없이 수용체와 결합할 수 있다는 것이 알려졌다. 헤크 또는 엘크와 결합하는 부가적인 단백질의 동정화는 또한 그러한 단백질 중 어떤 것이 길항체로써 기능을 하는가 결정하기 위하여 바람직하다.

본 발명은 러크-8 표시된 신규 싸이토킨을 제공한다. 이 싸이토킨은 엘크 및 헤크로 공지된 티로신 키나아제 수용체와 결합한다.

본 발명은 러크-8을 암호화하는 DNA, 러크-8 DNA를 포함하는 발현 벡터, 및 발현 벡터로 형질 전환시킨 숙주 세포를 포함한다. 러크-8 폴리펩티드의 생산방법은 러크-8의 발현을 전도하는 조건하에서 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 발현된 러크-8 을 회수하는 것을 포함한다. 가용성 및 막 결합 형태인 정제된 러크-8 폴리펩티드가 개시되어 있다.

러크-8 폴리펩티드 또는 그 면역원성 단편을 그 면역 반응성인 항체를 생성하는 면역원으로 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예 중 하나는 항체가 모노클로날 항체이다.

인간의 러크-8을 암호화하는 cDNA를 실시예 1에서 개시한 것과 같이 단리하였다. 이 러크-8 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열 동정 번호 제1번으로 존재하고, 이에 의하여 암호화된 아미노산 서열은 서열 동정 번호 제2번으로 존재한다. 이 러크-8 단백질은 N-말단 신호 펩티드(아미노산 -27 내지 -1), 세포외 영역(아미노산 1 내지 197), 트랜스맴브레인 부위(아미노산 198 내지 224), 및 세포질 영역(아미노산 225 내지 313)을 포함한다.

성숙한 인간의 러크-8 단백질의 계산된 분자량(서열 동정 번호 제2번의 아미노산 1 내지 313)은 약 33킬로달톤이고, 등전위점(pI)은 8.46이다. 따라서, 본 발명의 예는 단백질의 성숙한 형태의 N-말단 아미노산 서열이 Leu-Ser-Leu-Glu-Pro- Val-Tyr-Trp-Asn-Ser-Ala-Asn-(서열 동정 번호 제2번의 아미노산 1-12)이고, 계산된 분자량이 약 33킬로달톤이며 등전위점이 8.46인 정제된 인간의 러크-8 단백질에 관한 것이다. 계산된 분자량은 글리코실레이션(glycosylation)을 제외한 특정 아미노산 서열의 단백질의 분자량을 기본으로 한다. 당업자는 단백질의 글리코실레이트화된 형태가 보다 큰 분자량을 가질 것이라는 것을 인식할 것이다.

러크-8 단편, 예를 들면, 헤크 또는 엘크와 결합하는 능력을 보유하는 단편 또한 제공된다. 그러한 단편의 예는 가용성 러크-8 폴리펩티드이다.

본 발명은 러크-8의 세포막 결합 및 가용성(분비)형태를 모두 제공한다. 가용성 러크-8 폴리펩티드는 러크-8의 수용체-결합 영역을 포함하지만, 세포막상에 폴리펩티드를 갖도록 유발할 수 있는 트랜스맴브레인부는 결여되어 있다. 하나의 예로서, 가용성 러크-8은 전체적인 세포외 영역(예: 서열 동정 번호 제2번의 인간의 러크-8의 아미노산 1 내지 197)을 포함한다. 다른 경우, 가용성 폴리펩티드는 앨크 및 헤크와 결합하는 능력을 갖는 러크-8 세포외 영역의 단편이다. 수용체 결합에 있어서 가장 중요하다고 믿어지는 세포외 영역의 부분은 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 1 내지 142를 포함한다. 세포외 영역의 나머지(아미노산 143 내지 197)는 스페이서부를 구성한다. 가용성 인간의 러크-8 폴리펩티드의 예는 서열 동정 번호 제2번의 142 내지 197 사이의 잔기중 어느 하나이거나, 또는 그 위치에서 잔기를 포함하는 C-말단이 절단된 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다시 말하면, 그러한 가용성 러크-8 폴리펩티드는 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 1 내지 y를 포함한다(식중, y는 142 내지 197사이의 정수이다).

가용성 러크-8은 예를 들면 원심분리와 같이, 배양배지로부터 러크-8 폴리펩티드를 발현하는 완전한 세포를 분리함으로써, 원하는 단백질의 존재를 위하여 배지(상청액)를 시험함으로써 동정할 수 있다(아울러, 대응하는 비가용성 막 결합과 구분된다). 배지에서 러크-8의 존재는 단백질이 세포로부터 분비되었으며, 따라서, 원하는 단백질의 가용성 형태하는 것을 나타낸다.

러크-8 의 가용성 형태는 단백질의 막 결합 형태에 대하여 일정한 잇점을 가진다. 가용성 단백질이 세포로부터 분비되기 때문에 재조합형 숙주 세포로부터 단백질의 정제는 용이해진다. 더우기, 가용성 단백질은 일반적으로 예들 들면, 정맥주사 투여방법과 같은 일정한 용도에 보다 적합하다.

숙주세포내에서 초기에 발현될때, 가용성 러크-8 폴리펩티드는 유리하게는 사용된 숙주세포내에서 기능적인 하기의 신호 펩티드 또는 비정형의 선도자중 하나 또는 자연적인 신호 펩티드를 포함한다. 가용성 러크-8 단백질을 암호화하는 단리된 DNA 서열은 본 발명에 포함된다.

가용성 폴리펩티드를 포함하는 절단된 러크-8은 여러가지 통상적인 기술중 하나에 의하여 제조될 수 있다. 절단된 러크-8을 암호화하는 DNA 서열은 공지된 기술을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. DNA 단편은 또한 전체 길이가 클론된 DNA 서열의 엔도뉴클레아제 소화를 제한하여 생성할 수 있고, 아가로우스 겔상의 전기영동에 의하여 단리시킬 수 있다. 원하는 지점에 대한 DNA 단편의 5' 또는 3'-말단이 재현된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 엔도뉴클레아제 절단 부위의 제한을 함유하는 린커는 원하는 DNA 단편을 발현 벡터에 삽입하기 위하여 사용할 수 있다. 잘 알려진 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 방법이 또한 특정 단백질 단편을 암호화하는 DNA단편을 증식하기 위하여 사용될 수 있다. DNA 단편의 원하는 말단을 정의하는 프라이머가 PCR에서 사용된다. 또다른 방법으로, 공지된 돌연변이 유발성 기술은 원하는 지점, 예를 들면 수용체 결합 영역의 최후의 아미노산의 코돈의 아랫부분에서 즉각, 정지코돈을 삽입하도록 사용될 수 있다.

발현된 서열 표지(EST)는 서열 동정 번호 제1번으로 동정되는 영역을 함유한다(실시예 1 참조). 이 EST(접근 번호 H10006)에 대한 컴퓨터 데이터 뱅크기록은 DNA 서열 454 뉴클레오티드 길이를 나타낸다. EST H10006서열이 서열 동정 번호 제1번으로 지정된 경우, 동정 부위는 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오티드 663 및 1118사이에서 발견되었다. EST H10006에서의 일정 뉴클레오티드는 동정화되지 않는다(즉, 그 동정이 공지되지 않았기 때문에 데이터뱅크 기록에서 "N"으로 지정되었다). EST 서열은 서열 동정 번호 제1번에서 상응하는 위치에서 발견되지 않은 뉴클레오티드를 삽입하고 서열 동정 번호 제1번과 비교할 때 결실 및 오배합(mismatch)을 함유한다.

어떠한 리딩 프레임(reading frame)도 EST를 위한 데이터뱅크 파일에서 동정화되지 않으며, 그 서열은 개시코돈이 결여되어 있다. 더욱이, 상기 삽입 및 제거는 서열 동정 번호 제1번의 러크-8 서열의 리딩 프레임과 비교하여, 리딩 프레임에서의 이동을 야기할 것이다. 그러나, 리딩 프레임이 명료해 지거나 동정화되어지고, 삽입, 제거 및 비동정된 뉴클레이티드로 조절되었다고 해도, EST H10006의 번역은 다른 러크 단백질(하기에 기재)에서 보존되는 4개의 시스테인 잔기 중 하나를 결여할 수 있고, 마찬가지로 다른 보존된 잔기 또한 결여될 것이다. 4개의 보존된 시스테인은 엘크 및 헤크와의 결합 성질에 있어서 중요하다고 믿어진다.

헤크 및 엘크 모두와 결합하는 다른 단백질이 발견되었고, 러크-7(에프-관련 키나아제의 리간드)을 통해서 러크-1이 표시되었다. 러크 2 및 5는 유형 1의 트랜스맴브레인 단백질(러크-8)이고, 반면 러크 1,3,4,6 및 7는 GPI 연쇄에 의하여 세포막에 매우 가깝다. 이들 여섯 개의 단백질의 아미노산 서열의 백분율은 24 내지 59%이고, 각각의 단백질은 네 개의 보존된 시스테인 잔기를 갖는다.

홀쯔만등(Mol. Cell. Biol. 10:5830, 1990)은 B61로 불리우는 단백질을 cDNA의 코딩을 보고하였다. 엘크 및 헤크와 결합하는 B61의 능력이 후속적으로 발견되었고, B61 단백질이 선택적인 표시 러크-1로 주어졌다(Beckmann et al., EMBO J. 13:3757, 1994). B61이 또한 에크로 공지된 상기 티로신 키나아제 수용체용 리간드로서 보고되어 왔다(Bartley et al., Nature 368:558, 1994).

또한, 엘크 리간드로 공지된 러크-2가 PCT 출원 WO 94/11384에 기재되어 있다. 또한, 헤크 리간드로 공지된 러크-3 및 러크-4는 모두 PCT 출원 WO 95/06065에 기재되어 있으며, 러크-5는 WO 96/01839에, 러크-6은 WO 96/10911에, 러크-7은 WO 96/17925에 기재되어 있다.

여러가지 다른 단백질의 전체길이 아미노산 서열을 갖는 서열 동정 번호 제2번의 인간의 러크-8 아미노산 서열의 동정화 퍼센트는 하기와 같다. 여기서, h는 인간을, m은 생쥐(mouse)를, r은 쥐(rat)를 나타낸다.

h 러크-1 25.14

h 러크-2 40.80

r 러크-2 39.69

m 러크-2 40.00

h 러크-3 24.88

h 러크-4 25.41

h 러크-5 41.23

m 러크-5 42.07

m 러크-6 26.18

h 러크-7 24.88

본문에서 사용된 것과 같이, 용어 "러크-8"은 실시예 1에 기재된 인간의 러크-8 단백질과 실제적으로 동종인 폴리펩티드의 종류를 말한다. 바람직하게는 폴리펩티드는 하기에서 추가적으로 기재하고 있는 바와 같이, 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 서열에 대하여 80% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 러크-8 폴리펩티드는 헤크 및 엘크로 표시된 상기 수용체와 결합할 수 있다. 보다 상세하게는 후술하는 바와 같이, 러크-8의 일정한 용도는 엘크 또는 헤크와 결합하는 이러한 능력으로부터 발생한다. 쥐, 소, 돼지, 말 또는 여러 영장류종을 포함하나 이에 한정하지 않은 다른 포유류 종으로부터 얻어진 러크-8 핵산 및 단백질과 같이, 인간의 러크-8 핵산 및 단백질은 본 발명의 범위내에 존재한다.

하나이상의 코돈이 같은 아미노산을 암호화하는 유전 암호의 공지된 동의성(同儀性)에 기인하여, DNA서열은 서열 동정 번호 제1번에서 보여지는 것으로부터 변화할 수 있고, 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 서열을 갖는 러크-8 단백질을 여전히 암호화한다. 그러한 변형된 DNA 서열은 사일런트 돌연변이(silent mutations)로부터 생성될 수 있거나(예를 들면, PCR 증식동안 발생), 또한 본래의 서열의 사일런트 돌연변이 유발성의 산물이 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 천연 러크-8 DNA 서열로부터 선택된 단리된 DNA서열(예, 서열 동정 번호 제1번에 존재하는 뉴클레오티드서열을 포함하는 cDNA) 및 천연 러크-8 DNA 서열에 대한 유전 암호의 결과로써 축중(縮重)되는 DNA 를 제공한다.

본문에서 제공된 러크-8 폴리펩티드는 천연 러크-8의 생물학적 활성을 계속 유지하는 천연 러크-8 폴리펩티드의 변형체를 포함한다. 그러한 변형체들은 천연 러크-8과 실제적으로 동종이나, 하나이상의 결실, 삽입 또는 치환으로 인하여 천연 러크-8의 아미노산 서열과 구별되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 러크-8을 암호화하는 DNA는 하나이상의 결실, 삽입 또는 치환으로 인하여 천연 러크-8의 DNA와는 상이하지만 생물학적으로 활성인 러크-8 폴리펩티드를 암호화하는 변형체를 포함한다. 러크-8에서 언급한 것과 같이, 용어 "생물학적으로 활성"은 러크-8이 헤크 또는 엘크와 결합할 수 있다는 것을 가리킨다.

변형체 DNA 또는 아미노산 서열은 바람직하게는 천연 러크-8 서열과 80% 이상 동일하며, 보다 바람직하게는 90% 이상 동일하다. 동정화의 백분율은 예를 들면 문헌[Devereua et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984), 제6판]에 기재되어 있고, 위스콘신 대학 유전 컴퓨터그룹 (UWGCG)에서 구입할 수 있는 GAP 컴퓨터를 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정할 수 있다. GAP 프로그램의 바람직한 지정 인자는

(1) 문헌[Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979;]에 개시된 바와 같이, 뉴클레오티드를 위한 단일체의 비교 매트릭스(동정화를 위한 값 1 및 비동정화를 위한 값 0을 함유) 및 그리보스코프 및 부르게스(Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986)의 중량을 잰 비교 메트릭스,

(2) 각각의 간격동안 벌칙 3.0 및 각각의 간격에서 각각의 신호에 부가적으로 벌칙 0.10 및

(3) 말단의 간격동안 벌칙 없음

을 포함한다.

다양한 아미노산 서열의 또다른 예는 천연 러크-8의 1종 이상의 아미노산 잔기가 상이한 잔기에 의하여 치환되나 통상적으로 치환된 러크-8 폴리펩티드는 천연 단백질의 원하는 생물학적 활성을 보유한다는 것을 의미하는 전통적인 치환체를 포함하는 것들이다(예를 들면, 엘크 또는 헤트와 결합하는 능력). 전통적인 치환의 예에는 단백질의 2차 또는 3차 구조를 변형시키지 않는 잔기의 치환체를 포함한다.

주어진 아미노산은 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기에 의하여 치환될 수 있다. 통상적인 치환체의 예는 IIe, Val, Leu, 또는 Ala 상호간과 같이, 다른 것에 대하여 하나의 지방족 잔기의 치환체를, 또는 Lys 및 Arg, Glu 및 Asp, Gln 및 Asn 사이에서와 같이 다른 것에 대하여 하나의 극성 잔기의 치환체를 포함한다.

유사한 소수성 특성을 갖는 전체 부위의 치환체와 관련이 있는 다른 동류 치환이 잘 알려져 있다.

더욱이, 본 발명은 결합된 천연-패턴 글리코실레이션과 함께 또는 단독으로 러크-8 폴리펩티드를 포함한다. 효모 또는 포유류 발현시스템 (예를 들면 COS-7 세포)에서 발현된 러크-8은 분자량이 천연 러크-8 폴리펩티드 및 발현시스템 의 선택에 의존하는 글리코실레이션 패턴과 유사하거나 또는 현저하게 상이할 수 있다. 대장균과 같은 박테리아 발현시스템 에서의 러크-8 폴리펩티드의 발현은 비글리코실레이티드 분자를 제공한다.

N-글리코실레이션 장소는 포유류 및 효모 발현시스템 에서와 동종인, 보다 균일하고 감소된 탄수화물을 발현하도록 하는 글리코실레이션을 배제하기 위하여 조정될 수 있다. 진핵세포의 폴리펩티드에서 N-글리코실레이션 부위는 아미노산 트리플렛 Asn-X-Y에 의하여 특징지워진다(식중, X는 Pro를 제외한 아미노산이고, Y는 Ser 또는 Thr이다). 서열 동정 번호 제2번의 인간의 러크-8 단백질은 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 183 내지 185에서 _ 하나의 트리플렛을 포함한다. 이들 트리플렛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 적절한 치환, 첨가 또는 결실은 Asn 부 결합에 대한 탄수화물 잔기의 부착 방지라는 결과를 가져온다. 단일 뉴클레오티드의 개변은 Asn이 다른 아미노산, 예를 들면, N-글리코실레이션 부위에 충분히 불활성인 것에 의하여 치환되도록 선택된다. 단백질에서 N-글리코실레이션 부위를 불활성화하는 공지된 방법은 미국 특허 제5,071,972호 및 유럽 제276,846호에 기재되어 있다.

변형체의 다른 예에서 생물학적 활성에 필수적이지 않은 Cys 잔기를 암호화하는 서열은 재생시 잘못된 분자내 이황화 가교의 형성을 억제하여, Cys 잔기를 삭제하거나 또는 다른 아미노산으로 치환하도록 개변시킬 수 있다. 러크 단백질사이세서 유지되는 네 개의 시스테인에 상응하는 시스테인 잔기가 서열 동정 번호 35, 65, 77 및 129위치에서 발견되었다. 이들 4개의 시스테인은 바람직하게는 러크-8 변형체에서 변형되지 않게 남아있다.

KEX2 프로테아제 활성이 존재하는 효모 시스템에서는 발현을 증가시키기 위하여 다른 변형체들이 인접한 이염기 아미노산 잔기의 변형에 의하여 제조된다. EP 212,914 는 단백질내에서 KEX2 프로테아제 가공 부위를 불활성화하는 부위 특이적 돌연변이 유발의 용도에 대하여 개시한다. KEX2 프로테아제 가공 부위는 이들 인접한 염기성 잔기의 발생을 제거하기 위하여 Arg-Arg, Arg-Lys, 및 Lys-Arg 쌍을 변형시키는 잔기를 결실, 첨가 또는 치환하여 불활성화된다. 인간의 러크-8은 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 13-14, 63-64, 151-152, 225-226, 226-227 및 227-228에서 인접 염기 잔기 쌍을 함유한다. Lys-Lys 쌍은 KEX2 절단에 거이 영향을 받지 않으며, Arg-Lys 또는 Lys-Arg의 Lys-Lys로의 전환은 KEX2 부위를 불활성화하기 위한 전통적이고 바람직한 접근방법을 나타낸다.

자연 발생하는 러크-8 변형체 또한 본 발명에 포함된다. 변형체의 예는 교대 mRNA 접합으로부터 발생하거나 또는 러크-8 단백질의 단백질 가수분해 분열로부터 발생하는 단백질이다. 예를 들면, mRNA 의 교대 스플라이싱(splicing)은 단백질의 자연 발생하는 가용성 형태와 같이, 절개되었지만 생물학적으로 활성인 러크-8 단백질을 생성한다. 단백질 가수분해에 기인하는 변형체는 예를 들면, 러크-8 단백질로부터(일반적으로 1-5 말단 아미노산부터) 1종이상의 말단 아미노산의 단백질 가수분해 제거에 기인하는, 숙주세포의 상이한 유형에서의 발현에 대한 N- 또는 C-말단의 차이를 포함한다. 따라서, N-말단 잔기가 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 1 내지 5중 하나이고 C-말단 잔기가 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 308 내지 313중 하나인 러크-8 단백질이 특히 본 발명에서 제공된다. 가용성 러크-8의 경우, C-말단 잔기는 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 192 내지 197의 하나일 수 있다. 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 서열과 상이한 러크-8 단백질은 본문에서 관찰되는 유전적인 다형성(多形性)(단백질을 생성하는 개체간의 대립형질의 변형)에 기인할 수 있다.

하나의 단리된 러크-8 cDNA는 실시예 1에 기재된 cDNA와 비교했을 때 단일 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 변형체인 러크-8 DNA의 서열은 변형체의 1370 위치에서의 뉴클레오티드가 서열 동정 번호 제1번의 위치에서 발견된 구아닌(G)이라기 보다는 시토신(C)이라는 점에서 서열 동정 번호 제1번에서 나타나는 DNA 서열과 상이하다. 이 러크-8 단백질의 아미노산서열에서 298위치의 잔기는 루이신이다.

신호 펩티드 및 러크-8 단백질의 다양한 영역에 대한 앞선 토의에 관하여 당업자는 단백질의 부위의 상술한 경계가 가깝다는 것을 인식할 것이다. 트랜스맴브레인 부위의 경계(그 목적으로 판매되는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 예측가능함)는 상기한 것과 상이하다. 따라서, 세포외 영역의 C-말단이 상기 동정된 잔기와 상이한 가용성 러크-8 폴리펩티드가 본문에서 관찰된다. 또다른 보기에서와 같이 신호 펩티드의 절단은 컴퓨터 프로그램에 의하여 예측되는 부위 이외의 부위에서 발생할 수 있다. 더우기, 단백질의 제법은 하나이상의 부위에서 신호 단백질이 절단되는 데 기인하는, 상이한 N-말단 아미노산을 갖는 단백질 분자의 혼합물을 포함할 수 있다고 인식되고 있다.

인간의 러크-8 단백질의 컴퓨터 분석은 신호 펩티드가 서열 동정 번호 제1번의 아미노산 -1 이후에 주로 발생하려 할 것이라는 것을 나타낸다. 컴퓨터 프로그램에 의하여 예측된 네개의 선택적인 신호 펩티드 절단 장소는 서열 동정 번호 제2번의 잔기 3, -5, 2 및 -2 (가능성이 높은 것부터)이후에 위치한다. 따라서, N-말단 아미노산이 위치 4, -4, 3 및 -1 에서의 잔기로부터 선택되어진 성숙한 인간의 러크-8 폴리펩티드가 본문에서 제공되며, 실시예외에 N-말단 아미노산은 위치1 에서 잔기이다.

천연 러크-8 단백질의 변형체 및 유도체는 천연 러크-8 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의하여 제조된다. 돌연변이는 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하여 특정 부위에 도입될 수 있으며, 천연 서열의 단편에 대하여 결찰할 수 있는 제한 부위에 의하여 측면에 위치할 수 있다. 후술하는 결찰에서, 얻어지는 재구성된 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 동종을 암호화한다. 별법으로, 올리고뉴클레오티드-지향 부위-특이적 돌연변이 방법은 원하는 돌연변이를 도입하도록 사용될 수 있다. 그러한 변형을 이루기 위한 방법은 문헌[Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al.(Gene 37:73, 1985); Craik(BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al.(Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); 및 미국 특허 제 4,518,584호 및 제4,737,462호에 의하여 개시된 것들은 포함한다.

러크-8은 글리코실기, 지질, 포스페이트, 아세틸기등과 같은 기타 화학적 부분과 공유 또는 응집 접합을 형성함으로써 러크-8 유도체를 만들도록 변형할 수 있다. 러크-8의 공유 유도체는 러크-8 아미노산 곁사슬상에 또는 러크-8 폴리펩티드나 또는 그 세포외 영역의 N-말단 또는 C-말단에서, 화학적 부분을 관능기에 결합함으로써 제조된다. 본 발명의 범위내의 러크-8의 기타 유도체는 N-말단 또는 C-말단 융합으로서 재조합형 배양에서의 합성에 의한 경우와 같이, 다른 단백질 또는 폴리펩티드로 러크-8 폴리펩티드의 공유 또는 응집 접합체를 포함한다.

러크-8 폴리펩티드의 융합은 정제를 촉진하도록 첨가된 펩티드 및 러크-8의 동정화를 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러한 펩티드는 폴리-히스 또는 미국 특허 제5,011,912호 및 문헌[Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988]에 기재된 항원의 동정화 펩티드를 포함한다. 그러한 펩티드중 하나는 항원이며, 발현된 재조합형 단백질을 용이하게 정제하고 급속하게 시험할 수 있는 특정 모노클로날 항체에 의하여 가역적으로 결합된 에피토프(epitope)를 제공하는 등록 상표 플랙 펩티드, Asp- Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열 동정 번호 제3번)이다. 본명세서에서 참고문헌으로 기재한 미국 특허 제5,011,912호에 개시한 바와 같이, 4E11로 표시된 쥐과의 하이브리도마는 일정한 2가 금속 양이온의 존재하에서 등록 상표 플랙 펩티드와 결합하는 모노클로날 항체를 생성한다. 4E11 하이브리도마 세포주는 기탁번호 HB 제9259호로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁하였다. 등록 상표 플랙 펩티드와 결합하는 모노클로날 항체는 이스트만 코닥사(미국 코네티컷주 소재, 뉴헤븐, Scientific Imaging Systems Division)로부터 구입할 수 있다.

러크-8 단백질(단편 및 변형체를 포함)은 적당한 시험에서 헤크 또는 엘크와 결합하는 능력을 시험할 수 있다. 러크-8의 생물학적 활성은 예를 들면, 헤크 또는 엘크와 결합하는 천연 러크-8과 경쟁하는 변형체의 능력을 시험하여 결정될 수 있다(즉, 경쟁적 결합 시험)

경쟁적 결합 시험은 후술하는 통상의 계통적 분석법을 수행할 수 있다. 경쟁적 결합 시험에 사용가능한 반응자는 방사능 표지된, 가용성인 러크-8 및 완전한 헤크/엘크-발현 세포를 포함한다. 예를 들면, 라디오 표지된 가용성 천연 러크-8은 헤크 또는 엘크와 세포 표면 결합을 하는 가용성 러크-8 변형체와 경쟁하도록 사용될 수 있다. 완전한 세포대신에 Fc 부분과 단백질 A 또는 단백질 G (고체상에서)의 상호작용을 통하여 결합된 가용성 헤크/Fc 또는 엘크/Fc 융합 단백질을 고체상으로 치환할 수 있다. 단백질 A 및 단백질 G를 함유하는 크로마토그래피 칼럼은 미국 뉴저지주소재 피스카타웨이 파마시아 바이오텍사로부터 구입가능한 것들을 포함한다. 경쟁적인 결합 시험의 다른 유형은 헤크/Fc 또는 엘크/Fc 융합 단백질과 같은 방사능 표지된 가용성 헤크 또는 엘크 및 러크-8을 발현하는 완전한 세포를 이용한다. 또한, 러크-8은 엘크 또는 헤크와 결합하기 위하여 다른 러크 단백질중 하나(상기, 러크1 내지 7)와 경쟁하는 능력에 대하여 시험할 수 있다. 경쟁적인 자동 방사성 사진 판 결합 시험(autoradiographic plate binding assay)에 의하여 정성적인 결과를 얻을 수 있는 반면, 정량적인 결과를 얻기 위하여 스케쳐드 플롯(Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660, 1949)을 사용할 수 있다.

본 발명의 러크-8을 에프과의 기타 수용자와 결합하려는 것은 가능하다(배경기술부분을 참조). 그러한 결합은 상술한 것과 같은 적합한 시험을 사용하여 분석할 수 있다.

엘크 및 헤크와 결합하여 발생하는 러크-8의 용도는 다음의 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 러크-8은 단백질 정제 시약으로서의 용도가 발견된다. 러크-8 폴리펩티드는 고체 지지 물질에 부착될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피에 의하여 헤크 또는 엘크 단백질을 정제하도록 사용될 수 있다. 특히 실시예에서 러크-8 단편 또는 러크-8의 수용체 결합 영역을 함유하는 융합 단백질은 통상적인 순서에 따라 고체 지지에 부착될 수 있다. 하나의 실시예로서 단백질의 아미노산 곁사슬에 대한 관능기와 반응하는 관능기를 함유하는 크로마토그래피 칼럼을 구입할 수 있다(미국 뉴욕주 피스카타웨이 파마시아 바이오텍사). 러크-8/Fc 융합 단백질은 Fc 부분과의 상호 반응을 통하여 크로마토그래피 칼럼을 함유하는 단백질 A- 또는 단백질 G-에 부착될 수 있다.

러크-8 단백질은 또한 세포 표면상에 헤크 또는 엘크를 발현하는 세포를 정제하거나 또는 동정화하는 용도가 발견된다. 러크-8(또는 그 융합 또는 단편)은 칼럼 크로마토그래피 메트릭스로서 또는 유사한 적합한 기질로서는 고체상이어야 한다. 예를 들면, 자기성 마이크로스피어(magnetic microsphere)는 러크-8로 코팅될 수 있고, 자기장을 통하여 배양 용기에서 담아진다. 헤크/엘크-발현 세포를 함유하는 세포 혼합물의 현탁액은 러크-8을 갖는 고체상과 접촉한다. 세포 표면에서 헤크 또는 엘크를 발현하는 세포를 고정된 러크-8에 결합하고 이어서 결합되지 않은 세포를 세척한다.

별법으로, 헤크/엘크+세포를 함유한다고 생각되는 세포의 혼합물을 처음에는 비오틴화된 러크-8로 배양할 수 있다. 배양 주기는 헤크/엘크와 결합하기 충분한 시간동안이며 전형적으로는 1시간이상이다. 다음에는 생성된 혼합물을 아비딘 코팅된 비드로 채워진 칼럼을 통해 통과시키고, 이에 따라, 아비딘을 위한 바이오틴의 높은 친화성으로 인하여 비드에 대한 세포의 결합이 제공된다. 아비딘-코팅된 비드를 사용하는 순서는 문헌[Berenson, et al., J. Cell. Biochem., 10D:239, 1986]에 공지되어 있다. 결합되지 않은 물질의 세척 및 결합 세포의 방출은 통상적인 방법을 사용하여 수행된다.

다음에는 이에 따라 정제된 세포 모집단을 예를 들면 포유류의 조직에 재위치시키기 위하여 다양하게 생체외 연구 또는 생체내 방법을 사용할 수 있다. 설명을 위하여 엘크를 발현하는 중성세포를 앞선 방법에 의하여 단리시킬 수 있고, 신경퇴행성의 장애가 있는 포유류에 투여한다. 헤크⁺세포는 일정한 루케미아 세포를 포함한다(하기에 동정화되었음) 단리된 루케미아 세포는 예를 들면, 세포상에 다양한 약의 효과에 대한 연구에 사용된다.

세포 표면상에서 헤크 또는 엘크를 발현하는 세포의 부가적인 유형을 동정하기 위하여, 러크-8은 방사성 핵종과 같은 검출 가능한 부분과 결합될 수 있다. 한가지 예로서,¹²⁵I로 방사능 표지된 것은 고 특이 활성으로 표지화된 관능기인¹²⁵I 러크-8 분자를 발생시키는 여러 표준 계통적 분류법중 하나에 의하여 수행될 수 있다. 다른 검출가능한 부분은 비색계 또는 형광색계 반응을 촉매화할 수 있는 효소를 포함한다. 헤크/엘크-발현을 시험하는 세포는 표지된 러크-8과 접촉한다. 배양후, 결합되지 않은 표지 러크-8을 제거하고 세포상에 검출가능한 부분의 존재 또는 부존재를 측정한다.

러크-8 단백질은 또한 러크-8과의 결합 친화성의 견지에서 엘크 또는 헤크 단백질의 생물학적 활성을 측정하는 용도가 발견되었다. 따라서, 러크-8 단백질은 예를 들면, 상이한 조건하에서 엘크 또는 헤크 단백질의 안정성 및 저장 수명을 모니터하기 위하여 "품질 보증" 연구를 행하는 방법을 사용할 수 있다. 설명을 위하여 상이한 온도에서 저장되며, 상이한 세포 유형이 생산되는 엘크 단백질의 생물학적 활성도 측정을 위한 결합 친화도 연구에 러크-8을 사용할 수 있다. 러크-8은 또한 엘크 또는 헤크 단백질(예를 들면, 화학적 변형, 절개, 돌연변이 등)의 변형후에 생물학적 활성도가 유지되는 가에 따라 결정될 수 있다. 러크-8에 대한 변형된 엘크 단백질의 결합 친화도는 엘크의 생물학적 활성에 대한 변형의 역효과를 발견하기 위하여 변형되지 않은 엘크 단백질의 결합 친화도와 비교된다. 이와 같이, 헤크 단백질의 생물학적인 활성도는 러크-8을 사용하여 평가될 수 있다. 따라서, 엘크 또는 헤크 단백질의 생물학적 활성도는 예를 들면, 리서치 연구에서 사용되기 전에 확인될 수 있다.

러크-8 폴리펩티드는 엘크 또는 헤크 세포 표면의 수용체를 갖는 세포에 부착된 방출제를 위한 담체로서의 용도가 또한 발견되었다. JM 및 HSB-2로 표시된 인간의 T-세포 루케미아 세포주, 및 LK63을 표시하는 인간의 프리B 세포 루케미아 세포주를 포함하는 루케미아 세포주에 대한 헤크 항원의 발현이 보고되었다(Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992; Boyd et al., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992). 따라서, 러크-8 단백질은 생체내 또는 생체외 방법에서 진단 또는 치료제를 이들 세포(또는 세포 표면상에서 헤크 또는 엘크의 발현이 발견된 다른 세포 유형)로 운반하도록 사용될 수 있다.

그러한 용도의 하나의 예는 치료제가 루케미아 세포를 향한 세포독성을 나타내는지 평가하기 위하여 치료제/러크-8 복합체에 헤크⁺세포주를 노출하는 것이다. 러크-8에 부착된 많은 상이한 치료제는 루케미아 세포에 대한 작용제의 세포독성 효과와 비교 및 검출하는 시험에 포함될 수 있다. 러크-8/진단제 복합체는 생체내 또는 생체외에서 헤크⁺의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있다.

러크-8 폴리펩티드에 부착될 수 있는 검출가능한 (진단) 치료제는 목적하는 사용에 따라 선택된 특정 작용제와 함께 약, 독소, 방사성 핵종, 발색단, 비색 또는 형광색의 반응을 촉매하는 효소등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 약의 예에는 예를 들면, L-페닐 알라닌 질소 겨자 또는 시클로포스파미드와 같은 질소 겨자, 시스디아미노디클로로플라티늄과 같은 삽입제, 5-플루오로 우라실과 같은 항대사제, 빈스크리스틴과 같은 빈카 알카로이드, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신 및 그 유도체와 같은 항체와 같이, 다양한 형태의 암 치료에 사용되는 것을 포함한다.

독소에는 리신, 에브린, 디프테리아 독소, 슈도모나스 아루기노사 독소 A, 리보소옴 불활성화 단백질, 트리코테센과 같은 진균독 및 그 유도체 및 단편(예를 들면, 단일 사슬)이 있다. 진단용으로 적합한 방사성 뉴클레오티드는¹²³I,¹³¹I,^99mTc,¹¹¹In, 및⁷⁶Br을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 치료용으로 적합한 방사성 핵종은¹³¹I,²¹¹At,⁷⁷Br,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,²¹²Pb,²¹²Bi,¹⁰⁹Pd,⁶⁴Cu, 및⁶⁷Cu를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

그러한 작용제는 적합한 통상적인 방법에 의하여 러크-8에 부착될 수 있다. 단백질이 되는 러크-8은 예를 들면, 공유결합을 형성하기 위하여, 원하는 작용제상의 관능기와 반응할 수 있는 아미노산 곁사슬상에 관능기를 포함한다. 별법으로는, 단백질 또는 작용제는 원하는 반응성 관능기를 발생하거나 또는 부착하기 위하여 유도체화될 수 있다. 유도체화는 단백질에 대한 다양한 분자를 부착할 수 있는 이관능기성 커플링제중 하나의 부착과 관련시킬 수 있다(Pierce Chemical Company, Rocjford, Illinois). 방사능 표지된 단백질에 대한 여러가지 기술이 공지되어 있다. 방사성 핵종 금속은 예를 들면, 적합한 이작용성 킬레이트제를 사용하여 러크-8에 부착시킬 수 있다.

따라서, 러크-8을 함유하는 복합체 및 적합한 진단 또는 치료제(바람직하게는 공유결합됨)가 제조되었다. 복합체를 투여하거나 또는 특별한 사용에 적절한 양으로 사용할 수 있다.

본 발명의 러크-8의 다른 용도는 엘크 또는 헤크와 관련하여 러크-8이 엘크 또는 헤크 수용체를 갖는 세포의 상이함 또는 성장에서 작용할 수 있는 역할을 연구하기 위한 리서치 수단으로서의 용도에 있다. 본 발명의 러크-8 폴리펩티드는 또한 그 상호 반응 또는 러크-8 또는 엘크의 검출을 위한 생체외 시험에서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 러크-8은 헤크와 러크-8의 상호작용 또는 헤크를 위한 시험에서의 용도가 발견되었다. 헤크가 종양형성에 있어서 역할을 할 가능성이 제시되었다(Boyd et al., supra)

본 발명의 폴리펩티드 및 러크-8 DNA는 러크-8의 불완전한 또는 불충분한 양에 의하여 (직접 또는 간접적으로) 매개된 장애 치료 개발에 있어서 유용할 수 있다. 러크-8 폴리펩티드는 그러한 장애가 있는 포유류에 투여될 수 있다. 별법으로, 유전자 치료 접근 방법을 사용할 수도 있다. 천연 러크-8 뉴클레오티드 서열의 본문에서 개시된 내용에 따라 불완전한 러크-8 유전자의 검출 및 일반적인 러크-8-암호화를 하는 유전자와의 재배열이 가능하다. 불완전한 유전자들이 생체외 진단시험에서 검출될 수 있으며, 이 유전자에 결점이 잠복되어 있다고 생각되는 인간으로 부터 얻어진 러크-8 유전자와 비교하여 천연-러크-8 뉴클레오티드 서열이 본문에 개시되어 있다. 상기 토의된 바와 같이, 엘크 mRNA를 위하여 여러가지 쥐 조직을 분석한 경우, 전사는 단지 뇌 및 고환에서만 발견되었다(Lhotak et al., supra). 신경 조직상에서의 러크 단백질을 위한 수용체의 발현을 통하여 신경계의 재생 또는 개발에 작용할 수 있는 러크 단백질의 역할에 대한 연구가 가능해 진다. 러크-7은 축삭 길잡이 및 축삭의 관속 형성과 관련이 있다고 보고되어 왔다(Winslow et al., Neuron 14:973-981, 1995; Drescher et al., Cell 82:359-370, 1995). 본 발명의 러크-8은 중성 조직상의 수용자에 대한 러크-8의 결합의 영향 연구에 사용될 수 있다. 러크-8은 신경계와 관련이 있는 유도 또는 조절 공정에 작용하는 역할을 조사할 수 있다. 러크-8은 신경계의 개발을 촉진하거나 조절하기 위하여 생체내에 투여될 수 있다.

상기 러크 단백질중 일부는 신경 방어적 성질을 갖는다고, 예를 들면, 글루타메이트 매개된 여기독성에 대한 해마의 뉴우런을 보호한다고 보고되어 왔다. 신경계의 많은 장애에서 여기 성분의 관여가 구축되어 왔다. 글루타메이트에 대한 반응은 중추신경계(CNS)의 전개 빛 성숙에 있어서, 일반적인 기능이다. 그러나, 흥분성의 시넵틱 전달 및 가소성에 있어서 일반적인 역할외에도 글루타메이트는 또한 알츠하이머 질환, 헌팅톤 질환, 퍼킨슨씨 병, 발작(허혈), 간질 및 AIDS-관련 치매를 포함하나, 이에 한정하지 않는 다수의 CNS 이기능 상태를 매개하거나 또는 관여할 수 있다(Trends Pharmacol. Sci. 11:379, 1990; Choi, J. Neurosci. 10:2493, 1990; Liption et al., Neuron 7:111, 1991; and Andersson et al., Eur. J. Neurosci. 3:66, 1991).

본문에서 제공된 러크-8 폴리펩티드는 러크-8과 접촉하는 신경조직과 관련이 있는 장애를 치료하는 방법에서의 용도가 발견된다. 그러한 장애에는 만성 또는 급성인 신경 조직에 대한 장해 또는 신경성의 질환을 포함한다. 그러나, 장애의 예에는 CNS의 기능장애와 관련이 있는 상기 조건을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 러크-8은 그러한 조건에 영향을 끼치는 인간을 포함하는 포유류에 투여할 수 있다.

러크 단백질의 일부는 혈관형성을 촉진한다는 것이 발견되어 왔다. 마찬가지로 러크-8은 이식된 조직의 새로운 혈관형성을 자극하여 부상 치료에 유용할 수 있는 혈관형성을 촉진하는 또는, 원하는 혈관형성이 증가하는 조건에서 치료하는 용도가 발견될 수 있다. 생리적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 같은 다른 성분과 결합하여 본 발명의 러크-8 폴리펩티드의 유효량을 포함하는 조성물이 본 발명에서 제공된다. 러크-8은 약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위하여 사용된 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있다. 러크-8은 약학적으로 적합한 부형제(예, 염수, 트리스-염산, 아세테이트 및 포스페이트 완충용액), 보존제(예, 티머로살, 벤질 알콜, 파라벤), 유화제, 가용화제, 어드쥬번트 및/또는 담체와 함께 유일한 활성 물질로써 또는 다른 공지된 활성 물질과 함께 혼합물제에 결합될 수 있다. 약학적 조성물로서 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA]에 개시된 제제를 포함한다.

더욱이, 그러한 조성물들은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 금속이온과 착화합물된 , 또는 폴리아세트산, 폴리클리콜산, 수화겔, 덱스트란등과 같은 고분자 화합물로 혼입된, 또는 리포소옴, 마이크로에멀젼, 미셀, 단일 라멜라 또는 다층라멜라 액포, 환형 적혈구, 또는 아구(芽球)로 혼입된 러크-8을 함유할 수 있다. 그러한 조성물들은 물리적 상태, 용해성, 안정성, 생체내 방출속도 및 러크-8의 생체내 정돈 속도에 영향을 줄 것이며, 목적하는 사용에 따라 선택할 것이다. 러크-8은 또한 조직-특이성 수용체, 리간드 또는 항원에 관한 또는 조직-특이성 수용체의 리간드를 커플화하는 항체를 접합시킬 수 있다. 또한, 세포 표면상에 발현된 러크-8의 용도가 발견될 수 있다.

그러한 조성물은 천연 단백질, 변형체, 유도체, 올리고머 및 생물학적으로 활성인 단편과 같이, 본문에 기재된 어떠한 형태로도 러크-8 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 하나의 실시예의 경우, 조성물은 가용성 러크-8 폴리펩티드, 바람직하게는 가용성 러크-8 폴리펩티드를 포함하는 올리고머를 함유한다.

러크-8은 예를 들면, 국부, 장관외 또는 흡입에 의하여 적합한 방식으로 투여할 수 있다. 용어 "장관외"는 예를 들면, 질병 또는 손상된 부위의 국소 투여를 포함하는 피하, 정맥내 또는 근육내의 경로에 의한 주사를 포함한다. 삽입체로부터 계속적인 방출이 또한 나타난다. 당업자는 적합한 투여량은 치료될 장애의 성질, 환자의 체중, 연령 및 일반적인 조건 및 투여 경로와 같은 인자에 따라 변화할 것이라는 것을 인식할 것이다. 동물시험에 따라 일차적인 투여량이 결정될 수 있으며, 인간의 투여에 대한 복용량의 측정은 기술적으로 용인된 방법에 의하여 수행된다.

러크-8의 올리고머 형태

본 발명에 포함된 것은 러크-8 폴리펩티드를 함유하는 올리고머이다. 러크-8 올리고머는 공유 결합된 또는 비공유 결합된 이량체, 삼량체 또는 그 이상의 올리고머의 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 중 하나는 러크-8 폴리펩티드에 융합된 펩티드 부분사이에, 공유 또는 비공유 상호작용을 거쳐 결합된 다중 러크-8 폴리펩티드를 포함하는 올리고머에 관한 것이다. 그러한, 펩티드는 펩티드 린커(스페이서), 또는 올리고머화를 촉진하는 성질을 갖는 펩티드일 수 있다. 루이신 지퍼 및 항체로부터 얻어진 일부 폴리펩티드는 보다 상세하게는 후술하는 바와 같이, 부착되는 러크-8 폴리펩티드의 올리고머화를 촉진할 수 있는 펩티드 사이에 존재한다.

특히, 실시예에서 올리고머는 러크-8 폴리펩티드 두개 내지 네개를 포함한다. 올리고머의 러크-8 부분은 상술하는 바와 같이, 가용성 폴리펩티드일 수 있다.

하나의 별법으로, 러크-8 올리고머는 이뮤노글로불린으로부터 얻어진 폴리펩티드를 사용하여 제조된다. 항체-유도된 폴리펩티드(Fc 영역을 포함)의 다양한 영역에 융합된, 어느 정도 불균일한 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제법은 예를 들면, 문헌[Ashkenazi et al., (PNAS USA 88:10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344:677, 1990); and Hollenbaugh and Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19. 11, 1992)에 기재되어 왔다.

본 발명의 바람직한 예 중 하나는 항체의 Fc 부위에 러크-8을 융합하여 만들어진 두개의 융합 단백질을 포함하는 러크-8 이량체에 관한 것이다. 바람직하게는 Fc 폴리펩티드는 가용성 러크-8의 C-말단에 융합되어 진다. 러크-8/Fc 융합 단백질을 암호화하는 유전 융합은 적절한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 러크-8/Fc 융합 단백질은 재조합형 발현 벡터로 형질 변환시킨 숙주세포에서 발현되고, 2가의 러크-8을 생산하는 Fc부분사이에서 디술피드 결합형태로 내부 연결되는, 항체 분자와 같이 집합되도록 할 수 있다.

본문에서 제공된 것은 항체로부터 얻어진 Fc 폴리펩티드를 융합하는 러크-8 폴리펩티드를 포함하는 융합단백질이다. 그 Fc 부분사이에서 디술피드 결합을 거쳐 결합된 두개의 융합 단백질을 함유하는 이량체 및 그러한 융합 단백질을 암호화하는 DNA 또한 제공된다. 본문에서 사용된 용어 "Fc 폴리펩티드"는 항체의 Fc부위로 부터 얻어지는 폴리펩티드의 천연 및 돌연변이 형태를 포함한다. 이량체를 촉진하는 힌지 영역을 함유하는 그 폴리펩티드의 절개된 형태가 또한 포함된다. PCT출원 WO 93/10151에 기재된 하나의 적합한 Fc 폴리펩티드는 인간의 IgG1 항체의 Fc영역의 천연 C-말단에 대한 N-말단의 힌지 영역으로부터 연장된 단일 사슬의 폴리펩티드이다. 다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 미국 특허 제5,457,035호 및 문헌[Baum et al., (EMBO J. 13:3992-4001, 1994)]에 개시된 Fc 돌연변이이다. 이러한 돌연변이의 아미노산 서열은 아미노산 19가 Leu로부터 Ala로, 아미노산 20이 Leu로부터 Glu, 아미노산 22가 Gly로부터 Als로 변화되었다는 점을 제외하고는 WO 93/10151에 나타난 천연 Fc서열과 동일하다. 돌연변이는 Fc 수요자에 대한 감소된 친화도를 나타낸다.

다른 실시예에서, 러크-8은 항체의 가벼운 사슬 또는 무거운 사슬의 다양한 영역으로 치환될 수 있다. 융합 단백질이 항체의 무거운 사슬 및 가벼운 사슬로 만들어 진 경우, 네개의 러크-8 세포외 영역과 같은 러크-8 올리고머를 형성하는 것이 가능하다.

또한, 올리고머는 펩티드 린커(스페이서 펩티드)와 함께, 또는 펩티드 린커없이 다중 러크-8 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 적합한 펩티드 린커중에는 미국 특허 제 4,751,180호 및 제 4,935,233호에 기재된 것들이 있으며, 이에 따라 참조문헌에 포함되어 있다. 원하는 펩티드 린커를 암호화하는 DNA 서열을 적합한 통상적인 기술을 사용하는 러크-8을 암호화하는 DNA에서와 같이 같은 리딩프레임내 또는 사이로 삽입될 수 있다. 예를 들면, 린커를 암호화하는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드는 러크-8을 암호화하는 서열사이에서 결찰될 수 있다. 실시예에서 융합 단백질은 펩티드 린커에 의하여 분리된 두개 내지 네개의 가용성 러크-8 폴리펩티드를 포함한다.

올리고머 러크-8의 다른 제조 방법은 루이신 지퍼의 용도와 관련이 있다. 루이신 지퍼 영역은 발견되는 단백질의 올리고머화를 촉진하는 단백질이다. 루이신 지퍼는 원래 다양한 여러 단백질이 발견된 이래, 여러 DNA-결합 단백질(Landschulz et al., Science 240:1759, 1988)에서 동정화되었다. 공지된 루이신 지퍼중에는 이량화 또는 삼량화하는 그 유도체 및 펩티드의 자연 발생이 있다. 가용성 올리고머 단백질 제조를 위한 적합한 루이신 지퍼 영역의 예는 PCT 출원 WO 94/10308에 기재되어 있으며, 문헌[Hoppe et al.(FEBS Letters 344:191, 1994) 및 미국 특허 출원 번호 제08/446,922호]에 기재된 허파의 계면활성제 단백질 D(SPD)로부터 얻어진 루이신 지퍼가 이에 따라, 참조문헌에 포함된다. 루이신 지퍼 펩티드에 융합되는 가용성 러크-8 폴리펩티드를 포함하는 재조합형 융합 단백질은 적합한 숙주 세포 및, 형태가 배양 상청액으로부터 회수되는 가용성 올리고머 러크-8에서 발현된다.

올리고머 러크-8은 엘크 또는 헤크의 장소와 결합하는 2가, 3가등의 성질을 보유한다. Fc 부분을 함유하는 상기 융합 단백질(및 그로부터 형성된 올리고머)은 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼에 대한 친화성 크로마토그래피에 의하여 손쉬운 정제라는 장점을 제공한다.

발현시스템

러크-8 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 원핵 생물, 효모 또는 보다 높은 진핵 세포를 포함한다. 박테리아, 균성, 효모 및 포유류의 세포질의 숙주와 함께 사용된 적절한 클로닝 및 발현 벡터가 예를 들면, 문헌[Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)]에 기재되어 있다. 세포-없는 번역 시스템 은 본문에서 개시된 DNA 구조로 부터 얻어진 RNA 를 사용하여 러크-8 폴리펩티드를 또한 생성하도록 사용할 수 있다. 발현 벡터는 러크-8 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 또는 리더 펩티드를 암호화하는 DNA를 포함할 수 있다. 신호 또는 리더 펩티드를 함께 또는 미리 번역하여 러크-8을 그 합성 부위로부터 세포벽 또는 세포막의 외면 또는 내면의 부위까지의 전달하는 것에 관한 것이다. 신호 또는 리더 펩티드는 성숙한 러크-8 폴리펩티드로부터 분열된다. 신호 또는 리더 펩티드는 성숙한 러크-8 폴리펩티드로 부터 분열된다. 신호 또는 리더 펩티드의 선택은 사용될 숙주 세포의 유형에 따라 상이하다.

형질 변환을 위한 적합한 원핵 숙주 세포는 예를 들면, 대장균, 고초균(枯草菌), 살모넬라 티피무림, 및 슈도모나스, 스트렙토마이세스 및 포도상규군의 속에서의 다양한 종류를 포함한다. 대장균과 같은 원핵의 숙주세포에서 러크-8 폴리펩티드는 원핵세포의 숙주 세포에서 재조합형 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함한다. N-발단 Met는 발현된 재조합형 러크-8 폴리펩티드로 부터 분열될 수 있다.

러크-8 폴리펩티드는 효모 숙주 세포, 바람직하게는 효모군속(예를 들면, 맥주 효모군)으로부터 발현될 수 있다. 피치아, 케이. 락티스, 또는 클루베로마이세스와 같은 다른 효모의 속을 또한 사용할 수 있다. 효모 벡터는 2μ 효모 플라스미드로부터의 복제 서열의 기점, 자율 복제 서열(ARS), 프로모터부, 폴리아데닐레이션 서열, 전사 종결 서열 및 선택적인 표지 유전자를 함유할 수 있다.

효모벡터의 적합한 프로모터 서열은 에놀라아제, 글리세알데히드-3-포스페이트, 탈수소효소, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라아제, 포스포프룩토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라아제, 3-포스포클리세라이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오세포스페이트 아이소머라아제, 포스포글루코오스 아이소머라아제 및 글루코키나아제와 같은 다른 것들 사이에서 메탈로티오닌, 3-포스포클리세라이트 키나아제(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) 또는 다른 해당 효소(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; and Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978)를 포함한다. 또다른 것으로 문헌[Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) 및 Beier et al. (Nature 300:724, 1982)]에 기재된 글루코스-억제 ADH2 프로모터가 있다. 효모 발현에서의 용도로 적합한 다른 벡터 및 프로모터가 추가로 문헌[Fleer et. al., Gene, 107:285-195(1991); 및 van den Berg et. al., Bio/Technology, 8:135-139 (1990)]에 기재되어 있다.

효모 및 대장균에서 복제가능한 셔틀 벡터는 대장균(복제의 Amp^r유전자 및 기점)의 선택 및 복제를 위해 pRB322로부터의 DNA 서열을 상기 원하는 효모 벡터에 삽입함으로써 만들 수 있다.

적합한 리더 서열(예, 효모군속의 α-인자 리더)을 효모 세포로부터의 러크-8 폴리펩티드의 세크라틴에 직접 사용할 수 있다. α-인자 리더 서열은 일반적으로 프로모터 서열 및 구조 유전자 서열 사이에 삽입된다. 예를 들면, 문헌[Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330,1984; 미국 특허 제4,546,082호 및 EP 324,274]를 참조한다. 효모 숙주로 부터 재조합 폴리펩티드의 세크레틴을 촉진하는데 적합한 다른 리더 서열이 당업계에서 공지되어 있다. 리더 서열은 하나이상의 제한 부위를 함유하는 3' 말단의 근처에서 변형될 수 있다. 이는 구조 유전자의 리더 서열의 융합을 촉진시킬 것이다. 효모 형질 전환의 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 프로토콜중 하나는 문헌[Hinnen et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978.]에 기재되어 있다. 힌넨등의 프로토콜은 0.67%의 효모 질소 기재, 0.5% 카사미노 산, 2% 글루코오스, 10μg/ml 아데닌 및 20 μg/ml 우라실으로 구성된 선택적인 배지에서 Trp⁺를 선택한다.

ADH2 프로모터 서열을 함유하는 벡터에 의하여 형질 전환된 효모 숙주 세포는 "풍부"한 배지에서의 발현을 유도하기 위하여 성장할 수 있다. 풍부한 배지의 예는 1%의 효모 추출물, 2%의 펩톤, 및 80μg/ml 아데닌 및 80 μg/ml 우라실로 보충된 1%의 글루코오스로 구성된 것이다. 글루코오스가 배지로부터 소모되었을 때 ADH2 프로모터의 억제해제가 일어난다.

포유류 및 곤충의 숙주 세포 배양 시스템은 또한 재조합형 러크-8 폴리펩티드를 발현하도록 사용될 수 있다. 곤충의 세포에서 불균일한 단백질을 제조하기 위한 바쿠로바이러스 시스템은 문헌[Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47(1988)]에 의하여 재검토되었다. 포유류 기원의 구축된 세포주를 또한 사용하였다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예는 문헌[McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991)]에 기재된 것과 같이, 원숭이 신장 세포의 COS-7라인(ATCC CRL 1651; Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 차이니스 햄스터 난소(CHO)세포, HeLa 세포, BHK(ATCC CRL 10)세포주, 및 아프리카 녹색 원숭이의 난소 세포주 CV1(ATCC CCL 70), 난소 CV-1/EBNA-1 세포주(ATCC CRL 10478)를 포함한다.

포유류 숙주 세포 발현 벡터의 전사 및 번역 조절 서열은 바이러스성 게놈으로부터 절제될 수 있다. 통상적으로 사용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 폴리소마 바이러스, 아네노바이러스2, 시미안 바이러스 40(SV40), 및 인간의 세포 확대 바이러스로 부터 얻어진다. SV40 바이러스 게놈으로부터 얻어지는 DNA 서열은 예를 들면, SV40, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데노신 부위가 포유류의 숙주 세포에서 구조 유전자 서열의 발현을 위한 기타 유전 요소를 제공하기 위하여 사용될 수도 있다. 초기 및 말기의 바이러스는 복제의 바이러스 기점을 함유할 수 있는 단편으로써 바이러스 게놈으로부터 용이하게 얻을 수 있기 때문에 특히 유용하다(Fiers et al., Nature 273:113, 1978).

보다 적거나 큰 SV 40단편을 또한 사용할 수 있으며, 복제 부위의 SV40 바이러스 기점에 위치한 Bgl I부위를 향하여 힌드 III으로부터 연장된 약 250bp 서열을 제공한다.

포유류 숙주세포에서 사용된 발현 벡터의 예는 문헌[Okayama and Berg(Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983)]에 개시된 것과 같이 만들어진 것들이다. 유용한 상피세포는 문헌[Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986)]에 기재된 것과 같이 실제적으로 만들어질 수 있다. 문헌[Cosman et al., Nature 312:768, 1984]에 기재된 매우 유용한 발현 벡터, PMLSV N1/N4는 ATCC 39890으로서 기탁되었다. 포유류 숙주세포에서의 용도로 적합한 기타 발현 벡터는 pDC201 (Sims et al., Science 241:585, 1988), pDC302 (Mosley et al., Cell, 59:335, 1989), pDC406 (Mcmahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991), HAV-EO (Dower et al., J. Immunol. 142:4314, 1989), 및 EP-A-0367566 및 WO 91/18982에 기재된 벡터이다. 기타, 레트로바이로스로부터 얻어지는 벡터를 선택할 수 있다.

자연 신호 서열의 자리에 미국 특허 제4,965,195호에 기재된 IL-7의 신호서열, 문헌[Cosman et al., Nanure 312:768(1984)]에 기재된 IL-2의 신호서열, EP제367,566호에 기재된 IL-4 수용체 신호 펩티드, 미국 특허 제4,968,607호에 기재된 유형 I IL-1 수용체 신호 펩티드, 및 EP 제 460,846호에 기재된 유형 II IL-1 수용체 신호 펩티드와 같은, 불균일 신호 서열을 첨가할 수 있다.

러크-8 단백질 정제

본 발명의 러크-8 폴리펩티드는 상술한 재조합 발현시스템에 의하여 제조할 수 있거나 또는 자연적으로 발생하는 세포로 부터 정제할 수 있다. 러크-8을 제조하는 방법 중 하나는 러크-8의 발현을 촉진하기에 충분한 조건하에서, 러크-8을 암호화하는 DNA서열을 포함하는 발현벡터로 형질 전환시킨 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 다음에는 사용하는 발현시스템 및 러크-8이 세포로부터 분비되는 가에 따라상이하게 러크-8을 배양배지 또는 세포 추출물로부터 회수한다. 하나의 실시예에서 인간의 러크-8 단백질은 균주 ATCC 97441에서 발견된 러크-8 cDNA를 함유하는 발현 벡터로 형질 전환시킨 숙주세포에 의하여 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 포함한다.

당업자에게 공지된 것과 같이, 재조합형 단백질의 정제 순서는 사용된 숙주세포의 유형 및 재조합형 단백질이 배양배지로 분비되는가 아닌가와 같은 인자에 따라 변화할 것이다. 기타 원하는 단백질을 발현하기 위하여 사용된 특정 숙주세포에 따라 변화할 수 있는, 제거되어야 할 오염균의 유형을 고려한다.

예를 들면, 재조합형 단백질을 분비하는 발현시스템를 사용하는 경우, 배양 배지는 우선 단백질 농축필터(예를 들면, 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 판매, 한외여과 단위)를 사용하여 농축될 수 있다. 후술하는 농축단계, 농축물은 겔 여과 메트릭스와 같은 정제 메트릭스에 사용될 수 있다. 또한 음이온 교환수지, 예를 들면, 디에틸아미노에틸(DEAE) 기를 갖는 메트릭스 또는 기질을 사용할 수 있다. 메트릭스로는 아크릴아미드, 아자로스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에 통상 사용되는 다른 지지 물질일 수 있다. 또한 양이온 교환 단계를 사용할 수 있다. 적합한 양이온 교환기는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 포함하는 여러 불용성 메트릭스를 포함할 수 있다. 술포프로필기가 바람직하다. 더욱이, 소수성 RP-HPLC 배지(예 메틸 또는 기타 지방족 기를 치환기로 갖는 실리카겔 )를 사용하는 하나이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 사용할 수 있다. 후술하는 정제단계의 일부 또는 전부가 정제된 러크-8 단백질을 제공하기 위하여 사용될 수 있다.

추가적인 선택은 러크-8과 결합하는 헤크, 엘크 또는 항체를 함유하는 크로마토그래피를 사용하는 친화성 크로마토그패피이다. 러크-8 폴리펩티드를 통상의 기술(고염 완충액의 용리)을 사용하여 친화 컬럼으로부터 회수할 수 있고, 이어서 사용을 위하여 저 염의 완충액으로 투석할 수 있다.

박테리아 배지에서 만들어진 재조합형 단백질은 숙주 세포의 초기 분열, 원심분리, 불용성 폴리펩티드인 경우, 세포 펠릿으로 부터의 추출, 가용성 폴리펩티드인 경우 상청액 유체로 부터의 추출에 의하여 단리할 수 있고, 이어서 하나이상의 원심분리, 염석, 이온 교환, 친화성 정제 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계가 뒤따른다. 최종적으로, RP-HPLC가 최종 정제 단계에 사용될 수 있다. 마이크로 바이러스 세포는 프리즈 쏘우 사이클링(freeze-thaw cycling), 초음파 분해, 기계적 분열 또는 세포 용균제의 사용을 포함하는 통상적인 방법에 의하여 분열시킬 수 있다.

효모의 숙주세포에서, 러크-8은 바람직하게는 분비된 폴리펩티드로서 발현되어 정제를 단순화한다. 효모의 숙주세포로부터 분비된 재조합형 폴리펩티드는 문헌[Urdal et al. (j. Chromatog. 296:171, 1984)]에 개시된 방법과 동종의 방법에 의하여 정제할 수 있다. 상기 문헌은 예비 HPLC 칼럼상에 재조합형 인간의 IL-2의 정제 를 위한 두개의 연속하는 역상 HPLC 단계에 대하여 개시하고 있다.

원하는 순도는 단백질의 목적하는 용도에 따라 상이하다. 비교적 고순도는 단백질이 예를 들면, 생체내에 투여될 때 바람직하다. 유리하게는 러크-8 폴리펩티드는 다른 (비-러크-8) 단백질에 상응하는 단백질대가 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분석에 의하여 검출될 수 있도록 정제된다. 당업자는 상기한 특이한 글리코실레이션, 특이한 후-번역 가공등에 기인하여, 러크-8 단백질에 상응하는 다중대가 SDS-PAGE에 의하여 가시화될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 가장 바람직하게는 SDS-PAGE에 의한 분석상의 단일 단백질대에서 지적된 바와 같이, 러크-8은 실제적으로 동종으로 정제된다. 단백질대는 은색으로의 착색, 코마시에 블루 착색 또는 (단백질이 라디오 표지된 경우) 자동 방사선 촬영법에 의하여 가시화될 수 있다.

핵산 및 그 용도

상기 기재한 바와 같이 본 발명은 러크-8 폴리펩티드의 제조시 유용한 단리된 러크-8 핵산을 제공한다. 그런 핵산은 그 RNA 보충물 뿐 아니라 당일-가닥 및 이중-가닥 형태인 서열 동정 번호 제1번의 인간의 러크-8 DNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 러크-8 DNA 는 예를 들면, cDNA, 게놈의 DNA, 화학 합성된 DNA, PCR에 의하여 확대된 DNA, 그의 재조합형을 포함한다. 게놈의 DNA는 탐침으로써, 실시예 1에서 단리된 cDNA, 또는 그 적합한 단편을 사용하는 통상적인 기술에 의하여 단리시킬 수 있다.

러크-8을 암호화하는 DNA의 바람직한 실시예는 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오티드 398 내지 1420(N-말단 단일 펩티드를 포함하는 인간의 러크-8 전체길이를 암호화) 및 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오티드 479 내지 1420(성숙한 인간의 러크-8 전체를 암호화)을 포함하는 DNA이다. 가용성 인간의 러크-8을 암호화하는 DNA의 바람직한 실시예는 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오티드 398 내지 1069(단일 펩티드 및 세포외 영역) 및 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오티드 479 내지 1069(세포외 영역을 암호화)을 포함하는 DNA이다.

본 발명은 추가로 러크-8 뉴클레오티드 서열의 단편을 제공한다. 그러한 단편들은 바람직하게는 예를 들면, 서열 동정 번호 제1번에 존재하는 인간의 러크-8 서열의 17개이상의 연속적인 뉴클레오티드와 같은, 러크-8 DNA 서열의 약 17개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 단편들의 DNA 및 RNA 보충물은 러크-8 DNA의 단일가닥 및 이중가닥 형태 모두 본문에서 제공된다.

러크-8 핵산 단편의 용도중에, 탐침으로서의 용도가 있다. 그러한 탐침은 친은 부가적인 포유류종으로부터 러크-8 DNA를 단리시키기 위하여 교차종 혼성화 방법에 사용될 수 있다. 한 예로서, 러크-8의 세포외 영역에 상응하는 탐침을 사용할 수 있다. 탐침은 또한 노우썬 블롯 및 싸우썬 블롯(Northern and Sourthern blots)으로써 상기 절차 및 생체외 시험에서의 러크-8 핵산의 존재를 검출하는 용도가 발견된다. 발현하는 러크-8의 세포 유형을 동정화할 수 있다. 그러한 방법들은 특히 의도하는 사용에 따라 상이하게, 공지되어 있으며 숙련자라면 적합한 길이의 탐침을 선택할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 러크-8 핵산 분자는 서열 동정 번호 제1번의 DNA 서열의 30개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 및 그 DNA 및 RNA 보충물을 포함한다. 탐침은 통상적인 기술에 의하여 표지할 수 있다(예를 들면,³²P)

러크-8 핵산 단편은 또한 프라이머, 예를 들면, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에서의 용도가 발견된다. 원하는 러크-8 DNA의 말단에 상응하는 5' 및 3' 프라이머(dP, 가용성 러크-8을 암호화하는 DNA)는 통상적인 PCR 기술을 사용하여 DNA를 단리하고, 확대시키는데 사용된다.

러크-8 핵산의 다른 유용한 단편은 러크-8 mRNA(감각) 또는, 러크-8 DNA(역감각) 서열을 목표로 하기 위하여 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 서열(RNA 또는 DNA)을 포함하는 역감각 또는 감각 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에 따르면, 역감각 또는 감각 올리고 뉴클레오티드는 러크-8 cDNA 의 암호화부의 단편을 함유한다. 그러한 단편은 일반적으로 약 14개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 주어진 단백질을 암호화하는 cDNA서열을 기본으로 하는, 역감각 또는 감각 올리고뉴클레오티드를 얻는 능력은 예를 들면 문헌[Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1998) and van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988)]에 기재되어 있다.

역감각 또는 감각 올리고뉴클레오티드의 목적하는 핵산서열과의 결합은 이중가닥의 축중 증가, 전사 또는 번역의 조숙한 종결을 포함하는 여러가지 방법중 하나, 또는 다른 방법에 의하여 목적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 이중가닥의 형성을 발생시킨다. 따라서, 역감각 올리고뉴클레오티드는 러크-8 단백질의 발현을 차단하기 위하여 사용될 수 있다. 추가로 역감각 또는 감각 올리고뉴클레오티드는 단결합이 내생적인 뉴클레아제에 대하여 내성이 있는, 변형된 당-포스포디에스테르 기본구조(또는 WO 91/06629에 기재된 것과 같은 기타 당 결합)를 갖는 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 당결합 내성을 가진 올리고 뉴클레오티드는 생체내(효소 토화 내성이 있는)에서 안정하나 뉴클레오티드 서열을 목적하기 위하여 결합할 수 잇는 서열 특이성을 보유한다.

감각 또는 염감각 올리고뉴클레오티드의 다른 실시예는 문헌[WO 90/10448]에 기재된 것과 같은 유기 부분, 폴리-(L-리신)과 같은 목적하는 핵산 서열을 위한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 증가시키는 다른 부분에 공유결합되는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 더우기, 목적하는 뉴클레오티드 서열을 위한 역감각 또는 감각 올리고뉴클레오티드의 결합특이성을 변형하기 위하여, 엘립신(ellipticine) 및 알킬화제 또는 금속 착화합물과 같은 삽입제를 감각 또는 역감각 올리고뉴클레오티드에 결합시킬 수 있다.

역감각 또는 감각 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, CaPO₄-매개된 DNA 트랜스펙션, 전기영동을 포함하는 유전자 전이 방법에 의하여, 또는 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus)와 같은 유전자 전이 벡터를 사용함으로써, 목적하는 핵산 서열을 함유하는 세포에 도입할 수 있다. 바람직한 방법의 경우, 역감각 또는 감각 올리고뉴클레오티드는 적합한 레크로바이러스에 삽입된다. 목적하는 핵산서열을 함유하는 세포는 생체내 또는 생체외에서 재조합형 레트로벡터와 접촉한다. 적합한 레트로바이러스는 쥐과의 레크로바이러스 M-MuLV, N2(M-MuLV로 부터 얻어진 레트로바이러스) 또는 DCT5A, DCT5B and DCT5C(WO 90/13641)로 표시된 이중 복사 벡터로 부터 얻어지는 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

감각 또는 역감각 올리고뉴클레오티드는 WO 91/04753에 개시된 것과 같이 리간드 결합 분자와의 콘쥬게이트 형성에 의하여 목적하는 핵산서열을 함유하는 세포로 도입한다. 적합한 리간드 결합 분자들은 세포 표면 수용자, 성장 인자, 다른 싸이토킨 또는 세포 표면 수용자와 결합하는 다른 리간드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 리간드 결합 분자의 콘쥬게이션은 실제적으로 상응하는 분자 또는 수용체와 결합하는, 또는 세포로 그 콘쥬게이트된 변형물 또는 감각 또는 역감각 올리고뉴클레오티드의 도입을 차단하는 리간드 결합 분자의 능력을 저해하지 않는다.

또한, WO/90/10448에 기재된 것과 같이, 감각 또는 역감각 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드-지질 착화합물의 형성에 의하여 목적하는 핵산 서열을 함유하는 세포로 도입할 수 있다. 이 감각 또는 역감각 올리고뉴클레오티드-지질 착화합물은 바람직하게는 내생적인 리파아제에 의한 세포와 결합된다.

항체

본 발명은 러크-8 폴리펩티드와의 면역 반응성인 항체를 제공한다. 그러한 항체들은 특히, 항체의 항원-결합부를 거쳐서 러크-8과 결합한다(비항체 결합과 반대).

폴리클로날 및 모노클로날 항체는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)]을 참조한다. 러크-8에 관한 모노클로날 항체의 생성이 추가로 실시예 3에 설명될 것이다.

통상적인 기술에 의하여 생성될 수 있는 항체의 항원-결합 단편이 또한 본 발명에 포함된다. 그러한 단편의 예는 Fab, F(ab') 및 F(ab')₂단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 유전 공학 기술에 의하여 제조되는 항체 단편 또는 유도체가 제공된다.

본 발명의 모노클로날 항체는 예를 들면, 쥐과의 모노클로날 항체를 인체에 적용시킨 변형물인, 인간의 키메라 항체를 포함한다. 그러한, 인체에 적용시킨 항체는 통상적인 기술에 의하여 만들어 질 수 있고, 항체를 인간에게 투여할 때 면역 유전이 감소하는 잇점을 제공한다. 하나의 다른 실시예의 경우, 인간의 모노클로날 항체는 쥐과 항체(또는 그 항원 결합 부위)의 다양한 영역 및 인간의 항체로부터 얻어진 대조영역을 포함한다. 또한, 인간에 적용시킨 항체의 단편은 쥐과의 모노클로날 항체의 항원 결합부위 및 인간의 항체로 부터 얻어진 다양한 영역의 단편(항원 결합 부위의 부족)을 포함할 수 있다. 키메라 및 추가적으로 처리된 모노클로날 항체의 제조 방법은 문헌[Riechmann et al. (Nanure 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989), and Winter and harris(TIPS 14:139, May, 1993)]에 기재되어 있다.

항체의 용도에는 생체내 또는 생체외에서의 러크-8 폴리펩티드의 존재를 검축하는 시험으로서의 용도가 있다. 항체들은 또한 유전친화성 크로마토그래피에 의하여 러크-8 단백질을 정제하는 데에 사용될 수 있다.

부가적으로 수용체(예, 엘크 또는 헤크)에 러크-8의 결합을 차단할 수 있는 항체는 수용체에 러크-8을 결합하여 매기된 생리적 활성을 저해하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 항체는 생체내 방법에서 사용될 수 있거나 또한, 러크-8 매개된 생리적 활성을 저해하기 위하여 생체내에 투입될 수 있다. 이에 따라, 세포 표면 수용자에 대하여 러크-8의 결합에 의하여 (직접 또는 간접으로) 악화되거나 또는 매개된 병을 치료할 수 있다.

본 발명은 러크-8 및 적합한 희석제, 부형제 또는 담체에 관한 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 그러한 항체의 적합한 조성은 러크-8 단백질을 함유하는 조성물로 상기 기재한 바와 같다.

또한 본 발명은 러크-8에 관한 항체와 결합된, 검출가능한 (예, 진단가능한) 치료제를 포함하는 복합체를 제공한다. 그러한 작용제의 예는 상기에 기재되어 있다. 복합체는 생체내 또는 생체외 방법에서의 용도가 발견된다.

하기 실시예는 본 발명의 예를 추가적으로 나타내기 위하여 제공되었으며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.

<실시예 1: 인간의 러크-8 cDNA의 클로닝>

후술하는 방법에 의하여 본 발명의 인간의 러크-8을 암호화하는 cDNA를 단리시켰다. 검색 용어로써 러크-2 및 러크-5의 아미노산 서열을 사용하여 유전자 은행의 서열 데이타 뱅크(tfasta)를 검색하여 중요한 상동관계를 나타내는 EST(기탁 번호 H10006)를 동정화하였다. 가이드로써 러크-2 및 5의 리딩 프레임을 사용(러크-2 및 러크-5 서열과 비교하여, 삽입으로부터 야기된 프레인 이동 및 정지 코돈, EST에서의 삭제를 조절하기 위함)하여, EST의 번역이 명료해졌다. 러크-2 및 러크-5 아미노산 서열로의 EST의 이러한 번역 배열은 중복영역에서 러크-2 및 러크-5 모두 약 50% 서열 동정화를 나타낸다. 러크-1-7에 유지된 두번째, 세번째, 및 네번째 시스테인을 EST 번역시 동정화하였다.

EST를 기본으로 하는 올리고 뉴클레오티드를 폴리머라아제 사슬 반응(PCR)에서 5' 및 3' 프라이머의 용도로 합성하였다. 프라임는 EST의 110bp 내부 단편의 말단으로 정의된다. 파아지 λ 벡터에서의 인간의 cDNA 라이브러리로부터의 DNA를 PCR에서의 주형으로 사용하였다. 예상된 크기(110bp)의 DNA단편을 태아의 뇌, 피부의 섬유아세포 및 췌장암으로 부터 얻어진 cDNA 라이브러리 세가지로 부터 확장시켰다.

PCR에서의 프라이머로 사용된 동일한 두개의 올리고뉴클레오티드를 탐침으로써의 용도로³²P를 사용하여 말단 표지화하였다. 인간의 피부의 섬유아세포 cDNA 라이브러리를 섭씨 63도에서 하이브리제이션하도록 하여 스크린하고, 이어서 1 x SSC, 섭씨 63도에서 세척하였다. 하이브리징 클론중 하나는 표시된 λ를 단리시켰다. 이 클론의 암호화부는 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 8 내지 313을 암호화하는 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오티드 500 내지 1420에 상응하는 것이다.

이 클론의 단편은 PCR에의하여 확대되고, 표지화되고, 인간의 태아의 노 cDNA 라이브러리(섭씨 63도에서 하이브리제이션한 후, 1 x SSC, 섭씨 63도에서 세척)를 스크린하는 탐침으로써 사용하였다. 세가지 하이브리징 클론을 단리하였고 DNA 서열을 결정하였다. λ2로 표시된 하나의 클론은 암호화 영역의 전체 길이를 포함하였다.

클론 λ2의 인간의 러크-8 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 그에 따른 아미노산 서열은 각각 서열 동정 번호 제1번 및 서열 동정 번호 제2번에서 나타난다. 서열 동정 번호 제2번의 인간의 러크-8 단백질은 N-말단 신호 펩티드(아미노산 -27 내지 -1), 세포외 영역(아미노산 1 내지 197), 트랜스맴브래인 부(아미노산 198 내지 224) 및 세포질 영역(아미노산 225 내지 313)을 포함한다.

재조합형 파아지 벡터의 세포 용균액의 표본(벡터의 EcoRI 제한 부위로 삽입된 인간의 러크-8 cDNAλgt10 )은 미국 메릴랜드주 록빌소재, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁되었다. 표본은 부다페스트 협약에 의거, 1996년 2월 14일에 기탁되었고, 기탁 번호 ATCC97441로 지정되었다.

<실시예 2: 결합 연구>

엘크 또는 헤크에 대한 러크-8의 결합은 통상적인 결합 시험에 의하여 평가할 수 있다.

DNA 및 쥐의 엘크 cDNA를 위한 암호화된 아미노산 서열이 문헌[Lhotak et al. (Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991)]에 개시되어 있고, 이에 따라 참조문헌으로 게재되었다. 쥐의 엘크 단백질은 538 아미노산 세포외 영역, 25 아미노산 트랜스맴브레인 영역 및 419 아미노산 세포질 영역을 갖는다.

DNA 및 쥐의 헤크 cDNA를 위한 암호화된 아미노산 서열이 문헌[Wicks et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992)]에 나타나 있고, 이에 따라 본명세서에 게재되어 있다. 이 헤크 단백질은 (N-말단 부터 C-말단까지) 521 아미노산 세포외 영역, 24 아미노산 트랜스맴브레인 영역 및 418 아미노산 세포질 영역을 갖는다.

재조합형 가용성 엘크/Fc 및 헤크/Fc 융합 단백질은 예를 들면, PCT 출원 WO 96/01839에 기재된 것과 같이, 적합한 방법에 의하여 제조되며 참조문헌으로서 본 명세서에 게재되어 있다. 엘크/Fc 및 헤크/Fc 융합 단백질을 단백질 A 세파로오스 칼럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제한다.

세포 표면상에서 재조합형 러크-8을 발현하는 세포를 제조하였다. 러크-8 DNA를 PCR에 의하여 확장할 수 있더. PCR에서 사용된 프라이머는 러크-8 DNA의 암호화부의 말단을 의미하도록 선택되며, 또한 5'말단에 Xho I 제한 부위를, 확장된 DNA의 3'말단에 Not I부위를 첨가한다.

PCR 반응 생성물을 Xho I 및 Not I로 증해하고 Sal I(Xho I과 화합할 수 있는)로 분열된 발현 벡터에 삽입한다. pDC410으로 표시된 발현 벡터는 또한 대장균에서 복제하는 포유류의 벡터이며, pDC406(McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991)과 유사하다.

pDC410 다중 클로닝 부위(mcs)는 부가적인 제한부 및 세개의 정지코돈(각각의 리딩 프레임중 하나)을 함유한다는 점에서 pDC406과는 상이하다. mcs의 T7 폴리머라아제 프로모터 하부는 DNA서열이 mcs로 용이하게 삽입되도록 한다. 더우기, 복제의 EBV 기점은 pDC410에서 SV40 대 T항원을 암호화하는 DNA에 의하여 치환된다(SV40 프로모터로부터 얻어짐).

10cm²접시에서의 CV-1-EBNA-1 세포를 러크-8 DNA를 함유하는 재조합형 발현 벡터로 트랜스펙트한다. CV-1-EBNA-1 세포주(ATCC CRL 10478)는 CMV 직접 초기 인헨서/프로모터로부터 얻어진 EBV 핵 항원-1을 구조적으로 발현시킨다. CV-1-EBNA-1 세포는 문헌[McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991)]에 기재한 바와 같이, 아프리카 녹색 원숭이의 신장 세포주 CV-1 (ATCC CCL 70)로부터 얻었다.

트랜스펙트된 세포를 24시간동안 배양하고 각 접시의 세포를 24-웰 판으로 쪼갠다. 추가적으로 48시간동안 배양한 후, 트랜스펙트된 세포를 결합 배지(약 4 x 10⁴세포/웰)를 소혈청 알부민 25밀리그램/밀리리터, 소듐 아지드 2밀리그램/밀리리터, 20mM 레페스 pH 7.2를 함유하는 RPMI)인 BM-NFDM으로 세척하여, 50밀리그램/밀리리터의 비지방 건조우유에 첨가하였다. 다음에는 세포를 상기 엘크/Fc 융합 단백질 또는 헤크/Fc 단백질 융합단백질의 다양한 농도에서 섭씨 37도, 1시간동안 배양한다. 다음에는 세포를 세척하고 섭씨 37도에서 1시간동안 부드럽게 교반하면서 결합 배지에서¹²⁵I-생쥐 항 인간 IgG의 농도를 포화시키면서 일정하게 배양하였다. 전체적으로 세척한 후 세포를 트립시니제이션을 거쳐 방출하였다.

상기 사용된 생쥐 항-인간 IgG은 인간의 IgG의 Fc부에 대한 것이며, 미국, 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재, 잭슨 임뮤노리서치 레버러토리에서 구입할 수 있다. 항체는 표준 크로아민-T 방법을 사용하여 방사 요오드화할 수 있다.

항체는 세포에 결합하는 엘크/Fc 또는 헤크/Fc 융합 유전자에 결합할 것이다. 모든 시험에서¹²⁵I 항체의 비특이 결합은 엘크/Fc(또는 헤크/Fc)의 존재 및 분존재, 비표지된 생쥐의 항 인간 IgG항체의 200배 초과몰에서 시험된다.

세포-결합¹²⁵I-항체를 팩커드 오토감마 카운터상에서 양을 측정하였다. 친화 계산(Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949)은 마이크로박스 컴퓨터상에서 작동하는 RS/1(미국 마이애미주 보스턴시 소재 BBN 소프트웨어)상에서 얻어졌다.

<실시예3: 러크-8과 결합하는 모노클로날 항체 >

본 실시예는 러크-8과 결합하는 모노클로날 항체의 제조방법을 나타낸다. 그런 항체를 발생시키는데 사용될 수 있는 적합한 면역 유전자는 정제된 러크-8 단백질, 또는 세포외 영역 또는 러크-8을 함유하는 융합 단백질과 같은 그 면역유전자의 단편(예, 가용성 러크-8/Fc 융합 단백질)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

정제된 러크-8은 미국 특허 제4,411,993호에서 기재된 것과 같은 통상적인 기술을 사용하여 이와 면역 반응성인 모노클로날 항체를 발생기키기 위하여 사용될 수 있다. 간단하게는 생쥐를 프룬드의 완전한 어드쥬번트에서 유화시킨 러크-8 면역 유전자로 면역시키고 이어서 복망강내 또는 피하에 10 내지 100 μg의 양으로 주사한다. 10 내지 12일후에 면역된 동물을 불완전한 프룬드의 어드쥬번트로 추가적으로 러크-8로 촉진시킨다. 생쥐를 이후 정기적으로 일주 내지 격주로 면역 계획에 따라 촉진시킨다. 돗트 블로트 시험, ELISA(효소-연결된 임뮤노솔벤트 시험) 또는 헤크 또는 엘크 결합의 억제에 의하여, 러크-8 항체를 시험하기 위하여 혈청 표본을 정기적으로 레트로 오비탈 출혈 또는 꼬리-끝 절제에 의하여 얻는다.

사용 항체의 적정 농도를 발견한 후, 염수에서 러크-8의 최후의 정맥내 주사를 포지티브 동물들에 제공한다. 3일 내지 4일후에, 동물들을 희생시키고, 지라 세포를 얻고 지라 세포를 예를 들면 NS1, 바람직하게는 P3 x 63 Ag 8.653(ATCC CRL 1580)와 같은 쥐과의 골수증 세포주에 융합한다. 융합은 비융합 세포, 골수종하이브리드 및 지라세포의 하이브리드의 분열을 저해하는 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 선택적 배지에서, 다중 마이크로타이터 판에 놓은 하이브리도마 세포를 방출한다.

하이브리도마 세포를 문헌[Engvall et al. Immunochem. 8:871, 1971] 및 미국특허 제 4,703,004호에 개시된 기술을 적용하여 정제된 러크-8에 대한 반응성인 ELISA에 의하여 스크린한다. 바람직한 스크린 기술은 문헌[Beekmann et al., (J. Immunol. 144:4212, 1990)]에 기재된 항체 포착 기술이다. 포지티브 하이브리도마 세포는 항 -러크-8 모노클로날 항체 고농도를 함유하는 복수증(腹水症)을 생산하는 BALB/c 생쥐에게 복막강내로 주사할 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포는 다양한 기술에 의하여 생체외 플라스크 또는 롤러 병에서 성장할 수 있다. 생쥐 복수증에서 얻어진 모노클로날 항체는 암모늄 설페이트 침전물에 의하여 정제하고, 이어서 겔 배제 크로마토그래피할 수 있다. 또한 러크-8에 결합하는 것을 기본으로 하여 친화성 크로마토그래피를 할 수 있는 것과 같이, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합을 기본으로 하는 친화성 크로마토그래피를 또한 사용할 수 있다.

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인: 체레티, 더글라스 피.

(ii) 발명의 명칭: 러크-8 로 표시된 싸이토킨

(iii) 서열수: 3

(iv) 통신 주소:

(A) 수신인: 카쓰린 에이, 앤더슨, 임뮤넥스 코오퍼레이션

(B) 거리: 51 유니버시티 스티리트

(C) 도시: 시애틀

(D) 주: 워싱턴

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 98101

(v) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: 애플 파워 매켄토시

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 애플 오퍼레이팅 시스템 7.5.3

(vi) 최근 출원 기록:

(A) 출원번호: -지정중-

(B) 출원일: 1997년 3월 19일

(C) 분류:

(viii) 대리인 정보:

(A) 성명: 앤더슨, 카쓰린 에이.

(B) 등록번호: 32,172

(C) 참고번호: 2839-WO

(ix) 통신 정보:

(A) 전화: (206) 587-0430

(B) 팩스: (206) 233-0644

(C) 텔렉스: 756822

(2) 서열 동정 번호 제1번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 1708 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(vii) 직접적인 근거:

(B) 클론: 후러크8

(ix) 특징:

(A) 이름/키: CDS

(B) 위치: 398..1420

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 멧_펩티드

(B) 위치: 479..1417

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 시그_펩티드

(B) 위치: 398..478

(ix) 서열 설명: 서열 동정 번호 제1번:

(2) 서열 동정 번호 제2번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 341 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제2번:

(2) 서열 동정 번호 제3번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 8 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(vii) 직접적인 근거:

(B) 클론: FLAG 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제3번:

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

Claims (27)

1. 헤크 또는 엘크와 결합하며, 서열 동정 번호 제2번의 잔기 -27 내지 313 및 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 313으로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열과 80%이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 러크-8 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 DNA.
2. 제1항에 있어서, 상기 러크-8 폴리펩티드가 서열 동정 번호 제2번의 잔기 -27 내지 313 및 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 313으로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열과 90%이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 DNA.
3. 제2항에 있어서, 상기 러크-8 폴리펩티드가 서열 동정 번호 제2번의 잔기 -27 내지 313 및 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 313으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 DNA.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 러크-8 폴리펩티드가 자연적으로 발생하는 것이 특징인 DNA.
5. 1) 계산 분자량이 약 33킬로달톤이고,

   2) 등전위점(pI)이 약 8.46이며,

   3) N-말단 아미노산 서열이 Leu-Ser-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Trp-Asn-Ser- Ala-Asn- (서열 동정 번호 제2번의 아미노산 1-12)

   인 것이 특징인 헤크 또는 엘크와 결합하는 성숙한 인간의 러크-8 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 DNA.
6. 헤크 또는 엘크와 결합하며, 서열 동정 번호 제2번의 잔기 -27 내지 x(여기서, x는 142 내지 197의 정수를 나타낸다) 및 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 x로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 가용성 러크-8 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 DNA.
7. 제6항에 있어서, 상기 가용성 러크-8 폴리펩티드가 서열 동정 번호 제2번의 잔기 -27 내지 x 및 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 x로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인 단리된 DNA(여기서, x는 142 내지 197의 정수를 나타낸다).
8. 1) 서열 동정 번호 제2번의 인간의 러크-8 폴리펩티드 및

   2) 엘크 또는 헤크와 결합할 수 있는 1)의 폴리펩티드 단편

   으로 이루어지는 군으로부터 선택된 러크-8 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 DNA.
9. 제8항에 있어서, 상기 단편이 가용성 단편인 것인 DNA.
10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 DNA를 포함하는 발현 벡터.
11. 제10항의 발현 벡터로 형질 전환시킨 숙주 세포.
12. 러크-8 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 조건하에서 제11항의 숙주세포를 배양하고, 러크-8 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 러크-8 폴리펩티드의 생산방법.
13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 DNA에 의하여 암호화된 정제된 러크-8 폴리펩티드.
14. 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 313의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 정제된 러크-8 폴리펩티드.
15. 제14항에 있어서, 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 313의 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 러크-8 폴리펩티드.
16. 제15항에 있어서, 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 313의 아미노산 서열을 포함하는 러크-8 폴리펩티드.
17. 제15항에 있어서, 서열 동정 번호 제2번의 아미노산 1 내지 297 및 299 내지 313을 포함하며, 298 위치의 잔기가 루이신인 러크-8 폴리펩티드.
18. 헤크 또는 엘크와 결합하며, 성숙된 형태가

    1) 계산 분자량이 약 33킬로달톤이고,

    2) 등전위점(pI)이 약 8.46이고,

    3) N-말단 아미노산 서열이 Leu-Ser-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Trp-Asn-Ser- Ala-Asn- (서열 동정 번호 제2번의 아미노산 1-12)인 것이 특징인

    정제된 인간의 러크-8 단백질.
19. 헤크 또는 엘크와 결합하며, 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 x(여기서, x는 142 내지 197의 정수를 나타낸다)의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 정제된 가용성 러크-8 폴리펩티드.
20. 제19항에 있어서, 서열 동정 번호 제2번의 잔기 1 내지 x(여기서, x는 142 내지 197의 정수를 나타낸다)를 포함하는 가용성 러크-8 폴리펩티드.
21. 1) 서열 동정 번호 제2번의 인간의 러크-8 폴리펩티드 및

    2) 엘크 또는 헤크와 결합할 수 있는 1)의 폴리펩티드 단편

    으로 이루어지는 군으로부터 선택된 정제된 러크-8 폴리펩티드.
22. 제21항에 있어서, 상기 단편이 가용성 단편인 러크-8 폴리펩티드.
23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 러크-8 폴리펩티드 2 내지 4개로 이루어지는 올리고머.
24. 제23항에 있어서, 상기 올리고머가 두개의 가용성 러크-8/Fc 융합 단백질로 이루어지는 이량체인 올리고머.
25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항의 러크-8 폴리펩티드 또는 올리고머, 및 적합한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
26. 제13항 내지 제22항중 어느 한 항의 러크-8 폴리펩티드에 대하여 작용하는 항체.
27. 제26항에 있어서 상기 항체가 모노클로날 항체인 것인 항체.